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• BRAYAN BARRAZA MACIAS

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Capítulo 1. Bases celulares y moleculares de la fecundación SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 1.1. La maduración epididimaria. Bases moleculares y consecuencias. V. Flores SC 1.2. El istmo de la trompa como reservorio de espermatozoides “descapacitados”. La prevención o el retardo de la capacitación. V. Flores SC 1.3. El transporte de los espermatozoides. El papel de la movilidad propia del espermatozoide. V. Flores SC 1.4. La capacitación del espermatozoide y la reacción acrosómica. V. Flores SC 1.5. El papel de la redundancia de espermatozoides, de la reacción acrosómica y de la movilidad espermática. V. Flores SC 1.6. El contacto y reconocimiento entre las gametas. V. Flores SC 1.7. La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El

contacto espermatozoide ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular. V. Flores SC 1.8. La vía de señalización del IP3 en la activación del programa de la embriogénesis temprana. V. Flores SC 1.9. El bloqueo definitivo de la polispermia. La reacción cortical. V. Flores SC 1.10. El varicocele como principal causa de infertilidad masculina. M. Rapacioli SC 1.11. La enfermedad inflamatoria pélvica. M. Rapacioli SC 1.1. LA MADURACIÓN EPIDIDIMARIA. BASES MOLECULARES Y CONSECUENCIAS. V. Flores Los espermatozoides recién espermiados en los túbulos seminíferos, aun cuando están diferenciados desde el punto de vista ultraestructural, no poseen movilidad ni capacidad fecundante. Los espermatozoides extraídos de las vías espermáticas, luego de su paso por el epidídimo, sí poseen capacidad móvil y fecundante en tanto interactúen con moléculas del líquido tubárico. Estudios histoquímicos e inmunoquímicos muestran que en el epidídimo se modifica la organización química de superficie de los espermatozoides debido a que se le incorporan varias proteínas con diversas funciones. Por un lado le confieren capacidad de interactuar con moléculas del entorno del ovocito II, de sus cubiertas (corona radiata [radiante] y membrana pelúcida) y de la propia membrana plasmática del ovocito II. La posibilidad de realizar con éxito esta sucesión de interacciones confiere a los espermatozoides capacidad fecundante. Por ello, los cambios sufridos en el epidídimo se denominan genéricamente maduración epididimaria. Por otro lado, varias de las proteínas que se incorporan en el epidídimo mantienen a los espermatozoides estabilizados y en latencia. Estas proteínas son clásicamente denominadas factores descapacitantes, debido a que mantienen a los espermatozoides en un estado no apto para la fecundación o “descapacitado”. Dado que, en general se trata de proteínas con capacidad antigénica, también suelen ser designados genéricamente, desde otra perspectiva, como antígenos seminales.

El cuadro SC 1-1-1 incluye algunos de los cambios que clásicamente se consideran involucrados en la maduración epididimaria.

Los factores descapacitantes del líquido seminal son removidos de la superficie de los espermatozoides, en el tracto genital femenino, debido a interacciones con componentes de éste. Los espermatozoides entonces se capacitan y adquieren máxima capacidad fecundante (SC 1-4 La capacitación del espermatozoide y la reacción acrosómica). Dado que la maduración epididimaria posibilita la capacitación espermática, a la que siguen la reacción acrosómica y la hiperactivación de los espermatozoides, ha sido descrita como la adquisición de una batería de proteínas de superficie que programan al espermatozoide para las futuras interacciones con elementos del tracto genital femenino. Estas moléculas, a continuación, son estabilizadas por factores descapacitantes (Fig. SC 1-1-1). Una vez en la ampolla (sitio de encuentro de las gametas), en estado periovulatorio, los espermatozoides pierden sus factores descapacitantes e inician las interacciones que concluyen con la fecundación. El tracto genital femenino, especialmente el istmo tubárico, también contribuye a mantener a los espermatozoides descapacitados hasta el momento de la ovulación (SC 1-2 El istmo de la trompa como reservorio de espermatozoides “descapacitados”. La prevención o el retardo de la capacitación). La capacidad fecundante adquirida con la capacitación, sin embargo, es transitoria y se pierde en pocas horas. Este fenómeno suele denominarse envejecimiento del espermatozoide.

Fig. SC 1-1-1. Modificaciones de la cubierta superficial del espermatozoide a su paso por el epidídimo. A. Los espermatozoides de la cabeza carecen de las proteínas superficiales que son secretadas por el epidídimo. B. En la cola se agregan moléculas (∙) que a continuación son estabilizadas por factores descapacitantes (∩). Los cambios sufridos en el epidídimo no sólo involucran la superficie de la cabeza del espermatozoide. También se producen cambios en algunas proteínas del flagelo involucradas en la movilidad espermática, como por ejemplo la proteína motor dineína. Con la maduración epididimaria, algunas proteínas del flagelo contribuyen a estabilizar la estructura de los microtúbulos que servirán a la movilidad espermática. El aporte de energía para la movilidad proviene de las mitocondrias concentradas en la vaina del flagelo. Al parecer, durante la maduración también las mitocondrias también sufren cambios que modifican su capacidad de generar ATP.

Bibliografía Jones R, James PS, Oxley D, Coadwell J, Suzuki-Toyota F, Howes EA. (2008). The equatorial subsegment in mammalian spermatozoa is enriched in tyrosine phosphorylated proteins. Biol Reprod. 79(3):421-31. Marengo SR. (2008) Maturing the sperm: unique mechanisms for modifying integral proteins in the sperm plasma membrane. Anim Reprod Sci. 105(1-2):52-63.

Suzuki F, Nagano T. (1980). Epididymal maturation of rat spermatozoa studied by thin sectioning and freeze-fracture. Biol Reprod. 22(5):1219-31. SC 1.2. EL ISTMO DE LA TROMPA COMO RESERVORIO DE ESPERMATOZOIDES “DESCAPACITADOS”. LA PREVENCIÓN O EL RETARDO DE LA CAPACITACIÓN. V. Flores En la especie humana casi todos los embarazos resultan de coitos practicados en un lapso que va desde unos 6 días antes de la ovulación hasta que ésta ocurre. Esto significa que los espermatozoides pueden permanecer en el oviducto durante 6 días sin perder capacidad fecundante, vale decir, sin sufrir la reacción acrosómica, sin hiperactivarse, ni envejecer. El concepto de “oviducto como reservorio” de espermatozoides no se refiere sólo a que los espermatozoides se hallan contenidos en el oviducto durante su transporte, o que eventualmente pueden detenerse transitoriamente en él. El concepto alude a que el oviducto en período no ovulatorio posee una fisiología tal que, al igual que los conductos deferentes del tracto genital masculino, permite mantener a los espermatozoides en latencia, es decir, en un estado “descapacitado” hasta el momento de la ovulación. Existen varios hechos, de diversa naturaleza, que están incluidos en el concepto de “oviducto como reservorio” de espermatozoides: a) En el nivel morfológico, se considera que las características microanatómicas de los pliegues de la mucosa oviductal contribuyen a retener espermatozoides. La mucosa presenta pliegues de trayectos anfractuosos y de diversa jerarquía (los pliegues amplios y profundos se ramifican en pliegues más delgados y, naturalmente, de menor profundidad figura SC 1-2-1 A. Por otro lado los pliegues recorren sólo un cierto trayecto a lo largo de la mucosa y se interrumpen en fondos de saco ciego, como si el surco o cauce de un río se detuviera abruptamente en un extremo cerrado o en un foso. Todas estas anfractuosidades contribuyen a que los espermatozoides que se introducen en ellas queden retenidos transitoriamente. b) La vasculatura de la mucosa oviductal posee características histológicas similares a la que exhiben los órganos eréctiles. Por ello, se plantea que la ingurgitación de dichas redes vasculares podría generar un estado eréctil de los pliegues de la mucosa, con la consiguiente disminución de la luz y colapso de los espacios interpliegues. Se propone que este hecho puede contribuir a un “atropamiento” e inmovilización de espermatozoides entre pliegues adyacentes ingurgitados. c, d) Por otro lado, habría conexiones funcionales entre la vasculatura ovárica y la oviductal de modo que señales generadas en el ovario podrían actuar en la mucosa oviductal promoviendo cambios en su patrón de secreciones que convierten los fluidos tubáricos, durante período no ovulatorio, en un medio apropiado para el mantenimiento descapacitado de los espermatozoides. En el nivel celular, el mecanismo circulatorio descrito contribuiría también, en sinergia con los cambios producidos por los niveles hormonales, a modificar las características moleculares del glucocáliz de la membrana apical de las células del epitelio oviductal en período no ovulatorio. e) En el nivel molecular, los cambios del glucocáliz se refieren específicamente a una modificación en la composición de residuos azúcares de las glucoproteínas y polisacáridos que integran el glucocáliz. La interacción de estos grupos azúcares con proteínas símil-lectinas de la cubierta glucoproteica de la superficie del espermatozoide contribuye a dos hechos: 1) mantener a los espermatozoides en un estado descapacitado (de modo similar a como lo hacen los factores descapacitantes de los fluidos seminales) y 2) mantener a los espermatozoides anclados al epitelio oviductal.

Existen experimentos que indican que el estado “descapacitado” de los espermatozoides, antes de ingresar en la ampolla, es mantenido por interacciones con células del epitelio del istmo al cual los espermatozoides se adhieren (Fig. SC 1-2-1 B y 1-2-2 B). Estos experimentos muestran que la unión de los espermatozoides al epitelio depende de ciertos grupos azúcares pertenecientes a glucoproteínas de la superficie apical de las células epiteliales. En cultivos de bloques de mucosa ístmica y ampular del oviducto, de período no ovulatorio o estrogénico, con una suspensión de espermatozoides, se constata que los espermatozoides se unen específicamente a la mucosa. La figura SC 1-2-2 A (izquierda) muestra que, si a dicho medio de cultivo se agregan diferentes azúcares de modo que se unan a la superficie de los espermatozoides, éstos mantienen su capacidad de unión a la mucosa oviductal, salvo cuando se utiliza fucoidan (una mezcla de fucosa y fucosa-sulfato). Este hecho sugiere que la fucosa, integrante normal del glucocáliz, cumple un papel en la función de reservorio. El resultado descrito ocurre tanto en la mucosa del istmo como de la ampolla del oviducto. La figura SC 1-2-2 A (centro) muestra que el efecto descrito es dependiente de la dosis de fucoidan que se utiliza en el ensayo. Finalmente, la figura SC 1-2-2 A (derecha) corrobora el concepto ya que la eliminación de la mucosa del glucocáliz, por medio del tratamiento de la mucosa con fucosidasa (una enzima que elimina mucosa del glucocáliz), reduce significativamente la adhesión de los espermatozoides a la mucosa. La figura SC 1-2-2 B muestra esquemáticamente la idea de que la función de reservorio está mediada por interacciones entre proteínas símil-lectinas, de la cubierta glucoproteica de la superficie del espermatozoide, y grupos azúcar del glucocáliz de las células epiteliales. El esquema incluye el dato, aportado por la microscopia electrónica de barrido, de que, generalmente, los espermatozoides unidos a la mucosa se hallan “abrazados” por las cilias, como si éstas estuvieran inmóviles y rodeando a los espermatozoides. El esquema propone que tal interacción se pierde durante la capacitación y que el espermatozoide se suelta del epitelio. Ello inicia la etapa final, que conduce a la fecundación o al envejecimiento del espermatozoide.

Fig. SC 1-2-1. A. Corte transversal de la mucosa oviductal; se ilustran los pliegues de diversas jerarquía. B. La figura muestra un espermatozoide detenido en la trompa uterina

por medio de interacciones con el epitelio tubárico. Puede observarse que el espermatozoide se halla en buenas condiciones y el acrosoma se encuentra intacto. El esquema incluye el dato, aportado por la microscopia electrónica de barrido, de que, generalmente, los espermatozoides unidos a la mucosa se hallan “abrazados” por las cilias. Como si éstas estuvieran inmóviles y rodeando a los espermatozoides.

Fig. SC 1-2-2. A. Resultados de la interacción de espermatozoides con cultivos de bloques de mucosa oviductal (ístmica y ampular). Izquierda: si al medio se agregan azúcares que se unen a la superficie de los espermatozoides, sólo una mezcla de fucosa y fucosa-sulfato (fucoidan) interfiere con la unión al glucocáliz del epitelio oviductal sugiriendo que la mucosa cumple un papel en la función de reservorio. Centro: muestra que la unión es dependiente de la dosis de fucoidan agregado al medio. Derecha: el tratamiento de la mucosa con fucosidasa (una enzima que elimina fucosa del glucocáliz) reduce la adhesión de los espermatozoides a la mucosa. B. La función de reservorio está mediada por interacciones entre proteínas símil-lectinas,de la cubierta glucoproteica de la superficie del

espermatozoide, y grupos azúcar del glucocáliz de las células epiteliales. El esquema propone que tal interacción se pierde durante la capacitación y que el espermatozoide se suelta del epitelio. Ello inicia la etapa final, que conduce a la fecundación o al envejecimiento del espermatozoide. Se ha planteado que el mantenimiento de los espermatozoides dentro de las trompas cumple una función durante la fecundación: a) por un lado explicaría la escasa cantidad de espermatozoides que se hallan en el sitio de encuentro pero durante un lapso de tiempo prolongado en las cercanías del ovocito II; b) este hecho podría contribuir a disminuir la probabilidad de polispermia restringiendo el número de espermatozoides que llegan por unidad de tiempo. Esta hipótesis ha sido validada por medio de experimentos de extirpación quirúrgica del istmo. En varias especies, este procedimiento aumenta la tasa de polispermia. c) la consecuencia más importante sería aumentar la probabilidad de que, en el momento de la ovulación, existan espermatozoides fecundantes aun cuando el coito haya precedido en días a la fecundación. Probablemente la adhesión al epitelio del istmo tubárico se pierda cuando se produce la ovulación. Todos estos datos indican que la capacidad fecundante o capacitación se adquiere principalmente en la ampolla (sitio de encuentro), en el momento de la ovulación y que tal capacidad es transitoria pues le sigue el envejecimiento. También existen estudios realizados en seres humanos que indican que el cuello uterino también puede almacenar espermatozoides. Allí los espermatozoides pueden mantenerse descapacitados, durante varios días, en las criptas de las glándulas del cuello uterino y en sucesivas oleadas son llevados hacia el sitio de encuentro.

Bibliografía Lefebvre R, Lo MC, Suarez SS. (1997). Bovine sperm binding to oviductal epithelium involves fucose recognition. Biol Reprod. 56:1198-204. Smith TT. (1998). The modulation of sperm function by the oviductal epithelium. Biol Reprod. 58(5):1102-4. Suarez SS. (1998). The oviductal sperm reservoir in mammals: mechanisms of formation. Biol Reprod. 58(5):1105-7. Wilcox AJ, Weinberg CR, Baird DD. (1995). Timing of sexual intercourse in relation to ovulation. Effects on the probability of conception, survival of the pregnancy, and sex of the baby.N Engl J Med. 333(23):1517-21. SC 1.3. EL TRANSPORTE DE LOS ESPERMATOZOIDES. EL PAPEL DE LA MOVILIDAD PROPIA DEL ESPERMATOZOIDE. V. Flores La movilidad espermática es un dato importante del espermograma. El déficit en la movilidad se asocia a infertilidad. Se suele concluir, en consecuencia, que los espermatozoides ascienden hasta el sitio de encuentro gracias a su movilidad y que el déficit en la movilidad impide o dificulta el ascenso y el encuentro con el ovocito II. Esta conclusión probablemente sea errónea. El espermatozoide está programado para cumplir en plenitud su capacidad móvil en el momento del encuentro y no durante el ascenso hacia el sitio de encuentro (Fig. SC 1-3-1). Así, la movilidad propia del espermatozoide debe desempeñar un papel menor en el ascenso, en tanto que el tracto genital femenino desempeña un papel principal. Nótese que los espermatozoides empiezan a llegar al sitio de encuentro en sólo unos 30 minutos luego de depositados en la vagina. Mediciones sobre las velocidades máximas que desarrollan los espermatozoides y

estimaciones sobre la potencia de la fuerza propulsora del flagelo indican que los espermatozoides no podrían desplazarse a la velocidad que se requiere para recorrer tal distancia en sólo 30 minutos.

Fig. SC 1-3-1. A. Patrón de movilidad del espermatozoide en el eyaculado. B. Cambio en el patrón de movilidad del espermatozoide una vez que éste se encuentra en el sitio de encuentro. Tal cambio, al igual que la reacción acrosómica, es provocado por moléculas que se encuentran en el líquido folicular. Una vez en el sitio de encuentro, sin embargo, la movilidad propia desempeña un papel crucial pues es estimulada por el líquido folicular que también induce la reacción acrosómica. Los espermatozoides encuentran al ovocito II rodeado por la corona radiante (células foliculares unidas por una alta concentración de ácido hialurónico). El ácido hialurónico es degradado por enzimas acrosómicas, entre ellas la hialuronidasa. La velocidad de toda reacción enzimática depende, entre otros factores, de la energía cinética del medio. La hiperactivación de los espermatozoides contribuye a aumentar la energía cinética del medio, facilitar la degradación del ácido hialurónico, disminuir la cohesión de las células foliculares y a dispersarlas. Estos efectos facilitarían que los espermatozoides puedan atravesar la corona radiante y llegar al ovocito II.La hiperactivación también aumenta la energía cinética del espermatozoide y, en consecuencia, la probabilidad de colisión con la membrana pelúcida. No existen datos concluyentes sobre la existencia de un mecanismo quimiotáctico que direccione los espermatozoides hacia el ovocito II, aunque algunos resultados experimentales lo sugieren. Otro “momento” en el que la movilidad propia del espermatozoide es crucial ocurre durante la penetración de la membrana pelúcida. Éste también es un proceso de degradación enzimática (acrosina y neuraminidasa) incrementado por la frecuencia de colisión de la membrana acrosómica interna, que expone la cabeza del espermatozoide, contra sus sustratos de la membrana pelúcida. El aumento de la degradación sumado a la propulsión del flagelo posibilita la penetración de la membrana pelúcida y el contacto con el ovocito II. Es importante el dato experimental de que los espermatozoides que son incubados con líquidos foliculares de diferentes folículos no se comportan similarmente. Algunos líquidos foliculares son muy eficaces en producir hiperactivación y otros no. Es significativo el hecho de que, en el caso de los líquidos foliculares que estimulan

la hiperactivación, la fecundación se produce en un alto porcentaje y que, en el caso contrario, no se produce fecundación. Todos estos datos sugieren que la movilidad propia del espermatozoide y su déficit asociado a la infertilidad probablemente se deba principalmente al importante papel que la movilidad espermática adquiere en el sitio de encuentro.

Bibliografía Storey BT. (1995). Interactions between gametes leading to fertilization: the sperm's eye view. Reprod Fertil Dev. 7(4):927-42. Suarez SS, Ho HC. (2003). Hyperactivation of mammalian sperm. Cell Mol Biol (Noisy-legrand). 49(3):351-6. Suarez SS, Pacey AA. (2005). Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12(1):23-37. SC 1.4. LA CAPACITACIÓN DEL ESPERMATOZOIDE Y LA REACCIÓN ACROSÓMICA. V. Flores Varios estudios clásicos de fecundación in vitro mostraron que los espermatozoides recién eyaculados incubados con ovocitos II tardan un cierto tiempo en iniciar la fecundación. Los espermatozoides que han estado en contacto con fluidos tubáricos fecundan más rápido (Fig. SC 1-4-1).

Fig. SC 1-4-1. El grafico muestra que los espermatozoides extraídos del oviducto o los que son incubados en fluidos del oviducto fecundan más rápido que los recién eyaculados. Esta capacidad aumenta en función del tiempo de permanencia en el tracto genital femenino. Los espermatozoides en vías de capacitación, si son devueltos al líquido seminal se “descapacitan”; vale decir, pierden la capacidad adquirida en contacto con los fluidos del tracto genital femenino. Ello se debe a que el líquido seminal posee factores denominados “descapacitantes” que contribuyen a mantener en latencia a los espermatozoides (SC 1-1 La maduración epididimaria. Bases moleculares y consecuencias). La capacitación es el resultado de la pérdida de moléculas estabilizadoras y “descapacitantes” del líquido seminal que se adquirieron durante la maduración epididimaria (Fig. SC 1-4-2). Una vez iniciada la capacitación se inicia el envejecimiento de los espermatozoides y pierden capacidad fecundante en unas 12 horas.

Fig. SC 1-4-2. El esquema ilustra el probable comportamiento de algunas moléculas presentes en la cubierta de superficie del espermatozoide durante la capacitación. A. En los espermatozoides recién eyaculados, la moléculas de la superficie del espermatozoide (∙) que intervienen en la fecundación se hallan enmascaradas por moléculas descapacitantes (∩). Este hecho dificulta la fecundación. B. Después de cierto tiempo en contacto con fluidos tubáricos se desprenden los factores descapacitantes y quedan expuestos los que intervienen en la fecundación. C. Con el tiempo, los espermatozoides también van perdiendo las moléculas (∙) agregadas en la cola del epidídimo. Éstas se pierden desde el extremo del acrosoma hacia el polo opuesto. La letra R seguida de los signos – o + aluden a cómo las reacciones (R) de laboratorio realizadas para detección de moléculas (.) dan resultados negativos (-) o positivos (+) dependiendo del tiempo transcurrido dentro del tracto genital femenino en período ovulatorio (capacitante). Existen muchas dudas y discordancias en la literatura respecto de numerosos fenómenos moleculares involucrados en la capacitación y, al parecer, existen muchas diferencias dependientes de la especie. La capacitación conduce a la reacción acrosómica y la hiperactivación del espermatozoide, y en general se considera que se debe a la reversión de fenómenos que ocurrieron durante la maduración epididimaria, que los mantienen estabilizados en latencia, y al capacitarse adquieren rápida y sincrónicamente capacidad fecundante. El cuadro SC 1-4-1 muestra algunos datos clásicos sobre cambios involucrados en la capacitación.

Existen muchos datos, no siempre coherentes, acerca de los fenómenos moleculares involucrados en la producción de la reacción acrosómica. Mencionamos a continuación los más comunes: a) Algunas proteínas del fluido de la ampolla, entre ellas la albúmina, remueven colesterol de la membrana plasmática; ello aumenta su fluidez y facilita la fusión de membranas necesaria para la reacción acrosómica. b) Durante la capacitación se produce intercambio de iones con el medio. En algunas especies se eliminan iones K+ y la la membrana plasmática se hiperpolariza. A este fenómeno le sigue la entrada de Ca+2 y bicarbonatos que, por un lado, activa la producción de AMPc y, por otro, facilita la fusión de membranas necesaria para la reacción acrosómica. En algunas especies, la entrada de Ca+2 depende de la unión de polisacáridos del medio, que contienen fucosa, a un receptor del espermatozoide. Esta interacción permite la entrada de Ca+2. En mamíferos, la unión de estos receptores a sus ligandos produciría una despolarización de la membrana con la apertura de canales de Ca+2 dependientes de voltaje. La entrada de Ca+2 facilita la fusión de las membranas acrosómica externa y plasmática, la formación de poros y la consiguiente exocitosis del contenido. c) También es sabido que existen procesos de fosforilación de proteínas de la membrana que contribuyen a estos cambios. d) Otro hecho conocido es la eliminación de glucoproteínas “descapacitantes” de la superficie del espermatozoide, que enmascaran sitios de reconocimiento para la membrana pelúcida, Así, la capacitación también aumenta la probabilidad del primer contacto-reconocimiento entre el espermatozoide y la membrana pelúcida. Algunos de estos fenómenos son coherentes con el hecho de que la incubación de espermatozoides en medios de cultivo que contienen albúmina, Ca+2 y bicarbonato estimula la capacitación. El cultivo en presencia de líquido folicular del oviducto también estimula la capacitación. e) Para el caso de los espermatozoides que contactan con la membrana pelúcida sin haber sufrido la reacción acrosómica, ésta se desencadena por la interacción de la ZP3 de la membrana pelúcida con sus proteínas receptoras de la superficie del espermatozoide. Debido a esta interacción se abren canales de Ca+2. El aumento de este ión en el espermatozoide desencadena rápidamente la fusión entre la membrana plasmática y la membrana acrosómica interna y la producción de la reacción acrosómica. f) Se sabe en la actualidad que la capacitación y la reacción acrosómica consisten en una respuesta compleja del espermatozoide que implican múltiples modificaciones y que involucran a varias vías de señalización celular.

Bibliografía Austin CR. (1952). The capacitation of the mammalian sperm. Nature. 170(4321):326. Chang MC. (1951). Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168(4277):697-8. Salicioni AM, Platt MD, Wertheimer EV, Arcelay E, Allaire A, Sosnik J, Visconti PE. (2007). Signalling pathways involved in sperm capacitation.Soc Reprod Fertil Suppl. 65:245-59. Tulsiani DR, Zeng HT, Abou-Haila A. (2007). Biology of sperm capacitation: evidence for multiple signalling pathways. Soc Reprod Fertil Suppl. 63:257-72. SC 1.5. EL PAPEL DE LA REDUNDANCIA DE ESPERMATOZOIDES, DE LA REACCIÓN ACROSÓMICA Y DE LA MOVILIDAD ESPERMÁTICA. V. Flores El gran número de espermatozoides necesarios para la capacidad fecundante (SC 1-5 Utilidad del espermograma) resulta del hecho de que los espermatozoides, con excepción de la etapa de penetración del ovocito II, cumplen sus funciones cooperativamente, como población celular, y no aislada o independientemente. La mayor parte de los espermatozoides cumple sus funciones de modo que unos pocos tienen la posibilidad de penetrar la membrana pelúcida y, un número menor aún, tome contacto con el ovocito II. En consecuencia no desempeñan todos el mismo papel. El ovocito por otro lado se encuentra programado de modo que sólo uno consume la fecundación. Los espermatozoides constituyen una población heterogénea: no poseen el mismo grado de maduración, de movilidad, de estabilidad. Ni siquiera poseen similar vida media, algunos mueren en el tracto genital femenino mucho antes que otros. Sin embargo, como población, poseen cierto grado de maduración, de capacidad móvil y estabilidad que les permite realizar similares comportamientos, pero con diferente sentido biológico. En la especie humana, en el volumen eyaculado se hallan unos 300 millones de espermatozoides. Sin embargo, en el sitio de encuentro sólo se hallan, en forma permanente, unos 200 a 400 espermatozoides. Ello se debe a que aquellos que llegan más temprano cumplen sus funciones mientras están “de paso” por el sitio de encuentro. En efecto, los que llegan primero al sitio de encuentro, como consecuencia de a) la alta concentración del líquido folicular, b) se capacitan, c) sufren la reacción acrosómica (liberan enzimas), d) se hiperactivan, aumentan la energía cinética del medio, d) contribuyen a dispersar células de la corona radiante y convertirla en una capa laxa que pueda ser atravesada. Estos espermatozoides no poseen papel fecundante: realizan sus funciones lejos del ovocito II, no se fusionan con él, liberan grandes cantidades de enzimas denudantes (hialuronidasa), pierden capacidad fecundante (envejecen) y son llevados en su viaje ascendente hacia el peritoneo.

