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• Lucesita de Reyes

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INFORME TÉCNICO PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: 20050771 PRODUCCIÓN DE EDULCORANTES POR BIOCONVERSIÓN

DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO UPIBI-IPN

RESUMEN La industria de alimentos representa un sector económico importante a nivel mundial. Dentro de los insumos relacionados con dicha industria se encuentran los edulcorantes que son utilizados como aditivos para la preparación de formulaciones alimenticias. Los jarabes con alto contenido en fructosa o en glucosa producidos por bioconversión son utilizados en la industria de refrescos, de panificación y de confitería. El presente proyecto de investigación está relacionado con la producción de edulcorantes a partir de soluciones concentradas en sacarosa, por medio de su bioconversión utilizando la enzima invertasa en solución e inmovilizada. Es necesario mencionar que, si bien la materia prima para la producción de edulcorantes es propiamente un edulcorante también, los productos de la bioconversión permiten obtener un mayor poder edulcorante buscado por la industria de los alimentos. El proceso a desarrollar involucra la conversión de sacarosa en glucosa, fructosa y otros azúcares, obteniéndose una mezcla de azúcares con un poder edulcorante mayor al de la sacarosa.

El proyecto de investigación comprende la caracterización cinética de la bioconversión tanto con enzima libre como inmovilizada. Se seleccionará el método de inmovilización más conveniente y posteriormente los soportes de inmovilización que se utilizarán.

INTRODUCCIÓN Las enzimas son catalizadores biológicos (proteínas), entre sus características se encuentra la capacidad de acelerar ciertas reacciones químicas. Su importancia ha ido en aumento en los últimos años, ya que están presentes en procesos industriales destinados a la producción de fármacos, aditivos, detergentes, bebidas, por mencionar algunos casos. Recientemente se emplea e industrias tal como la cervecera enzimas inmovilizadas, con la finalidad de reutilizar el catalizador y poder incrementar la productividad.

El presente proyecto involucra el uso de la enzima invertasa en la producción de jarabes, que pueden ser empleados por la industria refresquera. La cual actualmente emplea jarabes altamente fructosados, obtenidos del maíz y que se caracterizan por ser más dulces y económicos en comparación con el azúcar de caña. Se utilizará la enzima inmovilizada con la finalidad de reutilizar el catalizador, y evaluar el efecto sobre la productividad. Misma que será comparada con la obtenida empleando la enzima en forma libre. El sustrato a emplear es la

sacarosa. Cabe mencionar que se evaluará que método de inmovilización se empleará para inmovilizar la enzima.

JUSTIFICACIÓN En la actualidad en nuestro país, el azúcar de caña atraviesa por una situación crítica, ya que ha sido sustituida por jarabes fructosados, los cuales además de ser más económicos que el azúcar de caña también tienen un poder edulcorante mayor. Estos jarabes se importan, ya que se elaboran a partir de los grandes excedentes de maíz que son subsidiados por el gobierno de Estados Unidos. Como una alternativa a esta situación, se propone el empleo de la bioconversión enzimática en la elaboración de jarabes fructosados empleando como sustrato el azúcar de caña (sacarosa). Mismos que pueden ser empleados como materia prima en la producción de refrescos o confitería, por mencionar algunas aplicaciones.

OBJETIVOS: GENERAL - Producción de edulcorantes por bioconversión. ESPECÍFICOS - Caracterización cinética de la hidrólisis de soluciones de sacarosa para la producción de glucosa y fructosa utilizando invertasa libre.

- Caracterización cinética de la hidrólisis de soluciones de sacarosa para la producción de glucosa y fructosa utilizando invertasa inmovilizada.

MARCO TEÓRICO

La sacarosa representa el 60 a 80 % de los edulcorantes y el 30 % de los carbohidratos usados como edulcorantes consumidos por el hombre. Su costo es generalmente bajo y es simple su producción y pureza. Su concentración en la caña de azúcar es alta (16 - 18 %). Sus propiedades físicas de caramelización, su higroscopía comparativamente baja y su estabilidad en muchos procesos para alimentos le hacen ser ideal como edulcorante en muchos alimentos, bebidas y productos de confitería. La sacarosa es también un preservante efectivo en la leche condensada dulce, donde inhibe el crecimiento bacteriano y de mohos como resultado de la presión osmótica en soluciones de alta concentración. Este azúcar también desarrolla el color en las carnes curadas, y favorece la conservación de las carnes durante su curado. La sacarosa es un disacárido compuesto por una molécula de glucosa (dextrosa) y una de fructosa (levulosa). Es dextrógira o dextrorrotatoria, lo cual significa que gira a la derecha +66,5° el plano de la luz polarizada. Al calentar en un medio ácido o por acción de la enzima invertasa se descompone para formar (+) Dglucosa y (-) D-fructosa, una mezcla de mayor dulzura que gira a la izquierda -20° el plano de la luz polarizada (levógira, levorrotatoria), invirtiéndolo de derecha a izquierda y por eso se llama azúcar invertido y al proceso inversión o hidrólisis. La

