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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE PESQUERÍA

“OBTENCIÓN DE GELATINA DE PIEL DE PERICO (Coryphaena hippurus) Y CARACTERIZACIÓN DE SUS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS”

Presentada por: RENZO AARÓN ROMERO SANTIVAÑEZ

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE INGENIERO PESQUERO

Lima – Perú 2016

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE PESQUERÍA

“OBTENCIÓN DE GELATINA DE PIEL DE PERICO (Coryphaena hippurus) Y CARACTERIZACIÓN DE SUS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS” Tesis para optar el título de Ingeniero Pesquero Presentada por: RENZO AARÓN ROMERO SANTIVAÑEZ Sustentada y aprobada por el siguiente jurado

__________________________ M.Sc. Raúl Porturas Olaechea Presidente

____________________________

__________________________

Dra. Fabiola Otilia Olivares Ponce

Dr. Elvito Fabián Villegas Silva

Miembro

Miembro

__________________________

__________________________

Dr. César Antonio Pizardi Díaz

Ing. Silvia Elvira Pandia Estrada

Asesor

Co-asesor Lima – Perú 2016

DEDICATORIA

A mis padres Renán y María Eugenia, por el amor y apoyo incondicional que me brindaron durante todos estos años.

AGRADECIMIENTO

-

En primer lugar, agradecer a Dios por permitirme llegar a este momento, por las pruebas y obstáculos que puso en mi camino, que hizo que me supere en todo momento y valore todo el esfuerzo depositado hasta el día de hoy.

-

A mis padres Renán y María Eugenia, gracias por su apoyo económico para iniciar y culminar la etapa universitaria y a mi hermana Tatiana por sus consejos.

-

Al Dr. César Pizardi, asesor de la presente investigación, gracias por el tiempo brindado, el apoyo incondicional en el modelamiento de la tesis y los amplios conocimientos transferidos con la finalidad de realizar un buen trabajo de investigación.

-

A la Ing. Silvia Pandia, co-asesora de la presente investigación, gracias por la dedicación puesta en esta tesis, por tus acertadas correcciones, por tu amistad y consejos a lo largo del tiempo que nos conocemos y gracias por ser una madre dentro del ambiente laboral.

-

Al Instituto Tecnológico de la Producción (ITP) a través de la Ing. Silvia Pandia por brindarme la oportunidad de la ejecución de la tesis en el Laboratorio de Físico Química y al Mg.Sc. Alberto Salas, Director General de Investigación Tecnológica para la Transformación Pesquera, por aceptarlo. Así mismo, agradecer a los amigos y profesionales del ITP, en especial al Blgo. Armando Solari y al Mg.Sc. Miguel Albrecht.

-

A mi amor, Mellisa, gracias por estar conmigo para aconsejarme, darme fuerzas y apoyarme incondicionalmente a lo largo de la realización de la tesis. A mis hermanos y mejores amigos, Sarita, Freddy, Francisco y Priscilla, gracias por su valiosa amistad y por los buenos consejos que me dieron para tomar siempre las decisiones correctas.

-

A la Dra. Rosa Aquino, quien me brindó su apoyo desinteresadamente con la finalidad de que logre culminar con éxito esta investigación.

-

Al Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECyT), por el financiamiento al Proyecto N° 108-2014.

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN SUMMARY I.

INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1

II.

REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................. 3 2.1.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL PERICO ............................................ 3

2.1.1.

Clasificación taxonómica ................................................................................ 3

2.1.2.

Características morfológicas ........................................................................... 4

2.1.3.

Distribución geográfica y hábitat .................................................................... 4

2.1.4.

Desembarque total de perico en el Perú .......................................................... 5

2.1.5.

Composición proximal, composición física y rendimientos por tipo de corte 6

a.

Composición proximal ........................................................................................ 6

b.

Composición física .............................................................................................. 6

c.

Rendimientos por tipo de corte ........................................................................... 7

2.2.

COLÁGENO .......................................................................................................... 7

2.3.

GELATINA .......................................................................................................... 10

2.3.1.

Fuentes de obtención de gelatina ................................................................... 10

2.3.2.

Tipos de gelatinas por proceso de obtención ................................................. 11

a.

Proceso ácido o gelatina tipo A ......................................................................... 11

b.

Proceso alcalino o gelatina tipo B ..................................................................... 11

2.4.

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA GELATINA .............................................. 11

2.4.1.

Composición proximal .................................................................................. 11

2.4.2.

Composición en aminoácidos ........................................................................ 12

2.4.3.

Distribución de pesos moleculares ................................................................ 12

2.5.

PROPIEDADES FÍSICAS DE LA GELATINA .................................................. 12

2.5.1.

Fuerza de gel .................................................................................................. 13

2.5.2.

Temperatura de fusión ................................................................................... 13

2.5.3.

Viscosidad ..................................................................................................... 14

2.6.

APLICACIONES DE LA GELATINA ................................................................ 14

2.7.

METODOLOGÍA DE SUPERFICIE DE RESPUESTA ..................................... 15

2.7.1. a.

Etapas de la metodología de superficie de respuesta ..................................... 16 Cribado .............................................................................................................. 18

b.

Búsqueda I o de primer orden ........................................................................... 18

c.

Búsqueda II o de segundo orden ....................................................................... 18

2.7.2. a.

Relación modelo – diseño ................................................................................. 19

b.

Técnicas de optimización .................................................................................. 20

2.8.

OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE VARIAS RESPUESTAS ....................... 20

2.8.1. III.

Elementos de la metodología de superficie de respuesta .............................. 18

Método de la función de deseabilidad ........................................................... 20

MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................. 24

3.1.

LUGAR DE EJECUCIÓN.................................................................................... 24

3.2.

MATERIALES ..................................................................................................... 24

3.2.1.

Materia prima ................................................................................................ 24

3.2.2.

Materiales de laboratorio ............................................................................... 24

3.2.3.

Reactivos químicos ........................................................................................ 25

3.2.4.

Equipos .......................................................................................................... 26

3.3.

MÉTODOS ANALÍTICOS .................................................................................. 27

3.3.1.

Análisis realizados a la materia prima ........................................................... 27

a.

Análisis de composición proximal .................................................................... 27

b.

Determinación del contenido de hidroxiprolina ................................................ 27

c.

Determinación de pesos moleculares por electroforesis ................................... 28

d.

Determinación de la composición en aminoácidos ........................................... 28

3.3.2.

Análisis realizados durante el diseño experimental ....................................... 29

a.

Fuerza de gel ..................................................................................................... 29

b.

Rendimiento de extracción de proteína ............................................................. 29

3.3.3.

Rendimiento de la gelatina obtenida en los niveles óptimos de las variables 29

3.3.4. Análisis realizados para la caracterización de la gelatina obtenida en los niveles óptimos de las variables ................................................................................... 30 a.

Viscosidad ......................................................................................................... 30

b.

Determinación de la temperatura de fusión....................................................... 30

c.

Determinación de la temperatura de gelificación .............................................. 31

d.

Determinación del pH ....................................................................................... 31

e.

Determinación de la actividad de agua (Aw) .................................................... 31

3.4.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ................................................................. 31

3.4.1.

Diagrama de flujo .......................................................................................... 31

3.4.2.

Descripción del proceso................................................................................. 33

a.

Materia prima .................................................................................................... 33

b.

Cortado .............................................................................................................. 33

c.

Lavado ............................................................................................................... 33

d.

Limpieza ............................................................................................................ 33

e.

Acondicionado en medio ácido ......................................................................... 34

f.

Extracción.......................................................................................................... 34

g.

Filtrado .............................................................................................................. 34

h.

Secado ............................................................................................................... 34

i.

Molienda............................................................................................................ 35

j.

Envasado ........................................................................................................... 35

k.

Almacenamiento................................................................................................ 35

3.5.

DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................ 35

3.5.1.

Etapa I: Selección .......................................................................................... 36

3.5.2.

Etapa II: Búsqueda I o de primer orden ......................................................... 36

a.

Definición de la función objetivo y variables ................................................... 36

b.

Diseño factorial 2k con réplica en el punto central............................................ 36

c.

Estimación del modelo matemático de primer orden ........................................ 38

3.5.3.

Etapa III: Búsqueda II o de segundo orden ................................................... 39

a.

Diseño central compuesto (DCC) ..................................................................... 39

b.

Estimación de los modelos matemáticos de segundo orden ............................. 41

3.6.

OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LAS RESPUESTAS .............................. 43

3.7.

VERIFICACIÓN DE LOS NIVELES ÓPTIMOS DE LAS VARIABLES ......... 45

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 46

4.1.

MATERIA PRIMA ............................................................................................... 46

4.1.1.

Composición proximal .................................................................................. 46

4.1.2.

Contenido de hidroxiprolina .......................................................................... 47

4.1.3.

Determinación de pesos moleculares por electroforesis................................ 47

4.1.4.

Composición en aminoácidos ........................................................................ 48

4.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................ 50

4.2.1. Búsqueda I o de primer orden: estimación de los modelos matemáticos de primer orden ................................................................................................................. 50 a.

Fuerza de gel ..................................................................................................... 50

b.

Rendimiento de extracción de proteína ............................................................. 56

4.2.2. Búsqueda II o de segundo orden: estimación de los modelos matemáticos de segundo orden .............................................................................................................. 62 a.

Fuerza de gel ..................................................................................................... 62

b.

Rendimiento de extracción de proteína ............................................................. 72

4.3.

OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LAS RESPUESTAS .............................. 82

4.4.

VERIFICACIÓN DE LOS NIVELES ÓPTIMOS DE LAS VARIABLES ......... 84

4.4.1.

Fuerza de gel .................................................................................................. 84

4.4.2.

Rendimiento de extracción de proteína ......................................................... 85

4.5.

RENDIMIENTO DE LA GELATINA ................................................................. 86

4.6.

CARACTERIZACIÓN DE LA GELATINA ....................................................... 86

4.6.1.

Composición proximal y pH.......................................................................... 86

4.6.2.

Determinación de pesos moleculares por electroforesis................................ 87

4.6.3.

Composición en aminoácidos ........................................................................ 88

4.6.4.

Viscosidad ..................................................................................................... 91

4.6.5.

Temperaturas de fusión y gelificación........................................................... 92

4.6.6.

Actividad de agua .......................................................................................... 93

V. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 94 VI.

RECOMENDACIONES .......................................................................................... 95

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 96

VIII.

ANEXOS ............................................................................................................ 102

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Composición proximal del perico ........................................................................... 6 Tabla 2: Composición física del perico ................................................................................. 7 Tabla 3: Rendimientos por tipo de corte del perico............................................................... 7 Tabla 4: Clasificación y descripción de los tipos de colágeno .............................................. 9 Tabla 5: Variables independientes y sus respectivos niveles utilizados para el diseño factorial 2k............................................................................................................................ 37 Tabla 6: Diseño experimental 2k con réplicas en el punto central....................................... 37 Tabla 7: Variables independientes y sus respectivos niveles utilizados para la etapa correspondiente al diseño central compuesto (DCC) .......................................................... 40 Tabla 8: Diseño central compuesto (DCC).......................................................................... 41 Tabla 9: Composición proximal de la piel de perico (%) .................................................... 46 Tabla 10: Contenido de hidroxiprolina en la piel de perico (%) ......................................... 47 Tabla 11: Composición en aminoácidos de la piel de perico .............................................. 49 Tabla 12: Fuerza de gel observada y estimada en el diseño factorial 2k con réplicas en el punto central ........................................................................................................................ 51 Tabla 13: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel ................... 52 Tabla 14: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel y prueba de falta de ajuste .................................................................................................................. 53 Tabla 15: Coeficientes de regresión estimados para la fuerza de gel .................................. 54 Tabla 16: Rendimiento de extracción de proteína observada y estimada en el diseño factorial 2k con réplicas en el punto central ......................................................................... 57 Tabla 17: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína ........................................................................................................................... 58 Tabla 18: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína y prueba de falta de ajuste ............................................................... 59 Tabla 19: Coeficientes de regresión estimados para el rendimiento de extracción de proteína ................................................................................................................................ 60 Tabla 20: Fuerza de gel observada y estimada en el diseño central compuesto .................. 63 Tabla 21: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel ................... 64 Tabla 22: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel y prueba de falta de ajuste .................................................................................................................. 65

Tabla 23: Coeficientes de regresión estimados para la fuerza de gel .................................. 66 Tabla 24: Rendimiento de extracción de proteína observado y estimado en el diseño central compuesto ............................................................................................................................ 73 Tabla 25: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína ........................................................................................................................... 74 Tabla 26: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína y prueba de falta de ajuste ............................................................... 75 Tabla 27: Coeficientes de regresión estimados para el rendimiento de extracción de proteína ................................................................................................................................ 76 Tabla 28: Solución de optimización, respuestas estimadas y deseabilidad global para la obtención de gelatina de piel de perico ............................................................................... 83 Tabla 29: Comparación de los valores estimados y observados para las respuestas en el punto óptimo ........................................................................................................................ 84 Tabla 30: Rendimiento de la gelatina obtenida de piel de perico ........................................ 86 Tabla 31: Composición proximal y pH de la gelatina de piel de perico ............................. 86 Tabla 32: Composición en aminoácidos en gelatina obtenida de diferentes fuentes .......... 89 Tabla 33: Hidroxiprolina en gelatina obtenida de diferentes pieles de pescado ................. 90 Tabla 34: Propiedades físicas de la gelatina de piel de perico ............................................ 91

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Perico (Coryphaena hippurus) ............................................................................... 4 Figura 2: Distribución geográfica mundial del perico ........................................................... 5 Figura 3: Desembarque total y destinado para fresco de perico en Perú ............................... 5 Figura 4: Estructura del colágeno en la que se muestra (de abajo a arriba) la regularidad de la estructura primaria: la hélice levógira, la triple hélice dextrógira, una molécula de 300 nm de largo y la organización de moléculas en una fibrilla típica, en la cual las moléculas de colágeno presentan enlaces cruzados ................................................................................ 8 Figura 5: Esquema de las etapas de la MSR en su contexto amplio ................................... 17 Figura 6: Relación modelo-diseño....................................................................................... 19 Figura 7: Función de deseabilidad individual para la maximización de una respuesta ....... 22 Figura 8: Función de deseabilidad individual para la minimización de una respuesta ....... 22 Figura 9: Función de deseabilidad para la obtención de un nivel específico de una respuesta ............................................................................................................................................. 23 Figura 10: Proceso de obtención de gelatina de pieles de perico (Coryphaena hippurus) . 32 Figura 11: Patrones electroforéticos del marcador de proteínas (MP), la piel de perico (P1) y la piel de perico lavada con NaOH (P2) ........................................................................... 48 Figura 12: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de primer orden ..................... 55 Figura 13: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de primer orden ........................................................................................................................ 61 Figura 14: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden ................................................. 67 Figura 15: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden .................. 67 Figura 16: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden ............ 69 Figura 17: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden ...................................................................................................................... 69

Figura 18: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables tiempo (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden ............ 71 Figura 19: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden . 71 Figura 20: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden ... 77 Figura 21: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden ...................................................................................................................... 78 Figura 22: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden ................................................................................................................. 79 Figura 23: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden .............................................................................. 80 Figura 24: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden ...................................................................................................................... 81 Figura 25: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden .............................................................................................. 81 Figura 26: Patrones electroforéticos del marcador de proteínas (MP) y la gelatina de piel de perico (GPP) ........................................................................................................................ 88

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Protocolo de determinación del contenido de hidroxiprolina………………….. 102 Anexo 2: Protocolo de determinación de pesos moleculares por electroforesis en gel de poliacrilamida – SDS……………………………………………………………………. 104 Anexo 3: Protocolo de determinación de proteína soluble – Método de biuret………….. 107 Anexo 4: Determinación de la fuerza de gel……………………………………………... 109 Anexo 5: Determinación del rendimiento de extracción de proteína – Método de biuret... 111 Anexo 6: Soluciones de optimización y respuestas estimadas para la obtención de gelatina de piel de perico según valores de deseabilidad global…………………………………... 115 Anexo 7: Composición proximal y propiedades fisicoquímicas de la gelatina obtenida de piel de perico…………………………………………………………………………….. 116 Anexo 8: Producto final obtenido………………………………………………………... 117

RESUMEN

El objetivo de la presente investigación fue obtener gelatina de piel de perico (Coryphaena hippurus) y caracterizar sus propiedades fisicoquímicas. Se evaluaron tres variables independientes sobre las condiciones de extracción de gelatina para optimizar el proceso en función a la fuerza de gel y al rendimiento de extracción de proteína. Durante la optimización se empleó la metodología de superficie de respuesta (MSR) para estudiar el efecto de las variables independientes temperatura de extracción (X1) (40 – 70 °C), tiempo de extracción (X2) (60 – 400 minutos) y concentración de ácido cítrico (X3) (0,10 – 0,90 %), mediante modelos cuadráticos aplicados a cada respuesta: fuerza de gel (Y1) y rendimiento de extracción de proteína (Y2). Se utilizó un diseño central compuesto (DCC) para ajustar cada respuesta a un modelo de segundo orden. Mediante el modelamiento se obtuvieron las ecuaciones que relacionaron cada respuesta con las variables independientes: 𝑦̂1 = 391,49 − 32,21 𝑥1 − 11,08 𝑥2 − 14,17 𝑥3 + 9,30 𝑥1 𝑥2 − 17,65 𝑥12

e

𝑦̂2 = 19,81 +

1,69𝑥1 + 0,49𝑥2 − 0,17𝑥3 − 0,07𝑥1 𝑥2 − 0,12𝑥2 𝑥3 − 0,44𝑥12 − 0,32𝑥32 . Los valores de las variables independientes que se utilizaron para obtener una gelatina con los máximos valores de las respuestas fueron: temperatura 56,8 °C, tiempo 331 minutos y concentración de ácido cítrico 0,26 %. La gelatina obtenida tuvo una fuerza de gel de 386,6 g y un rendimiento de extracción de proteína de 20,40 %. Se caracterizaron las propiedades fisicoquímicas de la gelatina obtenida dando el siguiente resultado: la composición proximal fue 94,8 % de proteína total, 0,2 % de grasa cruda y 1,0 % de ceniza en base seca; el pH fue 4,90, la viscosidad 11,0 cP, la temperatura de fusión 25,6 °C, la temperatura de gelificación 17,6 °C y el valor de actividad de agua 0,26. El perfil electroforético reveló la presencia de bandas correspondientes a cadenas α-1 y α-2 alrededor de 116 kDa y cadenas β alrededor de 200 kDa. Los contenidos de prolina e hidroxiprolina fueron de 10,74 y 7,90 %, respectivamente. Finalmente, el rendimiento de la gelatina obtenida de la piel de perico fue 18,52 %.

Palabras clave: perico, Coryphaena hippurus, gelatina, fuerza de gel, superficie de respuesta, electroforesis.

SUMMARY

The aim of this work was to obtain gelatin from skin of perico (Coryphaena hippurus) and to characterize their physicochemical properties. Three independent variables under gelatin extraction conditions were evaluated to optimize the process according to the gel strength and the protein yield. During optimization the Response Surface Methodology (RSM) was used to study the effect of independent variables: extraction temperature (X1) (40 – 70 °C), extraction time (X2) (60 – 400 minutes) and concentration of citric acid (X3) (0,10 – 0,90 %), by applying quadratic models to each response: gel strength (Y1) and protein yield (Y2). A Central Composite Design (CCD) was performed to fit each response to a second order model. As a result, the equations that related each response with the independent variables were obtained: 𝑦̂1 = 391,49 − 32,21 𝑥1 − 11,08 𝑥2 − 14,17 𝑥3 + 9,30 𝑥1 𝑥2 − 17,65 𝑥12 and

𝑦̂2 = 19,81 + 1,69𝑥1 + 0,49𝑥2 − 0,17𝑥3 − 0,07𝑥1 𝑥2 − 0,12𝑥2 𝑥3 − 0,44𝑥12 −

0,32𝑥32 . The values of the independent variables used to obtain a gelatin with the maximum values of the responses were: 56,8 °C (extraction temperature), 331 minutes (extraction time) and 0,26 % (concentration of citric acid). The gelatin obtained under these conditions had 386,6 gel strength and 20,40 % protein yield. The physicochemical properties of the gelatin obtained were characterized: the proximal composition was 94,8 % total protein, 0,2 % crude fat and 1,0 % ash on dry basis; the pH value was 4,90, the viscosity 11,0 cP, the melting temperature 25,6 °C, the gelling temperature 17,6 °C and the water activity 0,26. The electrophoretic profile showed the presence of bands corresponding to α-1-chains and α-2chains around of 116 kDa and β-chains around of 200 kDa. The contents of proline and hydroxiproline were 10,74 and 7,90%, respectively. Finally, the yield of the perico skin gelatin was 18,52%.

Key words: perico, Coryphaena hippurus, gelatin, gel strength, response surface, electrophoresis.

I.

INTRODUCCIÓN

En el Perú, las actividades del sector pesquero son importantes en el desarrollo económico y social del país (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, FAO, 2010a). Una de ellas es la transformación de recursos hidrobiológicos en productos congelados o venta en fresco, teniendo como consecuencia la generación de residuos, de los cuales el 30,0 % lo constituyen pieles, huesos y escamas (Gómez-Guillén et al., 2002). El perico (Coryphaena hippurus) es una de las principales especies desembarcadas con mayores valores de captura para consumo humano directo, registrando en 2013 una captura de 55830 TM (19097 TM destinadas a congelado y 36608 TM a fresco) (FAO, 2010a; Ministerio de la Producción, PRODUCE, 2015), en cuyo proceso de transformación puede generar hasta un 12,0 % de piel como residuo (Barriga et al., 2012) cifra mayor en comparación a otras especies desembarcadas y procesadas.

