• Author / Uploaded
• Ines Quiles

Citation preview

PROCESAMIENTO TISULAR TECNICAS ESPECIALES (HISTOQUIMICA)

Dr. Mauricio Valbuena

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA Las Técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción química en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido. El objetivo de la histoquímica → poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con técnicas generales y por tanto es necesario realizar pasos previos para poner de manifiesto la molécula que queremos detectar.

Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos: - REACCIONES QUIMICAS - HISTOQUIMICA ENZIMATICA

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA (GLÚCIDOS → Glykos). “HIDRATOS DE CARBONO” Biomoléculas → Formados principalmente por ( C - H2 -O) → “Hidratos de carbono”

+

OH (Hidroxilo)

*Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o polialdehídos).

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA .

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA Tipos de Glúcidos. -Monosacáridos ( 1 sola molécula)

→ GLUCOSA

-Oligosacáridos ( 2-10 moléculas)

→ SACAROSA

-Polisacáridos (>10 moléculas)

→ SIMPLES : GLUCOGENO , ALMIDÓN → COMPLEJOS: MCPS , MCProt, MCLip.

HERETEROSIDOS ( Glúcidos + otra molécula)

→ Glucolípidos , glucoproteínas Nucleótidos ( ARN, ADN)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA .

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA

DISACARIDOS

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA -POLISACARIDOS (GLUCOGENO)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA DETECCIÓN DE GLÚCIDOS (HIDRATOS DE CARBONO) El fundamento de las coloraciones de los hidratos de carbono se basa en: - Oxidación producida sobre los Polisacáridos, que provocan aparición de funciones aldehídicas que van a recolorear la leucofucsina o el reactivo de Shiff.

- Dependiendo de la calidad de la oxidación : -

Reacción del PAS ( Ácido Peryodico-Schiff) Reacción de Casella ( Permanganato-Schiff) Reacción de Bauer ( Ácido crómico-Schiff)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA DETECCIÓN DE GLÚCIDOS ( HIDRATOS DE CARBONO) - Dependiendo de la calidad de la OXIDACIÓN: -

Reacción del PAS ( Ácido Peryodico-Schiff) : - PAS + → Color púrpura ( glucógeno, moco , coloide tiroideo, células basófilas de adenohipófisis, luz glandular)

-

Reacción de Bauer ( Ácido crómico-Schiff) -

-

Bauer + → Rojo púrpura

Reacción de Casella ( Permanganato-Schiff)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff) Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico (HIO4) para incrementar el número de grupos carbonilo (aldehído o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff. Fijación: Formalina al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin Solución de Ácido Periódico……………0.5 % p/v. Reactivo de Schiff: Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g. Agua destilada……………………... 200 ml.

Contratinción: Hematoxilina Harris modificada Expresión: Fucsia brillante→ Magenta *Agua sulfurosa→ Bisulfito sodico10% en solución HCl 10%

