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Jornada de Patología Molecular

Cáncer de Tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas 29 de Octubre de 2004 Coordinadores Mercedes Robledo, CNIO - Madrid José Ángel Díaz, HU Clínico San Carlos - Madrid Xavier Matías-Guiú, HU Arnau de Vilanova - Lérida Auditorio CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Melchor Fernández Almagro 3 E-28029 Madrid www.cnio.es Secretaría técnica: Beatriz Ferreiro, Alma Izquierdo. Dpto. Reuniones Científicas, [email protected]

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Índice

Presentación

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Programa

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Resúmenes de las ponencias

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Resúmenes de las comunicaciones orales

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Resúmenes de los posters

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Lista de participantes

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Próximas actividades en el CNIO

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Presentación

Presentación La Jornada de Patología Molecular: Cáncer de tiroides: biología e implicaciones terapéuticas se ha planteado como punto de encuentro entre expertos e interesados en anatomía patológica, manejo clínico y genética para promover el intercambio entre los diferentes grupos de investigación clínica y básica que trabajan en España en torno a esta patología. El programa es amplio e incluye la descripción de nuevos marcadores moleculares procedentes de la biología molecular y la genómica, así como resultados de estudios de microarrays de expresión en diferentes subtipos de carcinomas tiroideos. Además, se describirá su uso potencial como herramientas de diagnóstico y de monitorización del tratamiento del cáncer de tiroides diferenciado. Confiamos en que la jornada resulte interesante para ponentes invitados y participantes y les damos la bienvenida al Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas,

Mercedes Robledo José Ángel Díaz Xavier Matías-Guiú

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Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas Programa 09:15

Bienvenida Miguel Ángel Piris, Director Programa Patología Molecular, CNIO, Madrid Sesión I: Nuevos aspectos genéticos al servicio del diagnóstico Moderador: Javier Benítez

09:30

Pilar Santisteban, Instituto Investigaciones Biomédicas. Madrid Aplicaciones en diagnóstico y tratamiento del transportador de yodo (NIS) en cáncer de tiroides

10:10

Mercedes Robledo, CNIO. Madrid Factores genéticos de riesgo en cáncer de tiroides Comunicaciones Orales Moderadoras: Cristina Álvarez Escolá y Mónica Marazuela

10:50

G. Riesco Eizaguirre, IIB, Madrid. Papel del oncogen V599EB-RAF en la diferenciación y transformación tiroidea

11.00

G. Troncone. Università Federico II, Napoli, Italia p27 (Kip1) cytoplasmatic mislocalitation is associated with the activation of the PI3K/AKT pathway in thyroid cancer

11.10

Ruiz-Llorente S. CNIO, Madrid. Identificación de factores genéticos de riesgo asociados al desarrollo de carcinoma medular de tiroides esporádico

11.20

Montero-Conde C. CNIO, Madrid. Identificación de Marcadores Genéticos de Riesgo asociados a Carcinomas Papilares y Foliculares de Tiroides 11:30

Café

Sesión II: Patología del Cáncer de tiroides Moderador: Agustín Acevedo 12:00

Xavier Matías-Guiú, Hospital Universitario Arnau de Vilanova. Lérida Tumor de tiroides. Clasificación de la OMS 2004. (I)

12:40

José Cameselle-Teijeiro, Hospital Clínico Universitario. Santiago de Compostela. Tumor de tiroides. Clasificación de la OMS 2004. (II)

13:20

Mesa Redonda 13:30

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Almuerzo

Programa

Sesión III: Manejo clínico del paciente con Cáncer de tiroides Moderadores: Mario Gómez y Purificación Martínez de Icaya 15:00

Antonio Picó. Hospital General Universitario. Alicante Nuevos marcadores del cáncer diferenciado de tiroides y tiroglobulina tras TSHrecombinante. Implicaciones genéticas

15.40

Francisco Pomares. Hospital Universitario San Juan de Alicante Carcinoma Medular de tiroides familiar: correlación genotipo-fenotipo. Implicaciones terapéuticas 16:15

Café.

Comunicaciones Orales Moderadores: José Ángel Díaz y Xavier Matías-Guiú 16.45

R Orellana, Corporació Sanitària Parc Taulí, Sabadell. Estudio inmunohistoquímico de antígenos en el diagnóstico citohistológico de los nódulos tiroideos

16.55

M.R. Bella, Corporació Parc Taulí (Sabadell) y Hospital de Mataró, Barcelona. Variante macrofolicular del carcinoma papilar de tiroides. Presentación de 4 casos, con estudio inmunohistoquímico para Citoqueratina 19 y Galectina-3

17.05

P. López Mondéjar, Hospital General Universitario de Alicante. Utilidad de la determinación de galectina-p3, citokeratina 34β y Ki-67 en el comportamiento del carcinoma diferenciado de tiroides

17.15

J. Santamaría, Hospital de Cruces, Baracaldo (Vizcaya). Tiroglobulina vs barrido total corporal con I-131 como marcadores pronósticos en carcinomas diferenciados tiroideos

17.25

I. Moraga, Hospital de Móstoles y Hospital Cruz Roja, Madrid. Experiencia con ácido-Cis retinoico en el tratamiento de las metástasis no captadoras de I-131 del cáncer tiroideo Conclusiones

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Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas

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Resúmenes de las ponencias

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Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas

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Resúmenes de las ponencias

Aplicaciones en diagnóstico y tratamiento del transportador de yodo (NIS) en cáncer de tiroides Santisteban, P., Costamagna, ME, García, B. Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-UAM. Arturo Duperier 4, Madrid, 28029. [email protected] El Iodo (I-) es el componente esencial de las hormonas tiroideas. La captación activa de este elemento a través de la membrana basolateral de las células epiteliales tiroideas está mediada por una proteína transportadora denominada NIS (Na+/I- Symporter). NIS es una proteína integral de membrana que media el transporte activo de I- en la glándula tiroidea y posee un papel clave en su patofisiología. Ello es debido a que esta proteína es la vía por la que el I- alcanza la glándula tiroidea para la biosíntesis de las hormonas tiroidea y por ser el medio de diagnóstico y terapia para el hipertiroidismo y el cáncer de tiroides (De la Vieja et al., 2000, Dohan et al. 2003). En nuestro laboratorio hemos demostrado que la expresión de NIS está estimulada por la hormona hipofisaria TSH e inhibida por insulina y por factores de crecimiento como IGF-1 y TGF-β El efecto de TSH, IGF-1 y TGF-ß tiene lugar a nivel transcripcional. Al promotor de NIS se unen dos de los factores de transcripción especificos de tiroides, TTF-1 y Pax-8, a una región “enhancer” denominada NUE (NIS Upstream Element) localizada a -2495 pares de bases (pb) . TTF-1 -2495

CREL-BF

TTF-1 -2495

+1 -550 -420

-245

-124

AATAAT

Pax-8

Pax-8

NTF-1

TTF-1

NUE

Aunque TTF-1 se une, su papel no es decisivo en el control hormonal de la transcripción de NIS. Sin embargo, el factor Pax-8 es el mediador de la respuesta a TSH, vía cAMP/PKA (Ohno eta al. 1999), así como de la inhibición por insulina/IGF1/PI3K y de la de TGF-ß/Smad3 (García & Santisteban 2002, Costamagna et al. 2004). El hecho de que el gen NIS esté sometido a esa fina regulación hormonal es importante para entender la fisiología de la célula tiroidea y además por que esta molécula es la que media la entrada de yodo radiactivo al tiroides. El radio-yodo se usa en el diagnóstico por imagen (gammagrafía tiroidea) y en el tratamiento de cáncer de tiroides. Por ello el conocer las hormonas que regulan su expresión, así como entender los segundos mensajeros y los factores de transcripción implicados dará una aproximación a la mejora de esas terapias con radio-yodo. En un intento de identificar los elementos represores que median la inhibición de NIS por IGF-1/PI3K, identificamos en el promotor de NIS elementos de respuesta para el factor de transcripción de la familia forkhead Foxo1 (Carlson & Mahlapuu 2002). Ello es importante dado que este factor es diana de la respuesta de supervivencia y antiapóptotica de insulina e IGF-1 vía PI3K y por que el ratón heterocigoto Foxo1+/presenta diabetes tipo 2 (Accili et al 2001), un problema metabólico que se puede 11

Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas asociar con situaciones de hipo o hipertiroidismo. Con respecto a la represión del gen NIS mediada por TGF-ß es importante destacar que las células tiroideas transformadas con oncogenes, así como las células tiroideas provenientes de tumores humano, producen altos niveles de este factor. Por ello el profundizar en sus mecanismos de acción resulta de interés en los estudios de cáncer de tiroides, ya que si las células tumorales expresan altos niveles de TGF-ß, la captación de radio-yodo como terapia no tendría efecto. Aunque el mecanismo represor de IGF-1 y de TGF-ß ocurre por vías diferentes, ambos confluyen en su acción sobre el factor Pax-8 dado que Foxo1 y Smad3 son capaces de interaccionar con Pax8 inhibiendo su capacidad de unión al promotor de NIS y por tanto su capacidad de transcribirlo. Además en el caso de TGF-ß/Smad3 hemos demostrado un mecanismo adicional que implica la interacción de Smad3 con el corepresor SinA3 y de éste con deacetilasasa de histonas. En nuestro grupo llevamos años estudiando los mecanismos básicos de transformación celular tiroidea implicados en el desarrollo del cáncer de tiroides y más en concreto el papel del oncogén Ras (Velasco et al. 1998), ya que este gen es uno de lo que aparece constitutivamente activado en los primeros estadios de la tumorogénesis tiroidea. Las células transformadas con Ras, pierden la expresión de Pax-8 (Ros et al 1999) y la captación de Yodo. Recientemente se ha descrito la mutación de otro de los miembros de la familia, en concreto la del oncogén B-Raf, en carcinoma papilar tiroideo (Nikiforova et al. 2003). Ello hace interesante nuestro estudio presentado en una comunicación a este symposium (Riesco and Santisteban) del estudio de este oncogén en los mecanismos de transformación tiroidea y el papel de Pax-8 y NIS en ellos. Los estudios sobre la aplicación de NIS en terapias están incrementando en los últimos años y no sólo en cáncer de tiroides. Las células tumorales tiroideas tienden a indiferenciarse y perder la expresión de marcadores tiroideos y entre ellos la captación de Yodo debido a la pérdida de la expresión y/o función de NIS. Para poder trata a estos pacientes con radioyodo, además de los tratamientos hormonales se están ideando estrategias para introducir el gen NIS en las células tumorales tiroideas. Las mismas estrategias se están aplicando a otros tipos de tumores (próstata, pulmón, colon etc.) que no expresan NIS, para después de inducir éste symporter poder tratar las células tumorales con radioyodo. Las estrategias mas utilizadas consisten en la construcción de vectores retro- o adeno-virales conteniendo el cDNA de NIS y posteriormente tras infección las células tumorales tratarlas con I131. Los primeros resultados en cultivos celulares son muy prometedores habiéndose obtenido un alto índice de mortalidad de las células tumorales que expresan NIS tras tratamiento con el radioyodo (Spitzweg and Morris). Referencias Accili, D., Y. Kido, J. Nakae, D. et al. (2001). Curr Mol Med 1(1): 9-23. Carlsson, P. and M. Mahlapuu (2002). Dev Biol 250(1): 1-23. Costamagna, E., B. Garcia and P. Santisteban (2004). J Biol Chem. 279, 3439-3446 Dohan, O., A. De la Vieja, V. Paroder, et al. (2003). Endocr Rev 24(1): 48-77. 12

Resúmenes de las ponencias Garcia, B. and P. Santisteban (2002). Mol Endocrinol 16(2): 342-52. Nikiforova, M. N., E. T. Kimura, M. Gandhi, P. W. et al. (2003). J Clin Endocrinol Metab88(11): 5399-404. Ohno, M., M. Zannini, O. Levy, et al. (1999). Mol Cell Biol 19(3): 2051-60..5 Ros, P., D. L. Rossi, A. Acebron and P. Santisteban (1999). Biochimie 81(4): 389-96. Spitzweg, C. and Morris, J C. (2004) Thyroid 8; 424-34 Velasco, J. A., A. Acebron, M. Zannini, et al. (1998). Endocrinology 139(6): 2796-802.

