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LA VALIDACIÓN EN LA INDUSTRIA

Curso on line Beatriz Soledad

Contenido INTRODUCCIÓN................................................................................................7 MÉTODOS DE VALIDACIÓN.......................................................................11 MÉTODOS ANALÍTICOS....................................................................................11 Exactitud......................................................................................................13 Precisión......................................................................................................14 Especificidad...............................................................................................14 Límite de detección......................................................................................15 Límite de cuantificación..............................................................................15 Linealidad....................................................................................................15 Rango..........................................................................................................15 Robustez......................................................................................................16 Rudeza.........................................................................................................16 Estudios Colaborativos.............................................................................................................16

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS.........................................................................18 Ensayos Microbiológicos Cualitativos........................................................21 Características de operación..........................................................................................................22 Exactitud...................................................................................................................................22 Recuperación............................................................................................................................22 Curva de Calibración................................................................................................................22

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Linealidad.................................................................................................................................23 Limites de detección.................................................................................................................23 Limite de cuantificación y detección.........................................................................................23 Precisión...................................................................................................................................23

Ensayos Microbiológicos Cuantitativos......................................................29 Características de rendimiento.......................................................................................................30 Exactitud...................................................................................................................................30 Recuperación............................................................................................................................30 Curva de Calibración................................................................................................................30 Linealidad.................................................................................................................................30 Limite de detección...................................................................................................................31 Limites de cuantificación y determinación................................................................................31 Precisión...................................................................................................................................31

PROCESOS DE FABRICACIÓN............................................................................36 Tipos de validación......................................................................................37 Prospectiva....................................................................................................................................38 Concurrente...................................................................................................................................38 Revalidación.................................................................................................................................39 Retrospectiva.................................................................................................................................39

Planificación de los estudios de validación................................................39 Prioridad de los productos y/o sistemas a validar..........................................................................40

Revalidación................................................................................................40 Elementos básicos para organizar con éxito un programa de validación. .41

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Implicación de la Dirección...........................................................................................................41 Creación de un Comité de Validación............................................................................................41 Formación de un Equipo de Trabajo Multidisciplinario................................................................41

Etapas en la validación de un producto o un proceso................................41 Plan Maestro de Validación...........................................................................................................42 Calificación del Diseño (DQ)........................................................................................................42 Calificación de la Instalación (IQ).................................................................................................42 Calificación Operacional (OQ)......................................................................................................42 Calificación del Funcionamiento (PQ)..........................................................................................42

Bibliografía.........................................................................................................43

PROLOGO

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El e-learning es el aprendizaje asistido por tecnologías de la información y fomenta el uso intensivo de las Tecnologías de Información y Comunicación facilitando la creación, adopción y distribución de contenidos, así como la adaptación del ritmo de aprendizaje y la disponibilidad de las herramientas de aprendizaje independientemente de límites horarios o geográficos. Esto permite que el alumno intercambie opiniones y aportes a través de las TIC. Human Capital Solutions conceptualiza el e-learning como: ”Es educación disponible a través de tecnología”. Un estudiante puede ser co-instructor de otros estudiantes a la par de irse perfeccionando en sus conocimientos Este sistema está dirigido a personas que desean ampliar sus destrezas sin necesidad de interrumpir sus actividades o gastar tiempo en largos traslados, por lo que las personas se pueden capacitar sin desplazarse de su lugar de trabajo, ni interrumpir su horario. Las ventajas del e-learning son las siguientes: Flexibilidad de estudio de acuerdo a su disponibilidad de tiempo Acceso las 24 horas del día, todos los días, desde cualquier lugar. Seguimiento personalizado con respuesta en menos de 48 horas a tus

consultas,

dirigiéndote

[email protected]. Interacción con participantes de todo el mundo

5

a:

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INTRODUCCIÓN

La calidad de los productos de una empresa es de suma importancia tanto para su prestigio como para su desarrollo económico. Atendiendo a esta necesidad, diversas instituciones tales como la Food and Drug Administration (FDA),