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA DETECCIÓN DE GLÚCIDOS El fundamento de las coloraciones de los hidratos de carbono se basa en: - Oxidación producida sobre los Polisacáridos, que provocan aparición de funciones aldehídicas que van a recolorear la leucofucsina o el reactivo de Shiff.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff) Compuestos PAS + • Polisacáridos simples: como el Glucógeno y la Celulosa. • Mucopolisacáridos Neutros • Mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio o bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y la hormona estimulante. • Glucoproteínas del suero • Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebrosidos.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA Controles de la técnica del PAS. Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy útiles las técnicas de bloqueo. 1. Técnica de bloqueo para aldehídos en general Se realiza tratando los grupos aldehído presentes en el tejido, tras la oxidación con ácido peryódico con una solución de ácido acético saturado con Dimedona (1-16 h. a 60 º C). Posteriormente se lava con agua destilada y se continúa con PAS normal. Únicamente se teñirá el material PAS +→ grupos aldehídos situados en posición 1,2 glicol (proceden de los glúcidos)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA Controles de la técnica del PAS. 2. Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol. Se basa en la negatividad de la reacción del PAS después de la acetilación de los grupos 1,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este proceso es total o parcialmente reversible por saponificación posterior mediante tratamiento con hidróxido potásico. El 2º problema en la técnica del PAS : tratar de diferenciar si los grupos aldehídos aparecidos tras la oxidación lo han hecho sobre grupos alcohólicos situados en posición 1,2 glicol o si los oxidados han sido grupos hidroxiaminos 1º o 2º (no presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS +.) Esta distinción pude realizarse mediante acetilación reversible y saponificación.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA …Controles de la técnica del PAS. 2. Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol. Acetilación: consiste en introducir un grupo acetilo en un compuesto orgánico (El anhídrido acético) con este reactivo se bloquean todos los grupos alcohólicos en general existentes en el tejido. → Enlace tipo ester Saponificación: Romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idóneas reaparece el grupo químico que existía antes de la acetilación. La acetilación es totalmente reversible tras saponificación para los grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol → (Realmente proceden de los glúcidos) Totalmente irreversible para los grupos hidroxiamino Secundarios Moderadamente reversible para los grupo hidroxiamino Primarios.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA POLISACARIDOS COMPLEJOS: (1. MUCOPOLISACARIDOS) - MPS NEUTROS: ( Galactosa + Acetil-glucosamina)+ Proteína → PAS + - Glucoproteínas y Mucoproteínas -

- MPS ÁCIDOS: Predomina el ácido urónico y pueden contener restos de sulfatos . Los mucopolisacáridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido periódico (ya que no aparecen los grupos carbonilos) → PAS – - Acido hialurónico (N-acetilglucosamina y ácido D-glucorónico) -

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MPS ÁCIDOS: Los mucopolisacáridos ácidos no tienen grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol sino grupos ácidos carboxilos o sulfatados. Se clasifican en:

1. Mucopolisacáridos ácidos no sulfatados (Carboximucopolisacáridos) • •

Carboximucopolisacáridos Epiteliales o Sialomucinas Carboximucopolisacáridos Conjuntivos

2. Mucopolisacáridos ácidos sulfatados (Sulfomucopolisacáridos • •

Mucopolisacáridos ácidos Sulfatados epiteliales Mucopolisacáridos ácidos Conjuntivos

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS. Son unos polisacáridos que no tienen grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol sino grupos ácidos carboxilos o sulfatados.

Las técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos a) Técnica del Azul Alcián: • pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacáridos ácidos sulfatados y los carboxílicos. • pH muy bajo cerca de 1, sólo se colorea los mucopolisacáridos sulfatados, los carboxílicos no se tiñen. • pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tinción y en este caso sólo se tiñen los mucopolisacáridos fuertemente sulfatados.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS. a) Técnica del Azul Alcián: Procedimiento Técnico: Fijación: formalina al 4%. Soluciones: Azul alcián a pH 2,5: Azul alcián (C.I. 74240)…………… 1 g. Ácido Acético 3%………………….. 100 ml.

Azul alcián a pH 1: Azul alcián…………………………. 1 g. HCl 0,1 N …………………………… 100 ml.

Azul alcián a pH 0,5 : Azul alcián …………………………. 1 g. HCl 0,5 N ………………………….. 100 ml.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS. a) Técnica del Azul Alcián: Modo de operar: • Desparafinar e hidratar. • Tratar con la solución deseada de azul alcián durante 30 min. • Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con agua (d) • Si se usó cualquiera de los otros dos, secar sólo con papel de filtro. • Contrastar si se desea con rojo nuclear. • Deshidratar, aclarar y montar.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

a) Técnica del Azul Alcián: Resultados: • Azul alcián a pH 2,5: mucopolisacáridos ácidos • Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos sulfatados. • Azul alcián a pH 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos fuertemente sulfatados.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

a) Técnica del Azul Alcián: Resultados:

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

b) Reacción Metacromática: Cambio de color cuando un colorante químicamente puro tiñe selectivamente una estructura tisular de color “diferente” al de la solución diluida de colorante.

Sustancias cromotropas: • Mucopolisacáridos ácidos • Ácidos nucleicos • Lípidos de carácter ácido • Partículas de sílice. .