Fig. SC 1-5-1. El dibujo muestra el resultado experimental de sumergir el ovocito junto con la corona radiante en una solución con colorante (fondo negro). Nótese que el colorante no penetra entre las células foliculares salvo en la periferia. Ello se debe a la presencia de una densa matriz extracelular entre las células foliculares. Los espermatozoides deben degradar la mayor parte de dicha matriz extracelular y dejar zonas de membrana pelúcida expuestas (denudación) antes de que algún espermatozoide pueda realizar el contacto-reconocimiento con la membrana pelúcida. Existe una gran diferencia temporal entre los espermatozoides que llegan primero y los que llegan últimos. Los primeros en llegar al sitio de encuentro sufren la reacción acrosómica y se encargan de producir la denudación de la corona radiante y exponer la membrana pelúcida a los espermatozoides que llegan más tarde. Este

fenómeno requiere la participación de una gran cantidad de espermatozoides ya que el paso a través de la corona radiante y su desagregación requiere una cantidad abundante de enzimas acrosómicas. La corona radiante, pese a su aspecto histológico de células en apariencia laxamente distribuidas, posee una densa malla de proteínas de matriz extracelular que dificulta el acceso de moléculas del medioambiente a su intersticio (Fig. SC 1-5-1). Los últimos se han mantenido sin realizar la reacción acrosómica: a) llegan “tarde” al sitio de encuentro, b) cuando se hiperactivan aumentan su probabilidad de colisión con la membrana pelúcida, c) no han sufrido la reacción acrosómica, d) poseen la membrana periacrosómica intacta y pueden realizar el primer contacto, mediado por la ZP3, con la membrana, e) sufren la reacción acrosómica provocada por la ZP3 de la membrana pelúcida y en consecuencia f) tienen su dotación enzimática acrosómica intacta. Son éstos los espermatozoides que, desde el punto de vista probabilístico, poseen papel fecundante.

Bibliografía Cummins JM, Yanagimachi R. (1986). Development of ability to penetrate the cumulus oophorus by hamster spermatozoa capacitated in vitro, in relation to the timing of the acrosome reaction. Gamete Research. 15(3): 187-212. Hong SJ, Chiu PC, Lee KF, Tse JY, Ho PC, Yeung WS. (2009). Cumulus cells and their extracellular matrix affect the quality of the spermatozoa penetrating the cumulus mass. Fertility and Sterility. 92(3):971-8. Vines CA, Li MW, Deng X, Yudin AI, Cherr GN, Overstreet JW. (2001). Identification of a hyaluronic acid (HA) binding domain in the PH-20 protein that may function in cell signaling. Mol Reprod Dev. 60(4):542-52. SC 1.6. EL CONTACTO Y RECONOCIMIENTO ENTRE LAS GAMETAS. V. Flores Pese a que los mamíferos son especies de fecundación interna, todavía conservan fenómenos moleculares adquiridos evolutivamente por ancestros muy lejanos, que garantizan la eficacia de las interacciones entre gametas de la misma especie que conducen a la fecundación. Estos mecanismos específicos de especies son esenciales en los animales de fecundación externa. Los organismos superiores son de fecundación interna y han adoptado muchos mecanismos nuevos, más elaborados y correspondientes a otros niveles de organización del individuo (celulares, histológicos, anatómicos, funcionales y conductuales) que garantizan la especificidad de especie en la fecundación. Éstos fallan sólo cuando se trata de especies muy emparentadas que aún están en proceso de especiación. No basta la colisión entre las gametas para que se produzca la fecundación. Se requieren varios mecanismos específicos de contacto y reconocimiento para el éxito de la fecundación. a) El primer contacto-reconocimiento se produce entre la membrana periacrosómica del espermatozoide y la membrana pelúcida del ovocito. En consecuencia, requiere que no se haya producido la reacción acrosómica. Este reconocimiento estaría mediado por varias proteínas de la membrana periacrosómica que se unen específicamente a restos glúcidos de la glucoproteína Zp3 de la membrana pelúcida. Esta interacción desencadena la reacción acrosómica y la membrana periacrosómica es eliminada. Diversos experimentos de interacción entre espermatozoides y ovocitos in vitro muestran que, si se incuban los ovocitos con concentraciones crecientes de espermatozoides, el número de espermatozoides unidos a la membrana pelúcida aumenta hasta un cierto punto, luego del cual el número de espermatozoides que se pegan a la membrana ya no aumenta. Cuando esto ocurre, sólo un pequeño porcentaje de la superficie de la membrana pelúcida está ocupada por espermatozoides. Ello indica que los espermatozoides no pueden unirse a toda la superficie expuesta de membrana pelúcida sino sólo a sitios en donde se concentran las moléculas que median el contactoreconocimiento (Fig. SC 1-6-1).

Fig. SC 1-6-1. Contacto-reconocimiento entre espermatozoides y membrana pelúcida. En el momento en que, en experimentos de unión espermatozoide-membrana pelúcida, la capacidad de la membrana para fijar espermatozoides se ha saturado, vale decir, se hallan todos los sitios potenciales de unión ocupados por espermatozoides, sólo una pequeña parte de la superficie de la membrana pelúcida tiene espermatozoides en contacto.

b) El segundo contacto se produce luego de producida la reacción acrosómica que expone al exterior la membrana acrosómica interna. Ésta posee proteínas que se unen a la membrana pelúcida. Una de ellas es la proteína Ph20 que se une específicamente a la proteína Zp2 de la membrana pelúcida. Dado que ésta es una red de proteínas Zp3 y Zp2 unidas por Zp1 (Fig. SC 1-6-2), el espermatozoide que ha sufrido la reacción acrosómica transfiere fácilmente su contacto inicial mediado por la unión a la Zp3 por el segundo contacto mediado por la unión a la Zp2. Las enzimas acrosina, neuraminidasa y otras del acrosoma permiten la penetración de la membrana pelúcida. Una vez que el espermatozoide la atraviesa, se encuentra con la membrana plasmática del ovocito y se inicia la activación de este último.

Fig. SC 1-6-2. A. Modelo de la red de proteínas que componen la membrana pelúcida. Se trata de una malla de filamentos formados por interacciones entre la ZP3 y la ZP2. La ZP1, que interactúa con ambos tipos de proteínas, une dichos filamentos formando una red tridimensional. La ZP3 y sus grupos azúcares son esenciales para el contacto primario. La ZP2 lo es para el contacto secundario. B. Este resultado experimental muestra que el agregado de Zp3, solubilizada, al medio de fecundación in vitro, inhibe la unión a la membrana pelúcida en forma dependiente de la concentración. La Zp3 sin sus restos glúcidos pierde dicha capacidad. El agregado de las proteínas Zp1 y Zp2 al medio no altera la unión del espermatozoide a la membrana pelúcida. (Modificado de Bleil y Wassarman, 1980, y Wassarman, 2005) c) El tercer contacto-reconocimiento se produce entre proteínas de superficie del espermatozoide, que operan como ligandos, y proteínas receptor de la membrana plasmática del ovocito. Este proceso involucra varios fenómenos moleculares que inician varios procesos de señalización celular con diferentes consecuencias (SC Recepción y transducción de señales. Vías de señalización intracelular; SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoide ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular). Por un lado se inicia la fusión de las membranas de las gametas y, a continuación, este proceso se inhibe por medio del bloqueo rápido de la polispermia. Si bien el proceso de fusión de membranas es bastante complejo, se sabe que la proteína fusógena fertilina, una de las proteínas de la membrana posacrosómica del espermatozoide, está involucrada en este tercer contacto. La fertilina se une

específicamente a proteínas integrinas de la membrana plasmática del ovocito y ello contribuye al inicio de la fusión de las membranas de ambas gametas (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia).

Bibliografía Bleil JD, Wassarman PM. (1980). Mammalian sperm-egg interaction: identification of a glycoprotein in mouse egg zonae pellucidae possessing receptor activity for sperm. Cell. 20(3):873-82. Bleil JD, Greve JM, Wassarman PM. (1988). Identification of a secondary sperm receptor in the mouse egg zona pellucida: role in maintenance of binding of acrosome-reacted sperm to eggs. Dev Biol. 128(2):376-85. Chen H, Sampson NS. (1999). Mediation of sperm-egg fusion: evidence that mouse egg alpha6beta1 integrin is the receptor for sperm fertilinbeta. Chem Biol. 6(1):1-10. Wassarman PM, Jovine L, Qi H, Williams Z, Darie C, Litscher ES. (2005). Recent aspects of mammalian fertilization research. Mol Cell Endocrinol. 234(1-2):95-103. SC 1.7. LA ACTIVACIÓN DEL OVOCITO Y LA ACTIVACIÓN DEL PROGRAMA DE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA. EL CONTACTO ESPERMATOZOIDE OVOCITO COMO SEÑAL PARA EL INICIO DE VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR. V. Flores El proceso de activación es en general descrito como una “cascada” o sucesión de eventos ordenados temporalmente que se inician en el momento del contacto espermatozoide-ovocito (E-O). Es natural suponer que los eventos del desarrollo embrionario se sucedan ordenadamente. También es natural suponer que, en procesos como la activación, todos los fenómenos se presentan en sucesión ordenada y que cada uno es causa desencadenante del siguiente. Sin embargo, a veces no es así; muchos fenómenos biológicos consistentes en secuencias de eventos son el resultado de procesos que corren en paralelo pero sincronizadamente. En el caso de la activación del ovocito II, es probable que el contacto-reconocimiento E-O involucre a una o más proteínas receptores de membrana del ovocito II, y que diversas moléculas de la superficie del espermatozoide operen como ligando o señales que inician varias vías de señalización intracelular (SC Recepción y transducción de señales. Vías de señalización intracelular). Éstas conducen a la ejecución de varios procesos con diferentes sentidos biológicos. Por ese motivo, más que una cascada de eventos, muchos fenómenos de la activación, aun cuando se producen en un orden cronológico definido, corresponden a varias cascadas que corren en paralelo y que permiten integrar todos los fenómenos que deben ocurrir desde el contacto E-O hasta la formación de la célula huevo. Los procesos incluidos, por diversos autores, en la activación del ovocito pueden ser categorizados de la siguiente manera: 1. Fenómenos vinculados al ingreso del núcleo y el centríolo del espermatozoide: a) Fusión de membranas. Proceso necesario para la fusión de ambas gametas y la formación de la célula huevo. En muchas especies requiere que la membrana del ovocito se encuentre con un potencial de reposo de –90 mV (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia). b) Penetración. La fusión de membranas no garantiza el ingreso del núcleo y del centríolo del espermatozoide. La incorporación de dichos elementos al citoplasma del ovocito depende de la operación de fuerzas similares a las involucradas en la fagocitosis. La generación de estas fuerzas depende del inicio de fenómenos contráctiles

que implican una reorganización del citoesqueleto cortical. Ello permite la formación de una abertura lo suficientemente grande, en la corteza del ovocito, para el ingreso del núcleo del espermatozoide y la emisión de seudópodos que rodean al núcleo y lo arrastran al interior. c) Migración del pronúcleo masculino. En especies con ovocitos voluminosos, el núcleo del espermatozoide recorre un largo trecho dentro del citoplasma del ovocito, hacia la región del polo animal del ovocito donde normalmente se forma el pronúcleo femenino. En este proceso participan el centríolo del espermatozoide y el citoesqueleto del ovocito II. El centríolo opera como centro organizador de microtúbulos y nuclea fascículos de microtúbulos a partir de tubulina almacenada en el citoplasma del ovocito. Estos fascículos de microtúbulos se ensamblan luego con la red de microtúbulos propia del ovocito. 2. Fenómenos vinculados al bloqueo de la polispermia: Estos fenómenos impiden que el ovocito sea fecundado por más de un espermatozoide. a) Bloqueo temprano o rápido. Depende de una despolarización transitoria de la membrana del ovocito debido al ingreso de Na+. El contacto con el primer espermatozoide produce la despolarización que lleva el potencial de membrana a unos +20 mV. Ello evita la fusión de membranas con nuevos espermatozoides (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia). No se sabe si en la especie humana opera este proceso de bloqueo de la polispermia. b) Bloqueo tardío o definitivo. Depende de la reacción cortical del ovocito por medio de la cual se exocita el contenido de las vesículas corticales. La reacción cortical posee varios efectos: el más importante es la degradación de las proteínas receptores Zp3 y Zp2 de la membrana pelúcida que reconocen a proteínas del espermatozoide. Luego de ocurrida la reacción cortical queda anulado el reconocimiento E-O. La membrana pelúcida se vuelve irreconocible por nuevos espermatozoides y también se sueltan los espermatozoides que ya se encontraban unidos a la membrana pelúcida o penetrándola. 3. Fenómenos vinculados al inicio del programa de desarrollo de la embriogénesis temprana. a) Terminación de la meiosis. Se inician procesos que conducen a la finalización de la meiosis II que dependen de la puesta en marcha de fenómenos cíclicos de degradación y síntesis de proteínas de control del ciclo celular o ciclinas. Las ciclinas forman complejos con proteínas enzimáticas denominadas genéricamene cinasas a las que activan. Las cinasas fosforilan una variedad de proteínas involucradas en el control del ciclo celular. De las ciclinas dependen la continuación de la miosis II y también el control temporal o periodicidad de los ciclos proliferativos durante la segmentación. El aumento del Ca+2 intraovocitario, operando como segundo mensajero, inicia la degradación de ciclinas; ello permite la salida del estado de metafase y la finalización de la meiosis II. b) Sincronización de los pronúcleos. En el momento de la fecundación, los núcleos del espermatozoide y del ovocito II se encuentran en diferente estado. El espermatozoide ha completado la meiosis, su núcleo posee un conjunto haploide [n] de cromosomas simples y el ADN está en un estado de máxima compactación. La compactación se debe a las proteínas básicas protaminas que interactúan, por un lado con el ADN y, por otro, entre sí por medio de numerosos puentes disulfuro formados entre residuos laterales de sus aminoácidos. En este estado, el ADN espermático no puede ser replicado ni transcrito. El ovocito II, por su parte, se encuentra detenido en la metafase de la segunda división meiótica. Mientras el ovocito completa la meiosis, el núcleo del espermatozoide se descondensa. La envoltura nuclear, debido a procesos de fosforilación, se desensambla y el material nuclear entra en contacto con el citoplasma del ovocito. El glutatión citoplasmático reduce los puentes disulfuro de las protaminas, el ADN se descondensa y las protaminas son reemplazadas por las proteínas básicas histonas sintetizadas y almacenadas en el ovocito. La envoltura nuclear se reconstituye rápidamente y se inicia la replicación del ADN espermático. Así se forma el pronúcleo masculino que sigue siendo haploide pero con cromosomas duplicados. Simultáneamente, el núcleo del ovocito, luego de finalizar la meiosis II, replica su

ADN formándose el pronúcleo femenino haploide con cromosomas duplicados. Estos procesos ocurren mientras los pronúcleos se desplazan uno hacia el otro debido a fuerzas generadas sobre haces de microtúbulos organizados por el centríolo del espermatozoide pero ensamblados a partir de proteínas tubulinas, MAP, etc. del ovocito. En mamíferos, el proceso de migración de los pronúcleos insume unas 12 horas. c) Activación del programa de la embriogénesis. El programa de la embriogénesis temprana ya está “impreso” en la organización molecular del citoplasma del ovocito. El gran tamaño de la célula huevo se debe en buena medida al almacenamiento de moléculas informativas que se sintetizan durante la ovogénesis a partir de información genética materna. Debido a ello se considera que la etapa más temprana del desarrollo se encuentra sólo bajo control genético materno (SC 2.4. El concepto control genético materno (CGM) de la embriogénesis temprana). El genoma aportado por el espermatozoide aún no participa. En el citoplasma del ovocito se encuentran almacenados diferentes tipos de moléculas informativas: a) en principio posee una reserva de gran variedad de proteínas y ARN ribosómicos y posee una gran cantidad de ribosomas; b) posee los ARN mensajeros necesarios para sintetizar una gran variedad de proteínas (se estima unos 30 a 50 mil tipos) que participan en el desarrollo temprano; c) posee una reserva de ARN de transferencia necesarios para la síntesis de nuevas proteínas; d) proteínas enzimáticas y proteínas reguladoras de enzimas (ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas, enzimas calcio-sensibles, etc.; e) proteínas que integran diferentes vías de señalización intracelular; f) proteínas estructurales que participan de la organización del citoesqueleto, que mantienen la organización interna de todos los elementos del ovocito y que participan del ensamblado y la orientación de los husos mitóticos durante cada división celular. Todos los elementos moleculares mencionados constituyen un programa de desarrollo que se elabora durante la ovogénesis y que se encuentra bloqueado en el ovocito II. La activación del programa de desarrollo consiste en poner en marcha este sistema de desarrollo que se halla en latencia. Los eventos de la activación del programa de desarrollo son clasificados arbitrariamente como tempranos y tardíos. El proceso se inicia con la activación de receptores como por ejemplo los receptores tirosina-quinasa y/u otros que siguen con la vía de señalización del inositol trifosfato o IP3. Esta vía de señalización ha sido exhaustivamente estudiada en el ovocito fecundado (SC 1-8 La vía de señalización del IP3 en la activación del programa de la embriogénesis temprana).

Bibliografía Ducibella T, Fissore R. (2008). The roles of Ca2+, downstream protein kinases, and oscillatory signaling in regulating fertilization and the activation of development. Dev Biol. 315(2):257-79. Horner VL, Wolfner MF. (2008). Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237(3):527-44. Tokumoto T, Yamashita M, Tokumoto M, Katsu Y, Horiguchi R, Kajiura H, Nagahama Y. (1997). Initiation of cyclin B degradation by the 26S proteasome upon egg activation. J Cell Biol. 138(6):1313-22. SC 1.8. LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL IP3 EN LA ACTIVACIÓN DEL PROGRAMA DE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA. V. Flores Existen varios modelos sobre el modo como se activa esta vía de señalización en el inicio de la activación (Fig. SC 1-8-1). Un modelo propone que la vía se inicia por medio de la activación del receptor del tipo tirosina-quinasa de la membrana del ovocito II que reconoce moléculas del espermatozoide. Los receptores clásicos de este tipo tienen un dominio extracelular que posee el sitio de alta afinidad para la molécula señal, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. Cuando el receptor interactúa con la molécula señal, el receptor se dimeriza y los

dominios intracelulares se fosforilan recíprocamente en residuos laterales del aminoácido tirosina. La fosforilación genera sitios de alta afinidad para una variedad de moléculas adaptadoras a partir de las cuales se pueden generar una variedad de interacciones moleculares que inician varias vías intracelulares de señalización. Una de las proteínas que se activan por interacción con dominios intracelulares activados de los receptores de tirosina-quinasa es la fosfolipasa C tipo γ. Otro modelo propone que el receptor para espermatozoides de la membrana del ovocito está asociado a una enzima tirosina-quinasa. Esta enzima, que se activaría luego de la interacción receptor-ligando, activa a la fosfolipasa C del ovotico.También se ha propuesto que el receptor para espermatozoide estaría asociado a una proteína G que podría activar a una fosfolipasa C tipo β del ovocito. Finalmente, existen datos que indican que el espermatozoide posee un pool propio de la enzima fosfolipasa C tipo ζ que serían aportados al ovocito durante la fusión E-O, y que esta enzima tendría, principalmente, a su cargo la continuación de la vía de señalización. No está descartado que todos estos procesos puedan estar incluidos, y actúen sinérgicamente, en la activación de la vía del IP3 en el inicio de la activación del ovocito.

Fig. SC 1-8-1. Se ilustran dos modelos por medio de los cuales se podría iniciar la vía de señalización del IP3. En ambos casos se activa una fosfolipasa C que genera IP3 y DAG que inician cascadas de reacciones que cumplen funciones complementarias. El IP3, hidrosoluble, difunde en citosol y conduce a la liberación de Ca+2. El DAG, liposoluble, difunde en la membrana. Ambos promueven la activación de la proteína-quinasa C y a través de ella la activación de un antitransportador Na+-H+.

En general hay acuerdo en que el siguiente paso está mediado por una o más de las fosfolipasas C mencionadas. Ésta genera los segundos mensajeros inositol trifosfato o IP3 y diacilglicerol o Dag a partir del fosfolípido fosfatidil inositol de la membrana plasmática del ovocito (SC Fosfolípidos. Fosfolipasas C. El fosfatidil inositol (PI) como fuente de moléculas señal: el inositol trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG)). El IP3 se une a canales de Ca+2 ‒que poseen un receptor para IP3‒ de las membranas del retículo endoplasmático liso. La apertura de estos canales produce liberación de Ca+2 al citosol. Todos estos fenómenos se inician en el sitio de contacto con el espermatozoide y desde allí se propagan hasta el polo opuesto. La liberación de Ca+2 se propaga como una onda a través de la corteza del ovocito gracias a que el retículo endoplasmático liso de la corteza posee canales sensibles al Ca+2. El aumento de Ca+2 produce varios efectos: a) desencadena la reacción cortical, b) forma complejos con proteínas sensibles al Ca+2 y estos complejos producen activaciones de diversas enzimas citoplasmáticas, c) contribuye a activar a la proteína-quinasa C que activa a un antitransportador de Na+ y protones (H+); el ingreso de Na+ se acompaña del egreso de H+ y debido a ello disminuye el pH citoplasmático; d) el DAG, por su parte, tam bién activa a la proteína-quinasa C por lo cual ambos IP3 y DAG conducen al mismo efecto, e) el Ca+2 también activa a una quinasa que fosforila NAD+ generando NADP+ que actúa como coenzima en la síntesis de lípidos; éstos son importantes en el proceso de biogénesis de membranas que ocurre cuando se inicia la proliferación de la célula huevo. Es común clasificar los eventos de la activación del ovocito II en tempranos y tardíos (SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoide ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular). En general se denominan tempranos aquellos descritos hasta el momento en que se produce el aumento del pH de ovocito II. Todos los eventos descritos hasta ese momento son cambios iónicos y no involucran fenómenos biosintéticos. Luego del aumento en la concentración de Ca+2 y del pH citoplasmático se inician fenómenos tardíos de la activación. Éstos corresponden a fenómenos biosintéticos e involucran la activación de macromoléculas que se encuentran almacenadas en el ovocito tales como enzimas, ARNm, transportadores de membrana, etc.; también se inicia la activación de ribosomas. Todos estos fenómenos llevan al inicio de los fenómenos de síntesis de proteínas y de ADN y se pone en marcha el programa de la embriogénesis temprana. En muchas especies durante esta etapa no es necesaria la expresión de los genes de la célula huevo. Vale decir, la síntesis de proteínas es independiente de la síntesis de ARNm. Esto es así debido a que las moléculas informativas que se utilizan fueron almacenadas durante la ovogénesis. Por ello este fenómeno se denomina activación. El ovocito ya está programado para el inicio del desarrollo pero se encuentra bloqueado. El espermatozoide opera como señal que desbloquea el programa. Aunque no se sabe con precisión qué moléculas del espermatozoide son las que inician estos fenómenos, existen indicios de que ciertas proteínas perinucleares del espermatozoide están involucradas en la activación del ovocito aunque su papel exacto es por el momento desconocido.

Bibliografía Carroll DJ, Ramarao CS, Mehlmann LM, Roche S, Terasaki M, Jaffe LA. (1997). Calcium release at fertilization in starfish eggs is mediated by phospholipase Cgamma. J Cell Biol. 138(6):1303-11. McPherson SM, McPherson PS, Mathews L, Campbell KP, Longo FJ. (1992). Cortical localization of a calcium release channel in sea urchin eggs.J Cell Biol. 116(5):1111-21. Xu Z, Kopf GS, Schultz RM. (1994). Involvement of inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ release in early and late events of mouse egg activation. Development. 120(7):1851-9.

SC 1.9 EL BLOQUEO DEFINITIVO DE LA POLISPERMIA. LA REACCIÓN CORTICAL. V. Flores Se denomina reacción cortical a un conjunto de procesos que ocurren en la corteza del ovocito II que impiden el ingreso de espermatozoides supernumerarios luego de que un primer espermatozoide realizó el contacto espermatozoide-ovocito (E-O) (Fig. SC 1-9-1). Dado que el bloqueo temprano es transitorio, la reacción cortical posee como función evitar: a) que los espermatozoides libres realicen el contacto primario con la membrana pelúcida, b) eliminar aquellos que ya lo hicieron y se encuentran unidos a la ZP3, c) impedir que los que se encuentran atravesando la membrana pelúcida, unidos a la ZP2, puedan llegar hasta la membrana del ovocito II. La reacción cortical está incluida entre los fenómenos tempranos de la activación del ovocito (SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoideovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular) y es una de las respuestas desencadenadas por las vías de señalización que se inician con el contacto E-O. Consiste, básicamente, en la exocitosis de las vesículas corticales; se inicia en el sitio de contacto E-O y se propaga hasta el polo opuesto. Depende de la fusión Ca+2-dependiente entre la membrana de las vesículas corticales y la membrana plasmática. Se inicia debido al incremento en la concentración intraovocitaria de Ca+2, unos 10-20 segundos luego del contacto E-O. Las proteínas Snares como la sinaptobrevina, sintaxina, sinaptotagmina y otras, que están involucradas en diversos procesos de exocitosis (liberación de hormonas o de neurotransmisores), direccionan y fijan las vesículas corticales a la membrana plasmática del ovocito y a continuación producen la exocitosis (SC Comportamientos moleculares involucrados en la exocitosis de las vesículas corticales). La reacción cortical, debido a la variedad de sustancias exocitadas, tiene varias consecuencias que derivan en un eficaz bloqueo definitivo de la polispermia: a) Se liberan proteasas que degradan los puentes o complejos formados entre proteínas de la membrana pelúcida y glicoproteínas de la membrana del ovocito. Estos complejos tienen la función de mantener unidas ambas membranas antes de la reacción cortical. b) Se liberan mucopolisacáridos ácidos que arrastran agua al espacio extracelular y se genera, en algunas especies, el espacio de fertilización, entre la membrana plasmática y la membrana pelúcida. Estos dos fenómenos llevan a que ambas membranas se separen de modo que un nuevo espermatozoide, al atravesar la membrana pelúcida, no contacte directamente con la membrana del ovocito II. c) Se liberan enzimas peroxidasas, que catalizan la unión (“cross-linking”) entre residuos de tirosina. Esto hace que las proteínas de la membrana pelúcida formen una red compacta que dificulta el paso de los espermatozoides a través de ella. d) Se liberan enzimas que degradan o que modifican la ZP3 y, en consecuencia, inhiben el contacto-reconocimiento primario del espermatozoide con la membrana pelúcida (SC 1-6 El contacto y reconocimiento entre las gametas). Una de dichas enzimas elimina los azúcares terminales de los oligosacáridos de la ZP3. La N-acetilglucosaminidasa de las vesículas corticales remueve Nacetilglucosamina de la porción glucídica de la ZP3. Este azúcar sirve como receptor específico para algunas moléculas del espermatozoide. De este modo, los espermatozoides libres ya no pueden realizar el contacto primario y los que lo hicieron se sueltan. e) Se liberan proteasas que degradan la ZP2 impidiendo el contacto secundario. La degradación de la ZP2 hace que los espermatozoides que están atravesando la membrana pelúcida se suelten de ella.