Generalmente, estas pieles se utilizan para la elaboración de harina residual lo que conlleva a un desaprovechamiento del colágeno presente en ellas. Una alternativa para el aprovechamiento de este material es su uso para obtención de gelatina, un producto de naturaleza proteica obtenido por hidrólisis parcial del colágeno siendo, además, uno de los biopolímeros más usados en aplicaciones alimenticias y farmacéuticas, debido a sus propiedades fisicoquímicas, funcionales y tecnológicas (Karim y Bhat, 2009; GómezGuillén et al., 2011). En los últimos años, han venido desarrollándose diversas investigaciones centradas en la obtención de gelatinas a partir de pieles de pescado, sean procedentes de peces de aguas frías o peces de aguas cálidas, ya que ambas fuentes producen gelatinas con diferentes propiedades, siendo generalmente las gelatinas de peces de aguas cálidas de mejor calidad (Montero y Gómez-Guillén, 2000; Gómez-Guillén et al., 2002; Muyonga et al., 2004; Karim y Bhat, 2009; Niu et al., 2013; Nikoo et al., 2014).

1

La presente investigación tiene la finalidad de obtener gelatina como una alternativa de aprovechamiento del colágeno presente en pieles de perico, aplicando la metodología de superficie de respuesta sobre las condiciones de extracción para optimizar el proceso en función a la fuerza de gel y al rendimiento de extracción de proteína, así como caracterizar las propiedades fisicoquímicas del producto obtenido.

2

II. 2.1.

REVISIÓN DE LITERATURA

CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL PERICO

El perico (Coryphaena hippurus) es una especie epipelágica, oceánica y nerítica de aguas tropicales, de cuerpo esbelto, alargado y comprimido lateralmente, con escamas muy pequeñas que le da apariencia de “liso” (Figura 1) (Solano-Sare et al., 2008). Cuando está vivo, tiene el cuerpo de color verde azulado amarillento brillante con tintes iridiscentes, plateado a los costados tornándose dorados y cuando mueren cambian rápidamente a un color grisáceo verdoso.

2.1.1. Clasificación taxonómica

La clasificación taxonómica del perico es la siguiente (Solano-Sare et al., 2008): Reino

: Animalia

Sub Reino

: Metazoaria

Phylum

: Chordata

Sub Phylum

: Vertebrata

Super Clase

: Piscis

Clase

: Osteichthyes

Orden

: Perciforme

Familia

: Coryphaenidae

Género

: Coryphaena

Especie

: Coryphaena hippurus

Nombre común

: perico

3

Figura 1: Perico (Coryphaena hippurus) FUENTE: Solano-Sare et al. (2008) 2.1.2. Características morfológicas El perico presenta un cuerpo alargado y su altura máxima es menos del 25,0 % de la longitud estándar en los adultos. Presenta el cuerpo esbelto y el perfil de la cabeza levemente convexo en ejemplares jóvenes (hasta 30 cm); en machos de mayor talla (de 30 cm a 2 m), el perfil de la cabeza llega a ser vertical por el desarrollo de una cresta ósea; área dentada de la lengua pequeña y ovalada; bandas de dientes presentes en las mandíbulas y en el vómer y los palatinos (paladar) (Solano-Sare et al., 2008; FAO, 2010b).

2.1.3. Distribución geográfica y hábitat

El perico es una especie con amplios desplazamientos. Se encuentra en las aguas tropicales y subtropicales en los océanos Atlántico, Índico y Pacífico (Figura 2). Su rango latitudinal es 35º 00’ N a 35º 00’ S. En el Pacífico Oriental se distribuye desde San Diego – California (Estados Unidos) hasta Antofagasta (Chile), habitando el pelagial oceánico y con frecuencia se le encuentra alrededor de las islas oceánicas (FAO, 2010).

En el Perú se presenta normalmente a lo largo de toda la costa asociado a la penetración de lenguas de agua subtropicales superficiales. Vive en aguas de temperatura de 21 a 30 °C, pudiendo ser aguas oceánicas o costeras. Su pesca es más intensa durante la primavera y verano y disminuye en otoño e invierno. Sus desplazamientos están asociados a movimientos de las aguas cálidas que constituyen su hábitat. Es considerado altamente migratorio, el patrón de migración no es totalmente conocido. La temperatura del agua parece ser una influencia importante en los hábitos migratorios, donde el pez prefiere aguas calientes (Solano-Sare et al., 2008; FAO, 2010b).

4

Figura 2: Distribución geográfica mundial del perico FUENTE: Solano-Sare et al. (2008) 2.1.4. Desembarque total de perico en el Perú De acuerdo al desembarque total de perico, en el año 2004 se alcanzó las 31 456 TM, en 2008 tuvo un crecimiento interesante registrándose 49 473 TM, que continuó hasta el 2009 con un desembarque de 57 153 TM y, aunque para el 2012 bajó a 42 347 TM, en el año 2013 se registró nuevamente un crecimiento alcanzando valores de 55 830 TM (Figura 3). Los datos de desembarque total muestran un crecimiento que se ha mantenido durante los últimos 10 años (PRODUCE, 2015). Cabe resaltar que el total del desembarque fue destinado para consumo humano directo, mediante la comercialización en fresco, congelado o curado. 60000

TONELADAS (TM)

55000

57153 53359 49473

55830

50000 43688 42347

45000

3842437278 37078 36608 35333 33755 31914 35000 31456 28965 30000 2469924919 22737 25000 20654 20170 20000 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 40000

TOTAL FRESCO

AÑOS Figura 3: Desembarque total y destinado para fresco de perico en Perú FUENTE: PRODUCE (2015) Elaboración propia

5

El desembarque de perico destinado para venta en fresco también ha tenido un ligero crecimiento durante los últimos años. En el año 2004 ésta alcanzaba apenas las 20 654 TM, en 2008 y 2009 tuvo un crecimiento interesante registrándose 31 914 TM y 38 424 TM, respectivamente, y aunque estos valores disminuirían hasta los 20 170 TM en el 2012, para el año siguiente se registró nuevamente un crecimiento alcanzando las 36 608 TM (PRODUCE, 2015). En la Figura 3 se puede observar que el desembarque destinado para fresco mantiene una tendencia similar al desembarque total de perico en el Perú.

2.1.5. Composición proximal, composición física y rendimientos por tipo de corte

a.

Composición proximal

En la Tabla 1 se puede apreciar la composición proximal del perico (humedad, proteína total, grasa cruda y ceniza). La composición proximal se ve afectada por el tamaño y sexo de la especie.

Tabla 1: Composición proximal del perico Componentes

Rango (%)

Humedad

76,20 – 80,22

Proteína total

17,79 – 21,60

Grasa cruda

0,42 – 0,98

Ceniza

1,20 – 1,50 74,94 – 95,22

Energía (Kcal) FUENTE: Barriga et al. (2012)

b. Composición física La composición física del perico (cabeza, vísceras, pieles, etc.) se puede observar en la Tabla 2. La composición física varía de acuerdo al tamaño y sexo de la especie.

6

Tabla 2: Composición física del perico Componente

Promedio (%)

Cabeza

10,70 – 19,40

Vísceras

6,70 – 16,61

Espinas

11,09 – 15,36

Piel

6,62 – 11,97

Aletas

5,46 – 10,65

Filetes sin piel

40,51 – 49,42 0,18 – 5,88

Pérdidas FUENTE: Barriga et al. (2012)

c.

Rendimientos por tipo de corte

La comercialización de perico en fresco se realiza mediante distintas presentaciones, siendo las más comercializadas en entero, eviscerado, eviscerado descabezado (HG), filete con piel y filete sin piel. En la Tabla 3 se muestran los rendimientos para cada tipo de corte del perico.

Tabla 3: Rendimientos por tipo de corte del perico Presentación

Rendimiento (%)

Eviscerado

86 – 92

Descabezado eviscerado (HG)

63 – 71

Filete con piel

48 – 52

Filete sin piel

44 – 48

FUENTE: IMARPE/ITP (1996)

2.2.

COLÁGENO

El colágeno es una escleroproteína que posee una estructura fibrosa y es muy poco soluble en agua. Forma parte de la matriz extracelular del tejido conectivo y se encuentra en la piel, huesos, tendones, cartílagos, etc.; teniendo una estructura característica en cada uno de estos tejidos de acuerdo con la función que desempeña en ellos (Teijón, 2006).

7

Lehninger (1982) define al colágeno como la principal proteína fibrosa de los tejidos conectivos en los animales superiores, siendo la más abundante de todas las proteínas de los vertebrados superiores y constituyendo alrededor de un tercio o más de la proteína total del cuerpo.

La unidad fundamental del colágeno es la molécula de tropocolágeno. El tropocolágeno tiene un peso molecular aproximado de 285 kDa y está formada por tres cadenas polipeptídicas de igual tamaño (Figura 4), cada una de las cuales es una hélice levógira, y las tres se enrollan para formar una superhélice dextrógira con tres residuos de aminoácidos por vuelta (Teijón, 2006).

Fibrilla

Zona de solapamiento

Zona hueca

Microfibrilla, empaquetamiento de las moléculas

Molécula de 300 nm de largo

Triple hélice dextrógira

α-2 α-1 α-1

Hidroxiprolina Gly

Secuencia típica de la hélice levógira del colágeno (α-1 y α-2) Figura 4: Estructura del colágeno en la que se muestra (de abajo a arriba) la regularidad de la estructura primaria: la hélice levógira, la triple hélice dextrógira, una molécula de 300 nm de largo y la organización de moléculas en una fibrilla típica, en la cual las moléculas de colágeno presentan enlaces cruzados FUENTE: Devlin (2004) 8

El tipo de cadenas que forman el tropocolágeno determina el tipo de colágeno, identificando hasta la fecha 27 tipos, designados como tipo I al tipo XXVII (Karim y Bhat, 2009). Así, el colágeno tipo I, que es el más abundante, está formado por unidades de tropocolágeno constituidas por dos cadenas α-1 (I) y una cadena α-2 (I), por lo que su fórmula molecular es [α-1 (I)]2 α-2 (I) y se encuentra en la piel, tendón, huesos. El colágeno tipo II es [α-1 (II)]3, y se localiza en el cartílago. El colágeno tipo III, [α-1 (III)]3, está en la piel y los vasos sanguíneos (Teijón, 2006). Los diferentes tipos de colágeno se caracterizan por tener propiedades físicas diferentes, debido a las diferencias que presentan en la secuencia de aminoácidos. La Tabla 4 muestra una breve clasificación y descripción.

Tabla 4: Clasificación y descripción de los tipos de colágeno Tipo

Descripción

Tipo I

Principalmente en el tejido conectivo, como la piel, huesos y tendones

Tipo II

Exclusivamente en el tejido cartilaginoso

Tipo III

Principalmente se encuentra en pieles muy jóvenes (hasta 50,0 %), pero con el tiempo el contenido de este tipo de colágeno se reduce a 5,0 – 10,0 %.

Otros tipos Los otros tipos de colágeno se presentan en muy bajas cantidades en organismos específicos. FUENTE: Karim y Bhat (2009)

La composición en aminoácidos característica del colágeno tipo I generalmente contiene 33,0 % de glicina, 12,0 – 20,0 % de prolina y 10,0 % de hidroxiprolina (Teijón, 2006). Las cadenas que forman el tropocolágeno tienen una secuencia de aminoácidos que se caracteriza por la presencia de glicina en cada tercera posición. La formación del tropocolágeno también resulta favorecida por la presencia de los aminoácidos prolina o hidroxiprolina, siendo GlyX-Y un conjunto que se repite en la estructura primaria, donde X e Y suelen ser prolina e hidroxiprolina, respectivamente (Gómez-Guillén et al., 2011).

La cuantificación de hidroxiprolina se relaciona con la presencia de colágeno, ya que este aminoácido se encuentra exclusivamente en este tipo de proteínas y no se encuentra de manera común en otras (Karim y Bhat, 2009). Específicamente el contenido de hidroxiprolina en el colágeno difiere de una especie a otra, dependiendo del tipo genético de colágeno y tejido del cual es aislado (Torres-Arreola et al., 2008).

9

Diversas investigaciones indican que existen altas concentraciones de colágeno en componentes del pescado que no son consumidos comúnmente como pieles, escamas y huesos (Regenstein y Zhou, 2007).

2.3.

GELATINA

La gelatina es una proteína soluble obtenida por hidrólisis parcial del colágeno. La fuente, la edad del animal y el tipo de colágeno, son factores intrínsecos que influyen en las propiedades de las gelatinas. Asimismo, el rendimiento y las propiedades de la gelatina son influenciados por el acondicionamiento de la materia prima previo a la extracción (concentración de ácido o álcali, tiempo y temperatura usada) y las condiciones de extracción (tiempo, temperatura y pH) (Regenstein y Zhou, 2007; Gómez-Guillén et al., 2009; GómezGuillén et al., 2011).

La mayoría de los fabricantes producen gelatina, en lugar de colágeno, debido a los amplios usos industriales de la gelatina. Actualmente, estudios sobre el proceso de obtención de gelatina se han centrado en optimizar los procesos en función del rendimiento y propiedades fisicoquímicas específicas (Regenstein y Zhou, 2007).

2.3.1. Fuentes de obtención de gelatina

La industria obtiene gelatina principalmente de la piel y huesos de mamíferos terrestres, particularmente de porcino y bovino (Haug et al., 2004; Gómez-Guillén et al., 2011), comúnmente llamadas gelatinas tradicionales. Sin embargo, la producción de gelatina a partir de productos de la pesca se ha incrementado en los últimos años debido al reemplazo de las gelatinas tradicionales por las de origen marino. Si bien, las razones inicialmente fueron socioculturales (productos halal y kosher) (Karim y Bhat, 2009), hoy en día se ha incrementado el interés en el aprovechamiento de subproductos y residuos generados por la industria pesquera y de acuicultura (pieles, huesos y/o escamas de carpa, pota, atún, tilapia, entre otras) como fuente de obtención de gelatina (Gómez-Guillén et al., 2002; Kasankala et al., 2007; Karim y Bhat, 2009; Niu et al., 2013).

10

2.3.2. Tipos de gelatinas por proceso de obtención

En la fabricación de gelatina existen dos procesos comúnmente utilizados: el proceso ácido y el proceso alcalino. La gelatina preparada por el proceso ácido es llamada gelatina tipo A, mientras que la gelatina preparada por el proceso alcalino es llamada gelatina tipo B (Karim y Bhat, 2009; Gómez-Guillén et al., 2011).

a.

Proceso ácido o gelatina tipo A

Se refiere a un acondicionamiento de la materia prima en una solución ácida previa a la extracción, generalmente seguida por una extracción llevada a cabo en un medio ácido (Muyonga et al., 2004). Las gelatinas tipo A presentan un punto isoeléctrico a un pH entre 7 y 9 (Gómez-guillén et al., 2011).

b. Proceso alcalino o gelatina tipo B

Se refiere a un acondicionamiento de la materia prima en una solución alcalina previa a la extracción, en la mayoría de los casos seguida por una neutralización con una solución ácida. La extracción posterior puede llevarse a cabo en un medio alcalino, neutro o ácido. Una ventaja de este proceso es la remoción considerable de proteína no colagénica (Regenstein y Zhou, 2007; Shyni et al., 2014). Las gelatinas tipo B presentan un punto isoeléctrico a un pH entre 4 y 5 (Gómez-Guillén et al., 2011).

2.4.

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA GELATINA

2.4.1. Composición proximal

Las gelatinas de mamíferos y de pescado tienen un contenido alto de proteína, generalmente entre 84,0 y 90,0 % tal como lo mencionan la Gelatin Manufacturers of Europe (GME, 2008) y autores como See et al. (2010) y Shyni et al. (2014). De acuerdo al contenido de humedad, la Gelatin Manufacturers Institute of America (GMIA, 2012) menciona que debe ser menor a 13,0 %. Por otro lado, las gelatinas se caracterizan por estar casi libres de grasa (< 0,5 %) (Muyonga et al., 2004). Según la GMIA (2012), un contenido de ceniza menor a 2,0 % está dentro del límite máximo recomendado para gelatinas comestibles. 11

2.4.2. Composición en aminoácidos

La composición en aminoácidos de la gelatina es muy cercana a la del colágeno, siendo la glicina (Gly), prolina (Pro), hidroxiprolina (Hyp) y alanina (Ala) sus aminoácidos más abundantes. La frecuencia de ocurrencia de glicina en la estructura primaria de la proteína es de una en cada tres aminoácidos. La secuencia de aminoácidos está caracterizada por la secuencia de repetición de tripletes de Gli-X-Y, donde X es mayormente Pro e Y es mayormente Hip (Karim y Bhat, 2009; Gómez-Guillén et al., 2011).

Por lo general, las gelatinas de mamíferos y de pescado tienen un contenido mayor a 30,0 % de glicina. La diferencia que existe entre ambas gelatinas es en el contenido de aminoácidos prolina e hidroxiprolina, siendo la cantidad de estos aminoácidos aproximadamente de 23,0 a 24,0 % en gelatinas de mamíferos, 19,0 a 21,0 % en gelatinas de peces de aguas cálidas y 16,0 a 17,0 % en gelatinas de peces de aguas frías (Gilsenan y Ross-Murphy, 2000; Haug et al., 2004; Muyonga et al., 2004; Ninan et al., 2010).

2.4.3. Distribución de pesos moleculares

La gelatina consiste en diferentes cadenas de polipéptidos con diferentes pesos moleculares. Zhou et al. (2006) mencionan que durante el proceso de extracción de gelatina, la conversión de colágeno a gelatina produce moléculas de distintos pesos, debido al rompimiento de los enlaces covalentes entre cadenas y de algunos enlaces peptídicos del interior de la cadena. Karim y Bhat (2009) sostienen que la gelatina obtenida tiene un menor peso molecular que el colágeno nativo, y consiste en una mezcla de fragmentos con pesos moleculares en el rango de 80 a 250 kDa (cadenas α con un peso molecular entre 80 y 125 kDa, y cadenas β con un peso molecular entre 160 y 250 kDa).

2.5.

PROPIEDADES FÍSICAS DE LA GELATINA

Las propiedades físicas difieren de una gelatina a otra, ya sea de mamífero (porcino o bovino) o de origen marino (peces de aguas cálidas o aguas frías). Estas diferencias se deben principalmente al contenido de los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, los cuales se encuentran en mayor proporción en los mamíferos, seguidos de peces de aguas cálidas y finalmente en peces de aguas frías. 12

Karim y Bhat (2009) expresan que las propiedades físicas más importantes de la gelatina son la fuerza de gel, viscosidad y temperatura de fusión; y que estas propiedades son afectadas por muchos factores, como el tamaño y distribución de pesos moleculares, composición en aminoácidos, concentración y pH de la solución de gelatina y tiempo y temperatura de formación de gel.

Generalmente, las gelatinas de pescado presentan valores inferiores de fuerza de gel y temperatura de fusión respecto a las gelatinas de mamíferos, debido principalmente a un menor contenido de prolina e hidroxiprolina (Muyonga et al., 2004). Sin embargo, algunas gelatinas de peces de aguas cálidas han alcanzado valores similares o mayores de fuerza de gel respecto a las gelatinas de mamíferos (Karim y Bhat, 2009).

2.5.1. Fuerza de gel

Dentro de las propiedades físicas de las gelatinas, se considera que la fuerza de gel es la más importante de todas, pues define su valor comercial. La fuerza de gel se determina por el método estándar de Bloom a una temperatura entre 5 y 7 °C con ciertos requisitos bien definidos, el cual fue desarrollado para normalizar la prueba. Esta propiedad es el requisito más crítico para evaluar comercialmente el grado y calidad de una gelatina (GMIA, 2012).

La fuerza de gel de las gelatinas comerciales, particularmente porcino y bovino, varía desde 200 a 300 g, pero son aquellas gelatinas con valores entre 250 y 260 g las más deseadas (Abrusci et al., 2004; Muyonga et al., 2004; Cho et al., 2005; Karim y Bhat, 2009). Por su parte, las gelatinas de peces de aguas cálidas pueden alcanzar valores de fuerza de gel entre 229 y 426 g (Muyonga et al., 2004; Kasankala et al., 2007; Songchotikunpan et al., 2008; Jamilah et al., 2011; Cho et al., 2005), mientras que las gelatinas de peces de aguas frías presentan valores más bajos de fuerza de gel (80 - 100 g) (Gómez-Guillén et al., 2002).

2.5.2. Temperatura de fusión

De acuerdo a su naturaleza, la gelatina es un gel termorreversible. Es decir, que cuando la temperatura aumente por encima de un cierto punto, la gelatina empezará a fundirse. Este punto es llamado temperatura de fusión y es usualmente más bajo que la temperatura del cuerpo humano. Debido a esta propiedad es extensamente aplicada en la industria de 13

alimentos y farmacéutica. La temperatura de fusión de las gelatinas de mamífero están en un rango entre 31 y 36 °C (Cho et al., 2005; Boran et al., 2010; Ninan et al., 2014). De acuerdo a las gelatinas de origen marino, las gelatinas de peces de aguas cálidas muestran temperaturas de fusión entre 23 y 29 °C (Muyonga et al., 2004; Cho et al., 2005; Karim y Bhat, 2009) y las gelatinas de peces de aguas frías entre 13 y 14 °C (Gómez-Guillén et al., 2002).

2.5.3. Viscosidad

La viscosidad también es una propiedad importante de las gelatinas, desde el punto de vista comercial (GMIA, 2012). Bajos valores de viscosidad ofrecen geles frágiles, mientras valores altos ofrecen geles más resistentes. Por muchas aplicaciones, las gelatinas con alta viscosidad son preferidas y demandan precios más altos. La viscosidad de la gelatina es medida a 60 °C y a una concentración de 6,67 %, tanto en Europa como en Norte América. Principalmente, la viscosidad se ve influenciada por el tamaño y distribución de pesos moleculares, ya que cuando hay una mayor proporción de moléculas de alto peso molecular se genera un incremento de la viscosidad (Alfaro et al., 2014). La mayoría de gelatinas comerciales presenta una viscosidad entre 2,0 y 7,0 cP, pudiendo alcanzar valores de 13,0 cP en algunos casos (Abrusci et al., 2004; Boran et al., 2010; Ninan et al., 2014). En gelatinas de pescado, las viscosidades pueden alcanzar valores entre 6,0 y 8,0 cP (Boran et al., 2010; Jamilah et al., 2011; Ninan et al., 2014).