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

b) Reacción Metacromática: La reacción metacromática presenta grandes variaciones ante las más pequeñas modificaciones del medio donde reproduce, por lo tanto la reacción metacromática es de difícil interpretación e incluso puede proporcionar resultados contradictorios

Factores de la Técnica Histológica que influyen sobre la metacromasia: 1. Fijación: • •

Tejido congelado o liofilizado (menores problemas de interpretación) MCPS ácidos fijar con : Alcohol, Bouin , Formalina → Evitar Agentes oxidantes

2. Colorantes: Mas utilizados •

Azul de Toluidina y Azur A

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

b) Reacción Metacromática: Factores de la Técnica Histológica que influyen sobre la metacromasia: 3. Disolventes y pH de disolución: • •

Disolvente: Agua destilada o Alcohol Etílico 30% pH de la disolución: 0,5 – 7.0 ( Caracterización de los MCPS)

4. Montaje de Preparaciones • •

Las características de los colorantes metacromáticos varían en función del disolvente utilizado. La DHT alcohólica modificara los resultados de la reacción( Inhibe metacromasia)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

b) Reacción Metacromática: Controles de Especificidad en la Reacción metacromática→ Se utilizan esencialmente para distinguir Sulfomucopolisacáridos Vs Carboximucopolisacáridos 1. Vacunación de pH: Realizar la coloración a pH de 3.5 ( valor al que la mayoría de los Carboximucopolisacáridos pierden su metacromasia y Sulfomucopolisacáridos la preservan). •

Se hacen 2 lotes ( 1º se tiñe a pH 4.5→ C-MCPS se pierden y 2º pH 3.5→ S-MCPS)

2. Metilación Reversible: • •

1º se Trata 1 grupo de cortes con OH Metílico y HCL → Bloqueo x metilación de grupos ácidos Metilación + Saponificación en otro lote → Reaparece metacromasia solo en C-MCPS

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

b) AZUL DE TOLUIDINA → Técnica de metacromasia que mas se hace Fijación: Alcohol, Bouin alcohólico, formalina-> evitarse los fijados con agentes oxidantes. Resultados: Elementos de carácter metacromático se van a ver de rojo a púrpura y el resto se va a ver azul. Los baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia→ realizar preparaciones testigo. • 1ª preparación se observa tras su paso por el agua acética antes de fijar con molibdato. Esto tiene por objeto evaluar el efecto metacromático inmediato en fase inestable. • 2ª preparación no se deshidrata y se monta en un medio acuoso para evitar el paso por alcohol etílico. • 3ª preparación se confecciona normalmente, es decir, deshidratando y montando por el método habitual. Comparando las 3 preparaciones se puede seguir la evolución del efecto metacromático y la influencia del procesamiento histológico realizado sobre ellas.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS, NEUTROS Y GLICOPROTEÍNAS. TÉCNICA DEL AZUL ALCIAN - PAS. Es la Técnica de diferenciación de carbohidratos mas empleada el practica habitual.

Procedimiento Técnico: • Fijación: formol al 4 %. • Soluciones: • • • •

Solución azul alcián a pH 2,5. Solución ácido periódico el 0,5 %. Reactivo de Schiff. Solución de ácido sulfuroso.

• Resultados: • Mucopolisacáridos ácidos → Azul • Mucopolisacáridos neutros y glucoproteínas → Rojo intenso

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)​​ son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.

• • • •

Forman parte de la estructura básica de los tejidos Desempeñan funciones metabólicas y reguladoras Son la base de la estructura del código genético (ADN) Base de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)​​ son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Un aminoácido una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH).

