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• Maria Jose Lopez Mora

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Cepas citotóxicas de Escherichia coli que codifican la colibactina, el factor necrótico citotóxico y la toxina distensiva citolítica colonizan el tití común de laboratorio (Callithrix jacchus) Las ciclomodulinas son factores de virulencia que modulan la diferenciación celular, la apoptosis y la proliferación. Entre ellas se encuentran la colibactina (pks), el factor necrosante citotóxico (cnf) y la toxina distensora citolítica (cdt). Las cepas patógenas pks+, cnf+ y cdt+ de E. coli están asociadas a la enfermedad intestinal inflamatoria (EII) y al cáncer colorrectal en humanos y animales. Los titíes en cautividad padecen con frecuencia enfermedades similares a la EII, y se desconoce su asociación con las ciclomodulinas. Los aislados rectales de E. coli que codifican ciclomodulinas se caracterizaron mediante ensayos basados en la PCR en titíes sanos y clínicamente afectados procedentes de tres fuentes de cautiverio diferentes. Se cultivaron 139 aislados de E. coli de 122 de 143 titíes. Se detectó el gen pks en 56 aislados (40%), cnf en 47 aislados (34%) y cdt en 1 aislado (0,7%). La prevalencia de los aislados pks+ y cnf+ de E. coli fue significativamente diferente entre las tres colonias de titíes. El 98% de las E. coli positivas a la ciclomodulina pertenecían al grupo filogenético B2. Los aislados representativos demostraron citotoxicidad por ciclomodulina, y el serotipado y la secuenciación del genoma completo fueron consistentes con las cepas de E. coli patógenas. Sin embargo, la presencia de E. coli pks+, cnf+ o cdt+ no se correlacionó con la enfermedad gastrointestinal clínica en los titíes. Las E. coli que codifican la ciclomodulina colonizan a los titíes comunes de laboratorio de una manera que depende de la fuente, lo que puede afectar a la reproducibilidad en los modelos de titíes. Escherichia coli es una especie ubicua y diversa de bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, de la familia Enterobacteriaceae. La mayoría de las cepas de E. coli son comensales en el tracto gastrointestinal de los animales. Sin embargo, las cepas patógenas de E. coli causan una variedad de infecciones intestinales y extraintestinales que varían en gravedad desde autolimitadas hasta letales1 . Estas cepas se clasifican clásicamente en patotipos, que incluyen E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli uropatógena (UPEC), E. coli asociada a la meningitis (MNEC) y otras. Cada patotipo representa una colección de cepas con factores de virulencia similares que confieren la capacidad de causar una patología similar2 . Las ciclomodulinas son una clase heterogénea de factores de virulencia que alteran el ciclo celular eucariótico para promover la invasión bacteriana y la colonización del huésped. Estas acciones inducen una inestabilidad genética que puede conducir al desarrollo del cáncer. Las ciclomodulinas que se encuentran en E. coli incluyen la colibactina, el factor necrótico citotóxico (CNF), la toxina distensora citolítica (CDT), el factor inhibidor del ciclo, la toxina shiga y la toxina subtilasa3 . La colibactina es un metabolito secundario genotóxico producido por especies de Enterobacteriaceae que albergan la isla genómica de la policétido sintasa (pks). La colibactina de E. coli alquila la adenina, provocando enlaces cruzados de ADN y roturas de doble cadena, lo que lleva a la detención del ciclo celular y a la senescencia in vitro, así

