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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental

PROYECTO DE INVESTIGACION AISLAMIENTO, SELECCIÓN E IDENTIFICACION DE RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS DE MAIZ CON CAPACIDAD FUNGICIDA FRENTE A FUSARIUM SP.

INTEGRANTES • De la Cruz Mendivil, Gabriela • Espinoza Calsina Franco • Inga Espinoza Angelo • Laveriano Flores, Will • Liñan Lorenzo, Karen • Obregón Obregón Miguel  Socualaya Castillo, Oliver

DOCENTE: MARTINEZ, Martin

Lima, Perú 2018

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INDICE LUGA DE EJECUTACIÓN DEL MUESTREO ......................................................................................................3 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES..................................................................................................................4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................................5 HIPOESIS .......................................................................................................................................................6 OBJETIVOS ....................................................................................................................................................6 

OBJETIVO GENERAL .........................................................................................................................6



OBJETIVO ESPECÍFICOS ....................................................................................................................6

MARCO TEÓRICO ..........................................................................................................................................6

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LUGA DE EJECUTACIÓN DEL MUESTREO



Lugar de donde se trajo la muestra de rices y arena del maíz: Picapiedra, Pachacamac.

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES SEMANA Reunión del equipo de trabajo

MAYO 1

2

3

JUNIO 4

5

1

2

3

4

5

Recopilación de información Determinación dela metodología del proyecto Solicitud de laboratorio y de algunos medios Obtención de la planta de maíz Preparación de medios Aislamiento de Bacillus sp Aislamiento de Actinomycetes Preparación de algunos medios no encontrados en el laboratorio

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Existen varias y distintas industrias que necesitan el producto del cultivos de maíz, este cereal al crecer sin ninguna dificultad y desarrollarse con gran cantidad de nutrientes permite obtener de este cultivo gran aprovechamiento para distintos insumos, las cuales permitirán generan grandes ganancias al inversionista, desafortunadamente esto no siempre ocurre así, ya que, en dicho cultivo se pueden presentar varios factores que intervienen en el crecimiento de la planta, esto se puede evidenciar en su fruto, uno de los factores son los distintos tipos de plagas; como por ejemplo, la pudrición del maíz por causa del hongo Fusarium moniliforme. Estos tipos de plaga ocasionan grandes pérdidas económicas y sobrecostos en la producción de los mencionados cultivos; ya que, las industrias se ven en la necesidad de comprar fungicidas químicos para controlar la plaga, aun sabiendo que son recalcitrantes para el ecosistema y generan un gran impacto ecológico. Además, estos tipos de plaga también ocasionan un rechazo por las instituciones internacionales al disminuir la calidad del producto.

Usando un método alternativo al cual no se requiera el fungicida químico, es usando la rizobacteria que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de la Fusarium sp que daña los cultivos de maíz, otro beneficio de gran importancia proporcionada por la rizo-bacteria es la fijación de nutrientes desde la raíz, dándole así, además de protección contra el hongo de Fusarium sp una mayor calidad a los frutos de dichos cereal.

En conclusión, la utilización de fungicidas químicos para combatir las plagas son de una u otra manera perjudiciales para la salud de quienes los consumen, ya que, las plagas generan un mal desarrollo de los cereales, dando una pésima calidad, así como una pérdida económica para el empresario; además, para combatir estas plagas se emplea los fungicidas químicos, que también presentan un aspecto negativo; ya que poseen en su composición contaminantes que dañan a corto o largo plazo la salud de quienes los consumen. Para evitar la pérdida de cultivo por plaga y contaminación por fungicidas químicos, se vio en la necesidad de desarrollar un método que pueda cumplir con las tres metas: la de proteger los cultivos de las plagas de hongo por Fusarium sp, la de no contaminarlos con fungicidas químicos, y darle un mecanismo que aumente la calidad de los cultivos de maíz. Por lo dicho anteriormente, nos surge la necesidad de responder a la siguiente interrogante:

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¿Las rizo-bacterias son promotoras de crecimiento y a la vez fungicidas frente al hongo Fusarium sp en los cultivos de maíz?

