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Virología.

Año 2011

GENERALIDADES DE LOS VIRUS - ESTRUCTURA PROPIEDADES - TAXONOMÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA CULTIVOS CELULARES - HUEVOS EMBRIONADOS

Objetivos: Que el alumno conozca: -Las características generales de los virus, su estructura, la relación con las propiedades físico-químicas. -Los principales conceptos sobre taxonomía y clasificación viral. -Los conceptos básicos sobre la metodología de estudio de los virus (multiplicación viral) -La importancia de estos conceptos para su futuro desempeño profesional CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS Los virus pueden considerarse como un conjunto complejo de macromoléculas orgánicas (ácido nucleico y proteínas), ordenadas tridimensionalmente, que no pueden replicarse fuera de células vivas. Las primeras características diferenciales de los virus con otros agentes fueron: el tamaño estimado por su capacidad de atravesar filtros que retienen a las bacterias y su incapacidad para reproducirse en medios biológicos inertes (como lo son los medios para cultivos de bacterias), requiriendo de células para su propagación. Hoy en día se sabe que estas características no alcanzan para diferenciar a los virus de otros agentes biológicos, ya que existen bacterias cuyo tamaño puede ser similar al de los virus más grandes y que otros agentes como Chlamydias y Ricketsias también son parásitos intracelulares obligatorios. La organización y composición de las partículas virales ofrecen por sí características diferenciales importantes con otros agentes: •

Poseen un solo tipo de ácido nucleico: ADN ó ARN, cuyo tamaño es relativamente pequeño con respecto al de otros agentes biológicos.

•

Tienen una estructura simple y estática.

•

Su tamaño oscila entre 20 y 300 nm (1 nanómetro = 10-9 m)

•

No tienen sistema metabólico propio y para su replicación dependiendo de la maquinaria de la célula huésped (parásitos intracelulares estrictos).

Además de su estructura tan simple y particular, el modo de reproducción de los virus tal vez sea la característica que justifica que tengan un lugar propio en la escala biológica. A diferencia de los que sucede con las células, en el momento de su multiplicación, los virus no aumentan de tamaño para su posterior división binaria, por el contrario la partícula viral es desintegrada y luego se multiplica en cada uno de sus componentes (proteínas y ácido nucleico) para finalmente dar lugar a múltiples copias de partículas (progeie) similares a las originales, en el último paso del proceso de replicación denominado ensamblaje y maduración. Los virus (del latín: veneno) están ampliamente distribuidos en la naturaleza afectando 1

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a los organismos de los reinos animal y vegetal, protistas y hongos. Pueden infectar a células eucariotas (virus animales y vegetales) como así también a células procariotas (bacteriófagos). ESTRUCTURA VIRAL El ácido nucleico del genoma viral varía entre las diferentes familias virales. Puede ser ADN, ARN, de cadena simple o doble, lineal o circular y de sentido positivo (+) o negativo (-). El material genético está rodeado por una capa proteica denominada cápside que está constituida por copias de un número determinado de proteínas codificadas por el genoma viral que se ordenan en unidades denominadas capsómeros. El ordenamiento final de las proteínas de la cápside define la pertenencia a alguna de las siguientes simetrías: icosaédrica, helicoidal ó compleja. Algunas proteínas se asocian tan estrechamente al ácido nucleico que se denominan nucleoproteínas constituyendo la nucleocápside. Algunos virus (ej: adenovirus) pueden tener proyecciones (fibras) en la cápside, generalmente en los vértices del icosaedro. Rodeando a la cápside de algunos virus existe una membrana que proviene de la membrana celular modificada de la célula donde se replicó el virus y que se denomina envoltura (envelope). Esta membrana, que se puede originar en la membrana plasmática (ej.: virus de la influenza) ó nuclear (ej.: Herpesvirus), está formada por una bicapa lipídica y posee glicoproteínas (proteínas + hidratos de carbono) con características antigénicas propias del virus y en muchos casos forman parte de ciertas proyecciones denominadas espículas. Los virus envueltos, debido a la estructura lipo-glico-proteica son más sensibles a las condiciones ambientales y pH extremos y a los solventes orgánicos. Estructura de un virus con envoltura

capside acido nucleico

envoltura glicoproteína

NOMENCLATURA y TAXONOMIA VIRAL El nombre de los virus obedece a diferentes consideraciones. En algunos casos éste se debe a la enfermedad que ellos producen (ej.: el poliovirus que se llama así porque produce la poliomielitis), a palabras compuestas (ej.: Papovavirus que corresponde a la contracción de los nombres papiloma, polioma y vacuolizante), al nombre de los descubridores (virus de Epstein-Barr) o hacen referencia al tejido de donde fueron aislados (ej.: adenovirus aislado de adenoides humanas). También puede deberse a las características estructurales (ej.: coronavirus pues parte de su estructura se asemeja a 2

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una corona), al tamaño como el parvovirus (parvo: pequeño), o a una derivación del lugar donde se detectaron por primera vez (ej.: virus Sendai o el Norwalk, Hantavirus -del Río Hantann-). La Taxonomía viral se utiliza para la identificación, clasificación y agrupamiento sistemático de los virus en categorías que revelan mutua vinculación entre ellos mediante relaciones que a su vez indican el orden en que fueron apareciendo en la naturaleza. En 1973 se crea para ello el Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV) que agrupa a los virus teniendo en cuenta los siguientes criterios: 1. La naturaleza del genoma viral (ADN, ARN) 2. Número de cadenas del genoma viral (una cadena o dos cadenas) 3. Propiedad de realizar transcripción inversa 4. Polaridad del genoma viral (para los de una cadena que pueden ser positiva (+) o negativa (-) De esta forma se crean diferentes clases de virus, diversas familias y numerosos géneros El sistema utiliza una serie de taxones como se indica en negrita a continuación: Orden (-virales) Familia (-viridae) Subfamilia (-virinae) Género (-virus) Especie Ejemplo: Orden: Herpesvirales Familia: Herpesviridae Subfamilia: Alphaherpesvirinae Genero: Simplexvirus Especie: Human herpesvirus 1

Otro tipo de clasificación es la denominada CLASIFICACIÓN DE BALTIMORE basada en el modo de replicación de los genes y su expresión. Nos referiremos a ella mas adelante.