como a un aumento de la virulencia en infecciones extraintestinales y al desarrollo de tumores in vivo4-6 . La presencia de E. coli pks+ está asociada a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y al cáncer colorrectal, y recientemente se ha demostrado que causa una firma mutacional única que está enriquecida en un subconjunto de cánceres humanos7-9 . Las ojivas de ciclopropano altamente reactivas e inestables de la colibactina se activan durante la secreción para evitar la autotoxicidad de las bacterias; por lo tanto, la toxicidad in vitro requiere el contacto directo de las células con las bacterias vivas. Los efectos en las células in vitro incluyen megalocitosis, focos de γH2AX fosforilados y detención del ciclo celular G210,11. El factor necrotizante citotóxico (CNF) es una familia de toxinas AB producidas por cepas de UPEC que causan cambios en el citoesqueleto que provocan la macropinocitosis de las bacterias en la célula huésped, así como la detención del ciclo celular G2. Estas acciones perjudican el recambio epitelial y favorecen la colonización de E. coli. En consonancia con estos mecanismos, muchas líneas celulares tratadas con sonicados de E. coli cnf+ presentan multinucleación y bordes celulares rufados. La CNF1 también puede inducir la transición epitelial a mesenquimal in vitro, por lo que puede aumentar el riesgo de cáncer12. Se han descrito tipos de CNF en E. coli, sin embargo, los CNF2 y CNF3 no se detectan con frecuencia13,14. Las cepas UPEC también producen hemolisina, una toxina formadora de poros de membrana. El gen cnf1, cuando está presente, siempre está codificado en el operón hlyCABD y se transcribe conjuntamente con la hemolisina. Sin embargo, hlyCABD puede existir sin cnf115. La hemolisina se produce como una forma libre o como una forma asociada a la vesícula de la membrana externa (OMV). La forma libre se inserta de forma irreversible en las membranas celulares de los eritrocitos y las células epiteliales, donde, dependiendo de la concentración, provoca un desequilibrio iónico, cambios estructurales y lisis celular. La forma asociada a la OMV es internalizada por las células epiteliales, donde se dirige a las mitocondrias y desencadena la apoptosis mediada por la caspasa-916-18. La toxina distensora citoletal (CDT) es una toxina de tipo AB2 producida por varias bacterias Gram negativas patógenas que provoca daños en el ADN y la detención del ciclo celular. La subunidad catalítica CdtB está muy conservada entre especies y provoca roturas de ADN de cadena simple y doble a través de una actividad similar a la DNasa I. Tis desencadena la respuesta al daño del ADN a través de la cinasa ATM, lo que conduce a la detención del ciclo celular en G2/M y G1/S. El CDT aumenta la colonización intestinal bacteriana, promueve respuestas proinflamatorias y desregula la respuesta inmunitaria. El tratamiento de células HeLa con CDT in vitro provoca distensión celular y multinucleación3,19. El tití común (Callithrix jacchus) es una especie de primate no humano que se utiliza cada vez más en diversos campos de la investigación biomédica, como la neurociencia, la toxicología, las enfermedades infecciosas, la inmunología, la reproducción, la obesidad y el envejecimiento20. El tití común en cautividad sufre con frecuencia una enfermedad similar a la EII, que a menudo se diagnostica postmortem como enteritis linfocítica crónica (CLE)21, cuya etiología y patogénesis se desconocen actualmente. No se ha investigado previamente el papel potencial de E. coli enteropatógeno codificador de ciclomodulina en la patogénesis de la enfermedad similar a la EII de los titíes, aunque E. coli se ha asociado previamente con la enfermedad GI en los titíes22-24. La mayoría de las colonias de titíes en cautividad no están libres de patógenos específicos (SPF), y ninguna excluye E. coli. Por lo tanto, se desconoce la prevalencia de E. coli codificadora de ciclomodulina en los titíes de laboratorio. Nuestra hipótesis es que el tití común, al igual que los roedores de laboratorio y otros primates no humanos de laboratorio25-29, está colonizado por E. coli codificadora de ciclomodulina, y que la prevalencia de E. coli pks+, cnf+ y cdt+ es mayor. coli en nuestra población variaría significativamente dependiendo de la colonia de origen, como se ha

demostrado en ratas de laboratorio28. Además, nuestra hipótesis es que las E. coli pks+, cnf+ y cdt+ están presentes en animales afectados por enfermedades gastrointestinales con mayor frecuencia que en animales clínicamente normales. Además, es de esperar que la colonización de los titíes por E. coli codificadora de ciclomodulina induzca una variabilidad fisiológica entre los animales de un estudio, lo que podría afectar a la reproducibilidad.

Resultados Caracterización microbiológica de aislados de E. coli del tití. En total, se aislaron 139 cepas de E. coli de 122 de los 143 titíes muestreados en las tres colonias (Tabla suplementaria S1). En la colonia A, se aislaron 31 cepas de E. coli en 26 de los 33 animales. En la colonia B, se aislaron 33 cepas de E. coli en 32 de los 33 animales. En la colonia C, se aislaron 75 cepas de E. coli en 64 de los 77 animales. Ocho cepas de E. coli procedentes de la colonia C mostraron actividad hemolítica cuando se cultivaron en placas de agar sangre. Algunos animales albergaban múltiples aislamientos de E. coli, según se determinó por la morfología distintiva de las colonias y la caracterización bioquímica mediante la prueba API. De los 139 aislados totales de E. coli, 54 tenían el código API 5144572 y 51 el código API 5144552, lo que constituía la mayoría de los aislados presentes en las tres colonias de titíes. La principal diferencia metabólica entre estos códigos es que las cepas con código API 5144572 fermentan la sacarosa, mientras que las de código 5144552 no lo hacen. Otros códigos API representados fueron el 5044552, el 5144172, el 7144552, el 7145552, el 5044572, el 5144573, el 1044552, el 4144512 y el 7144572 (Figura suplementaria S1). Hubo asociaciones significativas entre la colonia de origen del tití y las características bioquímicas vinculadas a la cepa E. coli, incluyendo la presencia de ornitina descarboxilasa (p