HIPOESIS

ჶ Demostrar la actividad anti fúngica de las Rizobacterias frente a la presencia de Fusarium sp. ჶ Determinar si las Rizobacterias son promotoras de crecimiento para las plantas de maíz. OBJETIVOS



OBJETIVO GENERAL

 Aislamiento, selección e identificación de rizobacterias promotoras de crecimiento en cultivos de maíz con capacidad fungicida frente a fusarium sp.



OBJETIVO ESPECÍFICOS



Aislar los microorganismos del suelo rizosférico en cultivo de maíz.



Determinar la presencia de Bacilus sp y Actinomycetes.



Emplear los microorganismos aislados dela rizosfera para comprobar la actividad anti fuñica contra el Fusarium sp.



Comprobar la capacidad promotora de crecimiento vegetal de las rizobacterias.

MARCO TEÓRICO 

RIZOBACTERIAS

Promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), se ha venido implementado el uso de los microorganismos benéficos del suelo, que pueden promover el crecimiento de las plantas y también evitar la infección del tejido vegetal por patógenos, estos son denominados PGPR (plant growth promoting rhizobacteria; rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal). Estos microorganismos pueden encontrarse en asociaciones simbióticas o de vida libre.

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Estos últimos están asociados a las partículas del suelo generando interacciones con las raíces de las plantas, en la zona de la rizósfera (Peña y Reyes, 2007).

Los primeros trabajos para la inoculación de semillas fueron realizados en Rusia en 1930. A finales de la década de las 70, Kloepper y colaboradores fueron los pioneros en introducir el término PGPR para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benéfico en las plantas. Recientemente, la denominación se ha extendido a microorganismos PGP para incluir hongos y cualquier organismo afín (Vessey, 2003).

Dentro de los mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal encontramos dos tipos, mecanismos directos e indirectos. Los mecanismos directos son aquellos en donde los microorganismos actúan sobre la planta. Dentro de estos encontramos la producción de promotores de crecimiento vegetal (también llamados fitohormonas), como auxina, giberelinas y citoquininas. La producción de estos metabolitos, también generan una mejor regulación de estomas, lo que evita su deterioro el cual está asociado a depresión del crecimiento y síntomas de marchitamiento en la planta. Ocasionan también un desarrollo radical más ramificado jugando un papel fundamental en la absorción del agua y en el mejoramiento de la nutrición al aumentar su acceso a los nutrientes en el suelo (Rivieros, 2008).

Adicionalmente, las PGPR pueden promover el crecimiento vegetal mejorando la disponibilidad de nutrientes en el suelo mediante solubilización de fosforo, fijación de nitrógenos y producción de sideróforos (Bobadilla y Rincón, 2008). Igualmente se ha demostrado que las rizobacterias ayudan a disminuir la resistencia a la conductividad hidráulica, lo cual les da a las plantas una mayor tolerancia a periodos de sequía (Rivieros, 2008). Los mecanismos indirectos son aquellos en donde el microorganismo es capaz de inhibir diferentes patógenos que interfieren con el desarrollo de la planta. Fitopatógenos como hongos y bacterias son neutralizados por diversos mecanismos, como competencia

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por espacio o nutrientes, o también producción de metabolitos antibióticos, secreción de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular de los patógenos (Reyes et al. 2008). También se ha evidenciado la producción de sideróforos los cuales se definen como moléculas pequeñas con cadenas laterales y grupos funcionales que les proporcionan alta afinidad para captar y concentrar iones férricos. Estas moléculas son producidas típicamente por bacterias, hongos y plantas monocotiledóneas en respuesta al estrés por concentraciones limitantes de hierro en el ambiente (Perez et al., 2007). Debido a que la biodisponibilidad de hierro es limitada en el suelo, la producción de sideróforos juega un papel importante en la competencia por este recurso, ya que, en general, los sideróforos producidos por bacterias tienen una mayor afinidad a este elemento que los producidos por hongos, limitando así a posibles patógenos (Compant et al., 2005). Otro mecanismo 17 indirecto es el incremento de la capacidad de respuesta sistémica de la planta frente a los patógenos (Vessey, 2003).