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MULTIPLICACION VIRAL Los virus son parásitos intracelulares obligados y pueden multiplicarse solamente en células vivas existiendo cierta especificidad para que un virus penetre a la célula huésped y multiplique. Esta especificidad de unión depende tanto de las propiedades de la cubierta del virión como de receptores específicos en la superficie celular como así también de la existencia de factores celulares necesarios para la replicación. Cuando se iniciaron los estudios experimentales y se desarrollaron los primeros métodos de diagnóstico de infecciones virales, debido a que no siempre era posible utilizar el huésped natural (hombre, animales, etc.) se recurrió a los animales de laboratorio (pequeños roedores) y huevos embrionados para multiplicar los virus. Tiempo después aparecieron los cultivos celulares. La multiplicación de un virus en un hospedador experimental suele presentar problemas de adaptación por lo que se deben realizar una serie de pasajes sucesivos denominados "pasajes ciegos" hasta que se observen los signos o lesiones características o propiedades de los mismos. Cultivos celulares El desarrollo de cultivo de células es una de las técnicas básicas del Laboratorio de Virología. Constituye el elemento fundamental para la multiplicación viral in vitro ya que ofrece células vivas rodeadas de un medio inanimado que provee el máximo de condiciones favorables para lograr la infección y multiplicación viral. La adaptación de un sistema celular a un medio que permita su crecimiento y mantenimiento ofrece muchas ventajas para estudiar la interacción virus-célula, como por ejemplo: 1- Acceso directo del virus a la célula huésped 2- Comportamiento previsible para la infección con determinados virus lo que hace que

puedan mantenerse con relativa facilidad en el laboratorio. 3- Permiten el estudio de alteraciones metabólicas o citopatogénicas 4- Están libres de interferencias tales como anticuerpos, hormonas, etc. Las condiciones óptimas de un cultivo varían con los diferentes tipos de células, lo cual exige el conocimiento del sistema para asegurar buenos resultados. Son muchas las variables a tener en cuenta y cada una de ellas merece particular atención según el tipo de cultivo que se realice y las células con que se trabaje: monocapa estática, monocapa en sistema roller, cultivos en suspensión, cultivos de alta densidad (microcarriers). Los factores más importantes son: 1)

Temperatura

2)

Composición del medio de cultivo

3)

pH

4)

Concentración de gases disueltos

5) Características del soporte inerte en el cual se propaga el

cultivo 6) Otros factores específicos. 4

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Cultivos celulares primarios: Es el primer cultivo de células a partir de un tejido (embrión de pollo, membrana corioalantoidea, dermis,

riñon,

pulmón, tumores).

Constituye una población mixta de células obtenida a partir de la dispersión del tejido original por acción digestora de una enzima (tripsina) asociada a una sustancia quelante (Acido Etilen Diamino Tetra-Acético-EDTA-). Cultivos celulares secundarios: Son los subcultivos de un cultivo primario. En la mayoría de los casos solo son posibles un número limitado de subcultivos.

Estas células

deben subcultivarse con un conteo inicial relativamente alto. Línea

celular:

Es

una

población

uniforme

de

células,

con

un

índice

de

multiplicación adecuado, derivadas de un cultivo celular primario que ha sido subcultivado durante un gran número de subpasajes (generalmente mas de 50 pasajes) y que a través de selección espontánea a lo largo de los pasajes o por clonación múltiple llegan a la unformidad. La “American Type Culture Collection" (ATCC) es el Banco de células de los Estados Unidos, que describe en publicaciones varias las características de una amplia variedad de líneas celulares, su disponibilidad para diversos fines y donde son provistas como as también las instrucciones para la preparación de los medios de culivo necesarios para su multiplicación, almacenamiento y congelamiento de las mismas ("Catálogo de líneas celulares e hibridomas de ATCC") Actualmente la ATCC posee líneas celulares de referencia, ya caracterizadas, derivadas de una amplia gama de especies, hibridomas, líneas obtenidas por ingeniería genética, etc. Todas están conservadas en nitrógeno líquido.

En

Argentina

existe,

cumpliendo

similares

tareas,

la

Asociación

Banco Argentino de Células (ABAC) que funciona en el "Instituto Viral de Enfermedades Humanas" (INEVH) de Pergamino y en el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Castelar. Diferentes tipos de células usadas en virología A: Cultivo primario de células fibroblásticas de mamífero. B: Línea celular de células fibroblásticas. C: Línea celular epitelioide.

