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UNIVERSIDAD DE SAN MARTÌN DE PORRES

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

Curso: Laboratorio Clínico

Tema: Tinción gram

Docentes: Dr. Reymundo Domínguez Jara. Dra. Yuptón Chávez, Verónica. Dr. Farias Rodríguez Tony.

Alumno: Edwin Omar Ramírez Peña (2007501161)

CHICLAYO-PERÙ 2013

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Contenido MARCO TEORICO ....................................................................................................................... 3 MATERIALES .............................................................................................................................. 4 PROCEDIMIENTO: ...................................................................................................................... 5 FUNDAMENTO DE LOS REACTIVOS: .......................................................................................... 8 FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN: ................................................................................................ 8 RESULTADO: .............................................................................................................................. 9 BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 11

Laboratorio Clínico – Tinción Gram

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MARCO TEORICO La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular. Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada. Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante. Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante. Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realización, a saber:  

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Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso. La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente. Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coli, S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados. Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram. Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo. Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias.

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MATERIALES        

Cristal violeta Alcohol acetona Safranina Lugol Agua Destilada Mechero Placa Petri con cultivo de colonias Microscopio

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PROCEDIMIENTO: 1) Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar. La extensión debe de rendir una fina monocapa representativa de la muestra.

2) Realizar una fijación mediante calor, por paso directo de 2 a 3 veces a través de la llama. Esperar a que el porta se enfríe antes de su tinción.

3) Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.

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Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación.

4) Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lavar la preparación.

5) Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante 10 segundos.

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6) Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. lavar la preparación.

7) Dejar secar al aire y observar al microscopio, podremos observar: Bacterias teñidas de azul-violeta y/ o rojo, dependiendo a que grupo pertenezca la bacteria (Gram+ o Gram-)

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FUNDAMENTO DE LOS REACTIVOS:    

Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tiñe la bacteria color violeta. Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a resistir la decoloración. Agente decolorizante- alcohol etílico al 95%, sirve como solvente de lípidos y agente deshidratante de proteínas. Remueve el cristal violeta. Contratinte- Safranina, tiñe de rojo la bacteria.

FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN: 

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Membrana externa de las Gram– es soluble en solventes orgánicos como el alcohol la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el complejo cristal violeta/yodo que se formó por lo que va perdiéndose el color azul-violeta. Las Gram+ no tienen su capa susceptible a la acción de solventes orgánicos se deshidratan los poros y se cierran reteniéndose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-violeta.

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RESULTADO:

Staphylococcus Los estafilococos (staphylococcus en inglés o su abreviación staph), es un tipo de bacteria que vive en muchas superficies de la piel sin ocasionar ningún daño, especialmente alrededor de la nariz, la boca, los genitales y el ano. Pero cuando la piel es punzada o en el caso de una herida, las bacterias estafilococos pueden entrar en la herida y causar una infección. La forma de cocos tiende a ser de tamaño mucho mas uniforme que los otros tipos morfológicos de bacterias, tienen un diámetro aproximado de 1 mm típicamente son casi perfectos en su forma esférica. Su característica morfológica más obvia es la notable tendencia a presentarse como masas de células, aparentando racimos. Ello es consecuencia de una división celular en tres planos, junto a la tendencia de las células hijas de permanecer en estrecha proximidad para crear el aspecto característico.

Los pacientes de los hospitales pueden contraer infecciones por estafilococos de la piel:  

En cualquier lugar donde un catéter o sonda ingrese a su cuerpo. Esto abarca sondas pleurales, sondas vesicales, vías intravenosas (IV) o vías centrales. En heridas quirúrgicas, úlceras de decúbito (también llamadas escaras de decúbito) o úlceras de los pies.

Una vez que el estafilococo entra en el cuerpo, puede propagarse a los huesos, las articulaciones, la sangre o cualquier órgano, como los pulmones, el corazón o el cerebro. El estafilococo también puede propagarse fácilmente de una persona a otra.

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CONCLUSIONES 

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La tinción de gram resulta de gran importancia para poder identificar el tipo de bacteria de acuerdo a la clasificación dada por la composición de sus paredes en grampositivas y gran negativas, así mismo para la identificación morfológica de las mismas y confirmar el diagnóstico médico. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas. El cristal violeta fija a las grampositivas y la safraninana las gramnegativas.

ANEXOS ¿Cómo realiza un cultivo? Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los microorganismos. A continuación se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación, duración, etc. Muchas de las bacterias patógenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37ºC habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias son muy difíciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.

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BIBLIOGRAFÍA 1) Microbiología médica, 6a ed. Autores

Patrick R. Murray, Kenneth S. Rosenthal, Michael A. Pfaller

Edición

6

Editor

Elsevier España, 2009

2) Microbiologia y parasitologia humana: Bases etiologicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias

Autor

Raúl Romero Cabello

Edición

3

Editor

Ed. Médica Panamericana, 2007

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