• Author / Uploaded
• Jimy Lopez

Citation preview

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE HIGIENE Y SEGURIDAD INDUSTRIAL

RECUENTO TOTAL DE MICROOGANISMOS EN PLACAS PETRI. EXPRECION DE RESULTADOS. CARACTERIZACIÓN DE COLONIAS. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS DE MEDIO SÓLIDO A MEDIO LÍQUIDO. COMPORTAMIENTO DE BACTERIAS EN CALDO NUTRITIVO Y BMI

CUARTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL HUARI RAMOS HUGO NELSON - 20162212H REYES OBREGON JOSEPH JOEL - 20180619I TORRES SILVA FABRICIO - 20180272I

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú 23 de Abril de 2019

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

INDICE

I.

RESUMEN ................................................................................................................................. 3

II.

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3

III.

OBJETIVOS ................................................................................................................................ 4 A. B.

OBJETIVO GENERAL: ........................................................................................................................ 4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .................................................................................................................. 4

IV.

MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 4

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 7 A. B.

MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO Y EQUIPOS ....................................................................................... 7 METODOLOGÍA. .............................................................................................................................. 7

VI.

RESULTADOS ........................................................................................................................ 9

VII.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................................................... 11

VIII.

CONCLUSIONES .................................................................................................................. 12

IX.

RECOMENDACIONES ............................................................................................................... 12

X.

FUENTES DE INFORMACIÓN .................................................................................................... 13

XI.

ANEXOS .................................................................................................................................. 13

XII.

APÉNDICE ........................................................................................................................... 14

A. B. C. D. E.

DIAGRAMA DE FLUJO .......................................................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. DATOS EXPERIMENTALES Y OBSERVACIONES............................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. PROCEDIMIENTO CALCULO ................................................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. DATOS CALCULADOS ........................................................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. ANÁLISIS DE ERROR............................................................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

Página 2 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

I.

Resumen En este laboratorio se hará el cálculo estimado del recuento estándar en placas Petri para las colonias que crecieron, además se caracterizará las colonias según su superficie, forma y borde, este decir, morfología. Se aprendió como se siembra los microorganismos de un medio sólido a un medio líquido. Para el recuento estándar en placas Petri se usaron algunas reglas, y para el estimado del recuento en placas también se usó algunas reglas para determinar

la

unidad

formadora

de

colonias.

En la morfología se usó la placa de concentración 10^-4 y 10^-5, y se marcaron las colonias las cuales serán usadas para la caracterización y aislamiento ya que serán inoculados en el caldo BHI para el crecimiento puro.

II.

Introducción

Para realizar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en los laboratorios de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. La población de microorganismos originalmente presente puede ser estimada por un recuento del número de colonias o el número de tubos que muestran evidencia del crecimiento y multiplicación a través de la dilución que fue agregada a las placas o tubos. En el caso de los alimentos, existe un límite para recuento de bacterias en estos, que ya están establecidos por la norma siendo permitidos dentro de un rango de 30 a 300 u.f.c./ml. Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se

Página 3 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme. Finalmente se realiza en un tubo con medio solido inclinado (asa de siembra), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marque con movimiento en zigzag o surcos en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Luego incubar en estufa durante 28-48 horas a temperatura más adecuada a 37ªC.

III.

Objetivos

a. Objetivo General: 

Establecer el recuento total de microorganismos



Caracterizar el tipo de colonias b. Objetivos Específicos:



Determinar la carga microbiana en una muestra como forma de evaluación de calidad de higiene.



Caracterizar el tipo de colonia de acuerdo a su forma, superficie, borde, color y textura.



Aprender la técnica de siembra de solido a liquido usando el asa de siembra

IV.

Marco Teórico Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos.

Página 4 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme. Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.

Página 5 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

Recuento de microorganismos La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico”. Para hacer el cálculo se tienen que contar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias aisladas ya que por encima de 300 el número es demasiado elevado para hacer un recuento fiable y por debajo de 30 no tiene valor estadístico. UFC/ml de muestra = (Número de colonias x factor de dilución) /ml sembrados en la placa Siembra por estría Usada para el aislamiento de cultivos, es un método útil de sembrar en placa. Un alambre con un aro en la punta (asa de cultivo) se esteriliza e introduce en una suspensión, convenientemente me diluida de organismos y se utiliza luego para hacer una serie de estrías paralelas, no supuesta sobre una placa. Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa con un ansa y se extiende formando estrías sobre la superficie en varios sentidos, cada célula aislada se multiplicará formando una colonia independiente, cada colonia representa un cultivo puro.

Página 6 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

V.

