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• Jonathan Rojas Padilla

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Resumen El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON), en el periodo comprendido de enero-mayo 2014. El objetivo fue aislar un cultivo puro de levadura por métodos normalizados y determinar su viabilidad para ser utilizados en procesos de interés biotecnológico. Se realizaron prácticas que comprendían las técnicas de diluciones mediante la NOM-110-SSA1-1194 a partir de un cultivo mixto, la técnica de vaciado en placa y conteo en base a la NOM-092-SSA1-1994, identificar levaduras macroscópica y microscópicamente, primeramente desde la caja Petri se observa por encima del medio, con una textura cremosa y microscópica dando su morfología ovoidea característica de la levadura para después resembrar en un medio puro para obtener un cultivo puro para fines de análisis microbiológicos, tales como conteo para la curva de crecimiento, las levaduras se contaron en la cámara de Neubauer y se midió absorbancia en el espectrofotómetro así como también se le realizo la tinción Güstein donde los resultados obtenidos fueron Azules 52.53% y Rojas-Rosas 47.45%. Se concluye que se logró el aislamiento de la levadura más sin embargo no es viable en base a los resultados obtenidos en la tinción Güstein para ser utilizado en un proceso biotecnológico.

Introducción. El hombre utilizado las levaduras desde hace muchos siglos para aprovechar sus usos como la fermentación y además para sintetizar ciertas vitaminas. Se encuentran en difundidas en la naturaleza se encuentran en frutas granos, aire, piel eh intestino de animales. Las levaduras son organismos heterótrofos lo cual consiguen su energía mediante el carbono y depende de plantas superiores y de los animales para obtener su energía por medio de desasimilación de oxidante aerobia o por la fermentación anaerobia de los azucares. Algunas son saprofitas y otras son parasitas. Las levaduras están agrupadas en unas 350 especies (las cuales se dividen en 39 genero) se presentan en forma unicelulares o micelios (monocelulares) de formas muy variadas desde esféricas, ovoides y elipsoidales como Saccharomyces cerevisiae (globosa a elipsoidal) y Saccharomyces elipsoides (elíptica). Dependiendo de las condiciones del medio influyen en los hongos para su crecimiento como filamentos o levadura depende de la cantidad de agua, el nivel de pH, temperatura optima de

reproducción y tanto el oxigeno como la ausencia de oxigeno (aerobias y anaerobias). Las células de la levadura son relativamente grandes, miden entre 1-5 micras de ancho por 3-5micras de largo. Las levaduras no poseen flagelos u otro tipo de órgano de locomoción y de reproducen vegetativamente por gemación o fisión binaria, y sexualmente por producción de esporas. Por lo tanto las levaduras han sido de gran uso al ser humano por su habilidad de fermentar azucares utilizados en la industria para la producción de alcohol. Sin embargo también se encuentran levaduras que pueden producir enfermedades en los seres humanos, por lo tanto se han aplicado una serie de análisis para detectar el tipo de microorganismo que quiere identificar.

Ilustración 1. Levadura vista microscópicamente

Objetivo El objetivo fue aislar un cultivo puro de levadura por métodos normalizados y determinar su viabilidad para ser utilizados en procesos de interés biotecnológico

una caja de la muestra 10-1 después agregó agar nutritivo el cual se mezcló perfectamente dando 8 giros hacia la derecha y 8 giros hacia las izquierda y movimientos hacia arriba y abajo, esto para todas las diluciones y posteriormente de solidificar el agar se llevó a incubar a 35 + 2°C durante un tiempo de 24-48hrs para realizar un conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Conteo

Ilustración 2. Observación al microscopio

Después de incubar las cajas Petri con las diluciones del cultivo mixto de 10 -1,10-2,10-3, 10-4,10-5, se realiza un conteo en cada una de las cajas, primeramente a las 24 horas y después a las 48 horas para así después pasar a la identificación de la levadura, tomando en cuenta lo mencionado por la Norma de tomar las cajas que están en el rango de 25 a 250 UFC/mL.

Metodología.

Identificación

Este trabajo de llevo a cabo en laboratorio de microbiología LV-513 del Instituto Tecnológico de Sonora campus Nainari en el periodo de Enero a Mayo del 2014.

La identificación de la levadura primeramente se observó la caja Petri y se buscó un colonia que estuviera por encima del medio, con una textura cremosa y de color blanca, cuando ya se cree que es una levadura para confirmar los datos, se realizó una tinción simple, la cual con una asa estéril se toma muestra de la colonia y se realiza el frotis y se agrega un colorante y se seca y se observa a 10x, 40x y 100x.