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Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas

Factores genéticos de riesgo en cáncer de tiroides Mercedes Robledo Grupo de Cáncer Endocrino Hereditario, Dpto. Genética Humana, Programa Patología Molecular. CNIO, Madrid. El cáncer de tiroides representa el 1% de todos los cánceres y es el más común entre las neoplasias endocrinas. La mayor parte de los tumores tiroideos son esporádicos y solo una proporción, variable atendiendo al subtipo histológico, tiene un carácter hereditario. En estos casos heredados, el desarrollo del carcinoma de tiroides se debe a mutaciones germinales en genes mayores de susceptibilidad, como RET en el caso del carcinoma medular de tiroides familiar (CMTF), o MET en el caso de algunas formas de carcinoma papilar familiar (CPTF). Los datos existentes hasta el momento indican que las neoplasias endocrinas hereditarias muestran en su mayoría una forma de herencia autosómica dominante, con penetrancia variable dependiendo de la mutación y con expresividad variable, no solo en lo relativo a la presentación clínica sino también a la edad de aparición de la enfermedad. Dicha variabilidad no solo se observa entre familias portadoras de la misma mutación, sino teniendo en cuenta una misma familia, en la que todos los miembros son portadores de una mutación idéntica en un gen de susceptibilidad mayor. Es obvio que es difícil explicar el comportamiento complejo de estas enfermedades considerando únicamente una mutación como responsable del proceso. Las variaciones en el fenotipo dentro de la misma familia sugieren la existencia de genes modificadores que actúan a través de un efecto cuantitativo. En este sentido, un gen de baja penetrancia se define como un gen en el que existen variaciones o polimorfismos asociados a un pequeño o moderado riesgo relativo al desarrollo de la enfermedad. Tales variaciones son relativamente comunes en la población, y por tanto, pueden conferir en la población general un riesgo mucho mayor que las mutaciones raras en los genes de alta penetrancia asociados a cáncer hereditario. Si la presencia de polimorfismos aislados, o la combinación de varios de ellos, se asocia a un cambio en la presentación clínica de una enfermedad, entonces es posible inferir que tales polimorfismos actúan de hecho como modificadores. Sin embargo, por el momento son escasos los estudios en curso sobre genes modificadores de fenotipo utilizando familias con tumores endocrinos y portadoras de mutación germinal en genes de susceptibilidad mayor. Esto se debe fundamentalmente a la baja prevalencia de estas enfermedades, hecho que complica el disponer de un número de individuos suficientemente elevado para llegar a conclusiones firmes. El segundo problema a tener en cuenta es la propia selección de genes candidatos sobre los que hacer el estudio. Por estos motivos, la estrategia está cambiando hacia la búsqueda de genes de baja penetrancia asociados a susceptibilidad de cáncer de tiroides esporádico, dado que al menos aquí la n no debe ser un problema. Una vez identificados los marcadores genéticos de riesgo, se puede analizar si además actúan como modificador de fenotipo o no entre familias portadoras de mutación. La selección de genes puede hacerse de acuerdo a criterios funcionales, o bien utilizando resultados de perfiles de expresión que identifiquen genes hasta ahora desconocidos como relacionados con la patología tiroidea. Una vez seleccionados los genes a analizar, es crucial disponer de herramientas bioinformáticas y estadísticas que permitan identificar haplotipos de riesgo y establecer los diplotipos a través de los que actúan. En cualquier caso, incluso después de identificar un buen gen candidato, hacen falta estudios complementarios que permitan identificar los mecanismos biológicos responsables de tal efecto, bien sea como marcador de riesgo bien como modificador.

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Resúmenes de las ponencias

Clasificación de la OMS de cáncer de tiroides (2004) Dr. Xavier Matias-Guiu y Dr. José Cameselle-Teijeiro Servicios de Patología, Hospital de Universitari Arnau de Vilanova, Universitat de Lleida, y Hospital Clínico Universitario, Universidad de Santiago de Compostela. Durante los años 2002 a 2004, la Organización Mundial de la Salud encargó a un extenso grupo de patólogos la elaboración de una clasificación actualizada de los cánceres del sistema endocrino, que sustituyera a las clasificaciones previas. Un subgrupo de patólogos fue encargado de proponer una clasificación de los cánceres de tiroides, que sustituyera a las dos versiones previas de la OMS. La coordinación general de este grupo fue desarrollada por el Profesor Ronald DeLellis. Los dos autores de este resumen participaron activamente en el diseño y la redacción de esta clasificación actualizada. En Abril de 2003, tuvo lugar una reunión de consenso en la sede de la IARC (International Agency for Research on Cancer), en Lyon, Francia. En las siguientes líneas se presentan los tipos fundamentales y la definición de las características de cada tipo, haciendo especial énfasis a los cambios en relación con las clasificaciones previas. Carcinoma Papilar Definición: Un tumor maligno epitelial mostrando evidencia de diferenciación folicular y con características nucleares específicas. Variantes: 1) Folicular 2) Macrofolicular 3) Oncocítica 4) Célula clara 5) Esclerosante y difusa 6) Células altas 7) Columnar 8) Sólida 9) Cribiforme 10) Con fasciitis-like stroma 11) Con componente insular focal 12) Con carcinoma escamoso o mucoepidermoide 13) Con carcinoma fusiforme o de células gigantes 14) Carcinoma papilar-medular combinado 15) Microcarcinoma papilar Observaciones: Se introducen varias variantes nuevas en relación con clasificaciones previas. Se introduce el papel de RET, TRK, RAS, BRAF. Carcinoma Folicular Definición: Un tumor maligno epitelial mostrando evidencia de diferenciación folicular y sin las características nucleares diagnósticas del carcinoma papilar. Variantes: 1) Oncocítica 2) Célula clara Observaciones: Se hace hincapié en que los carcinomas oncocíticos no tienen personalidad propia. Se hace énfasis en la imposibilidad de diferenciar un carcinoma folicular de un adenoma es punciones por aspiración. Se discute el papel de los reordenamientos de PPARγ 15

Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas Carcinoma Pobremente Diferenciado Definición: Una neoplasia folicular con evidencia limitada de diferenciación folicular, ocupando un espacio morfológico y de comportamiento en una zona intermedia entre los carcinomas diferenciados (folicular y papilar) y los indiferenciados. Observaciones: Se hace hincapié en la coexistencia de los patrones insular, trabecular y sólido. Este tipo de tumor no estaba en las clasificaciones previas. Carcinoma Indiferenciado Definición: Un tumor altamente maligno que histológicamente aparece totalmente o parcialmente constituido por células indiferenciadas, con evidencia inmunohistoquímica o ultraestructural de diferenciación epitelial. Carcinoma Escamoso Definición: Un tumor maligno epitelial compuesto enteramente por células con diferenciación escamosa. Carcinoma Mucoepidermoide Definición: Un tumor maligno epitelial mostrando evidencia combinación de componentes epidermoides y mucinosos. Carcinoma Mucoepidermoide esclerosante con eosinofilia Definición: Un raro tumor maligno mostrando evidencia combinación de componentes epidermoides y glandulares, acompañado por esclerosis y por infiltración linfocítica y eosinofílica. Carcinoma Mucinoso Definición: Un tumor maligno epitelial caracterizado por grupos de células neoplásicas rodeadas por abundantes depósitos mucinosos extracelulares. Carcinoma Medular Definición: Un tumor maligno epitelial con diferenciación de células C Observaciones: Se introducen varias variantes morfológicas, así como las características de los tipos familiar y esporádico. Se introduce una nueva clasificación de la hiperplasia de células C. Carcinoma Mixto Medular y Folicular Definición: Un tumor mostrando características morfológicas de un carcinoma medular con inmunoreactividad para calcitonina, y de un carcinoma folicular (o papilar) con inmunoreactividad para tiroglobulina. Timoma Ectópico Definición: Un tumor organotípico tímico o de arcos branquiales relacionados, localizado en el tiroides Tumor fusocelular con diferenciación tímica (SETTLE) Definición: Un raro tumor maligno caracterizado por una arquitectura lobulada y una composición celular bifásica con células epiteliales fusiformes en y estructuras glandulares. Carcinoma mostrando diferenciación tímica (CASTLE) Definición: Un carcinoma tiroideo con arquitectura similar a la de los tumores tímicos. 16

Resúmenes de las ponencias Teratoma Definición: Un tumor que muestra tejidos maduros o inmaduros de ectodermo, endodermo y mesodermo. Tumores secundarios Definición: Tumores que resultan de extensión directa o diseminaciónes hemática o linfática de otros tumores. Linfoma y Plasmocitoma primario Definición: Un linfoma primario del tiroides, usualmente asociado a tiroiditis linfocítica. Angiosarcoma Definición: Un tumor maligno con diferenciación endotelial Tumores musculares Definición: Un tumor benigno o maligno que deriva o muestra diferenciación hacia músculo liso. Tumores de nervio periférico Definición: Un tumor benigno o maligno que deriva o muestra diferenciación hacia célula de Schwann, perineuro o fibroblastos. Adenoma Folicular Definición: Un tumor benigno, encapsulado, mostrando evidencia de diferenciación folicular. Variantes: 1) Oncocítica 2) Fetal 3) Con células en anillo de sello 4) Mucinoso 5) Célula clara 6) Con hiperplasia papilar 7) Tóxico (Hiperfuncionante) 8) Lipoadenoma 9) Atípico 10) Con núcleos pleomórficos “bizarros” Observaciones: Se desaconseja el término “Tumor bien diferenciado de potencial maligno incierto” Tumor Trabecular Hialinizante Definición: Un raro tumor de origen folicular con un patrón trabecular y marcada hialinización intertrabecular Paraganglioma Definición: Un tumor neuroendocrino intratiroideo de origen paragangliomatoso. Tumor Fibroso Solitario Definición: Un tumor mesenquimal infrecuente, indistinguible de los tumores fibrosos solitarios, que ocurren en pleura u otras localizaciones extrapleurales.

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Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas Tumor Folicular Dendrítico Definición: Un tumor compuesto por células que muestran rasgos morfológicos y fenotípicos de célula folicular dendrítica. Histiocitosis de células de Langherhans Definición: Un tipo de histiocitosis caracterizada por una proliferación de células de Langherhans con un número variable de eosinófilos.