Procedimiento Experimental

a. Materiales, medios de cultivo y equipos  Incubadora

 Pisetas

 Contador de colonias

 Pabilos

 Algodón

 Gradillas

 Papel Kraft

 tubos de ensayos

 Mechero bunsen

 placas Petri.

 Encendedor

 Asa de siembra

 Rejillas

b. Metodología.

Calculo para el recuento estándar en placa. I.

Se consideran “representativas “las cajas que tienen un número de colonias dentro del rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC.

II.

Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas (o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor, se omite dejando el número de 2 cifras significativas. Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. Cuando el tercer dígito es 5 o superior, el segundo dígito se redondea al siguiente, por ejemplo, si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101 UFC, porque el tercer dígito es superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilución 10-3, por lo que se reportará como 24 x 104 UFC.

III.

Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los números y se multiplica por el inverso de la dilución.

Página 7 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

IV.

Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni su duplicado.

V.

Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se consideran ambas y se promedian.

VI.

Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente.

VII.

Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó< 1 / mL si la muestra se sembró directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: “valor estimado”.

VIII.

Si no hay placas representativas, pero hay alguna con un número menor de UFC., se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”.

IX.

Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar, por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado".

Técnica de siembra de microorganismos de un medio liquido un medio sólido. Medios sólidos: Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios. Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.

Página 8 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos. Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar. Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas. Después de realizar las diluciones y luego obtener un crecimiento microbiano en las placas, pasamos a realizar el conteo de colonias visibles. Luego escogemos 7 colonias y pasamos sembrarlos en el caldo nutritivo ya preparado y esterilizado. A esto llamaremos cultivo puro. Para realizar el cultivo mixto tomamos muestras del sarro dental y de las manos de un compañero de laboratorio con un hisopo estéril, Este debe estar embebido con agua peptonada, luego de pasarlo por el sarro dental colocarlo en el caldo BHI. De igual forma con otro algodón estéril y embebido con agua peptonada pasarlo por los pliegues, uñas y palma de la mano; luego colocar este en el caldo BHI. Rotular. Incubar a 35 °C por 48 horas. Después de incubar por 48 horas, sacamos las muestras y observamos las características del crecimiento microbiano en el caldo Nutritivo y BHI. Observamos si presenta turbidez, floculo, película o sedimento. Luego de observar, con la ayuda del asa de siembra transferimos microorganismos del medio líquido a otro medio sólido inclinado, se realizará siembra por estriado en el agar TSA. Esto se realizó para caldo BHI y Nutritivo. Rotular e incubar el agar TSA por 24 horas. Después de trascurrido el tiempo necesario, observar el crecimiento microbiano luego cubrirlos con papel Kraft.

VI.

Resultados

Para obtener estos resultados. De entre todas las colonias que se obtuvieron en placa se pasó a seleccionar solo 8 colonias. Caracterizamos cada uno de ellas de acuerdo a su morfología superficie, forma y borde. Después de haber caracterizado cada uno

Página 9 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

de las nueve colonias se pasó a sembrar en caldo nutritivo, en el caso de la muestra de mano y sarro dental en el caldo BHI. MORFOLOGIA COLONIAL BACTERIANA N°

SUPERFICIE

FORMA

BORDE

COLOR

1

acuminada

circular

redondeado

Crema blanquiazul

2

convexa

fusiforme

ondulado

Crema

3

acuminada

circular

redondeado

Crema fresa

4

plana

circular

filamentoso

blanco

5

plana convexa

fusiforme

redondeado

amarillo

6

plana

irregular

ondulado

Transparente

7

acuminada

irregular

ondulado

Amarillo transparente

plana

8

circular

ondulado

crema

En este cuadro veremos la cantidad de muestra en mililitros que se utilizan para formar colonias, en medio de las diluciones dadas, en el método 1 y método 2, en la cual notaremos que es muy poca. N° de colonias

UFC/ g o ml

Cantidad de la muestra en mL M.1 M.2

Diluciones

M. 1

M. 2

M. 1

M. 2

10-5

115 colonias 78 colonias 138 colonias 153 colonias 296 colonias

5 colonias 44 colonias 90 colonias 126 colonias 17 colonias

12 x 106

50x 105 = 5x106

9.58x10-11

1x10-11

78 x 104

440x104= 44x105

1x10-8

1x10-10

14 x 104

900x103= 9x105

9.8x10-7

1x10-7

15 x103

1260x102=13x104

1.02x10-4

9.7x10-6

30 x 102

170x101 = 17x102

9.9x10-3

1x10-3

10-4 10-3 10-2 10-1

CULTIVO PURO (CALDO NUTRITIVO) N° DE TUBO 1 2

CARACTERITICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Turbio con poco sedimento Crecimiento ligero

Página 10 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

3 4 5 6 7 8

Sedimento y turbio Se observa turbidez Ligero crecimiento microbiano Poco sedimento y turbidez Turbidez (poco sedimento) Presenta turbidez y sedimento

CULTIVO MIXTO (CALDO BHI) TIPO DE MUESTRA

CARACERISTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

BOCA

Sedimento, ligero crecimiento, superficial con poca turbidez Crecimiento superficial, con poco sedimento y poca turbidez

MANO

VII.