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS

Las proteínas→ (griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’)​​ son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. 2 aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el grupo amino de uno y el carboxilo del otro, liberándose una molécula de agua y formando un que se denomina enlace peptídico ( Formación de enlace covalente CO-NH)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS SE PUEDEN CLASIFICAR EN 3 GRUPOS - REACCIONES GENERALES → COLOREAR GLOBALMENTE LAS PROTEÍNAS PRESENTES EN UN TEJIDO, DETERMINANDOLAS COMO TAL. - REACCIONES DE GRUPO → NO CARACTERIZAN LA MOLÉCULA PROTEÍCA COMPLETA SINO UN CORTO NUMERO DE REACTIVOS PRESENTES EN DICHAS PROTEÍNAS -

TETRAZORREACCIÓN

- REACCIONES ESPECÍFICAS → GRUPOS QUÍMICOS PARTICULARES, PROPIOS DE DETERMINADOS AMINOÁCIDOS (PRESENTE / AUSENTE ) EN UNA DETERMINADA PROTEÍNA. (COMPOSICION EXACTA) -

SULFHIDRILO FENOL INDOL GUANIDIL

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA COLORACION DE PROTEÍNAS - REACCIONES DE GRUPO → NO CARACTERIZAN LA MOLÉCULA PROTEÍCA COMPLETA SINO UN CORTO NÚMERO DE REACTIVOS PRESENTES EN DICHAS PROTEÍNAS -

REACCION NIHIDRINA-SCHIFF : -

-

DESAMINACION OXIDATIVA DE CADENAS POLIPETÍDICAS POR LA NIHIDRINA LOS GRUPOS AMINO SON SUSTITUIDOS POR GRUPOS CARBONILO SE REALIZA LA DETERMINACION DE GRUPOS CARBONILO POR EL REACTIVO SE SCHIFF RESULTADOS → COLORACION ROJO PURPURA

MÉTODO DE LA TETRAZORREACCION: -

DETECCION DE PROTEINAS USANDO LA BENCIDINA TETRAZOADA A Ph 9.2 → UNIÓN SELECTIVA A PROTEINAS X MEDIO DE A.A DE CARÁCTER CÍCLICO ( PROLINA, TIROSINA…)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

Los Ácidos nucleicos son grandes polímeros formados por la repetición de monómeros denominados nucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster. Existen dos tipos básicos de ácidos nucleicos.: ADN y el ARN.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

Cada nucleótido es un ensamblado de tres componentes: 1. BASES NITROGENADAS • PURÍNICAS: Adenina (A) y la guanina(G). • PIRIMIDÍNICAS: Timina (T), la Citosina (C) y Uracilo (U)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

2. Pentosa (azúcar de cinco átomos de carbono) - Puede ser RIBOSA (RNA) o DESOXIRIBOSA (DNA).

- La diferencia es que el ARN sí posee un grupo OH en el segundo carbono.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS Cada nucleótido es un ensamblado de tres componentes:

3. Ácido fosfórico: de fórmula H3PO4. • Cada nucleótido puede contener 1 o varios

• (nucleótidos-monofosfato, como el AMP) • (nucleótidos-difosfato, como el ADP)

• **(nucleótidos-trifosfato, como el ATP) → Principal fuente de energía El trifosfato de adenosina (adenosine triphosphate, ATP) es un nucleótido fundamental en la obtención de energía celular. Está formado por una base nitrogenada (adenina) unida al carbono 1 de la ribosa, que en su carbono 5 tiene enlazados tres grupos fosfato.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

ARN → Qué función tiene? Las funciones del ARN pueden comprenderse mejor a través de la descripción de los diferentes tipos que existen. Entre los más conocidos están: • ARNm o ARN mensajero: Transmite la información codificante del ADN sirviendo de pauta a la síntesis de proteínas. • ARNt o ARN de Transferencia: Transporta aminoácidos para la síntesis de proteínas. • ARNr o ARN Ribosómico: localizado en los ribosomas y ayuda a leer los ARNm y catalizan la síntesis de proteínas.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS ARN → Es una Cadena simple formado por Ribosa + fosfato + bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y uracilo). • El ARN celular es lineal y monocatenario (de una sola cadena). Las bases púricas (adenina y guanina) pueden formar puentes de hidrógeno con las pirimidínicas (uracilo y citosina) según el esquema C=G y A=U