Imagen 2. Representación esquemática de los efectos fisiológicos provocados por cepas de microorganismos y posibles mecanismos de la bio-actividad

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 PSEUDOMONAS FLUORESCENS Esta

bacteria

es

un

cocobacilo

Gram

negativo, que se encuentra como saprófito en el suelo y es ampliamente conocido por ser una PGPR. Abundan en la superficie de las raíces, ya que son versátiles en su metabolismo

y

pueden

utilizar

varios

sustratos producidos por las mismas, pero no establecen una relación simbiótica con la

Imagen 3. Cepa de pseudomona fluorescens en la luz UV.

planta. Entre sus mecanismos de acción se

encuentran el aumento de la toma de agua y nutrientes por la planta, la solubilización de fosfatos, la producción de reguladores del crecimiento vegetal y el control biológico de patógenos, dado fundamentalmente por la producción de sideróforos, la antibiosis y la inducción de resistencia a la planta, mediante la producción de ácido salicílico, el cual actúa como una molécula de señalización que activa la ―resistencia sistémica inducida‖ (RSI) que es muy similar a la ―resistencia sistémica adquirida‖ (RSA) (Zhang et al., 2002).

 BACILLUS SP.

Estos microorganismos se caracterizan por ser bacterias Gram positivas con forma bacilar, aerobias estrictos o anaerobias facultativas que en

condiciones

estresantes

forman

una

endospora central, que deforma la estructura de la célula. Esta forma esporulada es resistente a las altas temperaturas y a los desinfectantes

Imagen 4. Fotografía de Bacillus Gram positivas

químicos corrientes. Esta bacteria es capaz

de generar un efecto benéfico en el crecimiento de las plantas por diversos mecanismos, en donde se encuentran la producción de sustancias antibióticas, producción de lipopéptidos que actúan como biosurfactantes, solubilización de fosfatos y reducción de enfermedades en las plantas (Kokalis-Burelle et al., 2006).

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

ACTINOMYCETES

Los actinomycetes son microorganismos ubicuos y se encuentran sobre la gran mayoría de sustratos naturales corrientes. Entre las propiedades más comunes de estos bacilos Grampositivos, se encuentra la tendencia a formar ramificaciones cortas

o

más

organotrofos,

desarrolladas;

aerobios,

son

mesofílicos

y

quimiocrecen

óptimamente en pH cercano a la 18 neutralidad (ElTarabil estudios

y

Sivasithampara, demuestran

la

2006).

Numerosos

importancia

de

los

actinomicetos sobre todo de Streptomyces sp.,

Image 5: Actinomycetes en la tierra.

como controlador de hongos fitopatógenos del suelo y promoción de crecimiento en plantas; por este motivo, los métodos comúnmente utilizados para el aislamiento y recuento de cepas de actinomycetes provenientes de suelo o rizosfera utilizados para bio-control o promoción de crecimiento en plantas, tratan exclusivamente con aquellos adecuados para las especies de Streptomyces (Goodfellow y Williams, 1983 citado por El-Tarabil y Sivasithampara 2006).



FUSARIUM SP.

El género Fusarium es un grupo de hongos filamentosos ampliamente distribuidos en el suelo y plantas. Debido a su capacidad de crecer a 37°C, son considerados oportunistas. Pueden causar infecciones sistémicas en pacientes inmunocomprometidos, con una alta mortalidad. Algunas de sus especies producen toxinas que afectan al hombre y animales. De las más de 100 especies de Fusarium descritas, sólo 12 de ellas pueden considerarse

Imagen 6. Muestra en placa Petri de fusarium oxysporum

patógenas para el humano, entre ellas destacan F. solani, F. oxysporum y F.verticilloides, en orden decreciente de frecuencia.

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Existen distintos medios que permiten su crecimiento; entre ellos, agar papa dextrosa (PDA), agar Sabouraud, agar Clavel (CLA), agar de Spezieller Nährstof-farmer (SNA) y agar avena. Los agares PDA y Sabouraud permiten observar el diámetro de la colonia, morfología y pigmento (café, rojo, violeta, naranja, gris, blanco) difusible Imagen 7. Muestra en placa Petri de Fusarium moniliforme

al medio, mientras que el agar CLA, permite observar el desarrollo de cadenas de microconidios y morfología en detalle de macroconidios.



MEDIO DE CULTIVO

Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio (véase microbiología) que consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso de pequeñas plantas.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.



