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• Janela Mostacero

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RECUENTO DE Staphylococcus aureus

I.

INTRODUCCION Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocácicas de 0,8-1,0 μm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y carecen de esporos. Son grampositivas. Para el recuento de S. aureus se han propuesto diversos medios específicos, estos medios difieren principalmente en los agentes selectivos que poseen entre los que destacan el telurito potásico, cloruro de litio, la azida sódica, la glicina, polimixina B, etc. En la actualidad gozan de gran aceptación los medios que contienen yema de huevo junto a uno o más de los agentes selectivos antes señalados. En estos medios la mayoría de las cepas de S. aureus utilizan la lipoproteína de la yema de huevo conocida como lipovitelina lo que da a lugar a que, en torno y debajo de las colonias, aparezcan aéreas de aclaramiento. Otro carácter propio de las reacciones de yema de huevo es la aparición de un precipitado blanco en las zonas total o parcialmente aclaradas, que es debida a la formación a sales de calcio y magnesio de los ácidos grasos liberados. A pesar de que estas reacciones son características de las colonias de S. aureus hay cepas de estafilococos coagulasa positiva que le presentan. S. aureus es altamente vulnerable a la destrucción por tratamiento térmico y a los agentes de saneamiento. Sin embargo la presencia de esta bacteria o de sus toxinas en alimentos procesados o en equipos para el procesamiento de alimentos, indica una pobre salubridad. S. aureus puede causar severos envenenamientos por alimentos. Los alimentos son examinados para buscar la presencia de S. aureus o de sus enterotoxinas y así, confirmar que S. aureus es el agente causal de

la enfermedad, para determinar si el alimento es la fuente

potencial del envenenamiento, y para demostrar la contaminación postprocesamiento, la cual generalmente se debe al contacto humano o por contaminación del alimento con superficies contaminadas. II.

OBJETIVOS. 

Realizar la técnica de recuento en placa para Staphylococcus aureus mediante un medio sólido selectivo (Agar Baird-Parker), presente en una muestra de queso.

III.

METODOLOGIA 3.1 Método de Conteo Directo en Placa A. Según la FDA Este método es aplicable para el análisis de alimentos en la cual se pueden esperar mas de 100 células de S. aureus /g Equipos y materiales 

Todos los equipos básicos para un conteo en placa.



Un incubador para secar la superficie del agar.



Una barra de cristal doblado estéril, con forma de palo Hockey, con los extremos pulidos, de 3-4 mm de diámetro, 15-20 cm de longitud, con una longitud para extender la muestra de 45-55 mm.

Medios y reactivos 

Medio Baird-Parker



Caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Aislamiento y enumeración de S. aureus



Para cada dilución a ser plaqueada, transferir asépticamente 1 ml de muestra suspendida a 3 placas de agar Baird-Parker, distribuir 1 ml de inóculo equitativamente a 3 placas (ej, 0.4 ml, 0.3 ml, y 0.3 ml).



Extender el inóculo sobre la superficie del agar, usando un asa de Drigalsky estéril. Colocar las placas en posición normal para que el inóculo sea absorbido por el agar (cerca de 10 min. sobre placas correctamente secadas.). Si el inoculo no es fácilmente absorbido, colocar las placas de manera vertical en un incubador por una hora. Invertir las placas e incubar de 45-48 h a 35°C.



Seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias, a menos que las placas con menores diluciones (>200 colonias) tengan colonias con características típicas de S. aureus.



Conteo de colonias. Si se observan varios tipos de colonias que se parecen a S. aureus en las placas seleccionadas, cuente el número de colonias de cada tipo y lleve las cuentas por separado. Cuando las placas de la dilución más baja contienen < 20 colonias, éstas, pueden ser utilizadas. Si las placas que contienen > 200 colonias tienen colonias con el aspecto típico de S. aureus y las colonias típicas no aparecen en diluciones más altas, utilice estas placas para la enumeración de S. aureus, pero no cuente las colonias no típicas. Seleccione a más de 1 colonia de cada tipo de conteo y realice la prueba de la coagulasa.