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS ADN → ¿Qué función tiene el ADN? Función más evidente→ Proveer la información genética que nos determina, el ADN tiene otras funciones, por ejemplo: • Replicación: La capacidad de hacer copias de sí mismo permite que la información genética se transfiera de una célula a las células hijas y de generación en generación. • Codificación: La codificación de las proteínas adecuadas para cada célula se realiza gracias a la información que provee el ADN. • Metabolismo celular: Intervienen en el control del metabolismo celular mediante la ayuda del ARN y mediante la síntesis de proteínas y hormonas. • Mutación: Nuestra evolución como especie está determinada por la función de mutación del ADN. También la diversidad biológica responde a esta capacidad.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES DE HIDRÓGENO Formación de un enlace de hidrógeno: Una de las bases debe presentar un "donador" de hidrógenos con un átomo de hidrógeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH) la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrógenos con un átomo cargado electronegativamente (C=O o N). complementariedad de las bases: Cada tipo de base en una hebra forma un enlace únicamente con un tipo de base en la otra hebra → A -T, y C - G.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES DE HIDRÓGENO los dos tipos de pares de bases forman un número diferente de enlaces de hidrógeno: A=T (dos puentes de hidrógeno) y C≡G (tres puentes de hidrógeno) → Estabilidad a la doble hélice.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA

ADN → DOBLE CADENA ENLAZADA POR PUENTES HIDRÓGENO

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS • En condiciones normales la molécula ADN se autorreplica y contiene la carga hereditaria del individuo. • ARN es responsable de la transmisión de la información nuclear al citoplasma.

• Los ácidos nucleicos + Proteínas básicas → nucleoproteínas La hidrolisis ácida → Separa el componente proteico y permite demostrar los ácidos nucleicos.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA PROCEDIMIENTOS PARA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS EXTRACCIÓN DE ADN - Hidrolisis ácida - Ácido perclórico 5% a 70⁰C x 20min + neutralización con carbonato sódico 1% x 5min y lavado en agua corriente x 5min. - Ácido tricloroacético 5% a 90⁰C x 15min y lavado en agua corriente x 5min. EXTRACCIÓN DE ARN - Hidrolisis en ácido perclórico 5% a 4⁰C durante 4 – 18 horas ( extracción selectiva) - Ribonucleasa al 0.01% a 37⁰C durante 1 hora

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS SE UTILIZAN PARA VISUALIZAR EL NÚCLEO → REACCION DE FEULGEN

SE REALIZA EN 2 FASES CONSECUTIVAS : 1. HIDROLISIS ÁCIDA DEL ADN ( HCL) → Romper la estructura del ADN por el sitio de unión de la pentosa a la base nitrogenada, para que reaparezca el grupo Carbonilo ( distancia 1 a 1.1nm) 2. DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILO→ Reactivo de Schiff

Resultados: ADN → Rojo purpura

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS 1. HIDROLISIS ÁCIDA DEL ADN ( HCL)

2. DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILO→ Reactivo de Schiff

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS REACCION DE FEULGEN Problemas Generales 1. Hidrólisis excesiva → HCl es muy fuerte si el tejido expuesto por tiempo prolongado se disgrega el ADN e impide su detección. ( Tiempo varia según fijador) Carnoy→ 8 min

Formalina → 8min

Zenker → 5min

Fleming→ 16min

2. Envejecimiento del Reactivo de Schiff → En condiciones normales es incoloro , la aparición de una tonalidad rosada (liberación de fucsina) → envejecimiento

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS REACCION DE FEULGEN Controles 1. Hidrolisis prolongada puede producir falsos - negativos 2. Falsos Positivos → No se someten a Hidrólisis las preparaciones control Importancia Carácter estequiométrico → (Cada molécula fijada de reactivo Schiff se corresponde con una porción constante y equivalente de molécula de ADN) Permite conocer la cantidad de ADN:

Célula Fase 0 → Rojo débil

Célula Fase de Replicación → Rojo intenso

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS QUE PERMITEN SEPARAR ADN DE OTRAS ESTRUCTURAS

REACCION DE FEULGEN

Resultados: ADN → Rojo purpura

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS PIGMENTO: Sustancias coloreadas que existen de forma natural , es decir tienen color por si mismo. • Se pueden realizar técnicas específicas para identificación de un determinado pigmento en un preparado histológico. TIPOS DE PIGMENTOS • ARTEFACTUAL • EXOGENOS • ENDOGENOS • Hemoglobinógenos • No Hemoglobinógenos