Animales de experimentación El uso de animales receptivos fue el primer método utilizado para la multiplicación de los virus. En algunos casos también pueden emplearse para el diagnóstico si se induce y se considera una respuesta clínica positiva o negativa ante 5

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una infección experimental. Los animales de laboratorio más utilizados son: ratones, hámsters, cobayos, conejos, hurones, monos y embriones de pollos. Pequeño roedores de laboratorio: Las vías de inoculación a utilizarse dependen del virus estudiado y su posible histotropismo. La inoculación puede realizarse por vía subcutánea (SC), intramuscular (IM), endovenosa (EV), intracardíaca (ICa), intraperitoneal (IP), intranasal (IN) e intracerebral (ICe). Se dan casos especiales de inoculación intratesticular y por ej. escarificación de la córnea del conejo para el caso de demostración de virus variólico. Los animales deben estar perfectamente identificados. Los que mueren dentro de las primeras 24-48 horas pos-inoculación son descartados debido a que se consideran muertes inespecíficas producto de la inoculación o de la vía empleada. Los inoculados se observan diariamente para detectar la presencia de signos clínicos posibles; los que mueren deben ser necropsiados y al final de la experiencia los sobrevivientes deben ser sacrificados. En las necropsias se observará si existen lesiones, se recogerá material, en caso de que sea necesario, y finalmente los cadáveres se esterilizan en autoclave o se incineran en horno crematorio. Huevos embrionados: Los huevos utilizados para estudios virológicos deben ser obtenidos de aves en buen estado, sanas, libres de infecciones bacterianas o virales. Las principales razones que llevan a utilizar huevos embrionados en estudios virológicos son:

• Se pueden adquirir con facilidad • Son baratos • Poseen tamaño adecuado • No se forman anticuerpos contra el virus inyectado porque carecen de respuesta inmune El éxito de una infección en huevos embrionados puede manifestarse como: •

muerte del embrión.

•

alteraciones macro y/o micropatológicas.

•

formación de cuerpos de inclusión

•

presencia de depósitos de urea

•

hemorragias sobre las membranas

•

retraso del crecimiento embrionario

•

engrosamiento, edematización y fibrosis de las membranas

lesiones focales características (ej. virus de la viruela) En algunos casos pueden no producirse manifestaciones visibles y, en tal caso, el éxito •

de la infección se manifiesta por la demostración de antígenos específicos en los tejidos y en los líquidos. Algunos de los factores que influyen sobre la multiplicación del virus en el embrión de pollo son: •

Edad del embrión

•

Vía de inoculación

•

Dilución y volumen del inoculo 6

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•

Temperatura y humedad de incubación

•

Tiempo de incubación Antes de ser inoculados, los huevos deben ser incubados durante el tiempo óptimo

para que el embrión, las cavidades extraembrionarias y sus membranas posean el tamaño necesario según la vía de inoculación a emplear. La vía de inoculación a seleccionar dependerá de la afinidad del virus por el tipo de célula constituyente del embrión y sus membranas (origen endodérmico, mesodérmico, ectodérmico) y de acuerdo a la vía que se utilizará será la edad de los embriones a utilizar. Vías de inoculación Membrana coríoalantoidea: se utilizan embriones de 10-12 días. Cavidad alantoidea: se emplean embriones de 9-12 días. Cavidad amniótica: se pueden utilizar embriones de 7-15 días. Saco Vitelino: se emplean embriones de 5-8 días de incubación. Vía intracerebral: puede practicarse en embriones de 8-14 días. Vía endovenosa: de muy poca aplicación en virología. Se utilizan embriones de 10-15 días.

Cavidad amnióüca Casca ra

Membrana d« la cascara aéreo Inoculación amniótíca Inoculación en Inoculación alantoidea

Cavid ad

Membrana eorioalantotctea

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PATOGENIA DE LAS INFECCIONES VIRALES TOMA DE MUESTRA - AISLAMIENTO VIRAL Objetivos: Que el alumno conozca: - Los conceptos generales sobre patogenia viral - Los efectos de una infección viral sobre la célula huésped - Los conceptos básicos sobre la metodología de estudio de los virus: toma de muestras a partir de casos clínicos para el diagnóstico por aislamiento viral. GENERALIDADES SOBRE PATOGENIA DE LAS INFECCIONES VIRALES El término patogenia se refiere a los mecanismos de generación del daño o enfermedad, en este caso, producidos por una infección viral. La patogenia puede estudiarse a distintos niveles según se considere como huésped a la célula, al individuo o a la población. Los factores que intervienen en su desarrollo se pueden clasificar en tres grupos que interactúan entre sí: Factores dependientes del virus: Son los inherentes a la estructura viral. Se conoce que sólo cierto tipo de virus pueden infectar células del aparato respiratorio y por lo tanto originar enfermedades como bronconeumonía y otros el sistema nervioso central (SNC) y producir encefalitis. Incluso, dentro de ellos, algunas cepas resultan más virulentas (Ej. adenovirus 3 y 7 causantes de enfermedades respiratorias). Factores dependientes del ambiente: Condiciones

medioambientales

como,

temperatura,

humedad,

salinidad,

pH,

ventilación, etc., pueden influir en la viabilidad del virus antes de llegar a la célula huésped y afectar su capacidad de infectar. La presencia de envoltura lipoproteica le confiere mayor labilidad a la partícula viral, por lo tanto los virus desnudos resisten mejor las condiciones ambientales adversas. Factores dependientes del huésped: Factores innatos como, raza, sexo, estado inmune, estado nutricional y otros, definen la resistencia o susceptibilidad ante los virus; a través de receptores celulares específicos y la capacidad de montar una respuesta inmune. Patogenia a nivel celular Los virus producen diversas alteraciones al infectar las células. Estas se conocen con

el nombre de efecto citopático o citopatogénico (ECP) y ocurren tanto en las células de los organismos vivos como en las células de cultivos in vitro. A menudo este ECP es tan característico que permite tener una idea aproximada del virus que lo produce; por lo tanto, esta propiedad es importante en el diagnóstico de laboratorio. Las alteraciones que producen los virus en las células infectadas van desde aquéllas que no conducen en forma inmediata a la muerte celular, a aquellas que destruyen la célula y que se denominan efectos citolíticos o lisis. Principales efectos citopáticos: 1.- Lisis celular. La destrucción celular se debe fundamentalmente a la detención de la síntesis de macromoléculas celulares, por algunas proteínas virales. Con posterioridad, durante la fase tardía del ciclo replicativo de ciertos virus, (ej: adenovirus, virus polio) la acumulación de grandes cantidades de proteínas capsulares puede