2.6.

APLICACIONES DE LA GELATINA

La gelatina se utiliza ampliamente en la industria alimentaria, farmacéutica, cosmética, y fotográfica debido a sus excelentes propiedades gelificantes, hidratantes, formadora y estabilizadora de emulsiones y espumas, propiedades viscoelásticas o filmogénicas (López, 2013).

Dentro de las aplicaciones alimenticias, la gelatina se utiliza generalmente como ingrediente funcional en lugar de ingrediente nutricional. Principalmente es utilizada en la elaboración de postres, como estabilizador y agente de textura en productos lácteos y en la clarificación de vinos y jugos (Regenstein y Zhou, 2007; GMIA, 2012).

14

Los usos no alimenticios de la gelatina son principalmente en la industria farmacéutica e industria fotográfica. En farmacia, la gelatina es utilizada para la fabricación de cápsulas, comprimidos y pastillas. Por otro lado, en la fotografía, la gelatina se ha utilizado como principal constituyente de la cubierta en la mayoría de películas y papeles fotográficos comerciales (GMIA, 2012).

2.7.

METODOLOGÍA DE SUPERFICIE DE RESPUESTA

La metodología de superficie de respuesta (MSR) es un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas útiles para modelar y analizar problemas en los cuales una respuesta de interés es influenciada por diversas variables y donde el objetivo es optimizar esta respuesta. El propósito inicial de estas técnicas es diseñar un experimento que proporcione valores razonables de la variable respuesta y a continuación determinar el modelo matemático que mejor se ajuste a los datos obtenidos. El objetivo final es establecer los valores de los factores que optimizan el valor de la variable respuesta. Por lo tanto la MSR es una técnica estadística que permite la optimización de una respuesta determinada considerando todos los factores que influyen directamente sobre ésta (Montgomery, 2011).

En la mayoría de los problemas de superficie de respuesta, la forma de la relación entre la respuesta y las variables independientes es desconocida. Por lo tanto, el primer paso en la metodología de superficie de respuesta (MSR) es encontrar una aproximación adecuada de la verdadera relación funcional entre “y” y el conjunto de variables independientes. Por lo general, se emplea un polinomio de orden inferior en alguna región de las variables independientes. Si la respuesta está bien modelada por una función lineal de las variables independientes, entonces la función de aproximación es el modelo de primer orden (Montgomery, 2011): 𝑌 = 𝛽0 + 𝛽1 𝑥1 + 𝛽2 𝑥2 + … + 𝛽𝑘 𝑥𝑘 + ∈ Los parámetros del modelo se estiman mediante el método de los mínimos cuadrados ordinarios. Una vez que se tienen los estimadores se sustituyen en la ecuación y se obtiene el modelo ajustado (Montgomery, 2011): 𝑌̂ = 𝑏0 + 𝑏1 𝑥1 + 𝑏2 𝑥2 + … + 𝑏𝑘 𝑥𝑘 15

Este modelo se utiliza cuando se quiere estudiar el comportamiento de la variable respuesta únicamente en la región y cuando no se conoce la forma de superficie.

En caso que el modelo de primer orden no sea adecuado, se puede utilizar el modelo de segundo orden: 𝑘

𝑘

𝑌 = 𝛽0 + ∑ 𝛽𝑖 𝑥𝑖 + 𝑖=1

𝑘

∑ 𝛽𝑖𝑖 𝑥𝑖2 𝑖=1

+ ∑ ∑ 𝛽𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 + ∈ 𝑖 1

0 y C A B Figura 9: Función de deseabilidad para la obtención de un nivel específico de una respuesta FUENTE: Montgomery (2011)

23

III. 3.1.

MATERIALES Y MÉTODOS

LUGAR DE EJECUCIÓN

La presente investigación se desarrolló en las instalaciones del Laboratorio de Físico Química del Instituto Tecnológico de la Producción (ITP), Callao.

3.2.

MATERIALES

3.2.1. Materia prima

La materia prima empleada en el presente estudio fueron las pieles frescas de perico sin carne y sin escamas obtenidas a partir de residuos del fileteo del Terminal Pesquero Mayorista de Ventanilla (TPMV) (pieles con carne y escamas adheridas), durante el mes de noviembre del 2015, Callao, mantenida a temperatura fría (7 - 10 °C) y transportada al laboratorio del ITP lo más rápido posible (1 – 2 horas).

3.2.2. Materiales de laboratorio

-

Placas Petri, marca Pyrex

-

Embudos de vidrio, marca Pyrex

-

Probetas de 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 mL, marca Pyrex

-

Matraces Erlenmeyer de 125, 250, 300 y 500 mL, marca Pyrex

-

Fiolas de 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 mL, marca Schott Duran

-

Beackers de 100, 250, 500, 1000, 2000 mL., marca Pyrex

-

Pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10 y 25 mL, marca Brand

-

Pipetas graduadas de 1, 2, 5, 10, 25 y 50 mL, marca Brand

-

Micropipetas digitales de 100, 1000 y 5000 ul, marca Brand

-

Frascos de vidrio con tapa rosca de 100, 500 y 1000 mL, marca Kimax

-

Balones de digestión para proteína, marca Gerhardt

24

-

Frascos bloom, tipo Brookfield

-

Algodón, marca CKF

-

Baguetas

-

Crisoles de porcelana, marca Haldenwanger

-

Pesafiltros, marca Witeg

-

Campana desecadora conteniendo sílica gel, marca Glaswerk

-

Papel de filtro N° 1 y N° 2, marca Whatman

-

Tubos de ensayo de 10 y 15 mL en vidrio, marca Pyrex

-

Tubos de centrífuga de 15 y 50 mL, marca Brand

-

Gradillas de acero inoxidable para 50 tubos

3.2.3. Reactivos químicos

-

Ácido sulfúrico p.a. 95 - 97 % de pureza, marca Fermont

-

Hidróxido de sodio p.a. 97,0 - 98,5 % de pureza, marca Fisher Scientific

-

Ácido clorhídrico p.a. 37 % de pureza, marca Merck

-

Sulfato de sodio anhidro p.a. 99 % de pureza, marca Merck

-

Éter dietílico, marca Merck

-

Ácido cítrico grado alimentario, marca Bretano Corp, proveedor Montana S.A.

-

L-hidroxiprolina, marca Merck

-

Buffer pH 4, pH 7 y pH 10,1, marca Merck

-

Cloramina T, marca Sigma

-

Albúmina de suero bovino (BSA), marca Sigma

-

Acetato de sodio trihidratado (ACS), marca Fermont

-

1-propanol, marca J. T. Baker

-

2-propanol, marca Fisher Scientific

-

4-dimetilaminobenzaldehido, marca Merck

-

Ácido perclórico p.a. 70,0 % de pureza, marca Mallinckrodt

-

Marcador de peso molecular, rango de 36 – 205 kDa, marca Sigma

-

Acrilamida para electroforesis, marca Merck

-

N, N’ - Metileno-bisacrilamida para electroforesis, marca Merck

-

Glicerina p.a. 99,85 % de pureza, marca J. T. Baker

-

Dodecilo sulfato de sodio p.a. 99,0 % de pureza, marca Merck

-

Indicador azul de bromofenol, marca Merck 25

-

Tris-HCl para electroforesis 99,6 % de pureza, marca J. T. Baker

-

Persulfato de amonio p.a. 98,0 % de pureza, marca Fluka

-

N, N, N’, N’ – Tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED) para electroforesis, marca Sigma

-

Estándar azul brillante Coomassie, marca Fluka

-

Metanol p.a. 99,8 % de pureza, marca Sigma

-

Ácido acético glacial p.a. 99,9 % de pureza, marca J. T. Baker

-

Etanol absoluto p.a. 99,8 % de pureza, marca Merck

-

Sulfato de cobre (II) pentahidratado p.a. 99,0 % de pureza, marca Merck

-

Cloruro de potasio p.a. 100,2 % de pureza, marca J. T. Baker

3.2.4. Equipos

-

Estufa eléctrica, marca Binder, modelo ED115

-

Estufa por convección forzada, marca MMM, modelo Venticell

-

Espectrofotómetro UV Visible, marca Perkin Elmer, modelo Lambda 950

-

Equipo de electroforesis, marca Atto

-

Agitadores magnéticos, marca H. W. Kessel

-

Balanza analítica digital, marca Ohaus, modelo DV214C 210 g, precisión 0,1 mg

-

Balanza electrónica, marca Kessel, modelo GF-610, precisión 0,01 g

-

Mufla, marca Barnstead Thermolyne, modelo Furnace 48000

-

Texturómetro Brookfield

-

Viscosímetro Brookfield

-

Selladora al vacío, marca Multivac

-

Potenciómetro, marca Mettler Toledo, modelo Seven Easy

-

Equipo digestor y destilador Kjeldahl, marca Gerhardt

-

Aparato de extracción Soxhlet, marca Yamato, modelo BS-64

-

Baño termostático con agitación, marca Memmert

-

Campana extractora eléctrica, marca The-Barker Company

-

Molino de cuchillas, marca Ika

-

Equipo de determinación de actividad de agua, modelo Aqualab PRE

-

Selladora de impulso, marca Sealer

26

3.3.

MÉTODOS ANALÍTICOS

3.3.1. Análisis realizados a la materia prima

a.

Análisis de composición proximal

Los análisis de composición proximal se realizaron según los procedimientos propuestos por la Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2000). Los ensayos fueron los siguientes y se realizaron por triplicado:

-

Humedad: se determinó por diferencia de peso, la muestra fue sometida a 103 °C en estufa por espacio de 12 a 16 horas, hasta obtener peso constante.

-

Grasa cruda: se empleó el método Soxhlet, en el cual la grasa fue extraída utilizando éter dietílico como solvente orgánico durante 6 a 7 horas.

-

Proteína total: se determinó por el método semi-micro Kjeldahl, determinando el porcentaje de nitrógeno total. Se utilizó el factor de conversión 5,5 (Lees, 1969) para la determinación de proteína.

-

Ceniza: se obtuvó calcinando las muestras a 600 °C en mufla por espacio de 12 a 14 horas.

b. Determinación del contenido de hidroxiprolina

La cuantificación del contenido de hidroxiprolina se realizó según los procedimientos de acuerdo a la AOAC (990.26) (AOAC, 2000) (ver Anexo 1). Las muestras fueron hidrolizadas, diluidas y filtradas. Se tomó una alícuota de 5 mL del filtrado y se hizo una dilución adicional en 100 mL. Luego fueron adicionados la solución del agente oxidante (cloramina T y buffer citrato pH 6) y el reactivo de color (4-dimetilaminobenzaldehído, ácido perclórico 60 % y 2-propanol). Los tubos fueron colocados en baño maría a 60 °C por 15 minutos. Posteriormente, se midió la absorbancia a 558 nm en el espectrofotómetro. La curva estándar de hidroxiprolina fue preparada a partir de soluciones estándar con el mismo

27

rango de concentraciones de 5 a 80 ppm. El contenido de hidroxiprolina fue expresado en mg/g de muestra. Este ensayo se realizó por triplicado.

c.

Determinación de pesos moleculares por electroforesis

La identificación de pesos moleculares se realizó mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), según el método de Laemmli (1970), citado por Cho et al. (2014) (ver Anexo 2). Las muestras fueron disueltas a una concentración de 1 mg/mL en un amortiguador de muestra (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 % de glicerina, SDS al 1 %, 0,02 % de azul de bromofenol) y agitadas. Las mezclas fueron calentadas durante 15 min a 95 °C para desnaturalizarlas, se dejaron enfriar a temperatura ambiente y luego se cargaron 20 ul de muestra al gel de poliacrilamida. Un sistema discontinuo de gel de poliacrilamida (40 %) fue empleado con una concentración de 7,5 % para el gel de separación y 3 % para el gel de apilamiento y se realizó la corrida a 35 mA durante 4 horas. Al término de ésta, se retiró el gel de la cámara y fue puesto en una solución de tinción de azul brillante de Coomasie 0,25 % (p/v) [disuelto en agua desionizada 45 % (v/v), metanol 45 % (v/v) y ácido acético glacial 10 % (p/v)] durante 4 horas. Finalmente, el gel fue colocado en una solución de destinción de metanol 30 % (v/v), ácido acético glacial 10 % (v/v) y agua desionizada 60 % (v/v) durante 18 horas con recambios de la solución cada 6 horas. Dentro de la corrida se incluyó un marcador de peso molecular (rango de 36 – 205 kDa, marca Sigma), cuyos componentes se aprecian en el Anexo 2.

d. Determinación de la composición en aminoácidos

La determinación de la composición en aminoácidos se realizó en La Molina Calidad Total Laboratorios, de acuerdo al método propuesto por Heinrikson y Meredith (1984). El ensayo se realizó por HPLC-FR (cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa). La muestra fue hidrolizada durante 24 horas a 110 °C en HCl 6 N y luego el ácido fue removido por evaporación. Se realizó una derivatización pre columna con PITC (fenilisotiocianato). Posteriormente, se realizó la separación cromatográfica de los aminoácidos por HPLC-FR y finalmente se cuantificaron.

28

3.3.2. Análisis realizados durante el diseño experimental

a.

Fuerza de gel

Para la determinación de la fuerza de gel se procedió de acuerdo al método usado por Montero y Gómez-Guillén (2000). Se disolvió la gelatina seca en agua destilada a 60 °C en una relación de 6,67 % (p/v), luego se colocó la solución de gelatina en frascos Bloom y se dejó en refrigeración (5 – 7 °C) durante 17 a 18 horas hasta la formación de la gelatina. La fuerza de gel a 7 °C fue determinada usando un analizador de textura equipado con un embolo cilíndrico y expresada como la fuerza máxima (en g) que toma el émbolo para penetrar 4 mm dentro de la gelatina. El resultado fue el promedio de 3 mediciones.

b. Rendimiento de extracción de proteína

De las soluciones de gelatina obtenidas posterior al filtrado, se colectaron alícuotas de 5 mL en tubos de centrífuga y fueron usadas para determinar la concentración de proteína soluble por el método de Biuret (Yang et al., 2008) (ver Anexo 3), midiendo la absorbancia a 545 nm en el espectrofotómetro. Se usó como solución patrón albúmina de suero bovino (BSA) y con ella se obtuvo la curva estándar. El rendimiento de extracción de proteína de la gelatina obtenida fue calculado usando la siguiente ecuación:

Rendimiento (%) = [(C * V) / M] * 100

Dónde: C = concentración de proteína en solución extraída (g/mL) V = volumen M = peso de la muestra usada para la extracción (g)

3.3.3. Rendimiento de la gelatina obtenida en los niveles óptimos de las variables

El rendimiento de la gelatina fue calculado de acuerdo al método propuesto por Shyni et al. (2014), basado en el peso del producto final obtenido (gelatina seca) con respecto al peso húmedo de las pieles frescas, utilizando la siguiente fórmula:

29

Rendimiento de la gelatina (%) =

Peso de la gelatina seca

x 100

Peso húmedo de las pieles frescas

3.3.4. Análisis realizados para la caracterización de la gelatina obtenida en los niveles óptimos de las variables

Los análisis realizados para la caracterización fisicoquímica de la gelatina que tuvo la mayor fuerza de gel y el mayor rendimiento de extracción de proteína fueron los siguientes: composición proximal, determinación del contenido de hidroxiprolina, determinación de pesos moleculares por electroforesis y composición en aminoácidos. La metodología seguida para la realización de estos análisis fue mencionada con anterioridad en el acápite 3.3.1. En el caso de la determinación de pesos moleculares por electroforesis se utilizó una concentración de 5 % para el gel de separación y 4 % para el gel de apilamiento.

Así mismo, se realizaron los siguientes análisis:

a.

Viscosidad

La viscosidad se determinó de acuerdo al método usado por Niu et al. (2013). Se preparó una solución de gelatina en una concentración de 6,67 % (p/v) en agua destilada a una temperatura de 60 °C. La viscosidad (cP) de la solución de gelatina fue determinada utilizando un viscosímetro Brookfield. El resultado fue el promedio de 3 mediciones.

b. Determinación de la temperatura de fusión

La determinación de la temperatura de fusión fue realizada de acuerdo al método utilizado por Muyonga et al. (2004). Las soluciones de gelatina conteniendo 6,67 % (p/v) fueron preparadas en tubos de ensayo con tapa rosca. Los tubos de ensayo fueron llenados dejando un espacio y luego cerrados. Las muestras disueltas fueron puestas en refrigeración (7 °C) por 17 a 18 horas, después de lo cual fueron transferidas a un baño maría (10 °C) e invertidas de tal modo que el espacio quede en la parte inferior. El baño maría se calentó gradualmente (1 °C por minuto) adicionando agua tibia (45 °C) en intervalos de 60 segundos. La temperatura a la cual la gelatina se empezó a fundir y que permitió que el gas dejado en el espacio comience a moverse hacia arriba se registró como la temperatura de fusión. 30

c.

Determinación de la temperatura de gelificación

La determinación de la temperatura de gelificación se realizó de acuerdo al método descrito por Muyonga et al. (2004). Las soluciones de gelatina conteniendo 10.0 % (p/v) fueron preparadas en tubos de ensayo con tapa rosca. Las muestras disueltas fueron puestas en baño maría (40 °C). El baño maría se enfrió lentamente adicionando agua helada (2 °C) en intervalos de 15 segundos. Un termómetro fue insertado y extraído a intervalos de 15 segundos. La temperatura de la mezcla a la cual la solución de gelatina dejó de gotear de la punta del termómetro se registró como la temperatura de gelificación.

d. Determinación del pH

El valor del pH fue determinado en una solución de gelatina de 1,0 % (p/v) a 25 °C de acuerdo a lo propuesto por Cole (2000), para lo cual se utilizó un potenciómetro.

e.

Determinación de la actividad de agua (Aw)

El valor de actividad de agua (Aw) de la gelatina seca se determinó mediante lectura directa en un equipo AQUALAB cuyo fundamento se basa en la técnica del punto de rocío, de acuerdo al método utilizado por Pandia (2011). En este tipo de técnica, la muestra se equilibra dentro de una cámara hermética que contiene un espejo sobre el cual se condensa el vapor de agua. En el momento de equilibrio la humedad relativa del aire en la cámara es la misma que la actividad de agua de la muestra. Una célula fotoeléctrica y un termistor detectan el punto exacto en el que se produce la condensación y la temperatura, respectivamente.

3.4.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

3.4.1. Diagrama de flujo

El diagrama de flujo seguido para la obtención de gelatina a partir de pieles de perico fue el utilizado por Gómez-Guillén et al. (2002) adaptado y ampliado a los requerimientos disponibles, tal como se muestra en la Figura 10.

31

Materia prima

Pieles frescas de perico

Cortado

En pedazos de 1 a 2 cm

Lavado

Con agua fría (10 – 12 °C) por 30 minutos

Limpieza

Con una solución NaOH 0,05 M por 6 horas (10 – 12 °C)

Pieles lavadas con NaOH Acondicionado en medio ácido

Extracción

Filtrado

Gelatina en solución

Secado

Con una solución de ácido cítrico 0,025 M por 1 hora (10 – 12 °C) Variables de extracción: Temperatura: 40 – 70 °C Tiempo: 60 – 400 min. Concentración de ácido cítrico: 0,1 – 0,9 %

Medida de pH En láminas Temperatura: 50 °C Humedad: < 13 %

Molienda

Envasado

Almacenamiento

Producto final Figura 10: Proceso de obtención de gelatina de pieles de perico (Coryphaena hippurus)

32

3.4.2. Descripción del proceso

Una breve descripción del diagrama de flujo general fue la siguiente:

a.

Materia prima

Se utilizaron pieles frescas de perico sin carne y sin escamas, con una longitud de 81,4 ± 2,51 cm y un peso de 99,5 ± 7,50 g (n = 10). Estas fueron obtenidas a partir de residuos del fileteo del Terminal Pesquero Mayorista de Ventanilla (TPMV) (pieles con carne y escamas adheridas), luego los restos de músculo y escamas fueron separados con un cuchillo. La materia prima se trabajó el mismo día que se obtuvo, siempre mantenida a temperaturas frías (10 - 12 °C).

b. Cortado

Se cortaron las pieles frescas en cuadrados de 1 a 2 cm con un cuchillo. Esta etapa se realizó con la finalidad de obtener las pieles reducidas a un tamaño mínimo que permita facilitar la etapa de extracción debido a una mayor superficie de contacto entre las pieles y el medio de extracción.

c.

Lavado

Se lavaron las pieles con agua fría (10 – 12 °C) durante 30 min. Esta operación se realizó con la finalidad de eliminar las impurezas y elementos extraños que quedaron de las etapas anteriores.

d. Limpieza Se limpiaron las pieles lavándolas en una solución fría de hidróxido de sodio 0,05 M (10 – 12 °C) durante 6 horas, con un recambio a las 3 horas y en una relación de piel: solución de 1:5. Luego se enjuagaron las pieles con abundante agua fría (10 – 12 °C) hasta obtener un pH neutro y finalmente se escurrieron. Esta etapa se realizó con la finalidad de facilitar la eliminación de la grasa presente y de la mayor parte de proteína que no sea colágeno. Al finalizar esta etapa las pieles quedaron con un mayor grado de pureza del colágeno y 33

preparadas para la etapa de extracción. A estas pieles se les denominó pieles de perico lavadas con NaOH.

e.

Acondicionado en medio ácido

Para esta operación y en cada tratamiento se pesaron 100 g de pieles lavadas con NaOH y se colocaron en recipientes con una solución fría de ácido cítrico 0,025 M (10 – 12 °C) durante 1 hora y en una relación de piel: solución de 1:5. Luego se enjuagaron con abundante agua fría (10 – 12 °C) hasta obtener un pH neutro y finalmente se escurrieron. Esta operación se realizó con la finalidad de eliminar la formación de sales, neutralizar el pH y facilitar la etapa de extracción.

f.