ISO 9000,

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las

Buenas Prácticas de

Manufactura (Good Manufacturing Procedures (GMP´s)) la Food and Agricultura Organization of the United Nation (FAO) y los Buenos Procedimientos de Laboratorio (Good Laboratory Procedures (GLP´s)) han venido formulando diferentes programas y parámetros para lograr el aseguramiento de la calidad de los distintos productos que elaboran las empresas. En tal sentido, el control estadístico de calidad tiene como objetivo monitorizar de forma continua, mediante técnicas estadísticas, la estabilidad del proceso, y por medio de los gráficos de control este análisis se efectúa de forma visual, representando la variabilidad de las mediciones para detectar la presencia de un exceso de variabilidad no esperable por puro azar, y probablemente atribuible a alguna causa específica que se podrá investigar y corregir. El proceso de validación exige el tratamiento estadístico para el manejo y análisis de los datos permitiendo juicios

con criterio que llevan

a una

correcta evaluación. Para hablar de validación, es necesario conocer

su

significado: En 1987, la FDA la define como: “La evidencia documentada que provee un alto grado de seguridad en que un proceso especifico producirá en forma consistente, un producto con las especificaciones y atributos de calidad predeterminados.” La Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales, 2001, la define como

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“Es el acto de demostrar y documentar que el procedimiento opera efectivamente”. A través de un sistema de validación se recogen y analizan las evidencias que sustentan la completa eficiencia de un proceso. Esto asegura que el producto resultante de dicho proceso tecnológico posee los atributos y características con las que fue diseñado y que estas se mantengan de lote a lote a través de la producción. En este punto es necesario comprobar que todos los elementos y operaciones involucradas en el proceso productivo, han sido diseñados y/o seleccionados adecuadamente para el fin propuesto. Es necesario validar todos los recursos operacionales involucrados en el proceso de manufactura de un producto. En una primera etapa se evalúan todos los recursos operacionales que pueden introducir variaciones en el proceso productivo como los materiales, los equipos, los métodos y desde luego el personal. En cuanto a los materiales se consideran tanto las materias primas como los materiales de envase y empaque utilizados en la elaboración. Es por ello importante verificar que los materiales se encuentran dentro de los límites establecidos. También se incluyen los equipos, instrumentos y aparatos que son utilizados tanto en el proceso productivo como en los métodos de análisis; a los cuales es importante evaluar para determinar las variaciones potenciales que pueden ocurrir durante el proceso de manufactura; además de su calibración y mantenimiento preventivo periódico.

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Con el propósito fundamental de asegurar que el proceso productivo se encuentra bajo control, es necesario contar con procedimientos escritos para todas las operaciones que se realizan. Esto incluye tanto las operaciones de producción, como los procesos de control de calidad. Finalmente se debe incluir todo el personal involucrado con la ejecución del proceso productivo, su adecuado entrenamiento, descripción clara de sus actividades, información detallada sobre vestimenta, equipos de seguridad y hábitos higiénicos, necesarios para la óptima realización del proceso de manufactura de un producto en particular. Una vez que el proceso productivo se encuentra optimizado, es necesario pasar a una segunda etapa la cual consiste en un sistema documentado que permite constatar la reproducibilidad de un proceso dado. Esto es lo que en términos generales se conoce como Validación de un Proceso.

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Métodos de validación En este capítulo se mostrarán diferentes métodos de validación utilizados con propósitos distintos los cuales se describen a continuación:

MÉTODOS ANALÍTICOS La validación de un método analítico es el proceso mediante el cual se establece por medio de estudios de laboratorio que las características representativas del método analítico cumplen con las especificaciones para su aplicación. Señala la Australian Pesticidas and Veterinary Medicines authority en

su Guía para la validación de métodos analíticos para constituyentes

activos, productos químicos para la agricultura y la veterinaria, que el objetivo de la validación de un método analítico es demostrar que el procedimiento, cuando se aplica adecuadamente, produce resultados que se ajustan al propósito del método. Las características típicas de ejecución que deberían considerarse en la validación de los tipos de métodos descritos se presentan en la Tabla 1.

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Tabla 1.- Características analíticas típicas usadas en métodos de validación. Exactitud Precisión Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Linealidad Rango Robustez Rudeza

En el caso de métodos compendiados, puede ser necesaria la revalidación en los siguientes casos: una propuesta de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) de un método analítico revisado, o el uso de un método general establecido con un nuevo producto o materia prima. Según la FAO (1997), en un reporte sobre la validación de métodos analíticos para el control de alimentos “Un método validado ideal es aquel que ha progresado completamente a través de un estudio colaborativo, de acuerdo con los protocolos internacionales armonizados para el diseño, conducción e interpretación del funcionamiento de los métodos estudiados”. Esto usualmente requiere un estudio en el cual se involucre en el diseño un mínimo de 5 métodos de ensayo, la participación de 8 laboratorios que