producir

la

inhibición

general

de

los

procesos

de

biosíntesis

de

macromoléculas, tanto virales como celulares, ocasionando la lisis y liberación de gran cantidad de viriones. 2.- Fusión celular. Ciertos virus codifican y poseen en su estructura, algunas proteínas que tienen la propiedad de fusionar membranas celulares. La presencia de estas proteínas en la superficie de las células infectadas o la presencia de partículas virales entre dos células vecinas permitirá la fusión celular, dando origen a células multinucleadas que reciben el nombre de células gigantes, policariocitos o sincicios. Los virus como el del sarampión, el respiratorio sincicial, el herpes simplex y algunos retrovirus, poseen este tipo de proteínas y son capaces de pasar de una célula a otra. 3.- Expresión de proteínas y antígenos. Durante la infección viral, en la célula, aparecen y desaparecen proteínas, tanto celulares como virales. En la infección por virus envueltos aparecen en la superficie de la célula infectada las proteínas de la envoltura viral. Por ejemplo, en la infección por virus influenza aparecen en la superficie de la célula infectada las hemaglutininas virales que puede unir glóbulos rojos produciendo un fenómeno de hemadsorción. También es posible detectar estas proteínas mediante el uso de anticuerpos específicos, considerando que son antígenos virales. 4.- Cambios morfológicos. Algunas proteínas virales y otras celulares, inducidas durante la infección, pueden actuar sobre el sistema del citoesqueleto celular. Su alteración origina que la célula se redondee, como ocurre con aquéllas infectadas por los herpesvirus y los adenovirus. Las células que poseen cilios, como las del tracto respiratorio, pierden su funcionalidad ciliar durante la infección por virus respiratorios. 5.- Cuerpos de inclusión. Son estructuras que aparecen durante la infección por determinados virus. En algunos casos podrían corresponder a sitios de agregación de

proteínas virales o viriones. También poseen la propiedad de teñirse con colorantes ácidos o básicos, presentan una localización intracitoplasmática y/o nuclear. 6.- Proliferación celular. Ciertos virus inducen la síntesis de ADN celular y determinan que las células infectadas proliferen antes de provocar su destrucción. Este hecho es fácilmente observable en las infecciones por virus papiloma, responsables de las verrugas. 7.- Alteraciones cromosómicas. Los virus pueden provocar cambios a nivel nuclear que conducen a la desintegración de la cromatina de las células infectadas, como ocurre en las infecciones por virus herpes simplex. En otros casos las alteraciones nucleares pueden ser tan sutiles que no se detectan sino por metodologías moleculares. 8.- Transformación celular. Ciertos virus DNA y los retrovirus pueden integrar el ADN viral sintetizado durante la replicación en el genoma celular, generando células transformadas que se comportan in vitro en forma semejante a las células cancerosas. Mecanismos de lesión El daño en las células infectadas afecta a los tejidos y órganos y constituye uno de los elementos esenciales y determinantes en la patogenia. Este daño se puede producir directamente por la acción de los virus, o bien indirectamente, por acción de otros mecanismos, en especial los del sistema inmune. El reconocimiento de alteraciones celulares, como expresión de antígenos en la superficie celular, permite a las células del sistema inmune (especialmente linfocitos T citotóxicos) y a los anticuerpos específicos, (actuando en conjunto con el complemento), destruir a las células infectadas por virus. Este mecanismo se ha denominado también de tipo inmunoalérgico. Otro mecanismo indirecto guarda relación con la activación de genes que controlan la llamada muerte celular programada o apoptosis. Patogenia a nivel del individuo Los factores que intervienen en la patogenia de las virosis a nivel del individuo son los que se describen a continuación: Fuentes de contagio: El origen de las enfermedades virales que afectan al hombre y los animales son generalmente otros humanos o animales infectados. Mecanismos de transmisión: Se clasifican en directos o indirectos según la forma de transmitirse desde la fuente de contagio al individuo susceptible de infectarse: A.- Directos: A1 con contacto físico. A2 sin contacto físico. A1 Aquellos que necesitan contacto físico entre los individuos para propagarse se favorecen por la presencia de lesiones en las barreras mecánicas, representadas por

la piel y las mucosas. Estas actúan como puerta de entrada y en general requieren de un contacto físico relativamente estrecho. Ej: verrugas causadas por virus papiloma. A2 Las enfermedades virales que no requieren contacto físico se contagian a través de las secreciones eliminadas por los individuos infectados, cuyo ejemplo más ilustrativo es el aerosol de partículas que se emiten al hablar, estornudar, etc. y que contienen virus. Este mecanismo es muy efectivo y es usado por la mayoría de los virus exantemáticos, respiratorios y otros para propagarse. B.- Indirectos: B1 a través de un vehículo. B2 a través de un vector: - mecánico. - biológico. El mecanismo indirecto implica la acción intermediaria de un elemento inerte (vehículo) o vivo (vector) en el contagio. El rol del agua y los alimentos como vehículo de transmisión de infecciones virales entéricas será eficiente en aquellos virus que estructuralmente estén condicionados para permanecer viables en el medio ambiente, como sucede con los enterovirus, rotavirus y otros. Los vectores pueden ser mecánicos, si el virus es transmitido en forma pasiva (ej.: moscas en infecciones entéricas, tábanidos en el virus de la anemia infecciosa equina), o biológicos, si el virus se multiplica y desarrolla un ciclo reproductivo en ellos (ej: virus de la Encefalitis del Nilo). Puerta de entrada: Lugar por donde los virus pueden ingresar al organismo a través de la infección de uno o varios tejidos. El hecho fundamental para que un órgano constituya una puerta de entrada de la infección es que las células de éstos tengan receptores para permitir la adsorción y penetración de determinados virus. Las puertas de entrada también representan barreras defensivas contra las infecciones virales, por ejemplo la mucosa respiratoria tiene cilios, secreciones, inmunoglobulinas y enzimas que dificultan la adsorción viral; el pH gástrico es una barrera para los virus que ingresan por vía digestiva.Para actuar como sitio de ingreso del virus estas barreras tienen que estar alteradas por ejemplo la piel que habitualmente requiere de una solución de continuidad para permitir el ingreso de un virus. Vías de diseminación: Dependiendo del modelo de infección viral, el virus puede permanecer en la puerta de entrada (infección local) permaneciendo en este sitio o a células vecinas o bien diseminarse a órganos distantes (sistémica) por diferentes vías. Las principales formas de diseminación son: a) Local. Ej. Bronconeumonía por virus respiratorio sincicial, verruga por virus papiloma. b) Sistémica: - sanguínea (a traves de células sanguíneas). Ej. Virus de la viruela - neural (por las terminaciones nerviosas). Ej. Virus de la rabia.