Fig. SC 1-9-1. La secuencia A-D muestra cómo los espermatozoides que se hallan unidos o atravesando la membrana pelúcida se sueltan de ella a medida que la reacción cortical progresa desde el sitio inicial del contacto E-O (arriba a la derecha) hasta el polo opuesto (abajo-izquierda). En D se observa que en el sitio de contacto E-O ha quedado el cono de fertilización. También puede observarse la formación del espacio de fertilización entre la membrana pelúcida y el ovocito.

En algunas especies, las vesículas corticales también liberan proteínas (hialina) que forman una cubierta relativamente rígida alrededor de la célula huevo y de las blastómeras durante la segmentación. Dado que la membrana de la célula huevo se une a dicha cubierta, se ha propuesto que posee un papel morfogenético durante el período denominado segmentación.

Bibliografía Moller CC, Wassarman PM. (1989).Characterization of a proteinase that cleaves zona pellucida glycoprotein ZP2 following activation of mouse eggs. Dev Biol. 132(1):103-12. Rothman JE, Söllner TH. (1997). Throttles and dampers: controlling the engine of membrane fusion. Science. 276(5316):1212-3. Weis WI, Scheller RH. (1998). Membrane fusion. SNARE the rod, coil the complex. Nature. 395(6700):328-9. SC 1.10. EL VARICOCELE COMO PRINCIPAL CAUSA DE INFERTILIDAD MASCULINA. M. Rapacioli El varicocele es la dilatación patológica del plexo venoso pampiniforme debida a diversas causas. Es más frecuente en el lado izquierdo y se postula que podría deberse a la mayor presión hidrostática en la vena testicular izquierda que en la derecha (la vena izquierda drena en la vena renal izquierda en tanto que la derecha lo hace en la vena cava inferior). Por otro lado, varios estudios estadísticos indican que un 75% de los pacientes con varicocele no poseen válvulas venosas, lo que podría ocasionar reflujo venoso. Por último, se ha comprobado la existencia de alteraciones obstructivas de las venas testiculares causadas por la obstrucción de la vena renal izquierda entre la aorta y la arteria mesentérica superior. La incidencia del varicocele es del 15% en la población general. No todos los pacientes con varicocele presentan infertilidad. Un 19 a 41% de los varones que consultan por infertilidad presentan varicocele; si se analizan sólo los casos de infertilidad masculina secundaria, este porcentaje asciende a 70-80%. Este hecho indicaría que el varicocele podría causar una pérdida progresiva en la calidad espermática. La corrección del varicocele mejora los parámetros espermáticos en un 50 a 80% de los pacientes e incrementa la tasa de embarazos en un 31 a 71%. A pesar de estos datos, la fisiopatología y el tratamiento del varicocele son temas controvertidos. No se conoce con precisión cuáles son los mecanismos que llevan a la alteración de la calidad espermática. Se proponen algunas hipótesis: Hipertermia. La temperatura testicular es mantenida en un nivel inferior a la corporal mediante un mecanismo de contracorriente en el cual la sangre arterial es enfriada por la sangre que corre por el plexo venoso pampiniforme. Las varicosidades de este plexo pueden disminuir la eficacia del enfriamiento. Si bien existen dudas sobre la existencia de una relación directa entre el varicocele y la hipertermia testicular, existen modelos animales y estudios realizados en seres humanos que muestran que en el varicocele se eleva la temperatura intratesticular. La temperatura elevada podría afectar la función de proteínas de unión a ARN y ADN que se expresan en la línea germinal. El funcionamiento óptico de estas proteínas requiere un rango de temperaturas inferior al corporal. Hipertensión venosa. El incremento en la presión venosa testicular puede desencadenar disminución del flujo arterial por un mecanismo de autorregulación de la presión intratesticular que causaría contracción de las arteriolas precapilares. Una vasoconstricción crónica podría ocasionar déficit nutricional y en consecuencia podría afectar la espermatogénesis. Por otro lado, un incremento en la presión venosa podría modificar las

relaciones entre presiones hidrostática y oncótica intravascular y extravascular y llevar a alteraciones en el transporte de sustancias, incluso hormonas, entre la sangre y el tejido conectivo. Autoinmunidad. El 91% de los varones infértiles con varicocele posee anticuerpos antiespermatozoides en el líquido seminal y fijados a los espermatozoides. Este porcentaje desciende al 41% de los varones infértiles que no presentan varicocele. No se ha comprobado la existencia de alteraciones en la barrera hematotesticular en pacientes con varicocele y se desconoce el mecanismo que lleva a este incremento de anticuerpos. Los anticuerpos antiespermatozoides causan alteraciones en la fecundación por varios motivos: aglutinación e inmovilización espermática, citotoxicidad espermática, incapacidad de penetración del moco cervical, alteraciones en la capacitación y en la reacción acrosómica y un incremento de la fagocitosis de los espermatozoides por macrófagos. Estrés oxidativo. La concentración de especies reactivas de oxígeno (ROS) es mayor en muestras de semen de pacientes con varicocele que en controles. La estirpe espermática produce, en condiciones normales, ROS. En varones sanos, el plasma seminal contiene antioxidantes que neutralizan los efectos de la generación excesiva de ROS. En condiciones patológicas, el exceso de ROS rompe esta relación y genera estrés oxidativo. El estrés oxidativo podría causar peroxidación lipídica de los ácidos grasos poliinsaturados de la cabeza y pieza media del espermatozoide, alteraciones en la morfología espermática, disminución en la movilidad espermática y disminución de la capacidad de fusión con el ovocito. También es causa de daño del ADN.

Bibliografía Jarow JP. (2001). Effects of varicocele on male fertility. Human Reproduction Update. 7: 59-64. Naughton CK, Nangia AK, Agarwal A. (2001). Varicocele and male infertility: Part II: Pathophysiology of varicoceles in male infertility. Human Reproduction Update. 7(5):.47381. Schoor RA, Elhanbly SM, Niederberger C. (2001). The pathophysiology of varicoceleassociated male infertility. Curr Urol Rep. 2(6):432-6. SC 1.11. LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA PÉLVICA. M. Rapacioli Los agentes infecciosos pueden producir alteraciones en la función del aparato reproductor. Bacterias, hongos, virus y parásitos pueden interferir con la función reproductora en ambos sexos. Las infecciones del tracto genitourinario masculino son responsables de alrededor del 15% de los casos de infertilidad masculina. Las infecciones pueden afectar diferentes partes del aparato reproductor (testículos, epidídimo y glándulas accesorias), incluso los espermatozoides pueden verse afectados. Entre los microorganismos que más comúnmente causan infecciones de transmisión sexual que interfieren con la fertilidad se encuentran Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. La infertilidad masculina se debe con menor frecuencia a infecciones que no son transmitidas sexualmente como la epidídimo-orquitis, que es causada en la mayor parte de los casos por Escherichia coli. Las infecciones que afectan la fertilidad femenina se deben en su mayor parte a Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. Estos patógenos están involucrados con alteraciones cervicales, tubáricas y peritoneales. En relación con las alteraciones tubáricas, suelen producir laceraciones, obstrucciones y adhesiones. Los microorganismos suelen colonizar primero la vagina y luego ascender al tracto reproductor a través del cuello uterino. Se considera que este ascenso se ve facilitado durante la fase menstrual debido a que existe una

dilatación del canal endocervical. Una vez que se encuentran en el útero, comienzan a proliferar y ascienden a las trompas. El efecto de los microorganismos en las trompas se debe fundamentalmente a la acción de las toxinas liberadas por ellos y a la respuesta inflamatoria que desencadenan. En relación con las toxinas, se ha observado que la exposición in vitro de epitelio de trompas de Falopio humanas a endotoxina gonocócica causa disminución y luego supresión de la actividad ciliar. Este fenómeno ocurre antes de que puedan detectarse alteraciones ultraestructurales en las células. Por otro lado, se ha observado que la infección por N. gonorrhoeae causa descamación de las células ciliadas del epitelio tubárico. Este hecho parece deberse a la acción del lipopolisacárido (LPS) que se libera de la membrana externa del microorganismo así como por monómeros de peptidoglicanos secretados por él. Los LPS se adhieren al extremo de las cilias, luego de 2 horas son incorporados a las células en vesículas y luego de 12 horas se produce la descamación de las células ciliadas. Este efecto es inhibido si se neutraliza la acción del LPS. En la infección por C. trachomatis se ha detectado que proteínas de estos microorganismos producidas en células infectadas interfieren con la vía de la apoptosis. Este hecho sería de principal importancia en la perpetuación de la infección dado que impediría la eliminación de las células infectadas. Además se ha observado que la proteína de shock térmico de 60 kDa (hsp60: heat shock protein) induce la expresión de metaloproteasas en las células infectadas. Este hecho podría conducir a una alteración de la matriz extracelular y dar lugar a la formación de cicatrices debido a un exceso de remodelación y reparación de ésta. La infección por ambos patógenos causa aumento en la producción de citocinas y factores proinflamatorios como factor de necrosis tumoral α (Tnfα), interleucina-1β e interferón γ (Ifn-γ). Se ha observado que la inoculación intratubaria de Tnf-α causa descamación de las células ciliadas. Por otro lado, todos estos factores llevan a la producción de moléculas de adhesión celular en las células endoteliales de la mucosa que favorece la invasión de ésta por linfocitos y monocitos. La respuesta inflamatoria produciría destrucción de la matriz extracelular con la consiguiente reparación, fibrosis y formación de adherencias que producirían obstrucción de la luz de las trompas que conducirían a infertilidad.

Bibliografía Dun EC, Nezhat CH. (2012). Tubal factor infertility: diagnosis and management in the era of assisted reproductive technology. Obstet Gynecol Clin North Am. 39(4):551-6. Gradison M. (2012). Pelvic inflammatory disease.Am Fam Physician. 85(8):791-6.

Capítulo 2. El periodo presomítico. Segmentación de la Célula Huevo y Gastrulación SÍNTESIS CONCEPTUAL

SEGMENTACIÓN SC 2.1. Los comportamientos celulares de la segmentación se hallan temporal y espacialmente organizados. V. Flores

SC 2.2. Papel de la adhesividad celular durante la segmentación. La polarización y compactación de las blastómeras y la formación de la mórula. V. Flores SC 2.3. Procesos de diferenciación celular durante el período de segmentación. ¿Cómo se genera diversidad celular durante la segmentación?. V. Flores SC 2.4. El concepto control genético materno (CGM) de la embriogénesis temprana. V. Flores SC 2.5. Los mamíferos poseen CH de regulación. La importancia de la polaridad A-V en los experimentos de merotomía de la CH. V. Flores SC 2.6. Comportamientos celulares involucrados en la primera determinación. En los mamíferos con sólo tres células se constituiría el embrioblasto. V. Flores SC 2.7. La morfología y la polaridad de las células huevos. V. Flores

SC 2.8. ¿Es la segmentación rotacional de las CH de mamíferos esencial para el desarrollo normal? V. Flores SC 2.9. La no equivalencia de las blastómeras del E4c de los mamíferos. V. Flores, M. Rapacioli GASTRULACIÓN SC 2.10. Concepto de territorio presuntivo. Su base experimental. Consideraciones teóricas. . Flores SC 2.11. Comportamientos moleculares involucrados en la migración celular dirigida. . Flores SC 2.12. El concepto de migración celular dirigida. Papel de desarrollo. El concepto de haptotaxis. Papel del citoesqueleto y de las fuerzas interfaciales célula-sustrato (Fif c-s). V. Flores SC 2.13. El papel de la polaridad planar y de la intercalación celular en la formación de la línea primitiva. N. Fosser SC 2.14. La transformación de ejes desde la fase

pregastrular a la organización del embrión cilíndrico. N. Fosser SC 2.15. El papel del hipoblasto en la gastrulación y en la inducción neural. N. Fosser SC 2.16. La secuencia de polaridades que aparecen desde la fecundación al embrión posgastrular. La importancia de tales polaridades en la organización espacial de tipos celulares emergentes. V. Flores SC 2.17. La primera determinación. La expresión de combinatorias de factores de transcripción específicas de tipo celular en la mórula y el blastocisto. V. Flores SC 2.18. La segunda determinación. La determinación de los linajes celulares epiblásticos e hipoblásticos y su organización espacial en el embrión bilaminar. V. Flores SEGMENTACIÓN SC 2.1. LOS COMPORTAMIENTOS CELULARES DE LA SEGMENTACIÓN SE HALLAN TEMPORAL Y ESPACIALMENTE ORGANIZADOS. V. Flores La segmentación implica, en todas las especies conocidas, la operación temporoespacialmente organizada de varios CCD. En muchas especies, los primeros planos de segmentación tienen posición constante. El eje del primer huso mitótico es perpendicular al eje animal-vegetativo (A-V) y el primer plano de segmentación es meridional (contiene al eje A-V). El segundo plano de segmentación también es meridional pero perpendicular

al anterior y se produce simultáneamente en las dos primeras blastómeras indicando que están sincronizadas. El tercer plano de segmentación es ecuatorial, en consecuencia, perpendicular a los dos primeros y también al eje A-V y se forma simultáneamente en las cuatro blastómeras. Ello revela que siguen sincronizadas. Esta forma de segmentación posibilita que cada blastómera contenga una porción característica del citoplasma de la CH original. En los mamíferos, que poseen CH de regulación, este tipo de control estricto de las posiciones relativas de las blastómeras no parece ser una necesidad fundamental. En los mamíferos pueden ocurrir varios modos de segmentación diferentes que conducen, todos, al desarrollo normal. En los mamíferos, en las etapas tempranas, lo esencial es que las blastómeras se organicen en un MCI y un MCE y, en relación con dicha disposición, se determinen diferentemente. El control espacial de los procesos de cariocinesis y citocinesis depende de macromoléculas informativas involucradas en la organización del citoesqueleto. La ubicación de los ásteres, la orientación del eje del huso mitótico y la orientación en el espacio de los planos de segmentación deben estar adecuadamente integrados para que la división celular se produzca normalmente. Se postula que estos procesos se encuentran tempranamente bajo control genético materno. Los ásteres desempeñan un papel primordial a) en el control del ensamblado del huso mitótico, necesario para la cariocinesis y b) en la determinación de la posición espacial del anillo contráctil responsable de la citocinesis. Datos de observación y resultados experimentales apoyan lo expuesto: 1) El espermatozoide aporta un centríolo a la CH y éste genera los ásteres que organizan el aparato mitótico. La segmentación normal requiere la penetración de un espermatozoide y la operación de sólo un par de ásteres. 2) La penetración de más de un espermatozoide genera una segmentación anormal con números de husos mitóticos y de surcos de segmentación acordes con el número de ásteres presentes. Los surcos de segmentación se ubican característicamente en el punto medio de la distancia entre dos ásteres adyacentes. 3) Si en la CH, por compresión mecánica, se modifica la posición de los ásteres y del huso mitótico, la posición en el espacio del surco de segmentación se modifica de acuerdo con la nueva posición de los ásteres. 4) Si en la CH se desplaza mecánicamente el huso mitótico a la periferia y se impide la progresión del surco de segmentación (Fig. SC 2-1-1), se produce una situación similar a la segmentación meroblástica de los huevos telolecíticos. Se genera una célula binucleada, con forma de herradura, con los núcleos ubicados en los extremos de las ramas de la herradura (Fig. SC 2-1-1 C). En la siguiente segmentación, en cada rama de la herradura se forman un par de ásteres y el huso mitótico correspondiente a la cariocinesis de cada núcleo. A continuación, en cada brazo de la herradura, a mitad de camino entre los dos ásteres –en la zona media de cada huso mitótico–, se genera un surco de segmentación. Lo significativo de estos experimentos es que en la zona curva de la herradura (Fig. SC 2-1-1 E), en donde no existe ningún huso mitótico, también se genera un surco de segmentación que se ubica en un punto equidistante entre dos ásteres adyacentes. Este surco de segmentación no está asociado ni a la cariocinesis ni a la formación de un huso mitótico. El resultado indica que no es el huso mitótico, sino la ubicación de los ásteres el fenómeno que instala en el citoesqueleto la referencia que determina la ubicación espacial del anillo contráctil de la citocinesis. La ubicación de los ásteres por un lado determina la posición del eje del huso mitótico y, por otro, señalizarían –probablemente por medio de los microtúbulos que a partir de él se extienden radialmente hacia la periferia celular– la orientación en el espacio de los planos división de la segmentación.

Fig. SC 2-1-1. El experimento ilustra el papel de los ásteres en la determinación de la posición del anillo contráctil de la citocinesis. La compresión de la célula huevo con una pequeña esfera de vidrio interrumpe el progreso del primer plano de clivaje. A. Con una esfera de vidrio se comprime la CH y se desplaza el huso mitótico a la periferia. B-C. Cuando se produce la citocinesis, el plano de clivaje se ubica a mitad de camino entre ambos ásteres. La esfera de vidrio impide el progreso (profundización) del surco. D-E. Durante la segunda segmentación se forman los surcos de segmentación correspondientes a los dos husos mitóticos. Además, en la zona inferior, pese a que no hay un huso mitótico y no corresponde a una célula que se está dividiendo, se forma un surco de segmentación extra (cabeza de flecha gris). Bibliografía Houliston E, Elinson RP. (1999). Patterns of microtubule polymerization relating to cortical

rotation in Xenopus laevis eggs. Development. 112(1):107-17. Rappaport R. (1971). Cytokinesis in animal cells. Int Rev Cytol. 31:169-213. SC 2.2. PAPEL DE LA ADHESIVIDAD CELULAR DURANTE LA SEGMENTACIÓN. LA POLARIZACIÓN Y COMPACTACIÓN DE LAS BLASTÓMERAS Y LA FORMACIÓN DE LA MÓRULA. V. Flores Algunos eventos morfogenéticos de la segmentación están mediados por cambios en la intensidad de fuerzas interfaciales célula-célula (Fif c-c). Los cambios en la intensidad de dichas fuerzas están involucrados tanto en la compactación de las blastómeras que conduce a la mórula como también en la cavitación que lo transforma en blástula. Los cambios en la intensidad de las Fif c-c son resultado de cambios en la organización química de superficie de las blastómeras. Estos cambios dependen de modificaciones en el patrón de síntesis de moléculas de adhesión celular o Cam (Cell adhession molecules). Desde los E2c-E4c, las blastómeras cambian la expresión de algunas proteínas de superficie celular. Éstas, sin embargo, ejercerán su efecto compactante sólo más adelante. Hasta el E4c, algunas glicoproteínas de superficie celular se encuentran uniformemente distribuidas, al azar, en la superficie de las blastómeras. Desde el E4c en adelante, como modificación preparatoria para la compactación y formación de la mórula, las blastómeras experimentan una redistribución y localización asimétrica o polarización de algunas proteínas de membrana. Éstas se localizan en regiones particulares de la superficie de las blastómeras. Algunas proteínas se concentran en la zona más externa de las blastómeras (el polo opuesto al centro del embrión) en tanto que otras se localizan internamente, en la zona donde las blastómeras toman contacto entre sí. La proteína de adhesión celular L-Cam, por ejemplo, se ubica preferencialmente en las zonas de contacto intercelular en donde aparece alta intensidad de Fif c-c. El incremento de las Cam en las zonas de contacto intercelular y el incremento en la intensidad de la Fif c-c hacen que las células se unan más fuertemente, disminuya el espacio entre ellas, se compacten y, en conjunto, formen una masa celular maciza o mórula. Se sabe que el fenómeno de polarización depende de interacciones entre blastómeras adyacentes. Diversas experiencias de disociación y reasociación de blastómeras muestran que las blastómeras aisladas no sufren polarización; las proteínas de membrana se distribuyen homogéneamente en el plano de la membrana. Cuando se las asocia de a pares, la polarización reaparece. La proteína L-Cam constituye un ejemplo de glicoproteína de superficie que cumple un papel específico en la compactación. La incubación de embriones en presencia de anticuerpos anti-L-Cam produce una rápida descompactación de la mórula. Existen experimentos que sugieren que uno de los sistemas de transducción de señales, la vía de señalización del fosfatidilinositol, está involucrado en la compactación. La enzima proteínaquinasa C, de un modo no dilucidado aún, actuaría sobre la localización de la L-Cam. Este hecho iniciaría la compactación. El citoesqueleto submembranoso y las proteínas de la membrana plasmática desempeñan un papel importante en la compactación. Es precisamente en la interface entre las membranas de blastómeras en contacto donde operan las Fif c-c que producen su compactación. Las membranas de las blastómeras correspondientes a las zonas de contacto generan pliegues o microvellosidades con gran cantidad de microfilamentos. Se piensa que éstas contribuyen a aumentar la superficie de contacto. La organización de la mórula compactada es rápidamente estabilizada por el desarrollo de complejos de unión, especialmente zónulas occludens entre las células superficiales de la mórula. Estas uniones, por un lado, cumplen una función estructural estabilizadora porque mantienen cohesionadas a las células y las hacen resistentes a tensiones mecánicas. Por otro, dada su capacidad de restringir el pasaje de moléculas a través de la vía paracelular, contribuyen a definir un medioambiente bioquímicamente definido en el interior de la mórula.

Esto genera la condición necesaria para la ocurrencia del primer evento de determinación durante el desarrollo de los mamíferos (SC 2.17. La primera determinación. La expresión de combinatorias de factores de transcripción específicas de tipo celular en la mórula y el blastocisto).

Bibliografía Cockburn K, Rossant J. (2010). Making the blastocyst: lessons from the mouse. J Clin Invest. 120(4):995-1003. Levy JB, Johnson MH, Goodall H, Maro B. (1986). The timing of compaction: control of a major developmental transition in mouse early embryogenesis. J Embryol Exp Morphol. 95:213-237. Pratt HP, Ziomek CA, Reeve WJ, Johnson MH. (1982). Compaction of the mouse embryo: an analysis of its components. J Embryol Exp Morphol. 70:113-32. SC 2.3. PROCESOS DE DIFERENCIACIÓN CELULAR DURANTE EL PERÍODO DE SEGMENTACIÓN. ¿CÓMO SE GENERA DIVERSIDAD CELULAR DURANTE LA SEGMENTACIÓN?. V. Flores Existen muchos momentos típicos del desarrollo en los que a partir de una población homogénea (formada por un único tipo celular con una potencia dada) se generan dos o más tipos celulares con diferentes características y potencias evolutivas. Éste es uno de los procesos involucrados en la génesis de la complejidad pluricelular. El inicio de la segmentación implica la generación de una cierta cantidad de blastómeras, morfológicamente similares y equipotentes. Al final de la segmentación, la organización del blastocisto depende de los fenómenos que operaron en ésta. El tipo de segmentación, a su vez, depende de la organización citoplasmática original de la CH. En los mamíferos, al final de la segmentación existen dos tipos celulares: a) células que forman el embrioblasto (originarán tejidos embrionarios y algunos no embrionarios) y b) células que forman el trofoblasto (originarán tejidos de la placenta encargados de la nutrición del embrión). Las blastómeras se forman por mitosis a partir de la CH. La mitosis mantiene la similitud de la información genética que se transfiere de célula madre a células hijas. Cada blastómera posee un citoplasma que corresponde a una fracción del citoplasma de la CH –proveniente del ovocito II– y un núcleo con información genética similar a la de la CH original. El interés por conocer cómo a partir de una célula que se divide por mitosis pueden originarse dos o más tipos celulares diferentes ha generado muchos e ingeniosos experimentos. Papel de las señales externas y de las interacciones núcleo-citoplasmáticas [Int n-c] en la especificación de tipo celular. La información genética reside en el núcleo, pero los procesos fisicoquímicos por medio de los cuales se ejecutan CCD y que confieren características morfológicas y/o funcionales típicas a las células ya diferenciadas ocurren mayoritariamente en el citoplasma. Las Int n-c constituyen la base de la diferenciación celular. Numerosas evidencias sobre la importancia de las Int n-c para el mantenimiento de la estructura y función de las células de cualquier organismo provienen de las clásicas experiencias de extirpación del núcleo en células de vida libre: la extirpación del núcleo de una ameba no interrumpe sus funciones vitales inmediatamente. Una ameba sin núcleo puede sobrevivir un tiempo pero, finalmente, muere. Si, antes de un cierto tiempo crítico, se reintroduce el núcleo en el citoplasma de la ameba, ésta recupera sus características normales y sobrevive. De modo similar, una CH enucleada puede iniciar el desarrollo. Se inicia la segmentación, se desarrollan parcialmente blástulas, pero el desarrollo se detiene antes de que se observen signos importantes de diferenciación. Esto indica que la eliminación del material genético, con la consiguiente ausencia de Int n-c, detiene el desarrollo.