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reporten datos válidos y más frecuentemente incluyan réplicas ciegas que aseguren los parámetros de repetibilidad de los ensayos entre laboratorios. Los documentos ICH (International Conference on Harmonization: Informe de Seguridad de la Conferencia Internacional de Armonización (cuyas siglas son ICH en inglés y CIARM en español)) dan una guía sobre la necesidad de revalidación en las siguientes circunstancias: Cambios en la síntesis de la sustancia o del principio activo, cambios en la composición del producto o del medicamento y cambios en el procedimiento analítico. Estas características representativas se expresan en términos de parámetros analíticos, que son los siguientes:

Exactitud. Definición: es el acercamiento de los resultados experimentales obtenidos, al valor verdadero. Se expresa como el porcentaje de recuperación por el ensayo de cantidades conocidas adicionadas al analito. Los documentos ICH recomiendan que la exactitud debe ensayarse usando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de

concentración,

cubriendo

un

rango

especificado

(esto

es,

tres

concentraciones y tres réplicas de cada concentración).

Precisión Definición: La precisión de un método analítico se refiere al grado de concordancia entre los resultados individuales de la prueba, cuando el procedimiento se aplica repetitivamente a muestras múltiples o a una muestra homogénea.

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Los documentos IHC recomiendan que la repetibilidad debería ensayarse usando un mínimo de nueve determinaciones cubriendo el rango especificado para el procedimiento (esto es tres concentraciones y tres réplicas de cada concentración o usando un mínimo de seis determinaciones a 100 % de la concentración del análisis).

Especificidad. Definición: El documento IHC, define especificidad como la habilidad para evaluar inequívocamente el analito en presencia de los componentes que se espera que estén presentes, así como impurezas, productos de degradación, y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analítico puede ser compensada por otro procedimiento analítico de soporte. Otras autoridades internacionales (IUPAC, AOAC) han preferido el término “selectividad” reservando “especificidad” para aquellos procedimientos que son completamente selectivos. Para los métodos de prueba o ensayo a continuación, la definición anterior tiene las siguientes implicaciones:

Límite de detección Es un parámetro de prueba límite. Es la concentración más baja a la cual puede detectarse el analito, pero no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones experimentales establecidas.

Límite de cuantificación Es un parámetro para ensayos cuantitativos de bajos niveles de compuestos en matrices de muestras, tales como impurezas en muestras activas o productos de degradación en productos terminados. Es la

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concentración de muestra en un analito que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones experimentales establecidas.

Linealidad Es la habilidad del método para obtener resultados en la prueba proporcionales a la concentración del analito en muestras dentro de un rango dado que resultan directamente o mediante una transformación matemática bien definida. Generalmente se expresa en términos alrededor de la pendiente de regresión lineal, calculada de acuerdo a una relación matemática establecida de los resultados obtenidos de la prueba al analizar muestras de concentración variable al analito.

Rango Es el intervalo entre el nivel más alto y más bajo del analito en el que se ha demostrado que puede ser determinado con exactitud, precisión y linealidad, tal y como lo indica el método. Normalmente se expresa en las mismas unidades que los resultados de la prueba en el método analítico.

Robustez Definición: es la medida de la capacidad de un método analítico para permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proporciona un índice de su confiabilidad durante su uso.

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Rudeza Definición: es el grado de reproducibilidad de los resultados de la prueba obtenidos por el análisis de una misma muestra bajo una variación de las condiciones normales de prueba, tales como diferentes laboratorios, analistas, ensayos, temperaturas, lotes de reactivos, días, etc. Es una medida de la reproducibilidad de los datos de la prueba bajo las condiciones operacionales normalmente esperadas de laboratorio a laboratorio y de analista a analista. La evaluación o no de los parámetros arriba mencionados dependerá del tipo de información que se quiera obtener de dicha validación, es decir del objetivo perseguido. Según la Food and Drug Administration (FDA) 2000. en “Guía para la Industria”, se tienen distintas características de validación para varios tipos de ensayos.