Extracción

La extracción se realizó colocando las pieles de cada tratamiento en recipientes de vidrio con una solución de ácido cítrico y en una relación de piel: solución de 1:3. Luego los recipientes se pusieron en baño maría y se calentaron con agitación constante para la extracción de gelatina. Las condiciones de extracción se llevaron a cabo en función a tres variables de estudio: temperatura (X1), tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) a fin de medir dos variables respuesta: fuerza de gel (Y1) y rendimiento de extracción de proteína (Y2). Los valores empleados de cada variable fueron definidos por la metodología de superficie de respuesta (MSR).

g.

Filtrado

La solución obtenida se filtró vertiéndola a través de un embudo utilizando como filtro una capa de algodón de 30 x 35 cm con un peso aproximado de 40 g. Se realizó con la finalidad de separar y eliminar los restos de piel e impurezas presentes en la solución.

h. Secado

La gelatina en solución fue puesta en bandejas de plástico de 18 x 12 cm con un volumen de 50 mL por bandeja y se secaron en una estufa por convección forzada a una temperatura de 50 °C, hasta alcanzar un contenido de humedad menor a 13 %. Se realizó como método de 34

conservación con la finalidad de eliminar el contenido de agua del producto para evitar su deterioro. La presentación de las gelatinas luego del secado fue en forma de láminas.

i.

Molienda

Las láminas de gelatina se molieron utilizando un molino de cuchillas hasta obtener gelatina en polvo. Se realizó con la finalidad de tener un producto homogéneo y facilitar el reconstituido de la gelatina en agua.

j.

Envasado

Las gelatinas en polvo se envasaron al vacío en bolsas de polietileno de alta densidad utilizando una selladora al vacío. Se realizó con la finalidad de conservar y mantener la calidad del producto por un periodo de tiempo más extenso.

k. Almacenamiento

Las muestras de gelatina en polvo se almacenaron en refrigeración (4 - 7 °C) para su posterior análisis y/o caracterización de acuerdo a sus propiedades fisicoquímicas.

3.5.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Para la evaluación del efecto de determinadas variables sobre las respuestas fuerza de gel (Y1) y rendimiento de extracción de proteína (Y2), así como la posterior determinación de los niveles de dichas variables que optimicen el proceso de obtención de gelatina, se aplicó la metodología de superficie de respuesta con un diseño central compuesto (DCC) (Gutiérrez y Vara, 2008).

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Programa Design-Expert version 9.0.

35

3.5.1. Etapa I: Selección

Teniendo en cuenta que sólo se trabajó con 3 variables no fue necesaria esta etapa de selección. De acuerdo a Gutiérrez y Vara (2008) esta etapa sólo se lleva a cabo cuando se tiene entre 6 y 8 variables, es por ello que el siguiente paso fue la búsqueda del modelo matemático de primer orden mediante un diseño factorial completo con puntos al centro.

3.5.2. Etapa II: Búsqueda I o de primer orden

Esta etapa consistió en correr un diseño experimental de primer orden que permita caracterizar de forma preliminar el tipo de superficie de respuesta y detectar la presencia de curvatura, así como verificar la falta de ajuste del modelo de primer orden a los datos obtenidos (Gutiérrez y Vara, 2008).

a.

Definición de la función objetivo y variables

Las funciones objetivo definidas para esta etapa fueron fuerza de gel (Y1) y rendimiento de extracción de proteína (Y2). Así mismo, las variables de estudio fueron temperatura (X1), tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3). Estas variables fueron elegidas de acuerdo a lo afirmado por Regenstein y Zhou (2007), Karim y Bhat (2009), Gómez-Guillén et al. (2011) y Niu (2013) quienes indican que la temperatura, el tiempo y concentración de ácido en la etapa de extracción son las principales variables que influyen sobre la fuerza de gel y el rendimiento de extracción de proteína en las gelatinas obtenidas.

Los niveles de las variables X1, X2 y X3 se establecieron de acuerdo a los resultados obtenidos de las pruebas preliminares. La temperatura de extracción fue evaluada entre 46,1 y 63,9 °C, el tiempo de extracción entre 129 y 331 minutos y la concentración de ácido cítrico entre 0,26 y 0,74 %. b. Diseño factorial 2k con réplica en el punto central En esta etapa se utilizó un diseño factorial (2k) con réplicas en el punto central del diseño, debido a que las repeticiones al centro permiten detectar la posible presencia de curvatura (Gutiérrez y Vara, 2008). Las variables fueron codificadas en 2 niveles (-1, +1) e incluyeron 36

un nivel para el punto central. La Tabla 5 muestra los valores de cada nivel de las variables. En la Tabla 6 se presenta el diseño factorial (2k) con 6 réplicas en el punto central.

Tabla 5: Variables independientes y sus respectivos niveles utilizados para el diseño factorial 2k

Variable

Niveles de las variables

Símbolo

Unidad

codificadas

Codificada Natural Temperatura

-1

0

+1

°C

x1

X1

46,1

55,0

63,9

minutos

x2

X2

129

230

331

Concentración de ácido cítrico % (p/v)

x3

X3

0,26

0,50

0,74

Tiempo

Tabla 6: Diseño experimental 2k con réplicas en el punto central Concentración de ácido Tratamiento

Temperatura (°C)

Tiempo (minutos)

cítrico (%)

X1

X2

X3

1

46,1

129

0,26

2

63,9

129

0,26

3

46,1

331

0,26

4

63,9

331

0,26

5

46,1

129

0,74

6

63,9

129

0,74

7

46,1

331

0,74

8

63,9

331

0,74

9

55

230

0,5

10

55

230

0,5

11

55

230

0,5

12

55

230

0,5

13

55

230

0,5

14

55

230

0,5

37

c.

Estimación del modelo matemático de primer orden

-

Fuerza de Gel

Los valores promedio de fuerza de gel (Y1) observados, fueron sometidos a un análisis de regresión múltiple (método de mínimos cuadrados) y ajustados a un modelo de primer orden que describa la dependencia de dicha respuesta en función de las variables bajo estudio. Dicho polinomio correspondió a la siguiente ecuación de primer grado: 𝑦̂1 = 𝛽̂0 + 𝛽̂1 𝑥1 + 𝛽̂2 𝑥2 + 𝛽̂3 𝑥3 Donde: 𝑦̂1 : fuerza de gel estimada (g) 𝛽̂0 : término independiente 𝛽̂1 , 𝛽̂2 , 𝛽̂3 : coeficientes de regresión lineal 𝑥1 , 𝑥2 , 𝑥3 : temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v) Posteriormente, se realizó el análisis de varianza para verificar la significancia del modelo estimado y de las variables en estudio, el efecto curvatura e interacción de coeficientes, y así establecer si el modelo matemático lineal fue o no suficiente para explicar las respuestas en dicha región experimental y poder asumir, de esta manera, la proximidad a la zona óptima. Se consideraron como significativas aquellas fuentes de variación cuyo valor de probabilidad p del estadístico F (prob > F) fueran menores al nivel de significación elegido (α = 0,05).

La calidad del ajuste se evaluó observando la forma en que el modelo se ajustó a los datos. Para ello se calculó el coeficiente de determinación (R2) y el coeficiente de determinación ajustado (R2aj) debiendo ser el valor de cada uno de ellos cercano a 1.

-

Rendimiento de extracción de proteína

Los valores promedio de rendimiento de extracción de proteína (Y2) observados fueron sometidos a un análisis de regresión múltiple (método de mínimos cuadrados) y ajustados a un modelo de primer orden que describa la dependencia de dicha respuesta en función de las

38

variables bajo estudio. Dicho polinomio correspondió a la siguiente ecuación de primer grado: 𝑦̂2 = 𝛽̂0 + 𝛽̂1 𝑥1 + 𝛽̂2 𝑥2 + 𝛽̂3 𝑥3 Donde: 𝑦̂2 : rendimiento de extracción de proteína estimado (%) 𝛽̂0 : término independiente 𝛽̂1 , 𝛽̂2 , 𝛽̂3 : coeficientes de regresión lineal 𝑥1 , 𝑥2 , 𝑥3 : temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v) Posteriormente, se realizó el análisis de varianza para verificar la significancia del modelo estimado y de las variables en estudio, el efecto curvatura e interacción de coeficientes, y así establecer si el modelo matemático lineal fue o no suficiente para explicar las respuestas en dicha región experimental y poder asumir, de esta manera, la proximidad a la zona óptima. Se consideraron como significativas aquellas fuentes de variación cuyo valor de probabilidad p del estadístico F (prob > F) fueran menores al nivel de significación elegido (α = 0,05).

La calidad del ajuste se evaluó observando la forma en que el modelo se ajustó a los datos. Para ello se calculó el coeficiente de determinación (R2) y el coeficiente de determinación ajustado (R2aj) debiendo ser el valor de cada uno de ellos cercano a 1.

3.5.3. Etapa III: Búsqueda II o de segundo orden

Una vez que se haya detectado la presencia de curvatura, se completó un diseño de segundo orden para caracterizar mejor la superficie y modelar la curvatura. Una vez que se tuvo el modelo ajustado se determinaron las condiciones óptimas de operación del proceso (Gutiérrez y Vara, 2008).

a.

Diseño central compuesto (DCC)

El análisis de superficie de respuesta de segundo orden para las respuestas fuerza de gel (Y1) y rendimiento de extracción de proteína (Y2) se realizó mediante un diseño central

39

compuesto (DCC) que, según Montgomery (2011), para k = 3 factores consta de 8 puntos factoriales (2k), 6 puntos axiales en los eje coordenados (a una distancia α) y 6 repeticiones en el punto central, dando un total de 20 puntos experimentales. Para determinar la ubicación de los puntos axiales se consideró α = (nf)1/4 = 81/4 = 1,682, y de acuerdo a Gutiérrez y Vara (2008), esto garantizó un diseño central compuesto rotable.

Las variables fueron codificadas en 5 niveles (-1,682, -1, 0, +1, +1,682). La Tabla 7 muestra los valores de cada nivel de las variables codificadas. La Tabla 8 presenta el diseño central compuesto (DCC) utilizado.

Tabla 7: Variables independientes y sus respectivos niveles utilizados para la etapa correspondiente al diseño central compuesto (DCC)

Variable Temperatura Tiempo Concentración de ácido cítrico

Unidad

Símbolo

Niveles de las variables codificadas

Codificada

Natural

-1,682

-1

0

+1

+1,682

°C

x1

X1

40,0

46,1

55,0

63,9

70,0

minutos

x2

X2

60

129

230

331

400

% (p/v)

x3

X3

0,10

0,26

0,50

0,74

0,90

40

Tabla 8: Diseño central compuesto (DCC) Concentración de ácido Tratamiento

Temperatura (°C)

Tiempo (minutos)

cítrico (%)

X1

X2

X3

1

46,1

129

0,26

2

63,9

129

0,26

3

46,1

331

0,26

4

63,9

331

0,26

5

46,1

129

0,74

6

63,9

129

0,74

7

46,1

331

0,74

8

63,9

331

0,74

9

40,0

230

0,50

10

70,0

230

0,50

11

55,0

60

0,50

12

55,0

400

0,50

13

55,0

230

0,10

14

55,0

230

0,90

15

55,0

230

0,50

16

55,0

230

0,50

17

55,0

230

0,50

18

55,0

230

0,50

19

55,0

230

0,50

20

55,0

230

0,50

b. Estimación de los modelos matemáticos de segundo orden

-

Fuerza de gel

Los valores promedio de fuerza de gel observados fueron sometidos a un análisis de regresión múltiple (método de mínimos cuadrados) y ajustados a un modelo de segundo orden, que incluya la curvatura de la superficie y que describa la dependencia de dicha 41

respuesta en función de las variables de estudio. Dicho polinomio correspondió a la siguiente ecuación de segundo grado: 𝑘

𝑘

𝑦̂1 = 𝛽̂0 + ∑ 𝛽̂𝑖 𝑥𝑖 + ∑ 𝛽̂𝑖𝑖 𝑥𝑖2 + ∑ ∑ 𝛽̂𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 𝑖=1

𝑖=1

𝑖 F) menor a 0,05. Por otro lado, la falta de ajuste del modelo fue también establecida mediante esta prueba, debiendo ser su valor de probabilidad p (prob > F) mayor a 0,05. Así mismo, la calidad del ajuste del modelo a los datos observados fue establecida mediante el coeficiente de determinación (R2) y el coeficiente de determinación ajustado (R2aj), debiendo ser el valor de cada uno cercano a 1.

-

Rendimiento de extracción de proteína

Los valores promedio de rendimiento de extracción de proteína observados, fueron sometidos a un análisis de regresión múltiple (método de mínimos cuadrados) y ajustados a un modelo de segundo orden, que incluya la curvatura de la superficie y que describa la dependencia de dicha respuesta en función de las variables de estudio. Dicho polinomio correspondió a la siguiente ecuación de segundo grado: 42

𝑘

𝑘

𝑦̂2 = 𝛽̂0 + ∑ 𝛽̂𝑖 𝑥𝑖 + ∑ 𝛽̂𝑖𝑖 𝑥𝑖2 + ∑ ∑ 𝛽̂𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 𝑖=1

𝑖=1

𝑖 F) menor a 0,05. Por otro lado, la falta de ajuste del modelo fue también establecida mediante esta prueba, debiendo ser su valor de probabilidad p (prob > F) mayor a 0,05. Así mismo, la calidad del ajuste del modelo a los datos observados fue establecida mediante el coeficiente de determinación (R2) y el coeficiente de determinación ajustado (R2aj), debiendo ser el valor de cada uno cercano a 1.

3.6.

OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LAS RESPUESTAS

Una vez obtenidos los modelos matemáticos de segundo orden correspondientes a cada respuesta evaluada se llevó a cabo la optimización simultánea de las respuestas, lo cual permitió encontrar las condiciones de extracción que cumplieran de la mejor manera determinadas restricciones. Para ello se tuvo en cuenta el método de la función de deseabilidad, descrita por Montgomery (2011) y Gutiérrez y Vara (2008).

Las restricciones sobre cada respuesta fueron establecidas en base a literatura sobre gelatinas comerciales de mamíferos y gelatinas de peces de aguas cálidas. De esta forma, la restricción 43

considerada para la fuerza de gel se estableció a partir de valores reportados en gelatinas comerciales de porcino y bovino (Karim y Bhat, 2009), y para el rendimiento de extracción de proteína se estableció a partir de valores reportados en gelatinas de peces de aguas cálidas (Kasankala et al., 2007; Yang et al., 2007), tal como se muestra a continuación:

-

Fuerza de gel: mayor o igual a 300 g

-

Rendimiento de extracción de proteína: mayor o igual a 20,0 %

Bajo estas restricciones, para la maximización de la fuerza de gel y del rendimiento de extracción de proteína, se utilizaron las siguientes ecuaciones: 0

𝑦̂1 < 300

𝑦̂1 − 300 1 ) 𝑑1 = (𝐹𝐺 𝑀𝐴𝑋 − 300 {

300 ≤ 𝑦̂1 ≤ 𝐹𝐺𝑀𝐴𝑋

1

𝑦̂1 > 𝐹𝐺𝑀𝐴𝑋

0

𝑦̂2 < 20

𝑦̂2 − 20 1 ( ) 𝑑2 = 𝑅𝑃 𝑀𝐴𝑋 − 20 {

20 ≤ 𝑦̂2 ≤ 𝑅𝑃𝑀𝐴𝑋

1

𝑦̂2 > 𝑅𝑃𝑀𝐴𝑋

Donde: 𝑑1 : función de deseabilidad para la fuerza de gel 𝑑2 : función de deseabilidad para el rendimiento de extracción de proteína 𝑦̂1 : fuerza de gel estimada (g) 𝑦̂2 : rendimiento de extracción de proteína estimado (%) 𝐹𝐺𝑀𝐴𝑋 : máxima fuerza de gel observada (g) 𝑅𝑃𝑀𝐴𝑋 : máximo rendimiento de extracción de proteína observado (%) El valor denominado deseabilidad global (D) representó la media geométrica de los valores de las deseabilidades individuales (di), es decir:

44

D = (𝑑1 ∗ 𝑑2 )1/2 Se eligió como tratamiento óptimo aquella combinación de niveles de las variables que tuvieron el valor D más alto.

Para la realización de esta optimización simultánea, se utilizó también el programa estadístico Design Expert version 9.0.

3.7.

VERIFICACIÓN DE LOS NIVELES ÓPTIMOS DE LAS VARIABLES

Considerando los niveles óptimos de las variables se realizó el proceso de obtención de gelatina correspondiente. Los valores observados de cada respuesta en la gelatina obtenida fueron determinados y comparados con los respectivos valores estimados por el modelo.

45

IV.

4.1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

MATERIA PRIMA

4.1.1. Composición proximal

La composición proximal de la piel de perico y de la piel lavada con NaOH se muestra en la Tabla 9, tanto en base húmeda como en base seca para efectos de comparación.

Tabla 9: Composición proximal de la piel de perico (g/100 g)

Componente

Piel de perico

Piel de perico lavada con NaOH

Base húmeda

Base seca

Base húmeda

Base seca

Humedad

66,4 ± 0,35

-

68,0 ± 0,30

-

Proteína total

28,0 ± 0,51

83,3 ± 2,37

29,1 ± 0,10

91,1 ± 0,96

Grasa cruda

2,0 ± 0,44

6,1 ± 1,31

1,3 ± 0,16

4,2 ± 0,54

Ceniza

2,3 ± 0,06

6,8 ± 0,18

1,0 ± 0,05

3,1 ± 0,16

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 9, la piel de perico tuvo una humedad de 66,4 % y contenidos de proteína total, grasa cruda y ceniza en base seca de 83,3 %, 6,1 % y 6,8 %, respectivamente. El contenido de proteína fue alto, debido a que mayormente la piel contiene colágeno; además de ello, no cuenta con restos de músculo ni escamas, eliminados previamente a la recepción de la materia prima.

Por otro lado, se aprecia que la piel lavada con NaOH presentó una humedad de 68,0 % y que los contenidos de grasa cruda y ceniza disminuyeron a 4,2 % y 3,1 %, respectivamente. La disminución se debió a que la solución alcalina facilitó la solubilización de la grasa y, por ende, su eliminación en agua.

46

Así mismo se aprecia que la proteína total aumentó a 91,1 %. Este aumento se debió al lavado en solución alcalina, ya que el álcali permite eliminar proteínas que no forman parte del colágeno, además de pigmentos no deseados, tal como lo mencionan Shyni et al. (2014). Como resultado de ello, y producto de la disminución de otros componentes, se obtuvo una piel cuyo contenido en su gran mayoría fue proteína, particularmente colágeno.

4.1.2. Contenido de hidroxiprolina

El contenido de hidroxiprolina en la piel de perico y en la piel lavada con NaOH, tanto en base húmeda como en base seca para efectos de comparación, se observa en la Tabla 10.

Tabla 10: Contenido de hidroxiprolina en la piel de perico (g/100g)

Componente Hidroxiprolina

Piel de perico

Piel de perico lavada con NaOH

Base húmeda

Base seca

Base húmeda

Base seca

2,18 ± 0,08

6,49 ± 0,26

2,52 ± 0,03

7,89 ± 0,10

De acuerdo a los resultados, el contenido de hidroxiprolina en la piel de perico fue de 6,49 % en base seca, mientras que en la piel lavada con NaOH fue de 7,89 %. El incremento del contenido de hidroxiprolina se debió a los lavados sucesivos con agua y solución alcalina, como se mencionó anteriormente, ya que sirvió para eliminar impurezas y material no deseado, como grasa interferente y otras proteínas. Producto de esta eliminación, el colágeno se concentró y, por ende, aumentó también su contenido de hidroxiprolina.

4.1.3. Determinación de pesos moleculares por electroforesis Los patrones electroforéticos de la piel de perico y de la piel lavada con NaOH se muestran en la Figura 11.

47

MP P1 P2

Cadena β

200 kDa

Cadena α-1 (I) Cadena α-2 (I)

116 kDa 97 kDa

66 kDa 55 kDa 45 kDa

Figura 11: Patrones electroforéticos del marcador de proteínas (MP), la piel de perico (P1) y la piel de perico lavada con NaOH (P2) En la Figura 11 se observa que en ambas muestras se encontraron subunidades estructurales de cadenas α-1 (I) y α-2 (I), junto con cadenas β (dímeros de cadenas α unidos covalentemente). El análisis de pesos moleculares reveló la presencia de bandas de proteína de cadenas α-1 (I) y α-2 (I) alrededor de 116 kDa y una mayor banda de proteína de cadenas β alrededor de 200 kDa. Teijón (2006) menciona que la presencia de cadenas α-1 (I) y α-2 (I) corresponde a colágeno tipo I, el cual se encuentra en las pieles de los organismos. De igual manera, Cho et al. (2014) realizaron un análisis electroforético de los pesos moleculares del colágeno presente en pieles de varias especies de pescado, concluyendo que las pieles están compuestas de cadenas α-1 (I) y α-2 (I), cuyos pesos moleculares están alrededor de 116,2 kDa y cadenas β con pesos moleculares alrededor de 200 kDa, correspondiente a colágeno tipo I. De acuerdo a ello, se puede asumir que el colágeno presente en la piel de perico correspondió a colágeno tipo I.

4.1.4. Composición en aminoácidos La Tabla 11 muestra la composición en aminoácidos de la piel de perico y está expresado en g de aminoácido por 100 g de muestra.

48

Tabla 11: Composición en aminoácidos de la piel de perico Aminoácido

Contenido (g/ 100 g muestra)

Ácido aspártico

1,90 ± 0,06

Ácido glutámico

5,67 ± 0,23

Serina

0,99 ± 0,04

Glicina

1,15 ± 0,01

Histidina

0,40 ± 0,00

Treonina

2,28 ± 0,13

Alanina

0,45 ± 0,01

Arginina

2,85 ± 0,11

Prolina

1,34 ± 0,06

Hidroxiprolina

2,18 ± 0,08

Tirosina

0,60 ± 0,03

Valina

1,11 ± 0,01

Metionina

0,37 ± 0,04

Isoleucina

0,12 ± 0,01

Leucina

2,10 ± 0,02

Fenilalanina

1,24 ± 0,02

Lisina

0,79 ± 0,03

Triptófano

0,03 ± 0,00

Total

25,54 ± 0,04

De acuerdo a los resultados, se aprecia que hay 25,54 g de aminoácidos por cada 100 de piel de perico. Si en los resultados de composición proximal de la piel de perico se observó que hay 28,0 g de proteína por cada 100 g de piel (ver Tabla 9), se puede decir que existe una diferencia de 2,46 g entre el contenido de proteína y el contenido de aminoácidos. Esta diferencia puede ser atribuida a que la proteína total se determinó a partir del nitrógeno total, el cual incluye a nitrógeno proteico y no proteico, mientras que en la composición en aminoácidos, éstos se cuantifican a partir del nitrógeno proteico.