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Resúmenes de las ponencias

Nuevos marcadores del cáncer diferenciado de tiroides (CDT) y tiroglobulina (Tg) tras TSH-recombinante (TSHr). Implicaciones genéticas Antonio Picó Alfonso, Pedro López Mondéjar, Alicia López Maciá Sección de Endocrinología y Nutrición. Hospital General Universitario de Alicante. Departamento de Medicina Clínica. Universidad Miguel Hernández. Elche. Habitualmente el comportamiento el CDT es indolente, pero en determinadas situaciones puede comportarse de forma agresiva reduciendo significativamente los años de supervivencia. Los principales factores de riesgo de comportamiento agresivo identificados son: edad avanzada, sexo masculino, determinadas variantes histológicas como la forma de células altas o de células columnares del carcinoma papilar. Factores moleculares como la presencia de mutaciones somáticas del gen supresor tumoral p-53, sobreexpresión de la proteína p21 o expresión C-myc también se han asociado a mal pronóstico. Por el contrario la expresión de marcadores inmunohistoquímicos característicos de células epiteliales como la galectina, la citoqueratina o el Ki-67 ha sido ampliamente utilizada en material procedente de PAAF para el diagnóstico diferencial entre benignidad y malignidad de nódulos tiroideos pero no ha sido estudiada como posible marcador del comportamiento clínico del CDT. Hemos determinado la reactividad inmunohistoquímica citoplasmática de galectina-p3, citokeratina 34β y Ki-67 en 57 piezas quirúrgicas de CDT (48 correspondientes a carcinomas papilares (CP) y 9 a carcinomas foliculares (CF) correspondientes a otros tantos pacientes intervenidos en nuestro hospital durante los últimos 15 años y de los que se ha recogido la presencia de multicentricidad, afectación extratiroidea o metástasis en el momento del diagnóstico y la persistencia de enfermedad residual o aparición de recidivas locales, metástasis linfáticas o metástasis a distancia durante el seguimiento. Se observa una mayor expresión de galectina en el CP que en el CF (55.93% vs 5.18% respectivamente) a la vez que se constata una correlación positiva entre expresión de este marcador y la presencia de enfermedad o recidiva de la misma y negativa con su ausencia en el CP pero no en el CF. Por el contrario la expresión de los otros 2 marcadores, citokeratina 34β y Ki-67, es baja en ambos carcinomas y no se correlaciona con su comportamiento clínico en el tiempo. Por otro lado, el seguimiento del CDT obliga a la realización periódica de gammagrafías de extensión tumoral (GET) y a la determinación de Tg en situación de TSH elevada para detectar la presencia o ausencia de enfermedad. Para ello es necesario suspender la administración sustitutiva/supresosra de hormonas tiroideas durante un 1 mes con el consiguiente riesgo de hiperestimulación tumoral y de los efectos secundarios de la deprivación. La deprivación hormonal está justificado ante la persistencia de enfermedad ya que la elevada y mantenida hiperestimulación de TSH facilitaría el posterior tratamiento metabólico con I131. Sin embargo, un importante porcentaje de pacientes con CDT se encuentran libres de enfermedad. En éstos, la disponibilidad de TSHr permite una aproximación alternativa a la GET más determinación de Tg tras deprivación. Hemos realizado un estudio prospectivo en 37 pacientes con CDT considerados libres de enfermedad para valorar la fiabilidad de la determinación de Tg como prueba de cribaje para detectar recidiva local o enfermedad metastásica durante el segumiento, utilizando como patrón de referencia la GET tras deprivación más ecografía cervical o TAC cérvico-torácio o PET cuando se consideró necesario. Se encontró concordancia entre Tg tras TSHr y patrón de referencia en 35/37 pacientes (34 con ausencia de enfermedad y 1 con enfermedad metastásica local indentificada por ecografía pero no por GET) y 2 falsos positivos. Como conclusión, la determinación de la expresión citoplasmática de galectina en piezas quirúrgicas de CP y la determinación de Tg tras TSHr durante el seguimiento del CDT considerado libre de enfermedad se revelan como 2 herramientas muy útiles a la hora de 19

Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas seleccionar los pacientes de mayor riesgo, lo que sin duda permitirá opitmizar recursos y reducir el gasto minimizando errores.

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Resúmenes de las ponencias

Carcinoma medular de tiroides familiar: correlación genotipofenotipo. Implicaciones terapéuticas Francisco José Pomares Gómez Endocrinología y Nutrición. Hospital Universitario San Juan de Alicante El carcinoma medular de tiroides (CMT) es un tumor derivado de las células parafoliculares que puede aparecer en la infancia, en el contexto de un síndrome hereditario familiar con patrón autosómico dominante, denominado síndrome de neoplasias endocrinas múltiples tipo 2 (MEN 2). Se diferencian 3 formas de MEN 2: MEN 2A, MEN2B y carcinoma medular de tiroides familiar (CMTF). MEN 2A puede expresar además del CMT, feocromocitoma e hiperparatiroidismo, MEN 2B asocia al CMT, feocromocitoma y neuromas mucocutáneos, mientras que en el CMTF sólo se observa el tumor tiroideo. Se ha identificado como responsables de la aparición del síndrome a mutaciones germinales en el protooncogén RET, ya que se aislaron en pacientes con MEN 2 y no en sujetos sanos, ni tampoco en formas esporádicas de CMT. RET se localiza en el cromosoma 10 y codifica una proteína transmembrana con actividad tirosinquinasa, que en condiciones normales se activa tras crear homodímeros mediada por sus ligandos. La proteína RET se compone de un dominio extracelular donde destaca una región rica en cisteínas, un dominio transmembrana y un tercero intracelular con la función tirosinquinasa. Las mutaciones de RET aumentan la acción de la quinasa, bien facilitando la homodimerización o induciendo exceso de función en el monómero. Este mecanismo de ganancia de actividad de la proteína establece la patogenia y las diferencias en el origen de la activación influyen sobre el fenotipo. Las mutaciones de RET se han identificado en los codones que codifican las regiones intra y extracelular. Respecto a las mutaciones extracitoplasmáticas, la mayoría alteran una cisteína del dominio rico en cisteínas, las más frecuentes acontecen sobre el codón 634 del exón 11, que expresan MEN 2A y además pueden manifestar liquen cutáneo amiloidótico. También en este exón las mutaciones sobre los codones 630, 635 y 637, se asocian a MEN 2A. Las variantes alélicas sobre el exón 10 (codones 609, 611, 618 y 620) son responsables de CMTF, aunque en ocasiones también de MEN 2A junto a enfermedad de Hirschsprung. Recientemente también se han identificado mutaciones en el exón 8 (codones 532 y 533) en familias con CMTF. El dominio intracelular tirosinquinasa se caracteriza porque en él se presentan las mutaciones responsables de MEN 2B, éstas se ubican en los exones 15 (codón 883) y 16 (codones 918 y 922). También se encuentran en esta región, pero próximos a la membrana, mutaciones relacionadas con CMTF en los exones 13 (codones 768, 790 y 791) y 14 (codones 804 y 844), pero también en los exones 15 (codón 891) y 16 (codones 912 y 916). Hay que destacar que en rara ocasiones también se ha descrito MEN 2A con errores en los codones 790, 804 y 891. Además de estas mutaciones que implican un cambio de aminoácido, otros factores pueden estar implicados en la expresividad del síndrome, su penetrancia o la evolución del CMT. Así se especula con la variabilidad de la regulación de la tirosinquinasa debida a otras mutaciones germinales en otros genes, o bien por mutaciones somáticas en el tumor. Estas teorías no están contrastadas, pero sí se ha observado que la presencia de determinados polimorfismos del protooncogén RET pueden actuar como genes modificadores que alterarían la evolución del CMT. Tal es así que la presencia de los polimorfismos G691S y S904S son más frecuentes en portadores que desarrollan CMT a edades más jóvenes. 21