Discusión de Resultados

En esta práctica de laboratorio, el grupo de trabajo enfrentó algunas dificultades al identificar la morfología de las colonias. Por el tamaño de estas colonias no se pudo clasificar adecuadamente la elevación. A demás de la siembra en caldo BMI ya que se requiere una alta destreza para llevarlo de forma adecuada, así también, como para evitar contaminación de las colonias. Observamos, en el conteo de colonias visibles, que conforme la dilución aumenta la cantidad de número de colonias visibles disminuye, por el contrario, la separación entre estas aumenta Para realizar el recuento se tuvo que entender los métodos y así poder realizar o establecer las Unidades formadoras de colonia (UFC), en el caso de la dilución 104 (método 1) se contabilizo una menor cantidad de la adecuada, esto es debido a que en el momento de añadir el APC, este estaba aún caliente. Al momento de añadir el agar en las placas que estaba destinadas al control de esterilidad hubo un error en la manipulación, porque después de incubarlos se evidencio levadura y bacilos.

Página 11 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

VIII.

Conclusiones

 La contaminación que se da en las placas Petri es superficial y también se presenta crecimiento microbiano en el interior del agar.  Crecimiento de levaduras en el control de esterilidad APC del método 1 y (APC +AP) del método 2  El control de esterilidad de método 2 resulta apropiado, sin crecimiento de contaminantes.  Probable crecimiento de bacilos en las muestras de método 1  EL crecimiento superficial es muestra de contaminantes por el medio.  Los microorganismos pueden anaeróbicos en algunos tubos debido a la formación dentro del caldo  Los microorganismos que se formaron en las paredes de los microorganismos pueden indicar que son microorganismos aeróbicos facultativos  La formación de microorganismos en la superficie puede indicar que son aeróbicos

IX.

Recomendaciones



Observar cuidadosamente las colonias para determinar así morfología



Al escoger las dos muestras, seleccionar la que tenga mayores colonias visibles y menos contaminadas



Por cuestiones de seguridad lo óptimo sería que la persona que use el mechero tenga el cabello sujetado.



Tener un rotulador a la mano para poder realizar un correcto seguimiento.



Usar instrumentos esterilizados



Hacer las siembras cerca de un mechero para evitar contaminación externa

Página 12 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

X.

Fuentes de información

Bibliografía Domench, A., López, A., & García Valdés, E. (2009). Prácticas de Microbiología . Madigan, M. M., & Parker, J. (2003). Brock - Biología de los microorganismos. 654-684. Montoya Campuzano, O. I. (1999). Manual de Microbiología. colombia. Prescott, L. (2002). Microbiology. McGraw-Hill Science., 441-446.

XI.

Anexos

Diluciones en placas Petri.

Selección de las colonias

Colonias

Página 13 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

XII.

4° Informe de Laboratorio

Apéndice a. Diagrama de flujo.

Técnica de siembra de microorganismos de acuerdo a su forma.

Esterilizar el asa de siembra

Página 14 de 16 La muestra que está en caldo lo

Después de esterilizar el asa de siembra, esperar hasta q todos se queden

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

Luego estriar la parte inclinada del agar TSA

Luego se retira lentamente el aza de siembra, todo cerca del mechero prendido;

Introducir hasta el fondo, la idea es que se forme una película en la aza de siembra

Realizar los mismos pasos para cada uno de los tubos con sus respectivos caldos.

b. Datos calculados.

Diluciones

N° de colonias

UFC/ g o ml

M. 1

M. 2

M. 1

M. 2

10-5

115 colonias

5 colonias

12 x 106

50x 105 = 5x106

10-4

78 colonias

44 colonias

78 x 104

440x104 = 44x105

Página 15 de 16

UNIVERCIDAD NACIONALDE INGENIERIA 4° Informe de Laboratorio

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

10-3

138 colonias

90 colonias

14 x 104

900x103 = 9x105

10-2

153 colonias

126 colonias

15 x103

1260x102 =13x104

10-1

296 colonias

17 colonias

30 x 102

170x101 = 17x102

La fórmula que se utiliza es:

𝑈𝐹𝐶 𝑁° 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 = (𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛) 𝑔 𝑜 𝑚𝑙 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Página 16 de 16