Gómez-Guillén et al. (2011) mencionan que los aminoácidos glicina, prolina e hidroxiprolina están presentes en la estructura primaria bajo una secuencie repetitiva Gly-XY, donde X e Y suelen ser prolina e hidroxiprolina, respectivamente. Por su parte, Teijón 49

(2006) expresa que estos tres aminoácidos se encuentran en mayor cantidad en la estructura y su presencia favorece la formación de colágeno. En la Tabla 11 se aprecia que el contenido de los aminoácidos glicina, prolina e hidroxiprolina en la piel de perico fue 1,15 %, 1,34 % y 2,18 %, respectivamente.

4.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL

4.2.1. Búsqueda I o de primer orden: estimación de los modelos matemáticos de primer orden

En la etapa de búsqueda I se evaluó el efecto de las variables en las condiciones de extracción de gelatina sobre las variables respuesta en forma individual.

a.

Fuerza de gel

La Tabla 12 muestra los valores promedio de la fuerza de gel observada y estimada para cada tratamiento analizado. Se observó que los valores de fuerza de gel fluctuaron entre 335,3 a 454,2 g (ver Anexo 4).

En la Tabla 12 se aprecia como la fuerza de gel varía con la temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico. Por ejemplo, si se comparan los tratamientos 1 y 5, se aprecia que variando sólo la concentración de ácido cítrico de 0,26 a 0,74 % la fuerza de gel disminuye de 454,2 a 404,5 g. Sin embargo, si se comparan los tratamientos 1 y 2, se aprecia que sólo una variación de la temperatura de 46,1 a 63,9 °C produce una mayor disminución de la fuerza de gel de 454,2 a 350,0 g. Esto demuestra que cada variable produce un efecto diferente sobre la fuerza de gel, es por ello que se requiere una optimización de las condiciones de extracción con la finalidad de obtener la mayor fuerza de gel en la gelatina.

50

Tabla 12: Fuerza de gel observada y estimada en el diseño factorial 2k con réplicas en el punto central Concentración Tratamiento

Temperatura Tiempo

de ácido

Fuerza de gel

Fuerza de gel

(°C)

(minutos)

cítrico (%)

observada (g)

estimada (g)

X1

X2

X3

Y1

𝑦̂1

1

46,1

129

0,26

454,2

440,4

2

63,9

129

0,26

350,0

355,1

3

46,1

331

0,26

396,9

400,3

4

63,9

331

0,26

346,7

352,1

5

46,1

129

0,74

404,5

418,3

6

63,9

129

0,74

338,0

332,9

7

46,1

331

0,74

381,4

378,1

8

63,9

331

0,74

335,3

330,0

9

55

230

0,5

388,8

390,0

10

55

230

0,5

383,3

390,0

11

55

230

0,5

394,3

390,0

12

55

230

0,5

390,5

390,0

13

55

230

0,5

396,9

390,0

14

55

230

0,5

386,0

390,0

La Tabla 13 muestra el análisis de varianza del modelo lineal. El ANVA incluyó los efectos simples y efectos interacción y se realizó con la finalidad de determinar los efectos que contribuyeron a explicar el comportamiento de la respuesta.

51

Tabla 13: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

11882,04

6

1980,34

44,15

0,0001

x1: temperatura (°C)

8906,68

1

8906,68

198,55

0,0000

x2: tiempo (minutos)

930,24

1

930,24

20,74

0,0039

x3: ácido cítrico (%)

982,72

1

982,72

21,91

0,0034

x1 x2

691,92

1

691,92

15,42

0,0077

x1 x3

219,10

1

219,10

4,88

0,0691

x2 x3

151,38

1

151,38

3,37

0,1159

Curvatura

680,02

1

680,02

15,16

0,0080

Error

269,15

6

44,86

Total

12831,22

13

Fuente de variabilidad

Fc

Valor p (prob > F)

En la Tabla 13 se aprecia que el valor p (prob > F) del modelo fue inferior a 0,05 y 0,01, por lo tanto al menos uno de los efectos evaluados (principales o interacciones) tuvo un efecto significativo.

Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que si el valor p del efecto es menor que el nivel de significancia prefijado α, se concluye que el efecto es estadísticamente distinto de cero, es decir, tal efecto está activo o influye de manera significativa sobre la respuesta. Además, mientras más pequeño sea el valor p o más grande sea el valor Fc de un efecto, éste es más importante sobre la respuesta.

De acuerdo a esto, en el ANVA que se muestra en la Tabla 13, se aprecia que a un nivel de significancia de α = 0,05 los efectos que tuvieron un valor p (prob > F) menor a 0,05 fueron los efectos principales (x1, x2, x3) y el efecto interacción (x1 x2), demostrando que las tres variables estudiadas afectan el proceso significativamente, siendo el efecto principal x1 el más importante sobre la respuesta. Esta significancia obtenida coincide con la afirmación hecha por Regenstein y Zhou (2007), Karim y Bhat (2009), Gómez-Guillén et al. (2011) y Niu (2013) quienes indican que la temperatura, el tiempo y concentración de ácido en la etapa de extracción son las principales variables que influyen sobre la fuerza de gel en las gelatinas obtenidas. 52

Así mismo, Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que con la finalidad de obtener un modelo en el que sólo se incluyan términos significativos, es usual construir el mejor ANVA, en el que se eliminan del análisis y se mandan al error a los efectos que claramente son no significativos.

De acuerdo a lo anterior, en el ANVA que se muestra en la Tabla 13, se aprecia claramente que los efectos interacción (x1 x3, x2 x3) fueron no significativos, por lo que se eliminaron para obtener el mejor ANVA tal como se observa en la Tabla 14.

La Tabla 14 muestra el mejor ANVA para la fuerza de gel, que incluyó sólo los efectos significativos. Además, se incluyó la curvatura y el error, el cual se separó en dos componentes: falta de ajuste (lack of fit) y error puro.

Tabla 14: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel y prueba de falta de ajuste Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

11511,56

4

2877,89

35,99

0,0000

x1: temperatura (°C)

8906,68

1

8906,68

111,40

0,0000

x2: tiempo (minutos)

930,24

1

930,24

11,63

0,0092

x3: ácido cítrico (%)

982,72

1

982,72

12,29

0,0080

x1 x2

691,92

1

691,92

8,65

0,0187

Curvatura

680,02

1

680,02

8,51

0,0194

Error

639,63

8

79,95

Falta de ajuste

511,60

3

170,53

6,66

0,0338

Error puro

128,03

5

25,61

12831,22

13

Fuente de variabilidad

Total

Fc

Valor p (prob > F)

R2 = 0,8972, R2aj = 0,8514

En la Tabla 14 se observa que la curvatura fue significativa puesto que presentó un valor p (prob > F) inferior a 0,05, lo cual significó que existe presencia de curvatura. Así mismo, la falta de ajuste resultó ser significativa puesto que el valor p (prob > F) fue inferior a 0,05.

53

Al respecto, Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que una falta de ajuste significativa es un fuerte indicio de curvatura.

Por lo mencionado anteriormente, se puede decir que el modelo de primer orden no fue una aproximación adecuada para explicar la respuesta en la región experimental elegida. De acuerdo a esto, Montgomery (2011) menciona que la existencia de curvatura en la superficie puede indicar al experimentador que se encuentra cerca del óptimo.

La Tablas 15 muestra los coeficientes de regresión estimados asociados a los efectos significativos en función a la fuerza de gel.

Tabla 15: Coeficientes de regresión estimados para la fuerza de gel Término del modelo

Coeficiente estimado

Intercepto

381,92

x1: temperatura (°C)

-33,37

x2: tiempo (minutos)

-10,78

x3: ácido cítrico (%)

-11,08

x1 x2

9,30

Luego de realizar el análisis de regresión múltiple con los valores observados, se obtuvo el siguiente modelo matemático o ecuación polinomial de primer grado: 𝑦̂1 = 381,92 − 33,37 𝑥1 − 10,78 𝑥2 − 11,08 𝑥3 + 9,30 𝑥1 𝑥2 Donde 𝑦̂1 representa la fuerza de gel estimada (g); y 𝑥1 , 𝑥2 y 𝑥3 la temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v), respectivamente, en su forma codificada.

Para medir la calidad de ajuste del modelo de regresión múltiple se utilizó el coeficiente de determinación (R2) y coeficiente de determinación ajustado (R2aj), los cuales se obtuvieron a partir del mejor ANVA tal como se muestra en la Tabla 14.

Montgomery (2011) expresa que estos coeficientes deben tener valores entre 0 y 1, siendo el R2 menor al R2aj. Además, menciona que ambos coeficientes sirven para cuantificar el 54

porcentaje de variabilidad presente en los datos y que es explicado por el modelo, por ello son deseables valores cercanos a 1. Gutiérrez y Vara (2008) indican que se prefiere al R2aj en lugar del R2, debido a que este último se incrementa de manera artificial con cada término que se agrega al modelo, aunque sea un término que no contribuya en mucho a la explicación de la respuesta. En cambio, el R2aj incluso disminuye su valor cuando el término que se agrega no aporta mucho. De esta manera, el coeficiente de determinación ajustado (R2aj) fue de 0,8514, es decir el 85,14 % de la variabilidad de los datos es explicada por el modelo lineal ajustado.

La falta de ajuste y presencia de curvatura en el modelo también puede ser observada de manera gráfica. La Figura 12 muestra la superficie de respuesta para la fuerza de gel en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2). La variable concentración de ácido cítrico (X3) permaneció constante en su nivel central con la finalidad de facilitar la representación gráfica tridimensional de la superficie.

Figura 12: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de primer orden

55

En la Figura 12 se aprecia que los puntos centrales del diseño (puntos rojos) se encontraron fuera de la superficie correspondiente al modelo lineal. Ello indicó una presencia de curvatura y una falta de ajuste a una superficie plana.

Según lo expresado por Gutiérrez y Vara (2008), una vez que se detecta la presencia de curvatura en la superficie se completa un diseño de segundo orden. De acuerdo a ello, se continuó con la siguiente etapa para estimar el modelo de segundo orden para la fuerza de gel y ubicar el punto óptimo.

b. Rendimiento de extracción de proteína

La Tabla 16 muestra los valores promedio del rendimiento de extracción de proteína observado y estimado para cada tratamiento analizado. Se observó que los valores de rendimiento de extracción de proteína fluctuaron entre 16,71 a 21,36 % (ver Anexo 5).

En la Tabla 16 se aprecia como el rendimiento de extracción de proteína varía con la temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico. Por ejemplo, si se comparan los tratamientos 7 y 3, se aprecia que variando sólo la concentración de ácido cítrico de 0,74 a 0,26 % el rendimiento de extracción aumenta de 17,49 a 18,34 %. Sin embargo, si se comparan los tratamientos 7 y 8, se aprecia que sólo una variación de la temperatura de 46,1 a 63,9 °C produce un mayor aumento del rendimiento de extracción de 17,49 a 20,97 %. Esto demuestra que cada variable produce un efecto diferente sobre el rendimiento de extracción de proteína, es por ello que se requiere una optimización de las condiciones de extracción con la finalidad de obtener el mayor rendimiento.

56

Tabla 16: Rendimiento de extracción de proteína observada y estimada en el diseño factorial 2k con réplicas en el punto central Rendimiento de Rendimiento de extracción de

extracción de

de ácido

proteína

proteína

cítrico (%)

observado (%)

estimado (%)

Temperatura Tiempo Concentración Tratamiento

(°C)

(minutos)

X1

X2

X3

Y2

𝑦̂2

1

46,1

129

0,26

16,84

16,92

2

63,9

129

0,26

20,41

20,33

3

46,1

331

0,26

18,34

18,15

4

63,9

331

0,26

21,36

21,55

5

46,1

129

0,74

16,71

16,78

6

63,9

129

0,74

20,25

20,18

7

46,1

331

0,74

17,49

17,53

8

63,9

331

0,74

20,97

20,93

9

55,0

230

0,50

19,92

19,83

10

55,0

230

0,50

19,89

19,83

11

55,0

230

0,50

19,76

19,83

12

55,0

230

0,50

19,79

19,83

13

55,0

230

0,50

19,80

19,83

14

55,0

230

0,50

19,83

19,83

La Tabla 17 muestra el análisis de varianza del modelo lineal. El ANVA incluyó los efectos simples y efectos interacción y se realizó con la finalidad de determinar los efectos que contribuyeron a explicar el comportamiento de la respuesta.

57

Tabla 17: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

25,61

6

4,27

538,16

0,0000

x1: temperatura (°C)

23,19

1

23,19

2922,94

0,0000

x2: tiempo (minutos)

1,95

1

1,95

246,16

0,0000

x3: ácido cítrico (%)

0,29

1

0,29

37,14

0,0009

x1 x2

0,04

1

0,04

5,63

0,0553

x1 x3

0,02

1

0,02

3,05

0,1312

x2 x3

0,11

1

0,11

14,02

0,0096

Curvatura

2,11

1

2,11

265,90

0,0000

Error

0,05

6

0,01

Total

27,77

13

Fuente de variabilidad

Fc

Valor p (prob > F)

En la Tabla 17 se aprecia que el valor p (prob > F) del modelo fue inferior a 0,05 y 0,01, por lo tanto al menos uno de los efectos evaluados (principales o interacciones) tuvo un efecto significativo.

Con respecto a los efectos del modelo estimado, en el ANVA que se muestra en la Tabla 17 se aprecia que a un nivel de significancia de α = 0,05 los efectos que tienen un valor p (prob > F) menor a 0,05 son los efectos principales (x1, x2, x3) y el efecto interacción (x2 x3), demostrando que las tres variables estudiadas afectan el proceso significativamente, siendo el efecto principal x1 el más importante sobre la respuesta. Esta significancia obtenida coincide con la afirmación hecha por Karim y Bhat (2009), Gómez-Guillén et al. (2011) y Niu (2013) quienes indican que la temperatura, el tiempo y concentración de ácido en la etapa de extracción son las principales variables que influyen sobre el rendimiento de extracción de proteína en las gelatinas obtenidas.

Con la finalidad de construir el mejor ANVA se eliminaron del análisis y se mandaron al error a los efectos que fueron no significativos.

58

De acuerdo a lo anterior, en el ANVA que se muestra en la Tabla 17, se aprecia que los efectos interacción (x1 x2, x1 x3) fueron no significativos, por lo que se eliminaron para obtener el mejor ANVA tal como se observa en la Tabla 18.

La Tabla 18 muestra el mejor ANVA para el rendimiento de extracción de proteína, que incluyó sólo los efectos significativos. Además, se incluyó la curvatura y el error, el cual se separó en dos componentes: falta de ajuste (lack of fit) y error puro.

Tabla 18: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína y prueba de falta de ajuste Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

25,55

4

6,39

438,59

0,0000

x1: temperatura (°C)

23,19

1

23,19

1592,38

0,0000

x2: tiempo (minutos)

1,95

1

1,95

134,10

0,0000

x3: ácido cítrico (%)

0,29

1

0,29

20,23

0,0020

x2 x3

0,11

1

0,11

7,64

0,0245

Curvatura

2,11

1

2,11

144,86

0,0000

Error

0,12

8

0,01

Falta de ajuste

0,10

3

0,03

8,66

0,0200

Error puro

0,02

5

0,00

Total

27,77

13

Fuente de variabilidad

Fc

Valor p (prob > F)

R2 = 0,9199, R2aj = 0,8842

En la Tabla 18 se aprecia que la curvatura fue significativa puesto que presentó un valor p (prob > F) inferior a 0,05, lo cual significó que existe presencia de curvatura. Así mismo, la falta de ajuste resultó ser significativa puesto que el valor p (prob > F) fue inferior a 0,05. Al respecto, Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que una falta de ajuste significativa es un fuerte indicio de curvatura.

Por lo mencionado anteriormente, se puede decir que el modelo de primer orden no fue una aproximación adecuada para explicar la respuesta en la región experimental elegida.

59

La existencia de curvatura en la superficie puede indicar al experimentador que se encuentra cerca del óptimo.

La Tabla 19 muestra los coeficientes de regresión estimados asociados a los efectos significativos en función al rendimiento de extracción de proteína.

Tabla 19: Coeficientes de regresión estimados para el rendimiento de extracción de proteína Término del modelo

Coeficiente estimado

Intercepto

19,38

x1: temperatura (°C)

1,70

x2: tiempo (minutos)

0,49

x3: ácido cítrico (%)

-0,19

x2 x3

-0,12

Luego de realizar el análisis de regresión múltiple con los valores observados, se obtuvo el siguiente modelo matemático o ecuación polinomial de primer grado: 𝑦̂2 = 19,38 + 1,70 𝑥1 + 0,49 𝑥2 − 0,19 𝑥3 − 0,12 𝑥2 𝑥3 Donde 𝑦̂2 representa el rendimiento de extracción de proteína (%); y 𝑥1 , 𝑥2 y 𝑥3 la temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v), respectivamente, en su forma codificada.

Para medir la calidad de ajuste del modelo de regresión múltiple se utilizó el coeficiente de determinación (R2) y coeficiente de determinación ajustado (R2aj), los cuales se obtuvieron a partir del mejor ANVA tal como se muestra en la Tabla 18. Estos dos coeficientes deben tener valores entre 0 y 1, siendo el R2 menor al R2aj. Ambos coeficientes sirven para cuantificar el porcentaje de variabilidad presente en los datos y que es explicado por el modelo, por ello son deseables valores cercanos a 1. Generalmente se prefiere al R2aj en lugar del R2.

60

De esta manera, el coeficiente de determinación ajustado (R2aj) fue de 0,8842, es decir el 88,42% de la variabilidad de los datos es explicada por el modelo lineal ajustado.

La falta de ajuste y presencia de curvatura en el modelo también puede ser observada de manera gráfica. La Figura 13 muestra la superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2). La variable concentración de ácido cítrico (X3) permaneció constante en su nivel central con la finalidad de facilitar la representación gráfica tridimensional de la superficie.

Figura 13: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de primer orden En la Figura 13 se aprecia que los puntos centrales del diseño (puntos rojos) se encontraron fuera de la superficie correspondiente al modelo lineal. Ello indicó una presencia de curvatura y una falta de ajuste a una superficie plana.

Según lo expresado por Gutiérrez y Vara (2008), una vez que se detecta la presencia de curvatura en la superficie se completa un diseño de segundo orden. De acuerdo a ello, se continuó con la siguiente etapa para estimar el modelo de segundo orden para el rendimiento de extracción de proteína y ubicar el punto óptimo.

61

4.2.2. Búsqueda II o de segundo orden: estimación de los modelos matemáticos de segundo orden

En esta etapa se completó un diseño central compuesto para estimar el modelo de segundo orden y ubicar el punto óptimo en cada respuesta.

a.

Fuerza de gel

La Tabla 20 muestra los valores promedio de la fuerza de gel observada y estimada para cada tratamiento analizado. Se observó que la fuerza de gel fluctuó entre 287,3 a 454,2 g (ver Anexo 4).

En la Tabla 20 se aprecia que los cambios extremos de temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico influyen drásticamente sobre la fuerza de gel. Por ejemplo, si se comparan los tratamientos 11 y 12, se aprecia que variando el tiempo de extracción de 60 a 400 minutos y manteniendo las otras dos variables en su punto central, la fuerza de gel disminuye de 409,5 a 370,8 g. Sin embargo, si se comparan los tratamientos 9 y 10, se aprecia que una variación de la temperatura de 40,0 a 70,0 °C y manteniendo de igual manera las otras dos variables en su punto central, produce una mayor disminución de la fuerza de gel de 390,1 a 287,3 g. Esto demuestra que existen variables que ejercen un efecto mucho mayor sobre la fuerza de gel, es por ello que se requiere una optimización de las condiciones de extracción con la finalidad de obtener la mayor fuerza de gel.

62

Tabla 20: Fuerza de gel observada y estimada en el diseño central compuesto Concentración Tratamiento

Temperatura Tiempo

de ácido

Fuerza de gel

Fuerza de gel

(°C)

(minutos)

cítrico (%)

observada (g)

estimada (g)

X1

X2

X3

Y1

𝑦̂1

1

46,1

129

0,26

454,2

440,6

2

63,9

129

0,26

350,0

357,6

3

46,1

331

0,26

396,9

399,8

4

63,9

331

0,26

346,7

354,0

5

46,1

129

0,74

404,5

412,3

6

63,9

129

0,74

338,0

329,2

7

46,1

331

0,74

381,4

371,5

8

63,9

331

0,74

335,3

325,7

9

40,0

230

0,50

390,1

395,7

10

70,0

230

0,50

287,3

287,4

11

55,0

60

0,50

409,5

410,1

12

55,0

400

0,50

370,8

372,9

13

55,0

230

0,10

423,3

415,3

14

55,0

230

0,90

360,9

367,7

15

55,0

230

0,50

388,8

391,5

16

55,0

230

0,50

383,3

391,5

17

55,0

230

0,50

394,3

391,5

18

55,0

230

0,50

390,5

391,5

19

55,0

230

0,50

396,9

391,5

20

55,0

230

0,50

386,0

391,5

La Tabla 21 muestra el análisis de varianza del modelo cuadrático. El ANVA incluyó los efectos simples, efectos interacción y efectos cuadráticos y se realizó con la finalidad de determinar los efectos que contribuyen a explicar el comportamiento de la respuesta.