Jornada de Patología Molecular. Cáncer de tiroides. Biología e implicaciones terapéuticas El tratamiento de los síndromes MEN 2, se fundamenta en el diagnóstico y abordaje precoz de los tumores. Inicialmente se basaba en determinar marcadores tumorales, que en ocasiones no garantizan la falta de extensión de la enfermedad. Las técnicas de diagnóstico genético permiten establecer el diagnóstico de portador antes de la aparición de neoplasias y recomendar tratamiento quirúrgico precozmente. El conocimiento de la relación fenotípica dependiente del genotipo ha aportado cambios en las pautas de diagnóstico y tratamiento del síndrome MEN 2. Se indica tiroidectomía profiláctica en los niños portadores de mutaciones de RET e incluso se sugiere la edad de intervención basándose en el genotipo que determinaría tres niveles de riesgo para el CMT. El nivel 1, que supone menor riesgo, queda establecido por las variantes de los codones 609, 768, 790, 791, 804 y 891, aconsejándose la tiroidectomía a la edad de 10 años. El nivel 2 está definido por las mutaciones sobre los codones 611, 618, 620 y 634, indicándose tratamiento exéresis del tiroides antes de los 5 años. Por último el nivel 3, el más grave, se determina por mutaciones en los codones 883, 918 (y 922), recomendándose realizar tiroidectomía en los primeros 6 meses de vida. Los fenotipos ligados a los niveles son CMTF, MEN 2A y MEN 2B, respectivamente. No obstante, hay que observar que algunos niños han presentado metástasis incluso antes de las edades recomendadas. Al margen de la edad indicada parar la tiroidectomía profiláctica, se discute sobre la idoneidad o no de realizar vaciamiento ganglionar del compartimento central del cuello. También, si se aconseja practicar este último, a partir de que edad realizarlo, para niños portadores mayores. El genotipo determina el desarrollo de los otros tumores que definen las variantes de MEN 2 y condiciona las pautas de diagnóstico precoz, sobre todo para el feocromocitoma. Es por ello que se discute la conveniencia de evaluar periódicamente despistaje de feocromocitoma e hiperparatiroidismo en el supuesto de mutaciones raras. Parece evidente que, aunque en los últimos diez años se ha aportado una gran carga de conocimiento sobre MEN 2, todavía queda mucho por aprender. El camino que se dirige al estudio de las otras alteraciones genéticas capaces de modificar la evolución fenotípica, puede abrir un campo de múltiples posibilidades, cuya integración en la clínica, ofrecerá en un futuro indicaciones de manejo más concretas e individualizadas. Referencias • • • • • •

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Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, Beck-Peccoz P, Bordi C, et al. Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 5658-5671. Machens A, Niccoli-Sire P, Hoegel J, Frank-Raue K, van Vroonhoven TJ, Roeher HD, et al. Early malignant progresión of hereditary medullary thyroid cancer. N Engl J Med 2003; 349: 1517-1525. Robledo M, Gil L, Pollán M, Cebrián A, Ruiz S, Azañedo M, et al. Polymorphisms G691S/S904S of RET as Genetic Modifiers of MEN 2A. Cancer Res 63;2003: 1814-1817. Rodríguez JM, Balsalobre MD, Pomares FJ, Torregrosa N, Ríos A, Carbonell P, et al. Prophylactic Thyroidectomy in MEN 2A Syndrome: Experience in a Single Center. J Am Coll Surg 2002; 195: 159-156. Sziani G, Meier C, Komminoth P, Zumsteng UW. Review of Multiple Endocrine Neoplasia Type 2A in Children: Therapeutics Results of Early Thyroidectomy and Prognostic Value of Codon Analysis. Pediatrics 2004; 111: 132-139. Yip L, Cote GJ, Shapiro SE, Ayers GD, Herzog CE, Sellin RV, et al. Multiple endocrine neoplasia type 2: evaluation of the genotype-phenotype relationship. Arch Surg 2003; 138: 409-16.