La prosecución transitoria del desarrollo luego de la eliminación del núcleo no implica que el citoplasma actúe con prescindencia de aquél. Sólo se debe a que el citoplasma posee almacenados los productos de Int n-c realizadas antes de la eliminación del núcleo, durante la ovogénesis, y que explican el fenómeno denominado control genénico materno de la embriogénesis temprana (SC 2.4 El concepto control genético materno (CGM) de la embriogénesis temprana). Si en algún momento las blastómeras empiezan a expresar CCD diferentes, puede suponerse que en ellas se están realizando diferentes Int n-c. Desde el punto de vista teórico, esta situación podría darse si las blastómeras: (a) poseyeran información genética diferente, o si... (b) poseyeran composiciones citoplasmáticas diferentes. Existe acuerdo con respecto a que la primera condición no se cumple en mamíferos. La segunda situación podría darse si: (b1) durante la segmentación las blastómeras recibieran de la CH porciones de citoplasma con factores determinantes citoplasmáticos diferentes, o si… (b2) durante la segmentación las blastómeras sufrieran cambios citoplasmáticos debidos a la recepción de estímulos ambientales diferentes y la consiguiente activación de vías de señalización con diferentes efectos de desarrollo. En favor del punto (a) del párrafo anterior alguna vez se argumentó que la información genética podría modificarse durante el desarrollo. El cambio en la composición del ADN podría explicar que las Int n-c sean diferentes y así podría explicarse que las blastómeras expresen diferentes CCD y originen poblaciones celulares diferentes. Algunas experiencias clásicas de trasplante nuclear permitieron descartar la opción (a). La experiencia consistió en transferir núcleos de distintos tipos de células, que ya han iniciado su diferenciación, a CH previamente enucleadas. El objetivo consistía en contrastar si los núcleos de células diferenciadas o en diferenciación, trasplantados, son capaces de promover un desarrollo normal. El fundamento se basó en la idea de que, si las CH núcleo-trasplantadas originaran individuos normales, ello implicaría que la información genética de los núcleos diferenciados o en diferenciación es similar a la de la CH. Las experiencias de Briggs y King (1959) consistieron en el trasplante de núcleos de células embrionarias somáticas (2n) (blastómeras del hemisferio animal de blástulas avanzadas de rana Pipiens) a óvulos enucleados. Un porcentaje de estas CH núcleo-trasplantadas se segmentaron y desarrollaron normalmente hasta etapas larvarias avanzadas sugiriendo que la información genética de los núcleos de blastómeras de blástulas avanzadas es similar a la de la CH que les dio origen. Diversos resultados obtenidos en la década del 60 por Gurdon, Laskey y otros, en la rana Xenopus Laevis permitieron aceptar, en general, la idea de que la información genética de las células somáticas permanece sin cambios cualitativos significativos a lo largo del desarrollo. En consecuencia, desde el punto de vista cualitativo, la información genética es básicamente similar en todas las células del organismo. Gurdon y cols. trasplantaron núcleos de células somáticas diferenciadas (2n) a ovocitos enucleados. El desarrollo de éstos dio origen a renacuajos normales y hasta algunos ejemplares adultos. Todos estos resultados sugieren que el ADN del núcleo diferenciado trasplantado, una vez en el citoplasma de la CH, es liberado de los procesos de activación y represión génica sufridos durante el proceso de diferenciación. El trasplante tendría el efecto de revertir la condición en la que se encuentra el ADN del núcleo de la célula somática diferenciada a la condición original que posee en el núcleo de la CH.

Los resultados clásicos han sido interpretados en el sentido de que el núcleo de cada tipo particular de célula somática posee una combinación típica de genes activados y reprimidos que es característica para cada tipo celular. Sin embargo, el núcleo de una célula ya diferenciada, puesto en el citoplasma de la CH pasa a comportarse como el núcleo de la CH. Sufre una reversión de los cambios (activación y represión selectiva) ocurridos durante el desarrollo. Estas ideas son la base de la clonación que en la actualidad se pueden realizar en diversas especies, incluso en mamíferos. Las experiencias de trasplante nuclear, primero iniciadas en protozoarios y luego en CH de anfibios, se han podido aplicar con éxito en mamíferos y hoy se sabe que los núcleos de células somáticas, aun de organismos adultos, cuando son trasplantados a CH enucleadas son capaces de promover el desarrollo hasta el estado adulto, aunque todavía no han sido exhaustivamente analizadas todas las consecuencias perjudiciales que pueden traer aparejadas las experiencias de trasplante nuclear. Todos estos resultados experimentales muestran que la actividad nuclear es regulada por moléculas que transitoriamente residen en el citoplasma y que, o son generados en respuesta a moléculas señal provenientes del medio (señales determinantes o permisivas) (SC 0.5. El concepto de determinación. Potencia y significado evolutivos; SC El concepto de diferenciación celular. Criterios que definen el grado de diferenciación) o también productos génicos de la propia célula (factores de transcripción y otras moléculas que regula la expresión génica). La operación de los CCD, en consecuencia, depende de la información genética propia y de componentes del medioambiente con sentido biológico (señales). De acuerdo con los datos considerados, el origen de la diversidad o diferenciación celular durante la ontogenia se centra en el punto (b) –las diferencias citoplasmáticas entre las blastómeras–. El mecanismo principal por medio del cual se introduce diversidad celular en el desarrollo temprano posee modalidades diferentes según se trate de (b1) CH de organización determinada –mosaico– o de (b2) CH de organización lábil o regulativa. A esta segunda categoría pertenecen los huevos de mamíferos, entre ellos el hombre (véase SC 2.5. Los mamíferos poseen CH de regulación. La importancia de la polaridad A-V en los experimentos de merotomía de la CH).

Bibliografía Briggs R, King TJ. (1952). Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs' eggs. Proc Natl Acad Sci. USA 38:455-63. Briggs R, King TJ. (1959). Nucleocytoplasmic interactions in eggs and embryos. In: The Cell (Eds. J. Brachet and A. E. Mirsk). New York: Academic Press. pp.537-617. Gurdon JB. (1962). Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Dev Biol. 4:256-73. Gurdon JB, Laskey RA, Reeves OR. (1975). The developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized skin cells of adult frogs. J Embryol Exp Morphol. 34:93-112. SC 2.4.EL CONCEPTO CONTROL GENÉTICO MATERNO (CGM) DE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA. V. Flores La célula huevo (CH) constituye un sistema de desarrollo que posee a) información genética cigótica, aportada por ambos progenitores, que se halla en un estado apto para ser utilizada como inicio de un programa genético de desarrollo y b) información citoplasmática ovocitaria representada por moléculas informativas (diferentes tipos de ARN, proteínas, ribosomas, etc.) sintetizadas y almacenadas durante la ovogénesis. La información citoplasmática que posee la CH le es transferida por el ovocito II y fue elaborada exclusivamente con la utilización del genoma materno. Ambos conjuntos informativos son importantes pero el control de los CCD durante la embriogénesis temprana, incluida la segmentación, depende principalmente de la información citoplasmática de la CH, por ello se dice que se halla fundamentalmente bajo CGM. El concepto no implica que

los elementos informativos que aporta el espermatozoide no influyan en absoluto en la organización de los CCD, sólo enfatiza la importancia que poseen los que aporta el ovocito. El CGM posee gran influencia en algunas especies y menor en otras (mamíferos). En las especies en las que existe un CGM riguroso se cumplen las siguientes condiciones: a) Varios CCD incluidos en la segmentación requieren proteínas y ARNm sintetizados durante la ovogénesis y almacenados en el citoplasma del ovocito. b) El genoma cigótico no se expresa durante el clivaje temprano. Recién lo hace en la fase final de la segmentación o al principio de la gastrulación. c) El cambio entre ambos tipos de control genético (CGM a CGC) es bastante brusco, se denomina transición y ocurre en un momento típico del desarrollo. El momento en el que se produce la transición (activación del CGC) para el caso de algunos genes o algunos CCD puede ser detectado con precisión y ser modificado experimentalmente. 1) Existen especies en las que el CGM de la proliferación se manifiesta por una curva típica de incremento en el número de células en función del tiempo o en función del número de ciclos celulares cumplidos (Fig.SC 2-4-1). Cuando se pasa al CGC, la pendiente de la curva se modifica típicamente. A dicho punto se denomina transición del control de la proliferación y ocurre en un número típico de ciclos celulares. 2) Aumentando experimentalmente la cantidad de cromatina del núcleo de la CH y, en consecuencia la de las blastómeras resultantes, se puede adelantar el momento en que se produce la transición. Si se aumenta al doble la cantidad de cromatina, la transición ocurre un ciclo más temprano. 3) Si se disminuye la cantidad de cromatina a la mitad, la transición ocurre un ciclo más tarde. 4) Otros experimentos muestran que, modificando el volumen citoplasmático y dejando constante la cantidad de cromatina, se produce también un desplazamiento en el momento de la transición.

Fig. SC 2-4-1. Evolución de la duración del ciclo celular y de su variabilidad en función del número de ciclos medido en células disociadas de embriones de Xenopus. Los primeros ciclos celulares están sincronizados y poseen una duración típica de 35 minutos. Luego de la transición del control de la proliferación (flecha), los ciclos celulares se alargan y pierden sincronización. La línea negra representa la duración media del ciclo celular. Las líneas azules representan el rango de dispersión del valor medio o variabilidad. Nótese que luego de la transición también aumenta la variabilidad.

Por estos resultados, se considera que la transición depende del cambio en la relación volumen nuclear/volumen citoplasmático (R vN/vC) que ocurre durante la segmentación. En sentido estricto, no se considera que el cambio en la relación volumen N/C es el fenómeno desencadenante de la transición sino que depende de cambios en la relación concentración de cromatina/disponibilidad de factores inhibitorios luego de cada ciclo. Nótese que, en ausencia de actividad biosintética, con cada citocinesis la cantidad de factores inhibitorios que poseen las células se reduce a la mitad. Sin embargo, dado que en cada ciclo, en el período S se duplica la cantidad de ADN, en sucesivos ciclos se produce una dilución de factores inhibitorios en relación con la cantidad de ADN por célula. Luego de un cierto número de ciclos proliferativos, la cantidad de factores inhibitorios puede haberse diluido hasta el punto en que ya no ejerce su efecto inhibitorio y los genes cigóticos se activan. Los mamíferos poseen CH pequeñas que no almacenan grandes cantidades de moléculas informativas. En estos casos el control genético materno es menos importante o duradero: a) existe menor cantidad de moléculas informativas acumuladas en el ovocito, b) el genoma cigótico empieza a activarse ya durante la segmentación temprana para producir las moléculas que participan en la segmentación y c) con excepción de la adhesividad celular, no existe una transición neta en otros CCD. El control materno es reemplazado desde temprano y, al parecer, gradualmente por el cigótico.

Bibliografía Gotoh T, Kishimoto T, Sible JC. (2011). Phosphorylation of Claspin is triggered by the nucleocytoplasmic ratio at the Xenopus laevis midblastula transition. Dev Biol. 353(2):3028. Lequarre AS, Marchandise J, Moreau B, Massip A, Donnay I. (2003). Cell cycle duration at the time of maternal zygotic transition for in vitro produced bovine embryos: effect of oxygen tension and transcription inhibition. Biol Reprod. 69(5):1707-13. Newport J, Kirschner M. (1982). A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30(3):675-86. SC 2.5. LOS MAMÍFEROS POSEEN CH DE REGULACIÓN. LA IMPORTANCIA DE LA POLARIDAD A-V EN LOS EXPERIMENTOS DE MEROTOMÍA DE LA CH. V. Flores Dos conceptos clásicos aluden a diferentes comportamientos exhibidos por los sistemas de desarrollo cuando son sometidos a experimentos en los que una parte de éste es eliminado. En algunos casos, el desarrollo se altera, falta aquella parte que hubiera sido formada por la porción eliminada. En otros, se forma una estructura completa y armónica. Este diferente comportamiento, que clásicamente ha recibido diferentes designaciones y diferentes interpretaciones, depende del carácter determinado o indeterminado del sistema en cuestión en el momento en que se realiza el experimento de ablación (SC 0.5. El concepto de determinación. Potencia y significado evolutivos). Todo CCD involucra la operación previa de diversas interacciones núcleo-citoplasmáticas. La expresión de la información genética durante el desarrollo embrionario puede depender de señales externas (provenientes de otras células o del ambiente) que actúan en un momento dado y/o de moléculas propias o endógenas que pudieron haber sido sintetizadas con mucha anterioridad, almacenadas en el citoplasma y que actúan tiempo después.

Clásicamente se denominó “factores determinantes citoplasmáticos” a sustancias no identificadas que, estando almacenadas en el citoplasma de una célula en desarrollo determinan su modo de desarrollo y su destino evolutivo; vale decir, determinan qué derivados originarán. En tales sistemas de desarrollo puede ocurrir que determinantes citoplasmáticos almacenados en la CH se repartan diferencialmente durante la segmentación de la CH de modo que, dependiendo del tipo de determinantes citoplasmáticos que quedan en diferentes blastómeras, ellas originan diferentes derivados. En tales situaciones, la eliminación de alguna blastómera, o incluso de alguna porción del citoplasma de la CH, puede dar lugar a la falta de aquella porción del embrión que hubiera derivado de la blastómera eliminada. Algunas especies (moluscos, helmintos, ascidias y otras) poseen CH con regiones citoplasmáticas determinadas a formar sólo ciertas regiones del embrión y no otras. La eliminación de dichas regiones citoplasmáticas ocasiona la producción de embriones incompletos. Estos sistemas de desarrollo fueron concebidos clásicamente como un mosaico de regiones diferentemente determinadas, vale decir, con diferente potencia evolutiva. También se los ha denominado “con organización rígida o determinada” o “sistemas heterogéneos” aludiendo a que diferentes regiones citoplasmáticas poseen diferentes elementos informativos y propiedades de desarrollo. Existen modos de programación del desarrollo más plásticas en las que los procesos de determinación se suceden gradualmente en función del tiempo. En estos casos las señales determinantes o directrices van produciéndose gradual y progresivamente (de lo general a lo particular) dependiendo del estado de desarrollo. En tales sistemas las blastómeras que se forman durante la segmentación se mantienen indeterminadas por períodos más prolongados, pues el ingreso a diversas vías de desarrollo no depende de determinantes citoplasmáticos almacenados tiempo antes, sino de fenómenos interactivos que se van sucediendo en función del estado de desarrollo alcanzado. Dado que en tales sistemas las blastómeras no están determinadas, la eliminación de algunas de ellas puede no comprometer el desarrollo global ya que, si las restantes poseen potencia evolutiva amplia, pueden compartir la potencia de la blastómera eliminada y, en consecuencia, pueden suplirla o reemplazarla. Estos sistemas fueron concebidos clásicamente como poseedores de la capacidad de “regular” los déficits o excesos y se denominaron sistemas con “capacidad regulativa” o simplemente de “regulación”. También se los ha denominado “sistemas no determinados”, “plásticos o lábiles” implicando estos términos que poseen una organización que puede ser recompuesta (reorganizada) luego de la eliminación de parte del embrión y que las diferentes blastómeras, o regiones citoplasmáticas, no tienen un destino evolutivo fijo sino que pueden modificar sus destinos en función de las interacciones que puedan realizar durante el desarrollo. Estos sistemas también fueron denominados clásicamente “homogéneos” en el sentido de que las propiedades de desarrollo podrían estar uniformemente distribuidas en el citoplasma de la CH y de las primeras blastómeras. Existen experiencias que muestran que esto último no necesariamente se cumple. Los experimentos clásicos que llevaron a los conceptos de regulación y mosaico consistieron en la separación experimental de las dos primeras blastómeras y su desarrollo en forma aislada. En estas circunstancias, en las especies con CH de regulación se forman dos embriones más pequeños, pero con plan anatómico normal (completo). En el caso de las CH en mosaico el experimento da lugar a dos embriones incompletos (carecen de porciones del organismo). Algunos experimentos ulteriores sobre el desarrollo de partes aisladas de sistemas de regulación –CH o embriones en segmentación– pusieron también de manifiesto la importancia de la organización espacial del citoplasma y de la polaridad A-V. Los experimentos de separación de partes de CH o blastómeras y su desarrollo en forma aislada deben respetar ciertas referencias espaciales para que la capacidad regulativa efectivamente se ponga de manifiesto. 1) En los huevos de anfibios las dos primeras blastómeras, una vez aisladas, pueden generar embriones completos, sólo cuando el primer plano de clivaje es meridional (contiene el eje A-V) y ambas blastómeras poseen componentes de la semiluna gris (Fig. SC 2-5-1). Si una de las blastómeras aisladas carece de tales componentes, no desarrolla un embrión.

Fig. SC 2-5-1. Experiencias de separación de la dos primeras blastómeras y capacidad regulativa de la CH de anfibio. A. La primera división es meridional y ambas blastómeras contienen material de la semiluna gris. B. Sólo una de las blastómeras posee material de la semiluna gris y es capaz de formar un embrión completo. 2) Por otro lado, si se separan las mitades animal y vegetativa de CH o de embriones en segmentación, y tales mitades son cultivadas en forma aislada, ninguna de ambas mitades posee capacidad para formar un embrión completo (Fig. SC 2-5-2). El conjunto de blastómeras correspondientes al hemisferio animal exhibe tendencia a desarrollar estructuras de tipo ectodérmico y las de la mitad vegetativa originan células de tipo endodérmico. En ambos casos, el desarrollo se detiene rápido y las estructuras formadas terminan muriendo. Por otro lado, ninguna de ambas origina células mesodérmicas. Normalmente, las células mesodérmicas se forman a partir de la zona ecuatorial del casquete animal, pero su formación requiere que los hemisferios animal y vegetativo se encuentren juntos. La capacidad o competencia para formar células mesodérmicas que posee el casquete animal requiere una acción directriz por parte del casquete vegetativo. Así, estas evidencias experimentales de existencia de polaridad A-V fueron interpretadas en términos de que los hemisferios animal y vegetativo poseen diferencias en su potencia de desarrollo y que tales potencias se ponen de manifiesto parcialmente aun cuando están aisladas. La formación del mesodermo, sin embargo, es un proceso epigenético, vale decir, dependiente de acciones de unas células sobre otras.

Fig. SC 2-5-2. Experiencias de separación de los hemisferios animal y vegetativo de CH de anfibios. Las blastómeras del hemisferio animal reciben del hemisferio vegetativo señales que les permiten determinarse en sentido mesodérmico. Las blastómeras del hemisferio animal aisladas no originan mesodermo. Cuando ambos hemisferios pueden interactuar, las blastómeras ecuatoriales del hemisferio animal reciben estímulos (flechas) del hemisferio vegetativo que les permiten diferenciarse en mesodermo.

Bibliografía Dale L, Slack JM. (1987). Regional specification within the mesoderm of early embryos of Xenopus laevis. Development. 100(2):279-95. Nieuwkoop PD. (1969). The formation of mesoderm in urodelean amphibians. I. Induction by the endoderm. Wilhelm Roux Arch Entw Mech Org. 162:341-47 Spemann H. (1938). Embryonic Development and Induction. New Haven: Yale University Press. SC 2.6. COMPORTAMIENTOS CELULARES INVOLUCRADOS EN LA PRIMERA DETERMINACIÓN. EN LOS MAMÍFEROS CON SÓLO TRES CÉLULAS SE CONSTITUIRÍA EL EMBRIOBLASTO. V. Flores El primer fenómeno de determinación en los mamíferos parece depender de la instalación de una asimetría o polaridad interior-exterior que se instala en el estado de mórula (embrión compactado). Tal polaridad consistiría en diferencias en la composición molecular entre los medios externo e interno de la mórula y diferencias entre las blastómeras que quedan periféricamente distribuidas y que poseen parte de la superficie primaria del ovocito versus células que quedan ubicadas internamente y pierden los componentes relacionados con la superficie primaria del ovocito. El externo está definido por las secreciones de las células del tracto genital femenino y el interno por la actividad biosintética propia de las células de la mórula. La organización espacial de las células de la mórula, resultante de la compactación, se estabiliza por medio de zónulas occludens y desmosomas desarrollados entre las blastómeras periféricas. Durante la compactación se forman también uniones nexo, aunque la síntesis de sus proteínas constituyentes –conexinas– se inicia ya desde el E4c. Aparte de su función cohesiva las zónulas occludens cumplen otras dos funciones importantes para el desarrollo. Por un lado, a) constituyen una barrera a la difusión lateral de las proteínas en el plano de la membrana plasmática y ello permite definir dos dominios en la membrana: uno apical y otro basolateral. Esto contribuye a estabilizar la organización de la mórula y el estado polarizado de las blastómeras externas. Por otro lado, b) las zónulas occludens sellan el espacio entre células adyacentes restringiendo el pasaje de macromoléculas a través de la vía paracelular. Esto permite delimitar y mantener un medio interno embrionario bioquímicamente definido por las propias células embrionarias. Los embriones de mamíferos son sistemas regulables (SC 2.5 Los mamíferos poseen CH de regulación. La importancia de la polaridad A-V en los experimentos de merotomía de la CH) y existen datos experimentales que permitieron postular que entre los E2c y E8c las blastómeras son equipotentes. Ello significa que todas pueden determinarse y diferenciarse en embrioblasto o trofoblasto. Entre los E8c y E16c aparecen diferencias en la potencia evolutiva de las blastómeras. Estas diferencias surgen, al parecer, como consecuencia de diferencias en las interacciones célula-medioambiente. Luego de la compactación y formación de zónulas occludens, las células centrales de la mórula interactúan con un medioambiente diferente del medio externo del embrión. Las células periféricas sin embargo pueden interactuar con el medio externo. Así, la determinación y el tipo de diferenciación que experimentará una blastómera es dependiente de posición (interna o externa dentro de la mórula). Las células centrales se determinan en MCI o embrioblasto y las periféricas en MCE o trofoblasto. En términos de CMD ello implica que, debido a su diferente posición, las células externas e internas pueden estar sometidas a diferentes conjuntos de moléculas señal. Éstas, por medio de diversas vías de transducción intracelular, pueden desencadenar diferentes tipos de reprogramación de la información genética de las blastómeras. Se piensa que las reprogramaciones estables e irreversibles involucradas en fenómenos de determinación pueden implicar tanto el ingreso en, o el egreso de, un estado apto para la transcripción de genes

de desarrollo y es sabido que, luego de la determinación, las blastómeras internas y externas no expresan los mismos conjuntos de factores de transcripción. Dado que el desarrollo es interactivo, muchos fenómenos del desarrollo dependen de una masa o un número crítico de células que garanticen su ocurrencia. En un embrión de E16c, la mayor parte de las células posee ubicación periférica. Muy pocas poseen posición central y, en consecuencia, probabilidad de integrar el embrioblasto. ¿Con cuántas células se constituye el embrioblasto más joven? Aunque las blastómeras no se determinan hasta luego de la compactación y formación de la mórula, ya en el E2c se puede identificar a la precursora de la mayoría de las células que constituirán el embrioblasto; es la blastómera que exhibe ventaja proliferativa. En los mamíferos existe un breve E3c pues una de las blastómeras del E2c se divide un poco antes que la otra (ventaja proliferativa). Las descendientes mantienen dicha ventaja proliferativa y de una de ellas deriva el primer par de blastómeras que ingresa en el E8c. Las descendientes de estas últimas poseen mayor probabilidad que las restantes de ubicarse en la zona central de la mórula. Así, del comportamiento proliferativo de las blastómeras y de sus características adhesivas surgiría una mayor probabilidad, para la célula que se divide primero en el E2c, de originar a aquellas que constituirán el MCI. Ello no implica que tal célula ya se encuentre determinada a formar el embrioblasto. Existen indicios de que la determinación en sentido embrioblástico se inicia entre E8c y E16c. Ello no implica que las células externas se determinen en sentido trofoblástico al mismo tiempo. Por medio de experimentos de construcción de embriones quiméricos (formados por células de individuos de diferentes cepas) se ha podido estimar cuántas células constituyen el embrioblasto más joven. Si las blastómeras de dos embriones de ratón (E4c), uno proveniente de una cepa negra y otro de una blanca, son reasociadas, se puede constituir un embrión quimérico de 8 células. Éste puede ser implantado en una madre que los geste hasta el nacimiento. Desde el punto de vista estadístico, cuanto mayor sea el número de células implicadas en la formación del MCI, menor será la proporción de ratones “puros” (de la cepa blanca o negra) obtenibles por este método, y mayor será la proporción de descendientes con células de ambas cepas (manchados). Si el MCI se constituyera con a) una sola célula, los ratones tendrían que ser blancos o negros; existiría 50% de probabilidades de ser blanco y 50% de ser negro y la probabilidad de ser “manchado” (mezcla de blanco y negro) sería 0%. Si el MCI se constituyera con b) dos células, habría 50% de probabilidades de ser puro (25% de probabilidades de ser blanco + 25% de ser negro) y 50% de probabilidades de ser “manchado”. Si el MCI se constituyera con 3 células sólo 2/8 de los descendientes (25%) serían puros (12,5% blancos y 12,5% negros) y 6/8 de los descendientes (75%) serían manchados. Los resultados de este tipo de experimentos indican que 3 es el número de células que, probablemente, se determinan en sentido embrioblástico y constituyen el MCI.

Bibliografía Fleming T P. (1987). Quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse embryo. Dev Biol. 119:520–31. Mintz B. (1964). Formation of genetically mosaic mouse embryos, and early development of "lethal (t12/t12)-normal" mosaics. J Exp Zool. 157:273-92. Pedersen RA, Wu K, Batakier H. (1986). Origin of the inner cell mass in mouse embryos: Cell lineage analysis by microinjection. Dev Biol. 117:581–95 Tarkowski AK, Ozdzeński W, Czołowska R. (2001). How many blastomeres of the 4-cell embryo contribute cells to the mouse body? Int J Dev Biol. 45(7):811-6. SC 2.7. LA MORFOLOGÍA Y LA POLARIDAD DE LAS CÉLULAS HUEVOS. V. Flores Comparadas con otras especies, las CH de mamíferos exhiben pocas evidencias estructurales de polaridad animal-vegativa (A-V). Existen especies en las que la importancia de la polaridad A-V radica en que los

hemisferios A y V poseen diferentes potencias de desarrollo, y el desarrollo normal requiere la interacción entre ambos hemisferios. Si en tales especies se separan los hemisferios A y V (en el estado de CH o de blástula), se puede demostrar que ambas evolucionan diferentemente (SC 2.5. Los mamíferos poseen CH de regulación. La importancia de la polaridad A-V en los experimentos de merotomía de la CH). Las características de la CH dependen principalmente de las de la gameta femenina (ovocito II) que aporta la mayor parte de su estructura. La gameta femenina constituye un sistema de desarrollo en latencia. Su complejidad se expresa, más que por su estructura, por a) la dinámica de la redistribución de elementos citoplasmáticos que sufre luego de la fecundación, b) por los procesos involucrados en su activación (SC La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoideovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular) y por c) la organización temporal y espacial de los CMyCD que ocurren durante la segmentación (SC Los comportamientos celulares de la segmentación se hallan temporal y espacialmente organizados; SC El concepto control genético materno (CGM) de la embriogénesis temprana). La morfología de las CH varía en distintas especies (diferentes tamaños, distribución de elementos citoplasmáticos, cantidad y distribución de vitelo, etc.). A estas diferencias se agregan las diferentes formas de segmentación que ellas realizan, que son resultado de adaptaciones evolutivas diferentes. En el hombre, que posee placenta y el embrión se nutre a partir del medio interno materno, la CH posee escasa cantidad de vitelo (oligolecítico). La CH posee estructura aparentemente simple. Decía C. W. Bodemer, en su clásica Embriología Moderna, que las CH no poseen una organización que permita suponer la complejidad estructural del animal que de él deriva; […] que su apariencia es tan simple que decepciona. Sin embargo, posee la información y organización necesarias para alcanzar tal complejidad. Las CH poseen cifrada, en términos de moléculas con valor informativo, la información necesaria para el inicio y prosecución de secuencias de eventos que conducen a la elaboración de los diferentes fenotipos que exhiben los organismos pluricelulares. Un indicio claro de la existencia de organización es la posesión de la propiedad, ya mencionada, denominada polaridad. Ésta posee tanto manifestaciones estructurales como conductuales. Todos los ovocitos tienen estructura polarizada: poseen un polo A y un polo V que definen una entidad informativa, el eje A-V que, desde el punto de vista teórico, puede asimilarse a una entidad vectorial. Algunos autores sin embargo coinciden en proponer que para el caso de los mamíferos el eje A-V no posee el mismo valor informativo que en los animales inferiores. En los mamíferos su importancia estaría restringida a la organización espacial de la CH necesaria para la realización de una meiosis espacialmente organizada y se ha propuesto la designación de eje meiótico. Con respecto a la importancia del concepto de polaridad y las evidencias experimentales de su existencia, véase SC Polaridad de la CH y organización citoplasmática. Evidencias experimentales y SC 2.9. La no equivalencia de las blastómeras del E4c de los mamíferos. En general, la existencia del eje A-V es revelada estructuralmente por a) la distribución organoides, b) la distribución de inclusiones subcelulares, c) las diferencias regionales en la corteza y d) la distribución asimétrica de diversos productos génicos. Si bien existen muchas observaciones e ideas acerca de la instalación de la polaridad, no existe una explicación universal satisfactoria sobre su génesis en las CH. No queda claro si es la distribución asimétrica de los elementos mencionados lo que instala la polaridad o si, por el contrario, tal distribución es la manifestación de una polaridad instalada por factores organizativos aún no detectados. Existen experiencias clásicas sobre estas preguntas: 1) En los erizos de mar, que poseen CH grandes, la centrifugación de ovocitos permite alterar la organización espacial del citoplasma desplazando los organoides e inclusiones citoplasmáticos de sus posiciones normales. El procedimiento hace que los elementos citoplasmáticos se desordenen y estratifiquen.