Diluciones. Se realizaron diluciones conforme lo indica la NOM-110-SSA1-1994 en las cual el objetivo era realizar bajar la carga microbiana partiendo de un cultivo mixto proporcionado por el maestro y en una gradilla con 5 tubos con 9 mL de agua destilada y enumerados del 1 al 5 según su número de dilución, se tomó 1 mL del cultivo mixto previamente mezclado perfectamente 30 veces en un Angulo de 45° y se colocó a 9 mL de agua destilada estéril siendo este 10-1, con una pipeta estéril, después de mezclar perfectamente , se colocó 1ml en el tubo 2 y así sucesivamente hasta llegar al tubo 5 realizando una perfecta dilución. Después se vació en placa como lo marca la NOM-092-SSA1-1994 utilizando 5 cajas en la cual se pasó 1 mL con una pipeta estéril a

Resembrar Al ya confirmar que es una levadura, se resembro por estrías por agotamiento en un medio con mayor selectividad para levaduras como lo indica la NOM-11-SSA1-1994 que es el Extracto de Malta, para así aislar colonias de levaduras para su posteriores análisis. Curva de Crecimiento Una vez que se obtuvo el cultivo puro de levadura, se inoculo por doble asada en un tubo de ensayo con 10 mL de Caldo Extracto de Malta para pasar a un matraz de 500 mL

con un contenido de 250 mL de Caldo Extracto de Malta. Una vez en el matraz se le se inició el conteo de células vivas mediante la cámara de Neubauer con finalidad de llevar acabo la curva de crecimiento de las levaduras de igual manera la curva de absorbancia, en un tiempo determinado de 24 hrs con intervalos de tiempo de 2 hrs cada conteo. Tinción Güstein Para determinar la viabilidad de la levadura se realizó la técnica de Tinción de Güstein. Del cultivo puro obtenido de levadura aislada se realizó un frotis al cual se le añadió azul de metileno al 1% dejando actuar durante 4 minutos sobre el frotis, se enjuago con agua destilada por 30 segundos; como siguiente paso se añadió acido tánico al 5% dejando actuar durante 2 minutos y se enjuago de igual manera con agua destilada; por último se añadió safranina al 1% por 1 minuto y finalmente se enjuago con agua destilada, prosiguiendo a observar en microscopio (Ilustración 3).

Tabla 1. Viabilidad en tinción Güstein.

Color Células Viabilidad Azul intenso 36.72% Azul claro 15.81% Rojo 19.77% Rosa 27.68% Dando así un porcentaje de Viabilidad del 52.52%, el cual es una viabilidad muy bajo para poder ser utilizada en una proceso biotecnológico, debería de andar arriba del 85-90% aproximadamente. En el análisis de la curva de crecimiento en base a la cámara de Neubauer y la absorbancia del espectrofotómetro, nos arrojó los siguientes resultados que se muestran en la tabla 2: Tabla 2 Los graficos los podemos observar en las siguientes graficas 1 y 2, cámara de Neubauer y Absorbancia respectivamente.

Ilustración 3. Tinción Güstein.

Resultados.

Gráfica 1. Curva de crecimiento cámara de Neubauer

Se obtuvo un cultivo puro de levaduras a partir de la mezcla de microorganismos proporcionada por el maestro, que fue identificada por su morfología macroscópica y microscópica mediante la tinción simple, donde se observó la morfología ovoidea y elipsoidal característica de la levadura. En el conteo de mesofilos aerobios y levaduras el resultado fue de: Para la tinción Güstein como se muestra en la tabla 1, se obtuvo un resultado de: Gráfica 2. Absorbancia

SSA1-1994, para la obtención de un cultivo puro.

Conclusión. Según a los resultados obtenidos se llegaron a las siguientes conclusiones, en el presente trabajo se identifico y se dio a conocer las características morfológicas, fisiológicas y de reproducción de una levadura, tanto como su comportamiento en diferentes medio. Por medio de diferentes técnicas implementadas como las diluciones con los procedimientos como lo marca la NOM-111-

Se determinó el crecimiento de las levaduras con la cámara de Neubauer para el conteo de la curva de crecimiento y su absorbancia mediante el espectrofotómetro. Así como su viabilidad mediante la técnica de la Tinción Güstein. Referencias Bibliográficas