Agregue el número de colonias en las placas

triplicadas representadas por las colonias que dan la prueba positiva de la coagulasa y multiplíquese por el factor de dilución de la muestra. Divulgue este número como el número de S. aureus/g del alimento. PRUEBAS CONFIRMATIVAS i. Prueba de coagulasa 

Transferir las colonias sospechosas de S. aureus a tubos que contengan de 0.2-0.3 ml de caldo BHI y mezclar. Inocular el agar inclinado de un medio conveniente para el mantenimiento, ejemplo, TSA, con una asada de la suspensión de BHI.



Incubar la suspensión del cultivo de BHI de manera inclinada por 18-24 h a 35°C. Conserve los cultivos inclinados a temperatura ambiente para las

pruebas auxiliares o en caso de que los resultados de la prueba de la coagulasa sean cuestionables. 

Agregar 0.5 ml del plasma reconstituido de coagulasa con EDTA (B-4, arriba) al caldo BHI y mezclar. Incubar a 35°C y examine periódicamente cada 6 h y verificar la formación del coágulo.

La aparición de un coágulo firme y

completo en el lugar de inclinación del tubo, se considera como reacción positiva para S. aureus. La coagulación parcial, o resultados 2+ y 3+, se deben de volver a realizar. Pruebe los cultivos positivos y negativos simultáneamente con cultivos que se desconozca su reacción. Realizar la coloración Gram a los tubos positivos y observar al microscopio. PRUEBAS AUXILIARES i.

Prueba de la Catalasa. Se realiza a partir del medio TSA inclinado, sobre láminas o placas, y se ilumina apropiadamente para observar la producción de las burbujas del gas.

ii.

Utilización anaeróbica de la glucosa.

Inocular los tubos con medio de

fermentación de carbohidratos que contiene glucosa (0,5%). Inocule. Haga que la picadura se aproxima al fondo del tubo. Cubra la superficie del agar con capa de aceite de parafina estéril de por lo menos 25 milímetros de grosor. Incube 5 días a 37°C. La producción de ácido anaeróbico se indica por el cambio a amarillo a través del tubo, indicando la presencia de S. aureus. Compruebe con medios de control. iii.

Utilización anaeróbica del manitol. Repetir el paso 2, usando el manitol como carbohidrato. S. aureus

usualmente es positivo pero algunas cepas son

negativas. Verificar los controles simultáneamente. iv.

Sensibilidad a la Lisostafina. Transfiera la colonia aislada de la placa de agar a 0,2 ml de un buffer salino, con un asa y emulsione. Transfiera la mitad de células suspendidas a otro tubo (13 x 100 milímetros) y mézclese con 0,1 ml de buffer fosfato salino, y uselo como control. Agregue 0,1 ml de lisostafina (disuelta en el buffer fosfato-salino 0,02 M con NaCl al 1%) al tubo original para la concentración 25 del µg lysostaphin/ml. Incube ambos tubos en 35°C por no más de 2 h. Si la turbiedad aclara en esta mezcla, considere la prueba

como positiva. Si esta no se aclara a las 2 h, la prueba es negativa. S. aureus es generalmente positivo TABLA1: Caractecaracterísticas típicas de S. aureus, S. epidermidis y Micrococcus

Características

S. aureus

S.

Micrococus

epidermidis Actividad de Catalasa

+

+

+

Producción de coagulasa

+

-

-

Producción de

+

-

-

+

+

-

Glucosa

+

+

+

Manitol

+

-

-

Termonucleasa Sensibilidad a 

Utilización anaeróbica de:

3.2 Según la ICMSF (Método empleado en el laboratorio) 

Preparar el homogenizado y las diluciones de las muestras del alimento (queso de cabra). Por duplicado



Añadir el agar Baird Parker a las placas (15 ml),dejar solidificar



Transferir 0.1 ml del homogenizado y sus diluciones a la superficie del medio contenido en placas



Extender el inóculo sobre la superficie del agar, usando un asa de Drigalsky estéril. Colocar las placas en posición normal para que el

inóculo sea absorbido por el agar (cerca de 10 min. sobre placas correctamente secadas.). 