63

Tabla 21: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

24251,37

9

2694,60

52,40

0,0000

x1: temperatura (°C)

14164,58

1

14164,58

275,43

0,0000

x2: tiempo (minutos)

1676,12

1

1676,12

32,59

0,0002

x3: ácido cítrico (%)

2741,62

1

2741,62

53,31

0,0000

x1 x2

691,92

1

691,92

13,45

0,0043

x1 x3

219,10

1

219,10

4,26

0,0659

x2 x3

151,38

1

151,38

2,94

0,1170

x12

4389,96

1

4389,96

85,36

0,0000

x22

7,95

1

7,95

0,15

0,7024

x32

29,80

1

29,80

0,58

0,4641

Error

514,28

10

51,43

Total

24765,65

19

Fuente de variabilidad

Fc

Valor p (prob > F)

En la Tabla 21 se aprecia que el valor p (prob > F) del modelo cuadrático fue menor a 0,05 y 0,01, por lo tanto el modelo fue significativo.

Con respecto a los efectos del modelo estimado, en el ANVA que se muestra en la Tabla 21 se aprecia que a un nivel de significancia de α = 0,05 los efectos que tuvieron un valor p (prob > F) menor a 0,05 fueron los efectos principales (x1, x2, x3), el efecto interacción x1 x2 y el efecto cuadrático x12.

Con la finalidad de construir el mejor ANVA se eliminaron del análisis y se mandaron al error a los efectos que fueron no significativos. Así, los efectos interacción x1 x3 y x2 x3 y los efectos cuadráticos x22 y x32 fueron no significativos por lo que se eliminaron para obtener el mejor ANVA tal como se observa en la Tabla 22.

La Tabla 22 muestra el mejor ANVA para la fuerza de gel. Además, el error se separó en dos componentes: falta de ajuste (lack of fit) y error puro.

64

Tabla 22: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para la fuerza de gel y prueba de falta de ajuste Fuente de variabilidad

Suma de

Grados de Cuadrado

Fc

Valor p

cuadrados

libertad

medio

Modelo

23845,85

5

4769,17

72,59

0,0000

x1: temperatura (°C)

14164,58

1

14164,58

215,59

0,0000

x2: tiempo (minutos)

1676,12

1

1676,12

25,51

0,0002

x3: ácido cítrico (%)

2741,62

1

2741,62

41,73

0,0000

x1 x2

691,92

1

691,92

10,53

0,0059

x12

4571,62

1

4571,62

69,58

0,0000

Error

919,80

14

65,70

Falta de ajuste

791,77

9

87,97

3,44

0,0938

Error puro

128,03

5

25,61

24765,65

19

Total

(prob > F)

R2 = 0,9629, R2aj = 0,9496

En la Tabla 22 se aprecia que la falta de ajuste resultó ser no significativa puesto que el valor p (prob > F) fue superior a 0,05. Al respecto, Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que una falta de ajuste no significativa indica que el modelo de segundo orden se ajusta de manera conveniente a los datos.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, se puede decir que el modelo de segundo orden fue una aproximación adecuada para explicar la respuesta en la región experimental elegida.

La Tabla 23 muestra los coeficientes de regresión estimados asociados a los efectos significativos en función a la fuerza de gel.

65

Tabla 23: Coeficientes de regresión estimados para la fuerza de gel Término del modelo

Coeficiente estimado

Intercepto

391,49

x1: temperatura (°C)

-32,21

x2: tiempo (minutos)

-11,08

x3: ácido cítrico (%)

-14,17

x1 x2

9,30

x12

-17,65

Luego de realizar el análisis de regresión múltiple con los valores observados, se obtuvo el siguiente modelo matemático o ecuación polinomial de segundo grado: 𝑦̂1 = 391,49 − 32,21 𝑥1 − 11,08 𝑥2 − 14,17 𝑥3 + 9,30 𝑥1 𝑥2 − 17,65 𝑥12 Donde 𝑦̂1 representa la fuerza de gel estimada (g); y 𝑥1 , 𝑥2 y 𝑥3 la temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v), respectivamente, en su forma codificada.

Para medir la calidad de ajuste del modelo de regresión múltiple se utilizó el coeficiente de determinación ajustado (R2aj), el cual se obtuvo a partir del mejor ANVA tal como se muestra en la Tabla 22. El valor del coeficiente de determinación ajustado (R2aj) fue 0,9496, es decir el 94,96 % de la variabilidad de los datos es explicada por el modelo cuadrático ajustado; por lo tanto, existe una adecuada correlación entre los valores observados y estimados de la respuesta.

De esta manera, el modelo cuadrático ajustado fue mucho más conveniente para representar la relación existente entre la respuesta (fuerza de gel) y las variables evaluadas (temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico).

Los contornos y superficies de respuesta presentados en las Figuras 14 a 19, muestran la influencia de dos variables sobre la respuesta fuerza de gel (la otra variable permaneció constante en su nivel central).

66

Las Figuras 14 y 15 muestran el efecto de la temperatura y el tiempo sobre la fuerza de gel (la concentración de ácido cítrico permaneció constante y fue igual a 0,50 %).

Figura 14: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden

Figura 15: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 14 y 15 se puede apreciar que el efecto del tiempo sobre la fuerza de gel fue inversamente proporcional ya que, a medida que aquel aumentó, la fuerza de gel disminuyó.

67

Por otro lado, la temperatura tuvo un efecto diferente, por cuanto se observó un incremento de la fuerza de gel cuando se incrementó la temperatura de extracción, pero esto sólo sucedió hasta un determinado nivel de temperatura, después del cual, los valores de fuerza de gel comenzaron a disminuir.

Se obtuvieron gelatinas con los mayores valores de fuerza de gel (aprox. entre 410 y 440 g) cuando se trabajó a bajas temperaturas de extracción (aprox. entre 40 y 55 °C) durante tiempos cortos (aprox. entre 60 y 200 min); sin embargo, los valores de fuerza de gel disminuyeron hasta 360 g cuando se incrementaron la temperatura (55,0 - 62,5 °C) y el tiempo (200 - 400 min) de extracción.

Además, se observó que a temperaturas mayores (> 62,5 °C) la fuerza de gel disminuyó considerablemente sin verse afectada por el tiempo de extracción, llegando hasta valores de 280 g. Esto se relaciona con lo observado en el mejor ANVA, mostrado en la Tabla 22, en el cual se determinó que la temperatura de extracción ejerció el efecto más significativo sobre la fuerza de gel.

Djabourov et al. (1993), citados por Karim y Bhat (2009), mencionan que tratamientos térmicos por encima de 40 °C rompen puentes de hidrógeno y enlaces covalente, desestabilizando la triple hélice del colágeno, la cual se desenrollará y dará lugar a gelatina soluble. Por su parte, Muyonga et al. (2004), Cho et al. (2005), Alfaro et al. (2014) y Jridi et al. (2015) indican que altas temperaturas y excesivos tiempos de extracción causan una degradación de la proteína, rompiendo demasiados enlaces y generando péptidos de bajo peso molecular (< cadenas α), lo que resulta en una disminución de su capacidad gelificante y, por ende, en gelatinas con valores más bajos de fuerza de gel.

Las Figuras 16 y 17 muestran el efecto de la temperatura y la concentración de ácido cítrico sobre la fuerza de gel (el tiempo permaneció constante y fue igual a 230 min).

68

Figura 16: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden

Figura 17: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 16 y 17 se puede apreciar que el efecto de la concentración de ácido cítrico sobre la fuerza de gel fue inversamente proporcional, ya que a medida que aumentó, la fuerza de gel disminuyó.

69

Por otro lado, la temperatura tuvo el mismo efecto descrito anteriormente, ya que se observó un incremento de la fuerza de gel cuando se incrementó la temperatura de extracción, pero después de un determinado nivel de temperatura, los valores de fuerza de gel comenzaron a disminuir.

En las Figuras 16 y 17 también se puede apreciar que con una extracción a bajas temperaturas (aprox. entre 40 y 55 °C) y utilizando bajas concentraciones de ácido cítrico (aprox. entre 0,1 y 0,5 %) se obtuvieron gelatinas con los mayores valores de fuerza de gel (> 400 g); sin embargo, éstos valores disminuyeron considerablemente (de 370 a 280 g) cuando la temperatura se incrementó a partir de 62,5 °C.

También se observó que la temperatura de extracción ejerció el efecto más significativo sobre la fuerza de gel. Las razones por la cual la fuerza de gel disminuye a partir de ciertos valores de temperatura se explicaron anteriormente (ver página 68).

Así mismo, a temperaturas de extracción iguales, la fuerza de gel disminuyó respecto a un incremento de la concentración de ácido cítrico. La concentración de ácido cítrico utilizada en la extracción estuvo relacionada con el pH final de la gelatina obtenida, es por ello que gelatinas obtenidas en soluciones con bajas concentraciones de ácido cítrico (0,26 – 0,10 %) presentaron valores mayores de pH (4,9 – 5,6), en comparación a altas concentraciones de ácido cítrico (0,74 – 0,90 %) que presentaron valores más bajos de pH (3,8 – 4,0).

Songchotikunpan et al. (2008) mencionan que la fuerza de gel depende del pH de la gelatina, y se pueden formar geles más compactos y fuertes ajustando su pH a valores cercanos de su punto isoeléctrico. Cabe mencionar que la gelatina obtenida fue una gelatina tipo A, debido a que las pieles de perico fueron previamente acondicionadas en una solución ácida, siendo la característica de estas gelatinas presentar un punto isoeléctrico a un pH entre 7 y 9 (Gómez-Guillén et al., 2011). Es así que, las gelatinas obtenidas con bajas concentraciones de ácido cítrico presentaron mayores valores de fuerza de gel, ya que tuvieron valores de pH (entre 4,8 y 5,6) más cercanos a su punto isoeléctrico (pH ~ 7 – 9), respecto a las gelatinas obtenidas con altas concentraciones de ácido cítrico y con valores de pH entre 3,8 y 4,0.

Las Figuras 18 y 19 muestran el efecto del tiempo y la concentración de ácido cítrico sobre la fuerza de gel (la temperatura permaneció constante y fue igual a 55 °C). 70

Figura 18: Contornos para la fuerza de gel, en función a las variables tiempo (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden

Figura 19: Superficie de respuesta para la fuerza de gel, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 18 y 19 se puede apreciar que el efecto del tiempo y de la concentración de ácido cítrico sobre la fuerza de gel fue inversamente proporcional ya que, a medida que aumentaron ambas variables, la fuerza de gel disminuyó.

71

Se obtuvieron gelatinas con los mayores valores de fuerza de gel (> 400 g) cuando se trabajó durante tiempos cortos extracción (entre 60 y 230 min) y en soluciones con bajas concentraciones de ácido cítrico (aprox. entre 0,1 y 0,5 %).

b. Rendimiento de extracción de proteína

La Tabla 24 muestra los valores promedio del rendimiento de extracción de proteína observado y estimado para cada tratamiento analizado. Se observó que el rendimiento de extracción de proteína fluctuó entre 15,74 a 21,36 g (ver Anexo 5).

En la Tabla 24 se aprecia que los cambios extremos de temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico influyen drásticamente sobre el rendimiento de extracción de proteína. Por ejemplo, si se comparan los tratamientos 14 y 13, se aprecia que variando la concentración de ácido cítrico de 0,90 a 0,10 % y manteniendo las otras dos variables en su punto central, el rendimiento de extracción aumenta de 18,66 a 19,12 %. Sin embargo, si se comparan los tratamientos 11 y 12, se aprecia que una variación del tiempo de extracción de 60 a 400 minutos y manteniendo de igual manera las otras dos variables en su punto central, produce un mayor aumento del rendimiento de extracción de 18,89 a 20,56 %. Esto demuestra que existen variables que ejercen un efecto mucho mayor sobre el rendimiento de extracción de proteína, es por ello que se requiere una optimización de las condiciones de extracción con la finalidad de obtener el mayor rendimiento.

72

Tabla 24: Rendimiento de extracción de proteína observado y estimado en el diseño central compuesto Rendimiento de

Rendimiento de

extracción de

extracción de

de ácido

proteína

proteína

cítrico (%)

observado (%)

estimado (%)

Temperatura Tiempo Concentración Tratamiento

(°C)

(minutos)

X1

X2

X3

Y2

𝑦̂2

1

46,1

129

0,26

16,84

16,84

2

63,9

129

0,26

20,41

20,36

3

46,1

331

0,26

18,34

18,21

4

63,9

331

0,26

21,36

21,44

5

46,1

129

0,74

16,71

16,73

6

63,9

129

0,74

20,25

20,26

7

46,1

331

0,74

17,49

17,64

8

63,9

331

0,74

20,97

20,86

9

40,0

230

0,50

15,74

15,72

10

70,0

230

0,50

21,35

21,39

11

55,0

60

0,50

18,89

18,98

12

55,0

400

0,50

20,56

20,64

13

55,0

230

0,10

19,12

19,18

14

55,0

230

0,90

18,66

18,61

15

55,0

230

0,50

19,92

19,81

16

55,0

230

0,50

19,89

19,81

17

55,0

230

0,50

19,76

19,81

18

55,0

230

0,50

19,79

19,81

19

55,0

230

0,50

19,80

19,81

20

55,0

230

0,50

19,83

19,81

La Tabla 25 muestra el análisis de varianza del modelo cuadrático. El ANVA incluyó los efectos simples, efectos interacción y efectos cuadráticos, y se realizó con la finalidad de determinar los efectos que contribuyeron a explicar el comportamiento de la respuesta.

73

Tabla 25: Análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína Fuente de variabilidad

Suma de

Grados de Cuadrado

Fc

Valor p

cuadrados

libertad

medio

(prob > F)

Modelo

46,85

9

5,21

782,90

0,0000

x1: temperatura (°C)

38,92

1

38,92

5853,45

0,0000

x2: tiempo (minutos)

3,33

1

3,33

501,29

0,0000

x3: ácido cítrico (%)

0,39

1

0,39

58,95

0,0000

x1 x2

0,04

1

0,04

6,72

0,0269

x1 x3

0,02

1

0,02

3,64

0,0854

x2 x3

0,11

1

0,11

16,73

0,0022

x12

2,85

1

2,85

429,24

0,0000

x22

0,01

1

0,01

1,84

0,2045

x32

1,52

1

1,52

228,84

0,0000

Error

0,07

10

0,01

Total

46,91

19

En la Tabla 25 se aprecia que el valor p (prob > F) del modelo cuadrático fue menor a 0,05 y 0,01, por lo tanto el modelo fue significativo.

Con respecto a los efectos del modelo estimado, en el ANVA que se muestra en la Tabla 25 se aprecia que a un nivel de significancia de α = 0,05 los efectos que tuvieron un valor p (prob > F) menor a 0,05 fueron los efectos principales (x1, x2, x3), los efectos interacción x1 x2 y x2 x3 y los efectos cuadráticos x12 y x32.

Con la finalidad de construir el mejor ANVA se eliminaron del análisis y se mandaron al error a los efectos que fueron no significativos.

De acuerdo al ANVA que se muestra en la Tabla 25, el efecto interacción x1 x3 y el efecto cuadrático x22 fueron no significativos por lo que se eliminaron para obtener el mejor ANVA tal como se muestra en la Tabla 26.

74

La Tabla 26 muestra el mejor ANVA para el rendimiento de extracción de proteína. Además, el error se separó en dos componentes: falta de ajuste (lack of fit) y error puro.

Tabla 26: Mejor análisis de varianza (ANVA) de la regresión para el rendimiento de extracción de proteína y prueba de falta de ajuste Suma de

Grados de

Cuadrado

cuadrados

libertad

medio

Modelo

46,81

7

6,69

779,40

0,0000

x1: temperatura (°C)

38,92

1

38,92

4535,83

0,0000

x2: tiempo (minutos)

3,33

1

3,33

388,45

0,0000

x3: ácido cítrico (%)

0,39

1

0,39

45,68

0,0000

x1 x2

0,04

1

0,04

5,21

0,0415

x2 x3

0,11

1

0,11

12,97

0,0036

x12

2,84

1

2,84

331,57

0,0000

x32

1,51

1

1,51

175,91

0,0000

Error

0,10

12

0,01

Falta de ajuste

0,08

7

0,01

3,20

0,1095

Error puro

0,02

5

0,00

Total

46,91

19

Fuente de variabilidad

Fc

Valor p (prob > F)

R2 = 0,9978, R2aj = 0,9965

En la Tabla 26 se aprecia que la falta de ajuste resultó ser no significativa puesto que el valor p (prob > F) es superior a 0,05. Al respecto, Gutiérrez y Vara (2008) mencionan que una falta de ajuste no significativa indica que el modelo de segundo orden se ajusta de manera conveniente a los datos.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, se puede decir que el modelo de segundo orden fue una aproximación adecuada para explicar la respuesta en la región experimental elegida.

La Tabla 27 muestra los coeficientes de regresión estimados asociados a los efectos significativos en función al rendimiento de extracción.

75

Tabla 27: Coeficientes de regresión estimados para el rendimiento de extracción de proteína Término del modelo

Coeficiente estimado

Intercepto

19,81

x1: temperatura (°C)

1,69

x2: tiempo (minutos)

0,49

x3: ácido cítrico (%)

-0,17

x1 x2

-0,07

x2 x3

-0,12

x12

-0,44

x32

-0,32

Luego de realizar el análisis de regresión múltiple con los valores observados, se obtuvo el siguiente modelo matemático o ecuación polinomial de segundo grado: 𝑦̂2 = 19,81 + 1,69𝑥1 + 0,49𝑥2 − 0,17𝑥3 − 0,07𝑥1 𝑥2 − 0,12𝑥2 𝑥3 − 0,44𝑥12 − 0,32𝑥32 Donde 𝑦̂2 representa el rendimiento de extracción de proteína estimado (%, p/p); y 𝑥1 , 𝑥2 y 𝑥3 la temperatura (°C), tiempo (minutos) y concentración de ácido cítrico (%, p/v), respectivamente, en su forma codificada.

Para medir la calidad de ajuste del modelo de regresión múltiple se utilizó el coeficiente de determinación ajustado (R2aj), el cual se obtuvo a partir del mejor ANVA tal como se muestra en la Tabla 26. El valor del coeficiente de determinación ajustado (R2aj) fue 0,9965, es decir el 99,65 % de la variabilidad de los datos fue explicada por el modelo cuadrático ajustado; por lo tanto, existe una adecuada correlación entre los valores observados y estimados de la respuesta.

De esta manera, el modelo cuadrático ajustado fue mucho más conveniente para representar la relación existente entre la respuesta (rendimiento de extracción de proteína) y las variables evaluadas (temperatura, tiempo y concentración de ácido cítrico).

76

Los contornos y superficies de respuesta presentados en las Figuras 20 a 25, muestran la influencia de dos variables sobre la respuesta rendimiento de extracción de proteína (la otra variable permaneció constante en su nivel central).

Las Figuras 20 y 21 muestran el efecto de la temperatura y el tiempo sobre el rendimiento de extracción de proteína (la concentración de ácido cítrico permaneció constante y fue igual a 0,50 %).

Figura 20: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden

77

Figura 21: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y tiempo (X2) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 20 y 21 se pudo apreciar que los efectos de la temperatura y el tiempo sobre el rendimiento de extracción de proteína fueron directamente proporcionales, ya que a medida que ambas variables aumentaron, el rendimiento también aumentó.

Se obtuvieron gelatinas con los mayores valores de rendimiento (> 21,0 %) cuando se trabajó a altas temperaturas de extracción (aprox. entre 62,5 y 70,0 °C) durante tiempos largos (aprox. entre 280 y 400 min).

Además, a temperaturas mayores de 62,5 °C, el rendimiento de extracción de proteína fue alto (> 20,5 %) incluso durante los tiempos cortos de extracción (entre 60 y 145 min). Esto se relaciona con lo observado en el mejor ANVA, mostrado en la Tabla 26, en el cual se determinó que la temperatura de extracción ejerció el efecto más significativo sobre el rendimiento de extracción de gelatina.

Como se mencionó anteriormente, el colágeno requiere tratamientos térmicos por encima de 40 °C para desestabilizar la triple hélice debido al rompimiento de enlaces covalentes y puentes de hidrógeno, y así dar lugar a gelatina soluble (Djabourov et al., 1993, citados por Karim y Bhat, 2009). Por su parte, Johnston-Banks (1990), citado por Kasankala et al. (2007) expresa que un número suficiente de enlaces deben romperse para convertir el colágeno en una forma adecuada para la extracción.

78

De acuerdo a ello, un incremento en la temperatura o tiempo de extracción facilitó la fragmentación de las cadenas de colágeno, incrementando la proporción de moléculas desestabilizadas y, por ende, una mayor proporción de gelatina fue solubilizada y extraída.

Las Figuras 22 y 23 muestran el efecto de la temperatura y la concentración de ácido cítrico sobre el rendimiento de extracción de proteína (el tiempo permaneció constante y fue igual a 230 min).

Figura 22: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden

79

Figura 23: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables temperatura (X1) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 22 y 23 se puede apreciar que el efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extracción de proteína fue directamente proporcional, ya que a medida que ésta aumentó también aumentó el rendimiento. En cuanto a la concentración de ácido cítrico, ésta tuvo un efecto diferente, ya que se observó que el rendimiento casi no fue afectado por el ácido cítrico cuando se emplearon temperaturas entre 40 y 55 °C, sin embargo, a temperaturas mayores de 55 °C se observó un ligero incremento del efecto del ácido cítrico sobre el rendimiento. De acuerdo a ello, se puede decir que la concentración de ácido cítrico ejerció un efecto menos significativo sobre el rendimiento, respecto al efecto que ejerció la temperatura de extracción. La explicación del aumento del rendimiento conforme un aumento de la temperatura se detalló anteriormente (ver página 78).

Las Figuras 24 y 25 muestran el efecto de la temperatura y la concentración de ácido cítrico sobre el rendimiento de extracción de proteína (la temperatura permaneció constante y fue igual a 55 °C).