sacarosa se obtiene a partir de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera. Es estable al aire pero en polvo se torna higroscópica, absorbiendo hasta el 1% de humedad. Es fermentable pero a concentraciones altas (aproximadamente 17%) resiste a la descomposición bacteriana. Es el principal endulzante utilizado por el sabor excelente que imparte. También se utiliza como preservante, antioxidante, excipiente, agente granulador y tensoactivo en jabones, productos de belleza y tintas.

Industria de edulcorantes El hombre siempre ha sido atraído por el sabor dulce; quizá éste, fue uno de los métodos que empleo el hombre primitivo en la selección de alimentos seguros. Probablemente el primer edulcorante empleado como tal fue la miel de abeja. Los azúcares representan la forma mas común y conocida de los edulcorantes, ampliamente distribuidos en la naturaleza se encuentran en frutas, vegetales, miel y leche. Son también las unidades de que están constituidos carbohidratos más complejos (polisacáridos): almidón, celulosa, pectina, glucógeno, aparecen igualmente

en moléculas orgánicas

simples y complejas

como el ADN, las

glicoproteínas, etc.

Todos los carbohidratos

deben ser desdoblados

hasta azúcares simples

(monosacáridos), para poder ser asimilados siendo la glucosa y la fructuosa los mas comunes. La sacarosa o azúcar de mesa es el azúcar más conocido en la industria y el hogar. Existe una confusión fuera del ámbito académico, ya que a la sacarosa

se le ha conocido siempre con el término de azúcar. La melaza, el piloncillo y la azúcar morena no son más que diversas formas de presentación de la sacarosa o subproductos

de su procesamiento. A partir de los sesenta en los países

desarrollados se han venido implementando procesos industriales, en su mayoría biotecnológicos, para la elaboración de edulcorantes

calóricos (consisten en

azúcares y alcoholes del azúcar, contienen calorías como la sacarosa)

y no

calóricos (son químicamente un grupo muy heterogéneo y todos ellos tienen en común un intenso sabor dulce y no contienen suficiente energía),

que han

modificado la estructura de este mercado. Esta situación a traído graves consecuencias a los países para los que las exportaciones de azúcar de caña constituyen una entrada importante de divisas y ha sido un factor determinante en las fluctuaciones del precio internacional del azúcar de caña. Dado el aporte de la biotecnología en este sector, en función del su origen, es necesario distinguir la clasificación de los

edulcorantes: naturales, químicos,

biotecnológicos y químico biológicos. La industria del azúcar es hoy el consumidor más grande de enzimas industriales.

En particular, son usadas para

la

producción de glucosa y azúcar invertido de sacarosa como para la isomerización de glucosa a fructosa. El interés en enzimas inmovilizadas por éstos y los otros procesos en la industria del azúcar son importantes, este interés ha resultado en el desarrollo

de

algunos

procesos

comercializados

que

involucra

enzimas

inmovilizadas. Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones termodinámicamente posibles en los seres vivos. La mayoría de las enzimas son de origen globular. La sacarosa es hidrolizada a fructosa y glucosa por una enzima, que se conoce con

el nombre de invertasa. Esta reacción se puede representar de la siguiente manera: sacarosa + agua ↔ glucosa + fructosa + agua invertasa

En muchos casos se usan enzimas en la industria alimentaría para incrementar los efectos deseables. Se pueden usar enzimas de distinto origen ya sea animal, vegetal o microbiano.

Invertasa La enzima invertasa provoca la inversión de la sacarosa; la hidrólisis de sacarosa para producir fructuosa y glucosa, aumentando la solubilidad de la solución y obteniéndose un sabor mas dulce. El nombre oficial para el invertasa es el beta-beta-fructofuranosidasa, la invertasa se utiliza principalmente en la industria del alimento (confitería) donde la fructosa se prefiere sobre la sucrosa porque es más dulce y no se cristaliza como fácilmente. Sin embargo, el uso del invertasa es algo limitado porque otra enzima, isomerasa de la glucosa, se puede utilizar para convertir la glucosa a la fructosa más económicamente. Por razones de la salud y del gusto, su uso en sector alimenticio requiere que la invertasa esté purificada altamente. Una amplia gama de microorganismos produce el invertasa y puede, así, utilizar la sucrosa

como

alimento.