- vertical (de madre a hijo). Ej. Virus de la diarrea viral bovina En este último caso puede ocurrir por varios mecanismos: 1) vía sanguínea transplacentaria. Ej: virus rubéola; HIV, virus hepatitis B. 2) contigüidad a través del canal genital durante el parto. Ej. virus herpes simplex, HIV, virus papiloma. 3) Alimentación con leche materna. Ej. citomegalovirus, HIV. Órgano blanco. La infección viral debe alcanzar los órganos que tienen receptores para los virus infectantes, para poder replicar en sus células. Así, se originan las manifestaciones propias de la enfermedad. Este tropismo de los virus por ciertos tejidos fue utilizado para clasificarlos en: virus neurotrópicos (Ej. virus de la poliomielitis), virus dermatotrópicos (Ej. virus del sarampión), virus respiratorios (Ej. adenovirus), virus entéricos (Ej. Enterovirus), etc. Posteriormente se demostró que este tropismo no era exclusivo y que muchas veces el fenómeno más interesante no correspondía a su clasificación. Así, por ejemplo, la muerte por sarampión se debe generalmente a bronconeumonía; ya que el aparato respiratorio es uno de sus órganos blanco. La forma más habitual de presentación de una infección por virus polio es la asintomática, en que el virus sólo se replica en el aparato digestivo, sin alcanzar el SNC. Las infecciones por adenovirus pueden provocar muerte por compromiso generalizado de hígado, pulmón, encéfalo; etc. Y los enterovirus ECHO y Coxsackie frecuentemente provocan exantemas o meningoencefalitis. MODELOS DE INFECCION VIRAL A nivel del individuo, el destino final del contacto de un virus con un individuo estará determinado por la interacción de los factores antes mencionados, pudiendo evolucionar de distintas formas: Infección aguda: Infección limitada en el tiempo, donde el virus es eliminado del organismo y el huésped se recupera. Esta puede presentarse con o sin síntomas. Ej: resfrío común por rinovirus, laringitis por virus parainfluenza, diarrea por rotavirus. A veces puede seguir una evolución grave y producir la muerte. Infección persistente: Después de la infección inicial sintomática o no, el virus completo o su genoma se mantienen en el organismo por tiempo prolongado -meses, años o de por vida (con o sin manifestaciones clínicas). Según su condición o estado replicativo, la infección persistente puede ser: a.- Latente. El virus permanece oculto en el organismo por tiempos variables posterior a la infección inicial, pudiendo reactivarse una o más veces. Tanto la primoinfección como las reactivaciones pueden ser con o sin manifestaciones clínicas. Durante la latencia puede detectarse el ácido nucleico viral, pero el virus infectivo no es

demostrable. b.- Crónica. El virus infecta en forma clínica o inaparente, y permanece en multiplicación continua, con o sin integración al genoma celular. Esta replicación viral puede demorar años en producir manifestaciones clínicas. Ej. Hepatitis crónica por virus hepatitis B, rubéola congénita y HIV. c.- Lenta. La primoinfección generalmente es asintomática y el virus no es detectable. Años después, se manifiesta como un cuadro severo, progresivo, que en meses lleva a la muerte. Los ejemplos se encuentran en infecciones virales convencionales, como la panencefalitis esclerosante subaguda por el virus del sarampión y en otros denominados no convencionales, porque todavía no está bien determinada la naturaleza del agente (Ej. priones). Infección transformante: En este tipo de infección, el virus es capaz de infectar las células, pero no puede producir partículas virales en forma significativa que implique destrucción celular. Generalmente el genoma viral está presente en la célula (integrado) y sólo parte de sus genes se traducen en proteínas virales. Estas originan cambios en las propiedades celulares o transformación celular, a través de la interacción con genes y proteínas celulares, originando un tumor benigno o maligno. Ej: verruga por virus papiloma 2, carcinoma cérvico uterino por virus papiloma 16-18.

MODELOS DE REPLICACIÓN VIRAL CUANTIFICACIÓN VIRAL Objetivos: Que el alumno conozca: - Las características generales y las diferentes etapas del mecanismo de replicación viral - Los principales conceptos sobre la clasificación de Baltimore - Los métodos de cuantificación viral REPLICACION VIRAL Los virus son parásitos intracelulares obligados por cuanto carecen de organelas que les permitan una vida autótrofa. La cinética de replicación viral varía dependiendo del tipo de genoma que posea el virión. La replicación viral requiere de una interacción entre los distintos compartimentos celulares y las macromoléculas virales. Las proteínas virales son sintetizadas en los ribosomas libres en el citosol o asociados al retículo endoplásmico rugoso (RER) y son transportadas por sistemas de vesículas hacia los distintos componentes del aparato de Golgi como se observa en el siguiente esquema. La localización celular de las proteínas virales está sujeta a información presente en las mismas en el conjunto de los primeros aminoácidos sintetizados en el ribosoma y que constituye el código de direccionamiento de la proteína en un determinado espacio celular. Es por eso que algunos virus tienen replicación estrictamente citoplásmica, mientras que otros alcanzan el núcleo celular, todo dependiendo de la adaptación realizada entre los virus y las células que las hospedan.