Estudios Colaborativos Se realizan estudios colaborativos para evaluar la precisión intermedia (Ej. equipos diferentes, analistas, días). También se utilizan los estudios colaborativos para evaluar la variabilidad entre laboratorios (esto es la reproducibilidad), en este caso un procedimiento analítico es usado en más de un laboratorio si se compara y evalúa la precisión y exactitud de dos procedimientos analíticos (Ej. procedimientos analíticos regulatorios y un procedimiento analítico alternativo). Al

planificar

un

ensayo

colaborativo,

se

debe

considerar

un

procedimiento de operación estándar adecuadamente escrito, el número de variables a ser ensayadas y el número de réplicas requeridas (Standard methods for the examination of water and wastewater, 1998)

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Cuando se realizan estudios colaborativos, deben utilizarse, si es posible,

muestras

homogéneas

del

mismo

lote.

Deben

analizarse

estadísticamente los resultados comparativos, discutirse y explicar cualquier anormalidad, el número mínimo de laboratorios es de 8 y sólo en casos especiales en los cuales se utiliza equipos muy costosos pueden conducirse estudios con un mínimo de 5 laboratorios. En el caso de análisis cualitativos, es necesario un mínimo de 10 laboratorios (AOAC INTERNATIONAL. Apéndice D. 2002).

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MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

La importancia de la microbiología clínica, de alimentos, de productos medicinales, de la calidad del agua, entre otros, tiene su fundamento en que los microorganismos y sus productos, especialmente los componentes de la pared celular, las enzimas y las toxinas, pueden causar infecciones en humanos y animales. Los productos medicinales deben ser particularmente seguros porque ellos usualmente son suministrados a personas enfermas, débiles y ancianos, que generalmente tienen el sistema inmune comprometido y no son capaces de responder a una infección severa. Los métodos microbiológicos convencionales están basados en el cultivo y crecimiento sobre un agar, pudiéndose caracterizar a la colonia después de 24 horas de incubación. Los ensayos de Gram y los ensayos clásicos de identificación han sido exitosos en los últimos 150 años. Los métodos encontrados en las farmacopeas consumen generalmente mucho tiempo; el ensayo de esterilidad toma 14 días, el crecimiento y detección de Mycoplasma, toma 35 días y el cultivo de la Mycobacterium toma 56 días. Es por ello que se presenta la necesidad de validar métodos alternativos, por lo general más rápidos, y se hace imprescindible demostrar

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que el método mida sólo eventos ciertos y no proporcione falsos positivos, por lo que es preciso plantearse y responder a las siguientes preguntas: ¿Está algo ahí? (Ensayo cualitativo) ¿Cuánto hay ahí? (Ensayo cuantitativo) ¿Qué hay? (Ensayo de identificación) Otra dificultad surge porque en la USP 26, (2003),

en el apartado

(1225) relativo a “Validación de Métodos Alternativos” los documentos usan términos familiares como linealidad, robustez, límite de detección; sin embargo la definición de estos términos se relacionan mas con la química analítica, que con la microbiología. En consecuencia, los datos generados algunas veces son difíciles de interpretar. (Sutton, S. 2005).

En G-ENAC-04 (2002), se señala que la validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. Esto puede conseguirse utilizando productos contaminados naturalmente o productos inoculados con un nivel conocido de microorganismos contaminantes. El analista debe estar consciente de que la inoculación de una matriz con microorganismos contaminantes imita tan sólo de una manera parcial la presencia de contaminantes naturales. No obstante, a menudo es la mejor y la única solución disponible. La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su aplicación. El laboratorio debe validar los métodos normalizados aplicados a matrices que no se especifiquen en el procedimiento normalizado.

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Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como aquellos en los que el resultado se expresa en términos de detectado/no detectado, y los procedimientos de confirmación e identificación, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial, repetibilidad y reproducibilidad En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una

variabilidad

establecida

y,

en

caso

necesario,

determinar

cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados.

Incertidumbre de la medida Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de los ensayos que no permiten realizar un cálculo riguroso, metrológica y estadísticamente válido de la incertidumbre de medida. En general, puede ser apropiado basar la estimación de la incertidumbre en datos sobre la repetibilidad y la reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es incluir los sesgos (p. Ej., los sesgos detectados como resultado de la participación en ensayos

de

aptitud).