AGAR

El agar o agar-agar es una sustancia gelatinosa no animal de origen marino. Es un polisacárido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas de los géneros Gelidium, Euchema y Gracilaria, entre otros, resultando, según la especie, de un color característico. La palabra “agar” viene del malayo agar-agar, que significa jalea. También es conocido por los nombres “gelosa”, “gelosina”, “gelatina vegetal”, “gelatina china” o “gelatina japonesa”.

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 AGAR NUTRITIVO El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente (w/v). (Gnzalez, 2012)

 AGAR KING B En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfato dipotásico estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes necesarios que incrementan la producción de fluoresceína y el agar es el agente solidificante.

Uso: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B y Flo Agar.

 CETRIMIDE Es una formula modificada por la adición de cetrimide para la inhibición selectiva de microorganismos diferentes a Pseudomonas aeruginosa y flourences. Estas cepas son identificadas desde las muestras por la producción del pigmento piocianina y la característica del olor frutal. P. aeruginosa es la única especie de Pseudomonas o Gram negativos conocida que excreta el pigmento. Por lo tanto, es un medio de cultivo valioso en la identificación de este microorganismo.

 AGAR TSA Medio utilizado para propósitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la observación de reacciones de hemólisis. También, este medio de cultivo, puede utilizarse como media base para preparar el medio agar chocolate.

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

PRUEBAS BIOQUIMICA



CATALASA

La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba es separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (negativa).

 NITRATO Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciendose agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa solo se encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente, en alguna microaerófila (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que esta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

 OXIDASA Catalasa y oxidasa. La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva.

 UREA Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el medio.

La hidrolisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos.

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 CITRATO Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.



AISLAMIENTO

Es la separación de un determinado microorganismo del resto que le acompañan. Estos métodos son:

 PLACA DE DESEMINACION El método de aislamiento por diseminación en placa es un procedimiento en el cual el investigador disemina una mezcla diluida de células sobre una superficie de agar, utiliza una varilla doblada de vidrio esterilizada, de tal forma que cada célula crece en su propia colonia separada. Los cultivos son incubados por un periodo de tiempo específico. En el medio sólido aparece un crecimiento macroscópicamente visible o un grupo de microorganismos, cada colonia representando un cultivo puro. Luego de que las colonias han crecido, son contadas y se calcula el número de bacterias en la muestra original.

 PLACA VERTIDA El procedimiento de placa vertida se utiliza extensivamente con bacterias y hongos y también puede producir colonias aisladas. Se prepara una muestra bacteriológica diluida. El investigador introduce una pequeña cantidad dentro de un plato de petri vacío. Se vierte agar derretido dentro del plato de petri que contiene la muestra. El agar y la muestra se mezclan meticulosamente al cubrir el plato e inclinarlo y revolverlo suavemente. Se le da tiempo para que el agar se vuelva gel mientras se asienta sobre la superficie plana. Los platos recubiertos se invierten y se dejan incubar por un periodo de tiempo específico. Las colonias

son

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luego

observadas

y

contadas,

y

se

registra

la

información.

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

PLACA ESTRIADA

El método de estrías en placa es el procedimiento clásico para aislar cepas de bacterias. El investigador esteriliza un lazo de alambre con una llama. Luego de enfriarse, el lazo de alambre es colocado en una placa de agar estéril. El investigador sumerge el lazo dentro de la muestra, recogiendo miles de bacterias, y a continuación realiza estrías con el lazo en la superficie de agar. Luego de esterilizar nuevamente el lazo y dejar que se enfríe, el investigador arrastra el lazo a través del recorrido anterior, levantando un grupo de bacterias y realiza otra estría en un área diferente del agar.

METODOLOGÍA



RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

Se recolectaron las muestras en Pachacamac Pica Piedra, teniendo en cuenta que hay cultivos afectados con marchitez vascular causada por F. oxysporum se escogieron plantas sanas en los focos de la enfermedad para tomar una muestra de raíces secundarias y suelo rizosférico. En cada finca se eligieron tres plantas separadas entre sí por 50m aproximadamente. Las muestras fueron refrigeradas hasta el momento de procesamiento en el laboratorio, teniendo en cuenta que en estas hubiera cultivos afectados con marchitez por Fusarium sp. se escogieron plantas sanas en los focos de la enfermedad para tomar una muestra de raíces secundarias y suelo rizosférico. En cada terreno se eligió 1 planta. Las muestras fueron refrigeradas hasta el momento de procesamiento en el laboratorio. 

