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• Luis Enrique Alvarado

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LA TINCION DE GRAM

1. INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. La tinción de Gram es uno de los métodos de mayor importancia y relevancia que se emplean en el laboratorio de Microbiología. Esta tinción constituye un tipo de tinción diferencial puesto que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: gram positivas y gram negativas en virtud a la coloración que estas desarrollen y la coloración dependerá de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.

El danés Christian Gram en el año de 1884 dejó una huella indeleble e imperecedera para la humanidad, al emplear y estudiar esta tinción.

El objetivo primordial del presente trabajo es buscar, recabar y documentar información sobre esta tinción que a la fecha no ha perdido vigencia ni notoriedad y sigue siendo la piedra angular en el campo de microbiología.

2. OBJETIVO  Reconocer la tinción adoptada por la pared bacteriana del Gram (+) y el Gram (-)  Explicar o fundamentar la coloración del Gram

3. MARCO TEÓRICO

1.1. ¿QUÉ ES LA TINCIÓN DE GRAM?

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el lector debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM. 1.2. RESEÑA HISTRORICA

Hablar de la Tinción de Gram es remontarse a los año de 1882, con el famoso científico danés Christian Hans Gram quien desarrolló la tinción más importante en microbiología que a la fecha lleva su nombre. Para el año de 1884, Gram presenta sus trabajos a la sociedad científica de su época y publica todas sus experiencias y conocimientos en lo relativo a su Tinción.

Para 1923, posterior a la época dorada de Gram, se inician las modificaciones a la Tinción original, así nace la llamada modificación de Hucker; donde la violeta cristal se disuelve con alcohol etanol y se prepara con una solución de oxalato de amonio. La solución se emplea por un período no mayor de 30 segundos. Luego se aplica una solución Iódica de Gram (lugol + bicarbonato sódico diluido). El alcohol-acetona será la solución decoloradora y no tomará más de 5 segundos en su aplicación. La safranina o fuscina básica al 0.1 a 0.2 % será el contra tinte o tinte de contraste y su periodo de tinción no pasará los 30 segundos."315'

Posteriormente, el científico Kopeloff efectuó modificaciones a la tinción de Hucker para microorganismos que no se veían bien y presentaban dificultades en la coloración, tal es el caso de los anaerobios; estas bacterias sólo se tiñen ligeramente y eran muy fáciles de decolorar por consiguiente no se observaban apropiadamente al microscopio. La modificación de Kopeloff emplea los mismos colorantes que Hucker

pero se cambia la concentración de los tintes unos a mayor concentración y otros a menor. El de-colorante es alcohol - acetona en proporción (7:3). Además, los tiempos de tinción varían ampliamente lo cual facilita la observación de estos gérmenes.

En 1978. El científico Gregersen determinó que las bacterias Gram negativas se diferenciaban de las Gram positivas en virtud a la composición de la pared celular al entrar en contacto con una solución alcalina diluida. Una suspensión de microorganismos en KOH al 3% toman un aspecto viscoso debido a la liberación de los lipopolisacáridos y DNA cuando se trabaja con bacterias Gram negativas. Mientras que las Gram positivas no presentan dicha viscosidad en virtud a la estructura de su pared celular.

1.3. PRINCIPIOS DE LA TINCION DE GRAM

 Las bacterias presentan características determinantes y constitutivas en la pared

celular,

la

cual

le

confiere

propiedades

determinantes

a

cada

microorganismo. Así la pared celular no tan sólo le sirve para dar forma, rigidez y tamaño a la célula, sino que soporta altas presiones osmóticas que pueden llevarla a una muerte segura por lisis osmótica.