Las proteínas que se dirigen al aparto de Golgi son modificadas mediante un proceso de “maduración” que requieren del sistema enzimático presente en los diferentes compartimientos del aparto de Golgi y la proteína así madura poseerá las funciones de proteína estructural o no estructural. Las glicoproteínas virales requieren de este sistema de transporte para garantizar su localización en la membrana celular, mientras que otras proteínas que constituyen las cápsides virales pueden realizar su proceso de síntesis y transporte en el sistema de citosol y dirigidos por el citoesqueleto celular.

La producción de partículas virales requiere que la célula sintetice ARNm y de esta manera se utiliza la maquinaria biosintética celular para la síntesis de proteínas virales. La célula eucariota sólo posee a nivel nuclear las enzimas necesarias para la producción de ARNm a partir de ADN de doble cadena, por esta razón en caso que el virus posea un genoma diferente al ADN de doble cadena debe aportar a la célula las enzimas necesarias para la síntesis de ARNm. Por convención se denominan cadenas genómicas (+) aquellas que se escriben en dirección 5’-3’ o en el caso de los ARN aquellos que se reconocen como ARNmensajeros. Las familias virales se organizan entonces y de acuerdo a la composición genómica en 7 grupos arbitrarios que se reconoce como la Clasificación de Baltimore que consiste en clasificar a los virus teniendo en cuenta el modo de replicación de los genes y su expresión. En ella el ARNm juega un papel central, de modo que los virus que constituyen un grupo siguen el mismo camino para la síntesis del ARNm. Todos los virus independientemente de cuál sea su genoma confluyen por diferentes mecanismos de transcripción en la producción a nivel intracelular con la

formación de ARNm para la síntesis final de proteínas virales. El tipo viral según la clasificación de Baltimore se asigna en números romanos: Grupo I: virus con genoma de tipo ADN de doble cadena (Adenoviridae, Herpesviridae, Papovaviridae, Poxviridae). Las familias Adenoviridae y Herpesviridae replican en el núcleo celular. La familia Poxviridae se replica en el citoplasma y posee sus propias enzimas para la replicación genómica. Grupo II: virus con genoma de tipo ADN de cadena única (Parvoviridae). La replicación de esta familia viral se realiza en el núcleo. Se sintetiza la cadena (-) de ADN que a su vez sirve de molde para la síntesis de genomas virales y para la síntesis de cadenas de ARNm. Grupo III: virus con genoma de tipo ARN de doble cadena (Reoviridae). El genoma de los miembros de esta familia viral es segmentado. Cada segmento se transcribe en forma independiente para producir un ARNm. Grupo IV: virus con genoma de tipo ARN de cadena única y sentido positivo (+) (Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Togaviridae). Grupo V: virus con genoma de tipo ARN de cadena única y sentido negativo (-) (Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae). Estos virus requieren de una ARN polimerasa ARN dependiente. Grupo VI: virus con genoma de tipo ARN de doble cadena, sentido (+) y ADN intermediario en su ciclo (Retroviridae). Son los únicos virus diploides en los que el ARN no codifica sino que sirve de molde para la transcripción inversa. Grupo VII: virus con genoma de tipo ADN con ARN intermediario (Hepadnaviridae). Como los retrovirus también hacen retrotranscripción pero a diferencia de ellos se lleva a cabo durante el proceso de maduración viral. Para una observación global y gráfica de este tipo de clasificación y, a modo de representación esquemática y como material complementario, se presentan en esta guía las siguientes

figuras

que representan

a cada uno de los grupos:

Para poder comprender

entonces la patogenia de la infección viral es

importante conocer cual es la secuencia de acontecimientos observados en el interior de la célula huésped. Si bien los pasos que se enumeran a continuación no son un esquema rígido y único en el interior de la célula infectada, sirven como organigrama para comprender como funcionan los virus y los mecanismos patogénicos. A pesar de las diferencias que existen en las estrategias de replicación, los

diferentes esquemas contienen los siguientes pasos básicos: 1. UNION, ANCLAJE o ADSORCIÓN: depende de la interacción física entre el virión y la superficie de la célula huésped. Esta interacción determina especificidad de especie. De un lado el virus aporta las proteínas de unión y por otro lado las células aportan los receptores de membrana. Este paso involucra el concepto de afinidad entre virión y célula, lo que nos explica porque los virus pueden ser selectivos de órgano o tejido (tropismo) y el porque hay agentes que causan infecciones localizadas