80

Figura 24: Contornos para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden

Figura 25: Superficie de respuesta para el rendimiento de extracción de proteína, en función a las variables tiempo (X2) y concentración de ácido cítrico (X3) en la búsqueda del modelo de segundo orden En las Figuras 24 y 25 se puede apreciar que el efecto del tiempo sobre el rendimiento fue directamente proporcional.

81

Por otro lado, la concentración de ácido cítrico tuvo un efecto diferente, ya que el rendimiento se incrementó cuando la concentración de ácido cítrico también aumentó, pero después de determinados niveles de concentración, el rendimiento disminuyó.

Se obtuvieron gelatinas con los mayores valores de rendimiento de extracción de proteína (> 20,0 %) cuando se trabajó durante tiempos largos de extracción (aprox. entre 300 y 400 min) y en soluciones con bajas concentraciones de ácido cítrico (aprox. entre 0,1 y 0,5 %).

4.3.

OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LAS RESPUESTAS

La optimización simultánea de las respuestas se llevó a cabo luego de haber obtenido los modelos matemáticos de segundo orden, correspondientes a cada respuesta evaluada (ver páginas 66 y 76). Para ello se tuvo en cuenta el método de la función de deseabilidad, descrita por Montgomery (2011) y Gutiérrez y Vara (2008). De acuerdo a esta teoría, se obtuvo una función de deseabilidad para cada respuesta implicada y, posteriormente, un valor de deseabilidad global.

Para la maximización de la fuerza de gel y del rendimiento de extracción de proteína se establecieron determinadas restricciones a partir de los resultados obtenidos en el diseño experimental y en base a literatura sobre gelatinas de mamíferos y de peces de aguas cálidas según lo indicado en el acápite 3.6 (ver páginas 43 y 44), tal como se muestra a continuación:

-

Fuerza de gel: mayor o igual a 300 g

-

Rendimiento de extracción de proteína: mayor o igual a 20,0 %

Posteriormente, se realizó la optimización con la finalidad de encontrar las condiciones de extracción que cumplan de la mejor forma con estas restricciones, para lo cual se utilizaron las siguientes ecuaciones: 0

𝑦̂1 < 300

𝑦̂1 − 300 1 ( 𝑑1 = 454,2 − 300) {

300 ≤ 𝑦̂1 ≤ 454,2

1

𝑦̂1 > 454,2 82

0

𝑦̂2 < 20

𝑦̂2 − 20 1 ( 𝑑2 = 21,36 − 20) {

20 ≤ 𝑦̂2 ≤ 21,36

1

𝑦̂2 > 21,36

Donde: 𝑑1 : función de deseabilidad para la fuerza de gel 𝑑2 : función de deseabilidad para el rendimiento de extracción de proteína 𝑦̂1 : fuerza de gel estimada (g) 𝑦̂2 : rendimiento de extracción de proteína estimado (%) Los valores de 454,2 g (ver Tabla 20) y 21,36 % (ver Tabla 24) correspondieron a los máximos valores observados para las respuestas fuerza de gel y rendimiento de extracción de proteína, respectivamente, en el diseño experimental.

La Tabla 28 muestra la solución de optimización elegida, las respuestas estimadas y el valor de deseabilidad global obtenido.

Tabla 28: Solución de optimización, respuestas estimadas y deseabilidad global para la obtención de gelatina de piel de perico Variables optimizadas

Valor

Temperatura (X1)

56,8 °C

Tiempo (X2)

331 minutos

Concentración de ácido cítrico (X3)

0,26 %

Respuestas estimadas Fuerza de gel (𝑦̂1 )

389,1 g

Rendimiento de extracción (𝑦̂2 )

20,58 %

Deseabilidad global

0,912

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 28, se aprecia que la solución de optimización presentó el valor de deseabilidad global de 0,912. Este valor se eligió debido a que fue el mayor valor obtenido (ver Anexo 6). Así mismo, la solución presentó como

83

resultado estimado el mayor valor de fuerza de gel (389,1 g) y rendimiento de extracción de proteína (20,58 %).

4.4.

VERIFICACIÓN DE LOS NIVELES ÓPTIMOS DE LAS VARIABLES

La Tabla 29 muestra la comparación de las respuestas observadas (fuerza de gel y rendimiento de extracción de proteína) en la gelatina obtenida en el punto óptimo, con sus respectivos valores estimados por los modelos.

Tabla 29: Comparación de los valores estimados y observados para las respuestas en el punto óptimo Valores

Respuestas de la MSR

Estimados

Observados

Y1: Fuerza de gel (g)

389,1

386,6 ± 4,50

Y2: Rendimiento de extracción (%)

20,58

20,40 ± 0,08

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 29, se aprecia que los valores observados y estimados en el punto óptimo fueron cercanos entre sí. Es así que, los modelos empíricos obtenidos por la metodología de superficie de respuesta, pudieron ser usados para describir adecuadamente la relación entre los factores y las respuestas, siempre y cuando se trabaje en cualquier condición que se encuentre dentro de la zona experimental analizada.

4.4.1. Fuerza de gel

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 29, la gelatina de piel de perico tuvo una fuerza de gel de 386,6 g. Este valor fue mayor respecto al obtenido en gelatinas de peces de aguas frías, según lo reportado por Gómez-Guillén et al. (2002), quienes obtuvieron valores entre 80 y 100 g. Así mismo, el resultado obtenido fue mayor respecto a gelatinas de peces de aguas cálidas como la perca del nilo (Muyonga et al., 2004), carpa herbívora (Kasankala et al., 2007), tilapia del Nilo (Songchotikunpan et al., 2008) y tilapia roja (Jamilah et al., 2011) con valores entre 229 y 385 g. Sin embargo, fue menor respecto a la gelatina de piel de atún de cola amarilla (Cho et al., 2005) que tuvo una fuerza de gel de 426 g, obtenida mediante optimización aplicando la MSR. Cabe mencionar que en el presente estudio se

84

obtuvieron valores altos de 423 y 454 g, pero estos resultados disminuyen los valores de rendimiento de extracción de proteína, y debido a que se busca optimizar ambas respuestas, no se consideraron como óptimas las gelatinas con los máximos valores de fuerza de gel.

Por otro lado, Muyonga et al. (2004), Cho et al. (2005) y Karim y Bhat (2009) reportan para gelatinas comerciales de bovino valores de fuerza de gel entre 200 y 221 g; y Cho et al. (2005) y Karim y Bhat (2009), para gelatinas comerciales de porcino, señalan valores entre 240 y 295 g. En comparación con estos resultados, la gelatina de piel de perico obtenida en el presente estudio tuvo una fuerza de gel mayor.

Karim y Bhat (2009) mencionan que la variación en la fuerza de gel depende de varios factores, tales como la diferencia en la composición en aminoácidos, la distribución y tamaño de pesos moleculares y el pH en la gelatina obtenida. Es así que, estas diferencias pueden ser explicadas por los diferentes procesos de extracción, así como por las propiedades intrínsecas del colágeno que varía entre las distintas especies de pescados y mamíferos.

La gelatina obtenida en el presente estudio se clasificó según su fuerza de gel como gelatina Tipo I (> 180g) y según su forma de presentación como clase G (gelatina en polvo), de acuerdo al Instituto Nacional de Defensa de la Competencia y de la Protección de la Propiedad Intelectual (INDECOPI, 2012).

4.4.2. Rendimiento de extracción de proteína

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 29, la gelatina tuvo un rendimiento de extracción de proteína de 20,40 %.

El rendimiento obtenido en el presente estudio fue ligeramente mayor respecto a lo reportado por Kasankala et al. (2007) quienes obtuvieron un rendimiento de 19,8 % en gelatina de piel de carpa herbívora (Catenopharyngodon idella) y Yang et al. (2007) un rendimiento de 19,2 % en gelatina de piel de bagre (Ictalurus punctatus). Estas diferencias pueden ser debido a los siguiente factores: tipo de especie empleada, acondicionamiento previo a la extracción y condiciones de extracción, tal como lo mencionan Yang et al. (2007) y Karim y Bhat (2009) ya que estas variables influyen en el rendimiento de extracción de proteína.

85

4.5.

RENDIMIENTO DE LA GELATINA

En la Tabla 30 se muestran los resultados del rendimiento de la gelatina obtenida a partir de la piel de perico.

Tabla 30: Rendimiento de la gelatina obtenida de piel de perico Muestra

Peso (kg)

Rendimiento (%)

Piel de perico

8,00

100,00

Gelatina de piel de perico seca

1,48

18,52

De acuerdo a los resultados, se aprecia que el rendimiento de la gelatina fue 18,52 %. Karim y Bhat (2009) mencionan que para gelatinas de piel de pescado se han obtenido rendimientos entre 6,0 y 19,0 %. En comparación con estos valores, la gelatina de piel de perico tuvo un rendimiento alto y muy cercano al valor máximo reportado por estos autores. Las diferencias presentadas en los rendimientos pudieron estar dadas por los mismos factores que influyen sobre el rendimiento de extracción de proteína: tipo de especie empleada, acondicionamiento previo a la extracción y condiciones de extracción utilizadas, tal como lo mencionan Karim y Bhat (2009) y corroborado con los resultados obtenidos en el presente estudio.

4.6.

CARACTERIZACIÓN DE LA GELATINA

4.6.1. Composición proximal y pH

La Tabla 31 muestra la composición proximal (tanto en base húmeda como en base seca) y pH de la gelatina de piel de perico.

Tabla 31: Composición proximal y pH de la gelatina de piel de perico Análisis

Base húmeda

Base seca

Humedad (g/100 g)

6,8 ± 0,11

-

Proteína total (g/100 g)

88,3 ± 0,04

94,8 ± 0,07

Grasa cruda (g/100 g)

0,2 ± 0,04

0,2 ± 0,04

Ceniza (g/100 g)

1,0 ± 0,01

1,0 ± 0,01

pH

4,9 ± 0,01

-

86

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 31, la gelatina de piel de perico tuvo un contenido de humedad de 6,8 %, un alto contenido de proteína total (88,3 %) y bajos contenidos de grasa cruda (0,2 %) y ceniza (1,0 %), además el pH de la gelatina fue 4,90.

Respecto a estos valores se puede decir que, generalmente la proteína es alta en gelatinas de pescado. See et al. (2010) y Shyni et al. (2014) obtuvieron contenidos de 89,7 %, 90,1 % y 88,4 % en gelatinas de piel de tilapia roja, tiburón y atún, respectivamente. Por su parte, la GME (2008) menciona que las gelatinas comerciales de porcino y bovino contienen entre 84,0 y 90,0 % de proteína. La humedad que se obtuvo en el producto estuvo dentro del rango establecido para gelatinas según la GMIA (2012), el cual debe ser menor a 13,0 %. El bajo contenido de grasa cruda puede ser un indicador de que existió una eficiente remoción de la misma en las etapas previas de limpieza y lavado de la piel. Muyonga et al. (2004) mencionan que las gelatinas generalmente deben estar casi libres de grasa (< 0,5 %), es por ello que este resultado estuvo dentro de los niveles establecidos. En cuanto a la ceniza, Jones (1977), citado por Shyni et al. (2014) y Jridi et al. (2015) mencionan que las gelatinas con un contenido de ceniza menor a 2,6 % son de buena calidad. De acuerdo a ello, según el bajo contenido de ceniza obtenido, la gelatina obtenida fue de buena calidad. El pH de la gelatina obtenida fue ácido, producto del empleo de ácido cítrico como medio para la extracción.

La gelatina de piel de perico cumplió con los estándares de una gelatina comestible de acuerdo a INDECOPI (2012), debido a que tuvo un contenido de humedad menor a 16,0 %, un contenido de ceniza menor a 3,0 % y un valor de pH entre 4 y 7,5. Así mismo, cumplió con los estándares de la GMIA (2012), ya que presentó un valor de ceniza menor al límite máximo recomendado de 2,0 % y estuvo dentro del rango de pH entre 3,8 y 7,5 para gelatinas comestibles.

4.6.2. Determinación de pesos moleculares por electroforesis Los patrones electroforéticos de la gelatina de piel de perico se muestran en la Figura 26.

87

MP GPP

Cadena β

200 kDa

Cadena α-1 (I) Cadena α-2 (I)

116 kDa 97 kDa

66 kDa

Figura 26: Patrones electroforéticos del marcador de proteínas (MP) y la gelatina de piel de perico (GPP) En la Figura 26 se observa que en la gelatina obtenida se encontraron cadenas α y cadenas β como los mayores constituyentes de proteína dentro del perfil electroforético.

El análisis de pesos moleculares reveló la presencia de una mayor intensidad de banda correspondiente a las cadenas α-1 y α-2 alrededor de 116 kDa, con respecto a la banda de proteína de cadenas β alrededor de 200 kDa.

Lo obtenido confirma que la gelatina consiste en una mezcla de diferentes cadenas de polipéptidos con diferentes pesos moleculares como lo mencionan Karim y Bhat (2009). Esto es debido a que durante el proceso de obtención de gelatina, la conversión de colágeno a gelatina genera moléculas de distintas masas producto del rompimiento de enlaces covalentes entre cadenas, así como de algunos enlaces peptídicos internos, tal como lo mencionan Zhou et al. (2006).

4.6.3. Composición en aminoácidos La Tabla 32 muestra la composición en aminoácidos en gelatina de piel de perico y en gelatinas comerciales de mamíferos, para efectos de comparación. Está expresado en g de aminoácido por 100 g de muestra.

88

Tabla 32: Composición en aminoácidos en gelatina obtenida de diferente origen Contenido (g/ 100 g gelatina) Aminoácido

Perico

Bovino

(presente estudio)

Porcino

(Ninan et al., 2010) (Ninan et al., 2010)

Ácido aspártico

4,32 ± 0,01

2,50

3,01

Ácido glutámico

8,57 ± 0,00

7,23

10,32

Serina

3,36 ± 0,01

2,95

3,01

Glicina

20,86 ± 0,01

29,20

27,69

Histidina

0,65 ± 0,00

0,08

0,03

Treonina

5,31 ± 0,03

2,11

2,06

Alanina

1,88 ± 0,01

11,40

11,20

Arginina

19,10 ± 0,01

5,10

4,90

Prolina

10,74 ± 0,06

11,89

12,44

Hidroxiprolina

7,90 ± 0,11

11,02

11,26

Tirosina

0,59 ± 0,00

0,11

0,08

Valina

1,95 ± 0,07

1,80

1,88

Metionina

1,81 ± 0,06

1,01

1,43

Isoleucina

4,41 ± 0,06

1,11

0,98

Leucina

2,63 ± 0,06

1,90

1,73

Fenilalanina

2,65 ± 0,07

1,60

1,20

Lisina

2,94 ± 0,04

4,01

3,29

Triptófano

0,00 ± 0,00

0,00

0,00

18,64

22,91

23,70

Hidroxiprolina + Prolina

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 32, la glicina fue el mayor componente en la gelatina de piel de perico con 20,86 %, seguido por la arginina (19,10 %), prolina (10,74 %) e hidroxiprolina (7,90 %). El alto contenido de glicina estuvo dentro del rango encontrado por Karim y Bhat (2009) y Gómez-Guillén et al. (2011), quienes mencionan que este aminoácido está alrededor del 30 % del total. Estos autores expresan que este aminoácido es importante ya que participa en la formación de la triple hélice del colágeno debido a que se encuentra en cada tercera posición al interior de cada hélice. El contenido de los aminoácidos prolina e hidroxiprolina obtenido fue 18,64 %. Este valor fue cercano a 19,16 y 20,86 % reportado por Ninan et al. (2014) en gelatina de piel de carpa común y carpa herbívora (peces 89

de aguas cálidas), respectivamente, pero menor a 22,91 y 23,70 % reportado en gelatinas comerciales de bovino y porcino, respectivamente, como se muestra en la Tabla 32. Al respecto, Songchotikunpan et al. (2008) mencionan que generalmente el contenido de prolina e hidroxiprolina en gelatinas de peces es menor que en gelatinas de mamíferos, ya que estos aminoácidos estabilizan térmicamente la triple hélice del colageno y como la temperatura corporal de los peces es menor que en los mamíferos terrestres, la cantidad de colágeno es menor en estos últimos.

Por otro lado, Ledward (1986), citado por Nikoo et al. (2014), menciona que la hidroxiprolina es el aminoácido más importante en la formación y estabilidad de la estructura parcial de la triple hélice en la gelatina. En la Tabla 33 se muestra el contenido de hidroxiprolina en gelatina de piel de perico y en gelatinas obtenidas de diferentes pieles de pescado, para efectos de comparación.

Tabla 33: Hidroxiprolina en gelatina obtenida de diferentes pieles de pescado Materia prima

Hidroxiprolina (g/ 100 g muestra)

Autor

Perico

7,90

Presente estudio

Esturión

6,10

Nikoo et al. (2014)

Bacalao

5,90

Zhou et al. (2006)

Perca del Nilo

7,76

Muyonga et al. (2004)

Tilapia del Nilo

7,78

Songchotikunpan et al. (2008)

Atún cola amarilla

8,63

Ninan et al. (2013)

Rohu

8,23

Ninan et al. (2013)

Elaboración propia

De acuerdo a la Tabla 33, el contenido de hidroxiprolina varía de acuerdo a la temperatura del hábitat de la especie. Así, la hidroxiprolina en la gelatina de piel de perico (especie de aguas cálidas) fue mayor que la reportada en gelatinas de peces de aguas frías, cuyos valores fluctúan entre 5,90 y 6,10 %, según Zhou et al. (2006) y Nikoo et al. (2014), respectivamente. Así mismo, este valor se encontró dentro del rango reportado en gelatinas de peces de aguas cálidas (perca del Nilo, tilapia del Nilo, atún de cola amarilla y rohu), cuyos valores fluctúan entre 7,76 y 8,63 %, según Muyonga et al. (2004), Songchotikunpan et al. (2008) y Ninan et al. (2013). Estos resultados están dentro de lo esperado, ya que

90

Regenstein y Zhou (2007) mencionan que, generalmente, las gelatinas de peces de aguas cálidas tienen un mayor contenido de hidroxiprolina respecto a las gelatinas de peces de aguas frías.

Por otro lado, estas diferencias se pueden deber a que el contenido de hidroxiprolina está influenciado por las condiciones de extracción empleadas, tal como lo mencionan Nikoo et al. (2013).

El contenido de hidroxiprolina influye directamente sobre la fuerza de gel en las gelatinas, ya que cuando la cantidad de hidroxiprolina aumenta, la fuerza de gel de la gelatina también aumenta, tal como lo mencionan Gilsenan y Ross-Murphy (2000) y Gómez-Guillén et al. (2002). De acuerdo a lo expresado anteriormente, se puede decir que el alto valor de la fuerza de gel en la gelatina de piel de perico estuvo influenciado por el alto contenido de hidroxiprolina presente en la gelatina.

4.6.4. Viscosidad En la Tabla 34 se aprecia el valor de la viscosidad en la gelatina de piel de perico obtenida.

Tabla 34: Propiedades físicas de la gelatina de piel de perico Propiedades físicas

Valores experimentales

Viscosidad (cP)

11,0 ± 0,06

Temperatura de fusión (°C)

25,6 ± 0,12

Temperatura de gelificación (°C)

17,6 ± 0,10

Actividad de agua

0,26 ± 0,01

De acuerdo a los resultados, se aprecia que la viscosidad de la gelatina fue 11,0 cP. Este valor fue mayor respecto a lo reportado por Jamilah y Harvinder (2002), citados por Songchotikunpan et al. (2008), Boran et al. (2010), Jamilah et al. (2011) y Ninan et al. (2014), quienes obtuvieron valores de viscosidad entre 6,0 y 7,7 cP en gelatinas de piel de tilapia y carpa. Así mismo, el resultado obtenido también fue mayor respecto a las gelatinas comerciales de bovino y porcino según lo reportado por Abrusci et al. (2004) y Boran et al. (2010), quienes obtuvieron valores de viscosidad entre 2,0 y 7,0 cP.

91

Alfaro et al. (2014) mencionan que bajas temperaturas durante la extracción de gelatina pueden propiciar una adecuada hidrolisis del colágeno, obtener compuestos de mayor peso molecular y dar lugar a gelatinas con mayores valores de viscosidad. De acuerdo a ello, el alto valor de viscosidad obtenido en el presente estudio pudo estar dado por la baja temperatura de extracción utilizada (56,8 °C) y, en consecuencia, a la presencia de cadenas β y una mayor intensidad de cadenas α de mayor peso molecular (~ 116 kDa) (ver Figura 26), respecto a gelatinas con cadenas α de menor peso molecular (~ 80 kDa) según lo mencionado por Karim y Bhat (2009) y Nikoo et al. (2014).

4.6.5. Temperaturas de fusión y gelificación

En la Tabla 34 se muestran los valores obtenidos de temperatura de fusión y gelificación en la gelatina de piel de perico.

De acuerdo a los resultados, se aprecia que la gelatina presentó una temperatura de fusión de 25,6 °C. Este valor fue mayor respecto al obtenido en gelatinas de peces de aguas frías, según lo reportado por Gómez-Guillén et al. (2002), quienes obtuvieron valores entre 13,8 y 14,0 °C. Así mismo, el resultado obtenido fue similar respecto a las gelatinas de peces de aguas cálidas, según lo mencionado por Muyonga et al. (2004), Cho et al. (2005) y Jamilah y Harvinder (2002), citados por Ninan et al. (2014), quienes obtuvieron valores entre 22,5 y 28,9 °C. Sin embargo, fue menor respecto a las gelatinas comerciales de bovino y porcino, según lo reportado por Cho et al. (2005), Boran et al. (2010) y Ninan et al. (2014), quienes obtuvieron valores entre 31,4 y 36,5 °C.

Por otro lado, según los resultados, la temperatura de gelificación obtenida fue de 17,6 °C. Este valor fue mayor respecto a las gelatinas de peces de aguas frías con temperaturas de gelificación entre 11,0 y 12,0 °C, según lo reportado por Gómez-Guillén et al. (2002). Así mismo, fue similar respecto a las gelatinas de peces de aguas cálidas con temperaturas de gelificación entre 17,9 y 19,5 °C, según lo reportado por Muyonga et al. (2004), Boran et al. (2010) y Ninan et al. (2014). Sin embargo, fue menor respecto de las gelatinas comerciales de bovino y porcino, según lo reportado por Cho et al. (2005), Boran et al. (2010) y Ninan et al. (2014), quienes obtuvieron valores entre 23,4 y 31,8 °C.