Los

distintos

componentes

individuales

de

la

incertidumbre deben identificarse y demostrar que están bajo control y evaluar su contribución a la variabilidad de los resultados. Algunos componentes como los efectos del pipeteado, el pesado y las diluciones,

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pueden medirse

directamente y evaluarse fácilmente para demostrar que realizan una contribución insignificante a la incertidumbre global. Otros componentes, como la estabilidad y preparación de las muestras, no pueden medirse directamente y su contribución tampoco puede evaluarse por métodos estadísticos, pero debe considerarse también su importancia en la variabilidad de los resultados. La AOAC INTERNATIONAL (1999), en Qualitative and Quantitative Microbiology Guidelines for Methods Validation, y posteriormente en una comunicación técnica de Feldine, P

et al, 2002., sobre una guía para la

validación de métodos de análisis oficiales microbiológicos para alimentos tanto cualitativos como cuantitativos, se ofrece una guía para los siguientes ensayos:

Ensayos Microbiológicos Cualitativos En esta sección se presentan ensayos para la presencia-ausencia de los métodos de detección de microorganismos en las matrices de alimentos. Sin embargo puede formar las bases para una matriz no alimenticia como productos

relacionados

con

drogas,

preservación

cosmética,

eficacia

microbiológica de desinfectantes y equipos de identificación microbiana.

Características de operación Exactitud Se define como muestras conocidas que contienen un analito microbiano que es correctamente identificado por el método ensayado.

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Pueden utilizarse muestras de referencia inoculadas si están disponibles y son aplicables.

Recuperación No puede ser estimada para métodos microbiológicos cualitativos a muy bajos niveles, porque la cuantificación a estos niveles no es precisa. Por esto se estima comparando la proporción de recuperación positiva con las obtenidas en paralelo con un método convencional reconocido, normalmente un método ilustrativo de la AOAC o con los esperados de varios niveles de inoculación siguiendo la distribución de la ecuación de Poisson. La homogeneidad de la muestra es crucial para una adecuada estimación de la recuperación.

Curva de Calibración En microbiología cualitativa, la respuesta es típicamente no lineal (sigmoidal) La respuesta de Poisson o alternativamente la respuesta en la referencia opcional del método de cultivo puede usarse para la calibración.

Linealidad No es aplicable.

Limites de detección Estos términos no son exactamente aplicables

Limite de cuantificación y detección.

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Este bajo nivel se conoce como el resultado de alrededor de 40 verdaderos negativos. La interferencia en la microflora de la matriz que es relativamente resistente a los agentes selectivos usados en el medio de enriquecimiento, así como a otros factores, pueden afectar los valores observados.

Precisión Es definido en términos de repetibilidad, reproducibilidad, y las consideraciones asociadas a positivo o negativo. Las diferentes matrices y los diferentes analitos son considerados como fuentes primordiales de variación. Repetibilidad Intralaboratorio.

Cada nivel preferiblemente

5)

en el cual se agregan cepas (al menos 3, pero debe

ensayarse

al

menos

en

pentuplicado

y

preferiblemente con 10 replicas por nivel. Si en un estudio preliminar del Protocolo de validación (PVM) se obtiene un status OMA (Método oficial), el número de replicas por nivel debe incrementarse a 20 con tres niveles de inclusión de cepas (bajo, alto y sin pinchar) Reproducibilidad Interlaboratorios.

Debe validarse en un mínimo de dos laboratorios, preferiblemente con diferentes lotes de cada matriz. Cada nivel en el que se agregan cepas ( al menos 3, pero preferiblemente 5) debe ensayarse al menos en pentuplicado y preferiblemente con 10 replicas por nivel La variabilidad de la matriz del lote es importante debido al potencial competitivo de la microflora de lote a lote.

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Falsos negativos y falso positivos

Siguiendo

el

método

oficial

de

procedimiento

de

estudio

precolaborativo, la siguiente tabla está basada en la asignación de la respuesta del método a la presencia o ausencia del analito determinada por inoculación o la metodología de referencia. Sensitividad

Para las condiciones de ensayo especificadas, la sensitividad representa la proporción de las muestras de ensayo que contiene el analito y responde positivamente al ensayo. Especificidad.

Para

condiciones

de ensayo determinadas, la especificidad es la

proporción de las muestras de ensayo que no contienen el analito, y responden negativamente al ensayo. Ensayo de Rudeza

Se deja a discreción el estudio del efecto de pequeños cambios en el medioambiente sobre un método de ensayo microbiológico (Ej. Temperatura de incubación). Comparación con métodos de referencia existentes.

Opcionalmente, los resultados del método de estudio pueden compararse con los resultados obtenidos por un método de cultivo convencional

usando

muestras

analíticas

de

la

misma

porción

.

Alternativamente, es preferible incrementar el alcance de las matrices y/o lotes de cada tipo de matriz que va a ser examinado por el método de ensayo.