o

generalizadas. 2- PENETRACIÓN: se refiere a la introducción de la partícula viral dentro de la célula, la internalización de la nucleocápside por endocitosis o por fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática. 3- DECAPSIDACIÓN O DESNUDAMIENTO: el ácido nucleico se libera de la nucleocápside. En general participan enzimas de la célula huésped y es un prerrequisito para la expresión del genoma viral. 4. TRANSCRIPCION: se define transcripción como el proceso por el cual se transfiere la información genética de una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico a otra. Este paso requiere la formación de un ARNm a partir de una molécula de ADN o la formación de una cadena de ARN complementario en caso de virus con genoma en forma de ARN monocatenario de polaridad negativa. En los virus que poseen ARN (+) el genoma se comporta como un ARNm por lo tanto puede ser usado directamente para la síntesis de proteínas. En los virus con ARN (-) el material genético posee la secuencia de nucleótidos necesaria para la síntesis del ARN complementario el cual funcionará como mensajero. Este ARN (-) requiere de una ARN polimerasa ARN dependiente (transcriptasa) que es codificada por el virus. Para la producción de ARN mensajero o para la replicación genómica los virus poseen unas enzimas que se denominan ARN polimerasas ARN dependientes. Estas enzimas cumplen con funciones de replicación cuando la función es la de copiar el ARN viral para formar nuevos genomas. Cuando las enzimas producen ARNm se designa que tienen una función de transcripción. La mayoría de los virus ADN se multiplican en el núcleo y dependen de ARN polimerasas celulares ADN dependientes. 5- TRADUCCIÓN: El ARNm, tanto de virus ARN como ADN, es traducido y se sintetizan las proteínas. Se lleva a cabo en el citoplasma por los ribosomas celulares, dando lugar a la biosíntesis de proteínas virales. 7- REPLICACION : durante esta fase tiene lugar la síntesis de ARN o ADN viral que sigue el esquema de Watson y Crick de bases complementarias. En el caso de virus

con genoma de tipo ADN estos pueden utilizar durante esta fase las ADN polimerasas de la célula presente en el núcleo celular o poseer su propia ADN polimerasa. En el caso de virus cuyo genoma se encuentra en forma de ARN se utilizan replicasas que tienen como función la formación de ARN a partir de cadenas complementarias o intermediarios replicativos que sirven de molde o templado. 8- ENSAMBLAJE : durante esta fase hay organización de las macromoléculas virales (proteínas y ácidos nucleicos) tendientes a la formación de viriones maduros. En el caso de partículas virales con envoltura, la nucleocápside se organiza y ensambla por debajo de la unidad de membrana celular, donde se han localizado la glicoproteinas virales. En el caso de virus desnudos la cápside se ensambla alrededor del genoma viral.

9- LIBERACION: Durante esta fase ocurre la salida de los viriones infectantes. Hay dos procesos que pueden tener lugar, de un lado la citólisis y de otra parte los virus pueden ser liberados por un proceso de gemación; este último es un proceso de endocitosis inversa (exocitosis) que si no produce daño a la membrana celular puede conllevar a infecciones latentes. Debe recordarse además que en la fase inicial ocurre lo que se conoce como periodo de eclipse, el cual estaría dado in vitro como el lapso transcurrido entre la desaparición de los viriones en el medio circundante, la denudación, la liberación del genoma viral a nivel intracelular y la aparición de nuevos viriones. Otros definen lo que se conoce como periodo de latencia el cual estaría comprendido entre la captación de viriones infectantes hasta la aparición del primer nuevo virión en el medio circundante.

Los periodos de eclipse y latencia pueden hacerse iguales en el caso de los virus cubiertos que maduran tomando parte de la membrana celular.

La replicación viral es entonces un proceso complejo y variado que depende fundamentalmente del tipo de ácido nucleico y de la organización genética de cada virus en particular.

CUANTIFICACIÓN VIRAL

Para la identidad, actividad y/o potencia de una preparación viral deben utilizarse métodos de cuantificación adecuados y perfectamente estandarizados. Es importante que el profesional posea los conocimientos básicos sobre este tema ya que en su actividad se encontrara frecuentemente con inmunógenos contra enfermedades virales en los que se detalla cómo están elaborados y la cantidad de partículas virales que poseen, si las mismas están activas o inactivadas, etc. Las partículas virales pueden ser cuantificadas desde dos puntos de vista: a- constitución físico-química b- actividad biológica En el primer caso solo contabilizamos partículas sin determinar si son o no infecciosas. En el segundo caso cuantificamos infectividad. a) Cuantificación por propiedades físico-químicas Teniendo en cuenta su constitución físico-química podríamos utilizar por ej.: * Microscopía electrónica. * Propiedades hemaglutinantes (HA) * Presencia de enzimas específicas * Propiedades antigénicas (Fijación del complemento, precipitación) Microscopía electrónica La ME permite cuantificar las partículas virales presentes en una muestra. Se puede determinar el número de partículas virales por campo y conociendo el volumen en la grilla de muestra se puede calcular el título del virus en partículas virales por ml. Sin embargo se debe tener en cuenta que en este método solo contamos partículas virales sin poder determinar si las mismas son infecciosas o no.

Imagen de herpesvirus al Microscopio electrónico Hemoaglutinación Se denomina Hemoaglutinación (HA) a la capacidad que presentan ciertos virus de aglutinar los glóbulos rojos de distintas especies animales La capacidad de hemoaglutinación refleja el hecho de que algunos eritrocitos poseen receptores para ciertos componentes de la superficie de las partículas virales que funcionan como proteínas de adherencia a las células. En el caso de los Ortho y Paramixovirus estos componentes de la superficie de las partículas virales llamados hemoaglutininas son espículas glicoproteicas. Los Orthomixovirus poseen dos tipos de espículas, unas con actividad de hemaglutinina (HA) y otras con actividad de enzima neuraminidasa (NA). Los Paramixovirus poseen las dos actividades en una sola espícula. Los virus que poseen propiedades hemoaglutinantes son heterogéneos en cuanto a tamaño, afinidad de receptores, condiciones en que se produce la hemaglutinación y características del antígeno hemoaglutinante, pero el fenómeno de la HA es básicamente similar en todos los casos. Una hemoaglutinina se une simultáneamente a dos glóbulos rojos estableciéndose un puente entre ellos. Si el número de células excede al número de partículas virales, se forma un número pequeño de dímeros celulares que por lo general no es detectable, pero si la concentración vírica es bastante elevada se forman puentes múltiples que dan lugar a un enrejado de células aglutinadas que se depositan de una forma muy característica, perfectamente diferenciable del patrón de sedimentación que presentan las células noaglutinadas. La prueba de HA es una reacción físico-química y se utiliza para la titulación adecuada de una suspensión viral que aglutinará un número estandarizado de eritrocitos. La prueba de HA no es muy sensitiva ya que son necesarias