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Luego del traslado de las muestras al laboratorio se procesaron siguiendo los métodos para el aislamiento de Pseudomonas fluorescens y para el aislamiento de bacterias mesófilas esporuladas. Se realizó un lavado superficial de las raíces, luego de este lavado se pesaron las raíces y se llevaron a una dilución 1/10 en una solución de tween 80 al 0.1%. (Detergente para sacar a los hongos). A esta dilución se le agregaron perlas de vidrio y se llevaron a tres ciclos de agitación en vortex cada uno con una duración de 10 segundos. Luego se llevaron a agitación durante una hora a 150 rpm, posteriormente se realizaron nuevamente tres ciclos de agitación en vortex. Seguido a esto, se realizaron diluciones hasta 10-7 y sembró 0.1 ml de las diluciones 10−4, 10−5 , 10−6 y 10−7 en agar King B y en Agar avena suplementado con Nistatina 0,1% (se puede sustituir por agar Czapeck Dox); el primero para realizar el

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aislamiento selectivo de Pseudomonas fluorescens y el segundo para el aislamiento de actinomycetes. Las siembras en agar King B se llevaron a incubar a temperatura ambiente por 48 horas y se realizó la lectura de las colonias fluorescentes mediante la exposición de luz UV. Las siembras en agar avena se llevaron a incubar a temperatura ambiente, hasta que aparezcan colonias características de estos microorganismos. El remanente de la primera dilución fue llevado a choque térmico, por 10 minutos a una temperatura de 80°C. Luego se realizaron diluciones hasta 10-7 sembrando 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en agar nutritivo. Estas siembras se llevaron a incubar de dos a tres días a temperatura ambiente. 

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE PSEUDOMONAS FLUORESCENS

A partir de las colonias que presentaron fluorescencia se realizó un aislamiento en agar nutritivo para purificar las colonias. Posteriormente se identificaron los aislamientos por pruebas bioquímicas. Inicialmente se hizo una coloración de Gram. Los cocobacilos Gram-negativos fueron los seleccionados para las siguientes pruebas bioquímicas: oxidasa, catalasa y ureasa escogiéndose los aislamientos que dieran resultados positivos en las anteriores bioquímicas y en esta última, los que dieran como resultado oxidadores. Estos se sembraron en agar Cetrimide y se escogieron las que tuvieran crecimiento moderado o crecimiento normal, sin producción de pigmentos verdes y cafés. Las colonias que coincidieron con los resultados mencionados anteriormente, se consideraron como Pseudomonas fluorescens. 

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE BACILLUS SP.

A partir del remanente de la primera dilución, que fue llevado a shock térmico, se procedió a diluir hasta 10-7 sembrando 0.1 ml de las diluciones de 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en agar nutritivo. Luego se pasó a observar las características macroscópicas de las colonias; se seleccionaron aquellas que eran cremosas e irregulares. Con estas últimas, se realizó una coloración Gram. Los bacilos Gram-positivos fueron seleccionados para las siguientes pruebas bioquímicas: catalasa, nitrato y glucosa OF. Se escogieron los aislamientos positivos para las pruebas mencionadas y para esta última los oxidadores y fermentadores. Las cepas que coincidieron con los resultados mencionados anteriormente se consideraron como Bacillus. 

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE ACTINOMYCETES

Las cepas que crecieron con las características macroscópicas de estos microorganismos, es decir colonias secas, pulverulentas y con olor característico (olor a suelo por producción de geosminas), fueron purificadas y se observaron sus características microscópicas, hifas en forma de espiral y esporas.

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PRUEBAS DE GERMINACIÓN PARA DETERMINAR PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO VEGETAL DE LAS CEPAS AISLADAS

Preparación de inóculos. A partir de cepas reconstituidas en TSA, e incubadas por 48 horas a temperatura ambiente, se realizaron suspensiones en solución salina a una concentración de 0.85% por cada cepa aislada. A partir de estas suspensiones se inoculó cada semilla aplicando 100μL de la suspensión bacteriana. Se tuvieron dos controles, inoculando la misma cantidad mencionada anteriormente con agua destilada estéril y solución salina estéril. 

PRUEBAS DE ANTAGONISMO IN VITRO FRENTE A FUSARIUM SP. PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD BIOCONTROLADORA DE LOS AISLAMIENTOS.