2) Si se deja el ovocito en reposo, durante un cierto tiempo, los elementos citoplasmáticos se reordenan y vuelven a sus posiciones originales. El resultado sugiere que la disposición de los organoides e inclusiones citoplasmáticos depende de algún elemento o elementos que no fueron afectados por la centrifugación. 3) Si el óvulo de erizo de mar es centrifugado y a continuación fecundado, con sus elementos citoplasmáticos “desordenados”, el desarrollo embrionario no se altera. Este resultado indica que el patrón de organización del ovocito, necesario para dirigir el desarrollo normal, no se altera aun cuando sus organoides e inclusiones hayan sido desplazados de su ubicación normal. 4) La centrifugación no modifica la posición de los gránulos y vesículas que se encuentran en la corteza, lo que ha hecho postular que la organización del óvulo podría depender de moléculas asociadas a la organización del citoesqueleto cortical que es la región del ovocito que posee la estructura y configuración más estable.

Bibliografía Immers J. (1960). Studies on cytoplasmic components of sea urchin eggs stratified by centrifugation. Exp Cell Res. 19:499-514. Plusa B, Grabarek JB, Piotrowska K, Glover DM, Zernicka-Goetz M. (2002). Site of the previous meiotic division defines cleavage orientation in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 4(10):811-5. Zernicka-Goetz M. (2004). First cell fate decisions and spatial patterning in the early mouse embryo. Semin Cell Dev Biol. 15(5):563-72. SC 2.8. ¿Es la segmentación rotacional de las CH de mamíferos esencial para el desarrollo normal? V. Flores En muchos mamíferos, a diferencia de la mayoría de las otras especies de vertebrados, la segmentación es holoblástica y rotacional. El primer término alude a que la CH y las siguientes blastómeras realizan citocinesis completa. El término rotacional alude al modo como se orienta en el espacio el segundo plano de clivaje; vale decir el plano de división de las dos primeras blastómeras. En la primera división el plano de clivaje es meridional (contiene al eje meiótico). En la segunda división, el plano de clivaje es meridional en una de las blastómeras pero es ecuatorial en la otra. Existe una inclinación de 90º entre dichos planos y a dicha característica se ha denominado rotacional. La posición del primer plano de clivaje depende de dos puntos de referencia, la ubicación del segundo glóbulo polar que se mantiene comunicado con la CH por un puente citoplasmático y la posición del cono de fertilización que queda en la corteza de la CH en el sitio a través del cual penetra el espermatozoide. En un porcentaje alto de casos (75%), el primer plano de segmentación pasa cerca de estos dos elementos. Con frecuencia ocurre que estos dos elementos quedan en una de las blastómeras. Se ha mostrado que la blastómera que posee el cono de fertilización –que contiene elementos que se hallaban en la membrana del espermatozoide, y quizás otros elementos– o la mayor parte de éste posee ciclos proliferativos más breves y se divide antes que la otra. A dicho fenómeno se ha denominado ventaja proliferativa. Por otro lado, dicha blastómera posee los elementos de referencia que condicionan la posición del plano de clivaje y, con alta frecuencia, se divide nuevamente según un plano de clivaje meridional. La otra blastómera, la que se divide más tarde, en general lo hace según un plano de segmentación ecuatorial. A este tipo de patrón de segmentación se ha denominado ME (primero Meridional-segundo Ecuatorial) y tiene como característica que el embrión del E4c es tetraédico.

Fig. SC 2-8-1. Embriones de E4c resultantes de las tres modalidades de segmentación. A. La modalidad ME origina dos blastómeras AV, una blastómera A (animal) y una V (vegetativa). B. La modalidad MM origina cuatro blastómeras AV. C. La modalidad EE origina dos blastómeras A y dos V. Descripción en el texto. Aparte de estas diferencias entre las dos primeras blastómeras, existen otras que permiten considerar que no son exactamente equivalentes (SC 2-9. La no equivalencia de las blastómeras del E4c de los mamíferos), lo que hace suponer que tales elementos no sólo instalan un sistema de referencia para los planos de clivaje sino que también constituyen un sistema de referencia necesario para la correcta organización de ciertos eventos del desarrollo. Esta no equivalencia sólo es puesta de manifiesto cuando las diferentes blastómeras son puestas a desarrollar unas independientemente de las otras. Cuando las cuatro primeras blastómeras están juntas conformando un sistema de desarrollo con capacidad regulativa, no se advierten diferencias significativas en su capacidad de desarrollo hasta el momento de la primera determinación. Pese a que la posición de unas blastómeras respecto de otras parece ser un factor fundamental para el desarrollo, dichas posiciones relativas no son un factor esencial, en tanto las blastómeras se hallen juntas. Tanto es así que, en las especies que poseen segmentación rotacional, no necesariamente todas las CH efectivamente se segmentan rotacionalmente. En el ratón, que posee segmentación rotacional, sólo un 81% de las CH segmentan según dicha modalidad. Existe un 11% de casos en los que las dos primeras blastómeras se dividen según un plano de clivaje meridional (patrón denominado MM) y un 8% de casos en los que ambas se dividen según planos ecuatoriales (patrón EE). En los tres casos, las posiciones relativas de las cuatro primeras blastómeras son diferentes. Sin embargo, en todos los casos, el desarrollo puede ser normal aunque existen diferencias estadísticas significativas en la viabilidad de los embriones originados según estos tres tipos diferentes de patrones de segmentación. Este hecho no sorprende si se considera que los embriones tempranos de mamíferos, hasta el momento de la primera determinación, constituyen sistemas con capacidad regulativa. Es probable que, en tanto alguna o algunas de las blastómeras presentes operen como sistema de referencia para las otras, el sistema posea la capacidad de organizarse y desarrollar normalmente. De todos modos, estadísticamente puede mostrarse que el tipo de segmentación EE compromete el desarrollo ya que un porcentaje significativamente menor de estos embriones llega al final del desarrollo.

Estos experimentos sugieren que existe una tendencia, representada por una mayor probabilidad de ocurrencia, a la producción del tipo de segmentación ME y EM, pero que tales patrones no están rigurosamente definidos. Los resultados también sugieren que la formación del embrión de E4c tetraédrico no es indispensable ya que los embriones resultantes de los otros tipos de segmentación también pueden desarrollarse normalmente hasta el final. Sin embargo, los embriones tienen diferencias representadas por la diferente probabilidad de llegar al final del desarrollo y producir un individuo normal. Diversos estudios estadísticos muestran que el 91% de los embriones tetraédricos (patrones de segmentación ME y EM) se desarrollan hasta el final y originan embriones normales. Una proporción menor, pero alta, (85%) de los embriones resultantes de segmentaciones MM llegan al final del desarrollo. Sin embargo, una proporción significativamente menor, de sólo 35%, de los embriones resultantes de segmentaciones del tipo EE llega al final del desarrollo.

Bibliografía Gardner RL. (2002). Experimental analysis of second cleavage in the mouse. Hum Reprod.17(12):3178-89. Piotrowska-Nitsche K, Zernicka-Goetz M. (2005). Spatial arrangement of individual 4-cell stage blastomeres and the order in which they are generated correlate with blastocyst pattern in the mouse embryo. Mech Dev. 122(4):487-500. SC 2.9. La no equivalencia de las blastómeras del E4c de los mamíferos. V. Flores, M. Rapacioli En erizos de mar, anfibios y otros vertebrados, la manifestación más clara de polaridad animal-vegetativa (A-V) es la diferencia en las tendencias de desarrollo exhibidas por las blastómeras de los hemisferios A y V. Cuando los hemisferios A y V son separados y cultivados en forma aislada, las blastómeras del hemisferio A tienden a generar tejidos ectodérmicos, en tanto que las del V tejidos endodérmicos. Además ninguno de ambos conjuntos de blastómeras es capaz de completar el desarrollo (SC 2.5. Los mamíferos poseen CH de regulación. La importancia de la polaridad A-V en los experimentos de merotomía de la CH). Experimentos de disociación y reasociación de blastómeras de embriones de ratón realizados en el E4c muestran que, aunque el embrión posea capacidad regulativa, las cuatro blastómeras no son equivalentes desde el punto de vista de sus comportamientos de desarrollo y quizá desde el punto de vista de sus capacidades para organizar el desarrollo de las demás. Las blastómeras de embriones de E4c resultantes de segmentaciones rotacionales se disponen en el espacio como se ilustra en la figura SC 2-9-1. Las blastómeras ubicadas en las posiciones 1 y 2 de dicha figura son hijas de la blastómera que en el E2c posee ventaja proliferativa y se divide meridionalmente, vale decir, la blastómera que luego de la división de la CH retiene los elementos que sirven de referencia para la segmentación: el 2.º glóbulo polar y el cono de fertilización. Las blastómeras ubicadas en las posiciones 3 y 4 son las hijas de la blastómera que perdió dichos elementos de referencia. Una de ellas (3) tiene cierta relación de cercanía con el polo meiótico (lugar por donde se eliminan los glóbulos polares) en tanto que la otra (4) pierde toda vinculación con dicho polo. Dado que las blastómeras conforman un embrión con capacidad regulativa, durante el desarrollo normal no se advierten diferencias en la potencia evolutiva de las blastómeras hasta que ocurre la primera determinación. Sin embargo, las experiencias de disociación y reagregación de blastómeras ofrecen indicios de que, al menos desde el punto de vista informativo u organizativo, no son equivalentes. Esta no equivalencia sólo es puesta de manifiesto cuando las blastómeras que se hallan diferentemente posicionadas son puestas a desarrollar independientemente de las otras. Los experimentos de disociación y reasociación de blastómeras muestran que al menos existen tres tipos diferentes de blastómeras desde el punto de vista de sus capacidades para promover el desarrollo normal:

a) Si se generan embriones quiméricos reasociando tres blastómeras de tipo 1 o 2 (blastómeras A-V) y se los deja evolucionar, originan blastocistos normales que, cuando son transferidos al útero de ratones hembra en estado apropiado para la implantación, la mayoría de ellos (70-90%) llegan al final del desarrollo. b) Si se generan embriones quiméricos reasociando blastómeras de tipo 3 (blastómeras A), estos embriones sólo llegan hasta el estado de mórula o tardan más tiempo en llegar al estado de blastocisto y poseen un número escaso de células. Una vez transferidos al útero, sólo un 27% llega al final del desarrollo. c) La generación de embriones quiméricos reasociando blastómeras de tipo 4 (blastómeras V) lleva a un peor resultado. En su mayoría detienen su desarrollo en estado de mórula u originan blastocistos con un número inferior de células y de desarrollo más lento. Luego de ser transferidos al útero, ninguno alcanza el final del desarrollo.

Fig. SC 2-9-1. Ilustra la generación y evolución de embriones quiméricos originados por medio de la reasociación de un único tipo de blastómeras (AV, A o V) obtenidas a partir de la disociación de embriones de E4c tetraédricos. Modificado de Zernicka-Goetz, 2005. Es importante remarcar que las diferencias mencionadas entre las blastómeras 1 y 2, por un lado, y la 3 y la 4 por otro, no se refieren a diferencias en las potencias citogenéticas entre ellas. Esto se muestra por el hecho de que todas poseen la capacidad de determinarse en sentido embrioblástico y trofoblástico y que tal determinación ocurre recién entre los E8c y E16c. La no equivalencia puede ser interpretada en términos de diferencias en la capacidad informativa de las blastómeras. Es probable que las blastómeras que retienen elementos que sirven de referencia poseen mayor

capacidad informativa (mayor capacidad de organizar los CCD de las blastómeras del embrión) que las blastómeras que pierden dichos elementos. La no equivalencia podría poseer un papel en el establecimiento de la polaridad céfalo-caudal del embrioblasto. Sobre todo si se considera que, mayoritariamente, las células que lo integran derivan de la blastómera que en el E2c posee los elementos de referencia (2.º glóbulo polar y cono de fertilización). Vale decir, derivan de la blastómera que posee ventaja proliferativa y se divide meridionalmente. Se han hallado diferencias en el nivel molecular entre las blastómeras del E4c resultantes de segmentaciones rotacionales de ambos tipos (casos ME y EM) que podrían explicar, al menos en parte, estas diferencias. Las blastómeras del E4c que originan las células del polo embrionario poseen mayores niveles de metilación de argininas de la histona H3 (SC ¿Son las blastómeras del embrión del E4c diferentes desde el punto de vista de su potencia citogenética? Muchos resultados conflictivos y una hipótesis conciliadora). También se observó que la sobreexpresión de la enzima metiltransferasa específica de argininas de la histona H3 en una blastómera dirige a las células derivadas de ella en sentido embrioblástico y genera un incremento en la expresión de los factores de transcripción Nanog y Sox2.

Bibliografía Piotrowska-Nitsche K, Perea-Gomez A, Haraguchi S, Zernicka-Goetz M. (2005). Four-cell stage mouse blastomeres have different developmental properties. Development. 132(3):479-90. Piotrowska-Nitsche K, Zernicka-Goetz M. (2005). Spatial arrangement of individual 4-cell stage blastomeres and the order in which they are generated correlate with blastocyst pattern in the mouse embryo. Mech Dev. 122(4):487-500. Zernicka-Goetz M. (2005). Cleavage pattern and emerging asymmetry of the mouse embryo. Nat Rev Mol Cell Biol. 6(12):919-28.

GASTRULACIÓN SC 2.10. Concepto de territorio presuntivo. Su base experimental. Consideraciones teóricas. V. Flores Es éste un concepto clásico que surgió a raíz de a) observaciones realizadas por medio de marcaciones supravitales(*) de células de diferentes regiones del epiblasto pregastrular con el objeto de construir mapas de destinos de éstas y b) resultados de trasplantes de células de un lugar a otro del epiblasto pregastrular de embriones de pollo. La marcación de células de diferentes regiones del epiblasto pregastrular con colorantes supravitales permite ver que las células se desplazan, de modo típico y constante, desde sus sitios originales (sitios en los que fue puesta la marca) a otras regiones embrionarias. Resultados similares se obtuvieron en muchas especies. Estos resultados revelan la existencia de diferentes patrones típicos de desplazamientos propios de diferentes regiones del epiblasto pregastrular. En consecuencia, permiten identificar, antes de la gastrulación, territorios que se distinguen sólo por los patrones de desplazamiento que exhiben durante la gastrulación las células que los ocupan. ¿Dependen las diferencias en los patrones de migración de diferencias intrínsecas, sin manifestación morfológica, entre las células? ¿Se hallan las células de diferentes regiones determinadas a migrar

diferentemente? ¿Se hallan las células de las diferentes regiones determinadas a formar los derivados que originan? Vale decir, ¿poseen diferente potencia las células de diferentes regiones? Diversas experiencias de trasplante de células, de una región a otra del epiblasto, muestran que las células trasplantadas exhiben el comportamiento migratorio correspondiente a la región a la cual son trasplantadas. Es decir, se comportan de un modo acorde con su nueva posición. Por ejemplo, si las células del territorio presuntivo (TP) del ectodermo epidérmico son trasplantadas al TP del mesodermo, ellas migran como las células de su “nueva región”, pasan a ubicarse en la hoja media del embrión y en esa ubicación se diferencian en células mesodérmicas. Vale decir, adquieren un modo de evolución, dependiente de su nueva posición, que no hubieran podido exhibir en su ubicación original. Estos resultados muestran que las células de diferentes regiones, aunque poseen diferentes destinos, comparten parte de su potencia evolutiva. Las regiones identificadas en el epiblasto fueron denominadas “territorios” presuntivos con la idea de enfatizar que no es en las células donde radican las diferencias que las llevan a migrar diferentemente, sino en los lugares que ocupan dentro del epiblasto. Este tipo de resultados ha permitido postular que: a) El comportamiento migratorio de las células epiblásticas es una propiedad dependiente de posición y no de diferencias intrínsecas entre células. Vale decir, las diferencias radican en el “lugar” que ocupan las células. b) Las células de algunos TP son equipotentes. Es decir, no están determinadas a originar los derivados típicos del TP que ocupan sino que comparten su potencia con células de otros territorios. c) El hecho de que las células de un TP originen típicamente ciertos derivados se debería a que, al ocupar un cierto TP, realizan los desplazamientos típicos de éste, finalizan la gastrulación en un cierto lugar y allí se determinan en relación con los estímulos que reciban. Cuando las células son trasplantadas a otro TP, siguen otro camino, se detienen en otro sitio, reciben estímulos determinantes distintos y se diferencian en los tejidos embrionarios correspondientes al TP al cual fueron trasplantadas. La noción de equipotencia de los TP, extraída de las experiencias de trasplante de células de TP, es aplicable sólo a aquellas poblaciones celulares cuya función es estructural. Se trata de la potencia para originar diferentes tipos celulares. Cuando se trata de TP de estructuras axiles, como el TP de la notocorda, cuyo papel es de carácter informativo y sirve como sistema de referencia que organiza en torno suyo a los demás tejidos embrionarios, las conclusiones de los experimentos de trasplante no son comparables. El nódulo de Hensen, dado su carácter de organizador, cumple dicha función en cualquier lugar en se halle. Desde el punto de vista teórico podría decirse que la notocorda no puede ser cambiada de lugar pues, ejerciendo sus células el rol de sistema de referencia para todas las demás, cualquiera sea el lugar que ocupe opera como organizador y punto de referencia que especifica el lugar de los restantes territorios. Así, el concepto de TP enfatiza la idea de propiedad dependiente de posición; jerarquiza la idea de “lugar” o “dominio” que ocupan las células, antes que las células mismas. De ahí la designación de “territorio de…” en lugar de “población celular precursora de…”. Los desplazamientos, y otros CCD, que realizan las células durante la gastrulación dependen de fenómenos de control que operan, por un lado, en el dominio del tiempo y, por otro, en el del espacio. Éstos últimos dependen de las características de la matriz extracelular que rodea a las células y de las señales que a través de ella difunden desde las poblaciones celulares organizadoras. La hipótesis más aceptada para explicar la asimetría en la fuerza interfacial célula-sustrato (Fif c-s) necesaria para toda migración celular dirigida es la distribución asimétrica (en forma de gradientes temporales y/o espaciales) de los componentes macromoleculares de la matriz extracelular que median la adhesión (SC 2.11.

Comportamientos moleculares involucrados en la migración celular dirigida; SC El concepto de migración celular dirigida. Papel de desarrollo. El concepto de haptotaxis. Papel del citoesqueleto y de la fuerzas interfaciales célula-sustrato (Fif c-s); SC Características de la célula migratoria. Los sitios de adhesión célulasustrato son también dispositivos para sensar el ambiente; SC 0.20. La intensidad de la fuerza interfacial célulamatriz extracelular participa en la regulación de la forma celular y la migración celular). Con respecto a cómo podría controlarse la gastrulación en el dominio del tiempo, se ha postulado que el proceso estaría regulado por un control temporal de (a) la aparición de la capacidad migratoria y (b) la aparición de moléculas de adhesión en la matriz extracelular: (a) Lo primero se basa en que, en algunas especies (anfibios), se ha visto que las células embrionarias disociadas y cultivadas desde antes de que se inicie la gastrulación (estado pregastrular) se mantienen inmóviles hasta el momento que correspondería al inicio de la gastrulación. En ese momento, las células disociadas y cultivadas adquieren capacidad migratoria. Este resultado sugiere que en el estado pregastrular las células ya estaban programadas para iniciar desplazamientos en el momento de la gastrulación. En dichas condiciones experimentales, los desplazamientos que realizan las células son desorganizados pues se encuentran en un medio de cultivo en el que no existe una organización espacial definida del sustrato. (b) Lo segundo está avalado por el hecho de que observaciones realizadas en embriones de diversas especies muestran una distribución regional característica de moléculas de la matriz extracelular respecto de las cuales las células poseen en general alta afinidad (laminina, fibronectina, etc.). La distribución que algunas de ellas exhiben sugiere que existen variaciones temporales y espaciales que podrían instalar los gradientes en la intensidad de las Fif c-s de adhesión necesarios para guiar los movimientos celulares. Por otro lado, además de encontrarse en el lugar adecuado, aparecen y desaparecen de esas regiones según patrones cronológicos coherentes con los de los movimientos celulares. Así, se ha postulado que las células seguirían “corredores” marcados por las moléculas de la matriz extracelular. Los avances biotecnológicos permiten en la actualidad generar medios de cultivo con sustratos de composición química definida y distribuidos en el espacio en forma de corredores. En estas condiciones se constata que las células migratorias transitan preferentemente a través de los corredores ocupados por macromoléculas que estimulan la migración. Pese a la dificultad en compatibilizar todos los datos presentados, desde el punto de vista didáctico, podría elaborarse un concepto de TP que integre las siguientes pautas: Un territorio presuntivo… a) Corresponde a un dominio o lugar del epiblasto pregastrular… b) …ocupado o integrado por células con capacidad migratoria c) Los TP son equipotentes desde el punto de vista citogenético e histogenético, … d) …vale decir, poseen grados de determinación similares e) Los TP realizan desplazamientos en forma integrada: sincronizados en el tiempo y ordenados en el espacio y… f) …exhiben patrones de desplazamiento típicos y constantes para cada especie y para cada TP, por lo cual, g) …concluyen sus desplazamientos en diferentes regiones del embrión postgastrular

h) En sus lugares definitivos en el embrión trilaminar sufren diferentes fenómenos de determinación dependientes de las señales determinantes que reciben en cada una de dichas regiones. Estas señales pueden ser moléculas solubles, componentes de la matriz extracelular, o moléculas expuestas en la superficie de otras células. (*) Se denomina marcación o tinción supravital al procedimiento que permite marcar y visualizar a una célula sin comprometer su sobrevida ni su comportamiento de desarrollo. Permiten el seguimiento de células embrionarias o sus descendientes en función del espacio y/o del tiempo.

Bibliografía Hatada Y, Stern CD. (1994). A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120(10):2879-89. Jacobson CO. (1959). The localization of the presumptive cerebral regions in the neural plate of the axoloti larva. J Embryol Exp Morphol. 7(1):1-21. Vogt W. (1925). Gestaltungsanalyse am Amphibienkeim mit ortlicher Vitalfarbung. I. Methodik und Wirkungsweise der ortlichen Vitalfarbung mit Agar als Farbtrager. Roux Arch Entw-Mech Organ. 106, 542-610. SC 2.11. Comportamientos moleculares involucrados en la migración celular dirigida. V. Flores Se denominan procesos de migración celular dirigidos aquellos en los que las células se desplazan siguiendo trayectos preferenciales instalados por las condiciones fisicoquímicas del medio en el que se desplazan. En este tipo de migración celular, los vectores de desplazamiento instantáneos correspondientes a las diferentes direcciones del espacio no poseen la misma probabilidad y ello se debe a que el medio se encuentra espacialmente organizado. Tal organización, en general, consiste en la distribución asimétrica de moléculas que influyen sobre el desplazamiento. Como en el caso de cualquier proceso de migración se requieren a) moléculas del citoesqueleto con capacidad de generar fuerzas mecánicas que produzcan deformaciones de la superficie celular como, por ejemplo, filamentos de actina, proteínas asociadas para generar fascículos paralelos separados por una distancia óptima, miosina-II, etc. La emisión de seudopodios, filipodios o membranas ondulantes constituye una deformación y requiere la operación de fuerzas. Las bicapas lipídicas de la membrana plasmática no poseen la capacidad de producir presiones ni generar tensiones que puedan producir deformaciones de la célula y menos aún desplazamientos pues, desde el punto de vista físico, constituyen un fluido. En consecuencia, las células migrantes poseen sitios de membrana especializados que consisten en grandes b) complejos macromoleculares denominados contactos focales. En los contactos focales, las fuerzas generadas internamente pueden ser transmitidas al exterior puesto que poseen, entre sus componentes, c) algunas proteínas (vinculina, α-actinina, talina, filamina) que los vinculan fuertemente con el citoesqueleto y d) proteínas que poseen alta afinidad por componentes de la matriz extracelular (integrinas). Así, los “contactos focales” se anclan, por un lado, al citoesqueleto y, por otro, a la matriz extracelular y operan como puntos de apoyo para la operación de fuerzas de tracción. Las células migratorias también poseen en su superficie e) proteínas receptor (FGFR, PDGFR, VEGFR, etc.) que los habilitan a detectar proteínas señal del medio que estimulan o regulan la migración (como factores quimiotácticos, factores de crecimiento, etc.) y, además, f) proteínas asociadas a receptores (quinasa de adhesión focal (FAK), quinasa Src), que inician las vías de señalización intracelular involucradas en las remodelaciones del citoesqueleto necesarios para la migración.