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Papel del oncogen V599EB-RAF en la diferenciación y transformación tiroidea. G. Riesco Eizaguirre y P. Santisteban Servicio de Endocrinología del Hospital Universitario La Paz e Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols.” CSIC-UAM Madrid. Recientemente se ha descubierto que la mutación V599EB-RAF está presente en el 40 % de los carcinomas papilares de tiroides (CPT), siendo el oncogen más frecuente asociado a este tumor, por encima del RET, RAS y TRK. El papel que juega este oncogen en la transformación y desdiferenciación tumoral del CPT está aún poco clara, así como su relevancia en la práctica clínica. En este estudio preliminar, analizamos 23 casos de cáncer diferenciado de tiroides (20 CPT y 3 CFT) en los que encontramos la mutación V599EB-RAF en 10 CPT (50%) y en ningún CFT. Dicha mutación está presente en tumores con un estadiaje tumoral más elevado (III y IV) y en metástasis (2/3 metástasis ganglionares), lo cual parece indicar que V599E B-RAF confiere mayor agresividad a estos tumores. En un intento de estudiar los parámetros de diferenciación tiroidea afectados por dicha mutación, hemos usado la línea diferenciada de tiroides PCCL-3. Estas células expresan los genes específicos de tiroides TG (Tiroglobulina), TPO (Tiroperoxidasa), NIS (Transportador de yodo) y RTSH (receptor de TSH), así como los factores de transcripción que determinan su expresión (TTF-1, FoxE1 y Pax8). Los primeros resultados que hemos obtenido tras las transfecciones transitorias de las formas silvestre y mutada de B-RAF en dichas célula, indican una disminución intensa de la expresión de NIS y TPO, así como una disminución leve y poco significativa de R-TSH y TG. Por último, en las células NPA, derivadas de un carcinoma papilar pobremente diferenciado humano, hemos demostrado que presentan homocigosis para la mutación V599E B-RAF y que la expresión de NIS está prácticamente ausente. En cambio, estas células expresan R-TSH, aunque a niveles más bajos. Estos hallazgos sugieren que V599EBRAF es un potente oncogen en el CPT. Financiado con proyectos FIS, Instituto de Salud Carlos III. RCGC (C03/10) y BMC 2001-2087.

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p27 (Kip1) cytoplasmatic mislocalitation is associated with the activation of the PI3K/AKT pathway in thyroid cancer G. Troncone, M.L. Motti, L. Palombini, A. Fusco, G. Viglietto Dipartimenti di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare "L Califano" e di Scienze Biomorfologiche e Funzionali, Università Federico II, Napoli, Italia. The functional inactivation of the tumor suppressor p27kip1 in human cancer occurs either through loss of expression or phosphorylation-dependent cytoplasmic sequestration. In this work, we demonstrate that disregulation of the PI3K/AKT pathway plays an important role in thyroid carcinogenesis and that p27kip1 is a key target of the growth-regulatory activity exerted by this pathway in thyroid cancer cells. Using specific pharmacological inhibitors of PI3K (LY294002), as well as dominant active AKT constructs (myrAKT), we demonstrate that the PI3K/AKT-dependent control of thyroid cell proliferation occurs through regulation of p27kip1 sub-cellular localization. Results obtained with phospho-specific antibodies and with transfection of non-phosphorylable p27kip1 mutant constructs, demonstrated that phosphorylation of p27kip1 at T157 and T198 (but not at S10 or T187) accounts for PI3K/AKT-dependent regulation of p27kip1 mislocalization in thyroid cancer cells. Finally, we extended the results obtained in cellular systems to human tumors. Analysis of thyroid carcinomas (n=100) indicated that p27kip1 phosphorylation at T157/T198 and cytoplasmic mislocalization is preferentially associated with activation of the PI3K/AKT pathway.

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Identificación de factores genéticos de riesgo asociados al desarrollo de carcinoma medular de tiroides esporádico Ruiz-Llorente S* 1,Montero-Conde C* 1, Pollán M 2, Cascón A 1, Letón R 1, Mercadillo F 1, González E 3, Urioste M 3, Benítez J 3, Dopazo J 4 y Robledo M 1. 1 Grupo de Cáncer Endocrino Hereditario, 3 Departamento de Genética Humana, 4 Unidad de Bioinformática. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, España. 2 Centro Nacional de Epidemiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España. Grupo de Cáncer Endocrino Hereditario, Patología Molecular. CNIO. C/ Melchor Fernández Almagro, 3, 28029, Madrid. Fax: 34 91 2246927; email: [email protected] Introducción El Carcinoma Medular de Tiroides (CMT) representa el 5% de los neoplasias tiroideos, y puede ocurrir esporádicamente (75% de los casos de CMT) ó como parte del síndrome conocido como Neoplasia Endocrina Múltiple tipo II (NEM II), enfermedad autosómica dominante causada por mutaciones germinales en el protooncogen RET. Aunque un número limitado de mutaciones son responsables de este síndrome, NEM II presenta una variabilidad intra e interfamiliar, que sugiere la existencia de factores genéticos modificadores del comportamiento clínico. Objetivos Identificar en genes pertenecientes a la ruta del proto-oncogen RET ó genes relacionados con el tiroides, posibles variantes de riesgo asociadas al incremento en la susceptibilidad al desarrollo de CMT esporádico. Pacientes, materiales y métodos Utilizando diferentes bases de datos públicas, se seleccionaron 85 variantes polimórficas (alguna de ellas con potencial efecto fenotípico) que se localizaban a lo largo de la secuencia de 25 genes de interés. Posteriormente, se realizaron ensayos de discriminación alélica (sondas TaqMan) en 188 muestras de ADN de sangre periférica de pacientes con CMT esporádico y en 244 controles sanos de población española, para inferir los haplotipos con los polimorfismos de cada gen y comparar su frecuencia en casos frente a controles, identificando posibles haplotipos de riesgo para CMT esporádico. El estudio de estas variantes se completó con el análisis de las variantes de forma individual, mediante la herramienta disponible en http://ihg.gsf.de/cgibin/hw/hwa1.pl. Conclusión Hemos identificado al menos 3 genes que presentan haplotipos de riesgo a desarrollar CMT esporádico. Esto permitirá con estudios posteriores de estos genes definir exactamente la variante funcional implicada en el incremento de la susceptibilidad al desarrollo de Carcinoma Medular de tiroides Esporádico. * Estos autores han contribuido igualmente en este trabajo. Agradecimientos: S. R-L es becario del Ayuntamiento de Majadahonda y C. M-C es becaria del Gobierno Vasco. Este trabajo está parcialmente financiado por FIS (02/0919) y la Fundación Genoma España. Agradecemos su colaboración en este trabajo a Cristina Álvarez y a José Ángel Díez, endocrinólogos del Hospital Universitario La Paz y del Hospital Universitario Clínico San Carlos de Madrid, respectivamente. 27