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TIPOS DE PIGMENTOS • ARTEFACTUAL: Aparecen como consecuencia de la aplicación generalmente incorrecta de determinadas técnicas histológicas y/o como efecto indeseable de las mismas. (Sobrefijación). • • • •

Pigmento formólico Depósitos de sales de mercurio Depósitos de Cromo Precipitados de plata

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TIPOS DE PIGMENTOS • EXOGENOS: Procedentes del medio ambiental , penetran al organismo y generan una coloración particular de los tejidos, que puede acompañar o no a una patología en los mismos. • • • • •

Pigmentación por humo de tabaco , polvo de carbon ( Pigmento Antracótico( Pigmentación por metales , sílice Pigmentación por ingesta de carotenos ( Coloración amarillenta de la piel) Agentes terapéuticos ( Sales de oro ) Tatuajes

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TIPOS DE PIGMENTOS • PIGMENTOS ENDÓGENOS: Sustancias coloreadas presentes en los tejidos y elaboradas por el propio organismo a partir del catabolismo, degradación o síntesis de diferentes elementos. HEMOGLOGINÓGENOS: Degradación y destrucción fisiológica o patológica de la molécula de hemoglobina:

-

Hemoglobina Hemosiderina Hemofucsina Hematoidina Bilirrubina

NO HEMOGLOGINÓGENOS: -

Melanina Lipofucsina Ceroide Cobre

• Problema es que la mayoría tiñen de igual color (pardo) → excepto la hemoglobina

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TIPOS DE PIGMENTOS • PIGMENTOS HEMOGLOBINÓGENOS HEMOGLOBINA : Es el que aparece con mayor frecuencia en tejidos normales • Principalmente en el interior de los hematíes • Soluble en Agua y se diluye fácilmente en Alcohol etílico • Patológico →Depósitos amarillo-dorados ( cilindros tubulares del riñon)

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS

1. Técnica histoquímica para determinación de hemoglobina ( Técnica de la bencidina) - Conocida también como Reacción de pseudo-peroxidasa - La Hb es capaz de liberar O2 a partir de agua oxigenada - Primero oxida a la bencidina incolora → venzo-purina de color verde - Sustituida por el método de la diaminobencidina - Resultados → Núcleos : Azules Hemoglobina y Eritrocitos: Verde

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS

2. Métodos HQ para la demostración del hierro y pigmentos que lo contienen. - Deposito Tisular de Hierro: a. Forma iónica o formando sales ferrosas / férricas • • •

Azul de Perls → Hierro férrico Azul de Turnbull → Hierro ferroso Tirman-Schmeltzer → ambos

b. Hierro ligado a proteínas (enmascarado): - No se puede visualizar directamente → proceso de Desenmascaramiento → Fe iónico - Ferritina / Transferrina

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS 2. Métodos HQ para la demostración del hierro y pigmentos que lo contienen. -HEMOSIDERINA: • Pigmento proteico color amarillo dorado o pardusco • Contiene hidróxido férrico (Fe***)→ Acúmulos o granulaciones en interior de Macrófagos. • Soluble en Ácidos incluso tras su fijación • Insoluble en álcalis , alcohol y agua • Puede colorearse x Azul de Perls

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS • TÉCNICA PARA DETECTAR IÓNES FÉRRICOS Técnica del Azul de Perls (Prusia) → Técnica de mayor importancia para detectar hierro Fundamento: Se basa en la propiedad del ferrocianuro potásico o prusiato amarillo para transformarse en presencia de hierro férrico en ferrocianuro férrico o azul de Prusia por acción del HCl. 1. Solución de Ferrocianuro potásico 10% 2. Acido Clorhídrico 2% 3. Solución Ferrocianuro potásico + HCl Fe Férrico incluido hemosiderina→Azul