Con respecto a las moléculas del entorno involucradas en el control de la dirección del movimiento, habitualmente existen g) moléculas que son componentes fijos de la matriz extracelular; estas moléculas conforman una fase sólida capaz de operar como puntos de apoyo para las fuerzas de tracción necesarias para el desplazamiento; las zonas del embrión que expresan estas moléculas son fácilmente invadidas por ciertas células migrantes. También existen h) moléculas de la matriz extracelular y de las células que producen el efecto inverso, vale decir, moléculas que evitan que las células puedan adherirse a la matriz extracelular y que esta pueda servir de apoyo para la migración. Las zonas del embrión en las que estas moléculas se expresan no pueden funcionar como sustrato para la migración y, en consecuencia, las células no ingresan en ellas. Sirven como moléculas de exclusión de ciertos tipos celulares migratorios. También existen moléculas intracelulares que participan en la reorganización del citoesqueleto necesarias para la migración, como por ejemplo las proteínas nucleadoras que integran el complejo Arp2/3 (Actin Related Proteins); las proteínas que se unen a las subunidades libres de actina como las proteínas timosina y profilina; proteínas que se unen lateralmente a los filamentos de actina y modifican su estabilidad, como la proteína gelsolina y otras que regulan el ensamblado del citoesqueleto de actina. Los procesos de migración celular habitualmente se acompañan de proliferación celular que permite la amplificación de la población celular migratoria. Ello se debe a que normalmente, durante el proceso de migración, el sistema global se expande y el número de células migratorias que parten de un cierto sitio no necesariamente es similar al número de células que llegan a destino. Generalmente, cuando se trata de largos recorridos, las células migratorias que llegan a destino no son las que partieron sino descendientes de ellas. Este proceso de amplificación de células migrantes también está sometido a control. En general existen moléculas señal que operan como i) factores de mantenimiento o j) factores que estimulan la proliferación (factores de crecimiento) a lo largo de las vías migratorias con sentido biológico para una cierta población celular. De esta forma las células que van por el camino correcto son mantenidas y amplificadas. Por el contrario, las que equivocan el camino no son estimuladas a proliferar ni mantenidas. Ingresan a la vía apoptótica y desaparecen. Otro mecanismo tendiente a garantizar que la mayor parte de las células migratorias llegue a destino y/o no equivoquen el camino es la secreción de k) proteínas señal quimiotáctica. Si las células localizadas en la zona de destino final de las células migratorias secretan una señal quimiotáctica, ello genera una mayor probabilidad de que las células lleguen al destino correcto. Por otro lado, una población celular migratoria no necesariamente mantiene sus propiedades o capacidades de desarrollo a lo largo de todo el proceso migratorio. Frecuentemente a lo largo de la vía migratoria que recorren realizan Int c-c con otras poblaciones celulares y éstas pueden modificar sus propiedades de desarrollo. Tanto es así que existen ejemplos de cambios en el grado de determinación de las células migratorias que ocurren entre el momento en que salen del punto de partida y el momento en que llegan a destino. También existen ejemplos, aunque distintos, que ilustran el mismo concepto. Hay células migratorias que, poseyendo un punto de partida común, en el momento de partir poseen similar grado de determinación. Pero si esas células poseen dos vías migratorias posibles, las que siguen una de ellas sufren una determinación diferente de la que sufren las que siguen la otra vía. Todos estos hechos muestran que la migración celular, al igual que otros CCD, se ejecuta y regula epigenéticamente, (interactivamente) y que en buena medida depende de las condiciones fisicoquímicas del ambiente en el que las células se hallen. Estas características pueden cambiar en función del tiempo, para el caso de las células no migratorias, pero también cambian en función del espacio (o de la posición que ocupan en cada momento) para el caso de las poblaciones celulares migratorias.

Bibliografía Ballestrem C, Wehrle-Haller B, Hinz B, Imhof BA. (2000) Actin-dependent lamellipodia

formation and microtubule-dependent tail retraction control-directed cell migration. Mol Biol Cell. 11(9):2999-3012. Suetsugu S, Miki H, Takenawa T. (2002). Spatial and temporal regulation of actin polymerization for cytoskeleton formation through Arp2/3 complex and WASP/WAVE proteins". Cell Motil Cytoskeleton. 51(3):113-22. SC 2.12. El concepto de migración celular dirigida. Papel de desarrollo. El concepto de haptotaxis. Papel del citoesqueleto y de las fuerzas interfaciales célula-sustrato (Fif c-s). V. Flores La migración celular dirigida es un CCD que se ejecuta interactivamente con la matriz extracelular y señales difusibles. Consiste en un desplazamiento o cambio de posición a) activo –mediado por la operación de fuerzas generadas por las células migratorias y fuerzas de adhesión interfaciales entre células y matriz extracelular o sustrato (Fif c-s)– en el que b) las posibles direcciones de los vectores instantáneos de desplazamiento no poseen similar probabilidad. La función de densidad de probabilidades de los valores de los ángulos que definen las direcciones de los vectores de desplazamientos instantáneos no corresponde a una distribución uniforme ni gaussiana y las series numéricas temporales que representan los cambios de posición no corresponden a movimiento browniano estándar sino a otro tipo de procesos estocásticos denominados correlacionados o con memoria. Esto significa que existen factores que instalan correlaciones entre dichos valores y hacen que el proceso no sea de tipo browniano estándar. Desde el punto de vista teórico, el único modo de definir la migración es como cambio de posición y éste sólo puede ser registrado con precisión cuando se establece un sistema de referencia formal. La migración celular dirigida es un CCD que se ejecuta interactivamente con la matriz extracelular y señales difusibles. Consiste en un desplazamiento o cambio de posición a) activo –mediado por la operación de fuerzas generadas por las células migratorias y fuerzas de adhesión interfaciales entre células y matriz extracelular o sustrato (Fif c-s)– en el que b) las posibles direcciones de los vectores instantáneos de desplazamiento no poseen similar probabilidad. La gastrulación es uno de los eventos del desarrollo que más claramente revela los diferentes roles de desarrollo que puede poseer la migración celular. Ilustra cómo los desplazamientos celulares pueden a) poseer rol morfogenético produciendo cambios de forma, b) modificar la organización espacial de un sistema, c) facilitar la ocurrencia de Int c-c y cómo éstas, a su vez, pueden d) incrementar la complejidad introduciendo mayor diversidad celular. La migración celular consiste, esencialmente, en el movimiento de una célula sobre un material biológico suficientemente rígido como para actuar como apoyo o sustrato para la operación de fuerzas. Al respecto, es posible plantear dos generalizaciones básicas aplicables a toda célula con capacidad migratoria: a) Debe poseer actividad contráctil y ser capaz de realizar cambios de forma con la producción de prolongaciones celulares (aplanadas: lamelipodios; o cilíndricas: seudopodios, filipodios). Estas dos características dependen de modo fundamental de la capacidad de remodelar rápidamente el citoesqueleto y generar fuerzas de intensidad suficiente para producir el cambio de forma celular y para el movimiento. b) Debe ser capaz de adherirse al sustrato sobre el cual migra. Esta capacidad debe ser regulada o modulada. La célula debe ser capaz de adherirse pero además de despegarse y volver a adherirse en algún punto que se encuentra más adelante en la dirección del movimiento (SC El concepto de migración celular dirigida. Papel de desarrollo. El concepto de haptotaxis. Papel del citoesqueleto y de la fuerzas interfaciales célulasustrato [Fif c-s]).

Para el caso de los movimientos celulares con papel morfogenético, a estas dos generalizaciones cabría agregar una tercera referida a que aquéllos deben cumplirse integradamente con otros fenómenos. Vale decir, deben estar sujetos a algún tipo de control temporal y espacial. Se han descrito muchos CMD involucrados en la regulación de la migración celular dirigida (SC 2.11 Comportamientos moleculares involucrados en la migración celular dirigida). La mayoría de estos CMD corresponden a interacciones denominadas genéricamente interacciones célula-matriz extracelular (Int c-mec) o célula-sustrato (Int c-s) que poseen como base molecular a) la interacción entre componentes macromoleculares pertenecientes a las dos superficies interactuantes (la superficie externa de la membrana plasmática y la matriz extracelular) y b) las proteínas difusibles que operan como señal (agentes quimiotácticos), o como factores de crecimiento y mantenimiento para las células migratorias, proteínas enzimáticas (sus activadores e inhibidores) que procesan la matriz extracelular y que pueden estar tanto en forma libre o adheridos a las superficies mencionadas. La idea de que la migración celular puede ser resultado de la acción de fuerzas interfaciales entre la célula y el sustrato (Fif c-s), fenómeno llamado haptotaxis, data de muchos años. Esta noción proviene de la Física pero ha sido modificada y enriquecida a partir de estudios sobre la dinámica de la membrana plasmática durante la migración, la estructura del citoesqueleto y la composición macromolecular de la superficie celular y de la matriz extracelular. La idea básica del concepto de haptotaxis se basó en la hipótesis de que la energía necesaria para producir el movimiento es resultado de la operación de Fif c-s de atracción. De acuerdo con esta concepción, el desplazamiento real de una célula sería un fenómeno fundamentalmente pasivo. Diversos estudios sobre migración dirigida permiten plantear el concepto de haptotaxis de un modo más amplio. Se sabe que las células migratorias se adhieren al sustrato y que desarrollan respecto de éste una Fif c-s medible experimentalmente. La intensidad de la Fif c-s depende de la existencia, en la superficie de la membrana plasmática, de moléculas específicas que poseen fuerte afinidad por componentes macromoleculares específicos de la matriz extracelular. La Fif c-s de atracción puede ser biológicamente definida como resultado de “afinidades específicas” entre grupos moleculares pertenecientes a ambas superficies. Sin embargo, no se considera que la Fif c-s genere la fuerza necesaria para el movimiento. Numerosos estudios de la dinámica de la membrana plasmática del frente de avance de células migratorias muestran una intensa actividad con producción de prolongaciones celulares (lamelipodios, seudopodios, filipodios), a veces muy ramificadas, que se extienden, realizan movimientos exploratorios de barrido sobre el sustrato, se fijan a ciertos puntos de éste y se adhieren o, por el contrario, no se fijan y se retraen. Varios estudios ultraestructurales y moleculares sobre la dinámica del citoesqueleto indican que éste es el elemento responsable tanto de la emisión como de la retracción de las prolongaciones celulares. Con el objeto de ilustrar qué papel corresponde al citoesqueleto (emisión y retracción de seudopodios y contractilidad citoplasmática) y qué papel corresponde a la Fif c-s (adhesividad por el sustrato), analicemos un ejemplo simplificado (Fig. SC 2-12-1). Consideremos una célula migratoria ubicada en la región 2 que tiene la posibilidad de emitir seudopodios distribuidos al azar sobre las regiones circundantes 1 y 3. Desde el punto de vista teórico, esto implica que los valores de los ángulos (respecto del eje x) de las rectas que unen el centro de la célula con los puntos extremos de los seudopodios poseerán una función de densidad de probabilidades uniforme. Vale decir, los puntos de emisión y los ejes de crecimiento de seudopodios tendrán distribución isotrópica (similar probabilidad en todas las direcciones del espacio). Supongamos a continuación que la intensidad de la Fif c-s es mayor en la región 3 que en las regiones 1 y 2. Cuando los seudopodios que hayan tomado contactos en dichas regiones se retraigan, aun cuando las fuerzas generadas por la retracción de los seudopodios posean una distribución isométrica, la célula tenderá a despegarse de las regiones 1 y 2 y tenderá a desplazarse hacia la región 3.

Fig.SC 2-12-1. Modelo simplificado que ilustra cómo la asimetría espacial en la intensidad de la Fif célula-sustrato puede dirigir el movimiento celular, aun cuando la probabilidad de emitir seudopódos esté uniformemente distribuida en el espacio. (Descripción en el texto). Bibliografía Carter SB. (1967). Haptotaxis and the Mechanism of Cell Motility. Nature. 213:256-60. Cattaruzza S, Perris R. (2005). Proteoglycan control of cell movement during wound healing and cancer spreading. Matrix Biol. 24(6): 400-17. Links http://labs.bio.unc.edu/harris/Courses/biol104/wrinkles2.mov http://labs.bio.unc.edu/harris/Courses/biol104/wrinkles.mov SC 2.13. El papel de la polaridad planar y de la intercalación celular en la formación de la línea primitiva. N. Fosser La línea primitiva es un conglomerado de células epiblásticas y el primer signo del inicio de la gastrulación. Aparece en la zona caudal del disco embrionario y luego incrementa su longitud en sentido cefálico.

En el blastodermo de pollo, previamente al inicio de la formación de la línea primitiva, las células realizan extensivos movimientos conocidos como de “polonesa” (SC 2.14 La transformación de ejes desde la fase pregastrular a la organización del embrión cilíndrico). Estos movimientos son interpretados como reorganizaciones celulares en el contexto de un tejido epitelial con polaridad celular planar (PCP). Entre las consecuencias de estos movimientos pregastrulares se encuentra la formación de la línea primitiva. Sin embargo, poco se sabe sobre los comportamientos celulares involucrados en su formación. Las hipótesis propuestas para explicar la morfogénesis de la línea primitiva se centraban en la proliferación celular y el reclutamiento por quimiotaxis. Sin embargo, la duración de los ciclos celulares es mayor que el tiempo que insume la formación de la línea primitiva. Con respecto a los factores quimiotácticos que podrían guiar a las células, no se ha encontrado aún ninguno que permita explicar acabadamente los fenómenos que llevan a la aparición de la línea primitiva. Recientemente, el uso de técnicas que permiten seguir a células individuales ha permitido registrar sus cambios de posición y sus trayectorias en el epiblasto durante los instantes previos al inicio de la gastrulación. Durante la polonesa epiblástica, las células convergen hacia la línea media en la zona caudal del disco (Fig. SC 2-13-1). En la zona medial donde se origina la línea primitiva, las células que convergen desde las mitades derecha e izquierda del disco se intercalan unas con otras, mientras que las que se encuentran por fuera de esta zona, no presentan este comportamiento. Esta intercalación de células epiblásticas explica la extensión por convergencia de la línea primitiva en sus orígenes. La zona del epiblasto donde estos comportamientos celulares se inician coincide con la zona de la hoja inferior en donde se inicia la formación del hipoblasto.

Fig. SC 2-13-1. Convergencia e intercalación de células epiblásticas durante la formación de la línea primitiva. A. Movimientos pregastrulares (polonesa) de células epiblásticas. B. Ilustra la convergencia e intercalación de células que deriva en la formación de la línea

primitiva. C-E. Detalle que muestra cómo se produce la intercalación de células en la línea media. Los experimentos de rotación planar del hipoblasto (rotación en el plano de la hoja sin invertir la posición de sus caras “dorsal y ventral”) producen alteraciones morfológicas de la línea primitiva y expresión ectópica de moléculas relacionadas con las vías de señalización involucradas en la PCP. Para comprobar si estas vías son importantes en la intercalación observada durante la formación de la línea primitiva, se realizaron experimentos de pérdida de función. Los resultados mostraron que estas vías son esenciales para la formación de la línea primitiva, por lo que se concluye que la PCP es requerida para los movimientos de polonesa y los movimientos de intercalación que dan origen a la línea primitiva.

Bibliografía Voiculescu O, Bertocchini F, Wolpert L, Keller RE, Stern CD. (2007). The amniote primitive streak is defined by epithelial cell intercalation before gastrulation. Nature. 449(7165):1049-52. Bénazéraf B, Pourquié O. (2008). Developmental biology: cell intercalation one step beyond. Curr Biol. 18(3):R119-21. SC 2.14. La transformación de ejes desde la fase pregastrular a la organización del embrión cilíndrico. N. Fosser Previamente a la formación de la línea primitiva, las células del epiblasto de los embriones amniotas realizan movimientos conocidos como “polonesa” o pregastrulares. Éstos pueden descomponerse, a su vez, en dos: a) el primero lo realizan células que convergen hacia la línea media, siguiendo el borde posterior del disco bilaminar; y recorren un camino adyacente a la hoz de Koller; b) el segundo es un movimiento de elongación hacia el extremo cefálico, a lo largo de la zona medial del disco embrionario; este movimiento es realizado por las células que, luego de converger, llegan a la zona medial. Un movimiento similar realizan las células de la hoja ventral del disco, el hipoblasto. Este segundo movimiento coincide con el surgimiento y extensión de la línea primitiva. Numerosos estudios han permitido la construcción de mapas de especificación y de destino de las células epiblásticas que muestran aspectos llamativos de su organización previa a la formación de la línea primitiva. Así pudo definirse que las células que originalmente se encuentran en la zona cefálica y lateral del disco quedan en posición posterior y medial al término de los movimientos de polonesa. Por otra parte, las células que lideran el movimiento de elongación a lo largo de la zona medial tendrán como lugar definitivo una posición cefálica al extremo anterior de la línea primitiva y tendrán destino “dorsal” (placa neural, ectodermo epidérmico, organizador y sus derivados). Las “rezagadas” que siguen a las líderes, pero quedan en posiciones caudales a las primeras tendrán un destino “ventral” (meso-endodermo) (Fig. SC 2-14-1).

Fig. SC 2-14-1. Esquemas que ilustran la ubicación aproximada de los diferentes territorios presuntivos de poblaciones celulares mesodérmicas (rosa) y neurales (gris) en embriones pregastrulares de edad creciente. Al finalizar los movimientos pregastrulares, los territorios

de poblaciones celulares que luego de la gastrulación ocuparán posiciones dorsales se hallan en posición “cefálica” al organizador; los territorios de poblaciones celulares que luego de la gastrulación ocuparán regiones ventrales se hallan en posición “caudal”. El asterisco (*) marca la posición del extremo cefálico de la línea primitiva. Estos resultados muestran que la descripción de la organización del embrión bilaminar pregastrular, en términos de una hoja dorsal y una ventral, no describe fielmente el destino futuro de las células que lo componen. Las células que luego de la gastrulación adoptarán posiciones dorsales y ventrales se hallan todas en el plano del epiblasto: las futuras células dorsales, en posición “cefálica” al futuro organizador, y las futuras células ventrales, “caudales” a él. Así, en el caso del embrión bilaminar, el uso de los términos dorsal y ventral, para aludir a sus dos hojas, no tiene el mismo sentido que cuando se los usa para describir la organización anatómica básica que se alcanza más tarde. Resulta claro que las poblaciones celulares que conformarán estos ejes embrionarios no se encuentran presentes sino hasta que se haya avanzado en los movimientos gastrulares y luego, durante la regresión caudal de la línea primitiva y el nodo. Incluso luego del plegamiento embrionario, las poblaciones celulares mencionadas como dorsales y ventrales no dan encarnadura al eje dorso-ventral anatómico, sino a la polaridad representada por los tejidos que actúan en la vida vegetativa (internos, endo, dentro) y los de vida de relación (externos, ecto, fuera).

Bibliografía Foley AC, Skromne I, Stern CD. (2000). Reconciling different models of forebrain induction and patterning: a dual role for the hypoblast. Development. 127(17):3839-54. Chuai M, Zeng W, Yang X, Boychenko V, Glazier JA, Weijer CJ. (2006). Cell movement during chick primitive streak formation. Dev Biol. 296(1):137-49. -Hatada Y, Stern CD. (1994). A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120(10):2879-89. Links Videos que ilustran los movimientos pregastrulares. Véase Apéndice A en Chuai y cols., 2006. SC 2.15. El papel del hipoblasto en la gastrulación y en la inducción neural. N. Fosser El hipoblasto es la hoja “ventral” (o “inferior”, de ahí el uso del prefijo “hipo” en su designación) del disco embrionario bilaminar pregastrular de las aves. La mayoría de sus células tienen un destino extraembrionario. Es considerada una población celular homóloga al endodermo visceral de los embriones de ratones y roedores. Las interacciones recíprocas entre el epiblasto y el hipoblasto han sido investigadas desde hace largo tiempo. En el año 1933, C. Waddington informó que la rotación planar del hipoblasto (rotación en el plano de la hoja sin invertir la posición de sus caras “dorsal y ventral”) producía alteraciones morfológicas de la línea primitiva. Más recientemente se observó que a) la eliminación del hipoblasto tiene como resultado la formación de varias líneas primitivas; además, b) durante el desarrollo, el hipoblasto es reemplazado, desde el extremo “caudal” hacia el cefálico del disco embrionario, por otro tejido extraembrionario conocido como endoblasto o hipoblasto secundario. El desplazamiento, en sentido cefálico, de las células hipoblásticas, debido a la ocupación de la

región caudal de la hoja ventral por el endoblasto, coincide temporal y espacialmente con la aparición de la línea primitiva en el epiblasto. Los dos hechos mencionados sugieren que el hipoblasto tiene un efecto inhibitorio sobre la formación de la línea primitiva. Algunos estudios en los que se silencia o sobreexpresa en forma ectópica la proteína de secreción Cerberus (un antagonista de la proteína señal Nodal, expresada en el epiblasto) sugieren que la proteína Cerberus producida por el hipoblasto está involucrada en la inhibición de la formación del surco primitivo. El desplazamiento en sentido cefálico del hipoblasto por parte del endoblasto libera al epiblasto de esta acción inhibitoria y, además, provee un control temporoespacial del proceso de formación de la línea primitiva/surco primitivo. La proteína Cerberus tiene tres sitios de unión o “cabezas” (de ahí su designación “Cerberus”) con papeles de desarrollo que antagonizan a las proteínas señal Nodal, Wnt y Bmp. Estos sitios de unión fijan a las tres proteínas, impiden la unión a sus respectivos receptores e inhiben sus correspondientes vías de señalización. Las moléculas señaladas participan en general, entre otros procesos, en estimular la formación del surco primitivo, de la notocorda y otras poblaciones que participan en el desarrollo de las regiones caudales del tubo neural (cerebro posterior y médula) y del tronco. Así, la expresión de la proteína Cerberus contribuye a inhibir el desarrollo de estructuras troncales y estimular el desarrollo de estructuras cefálicas. Todos estos fenómenos ocurren tempranamente, durante la gastrulación (Fig. SC 2-15-1).

Fig. SC 2-15-1. Modelo de interacciones celulares durante las etapas tempranas de la gastrulación. Se ilustra la mitad izquierda de discos embrionarios de edades crecientes. Caudal a la derecha. A. En estados tempranos, el hipoblasto secreta Fgf8, que promueve la expresión transitoria de los factores de transcripción proneurales Erni y Sox3, y Cerberus, que inhibe la acción de Nodal, que se secreta en el epiblasto caudal. B. El hipoblasto comienza a ser desplazado por el endoblasto desde la región caudal. En la región del

epiblasto suprayacente, Nodal actúa sinérgicamente con Fgf8 y promueve la expresión de Brachyury (Bra) y Tbx6l, que promueven la formación de la línea primitiva. C. La estimulación del epiblasto por Fgf8 por un tiempo prolongado promueve la expresión de Churchill en el epiblasto. D. Churchill promueve la expresión de Sip1, que inhibe la expresión de Bra y Tbx6L en la región cefálica del surco primitivo inhibiendo el ingreso. Las células epiblásticas adyacentes al organizador formarán la placa del piso. La gastrulación consiste, básicamente, en una reorganización de las células del embrión. Durante su desarrollo, parte de ellas abandona la hoja dorsal merced a una T e-m y ulterior migración. Si la T e-m no estuviera sometida a regulación, el desarrollo podría alterarse por la excesiva pérdida de células epiblásticas, necesarias también para la generación del sistema nervioso.

El desplazamiento del hipoblasto hacia el extremo cefálico del disco embrionario permite la generación de dos zonas en el epiblasto: una caudal donde la Te-m es posible (surco primitivo) y otra cefálica donde conserva su morfología epitelial. En esta última zona, el hipoblasto, a través de la secreción de la proteína señal FGF, promueve la expresión temprana y transitoria de ciertas proteínas factores de transcripción preneurales Erni, Sox3, Otx2 y otras que llevan al tejido a un estado precerebro anterior (preprosencefálico). La inducción neural es un proceso multipasos en el que el hipoblasto tiene un papel destacado mediado por la estimulación de la expresión transitoria de las proteínas mencionadas anteriormente. La adquisición del carácter neural requiere, además, acciones ulteriores que tienen carácter de “estabilizantes”, provenientes de poblaciones celulares nodales y sus derivados (mesodermo precordal, notocorda).

Bibliografía Stern CD, Downs KM. (2012). The hypoblast (visceral endoderm): an evo-devo perspective. Development. 139(6):1059-69. Stern CD. (2005). Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132(9):2007-21. Bertocchini F, Stern CD. (2002). The hypoblast of the chick embryo positions the primitive streak by antagonizing nodal signaling. Dev Cell. 3(5):735-44. SC 2.16. La secuencia de polaridades que aparecen desde la fecundación al embrión posgastrular. La importancia de tales polaridades en la organización espacial de tipos celulares emergentes. V. Flores El progreso del desarrollo embrionario desde la formación de la CH hasta la formación del embrión trilaminar posgastrular, denominado período presomítico, implica una sucesión ordenada de eventos que conducen al establecimiento de a) sucesivas asimetrías o polaridades que sirven como marco de referencia para el establecimiento de b) varias líneas celulares determinadas y espacialmente organizadas con respecto a los ejes de las polaridades mencionadas. Ambos fenómenos (a: aparición de nuevos ejes de referencia y b: aparición de nuevos tipos celulares) derivan epigenéticamente de la polaridad original “impresa en”, o “representada por”, la organización espacial de las moléculas informativas presentes en la célula huevo. Ambos fenómenos resultan de una sucesión temporal y espacialmente organizada de CCD y CMD. La figura SC 2-161, ilustra las diversas polaridades (a veces denominadas ejes) que aparecen durante el período de tiempo considerado.