92

Gudmundsson (2002), citado por Nikoo et al. (2014) indica que la temperatura del medio ambiente del animal afecta las temperaturas de fusión y gelificación de la gelatina resultante. Es por ello que las diferencias en las temperaturas de fusión y gelificación de la gelatina de piel de perico respecto a las gelatinas de peces de aguas frías y gelatinas de bovino y porcino fueron en parte influenciadas por las diferencias en la temperatura del hábitat entre las distintas especies. Así mismo, la similitud encontrada entre las temperaturas de fusión y gelificación de la gelatina de piel de perico con las gelatinas de peces de aguas cálidas está dada porque el perico es una especie de aguas cálidas.

Karim y Bhat (2009) mencionan que generalmente, las gelatinas de peces de aguas frías tienen menores temperaturas de fusión y gelificación respecto a las gelatinas de peces de aguas cálidas, y que ambas son menores respecto a las gelatinas de mamíferos. Estas diferencian son debido a que las temperaturas de fusión y gelificación de las gelatinas están relacionadas con la proporción de los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, tal como lo menciona Veis (1964), citado por Gilsenan y Ross-Murphy (2000), siendo el contenido de estos aminoácidos aproximadamente de 23,0 a 24,0 % en gelatinas de mamíferos, 19,0 a 21,0 % en gelatinas de peces de aguas cálidas y 16,0 a 17,0 % en gelatinas de peces de aguas frías, según lo reportado por Gilsenan y Ross-Murphy (2000), Haug et al. (2004), Muyonga et al. (2004) y Ninan et al. (2010).

4.6.6. Actividad de agua

En la Tabla 34 se muestra el valor de actividad de agua (Aw) de la gelatina de piel de perico obtenida.

De acuerdo a los resultados, se aprecia que el valor de Aw en la gelatina fue de 0,26. Badui (2006) menciona que los productos secos tienen valores de actividad de agua aproximadamente entre 0,30 y 0,60 y que el crecimiento de microorganismos como bacterias, hongos y levaduras se da a una actividad de agua superior a 0,70. Es por ello, que el valor obtenido de actividad de agua de la gelatina de piel de perico permitirá asegurar su estabilidad en almacenamiento por largos periodos de tiempo, siempre y cuando sea envasado al vacío en bolsas de polietileno de alta densidad y baja permeabilidad al vapor de agua.

93

V. 1.

CONCLUSIONES

Los niveles establecidos como óptimos para la obtención de gelatina con el mayor valor de fuerza de gel y rendimiento de extracción de proteína fueron: temperatura 56,8 °C, tiempo 331 minutos y concentración de ácido cítrico 0,26 % (p/v).

2.

Los valores de fuerza de gel y rendimiento de extracción de proteína obtenidos bajo las condiciones óptimas fueron 386,6 g y 20,4 %, respectivamente.

3.

La gelatina obtenida presentó una composición proximal de 94,8 % de proteína total, 0,2 % de grasa cruda y 1,0 % de ceniza en base seca; así como un pH de 4,90, cumpliendo con los requisitos mínimos de una gelatina de grado alimentario.

4.

Los contenidos de prolina e hidroxiprolina en la gelatina obtenida fueron de 10,74 y 7,90 %, respectivamente.

5.

El análisis de electroforesis de la gelatina obtenida reveló la presencia de bandas con pesos moleculares alrededor de 116 kDa y 200 kDa.

6.

Las propiedades físicas de la gelatina obtenida bajo los niveles óptimos de las variables fueron: viscosidad de 11,0 cP, temperatura de fusión de 25,6 °C, temperatura de gelificación de 17,6 °C y actividad de agua de 0,26.

94

VI. -

RECOMENDACIONES

Escalar el proceso de obtención de gelatina de piel de perico a nivel de planta piloto y elaborar un estudio técnico-económico con la finalidad de evaluar su viabilidad.

-

Obtener gelatinas a partir de pieles, escamas, huesos, vejigas natatorias o cartílagos de otras especies comerciales del litoral peruano, con la finalidad de darle un valor agregado a estos residuos y diversificar su utilización.

-

Utilizar la gelatina en la industria alimentaria para la elaboración de postres, helados, productos lácteos o clarificación de vinos y jugos, o en la industria farmacéutica para la elaboración de cápsulas duras o blandas.

95

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.

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liquid

chromatography:

Precolumn

derivatization

with

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99

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100

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101

VIII. ANEXOS ANEXO 1

PROTOCOLO DE DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE HIDROXIPROLINA

REACTIVOS

-

Ácido sulfúrico 7 N

-

Buffer citrato pH 6: disolver 3 g ácido cítrico monohidratado, 1,5 g de hidróxido de sodio y 9 g de acetato de sodio trihidratado en 50 mL de agua desionizada. Luego adicionar 29 mL de 1-propanol. Verificar el pH con el potenciómetro y si es necesario ajustar con ácido o base. Finalmente, enrasar con agua desionizada a una fiola de 100 mL. La solución es estable por 2 meses a 4 °C en botella ámbar.

-

Solución oxidante: disolver 1,41 g de cloramina T en 100 mL de buffer citrato pH 6. La solución es estable a 4 °C por una semana en oscuridad.

-

Reactivo de color: disolver 2 g de 4-dimetilaminobenzaldehído en 7 mL de ácido perclórico 60 %. Luego agregar lentamente 13 mL de 2-propanol para obtener 20 mL de reactivo de color. Preparar la solución el día del ensayo

-

Solución stock de hidroxiprolina (600 ug/mL): disolver 60 mg de L-hidroxiprolina en agua desionizada y enrasar a una fiola de 100 mL. La solución es estable por dos meses a 4 °C.

-

Solución intermedia (6 ug/mL): pipetear 5 mL de solución stock de hidroxiprolina dentro de una fiola de 500 mL y enrasar con agua desionizada.

-

Soluciones de trabajo para curva estándar: pipetear 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 80 mL de la solución intermedia dentro de fiolas de 100 mL y enrasar cada una con agua desionizada. Las soluciones estándar de trabajo contienen 0,3; 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,6 y 4,8 ug de hidroxiprolina/mL, respectivamente. Preparar estas soluciones el día del ensayo.

102

ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA

-

Pesar 2 a 4 g de muestra en un frasco

-

Añadir 30 mL de ácido sulfúrico 7 N y cubrir con una tapa que tenga un pequeño orificio.

-

Colocar en estufa e hidrolizar a 103 °C por 16 horas.

-

Filtrar la solución, transferirla a una fiola de 100 mL y enrasar con agua.

-

Diluir la solución hasta una concentración de hidroxiprolina de 0,3 a 4,8 ug/mL.

PROCEDIMIENTO

-

Pipetear 2 mL de la dilución final en tubo de ensayo.

-

Pipetear 2 mL de agua desionizada para el blanco en tubo de ensayo. Preparar 2 blancos.

-

Pipetear 2 mL de cada concentración de las soluciones de trabajo para la curva estándar en tubo de ensayo.

-

Añadir 1 mL de solución oxidante a cada tubo y agitar.

-

Dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente.

-

Añadir 1 mL de reactivo de color a cada tubo.

-

Agitar y tapar cada tubo.

-

Colocar en baño maría a 60 °C por 15 minutos.

-

Enfriar los tubos.

-

Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 558 nm.

103

ANEXO 2

PROTOCOLO DE DETERMINACIÓN DE PESOS MOLECULARES POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA – SDS

REACTIVOS

-

Mix acrilamida (40%): disolver 38,67 g acrilamida y 1,33 g metilenobisacrilamida en agua desionizada y enrasar a 100 mL en fiola.

-

Catalizadores: TEMED y persulfato de amonio al 10% (p/v).

-

SDS 10% (p/v).

-

Buffer TRIS 1.5 M (pH 8.8): disolver 18,17 g TRIS-HCl en agua desionizada y enrasar a 100 mL en fiola.

-

Buffer TRIS 1.0 M (pH 6.8): disolver 12,11 g TRIS-HCl en agua desionizada y enrasar a 100 mL en fiola.

-

Buffer TRIS-glicina (pH 8.3): disolver 3 g TRIS-HCl, 14 g glicina y 1 g SDS en agua desionizada y enrasar a 1 L en fiola.

-

Solución de tinción: disolver 0,25 g de azul brillante de Coomasie en 450 mL de agua desionizada, 450 mL de metanol y 100 mL de ácido acético glacial.

-

Solución de destinción: mezclar 600 mL de agua desionizada, 350 mL de metanol y 50 mL de ácido acético glacial.

-

Azul de bromofenol (BPB): disolver 10 g BPB, 2 mL de glicerina, 0,2 mL buffer TRIS 0,5 M (pH 6,8) en agua desionizada y enrasar a 10 mL en fiola.

-

Buffer desnaturalizante: TRIS-HCl 50 mM (pH 7,5), 50% glicerina, 1% SDS, 0,02% azul de bromofenol.

PROCEDIMIENTO

Realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes.

-

Preparación del gel: preparar geles verticales al 3% de gel de apilamiento y 7,5% de gel de separación para la muestra piel de perico y geles verticales al 4 % de gel de apilamiento y 5 % de gel de separación para la muestra de gelatina de piel de perico. 104

Luego sumergirlos en buffer TRIS-glicina (pH 8,3) bajo corriente de 35 mA por 4 h. A continuación se indica la composición del gel de separación y de apilamiento, respectivamente.

Gel de separación

Gel de apilamiento

(50 mL)

(20 mL)

Componentes de la solución 5%

4%

5%

17,75

15,6

15,1

14,6

30,25 27,12

40% mix acrilamida (mL)

6,25

9,38 12,5 18,75

1,5

2

2,5

Buffer Tris 1,5 M (pH 8.8) (mL) 12,5

12,5 12,5 12,5

-

-

-

SDS 10% (mL)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,2

0,2

0,2

Persulfato de amonio 10% (mL)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,2

0,2

0,2

TEMED (mL)

0,04

0,03 0,02 0,02

0,02

0,02

0,02

2,5

2,5

2,5

-

-

24

3%

Agua destilada (mL)

Buffer Tris 1,0 M (pH 6.8) (mL)

-

7,5 % 10% 15%

-

-

Preparación de las muestras y de los marcadores de pesos moleculares: pesar 10 mg de muestra en un tubo de ensayo y agregar 10 mL de buffer desnaturalizante para lograr una concentración deseada de 1 mg/mL. Calentar los tubos en baño maría a 95 °C por 5 minutos para lograr la desnaturalización de las muestras. Si es necesario, colocar los tubos en un agitador de tubos a 70 °C por 16 horas. Por otro lado, reconstituir el marcador de peso molecular con 100 ul de agua desionizada y mezclar 15 ul de la solución preparada con 15 ul de solución de azul de bromofenol. A continuación se indican los componentes del marcador de peso molecular utilizado:

Proteínas

Peso molecular (kDa)

Miosina de músculo de conejo

200

β-Galactosidasa de E. coli

116

Fosforilasa b de músculo de conejo

97

Albúmina de suero de bovino

66

Deshidrogenasa glutámico de higado de bovino

55

Ovoalbúmina de huevo de pollo

45

Gliceraldehído-3-fosfato Deshidrogenasa de músculo de conejo

36

105

-

Corrida en la cámara electroforética: colocar en cada pocillo del gel de apilamiento, alícuotas de 15 ul de las muestras (1 mg/mL) y de los marcadores de pesos moleculares.

-

Tinción y decoloración de los geles: retirar el gel y luego sumergirlo en la solución de tinción durante un tiempo de 2 a 4 horas. Posteriormente, desteñir el gel en la solución de destinción durante 18 horas, con recambios cada 6 horas.

-

Lectura de distribución de pesos moleculares: observar las bandas de proteínas en el megatoscopio.

106

ANEXO 3 PROTOCOLO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SOLUBLE – MÉTODO DE BIURET

REACTIVOS

-

Reactivo I (Biuret): disolver 8g de hidróxido de sodio y 200 ul de glicerina en aproximadamente 30 mL de agua desionizada. Por otro lado, disolver 400 mg de sulfato de cobre pentahidratado en 30 mL de agua desionizada. Adicionar la solución de sulfato de cobre a la solución de hidróxido de sodio. Finalmente, enrasar con agua desionizada a una fiola de 100 mL.

-

Reactivo II (corrección de turbidez): disolver 8g de hidróxido de sodio y 200 ul de glicerina en aproximadamente 50 mL de agua desionizada. Luego enrasar a una fiola de 100 mL.

-

Solución stock de BSA (10mg/mL): disolver 500 mg de BSA en cloruro de potasio 0,1 M y enrasar a una fiola de 50 mL.

ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA

-

Las muestras de gelatina en solución fueron diluidas hasta una concentración de proteína de 1 a 10 mg/mL.

PROCEDIMIENTO

-

Pipetear 1 mL de la dilución final de la muestra en tubo de ensayo.

-

Preparar dos blancos y la curva estándar a partir de la solución stock de BSA, tal como se indica a continuación

107

Concentración de

Solución Stock

proteína

BSA (10 mg/mL)

Agua desionizada

(mg/mL)

(mL)

(mL)

Blanco (2)

0

0

1,0

1a

1,00

0,1

0,9

2a

2,50

0,25

0,75

3a

5,00

0,5

0,5

4a

7,50

0,75

0,25

5a

8,25

0,825

0,175

6a

9,50

0,95

0,05

7a

10,00

1,0

0

Tubos

-

Pipetear 2,5 mL del reactivo I (Biuret) al blanco, a la curva estándar y a las muestras preparadas.

-

Por otro lado preparar las mismas muestras, dos blancos y la misma curva estándar, tal como se indicó anteriormente.

-

Pipetear 2,5 mL del reactivo II (corrección) a los blancos, la curva estándar y las muestras preparadas.

-

Dejar todos los tubos en reposo por 2 horas a temperatura ambiente y en oscuridad.

-

Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 545 nm.

108

ANEXO 4

DETERMINACIÓN DE LA FUERZA DE GEL BÚSQUEDA I O DE PRIMER ORDEN – 8 puntos factoriales (2k) y 6 repeticiones en el punto central

Fuerza de gel (g)

Concentración Tratamiento

Temperatura Tiempo

de ácido

(°C)

(min)

cítrico (%)

X1

X2

X3

1

46,1

129

2

63,9

3

Medición Medición Medición

Promedio

1

2

3

0,26

454,4

454,2

454,0

454,2

129

0,26

350,6

352,0

347,4

350,0

46,1

331

0,26

396,6

395,4

398,8

396,9

4

63,9

331

0,26

347,0

346,6

346,6

346,7

5

46,1

129

0,74

403,2

405,4

404,8

404,5

6

63,9

129

0,74

337,6

339,6

336,8

338,0

7

46,1

331

0,74

383,0

380,4

380,8

381,4

8

63,9

331

0,74

337,0

335,0

334,0

335,3

9

55,0

230

0,50

387,4

390,2

388,8

388,8

10

55,0

230

0,50

383,0

384,6

382,4

383,3

11

55,0

230

0,50

395,6

394,6

392,8

394,3

12

55,0

230

0,50

390,2

391,0

390,2

390,5

13

55,0

230

0,50

397,2

397,4

396,0

396,9

14

55,0

230

0,50

385,8

384,2

388,0

386,0

109

BÚSQUEDA II O DE SEGUNDO ORDEN - 6 puntos axiales en los ejes coordenados

Fuerza de gel (g)

Concentración Tratamiento

Temperatura Tiempo

de ácido

(°C)

(min)

cítrico (%)

X1

X2

X3

9

40,0

230

10

70,0

11

Medición Medición Medición

Promedio

1

2

3

0,50

392,0

390,0

388,2

390,1

230

0,50

287,2

287,8

286,8

287,3

55,0

60

0,50

408,8

411,0

408,6

409,5

12

55,0

400

0,50

370,4

372,2

369,8

370,8

13

55,0

230

0,10

424,4

423,2

422,2

423,3

14

55,0

230

0,90

361,8

361,0

360,0

360,9

110

ANEXO 5 DETERMINACIÓN DEL RENDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA – MÉTODO DE BIURET BÚSQUEDA I O DE PRIMER ORDEN - 8 puntos factoriales (2k) y 6 repeticiones en el punto central

Curva de calibración para la determinación de la concentración de proteína en gelatinas Concentración de proteína

Absorbancia

(mg/mL) 0,00

0,000

1,00

0,082

2,50

0,203

5,00

0,397

7,50

0,587

8,25

0,651

9,50

0,737

10,00

0,780

Absorbancia

Curva de calibración de concentración de proteína 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000

y = 0.0777x + 0.0049 R² = 0.9998

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

Concentración de proteína (mg/mL)

111

10.00

RENDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA Concentración Volumen Rendimiento Concentración de proteína en final de de Tratamiento Absorbancia de proteína Promedio solución final solución extracción (mg/mL) (g/mL) (mL) (%) 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

0,426

5,42

0,05422

312

16,92

0,422

5,37

0,05371

312

16,76

0,480

6,12

0,06117

333

20,37

0,482

6,14

0,06143

333

20,46

0,458

5,83

0,05834

315

18,38

0,456

5,81

0,05808

315

18,30

0,498

6,35

0,06349

335

21,27

0,502

6,40

0,06401

335

21,44

0,437

5,56

0,05564

301

16,75

0,435

5,54

0,05538

301

16,67

0,479

6,10

0,06104

330

20,14

0,484

6,17

0,06169

330

20,36

0,430

5,47

0,05474

318

17,41

0,434

5,53

0,05525

318

17,57

0,494

6,30

0,06298

332

20,91

0,497

6,34

0,06336

332

21,04

0,510

6,50

0,06504

306

19,90

0,511

6,52

0,06517

306

19,94

0,503

6,41

0,06414

311

19,95

0,500

6,37

0,06375

311

19,83

0,502

6,40

0,06401

310

19,84

0,498

6,35

0,06349

310

19,68

0,509

6,49

0,06491

304

19,73

0,512

6,53

0,06529

304

19,85

0,514

6,56

0,06555

303

19,86

0,511

6,52

0,06517

303

19,75

0,510

6,50

0,06504

304

19,77

0,513

6,54

0,06542

304

19,89

112

16,84

20,41

18,34

21,36

16,71

20,25

17,49

20,97

19,92

19,89

19,76

19,79

19,80

19,83

BÚSQUEDA II O DE SEGUNDO ORDEN - 6 puntos axiales en los ejes coordenados

Curva de calibración para la determinación de la concentración de proteína en gelatinas Concentración de proteína

Absorbancia

(mg/mL) 0,00

0,000

1,00

0,076

2,50

0,191

5,00

0,386

7,50

0,575

8,25

0,632

9,50

0,729

10,00

0,766

Absorbancia

Curva de calibración de concentración de proteína 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000

y = 0.0767x + 3E-06 R² = 1

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

Concentración de proteína (mg/mL)

113

10.0

RENDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA Concentración Volumen Rendimiento Concentración de proteína en final de de Tratamiento Absorbancia de proteína Promedio solución final solución extracción (mg/mL) (g/mL) (mL) (%) 9

10

11

12

13

14

0,4000

5,22

0,05216

301

15,70

0,4020

5,24

0,05242

301

15,78

0,4530

5,91

0,05907

359

21,21

0,4590

5,99

0,05985

359

21,49

0,4750

6,19

0,06194

306

18,95

0,4720

6,15

0,06155

306

18,83

0,5010

6,53

0,06533

316

20,64

0,4970

6,48

0,06481

316

20,48

0,4770

6,22

0,06220

310

19,28

0,4690

6,12

0,06116

310

18,96

0,4630

6,04

0,06038

310

18,72

0,4600

6,00

0,05999

310

18,60

114

15,74

21,35

18,89

20,56

19,12

18,66

ANEXO 6

SOLUCIONES DE OPTIMIZACIÓN Y RESPUESTAS ESTIMADAS PARA LA OBTENCIÓN DE GELATINA DE PIEL DE PERICO SEGÚN VALORES DE DESEABILIDAD GLOBAL

Variables optimizadas Soluciones

Respuestas estimadas

Concentración

Fuerza

Rendimiento Deseabilidad de extracción global

de

Temperatura

Tiempo

de ácido

de gel

optimización

(°C)

(minutos)

cítrico (%)

(g)

(%)

X1

X2

X3

𝑦̂1

𝑦̂2

1

56,8

331

0,26

389,1

20,58

0,912

2

56,2

331

0,27

390,6

20,48

0,909

3

57,1

331

0,29

386,4

20,66

0,907

4

56,2

296

0,26

394,6

20,26

0,905

5

56,7

265

0,26

395,6

20,17

0,899

115

ANEXO 7

COMPOSICIÓN PROXIMAL Y PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LA GELATINA OBTENIDA DE PIEL DE PERICO

Componente (g/100 g)

Repetición Repetición Repetición

Promedio

Desviación

1

2

3

Humedad

6,91

6,73

6,72

6,8

0,11

Proteína total

88,28

88,34

88,35

88,3

0,04

Grasa cruda

0,11

0,16

0,18

0,2

0,04

Ceniza

0,97

0,98

0,97

1,0

0,01

Propiedades fisicoquímicas

Repetición Repetición Repetición

Promedio

estándar

Desviación

1

2

3

20,49

20,33

20,39

20,40

0,08

Fuerza de gel (g)

382,1

391,1

386,6

386,6

4,50

Viscosidad (cP)

11,0

11,0

11,1

11,01

0,06

Punto de fusión (°C)

25,5

25,7

25,7

25,6

0,12

Punto de gelificación (°C)

17,5

17,6

17,7

17,6

0,10

pH

4,9

4,9

4,9

4,9

0,01

Actividad de agua

0,27

0,25

0,26

0,26

0,01

Rendimiento de extracción de proteína (%)

116

estándar

ANEXO 8

PRODUCTO FINAL OBTENIDO

Gelatina de piel de perico en polvo

117