Comercialmente,

la

invertasa

es

biosintetizada

principalmente por las tensiones de la levadura del saccharomyces cerevisiae o

del Saccharomyces carlsbergensis. Incluso dentro de la misma cultura de la levadura, la invertasa existe en más de una forma. En contrario a la mayoría de las otras enzimas, la invertasa exhibe actividad relativamente alta sobre una amplia gama de pH (3,5 - 5,5), con el pH = 4.5 cercano óptimo. La actividad enzimática alcanza un máximo en alrededor 55º C. Aunque la invertasa libre se puede utilizar con tiempos de residencia alrededor de un día, el uso de enzimas inmovilizadas en un PBR con tiempo de residencia de cerca de 15 minutos hace el proceso competitivo.

Glucosa isomerasa Esta enzima transforma la glucosa en fructosa que es más soluble y más dulce. Se usa en la elaboración de jarabes. Fue descubierta en 1957 por Marshall y Koi, en Pseudomonas bydrophila. Actualmente

hay una extensa gama

de

preparaciones comerciales de glucosa isomerasa. Cabe señalar que la glucosa isomerasa, es una de las raras enzimas no hidrolíticas usadas en la industria, se utiliza por lo general en forma inmovilizada. Se requieren procesos de separación para obtener fructosa pura, pero no para la obtención de jarabes con 42% de fructosa, porque éstos presentan propiedades similares a las de los jarabes de azúcar invertido. Estos se producen en algunos países industrializados por acción de esta enzima; inicialmente la producción en gran escala de jarabes fructosados se llevó acabo usando células completas o enzima soluble.

La actividad de la glucosa isomerasa producida por algunos microorganismos se ha utilizado en forma inmovilizada a soportes sólidos en la conversión continua de glucosa a fructuosa. El método de inmovilización por adsorción presenta las mayores ventajas por ser sencillo, suave, reversible, lo que permite la reutilización del soporte

y de la

enzima; el complejo obtenido tiene una alta actividad por unidad de peso de soporte. Además, ya que tanto el sustrato como el producto de la glucosa isomerasa son moléculas pequeñas sin carga; permiten que la enzima adsorbida pueda usarse en concentraciones fuertes de sustrato.

Jarabes Se le llama jarabes glucosados a hidrolizados a partir de un ED de 20 (aunque éstos tengan muy bajos contenidos de glucosa). A menudo se incurre en el error de pensar que dicho jarabe contiene 20 % de glucosa, pero de acuerdo con la definición, debe entenderse como un jarabe

que presenta un poder reductor

similar al de una solución con 20% de glucosa.

Desarrollos

biotecnológicos, específicamente en el área de la tecnología

enzimática, han hecho posible la producción

a gran escala de jarabes

maltosados, que empiezan a ganar terreno en la industria alimentaría. La maltosa tiene un poder edulcorante equivalente a 50 a 75% del poder edulcorante de la sacarosa, pero a diferencia de la glucosa, la maltosa tiene una calidad de dulzor de alta aceptabilidad. Los jarabes son principalmente usados en cervecería, panadería, bebidas no alcohólicas, confitería, etc., y su importancia radica

probablemente más

en sus propiedades funcionales

que en su poder como

edulcorante.

BIOCONVERSIONES

Los procesos biocatalíticos involucran el uso de microorganismos y enzimas libres o inmovilizadas en medios acuosos o inorgánicos conteniendo compuestos orgánicos como sustrato. En estos procesos las enzimas convierten el sustrato en un nuevo compuesto de interés comercial.

Una de las principales ventajas de las enzimas además de las de índole económica o biotecnológica, se asocia a su gran especificidad de acción lo cual evita reacciones laterales imprevistas. Así mismo, se pueden trabajar en condiciones moderadas: presión atmosférica, temperaturas bajas o medias y pH de 3 a 10, obviamente las condiciones varían en función de la enzima que se trate.