Fig. SC 2-16-1. Representación esquemática de la morfología de las diferentes etapas del desarrollo temprano del embrión de ratón desde la fecundación hasta la formación del cilindro embrionario (embrión de inicio de gastrulación). Las flechas representan las sucesivas polaridades que aparecen durante este período del desarrollo. Entre paréntesis se específica la edad de desarrollo (DD: días de desarrollo embrionario). En la barra de colores (parte inferior del panel) se presenta el código de colores con el que se representa la derivación de tipos celulares a partir de la CH y las blastómeras indeterminadas. Los eventos del desarrollo temprano ocurren diferentemente en especies de diferente complejidad. En invertebrados y vertebrados “inferiores”, la polaridad inicial (eje animal-vegetativo) y la aparición de los primeros tipos celulares están ya establecidas en la organización del ovocito. Éste contiene determinantes citoplasmáticos cuyas distribuciones espaciales asimétricas (polaridad) especifican los ejes o direcciones del espacio a lo largo de los cuales se organizan los tipos celulares que inicialmente derivan de la célula huevo. El resto del desarrollo ocurre como consecuencia de interacciones epigenéticas entre los tipos celulares tempranamente formados. En los mamíferos, sin embargo, el desarrollo es más plástico, y no está definitivamente aceptado que a) la posición del segundo cuerpo polar (tomado como indicio estructural que marca la posición del polo meiótico) y b) el sitio de entrada del espermatozoide condicionen, o determinen, el comportamiento proliferativo o el

destino de las blastómeras resultantes de la segmentación. Algunas experiencias realizadas en embriones de ratón tienen resultados no siempre compatibles (SC ¿Requiere la emergencia de la polaridad “interior-exterrior” de la mórula o la generación del eje “embrionario-abembrionario” una organización previa (prepattern) de la CH?) y no existe consenso acerca de la existencia de relaciones causales en la siguiente sucesión de hechos: 1) Si (a) la polaridad inicial del ovocito o eje meiótico (homólogo al eje animal-vegetativo de los invertebrados y vertebrados “inferiores”) tiene un efecto directivo sobre el establecimiento del eje embrionario-abembrionario del blastocisto. 2) Si (b) la existencia de un eje meiótico tiene un efecto determinante con respecto a la asimetría estructural y molecular del embrioblasto. 3) Si (c) la asimetría estructural y/o molecular del embrioblasto determinan la polaridad del endodermo visceral del polo distal (endodermo visceral distal: Dve) en el embrión pregastrular. 4) Si (d) la asimetría del Dve determina su desplazamiento hacia el futuro extremo cefálico y su transformación en Ave en el inicio de la gastrulación. 5) Si (e) la polaridad instalada por el desplazamiento del Ave finalmente determina la polaridad céfalocaudal del embrión trilaminar posgastrular. La idea de la existencia de una organización citoplasmática preestablecida (“prepattern”) de la que podría derivar la sucesión de hechos mencionados, sumada a la idea de una distribución asimétrica de tendencias de desarrollo en las dos primeras blastómeras, es cuestionada por quienes enfatizan el carácter plástico y altamente regulativo del desarrollo temprano de los mamíferos. Así, algunos consideran aventurado establecer una relación lineal entre asimetrías observables en el ovocito y el establecimiento de los ejes que definen el plan estructural del embrión trilaminar posgastrular. Se argumenta que este último es, a todas luces, bastante más complejo de lo que podría especificarse por medio del eje meiótico de un huevo de regulación. Esta objeción, sin embargo, es débil en el contexto de la embriología moderna que plantea que la derivación de formas de organización complejas a partir de otras más simples es, precisamente, la clave de la epigénesis. En general existe acuerdo con respecto a la idea de que, en embriones de ave y de ratón, la polaridad que precede, y de la que deriva, el eje céfalo-caudal es establecida epigenéticamente, en etapa pregastrular. Existe consenso acerca de que tal polaridad es instalada mediante señales generadas por células extraembrionarias que poseen una ubicación excéntrica respecto del disco embrionario (hoz de Köller en el pollo y ectodermo extraembrionario –cono ectoplacentario‒ en el ratón). Algunos consideran que tal asimetría se instala tempranamente y posee manifestaciones estructurales ya durante la maduración del blastocisto (SC La transición entre la aparición del eje embrionario-abembrionario del blastocisto y la instalación de la polaridad céfalo-caudal del embrión gastrular). Vale decir, ya existiría una asimetría, precursora de la polaridad cefálocaudal, en el blastocisto preimplantatorio. El problema de la sucesión de los cinco hechos arriba mencionados se divide en dos aspectos centrales más generales: 1) cómo se llega de una célula huevo con organización aparentemente simétrica (esférica o, al menos, radiada) a una mórula con una polaridad exterior-interior y cómo se pasa de esta organización a la del blastocisto maduro que expresa una polaridad embrionaria-abembrionaria y 2) cómo la evolución del embrioblasto lleva a la constitución de un disco bilaminar con una polaridad epihipoblástica y una polaridad precursora de la polaridad céfalo-caudal del embrión posgastrular (SC La emergencia de polaridades desde la formación de la CH hasta la organización del embrión posgastrular. Manifestaciones estructurales y moleculares de organización asimétrica).

Con respecto al primer punto, existen modelos que proponen cómo se podrían establecer las diferencias moleculares que explican la aparición de dos vías evolutivas diferentes en la mórula: a) la vía de las células externas que lleva a la formación del trofoblasto y b) la vía evolutiva de las células internas que lleva a la formación del embrioblasto. Algunas revisiones críticas de conjuntos de datos colectados en las últimas décadas permiten proponer un modelo aleatorio de especificación de tipos celulares dependiente de a) la posición de las células en la mórula y de b) interacciones entre células. Algunos proponen que, pese a que puedan existir tendencias de desarrollo asimétricamente distribuidas en las dos primeras blastómeras, éstas pueden ser anuladas debido a las influencias de la posición y de las interacciones celulares. Clásicamente se ha considerado que las blastómeras del embrión de ratón son citogenéticamente equipotentes hasta el E8c y que durante los siguientes ciclo de segmentación –4.º y 5.º ciclo‒ se produce la primera determinación de vías evolutivas: la línea de células externas (trofoblasto) y la de células internas (embrioblasto) (SC 2.3. Procesos de diferenciación celular durante el período de segmentación. ¿Cómo se genera diversidad celular durante la segmentación?; SC 2.6. Comportamientos celulares involucrados en la primera determinación. En los mamíferos con sólo tres células se constituiría el embrioblasto). A continuación, las células del embrioblasto, en una segunda bifurcación, se determinarán en epiblasto e hipoblasto (endodermo primitivo) (SC La segunda determinación en los embriones de mamíferos). De estas tres poblaciones celulares, sólo la epiblástica retiene potencia para originar un embrión. Las otras originan tejidos no embrionarios pero desempeñan un papel importante en la generación de señales espacialmente organizadas que inician el patterning del disco embrionario pregastrular. La segregación de los dos tipos celulares mencionados es seguida de la organización de dichos tipos celulares en un blastocisto con asimetría estructural embrionaria-abembronaria. Ciertas experiencias destinadas a caracterizar los tipos celulares presentes en el blastocisto maduro permiten identificar células troncales embrionarias pluripotentes (las que abundan luego en el epiblasto), células troncales trofoblásticas y células troncales de endodermo primitivo (poseen características de endodermo primitivo o hipoblasto). Es interesante que las células troncales embrionarias pluripotentes tienen potencia suficiente para originar a las otras dos cuando son manipuladas experimentalmente de modo que alteren la expresión de algunos factores de transcripción.

Bibliografía Rossant J, Tam PPL. (2009). Blastocyst lineage formation, early embryonic asymmetries and axis patterning in the mouse. Development. 136:701-13. Nishioka N, Yamamoto S, Kiyonari H, Sato H, Sawada A, Ota M, Nakao K, Sasaki H. (2008). Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse embryos. Mech Dev. 125:270-83. Niwa H, Toyooka Y, Shimosato D, Strumpf D, Takahashi K, Yagi R, Rossant J. (2005). Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell. 123:917-29. SC 2.17. La primera determinación. La expresión de combinatorias de factores de transcripción específicas de tipo celular en la mórula y el blastocisto. V. Flores Se sabe que la expresión de la homeoproteína factor de transcripción Cdx2 está involucrada en la determinación/diferenciación en sentido trofoblástico. La estimulación experimental de la expresión de Cdx2 en células troncales embrionarias pluripotentes las lleva a determinarse en las células troncales trofoblásticas.

El factor Cdx2 empieza a expresarse en las blastómeras ya en el E8c y luego, gradualmente, queda restringido a las células externas de la mórula ya antes de la formación del blastocisto. El análisis del efecto de mutaciones de diversos factores de transcripción permite proponer una sucesión temporal definida de expresión de factores de transcripción: -- los embriones mutantes para el factor Cdx2 pueden realizar la segmentación pero, cuando las células deben organizarse formando un blastocisto, las células externas pierden sus características epiteliales y no se diferencian y organizan en un trofoblasto. En estos embriones se reduce la expresión del factor de transcripción con caja T, Eomes. -- los embriones mutantes para el factor de transcripción con caja T, Eomes, también sufren alteraciones en el trofoblasto pero un poco más tarde que los mutantes para Cdx2. En estos embriones no se altera la expresión del factor Cdx2. Esto indicaría una secuencia temporal Cdx2 → Eomes. En ambas mutaciones, el desarrollo del trofoblasto se inicia pero luego se altera. Ello sugiere que otros factores participan en los pasos previos, entre mórula y blastocisto. -- se ha mostrado que el factor de transcripción Tead4 se expresa antes que el Cdx2 y que es necesario para la expresión de este último y para la formación de células troncales trofoblásticas. Así, el factor Tead4 precedería a los anteriores factores en la sucesión de eventos que llevan a la diferenciación del trofoblasto. La sucesión más probable sería: → Tead4 → Cdx2 → Eomes →etcétera. En los mamíferos, el factor Tead4 sólo puede producir su efecto sobre la transcripción con la participación del coactivador Yap (yes associated protein). La disponibilidad de Yap sería también un paso limitante en la formación del trofoblasto y en la especificación del linaje trofoblástico y, en consecuencia, en la formación del trofoblasto. Éstos son sólo algunos de los factores identificados de una red, seguramente más compleja, de factores de transcripción necesarios para la programación del linaje celular trofoblástico. No sólo los factores mencionados (Tead4, Cdx2, Eomes), que son específicos-de-células troncales trofoblásticas, se expresan tempranamente en la mórula. Los factores de transcripción específicos-de-células troncales embrionarias (embrioblasto) tales como por ejemplo Oct4, Sox, Nanog, Gata y otros, también son expresados, al principio de la segmentación de la CH, en prácticamente todas las blastómeras, Luego, durante la blastulación, se instala una expresión espacial diferencial de los factores mencionados de modo que los factores Cdx2 y Eomes quedan restringidos y, con alta expresión, a las células polarizadas externas de la mórula (futuro trofoblasto), en tanto que Oct4, Sox, Nanog, Gata, etc. quedan restringidos a las células no polarizadas internas (futuro embrioblasto). Esto lleva a la formación de células que ocupan diferentes posiciones y que expresan diferentes combinatorias específicas de factores de transcripción. La instalación de la expresión espacial diferencial de los factores de transcripción resulta del hecho de que los factores de transcripción específicos-de-trofoblasto y específicos-de-embrioblasto interactúan entre ellos de modo que se inhiben recíprocamente. Debido a ello, precisamente, se segregan en dos líneas celulares con diferentes potencias de desarrollo. Por ejemplo, en embriones mutantes para el factor Cdx2, específico de trofoblasto, dichas diferencias regionales no se producen y los factores Oct4, Sox2, Nanog, específicos de embrioblasto, se expresan también en las células externas.

Así, la constitución de los dos primeros linajes celulares pasa por una etapa inicial en la que las células expresan tanto factores específicos-de-trofoblasto y como factores específicos-de-embrioblasto. Luego, la expresión de Cdx2 queda restringida al exterior y, como Cdx2 inhibe la expresión de factores específicos-de-embrioblasto, la expresión de éstos queda restringida a las células internas. La represión recíproca de factores específicos-de-trofoblasto por parte de los factores Oct4/Sox2/Nanog en los linajes pluripotentes combinada con la autorregulación positiva de Oct4 consolida o refuerza el mantenimiento de las diferencias en las combinatorias de factores de transcripción expresadas por células externas (trofoblasto) e internas (embrioblasto). Todas las células pluripotentes de la mórula poseen inicialmente la capacidad de expresar estos factores de transcripción. Las diferencias se establecen luego dependiendo de cómo las blastómeras adquieren diferentes posiciones (y posibilidades de interacción) respecto del medio y respecto de las otras blastómeras. Algunos hechos relevantes que generan diferentes posibilidades de interacción son a) la polarización de las blastómeras, b) la compactación de la mórula, c) el desarrollo de uniones oclusivas entre células superficiales, d) el desarrollo de un medio intramórula bioquímicamente definido por las propias células del embrión (SC 2.6. Comportamientos celulares involucrados en la primera determinación. En los mamíferos con sólo tres células se constituiría el embrioblasto) y, considerando los eventos intracelulares, e) la existencia de interacciones positivas y negativas en la red de interacciones entre factores de transcripción que rigen este estado temprano del desarrollo.

Bibliografía Dietrich JE, Hiiragi T. (2007). Stochastic patterning in the mouse preimplantation embryo. Development. 134:4219-31. Boyer LA, Lee TI, Cole MF, Johnstone SE, Levine SS, Zucker JP, Guenther MG, Kumar RM, Murray HL, Jenner RG, Gifford DK, Melton DA, Jaenisch R, Young RA. (2005). Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122:947-56. Zhao B, Ye X, Yu J, Li L, Li W, Li S, Yu J, Lin JD, Wang CY, Chinnaiyan AM, Lai ZC, Guan KL. (2008). TEAD mediates YAP-dependent gene induction and growth control. Genes Dev. 22:1962-71. SC 2.18. La segunda determinación. La determinación de los linajes celulares epiblásticos e hipoblásticos y su organización espacial en el embrión bilaminar. V. Flores En general existe acuerdo sobre el hecho de que en la primera determinación ‒bifurcación de linajes celulares embrioblástico y trofoblástico a partir de la mórula‒ la vía celular programada depende, en parte, de la posición de las blastómeras. Vale decir, la existencia de diferencias posicionales precede a, y es una condición para, la existencia de determinaciones diferentes. En el caso de la segunda determinación ‒bifurcación de los linajes epiblástico e hipoblástico a partir del embrioblasto‒ se ha planteado que puede existir una situación inversa: primero se produciría la determinación de los linajes celulares y luego, dependiendo de las propiedades de las células, se produciría una distribución espacial diferencial de éstas. Vale decir, la posición definitiva de las células dependería del tipo de determinación realizada. El embrión bilaminar sería el resultado de un proceso de determinación celular seguido de un proceso de sorting out (segregación espacial) que llevaría a las células a organizarse en dos capas (Fig. 218-1 A-C). Esta postulación posee aún numerosas objeciones y, en opinión de algunos investigadores, requiere evidencias más claras y directas.

La idea clásica, predominante hasta la actualidad, considera que el embrioblasto es una población celular homogénea, integrada por células citogenéticamente equipotentes (similarmente determinadas), vale decir, sin restricción de linaje en sentido epiblástico o hipoblástico (Fig. SC 2-18-1 B). La concepción clásica proponía que la segunda determinación, al igual que la primera, podría ser un fenómeno dependiente de la posición: las células de ubicación dorsal (adyacentes al trofoblasto polar) se determinarían en epiblasto y las de ubicación ventral (limitantes con el blastocele) se determinarían en hipoblasto. Se sabe, en la actualidad, que las células embrioblásticas, consideradas individualmente, expresan proteínas específicas-de-linaje epiblástico (como el factor de transcripción Nanog) o, por el contrario, proteínas específicas-de-linaje trofoblástico como los factores de transcripción Gata4 y Gata6. Estas células se distribuyen en el embrioblasto con una distribución supuestamente aleatoria, vagamente precisada y denominada patrón “salt and pipper”. Tal designación, en realidad, sólo pone de manifiesto la incapacidad de los observadores para precisar la distribución espacial. De todos modos, independientemente de que las células ya estén determinadas o no, la existencia de células que expresan marcadores epiblásticos o hipoblásticos precede a la formación de las capas epiblásticas e hipoblásticas del embrión bilaminar. Algunos estudios de seguimiento de células derivadas de las células embrioblásticas (precursoras de los linajes celulares epiblásticos e hipoblásticos) sugieren que estas últimas se hallan ya determinadas antes de la formación de las dos capas del embrión bilaminar. Tales resultados permiten proponer un modelo de segregación de linaje celular basado dos etapas: a) una primera etapa de determinación celular aleatoria que lleva a la formación de un embrioblasto con una organización en mosaico. Este mosaico consiste en una mezcla de células precursoras epiblásticas e hipoblásticas ya determinadas distribuidas espacialmente al azar (Fig. SC 2-18-1 B) y b) una segunda fase de sorting-out (segregación en dos grupos) selectivo de éstas que conduce a la segregación de los dos tipos celulares y su organización en las dos capas celulares conocidas (Fig. SC 2-18-1 C).

Fig. SC 2-18-1. Ilustra un modelo de determinaciones durante la morulación y blastulación. A. En el estado de mórula en forma dependiente de posición (polaridad interior-exterior) se determinan las células del embrioblasto y trofoblasto. B. Durante la blastulación se produce una determinación en sentido epiblástico o hipoblástico pero con organización espacial aleatoria. C. Luego de la determinación en sentido epiblástico o hipoblástico, las células

sufrirían un proceso de reorganización y células ya determinadas se organizarían formando el embrión bilaminar con polaridad epiblástica-hipoblástica. DD: días de desarrollo embrionario. Ciertos estudios ulteriores de expresión genética global (GWA) apoyan tal visión ya que muestran que las células del embrioblasto corresponden a una de dos categorías: a) células que expresan preferentemente proteínas del epiblasto o b) células que expresan proteínas del hipoblasto. Una de las proteínas típicas de las células precursoras hipoblásticas es la proteína receptor tipo α del factor de crecimiento derivado de plaqueta o Pdgfra (platelet-derived growth factor receptor α). Siguiendo la expresión del constructo Pdgfra-H2B-Gfp resultante de la fusión de los genes codificantes de las proteínas Pdgfra, la histona H2B y la proteína fluorescente verde Gfp (Gfp; green fluorescent protein) se ha podido determinar la ubicación temprana y ulterior reubicación de células precursoras hipoblásticas. Estos experimentos muestran que las células del embrioblasto, que durante la blastulación temprana expresan el constructo mencionado, expresan también el factor de transcripción Nanog (específico de epiblasto). Sin embargo, en la blástula madura, las células del embrioblasto ya no coexpresan proteínas específicas de epiblasto e hipoblasto sino sólo uno de ambos conjuntos. Algunos estudios de videomicroscopia, que permiten seguir la evolución de estas células en función del tiempo, muestran que las células Pdgfra (+) que se hallan delimitando el blastocele permanecen en dicho lugar. Sin embargo, las que se hallan en el seno del embrioblasto sufren una reubicación hacia la superficie (sorting-out) o son eliminadas por apoptosis. Esto lleva a la separación espacial de ambos tipos celulares, con la consiguiente formación de epiblasto e hipoblasto en las posiciones habituales dentro del blastocisto maduro.

Bibliografía Gerbe F, Cox B, Rossant J, Chazaud C. (2008). Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Dev Biol. 313:594-602. Rossant J, Chazaud C, Yamanaka Y. (2003). Lineage allocation and asymmetries in the early mouse embryo. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358:1341-9.

Capítulo 3. El período somítico. El desarrollo del plan anatómico básico y la definición de sistemas, aparatos y órganos SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 3.1. El plan anatómico básico de los vertebrados. V. Flores SC 3.2. Concepto de esbozo. V. Flores

SC 3.3. El alcance del término esbozo. V. Flores SC 3.4. Concepto de campo morfogenético. V. Flores SC 3.5. ¿Plegamiento o crecimiento diferencial? V. Flores SC 3.6. La celomización. Somatopleura y esplacnopleura. Significado biológico. V. Flores SC 3.7. El origen, la programación temporal y la organización espacial de la segmentación del mesodermo paraxil. V. Flores, M. Rapacioli SC 3.8. Somitogénesis. Evidencias moleculares de la existencia de un oscilador o reloj de segmentación. V. Flores, M. Rapacioli SC 3.9. Mecanismos de integración molecular entre el reloj de segmentación y el gradiente de somitogénesis. V. Flores, M. Rapacioli SC 3.10. Conceptos de morfogénesis e histogénesis. Los primeros procesos histogenéticos. V. Flores SC 3.11. La deslaminación del mesodermo lateral y

la especificación de las hojas somáticas y esplácnicas del celoma. V. Flores, M. Rapacioli SC 3.12. Epitelización y deslaminación del mesodermo lateral. Cambios en el patrón de expresión de proteínas asociados a la especificaión y determinación de las hojas somática y visceral del mesodermo lateral. V. Flores, M. Rapacioli SC 3.1. EL PLAN ANATÓMICO BÁSICO DE LOS VERTEBRADOS. V. Flores Las especies bióticas, aun cuando estén relacionadas evolutivamente, pueden presentar diferencias importantes. Éstas resultan de la gran variedad de adaptaciones a diferentes medioambientes (aves y peces) o son el resultado de diferentes modos de adaptación al mismo medio (vacas, caballos y el ser humano comparten básicamente el mismo medio). Estas adaptaciones, que son el resultado de la selección natural, generan diferencias notables que a veces enmascaran las similitudes básicas que poseen las especies emparentadas. Los vertebrados poseen un plan corporal básico derivado de los cordados que se adquiere tempranamente durante el período somítico del desarrollo embrionario (Fig. SC 3-1-1).

Fig. SC 3-1-1. Esquema de la organización anatómica básica de los cordados. Descripción en el texto. Las características principales de dicho plan son las siguientes: 1. Son animales cilíndricos con simetría bilateral. Poseen un elemento axil denominado “cuerda dorsal” que coincide con el eje longitudinal. Este eje se extiende desde la cabeza a la cola y se denomina eje céfalo-caudal. La simetría bilateral está definida respecto de un plano denominado “sagital” que coincide con la posición de la

cuerda dorsal y, en consecuencia, contiene al eje céfalo-caudal. La posición del plano sagital está definida por dos ejes contenidos en él: uno es el eje céfalo-caudal y otro es el dorso-ventral. El plano sagital o de simetría bilateral se define como aquel que divide al cuerpo en mitades que son, una respecto de la otra, imágenes especulares. Esta organización espacial de los componentes corporales es descrita anatómicamente en términos de la posesión de una cabeza o extremo cefálico, una cola o extremo caudal, una superficie dorsal (la espalda), una ventral y mitades o lados derecho e izquierdo respecto del plano sagital. La existencia del plano sagital, que ocupa una posición denominada “medial”, permite definir un tercer eje espacial que se dirige desde el plano sagital o medial hacia los lados (derecho o izquierdo) por lo cual se denomina eje “medio-lateral” (de la línea media a los lados). Si bien pueden describirse dos ejes medio-laterales, éstos son equivalentes para el caso de las estructuras corporales con simetría bilateral. Para el caso de las estructuras corporales asimétricas, este eje carece de sentido. Por otro lado, tomando siempre como referencia el elemento axil (la cuerda dorsal), se definen otras dos regiones. La que está dorsal a la cuerda se denomina epiaxial y la región ventral a ella se denomina hipoaxial. 2. Son animales celomados. El cuerpo consiste en dos componentes cilíndricos concéntricos, uno externo o somatopleural (vinculado a la vida de relación) y uno interno o esplacnopleural (con estructuras vinculadas a la vida vegetativa). Ambos elementos están separados por una cavidad interna denominada celoma. Éste, en el estado adulto, permite la independencia de los movimientos entre los componentes de la vida de relación y los de la vida vegetativa. Los primeros asientan en la pared corporal en la que se encuentran los elementos para sensar el medio y en la que se asocian elementos contráctiles (músculos esqueléticos, rápidos) y elementos rígidos, móviles y articulados (huesos y articulaciones) que permiten el desplazamiento del individuo en su medio. Por el otro lado, entre los elementos de la vida vegetativa también existen elementos móviles que se desplazan respecto de la pared corporal. Dichas estructuras son el pulmón, el corazón y el tubo digestivo. Estas estructuras están separadas de la pared corporal por una cavidad denominada celoma (pericárdico, pleural y peritoneal). Las cavidades celómicas poseen paredes lisas y contienen volúmenes adecuados de un líquido lubricante que permite sus desplazamientos con muy escasa fricción. La adquisición de una cavidad celómica trajo apareadas varias ventajas evolutivas a los celomados. La deslaminación del mesodermo y la constitución de la somatopleura y la esplacnopleura permitió un desarrollo relativamente “independiente” de los órganos de la vida de relación, por un lado, y de la vida vegetativa, por otro. La existencia de una cavidad corporal interpuesta entre somatopleura y esplacnopleura permite una organización anatomofuncional independiente. Por ejemplo, permite el desarrollo de un tubo digestivo de varios metros de longitud dentro de un cilindro somatopleural de una longitud visiblemente inferior. Algo similar ocurre con el pulmón y con el corazón y los grandes vasos que durante el desarrollo realizan desplazamientos, curvaturas y torsiones independientes de los que realiza la somatopleura. También posibilita el desarrollo de órganos voluminosos que sólo se vinculan a la somatopleura por mesos laxos y móviles como el hígado, el páncreas, el pulmón y las gónadas. La organización anatómica “independiente” posibilita que los movimientos de los órganos viscerales (pulmón, corazón, tubo digestivo) y los del aparato locomotor no interfieran entre sí como ocurriría si todos estuvieran unidos por tejidos conectivos. 3. Son animales segmentados. Poseen una organización de los componentes de la pared corporal o somatopleural adaptada a la realización de los movimientos necesarios para desplazarse en el medio. En consecuencia, el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, el esqueleto y la musculatura axil poseen una organización en segmentos o metámeras. Éstas se definen como unidades anatomofuncionales, con disposición bilateral y simétrica, que se repiten a lo largo del eje céfalo-caudal, con una misma estructura básica pero con diferencias regionales que permiten su identificación. Cada segmento corporal posee simetría bilateral. Un segmento del sistema nervioso es capaz de funcionar autónomamente pues posee una población neuronal en el sistema nervioso periférico (la neurona sensorial primaria), y dos poblaciones neuronales en el sistema nervioso central, una población de asociación y una eferente. Ésta última inerva los músculos correspondientes al segmento corporal. Los músculos y los huesos del esqueleto axil están dispuestos de modo tal que pueden realizar movimientos de flexión (por la contracción de músculos hipoaxiales), de extensión (por los músculos epiaxiales), laterales (por la existencia de músculos ubicados en posición lateral al eje). También pueden realizarse movimientos de rotación o torsión combinando adecuadamente el uso simultáneo de varios grupos

musculares. A lo largo de la evolución, el aparato de la locomoción se ha perfeccionado y, como apéndices del esqueleto axil, surgieron los miembros anteriores y posteriores. Este hecho, sumado al desarrollo desigual de muchas regiones corporales hace que superficialmente no se advierta el carácter cilíndrico que con claridad se percibe en algunos peces y ofidios. 4. Poseen un sistema nervioso central en posición epiaxial. El sistema nervioso se encuentra en el plano dorsal del animal en una región que se continúa directamente con la pared corporal de la cual recibe los estímulos y a la cual envía las respuestas vinculadas a la relación con el medio. La inervación de los elementos de la vida vegetativa se realiza a través de láminas llamadas “mesos” que vinculan la esplacnopleura con la somatopleura. La fibras del sistema nervioso autónomo (simpáticas y parasimpáticos llegan hasta los órganos vegetativos esplacnopleurales a través de dichos mesos. A través de éstos también transcurren los vasos arteriales y venosos del aparato digestivo. En posición inmediatamente ventral al SNC se encuentra la cuerda dorsal y, en los vertebrados, la columna vertebral. 5. En posición inmediatamente ventral a la cuerda dorsal (o la columna vertebral) se encuentra el plano vascular de los grandes vasos que salen y llegan al corazón. 6. Inmediatamente ventral al plano vascular se encuentra el plano del cilindro interno que forma el tubo digestivo y sus órganos anexos. 7. Además de los órganos que se forman en los cilindros externo (formados por la asociación de tejidos ectodérmicos y mesodérmicos) e interno (formados por la asociación de tejidos endodérmicos y mesodérmicos), poseen órganos que se forman directamente en la intimidad del mesodermo. Estos órganos pertenecen a los aparatos excretor y reproductor y al sistema circulatorio.

