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• Leonardo Cano

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INMUNOPEROXIDASA ELISA PCR

PRUEBA DE INMUNOPEROXIDASA Técnica de inmunotinción. Permite demostrar antígenos presentes en células o tejidos utilizando anticuerpos específicos. •Tinción de anticuerpos con peroxidasa introducido en 1968. •Primer método en usarse en tejidos •Usando enzimas marcadas en lugar de colorantes fluorescentes •Abrió la puerta al desarrollo de métodos modernos de IHC.

PRUEBA DE INMUNOPEROXIDASA Empleo de marcadores

Enzimas: Color a sustrato incoloro

Especificidad de la reacción Demostrar la unión a un anticuerpo específico. Ac. Se visualizan por reacción catalizada por la peroxidasa.

Ag

Inmunotinción Inmunohistoquímica Inmunocitoquímica

Biología molecular Diagnóstico clínico Investigaciones

Determinar en el cual las células o partes de células o de una proteína particular u otra macromolécula se encuentran.

PEROXIDASA Es una enzima que cataliza una reacción química y genera un producto coloreado. Formación de peróxido de hidrógeno, altamente oxidante.

ENZIMAS A EMPLEAR Color pardo: Peroxidasa, fosfatasa alcalina, sustratos diaminobenzidina. Color rojo: Diaminoetilcarbazol Color azul: nitroazul de tetrazolio ANTICUERPOS EMPLEADOS Originalmente POLICLONAL (de animales tales como caballos o conejos). MONOCLONAL (cultivo de tejidos) Proporciona una mayor especificidad de antígeno

•Tejido se fija sobre el vidrio. •Contacto con el sustrato antigénico. • Formación complejos Ag-Ac. •Adicionar antigamaglobulina humana marcada con P.

•Ac. Unido químicamente a la enzima peroxidasa.

•Reacción colorimética en presencia de un cromógeno y agua oxigenada. •Después de desarrollar la coloración es examinado por microscopía.

DETECCION DIRECTA El anticuerpo primario se puede marcar directamente con la enzima peroxidasa, que cataliza una reacción química para generar un producto coloreado

DETECCION INDIRECTA El anticuerpo primario es etiquetado con una molécula pequeña reconocida por una molécula de unión conjugada con peroxidasa de alta afinidad. Amplifica la señal.

ASPECTOS A TENER EN CUENTA Tinción óptima: •Dilución de anticuerpo •Productos químicos de tinción •Preparación y / o la fijación de las células / tejidos •Duración de la incubación con anticuerpos / reactivos de tinción. Necesario ajustar el ensayo. Alternativas a las manchas peroxidasa •Fosfatasa alcalina •Fluorocromos. •Partículas de oro coloidal – microscopía electrónica.

VENTAJAS Localización precisa de las reacciones. Tinción es permanente y estable. Presenta contraste de fácil visualización. Preservadas. DESVENTAJAS Exige estandarización exacta y controlada. Reactivos carcinogénicos, cuidados en la manipulación. Material a fijar fresco, congelado, preservado formalina.

Melanoma: Reconocimiento de Ag. De membrana intracelular específico de tumor.

Mieloma: Detección de antígeno específico de cel. B, alteradas.

Epitelio Alveolar. Presencia de virus en pulmón ovino. Epitelio infectado.

Tejido renal – Hembra trucha arco iris inoculado con p. salmonis

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FUNDAMENTO

Uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima CONJUGADOS INMUNOLOGICA

ENZIMATICA

Antígeno o anticuerpo - Marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígenoanticuerpo quedará inmovilizada

Revelada mediante la adición de un substrato Producirá un color observable a simple vista Cuantificable por uso de un espectrofotómetro o un colorímetro

TIPOS DE ELISA • Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sándwich (Doble (DAS) ƒ Heterólogo (HADAS) ) • Antígeno marcado: ELISA competitivo

TIPOS DE ELISA • Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sándwich (Doble (DAS) ƒ Heterólogo (HADAS) ) • Antígeno marcado: ELISA competitivo

ELISA Directo

• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA INDIRECTO

• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición del suero problema. Sus anticuerpos reaccionarán con los antígenos fijados al soporte . Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzimaque reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos . Lavado para eliminar los antianticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

•Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.

ELISA INDIRECTO

SANDWICH “DAS” (Double Antibody Sandwich). • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar.

• Adición de la muestra problema. El agente de diagnóstico (antígeno), reaccionará con los anticuerpos fijados al soporte.

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar con un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte. Son conjugados con una enzima que reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.

Sándwich “HADAS”. 1

2

3

Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior..

4

ELISA COMPETITIVO

• Fijación al soporte de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. • Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos. Paralelamente, añadir antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. (Se puede parar la reacció)

ELISA COMPETITIVO Lecturas de ambas pruebas análogas: el antígeno a estudio no corresponde a los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.

Lecturas Diferentes: El antígeno objeto de estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica, es proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra.

PCR Polymerase Chain Reaction

DEFINICIÓN La reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis Amplificación in vitro de secuencias especificas de ADN existentes en una muestra para producir millones de copias en horas

Reactivos 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP)

Dos primers (6-40 nucleótidos) Delimitan la zona de ADN a amplificar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2) : cofactor de polimerasa Buffer (ph adecuado para el funcionamiento de el ADN polimerasa).

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq) ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo

Equipos

Tipos de PCR PCR anidada • Producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada

• Altamente sensible y específica • No permite cuantificar la muestra

PCR con RT • Virus de genoma ARN • Enzima transcriptasa reversa (TR): ADNc a la cadena de ARN: molde para la reacción de PCR

qPCR: • Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original • Reducción tiempo análisis

PCR Múltiple • Se amplifica simultáneamente más de una secuencia. • 2 o más pares de primers en un mismo tubo + reactivos • Ventajas: información en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos

Resultados

Usos • Paleontología • Diagnóstico • Antropología • Genotipificar especies de cuadros• Ciencias forenses infecciosos • Infecciones virales (VIH, Hepatitis) • Enfermedades hereditarias