La enzima de interés es la invertasa, la cual cataliza la hidrólisis de sacarosa y glicósidos relacionados. La invertasa de levadura, ha tenido un rol excepcional en el desarrollo de la enzimología moderna. Dicha enzima fue extraída de la levadura en 1860 por Berthelot. Posteriormente, el trabajo de dicha enzima tomó una gran importancia para el desarrollo de cinéticas enzimáticas. Además, fue una de las enzimas tratadas en 1990 por Sorensen, en la determinación de la concentración

del ión hidrógeno y la dependencia de la actividad de la enzima sobre el pH. El sustrato típico de esta enzima es la sacarosa.

La invertasa inmovilizada y células enteras de levadura han sido estudiadas para la inversión en continuo de soluciones de sacarosa. Para lo cual se han empleado soluciones diluidas de sacarosa bajo condiciones ideales en el laboratorio, mismas que son de interés académico. Sin embargo, el empleo de la invertasa inmovilizada tiene su principal dificultad en la recuperación del catalizador inmovilizado de las soluciones viscosas y pegajosas de sacarosa. Una importante ventaja es que se puede emplear el catalizador inmovilizado para operar en continuo.

Hay evidencias de que la enzima inmovilizada en material tal como polietilenamina, presenta mayor estabilidad durante un tiempo de 90 días a una temperatura de 50ºC, almacenada en una solución de sacarosa al 80% (Godbole, 1990).

INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA

La inmovilización enzimática es un conjunto de técnicas que proporcionan beneficios en los bioprocesos, incluyendo aumento de la productividad de la bioconversión, en algunos casos brinda estabilidad al biocaralizador y facilidad en

los procesos de recuperación; ya que las enzimas son fácilmente recuperadas y recicladas.

La ventaja más importante de la inmovilización enzimática es la productividad por operaciones continuas y reuso del biocatalizador (Groboillot, 1994).

Existen varios métodos para inmovilizar, estos pueden ser divididos en 2 categorías (Kennedy, 1983):

•

Unión química

•

Retensión física

UNIÓN QUÍMICA. Dentro de este tipo de inmovilización se encuentra la unión a soportes, los soportes pueden ser orgánicos, inorgánicos y sintéticos. La forma en la que están unidas las células a los soportes puede ser por medio de adsorción ó unión covalente.

Unión a soportes. La elección del soporte y el tipo de enlace son determinantes en el comportamiento

posterior

del

biocatalizador.

Debe

procurarse

que

la

inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además, el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las

condiciones de operación del reactor, y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado (Kennedy, 1983).

Los materiales empleados como soportes en la inmovilización difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, generalmente se encuentran en forma de cilindro, hojas, fibras y regularmente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en tres grandes grupos: soportes inorgánicos, orgánicos y sintéticos.

Los tipos de uniones que existen son:

Adsorción. La unión se realiza por medio de interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en la adsorción son: el pH del medio, la fuerza iónica, el diámetro de poro y la presencia de iones. Unión covalente. Pueden agregarse sustancias las cuales forman el puente de unión del soporte al biocatalizador, se logra un enlace fuerte que reduce la perdida de células como ocurre con el glutaraldehído. Es de fácil realización, sin embargo, las sustancias que se utilizan para formar el puente entre el biocatalizador y el soporte pueden resultar en tóxicas en ocasiones, haciendo variar la fisiología del mismo ya que se trata de interacciones químicas, lo cual provocaría la pérdida de dicho biocatalizador (Durán, 1997).

RETENSIÓN FÍSICA. Los métodos de retensión física incluyen encapsulación y atrapamiento. Se presenta a continuación una breve explicación de los mismos así como algunas de las ventajas que tienen.

Encapsulación.

La encapsulación del biocatalizador, se lleva a cabo reteniendo al mismo dentro de una membrana semi-permeable que permite la difusión de los sustratos. La formación de la membrana se logra en dos pasos: 1º la enzima se inmoviliza en esferas de hidrogel, se adiciona una capa de un polímero catiónico (polilisina de polietilenamina), ésta es adsorbida formando la superficie de la esfera. Después, el gel se disuelve y la enzima permanece atrapada dentro de la cápsula.

Atrapamiento enzimático.

Consiste en la retensión física del biocatalizador en una red rígida, que evita la salida de este al ambiente líquido, además permite la difusión de los substratos y productos. Los soportes pueden ser geles de naturaleza sintética (poliacrilamida, poliuretano, cloruro de polivinilo) o de naturaleza biológica (agar, celulosa, gelatina, colágeno, alginato, carragenina) (Groboillot, 1994).