Incubar las placas en posición invertida a 35 y 37°C durante 30 y 48 h.



Pasadas las primeras 30 horas de incubación, seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias, y contar todas las colonias negras brillantes de margen estrecho y blanco.



Una vez finalizado el segundo el periodo de incubación (48 h), y contar todas las colonias con el aspecto mencionado antes y también cuyo color sea negro brillantes con o sin margen estrecho y no presenten área de aclaramiento.



Llevar a cabo la prueba de la coagulasa con un número significativo de colonias (no menos de 5).



Conteo de colonias: Sumar el número de colonias que presentan el número de zonas claras a las 30 horas de incubación i.

Si se observan varios tipos de colonias que se parecen a S. aureus en las placas seleccionadas, cuente el número de colonias de cada tipo y lleve las cuentas por separado.

ii.

Cuando las placas de la dilución más baja contienen colonias, éstas, pueden ser utilizadas.

< 20

Si las placas que

contienen > 200 colonias tienen colonias con el aspecto típico de S. aureus y las colonias típicas no aparecen en diluciones más altas, utilice estas placas para la enumeración de S. aureus, pero no cuente las colonias no típicas. iii.

Seleccione a más de 1 colonia de cada tipo de conteo y realice la prueba de la coagulasa. Agregue el número de colonias en las

placas triplicadas representadas por las colonias que dan la prueba positiva de la coagulasa y multiplíquese por el factor de dilución de la muestra. Divulgue este número como el número de S. aureus/g del alimento. 

Confirmación de colonias: i.

Pasar las colonias positivas a tubos de caldo infusión cerebro corazón BHI y mezclar. Incubar a 35°C- 37°C

ii.

Pasar 0.1 ml de los cultivos a tubos 10x75 mm conteniendo 0.3 ml de plasma de conejo e incubar de 35°C- 37°C

iii.

Y examine periódicamente cada 6 h y verificar la formación del coágulo. La aparición de un coágulo firme y completo en el lugar de inclinación del tubo, se considera como reacción positiva para S. aureus. La coagulación parcial, o resultados 2+ y 3+, se deben de volver a realizar. Pruebe los cultivos positivos y negativos simultáneamente con cultivos que se desconozca su reacción. Realizar la coloración Gram a los tubos positivos y observar al microscopio. Cuadro 01: Esquema orientativo para puntuar las reacciones de la prueba de coagulasa.

I.

MATERIAL:

A. MATERIAL BIOLÓGICO: 

Queso

B. MATERIAL DE LABORATORIO: 

Incubadora



Tubos de ensayo



Gradilla



Placas petri



Bombillas



Hisopos de algodón u otro material equivalente, largo aproximado de 12 cm.



Guantes descartables de primer uso



Protector de cabello.



Mascarillas descartables.



Plumón marcador indeleble (para vidrio).

C. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 

Agar Baird Parker



Agua de peptonada



TTC

II.

1.

METODO: RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVOS

MÉTODO (Siembra directa en placas de agar de Baird-Parker)

A. MATERIAL Y APARATOS 1. Placas de Petri, de vidrio (100 x 15mm) 6 de plástico (90 x 15mm). 2. Pipetas bacteriológicas de 1 ml con subdivisiones de 0.1 ml o inferiores. 3. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio a 44-46°C. 4. Estufa de incubación, 35-37°C. 5. Cabina de flujo laminar o estufa de desecación para secar la superficie del medio sólido contenido en las placas. 6. Varillas de vidrio en forma de bastón de hockey, pulidas al fuego o alambres doblados, para disminuir el inóculo, cuyas medidas sean aproximadamente: 3.5 mm de diámetro y 20 cm de longitud, dobladas en ángulo recto a 3 cm de un extremo. 7. Agar de Baird-Parker (Medio 6). 8. Agar de Baird-Parker, modificación de Holbrook (Medio 7) Este medio puede emplearse en lugar del señalado en el punto 7.

