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Técnicas de Biología Molecular (preparado por E. Zacarias)

1. Introducción La Biología Molecular es “el estudio de la estructura, función y composición de las moléculas biológicamente importantes”. En esta disciplina estudiamos los procesos moleculares que se desarrollan en los seres vivos, principalmente las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo que incluye muchísimas relaciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la síntesis de proteínas, el metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un correcto funcionamiento de la célula. A partir de la década del 70, con el descubrimiento de las endonucleasas de restricción (enzimas que selectivamente y específicamente pueden cortar moléculas de ADN); la tecnología del ADN recombinante ha visto un crecimiento exponencial en su aplicación y sofisticación, produciendo herramientas cada vez más potentes para la manipulación del ADN. La clonación de genes es ahora tan simple y eficiente que se ha convertido en una técnica de laboratorio estándar. Las técnicas de Biología Molecular son todos aquellos métodos de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP-Restriction fragment lengh polimorfism), entre otras.

ADN Bacteriano El ADN de la mayoría de bacterias se encuentra en una única molécula circular, llamada cromosoma bacteriano. También contiene, frecuentemente, uno o varios plásmidos, que son moléculas de ADN pequeñas y circulares. Las bacterias pueden ganar plásmidos nuevos de otras bacterias (durante conjugación) o del medio ambiente. E. coli DH5-α es una cepa bacteriana manipulada en el laboratorio y es la más usada para aplicaciones de clonado. Son bacterias de crecimiento lento pero que se transforman con elevada eficiencia. Al igual que otras cepas comúnmente utilizadas para clonado molecular, E. coli DH5-α tiene muchas características que la hacen útil para los métodos que implican la presencia de DNA recombinante:

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Esta es una cepa no patógena. Desarrollada en el laboratorio para su uso en clonamientos, por lo tanto no existe en la naturaleza. Posee un único cromosoma circular de 4,686,137 nucleótidos. Contiene múltiples mutaciones que le permite trasformaciones altamente eficientes, como la mutación lacZ Delta M15 que le permite conseguir colonias blancas-azules. Otras mutaciones importantes: endA1 recA hsdR17 U169

Plásmidos Plásmidos son “vehículos de delivery”. También llamados VECTORES porque podemos introducir DNA foráneo dentro de la bacteria. En 1977, el laboratorio de Boyer reconoció la necesidad de tener un plásmido para clonamientos, uno compacto con sitios de restricción únicos para contener ADN foráneo, y que pueda expresar resistencia a algún antibiótico para revelar a las bacterias transformadas. Siendo así, desarrollaron el primer vector, pBR322, exclusivamente diseñado para propósitos de clonamiento. Este vector era pequeño (~4 Kb) y con dos genes de selección para antibióticos. Plásmido pUC19. Resistente a ampicilina, contiene el operon lacZ con un Sitio de múltiples clonamientos.

Sin embargo, vectores que se religan sin inserto de ADN, aún pueden tener resistencia a antibióticos, lo que involucraría tiempo en seleccionar las bacterias transformadas. Es por esto que Vieira y Messing crearon una serie de plásmidos pUC, los que contenían un sistema de operon para COLONIAS BLANCAS/AZULES. Este sistema contiene un sitio de clonamiento múltiple (MCS) dentro del gen LacZ´. Cuando las bacterias con plaqueadas en el medio correcto, LAS COLONIAS BLANCAS CONTENDRÁN LOS PLÁSMIDOS CON INSERTOS, mientras que las colonias azules no contendrán ningún inserto. Selección de bacterias blancas-azules con pUC19 transformadas en DH5-alpha.

Bacterias competentes En microbiología, genética, biología celular y biología molecular, “competente” es la habilidad de una célula de tomar DNA extracelular de su ambiente, en un proceso llamado TRANSFORMACIÓN. En el laboratorio inducimos esta “competencia” de las células, haciendo a las células TEMPORALMENTE PERMEABLES al DNA. Para preparar células competentes, podemos seguir diferentes protocolos, de acuerdo al tipo de transformación a realizar.

Transformación de bacterias Para poder utilizar los plásmidos en el proceso de clonamiento, primero se tienen que realizar las extracciones de ADN plasmídico de las bacterias hospederas. Existen muchos métodos para purificar plásmidos, pero todos ellos envuelven tres pasos importantes: EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA EN UN MEDIO DE CULTIVO, COSECHAR Y LISAR LA BACTERIA, Y FINALMENTE PURIFICAR EL PLÁSMIDO. Una vez obtenidos los plásmidos, podemos obtener el fragmento del ADN de interés denominado inserto (target ADN), el cual se va a unir al vector. Estos fragmentos son obtenidos mayormente por una reacción de digestión usando ENDONUCLEASAS. Las endonucleasas, también conocidas como enzimas de restricción, son enzimas que cortan al ADN en secuencias específicas dentro de la molécula (contrario a las exonucleasas, que digieren a las moléculas de ADN por sus extremos). Su función biológica consiste en reconocer y romper el ADN ajeno que puede penetrar en la célula (por ejemplo, ADN procedente de bacteriófagos). A continuación, el inserto y el vector son colocados dentro de una reacción de ligación, utilizando la enzima ADN LIGASA. Esta posee la capacidad de formar enlaces fosfodiéster en una cadena de ADN rota, pudiendo unir covalentemente ADNs de diferentes orígenes para formar moléculas híbridas. Finalmente, se introduce el ADN recombinante en una célula receptora. Un paso importante en el proceso de clonación es la identificación de aquel clon o clones que contienen el ADN recombinante. Para identificar estos transformantes se emplean varios métodos, principalmente métodos de hibridación, mapas de restricción, reacción en cadena de la polimerasa, etc.