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Cuando se tiene una matriz particularmente difícil, vale la pena utilizar el método de comparación.

Parámetros

adicionales

para

métodos

cualitativos

microbiológicos. Matrices de muestra.

Se refiere a los métodos microbiológicos recomendados para alimentos y grupos de alimentos. Debe escogerse matrices donde el microorganismo crezca. Se requieren una o mas matrices diferentes por categoría de alimentos. En un método oficial de estudio cualitativo precolaborativo, se requieren 20 matrices si la aplicabilidad se atribuye para todos los alimentos y 5 matrices si la aplicabilidad es para una sola categoría de alimento. Se requiere un número intermedio de matrices si la aplicabilidad es menor a todos los alimentos pero mayor a una categoría de alimentos. Microorganismos analitos.

En estudios precolaborativos oficiales, se usan diferentes cepas para diferentes matrices. El analista debería investigar previamente las cepas candidatas, bien empíricamente o bien sobre las bases de los datos de la literatura. Generalmente, como en los estudios precolaborativos de métodos oficiales, no se recomienda el añadir cepas con mezclas debido a las interacciones potenciales entre cepas. Idealmente deberían ensayarse una variedad de cepas (serotipos, etc.) de los microorganismos analitos. Cada matriz debería ser ensayada con al menos una cepa aislada de la matriz, esto es uno de sus contaminantes naturales. Se ha sugerido que una amplia selección de serotipos sea estudiada.

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Estado de estrés del microorganismo analito

La cepa puede ser usada sin estrés o estresada, según sea lo apropiado. Los tratamientos de estrés deberían ser descritos cuantitativamente en términos de parámetros medioambientales, tiempo de exposición, fracción sobreviviente de la población estresada, y la fracción de sobrevivientes exhibiendo un nivel de injuria operacionalmente definido. Pueden utilizarse células del analito, en muestras naturalmente contaminadas, pero el grado de estrés generalmente será desconocido. En estudios precolaborativos de métodos oficiales, en las muestras almacenadas “a condición” se simula el estrés al cual los microorganismos pueden estar sujetos en una matriz particular; para alimentos secos se usan inóculos secos y se usan inóculos húmedos para alimentos húmedos. Se recomienda que cuando se cuenta un inóculo sobre un medio no selectivo, se debe hacer un recuento paralelo sobre un medio selectivo apropiado para estimar el posible estrés entre la población del inoculo. Niveles de agregado de microorganismos

Cada cepa es usada a un mínimo de 3 niveles por muestra analítica (25 g/mL): 1–10 ufc (unidades formadoras de colonias); 10–50 ufc ; blanco: sin adición. Pero pueden usarse más niveles al igual que en estudios precolaborativos no oficiales. La cepa debería cuantificarse al momento de la inoculación por el número mas probable (NMP) o por el conteo de colonias de suspensiones inoculantes de bajo nivel las cuales pueden realizarse con mas exactitud si las replicas son suficientemente altas, por ejemplo 50 – 100 ufc. En contraste, el conteo de NMP en 3 y 5 tubos tienen un amplio límite de confianza

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Microflora Interferente

Opcionalmente, la mayor variable lote a lote de la matriz alimenticia, puede ser ensayada con un competidor a un nivel que de justo un efecto adverso medible con el medio de cultivo selectivo convencional. El analista debería preensayar candidatos competitivos adecuados para escoger un solo competidor competitivo por la microflora. No se recomienda el uso de una mezcla de cepas, típicamente con habilidades competitivas no caracterizadas. Para distinguir los efectos de los competidores a partir de los efectos de la microflora de la matriz incurrida, el ensayo de competición debe ser corrido en ausencia de una matriz alimenticia o con una matriz esterilizada, tan lejos como las consideraciones puedan ser hechas para cualquier sustancia inhibitoria inducida por el proceso de esterilización. La matriz de microflora natural puede ser de valor en la evaluación competitiva tan lejos como la porción de microflora que es verdaderamente competitiva sea estimada por conteo de placas

sobre un medio sólido hecha de un medio selectivo

proanalito usado en la metodología del ensayo. Pero esta porción debería representar solamente la población

potencial competidora porque esta no

toma en cuenta las velocidades de crecimiento

de sus constituyentes

individuales. Criterios de aceptación.

Deben establecerse criterios para establecer el punto de partida de una matriz tipo dada. A niveles bajos del inóculo, (