aproximadamente

106 partículas

virales

para la visualización

de 1 unidad

hemoaglutinante. Por ello, cuando dicha suspensión viral es titulada, la misma es diluida solo en base 2 (1:2, 1:4, etc.) Los anticuerpos producidos en respuesta a la infección por cierto tipo de virus que, como anteriormente se mencionó, presentan en su envoltura hemoaglutininas, las que actúan como potentes antígenos (Orthomixo, Paramixo y Togavirus) son inhibidores de la hemaglutinación y esta técnica se utiliza entonces para evaluar la capacidad de los anticuerpos para bloquear una infección viral específica. La reacción de HI es una verdadera reacción inmunológica

b) Cuantificación por propiedades biológicas Desde el punto de vista de su actividad biológica (infectividad), la titulación de un virus es un ensayo cuantitativo en el que se utilizan diluciones sucesivas de la suspensión viral (de un factor constante determinado) y se contabilizan el número de respuestas positivas

sobre el número total de respuestas posibles producidas en un sistema

hospedador determinado. La actividad biológica de un virus puede manifestarse por su acción sobre una sola célula o bien sobre varias células. Todos los métodos de cuantificación viral en los que se emplea infectividad como factor determinante

son de 105 - 107 veces más sensibles que los métodos

que se basan en las propiedades físico-químicas.

Existen dos sistemas fundamentales de determinación viral por medio de su actividad biológica o infectividad: Método de placa, pocks o tumor: Es un método enumerativo y se basa fundamentalmente en que se considera que una partícula viral infecciosa es capaz de producir un efecto observable, por lo tanto “un efecto observable = una partícula viral”. Se utilizan

monocapas celulares

mantenidas bajo una capa de medio

semisólido para impedir el pasaje de la progenie viral al sobrenadante lo que posibilitaría la aparición de nuevos focos (alejados del sitio inicial de infección) con el consiguiente error de los resultados.

Pueden utilizarse otros sustratos celulares

como el embrión de pollo (membrana corioalantoidea) donde es posible observar la presencia de “pocks”. Para el caso de virus tumorales se contabilizan los “focos neoplásicos” producidos en animales o en monocapas celulares. La actividad biológica del virus sobre la célula puede registrarse de varias formas como por ejemplo: A- Efecto citopatogénico (ECP) como la lisis celular: se detecta por colorantes específicos (azul tripán que tiñe células muertas o rojo neutro que tiñe células vivas) B- ECP como la formación de células multinucleadas (Tinción H-E) Si el número de efectos observables es elevado, se hace confluente y dificulta la observación, se deben realizar diluciones hasta lograr un N° adecuado que permita el conteo. Si el número de efectos observables en los sustratos infectados con diferentes diluciones de la misma mezcla viral son proporcionales a la concentración del virus, tendremos entre ambas (concentración de virus versus número de efectos) una relación lineal

Método de punto final 50%: Este tipo de análisis cuantitativo se basa en la estimación del número de respuestas positivas sobre el total de respuestas posibles, utilizando un cálculo estadístico que determina la cantidad de dosis infectantes contenidas en el inóculo. Las diluciones menores de virus contendrán más Dosis infectantes que las mayores y entre ellas habrá un gradiente de actividad. Se ha establecido determinar el 50 % de actividad y tomarla como

Dosis infectante 50 %. El método mas comúnmente

utilizado para la interpolación del Punto Final 50% es el Método de Reed y Muench. Se basa en la respuesta “todo o nada” es decir “positiva o negativa” sin que haya calificaciones intermedias. La respuesta o reacción producida en el hospedador debe ser típica de la infección producida por el virus de tal modo que permita su interpretación sin dificultad. El virus a estudiar se inocula en diluciones a su respectivo hospedador: ratas, ratones, embrión de pollo, cultivo celulares, etc. Entre los criterios a utilizar para la lectura tomamos por ej: * Muerte o alteraciones del animal ó embrión * Efecto citopático sobre cultivos celulares Los resultados deben expresarse de acuerdo al método utilizado y solo podrán ser reproducibles siempre que se use el mismo método y el mismo sistema, el que deberá ser referido en el resultado. Ej: Dosis letal ratón 50%; Dosis infecciosa pollo 50%, Dosis paralizante ratón 50%, Dosis letal embrión de pollo 50%, Dosis infectante cultivo de tejido 50%, etc.

RESUMEN: El punto final 50% en la titulación de una suspensión viral, es la dilución de virus que produce el 50% de efectos positivos. El título es la inversa de aquella dilución a la cual reaccionan, estadísticamente, la mitad de los sujetos infectados o unidades reveladoras. Figura 1: Modelo de titulación en microplaca. Lectura de presencia de ECP en celulas infectadas con 0, 1 ml de diluciones en base 10. Método de Reed y Muench -1 + + + + + +

A B C D E F G H

-2 + + + + + +

-3 + + + + + +

-4 + + + + + +

-5 + + + -

-6 -

-7 -

-8 -

9 -

10

11

12

Vemos que el punto final 50% del virus está en la dilución de 10 -5 (tres de seis reacciones positivas). La inversa de este valor = 105 DICT50 es el título de la suspensión vírica original que es equivalente a 100.000 partículas virales. En el caso de que el 50% de los efectos observables se encuentre entre una u otra dilución debe realizarse un cálculo estadístico conocido como Método de Reed y Muench .