La ventaja de emplear los geles biológicos es que las reacciones de polimerización son muy suaves, por lo que se disminuye en gran medida el riesgo de causar daños al biocatalizador. Otra característica de estos soportes es que no son tóxicos, por lo que son muy utilizados en la industria alimentaria y en la industria farmacéutica.

La gelificación se lleva a cabo por los cambios de temperatura, además de la presencia de cationes divalentes en el caso del alginato y la carragenina.

MATERIALES Y MÉTODOS. Los materiales y técnicas analíticas empleados se presentan a continuación: 1. Equipo

El equipo principal que será empleado durante el trabajo experimental es el siguiente: •

Espectrofotómetro UV-Vis.

•

HPLC.

•

Baño de recirculación con control de temperatura.

•

Célula de Lewis para reacciones enzimáticas a temperatura y agitación controlada.

•

Juego de pipetas automáticas.

2. Reactivos Cuadro 1. Reactivos empleados. REACTIVO

GRADO

Cloruro de sodio Cloruro de potasio Citrato de sodio Dextran

Analítico Analítico Analítico Analítico

Invertasa

Analítico

Glucosa

Analítico

Sacarosa

Analítico

Fructosa

Analítico

3. Soluciones •

Solución de KCl 0.3 M

•

Solución k-carragenina 2% (w/v).

•

Solución citrato de sodio 0.1 M

•

Solución de dextran 2% (v/v).

Después de la selección para inmovilizar la enzima, se montó en laboratorio dicha técnica y actualmente se lleva acabo la estandarización para el uso de dicha enzima (invertasa). A continuación se presenta el esquema de esta técnica (ver figura 1).

La descripción de la técnica es la siguiente: La enzima se adiciona a una solución de soporte al 2% contenida en un recipiente enchaquetado, manteniendo constante temperatura (55ºC) para evitar que el polisacárido gelifique y con agitación de 120 rpm, la suspensión se mantiene completamente uniforme.

La suspensión se hace pasar a través de una aguja por medio de una bomba peristáltica. Controlando el flujo, la aguja deja sólo pasar gotas de la solución de soporte – enzima. Las gotas, al ponerse en contacto con la solución de KCl 0.3 M, solidifican instantáneamente formándose así esferas de aproximadamente 3 mm. de diámetro.

La solución de KCl 0.3 M se encuentra con agitación mínima, para evitar que las esferas se peguen entre ellas al momento de caer. Suspensión de soporte al 2% con enzima

Bomba peristáltica

ºC, con agitación

Solución de KCl 0.3 M

Figura 1. Esquema de la técnica de inmovilización enzimática por atrapamiento.

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Y DE FRUCTOSA

Dichos azúcares se determinarán por dos métodos:

- Por azúcares reductores con el ácido 3,5-dinitrosalicílico. - Por HPLC con soluciones diluidas de ácido sulfúrico y detector de índice de refracción.

Cuadro 2. Concentraciones utilizadas para curva patrón. FRUCTOSA Absorbancia 0 0.1831 0.3843 0.5849 0.77545 0.96625 1.169 1.35375 1.49745 1.6542 1.8342

GLUCOSA Absorbancia 0 0.19285 0.399 0.63785 0.80005 0.99735 1.169 1.3713 1.52855 1.7338 1.9385

(g/l) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4

CURVAS TIPO (GLUCOSA-FRUCTOSA) 4.5 y = 2,1607x - 0,0434

4

R2 = 0,9982

3.5

y = 2,0852x - 0,0412 2

CONCENTRACIÓN (g/l)

R = 0,999

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

-0.5 ABSORBANCIA (540 nm)

GLUCOSA

FRUCTOSA

Figura 2. Curva Patrón de glucosa y fructosa determinados por HPLC.

RESULTADOS

Se realizaron un conjunto de cinéticas enzimáticas con invertasa libre con soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones.

A continuación se presentan un conjunto de gráficas (figuras 3 a 8) que representan cinéticas enzimáticas con invertasa libre comercial (SIGMA), a diferentes concentraciones de sacarosa.

Concentración 1.5M de Sacarosa

2.5

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

2

1.5

1

0.5

0 0

1

2

3

4

Tiempo (minutos) 2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

0.1(g/l)

Figura 3. Cinética Enzimática con sacarosa 1.5 M.

Concentración 1M de Sacarosa 6

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

5

4

3

2

1

0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Tiempo (minutos) 2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

Figura 4. Cinética Enzimática con sacarosa 1 M.