2. OBJETIVOS     

Aprender los conceptos fundamentales utilizados en la Biología Molecular. Conocer la utilidad de los plásmidos y su uso en la formación de recombinantes. Conocer los pasos más importantes para realizar clonamientos en bacterias. Familiarizarse con las bases de la purificación de ácidos nucleicos Aprender la técnica de electroforesis para la separación de ácidos nucleicos

3. MATERIALES  

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Kit de extracción de ADN Fuente de ADN: Frutas suaves como la Banana, Frutilla, Mora, etc. Puntas de 1ml y 100ul Agarosa en polvo Botes para pesar agarosa Buffer TAE (Tris, Acetato, EDTA) a 1X Solución diluida de Bromuro de etidio (0.5ug/ml)

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Azul de corrida 6X Cámara de corrida, molde y peinetas para corrida de geles Fuente de poder para electroforesis Erlenmeyer de 150ml Tubos de base cónica Pipetas de 1ml y 100ul Probetas de 50ml Etanol frio al 95% Transiluminador UV

4. METODOS

Preparación de geles de Agarosa:        

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Pesar la cantidad necesaria de Agarosa para preparar geles de 0.8% y 1.0%. Añadir lo pesado a un Erlenmeyer de 150ml. Agregar la cantidad necesaria de buffer TAE 1X para preparar el gel (80 ml por cada gel). Colocar en una placa calefactora y dejar hasta fundir/disolver el agarosa. Observar detenidamente para evitar la pérdida de líquido por ebullición/derrame. Dejar enfriar al medio ambiente (TA=temperatura ambiente) hasta unos 60°C aproximadamente (soportable al tacto). Preparar el molde para el gel de agarosa, esto es, colocar la peineta y los jebes bordes del molde para evitar la dispersión del gel. Cuando el gel se haya enfriado lo suficiente (no mucho sino se va a solidificar en el Erlenmeyer), verter dentro del molde para gel, DESPACITO, poquito a poquito, de tal forma de no crear burbujas con el gel. Dejar solidificar al medio ambiente hasta obtener nuestro gel polimerizado.

Extracción de ADN:     

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Colocar 1 gr (1cm de banana) dentro de la bolsa con zipper. Añadir 25ml de la solución al 7.5% SDS/1.5% NaCl dentro de la bolsa. Agregar 1ml de solución al 0.5% pepsina dentro de la bolsa. Quitar el aire de la bolsa, lo más que se pueda sin perder líquido, y sellarla. Macerar completamente la muestra durante 5 minutos (usar los dedos). Cuanto más se mezcle la muestra con el detergente, mayor cantidad de ADN que se obtendrá. CUIDADO DE NO ROMPER LA BOLSA. Separadamente ir armando el filtro dentro de un tubo de base cónica. Una vez pasados los 5 minutos. Abrir la bolsa y colocar el líquido dentro del filtro, DESPACITO, poquito a poquito, hasta completar toda la muestra. Descartar el filtro. Añadir al tubo con la muestra, 2ml de Etanol frio al 95%. Tapar el tubo y mezclar gentilmente un par de veces, mientras observamos su contenido. Continuar mezclando si es necesario. Colocar parte del ADN en un tubo de micro centrífuga de 1.5ml y centrifugar por 10 minutos a 12,000rpm Descartar el líquido con cuidado de no dejar caer el ADN. Añadir 1ml de 75% de Etanol frio y lavar el ADN “pellet” agitando el tubo hasta soltar el ADN del tubo. Centrifugar 5 minutos a 12,000 rpm Descartar el líquido, y centrifugar nuevamente por unos segundos. Luego retirar el resto del líquido con una pipeta. Dejar secar al ambiente. Agregar 500ul de agua destilada y disolver el pellet dando pequeños golpes en el tubo.

Corrida de geles:    

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Colocar el gel ya solidificado dentro de la cubeta de corrida, para esto debemos retirar la peineta y la cinta de los geles. Colocar el buffer TAE 1X en las cámaras de corrida hasta cubrir totalmente el gel. En un tubo de centrifuga limpio, colocar 10 ul de ADN y 10 ul de azul de corrida 6X, mezclar suavemente con la pipeta. Colocar la pipeta en 20ul (el total de la muestra), luego aspirar toda la muestra y colocarla lentamente en los orificios del gel de agarosa, evitando que esta se difunda en el buffer de corrida. Tip! Colocar la punta de la pipeta dentro del orificio y verter el contenido con suma delicadeza Una vez de haber terminado de “cargar”/colocar nuestras muestras, colocar la tapa de la cámara de corrida y conectar los cables a la fuente de poder, teniendo cuidado de los polos. Colocar la fuente de poder para que emita 100V e iniciar la corrida presionando “Run” en la fuente de poder

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Dejar “correr” la electroforesis entre 15 - 30 minutos (hasta que la banda azul este a 2-3 cm del pocillo) Apagar la fuente de poder y retirar la tapa de la cámara Con mucho cuidado remover el gel del molde y transferirlo a una bandeja conteniendo la solución de bromuro de etidio (0.5 ug/ml). ¡Atención! manipular la solución de Bromuro de etidio con guantes Incubar el gel en la solución por 10 minutos Visualizar el ADN en el gel usando el transiluminador UV

5. BIBLIOGRAFIA 1. Sambrook J and Russell D. (2001) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Third Edition. 2. Campbell, Neil A. and Resse, Jane B: 2010. Biología. Editorial Pearson. 10th Edición. 3. https://www.sciencelearn.org.nz/resources/1900-bacterial-dna-the-role-ofplasmids 4. http://www.biologydiscussion.com/dna/recombinant-dna-technology/top-5applications-of-recombinant-dna-technology-in-medicine/11935 5. https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/foundations-ofmolecular-cloning-past-present-and-future