B. TÉCNICA 1. Preparar las muestras de alimento con la dilución de los homogeneizados de alimentos. 2. Añadir el agar de Baird-Parker a las placas (15ml a cada una), dejar solidificar y secar las superficies en la cabina de flujo laminar o en la estufa. Cuando se emplea la modificación del

medio de Baird-Parker propuesta por Holbrook hay que añadir piruvato sódico al medio contenido en las placas antes de proceder a secar las superficies. 3. Transferir 0.1 ml del homogeneizado y de sus diluciones a la superficie del medio contenido en placas independientes y extender el inóculo con ayuda de las varillas de vidrio o de los alambres hasta que sea absorbido por el medio. Para cada dilución deben prepararse placas por duplicado. 4. Incubar las placas en posición invertida a 35-37°C durante 30 y 48 horas. 5. Pasadas las primeras 30 horas de incubación, elegir las placas que contengan entre 20 y 200 colonias aisladas y contar todas las colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco rodeadas de áreas claras que se extienden en el medio opaco. La probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus es muy elevada. 6. Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas otras 18 horas. 7. Una vez finalizado el segundo periodo de incubación (48 horas), contar todas las colonias que presenten el aspecto mencionado y también aquellas cuyo color sea negro brillante con o sin margen estrecho blanco y que no presenten el área de aclaramiento. Llevar a cabo la prueba de la coagulasa con un número significativo de colonias sospechosas de corresponder a S. aureus (no menos de cinco) 8. Con ciertas partidas de yema de huevo, las colonias de algunas cepas de S. aureus pueden estar rodeadas de una zona opaca a las 30 horas de incubación, pero un número mayor de cepas puede mostrar este aspecto a las 48 horas. Contar estas colonias a las 48 horas y someterlas, o a un número adecuado de ellas (no menos de cinco) si son muchas, a la prueba de la coagulasa.

C. RESULTADOS ESPERADOS El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente: Redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.

El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos.

El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma también una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible a partir de las 24 horas de incubación.

a. COLONIAS TIPICAS El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de las mismas, son las características típicas más visibles de las colonias típicas.

b. COLONIAS ATIPICAS Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.

D. RECUENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS Para ello la cifra obtenida en las placas se multiplica por el factor de dilución de la placa, lo que da como resultado el recuento total de S. aureus coagulasa positivo en 0,1 gramo del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el recuento total de S. aureus por gramo o mililitro de muestra.

Cálculos: En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la dilución y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g de alimento (UFC/g).

N = C x D x 10 Dónde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL). C=

Media

del

número

de

colonias

en

las

dos

placas.

D= Factor o inverso de la dilución.

Expresión de los resultados: Media del número de colonias típicas en las dos placas x inverso de la dilución x 10 = UFC/g o UFC/Ml

CONFIRMACIÓN DE LA PRUEBA DE LA COAGULASA Se seleccionan, como minino, dos colonias típicas para su confirmación. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio para producir Coagulasa. La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas) producen esta enzima. Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo infusión cerebro-corazón, BHI (BrainHeartInfusion) contenido en tubos. Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.

 COAGULASA POSITIVA La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.  COAGULASA NEGATIVA La reacción es negativa cuando no se coagula el plasma III.

PROTOCOLO

RECUENTO EN PLACA DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS. ICMSF 2001

IV.

RESULTADOS: MÉTODO

RECUENTO

DE

ESTAFILOCOCOS

COAGULASA

POSITIVOS (Siembra directa en placas de agar de Baird-Parker) (ICMSF, 2000)

A. RECUENTO DE COLONIAS Dilución 10-1 Dilución 10-2

Dilución 10-3

Tabla N° 01: Recuento colonias sumadas en placa en las respectivas diluciones.

B. PRUEBA DE COAGULASA :

C. RECUENTO

.

V.

BIBLIOGRAFIA:

 I.C.M.S.F. 2000. Los microorganismos de los Alimentos. Vol. 1: Su significado y métodos de enumeración 2ª Edición. Editorial Acribia, S.A. – Zaragoza (España).

 PASCUAL ANDERSON, M. del Rosario, Calderón Pascual , Vicente

1999. Microbiología Alimen