4

Concentración 0.5M de Sacarosa

7

6

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

5

4

3

2

1

0 0

1

2

3

4

Tiempo (minutos) 2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

0.1 (g/l)

Figura 5. Cinética Enzimática con sacarosa 0.5 M.

Concentración 0.25M de Sacarosa

7

6

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

5

4

3

2

1

0 0

1

2

3

4

Tiempo (minutos)

2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

0.1 (g/l)

Figura 6. Cinética Enzimática con sacarosa 0.25 M.

Concentración 0.1M de Sacarosa

6

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

5

4

3

2

1

0 0

1

2

3

4

Tiempo (minutos) 2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

0.1 (g/l)

Figura 7. Cinética Enzimática con sacarosa 0.1 M.

Concentración 0.05M de Sacarosa

6

Concentración de Azúcares Reductores (g/l)

5

4

3

2

1

0 0

1

2

3

4

Tiempo (minutos) 2(g/l)

1(g/l)

0.5 (g/l)

0.25(g/l)

0.1 (g/l)

Figura 8. Cinética Enzimática con sacarosa 0.05 M.

A partir del conjunto de cinéticas realizadas a diferentes concentraciones de sustrato, se fabrica la gráfica de velocidades de reacción contra concentración de sustrato (cuadro 3 y figura 9).

Cuadro 3. Velocidades de reacción de invertasa libre. Conc.Sacarosa 1.5 1 0.5 0.25 0.1 0.05

2(g/l) 4487.89109 11662.5547 88002.045 49149.6213 50868.5163 28542.7344

1 (g/l) 3588.20123 10112.0143 14390.3243 16210.3003 17401.3233 12639.6542

0,5 (g/l) 3701.65623 5584.07087 11531.6623 8130.73351 7855.2863 6719.9355

0,25 (g/l) 1616.65492 2369.52007 3387.08735 4901.71779 4523.18604 3228.06988

0,1 (g/l) 597.370727 1387.87549 1387.98416 1375.78504 1008.4742

Velocidades

2 g/l 100000 80000 60000 40000 20000 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

Concentración de sustrato

Figura 9. Velocidad de reacción vs concentración de sacarosa De acuerdo a la figura 9, se pone de manifiesto la inhibición enzimática presentada en el sistema estudiado, por la presencia de concentraciones de sustrato mayores a 0.5M de sacarosa.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE INVERTASA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN. Se realizó un estudio sobre el efecto de la concentración de la enzima invertasa libre sobre la velocidad de reacción en el sistema (figura 10, cuadro4).

Vmax 100000

90000

80000

Velocidad maxima

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0 0

0.5

1

1.5

2

Concentración de enzima (g/l)

Figura 10. Concentración de invertasa vs velocidad de reacción.

Cuadro 4. Concentración de enzima vs velocidad de reacción.

Conc. Enzima (g/l) 2 1 0.5 0.25 0.1

Vmax 88002.045 17401.3233 11531.6623 4901.71779 1387.98416

Con dicho estudio se puede observar que la concentración de enzima libre óptima resulta a una concentración de 0.25 g/l en el sistema estudiado.

CONCLUSIONES La producción por edulcorantes vía enzimática, con invertasa libre comercial, fue demostrada con soluciones de sacarosa de diversas concentraciones. También, se puso de manifiesto la inhibición enzimática presentada en el sistema estudiado, por la presencia de altas concentraciones de sustrato. Sin embargo, el proyecto no llegó completamente a su etapa final, debido a que faltó realizar los estudios relacionados con la caracterización cinética de la enzima en estado inmovilizada, todo ello debido a que la estudiante de maestría quedó fuera del proyecto por renuncia. Dicha etapa faltante, será resuelta en los meses a venir con la participación de dos alumnos de licenciatura de la carrera de ingeniería

biotecnológica. Dichos resultados serán reportados como complemento del presente informe en el futuro próximo.

IMPACTO DEL PROYECTO

El proyecto es de alto impacto desde el punto de vista que fundamenta las bases para poder producir edulcorantes vía bioconversión. La idea es que el proyecto pueda derivar en el futuro próximo en el uso de mieles finales de ingenios cañeros para la producción continua, por bioconversión enzimática o celular, de jarabes altamente fructosados o altamente glucosados, para su aplicación en la industria refresquera y de confitería. Con ello, el valor agregado de las mieles finales de ingenio se vería incrementado de forma exponencial. Sin embargo, es necesario aún realizar múltiples experimentos para llegar a dicha etapa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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