Preparación de inóculo La preparación de los inóculos bacterianos para realizar la prueba de antagonismo contra el Fusarium sp. La cepa de Fusarium sp. que se usó para este ensayo, fue la cepa aislada la Universidad peruana Cayetano Heredia; esta cepa se reconstituyó en medio PDA y se dejó crecer por 10 días. 

MONTAJE DE LA PRUEBA DE ANTAGONISMO

Se realizó la técnica de enfrentamiento dual en medio Agar Müller-Hinton sembrando en cuatro placas Petri el fusarium sp.. Luego se realizó la siembra de las bacterias, por el método de estriado, en solo tres placas Petri, dejando uno como control. Estas se sembraron a los costados de la siembra de la cepa de fusarium; ya que, sabiendo que esta última crece de forma concéntrica, se observará una región de inhibición (con forma de menisco) que nos permitirá demostrar la acción fungicida de las bacterias aisladas frente al fusarium sp.

%inhibición= ((crecimiento libre-crecimiento influenciado) / crecimiento

influenciado)100%

RESULTADOS Y DISCUCION 

AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

A partir de las muestras de microorganismos (Bacillus, Actinomycetes y P. fluorecens) de los tres agares en placa Petri, fueron seleccionados 3 aislamiento por cada placa Petri, tomando así, 9 aislamientos de Bacillus, Actinomycetes y de P. fluorecens, tomando como criterio de selección las características macroscópicas como la fluorescencia que estas

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bacterias presentaron en agar King B y características microscópicas (como bacilos Gram negativos); igualmente se seleccionaron 9 aislamientos de Bacillus sp., de acuerdo con las características macro y microscópicas (bacilos Gram positivos, esporulados), y 9 de actinomycetes. De acuerdo con las pruebas bioquímicas de oxidasa y catalasa se realizó una identificación preliminar de los aislamientos. Los aislamientos de Pseudomonas sp, fueron codificados con las letras “PF”, los de Bacillus sp., con la letra “B” y los actinomycetes con “AT”, a su vez, se procederá a ponerle la numeración y entre paréntesis la dilución.

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Los géneros Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Actinomycetes, son una importante fracción de las poblaciones microbianas aisladas a partir de la rizosfera, las cuales han sido constantemente relacionados con la promoción del crecimiento en plantas y la inhibición de un amplio rango de patógenos, especialmente las pseudomonas, lo cual se debe a su capacidad de colonizar diferentes partes de la raíz incluyendo partes internas, la capacidad de utilizar exudados radicales, competir con otros microorganismos y ser capaces de adaptarse a diferentes condiciones de estrés ambiental.

MATERIALES, EQUIPOS Y OTROS 

MATERIALES

o o o o o o

Placas Petri Tubos de ensayo. Vaso de precipitado. Asa de drigaslsky. Matraz Bagueta



EQUIPOS

o o o

Incubadora. Autoclave. Horno.

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o o o o o o

Cubreobjetos Portaobjetos. Probeta. Trípode Mechero de bunsen. Rejilla

o o

Refrigeradora. Agitador térmico.

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

CULTIVOS

o o o o

Agar King B. Agar Czapeck Dox. Agar Nutritivo. Agar Cetrimide.

o o o o

Prueba de oxidasa Prueba de Glucosa. Prueba de Ureasa. Indol.

BIBLIOGRAFÍA

Cid, M. I. (2006). Aislamiento y caracterización de bacterias promotoras de crecimiento vegetal de la rizósfera de Lolium. Valdivia, Chile. Florez-Márquez, J. D. (2017). AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE RIZOBACTERIAS ASOCIADAS A CULTIVOS DE ARROZ (Oryza sativa L.). Cúcuta, Colombia. Gnzalez, C. C. (2012). Medios de cultivo en laboratorio de Microbiologia. Holguin, G. (1996). INTERACClONES ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS BENEFICOS: PROCEDIMIENTOS PARA EL AISLAMIENTO Y CARACTERIZAClON DE. La paz, México. Medio de cultivo. (s.f.). DIBICO.

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ANEXO

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Proyecto de Microbiología Ambiental

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Presentación en la Feria de Proyectos

Proyecto de Microbiología Ambiental

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Proyecto de Microbiología Ambiental

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