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Identificación de Marcadores Genéticos de Riesgo asociados a Carcinomas Papilares y Foliculares de Tiroides Montero-Conde C*, Ruiz-Llorente S*, Cascón A, Letón R, Mercadillo F, González E, Yankilevich P, Dopazo J, Benítez J y Robledo M. Grupo de Cáncer Endocrino Hereditario, Departamento de Genética Humana. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, España; Cristina Montero-Conde. Grupo de Cáncer Endocrino Hereditario, CNIO. Madrid, España. [email protected] Introducción El cáncer de tiroides es un enfermedad compleja cuya etología puede considerarse poligénica, por lo que pueden existir varios genes de baja penetrancia que incrementen el riesgo de desarrollo. Dentro de las neoplasias tiroideas, el carcinoma papilar (PTC) es el más frecuente (80%), seguido del folicular (FTC) (10%). Ambas lesiones se originan a partir del mismo tipo celular: las células foliculares tiroideas. Objetivo Analizar variantes (SNPs) de genes específicos de la fisiología de las células foliculares (TPO, TSHR,....), de genes vinculados a estos carcinomas (BRAF, RET,...), así como de genes del ciclo celular en general (INK4a, INK4b, MDM2, ATM), para identificar haplotipos y marcadores asociados significativamente al desarrollo de PTC y FTC . Material Actualmente tenemos ADN de sangre periférica de 150 PTCs y FTCs, y 270 controles sin ninguna patología tiroidea representativos de población española. Método Los genotipos de los marcadores seleccionados se obtuvieron por la técnica de discriminación alélica mediante sondas ABI TaqMan 7900HT. Los SNPs analizados hasta el momento son 65 correspondientes a 13 genes. Los marcadores se dispusieron a lo largo de cada gen en posiciones intrónicas y potencialmente funcionales. Utilizamos el programa PHASE v2.0.2 para comparar las distribuciones haplotípicas en casos y controles para cada gen. Mediante un test estadístico identificamos el/los haplotipos caso-control significativamente diferentes. Completamos el estudio analizando las frecuencias alélicas y genotípicas caso-control de cada SNP a través de la página web: http://ihg.gsf.de/cgibin/hw/hwa1.pl. Estos datos nos han permitido identificar 5 SNPs relacionados con la susceptibilidad de desarrollar carcinomas tiroideos. Agradecimientos a Ignacio Ramos del Hospital Vega Baja de Orihuela, a Joaquín Serrano del Hospital Virgen de los Lirios de Alcoy, a Luis Arribas del hospital Marina Alta de Denia, a Mº Rosa Pinedo del Hospital de Elda, a Francisco Pomares del Hospital Universitario de San Juan de Alicante, y a Pino Navarro y Pedro López Mondéjar del Hospital General Universitario de Alicante. *C. Montero-Conde y S. Ruiz-Llorente han contribuido igualmente en este trabajo. CM-C, tiene una beca del Gobierno Vasco, y SR-LL tiene una beca del Ayuntamiento de Majadahonda. Este trabajo está parcialmente financiado por FIS (FIS 02/0919) y la Fundación de Genoma España. 28

Resumenes de las comunicaciones orales

Estudio inmunohistoquímico de antígenos citohistológico de los nódulos tiroideos

en

el

diagnóstico

R Orellana, N Combalia, MR Bella, G Giménez∗, D Mauricio∗, G Marqués∗∗, A Zidan∗∗∗, M Rey Servicio de Patología, Unidad de Endocrinología∗, Serv de Cirugía∗∗, Serv de Diagnòstic per la Imatge∗∗∗. Corporació Sanitària Parc Taulí. Institut Universitari. Sabadell (Barcelona) Objetivo. Establecer el valor diagnóstico del estudio inmunohistoquímico en bloque celular y pieza quirúrgica en las diferentes patologías tiroideas respecto a la expresión de antígenos CK-19, Galectina-3, Involucrina, p27 y MIB-1. Material y método. Estudio preliminar de 22 pacientes tiroidectomizados según categorías diagnósticas: 5 hiperplasias nodulares (HN), 5 adenomas foliculares (AF), 4 carcinomas foliculares (CF) y 7 carcinomas papilares (CP); con diagnóstico citológico previo. Se realiza determinación de CK-19(b170), Galectina-3(9C4), Involucrina(SY5), p27(1B4) y MIB-1 en el bloque celular y en la pieza quirúrgica y se valora la expresión antigénica de forma semicuantitativa. Resultados. Resultados del estudio inmunohistoquímico en la pieza quirúrgica

Diag NH FA FC PC

Inv 6

Gal-3 1(+) 7(++)

ck-19 2(++) 3(+) 1(++) 7(+++)

p27 5* 4¹ 4² 6³

Mib-1 5• 5• 4• 7•

Total 5 5 4 7

/ ¹ 4 casos score 2+, 1 caso 1+ / ² 2 casos score 2+, 2 casos 1+ ³ 4 casos score 1+, 2 casos 2+, 1 caso 0+ / • todos score 1+

* 4 casos score 3+, 1 caso 2+

/

Los resultados fueron similares en el bloque celular, aunque la Involucrina fue negativa en 3 CP. La expresión de MIB-1 y p27 se detecta tanto en lesiones benignas como malignas. Sorprende que la Galectina-3, CK-19 e Involucrina se detecten en los CP, aunque dentro de la misma lesión presenten positividad heterogénea. Conclusiones. Observamos que la expresión de Galectina-3 (p