 El péptidoglicano es la sustancia que le confiere la rigidez a la pared celular y le brinda todo el soporte que esta necesita. La molécula de péptidoglicano está conformada principalmente por disacáridos, constituidos por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico que se unen por enlaces de B (1>4) repitiéndose un número plural de veces y un enlace de tetra-péptido unido a la N-acetilglucosamina. Este compuesto se alterna con los aminoácidos L y D de alanina. D-ácido glutámico y usina o ácido diaminopimélico. Las cadenas de estas moléculas se unen entre si constituyendo una ultra estructura de enlaces peptídicos con los aminoácidos que conforman una estructura rígida y continua que es la pared celular bacteriana. La estructura de estos puentes peptídicos varía entre las especies bacterianas.  Los microorganismos presentan marcadas diferencias estructurales en la pared celular que son la base para clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Las bacterias Gram positivas tienen una pared

celular

gruesa

conformada

de

varias

capas

interconectadas

de

péptidoglicano en niveles que van por el orden de 80 a 90 % de la estructura total.

 También, poseen otras sustancias como: el ácido teicoicos que son polímeros de hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato unidas entre sí por enlaces fosfodiéster. Otro elemento importante que se encuentra en ciertas bacterias Gram positivas es el ácido teicurónico que se sintetiza como respuesta a la falta de ácido teicoico por limitación de fosforo  Por otro lado, las bacterias Gram negativas tienen una línea capa de péptidoglicano que constituyen un 20% de la pared celular. Esta estructura se encuentra rodeada por una segunda membrana lipídica exterior que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas que son de variada complejidad. La membrana externa se encuentra unida a la capa de péptidoglicano por medio de lipoproteínas.

 El colorante básico violeta cristal penetra en las células bacterianas tanto de microorganismos Gram positivos como de Gram negativos. Luego el lugol o Yodo de Gram entra en las células y constituye un complejo insoluble con la solución acuosa de violeta crista  La mezcla de alcohol-acetona tiene como función determinante la decoloración ya que la misma es soluble al complejo que se ha formado violeta cristal -Yodo de Gram.

 Las bacterias Gram positivas no se decoloran. Mientras que las Gram negativas se decoloran. Sin duda alguna esta característica marca la gran diferencia entre esto dos tipos de células.  Los microorganismos Gram negativos tienen espacios en la estructura de su pared celular y el alcohol-acetona es un solvente lipídico que actúa sobre la membrana exterior de la pared de la célula y afecta la membrana citoplásmica donde se unen los péptidoglicano.  Además, la delgada capa de péptidoglicano no retiene el complejo violeta cristal yodo lo cual obliga a las células Gram negativas a decolorarse.

 Sin embargo las células Gram positivas debido a sus gruesas paredes de péptidoglicano y pocos lípidos no son permeables al decolorador puesto que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, alterando y afectando el pequeño espacio entre las moléculas. El complejo violeta cristal-yodo queda atrapado dentro de la pared celular tiñendo a las bacterias Gram positivas de color azul.  Finalmente, se adiciona la safranina que es un tinte de contraste y puede o no utilizarse ya que en algunos casos se sustituye por carbol-fuscina, cuya función es poner de manifiesto las bacterias que estaban decoloradas es decir le da color a las bacterias Gram negativas, tomando una tonalidad roja.

4. RESUMEN

La tinción de Gram es un procedimiento sencillo pero de gran utilidad, empleado por todos los laboratorios de microbiología, lo cual le da un sentido de universalidad y su aplicación cubre diversos campos de la ciencia. Esta tinción constituye un tipo de tinción diferencial ya que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas en virtud a la coloración que estas desarrollen y la coloración dependerá de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.

La tinción de Gram es un recurso barato y sencillo que bien utilizado puede brindar valiosa información; dependerá de nosotros darle el buen uso para obtener la mejor información posible.

5. CONCLUSIONES  La tinción de Gram (+) se vuelve violeta y se mantiene de ese color porque el complejo CV-I continua dentro dela celula dándole la coloracio  La tinción del Gram (-) se vuelve rosa pues al eliminarse las grasas de la paredes aumenta la porosidad y el complejo CV-I se separa de la celula

6. BIBLIOGRAFIA

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