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS • TÉCNICA PARA DETECTAR HIERRO FERROSO - Método del Azul de Turnbull → Escasa utilidad práctica Fundamento: Reacción que ocurre al poner en contacto el *Ferricianuro potásico K3[Fe+++(CN)6] y el Ácido Clorhídrico en presencia de Cloruro Ferroso existente en el tejido formándose ferricianuro ferroso (azul de turnbull) *Ferricianuro potásico, también conocido como Rojo de Prusia

- Método Tirmann-Smeltzer : Convertir (Fe+++) por acción del sulfato de amonio en (Fe++) , Luego realizar la técnica de Turnbull y colorear ambos iones. Expresión → Azul oscuro

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS • Métodos para detectar hierro ligado a proteínas. • Desenmascara hierro mediante el tratamiento de tejidos con ácido sulfúrico 4% en etanol de 96% (30min a 2 horas). • Hierro ligado a proteínas ( Ferritina y transferrina) pasa a Fe2+ o Fe3+ y luego se realiza procedimiento normal para hierro.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TÉCNICA PARA DETECCION DE HEMATOIDINA Y BILIRRUBINA • Hematoidina y bilirrubina son pigmentos difíciles de diferenciar pero fáciles de separar de los demás pigmentos. Hematoidina: Pigmento derivado de la descomposición de la Hb ( NO CONTIENE HIERRO) Color amarillo parduzco Bilirrubina: Producto de la desintegración de la hematoidina y Resultado final de la degradación de la Hb. Determinación Conjunta → Método de Gmelin Determinación específica de Bilirrubina → Método de Hall

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TÉCNICA PARA DETECCION DE HEMATOIDINA Y BILIRRUBINA

Determinación Conjunta → Método de Gmelin • Hacer reaccionar Hematoidina o la bilirrubina con ácido nítrico para producir otros pigmentos diferentes. • Continúan secuencia normal degradativa de pigmentos Hb → Bilicianina y biliverdina ( Color verde azulado característico) → Resultado final Rojo purpura

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TÉCNICA PARA DETECCION DE HEMATOIDINA Y BILIRRUBINA

• •

Determinación específica de Bilirrubina → Método de Hall Solución reactivo de Fouchet ( Ac. Tricloroacético 25%+Cloruro férrico 10%) Picrofucsina de Van Gieson

• Resultados: Bilirrubina → Verde Colágena → rojo Músculo, células epiteliales y eritrocitos → Amarillo

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS NO HEMOGLOBINOGENOS

•

Métodos para determinar Melanina Argentafinidad de Masson-Fontana:

•

Técnica de decoloración de la melanina: ( “blanqueamiento de melanina) •

Agentes oxidantes fuertes que decoloran la melanina • •

• •

Permanganato potásico, ácido perfórmico y agua oxigenada Resultados la decoloración del pigmento melánico

Métodos histoenzimáticos que determinan DOPA-oxidasa: Determinación de melanosomas o granulaciones citoplasmáticas de células que producen melanina. Métodos que emplean Fluorescencia: Células con granulaciones citoplasmáticas que contienen aminoácidos ( Fenilalanina, Triptófano) → autofluorescencia tras su tratamiento previo con paraformaldehído. •

Células argentafines, melanocitos, cromafines → Fluorescencia amarilla

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS NO HEMOGLOBINOGENOS

Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide Lipofucsina → Pigmento que sirve como marcador de desgaste (pardo-amarillo) que aparece en Células envejecidas del SNP, músculo , hígado, testículo y glándulas suprarrenales. 3 métodos de coloración carácter no específico 1. Técnica de lípidos ( sudan negro y azul de Nilo) 2. Técnica del PAS ( lipofucsina es PAS+ por contener restos de hidratos carbono) 3. Técnica de Schmorl→ Lipofucsina, melanina, pigmento biliar, argentafines y cromafines.

PROCESAMIENTO TISULAR Y CITOLÓGICO HISTOQUÍMICA MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y TINCIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS NO HEMOGLOBINOGENOS

Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide Pigmento Ceroide → Es una Lipofucsina en fase inicial - PAS , Sudan negro y azul de Nilo negativos - Autofluorescencia amarilla espontanea que se tiñe con Ziehl-Neelsen