Bibliografía Gilbert SF, Raunio AM, Editors. (1997). Embryology, Constructing the Organism. Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc. Schnek A, Massarini A. (2008) Curtis. Biología. 7ª edición. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana. SC 3.2. CONCEPTO DE ESBOZO. V. Flores La 4ª y la 5ª SD son etapas organogénicas. En ellas se constituyen las poblaciones celulares precursoras de la mayor parte de los aparatos, sistemas y órganos que comúnmente se denominan esbozos. En el texto impreso se usa reiteradamente el término “esbozo”. Probablemente queda implícito, por el sentido que se le asigna en las descripciones, que alude a poblaciones celulares a partir de la cuales se generan órganos, aparatos o regiones particulares del organismo. En el campo de la biología del desarrollo el término posee una acepción específica no siempre claramente acotada en los textos. Desde el punto de vista teórico, el esbozo de la estructura adulta A se define como... (a) ... la población celular embrionaria formadora o precursora de la estructura A... (b) ... identificable dentro de un sistema de referencia temporoespacial que lo precede y del cual derivan tanto su relación armónica con el resto del organismo como su propia organización interna…

(c) ... caracterizable como un sistema de desarrollo completo ya que en él que radican todos los elementos estructurales e informativos que interactivamente generan el órgano A y sólo el órgano A… (d) ... integrado por una o más poblaciones celulares… (e) .. que en conjunto se encuentran determinadas, vale decir, … (f) ... poseen potencia evolutiva restringida o acotada a la formación de la estructura A.

A continuación se aclaran y amplían algunos de los ítems que integran el concepto de esbozo: (a y c) Cuando se alude a “población celular embrionaria precursora o formadora de la estructura A” ... caracterizable como un “sistema de desarrollo completo” equipado con los elementos estructurales e informativos que interactivamente generan el órgano A, se pretende enfatizar que la población celular que recibe el nombre de esbozo debe ser capaz de generar una estructura A compleja, completa, armónica, estructural y funcionalmente integrada. - La calificación de “compleja” alude a que normalmente las estructuras biológicas se constituyen como entidades heterogéneas constituidas por partes apropiadamente autoensambladas. - La calificación de “completa” alude a que la población aludida como esbozo debe generar todas las partes que componen el órgano definitivo. - El termino “armónica” alude a las relaciones de posiciones, tamaños y volúmenes relativos que deben poseer las partes del todo generadas por el esbozo. - El criterio referido como “estructural y funcionalmente integrada” alude a que el cumplimiento de toda función biológica requiere una cierta estructura óptima que, precisamente, habilita a cumplir tal función, Tal vínculo entre estructura y función es habitualmente designado como “relación o unidad estructura-función”. (b) Elementos informativos y estructurales y mecanismos de interacción entre ambos. Cuando un esbozo está integrado por dos o más poblaciones celulares, ellas, en general, se comportan diferente y complementariamente y, debido a ello, su separación produce una interrupción del desarrollo. De ahí deriva la noción de que el desarrollo es interactivo. La importancia de las asociaciones epitelio-mesenquimáticas en la constitución de esbozos radica en que el desarrollo sólo procede como consecuencia de interacciones entre ambos. Cuando ambos son separados y cultivados “in vitro”, el desarrollo se detiene y su reasociación “in vitro" es suficiente para iniciar fenómenos morfogenéticos e histogenéticos, sin estímulos externos adicionales, logrando un cierto grado de diferenciación. La noción de heterogeneidad celular en la constitución de los esbozos incluye también las diferencias referidas a los diferentes papeles informativos que pueden poseer las células de un esbozo. Este concepto se discute bajo otros títulos (SC 3.4 Concepto de campo morfogenético). Todo esbozo cumple un programa epigenético en el que está incluida la expresión de moléculas que median los procesos de determinación y diferenciación celular espacialmente organizados. Este hecho es posible debido a que en los esbozos están incluidas células que poseen roles informativos referidos específicamente a la instalación del patrón de organización de éste (SC Poblaciones celulares organizadoras (pcO) y la regionalización y determinación progresiva del tubo neural). (d) La composición celular heterogénea de los esbozos. En general los órganos están compuestos por más de un tipo celular. Los conceptos de parénquima y estroma se refieren a este hecho. Las células que integran el parénquima cumplen la(s) función(es) específica(s) del órgano y las que componen el estroma participan estrechamente con las primeras en el cumplimiento de las funciones del órgano: mantienen las características

del estado diferenciado, proveen el patrón de organización al mismo, constituyen el andamiaje estructural del órgano y posibilitan su integración funcional proveyéndole mecanismos de comunicación (neurales y vasculares [endocrinos, inmunitarios, etc]) con otros órganos de la economía. Desde el punto de vista estructural, la heterogeneidad celular de los esbozos de órganos se refiere a que éstos habitualmente están compuestos por dos o más poblaciones de células embrionarias interactuantes: uno epitelial (que originará el parénquima) y uno mesenquimático (que originará el estroma). Para el caso de estructuras de origen somatopleural, los esbozos están constituidos por la asociación del epitelio ectodérmico + el mesénquima somático y, para el caso de las estructuras de origen esplacnopleural, los esbozos están compuestos por el epitelio endodérmico + el mesénquima visceral. En general, el epitelio origina el parénquima y el mesénquima origina el estroma de los órganos de origen somatopleural o esplacnopleural. (e) El carácter determinado de los esbozos. Se refiere a que éstos se constituyen como consecuencia de fenómenos interactivos que fijan el destino evolutivo de la(s) población(es) celular(es) que integra(n) el esbozo. Estas interacciones celulares son denominadas determinantes –directrices o instructivas–. Los fenómenos de determinación consisten en reprogramaciones de la información genética que instalan restricciones a la potencia evolutiva de las células. Una determinación implica la retención de una de dos o más opciones de desarrollo; la vía de desarrollo seleccionada, de ahí en más, se mantiene como un efecto estabilizado o irreversible de larga duración. Esto último es descrito también en términos de la adquisición de un compromiso de desarrollo. El grado y tipo de determinación que posee un esbozo cualquiera es el resultado global de la historia de determinaciones que han sufrido las células que constituyen el esbozo y sus antecesoras. Para más detalles sobre el concepto de determinación (SC 0.5. El concepto de determinación. Potencia y significado evolutivos; SC 0.6. Concepto de acción celular determinante (A c-c D); SC 0.7. Poblaciones celulares determinantes (pcD) y poblaciones celulares competentes (pcC)). (f) El carácter restringido de la potencia evolutiva de un esbozo. Que una población celular embrionaria posea capacidad para originar la estructura adulta “A” no es suficiente para considerarla como el esbozo de “A”. Ese hecho sólo indica que la capacidad de formar “A” forma parte de su potencia de desarrollo. Dilucidar si una población celular embrionaria, efectivamente, constituye el esbozo de la estructura adulta “A” requiere investigar si es capaz de originar exclusivamente dicha estructura. Dado que el desarrollo se ejecuta como un programa de interacciones celulares, tales experimentos consisten en trasplantar el presunto esbozo “A” a otras regiones embrionarias o hacerlo desarrollar en distintos medioambientes –medios de cultivo químicamente definidos o medios condicionados– diseñados artificialmente. Estos experimentos se realizan para contrastar si la población celular en cuestión, en efecto, sólo posee la potencia de generar el órgano “A” o si, por el contrario, todavía retiene otras potencias de desarrollo. Sólo cuando una población celular embrionaria ha restringido su potencia a la formación de una estructura en particular, es considerada el esbozo de dicha estructura.

Bibliografía Flores V. (2000). SBD. Bases biológicas y moleculares del período somítico. Dir. Vladimir Flores. SC 3.3. EL ALCANCE DEL TÉRMINO ESBOZO. V. Flores El concepto de esbozo se asocia a la idea de población celular precursora de alguna “parte”, “región”, o “lugar” del individuo. Tales partes o lugares del individuo deben poseer características biológicas (estructurales y funcionales) que los delimiten y definan suficientemente bien como para conferirles entidad y nombre propio (identidad) durante el desarrollo embrionario y en el individuo terminalmente diferenciado. También existen algunas poblaciones celulares embrionarias o asociaciones de poblaciones celulares que cumplen con las características de esbozos pero que son transitorias y no poseen un derivado único en el adulto sino múltiples estructuras adultas definitivas. Ciertas estructuras como la somatopleura o la esplacnopleura se comportan del modo descrito pero en general no se aplica a ellas el término esbozo.

Las poblaciones celulares embrionarias denominadas esbozos son precursoras o formadoras de una variedad de entidades biológicas que pueden corresponder a diferentes niveles de organización del individuo. El término esbozo, en consecuencia, se aplica a varios niveles de organización. En general se trata de a) poblaciones generadoras de órganos (p. ej., esbozo de la glándula tiroides), aunque también se aplica el término esbozo para referirse a b) poblaciones celulares generadoras de todo un aparato (p. ej., esbozo respiratorio o laríngeotráqueo-bronco-pulmonar que forma casi todo el aparato respiratorio), o c) poblaciones celulares precursoras de todo un sistema (p. ej., la placa neural que es el esbozo del sistema nervioso central). El término esbozo también se aplica a poblaciones celulares que generan estructuras o entidades, que d) no corresponden con precisión a ninguno de los niveles de organización clásicos, y que sólo son partes de órganos (p. ej., el esbozo dorsal del páncreas o el esbozo de la corteza suprarrenal) o, por el contrario, a esbozos que generan e) conjuntos de órganos que integran regiones corporales (p. ej., esbozos de miembros superiores o inferiores que originan todos los órganos (huesos y músculos) contenidos en el miembro). También se aplica a f) poblaciones celulares que generan órganos que están incluidos dentro de otros órganos (p. ej., esbozo de la lente, un órgano que está incluido dentro del ojo que, a su vez, es considerado el “órgano de la visión”). Finalmente, g) el término esbozo suele ser usado también incorrectamente cuando se designan elementos anatómicos que en rigor no poseen ninguna población celular embrionaria y que sólo son lugares delimitables anatómicamente por su carácter de cavidades (p. ej., esbozo del cuarto ventrículo o del tercer ventrículo, estomodeo o boca primitiva, como esbozo de la boca definitiva). También es incorrectamente aplicado para designar regiones embrionarias que originan regiones anatómicas bien definidas en el adulto pero que no se forman como consecuencia de la operación de los mecanismos de desarrollo involucrados en la génesis de esbozos (p. ej., esbozo del quiasma óptico). ¿Qué tienen en común todas estas estructuras tan disímiles que permite afirmar que todas ellas se generan a partir de esbozos? Tienen en común el hecho de que, pese a las grandes diferencias en cuanto a su complejidad y a la dificultad para ubicarlos en algún nivel de organización definido del organismo, comparten la cualidad de que, para todas ellas es posible identificar, en un momento del desarrollo y en una ubicación definida dentro del embrión, una (o más) población (es) celular(es) cuya única potencia de desarrollo es la de generarlos. Vale decir, se trata de poblaciones celulares que han sufrido un grado tal de determinación, dependiente de su historia de determinaciones previas, que sólo pueden formar la estructura en cuestión. El concepto de esbozo resulta en consecuencia de una contrastación experimental. La mera observación, por reiterada que sea, de que una cierta población celular embrionaria genera una cierta estructura “A” no es suficiente para afirmar que tal población sea el esbozo del órgano “A”. Si la población celular embrionaria en cuestión, al ser manipulada (cambiada de lugar en el embrión, por ejemplo) es capaz de originar una estructura normal diferente de “A”, no debe ser considerada el esbozo de “A” (SC Concepto de esbozo).

Bibliografía Flores V. (2000). SBD. Bases biológicas y moleculares del período pomítico. Dir. Vladimir Flores. SC 3.4. CONCEPTO DE CAMPO MORFOGENÉTICO. V. Flores Se denomina campos morfogenéticos a regiones definidas de un organismo en desarrollo en los que es posible demostrar experimentalmente que se comportan como esbozos con capacidad regulativa. Un campo es, a su vez, un “sistema de desarrollo” determinado a formar diversos tipos de entidades que integran un organismo complejo: desde estructuras identificables como “parte” o “región” corporal o “lugar” del organismo hasta órganos bien delimitados. La definición de campo es independiente de la complejidad, tamaño o localización de las estructuras que originan; así hay campos que originan a) regiones corporales grandes como el miembro inferior o superior, o b)

conjuntos de órganos como el corazón y parte de los grandes vasos o d) estructuras pequeñas y delicadas como la adenohipófisis, el conducto coclear del oído interno u otras más pequeñas aún. Dado que los campos son esbozos con capacidad regulativa, el concepto de campo incluye todos los ítems que conforman la definición de esbozo (SC Concepto de esbozo). Así: - los campos están integrados por poblaciones identificables de células embrionarias precursoras de una cierta estructura (aparato, sistema, órgano o región corporal) que conforman… - un sistema autodiferenciante, caracterizado por su completitud, vale decir, equipado con todos los elementos estructurales e informativos de cuyas interacciones surge una estructura con entidad propia, compleja, completa y armónica… - constituido dentro de un sistema de referencia temporoespacial que lo precede y del cual derivan tanto su relación armónica con el resto del organismo como también el sistema de referencia que establece su propia organización interna… - constituido por una o más poblaciones celulares que… - en conjunto forman un sistema de desarrollo determinado o comprometido, vale decir… - un sistema con una potencia evolutiva restringida o acotada a la formación de una estructura definida.

Por otro lado, los campos también se caracterizan porque en ellos es posible determinar experimentalmente que: a) Son sistemas con organización interna lábil o indeterminada. Si bien un campo es una población determinada a formar una cierta estructura que puede poseer una organización interna compleja integrada por varias regiones o tipos tisulares apropiadamente estructuradas en el espacio, las células no están determinadas a formar alguna subregión o subestructura en particular de todas las que integran la estructura completa terminalmente diferenciada. Vale decir, están determinadas a formar una entidad correspondiente a un cierto nivel de organización pero indeterminadas desde el punto de vista de los niveles de organización subordinados. Como ejemplo: el esbozo del miembro superior derecho es un campo; las células del campo están determinadas a originar el miembro superior; pero no están determinadas a formar algún segmento en particular del miembro sino que poseen la capacidad de originar cualquiera de las diferentes regiones del miembro (brazo, antebrazo, mano, etc.). Por supuesto que, según el desarrollo progresa, llega el momento en que las células se determinan a formar todas las estructuras que corresponden a las subregiones o los detalles estructurales que integran la estructura completa. Estas sucesivas determinaciones ocurren de lo general a lo particular y a ello alude el concepto de determinación progresiva (SC Evolución de la potencia citogenética y del grado de determinación durante el desarrollo. La determinación progresiva de tipos celulares; SC 9.2. Poblaciones celulares organizadoras (pcO) y la regionalización y determinación progresiva del tubo neural; SC 5.3. La determinación progresiva de las células cardiogénicas: la placa cardiogénica, los campos cardiogénicos primario y secundario y otras estirpes celulares). b) Poseen capacidad regulativa. La capacidad regulativa alude a la plasticidad de un sistema de desarrollo de adaptarse a déficits o excesos de células, o de partes del sistema, de modo tal que el desarrollo no se altera. La capacidad regulativa se pone de manifiesto por el hecho de que la eliminación (déficits) o el agregado (exceso) de células del sistema no conducen ni a la pérdida (ausencia) ni al exceso (duplicaciones) de partes en la estructura terminalmente desarrollada. Ello implica que las células no están determinadas a formar alguna parte definida del sistema sino que pueden modificar sus destinos, dependiendo de las interacciones internas del sistema, de modo que la estructura resultante sea completa y armónica. La eliminación de células no

ocasiona pérdida de partes pues las células remanentes son capaces formar los tejidos que hubieran derivado de las que fueron eliminadas. Ello implica que las células son equipotentes; vale decir, no están diferentemente determinadas. c) Poseen patrón informativo instalado por una pcO. En varios modelos experimentales de campo es posible constatar que éstos poseen al menos dos categorías de células. Una de ellas, denominada zona de actividad polarizante o ZAP, posee función eminentemente informativa; instala un sistema de referencia que regula o controla CCD por medio del establecimiento de un sistema de señalización celular espacialmente organizado en forma de gradiente. Así, la distribución espacial asimétrica de valores de concentración de una sustancia señalizadora, denominada genéricamente morfógeno, genera diferencias en función del espacio en los CCD. d) Poseen una población celular sensible al patrón informativo. Los campos están equipados también con células equipotentes, con función eminentemente estructural, sensibles al patrón informativo y que responden al gradiente señalizante de un modo dependiente de la concentración y el tiempo de exposición. Ello implica que las células sensibles al patrón, aunque son equipotentes y conforman un sistema homogéneo, ejecutan diferencialmente sus CCD tomando como referencia el patrón informativo. En consecuencia, pueden comportarse diferentemente en el espacio y generar un sistema complejo o heterogéneo.

Bibliografía Li H, Tierney Ch, Wen L, Wu JY, Rao, Y. (1997). A single morphogenetic field gives rise to two retina primordia under the influence of the prechordal plate. Development. 124(3):60315. Wolpert L. (1968). The French flag problem: A contribution to the discussion on pattern formation and regulation. In: C. H. Waddington (ed.). Towards a Theoretical Biology. Edinburg: Edinburgh University Press. pp. 125-33. Wolpert L. (1969). Positional information and the spatial pattern of cellular differentiation. J Theor Biol. 25:1-47. Wolpert L. (1977). The Development of Pattern and Form in Animals. Burlington, NC: Carolina Biological. Wolpert L. (1978). Pattern formation in biological development. Sci Am. 239(4):154-64. Stocum DL. (1984). The urodele limb regeneration blastema: Determination and organization of the morphogenetic field. Differentiation 27(1):13-28. SC 3.5. ¿PLEGAMIENTO O CRECIMIENTO DIFERENCIAL? V. Flores En el lenguaje común, el término plegar alude a generar uno o más pliegues doblando o curvando algo sobre sí mismo. Esta acepción común, aplicada al plegamiento embrionario, sugiere que las hojas del disco embrionario, que son homologadas a planos, se doblan sobre sí mismas. En la mayor parte de los textos, como recurso didáctico, se recurre a la metáfora de que durante el plegamiento los bordes del disco embrionario se acercan a la línea media, contactan y se fusionan. Si así fuera, al final del plegamiento el embrión debería tener dimensiones menores que las que tiene al principio (cuando algo se pliega disminuye alguna de sus dimensiones; un paraguas desplegado no entra en su estuche, plegado sí lo hace debido a que disminuyen dos de sus tres dimensiones). La expresión “plegamiento del embrión” no sugiere aumento de tamaño ni crecimiento diferencial. Sin embargo, éstos son los fenómenos que explican el plegamiento el embrión. Es cierto sí, que durante la 4ª y 5ª SD, en la frontera entre el embrión y los tejidos no embrionarios se genera una zona circular que resiste la

distensión que podría provocar el continuo e intenso crecimiento del embrión. Por lo demás, no ocurre que los bordes derecho e izquierdo del disco embrionario contacten entre sí y se fusionen. El plegamiento del embrión es el resultado de CCD que producen un crecimiento diferencial. Se entiende por crecimiento diferencial el aumento de tamaño de una estructura de un modo no uniforme, no isométrico o no armónico. En el caso del crecimiento uniforme, el crecimiento global implica un crecimiento similar en cualquier dirección del espacio y en cualquier área considerada, independientemente de su tamaño y posición dentro del sistema. La estructura crece (aumenta su tamaño) similarmente en todas las escalas y en todas las regiones. Este tipo de crecimiento se denomina también isométrico o isotrópico. El aumento en longitud es similar en todas las direcciones del espacio. El crecimiento diferencial es un tipo diferente de aumento de tamaño o longitud. El crecimiento global no es el resultado de crecimientos similares en cualquier región o cualquier escala considerada. Por el contrario, existen diferencias en la intensidad del crecimiento en función del espacio y algunas regiones crecen más que otras. Esto deriva en que el aumento en tamaño no es similar en todas las direcciones del espacio. Este tipo de crecimiento se denomina anisométrico o anisotrópico. El modo particular de plegarse del embrión y su forma final resultan de que a) las regiones periféricas del disco embrionario crecen menos que las regiones centrales y mediales y que b) el crecimiento en la dirección del eje céfalo-caudal es mayor que el crecimiento en la dirección medio-lateral. Las estructuras que crecen mucho en longitud (en dirección céfalo-caudal) son las estructuras mediales: la placa neural (luego tubo neural), la notocorda y el mesodermo paraxil (luego somitas). Éstas son las estructuras más rígidas que posee el embrión y que son capaces de generar tensiones en los demás tejidos. Los restantes tejidos se van acomodando a las líneas de fuerza que ellas generan durante su expansión. El comportamiento físico de los tejidos del embrión varía en función del tiempo y la región considerada. En general oscila desde un comportamiento símil-rígido (como el de la notocorda) pasando por un comportamiento elástico (como las regiones laterales de la placa neural) hasta el de un material viscoso (como los tejidos más delgados de las regiones laterales del embrión). Cuando los tejidos exhiben un comportamiento elástico son capaces de almacenar las fuerzas que operan sobre ellos, tensarse, transmitir fuerzas en su intimidad y a los tejidos adyacentes, y cambiar de forma. Cuando exhiben un comportamiento viscoso no son capaces de generar fuerzas, se acomodan a las fuerzas que operan sobre ellas cambiando de forma y la energía se disipa; no se tensan y no son capaces de transmitir fuerzas. Las simulaciones computacionales de cambios de forma de láminas epiteliales aplicando a los tejidos gradaciones de las propiedades físicas descritas (rígido, elástico, viscoelástico y viscoso) permiten simular muchos fenómenos morfogenéticos. Algunas estimaciones de la intensidad de las fuerzas que operan entre las células y las necesarias para producir dichos cambios coinciden con bastante proximidad. El efecto de un crecimiento anisométrico como el descrito para el embrión puede visualizarse a través de un ejemplo simple: el juguete para hacer pompas de jabón. Una lámina de agua jabonosa se extiende en el espacio definido por un pequeño aro de metal. Debido a la tensión superficial (resultante de la fuerza de atracción entre sus moléculas) y a la alta afinidad por el metal, el agua adopta una disposición plana sin “derramarse” del aro de metal que delimita sus bordes. Cuando aumenta la presión sobre una de sus caras (como cuando se la sopla de un lado) la lámina se abomba hacia el lado opuesto. Nótese que el abombamiento es consecuencia de dos hechos: a) un aumento de la superficie de la lámina de agua jabonosa que excede el área definida por el aro de metal sumado a b) una ausencia de expansión del borde de la lámina correspondiente a la porción de agua que se encuentra adherida al aro. El aumento de la superficie de la región interna del plano con una restricción a la expansión en los bordes tiene una consecuencia inevitable, la lámina debe abandonar la disposición plana y debe plegarse. Existe una diferencia sustancial entre este ejemplo simple y el plegamiento del embrión. En el caso del ejemplo se produce un abombamiento de curvatura regular. Ello se debe a que la región interna de la lámina jabonosa se expande isométricamente. Si se detuviera el procedimiento a mitad de camino, se obtendría una hemiesfera. Otro sería el resultado si la porción interna del plano se distendiera anisométricamente. Si el material fuera fácilmente distensible en una dirección “A” del espacio y muy poco distensible en otra dirección “B”, ubicada 90 grados respecto de la primera, y entre ambas direcciones existiera una gama continua de distensibilidad, el resultado no sería una hemiesfera. La pompa estaría muy abombada a lo largo de la dirección “A” y estaría poco abombada a lo largo de la dirección “B”. Algo similar ocurre con el embrión que aumenta

mucho en longitud y, en consecuencia, los extremos cefálicos y caudal presentan una muy marcada curvatura. Ello se aprecia en los cortes sagitales del embrión (Fig. SC 3-5-1). Por el contrario, en los cortes transversales (perpendiculares al primero), la curvatura es menor sobre todo a mitad de camino entre los dos extremos. Si un plano creciera isométricamente en toda su extensión, por intenso que el crecimiento fuera el plano no se plegaría; sólo aumentaría su superficie armónicamente sin abandonar la disposición plana. Vale decir, se transformaría en un plano más grande. El crecimiento anisométrico de cualquier región ubicada en el interior de un plano obligatoriamente produce su incurvación.

Fig. SC 3-5-1. Crecimientos diferenciales responsables del plegamiento del embrión. En los paneles derecho e izquierdo se ilustran esquemas de cortes longitudinales sagitales y transversales, respectivamente, de embriones en distintos estados de plegamiento. Nótese

que los tejidos de las regiones correspondientes al borde del embrión temprano (los que luego bordean los pedículos vitelino y de fijación) crecen relativamente menos que los demás. Recomendamos al lector identificar y nombrar cada uno de los tejidos y estructuras embrionarias y seguir sus cambios de posición durante el plegamiento (Véase animación 2D en sitio web). SC 3.6. LA CELOMIZACIÓN. SOMATOPLEURA Y ESPLACNOPLEURA. SIGNIFICADO BIOLÓGICO. V. Flores Los animales superiores poseen conjuntos de órganos que tienen la función de brindar respuestas rápidas a las señales provenientes del medio y conjuntos de órganos que cumplen funciones vegetativas. Los que cumplen la función de relación con el medio son los órganos de los sentidos, la piel, el sistema nervioso, el aparato de la contención neurosensorial, el locomotor, etc. Los que cumplen funciones vegetativas son los aparatos respiratorio, digestivo, circulatorio, excretor, reproductor, etc. Estos diferentes conjuntos de órganos están distribuidos en el organismo de un modo eficazmente adaptado al cumplimiento de sus respectivas funciones. En efecto, sus funciones, las relaciones funcionales entre ellos, las ventajas aportadas por la máxima eficacia funcional y la ventaja resultante de la protección de órganos vitales han hecho que a lo largo de la evolución filogenética se haya seleccionado un tipo de organización estructural de ellos dentro del organismo. Dicha organización estructural básica, debido a las ventajas que aporta, han sido mantenidas en los vertebrados que, en consecuencia, comparten un conjunto de características estructurales y funcionales básicas. Desde el punto de vista anatómico, la formación del celoma contribuye a la generación del patrón anatómico y genera la primera y más elemental distribución básica: a) los órganos de la vida de relación, superficialmente y b) los de la vida vegetativa, internamente. La celomización genera cierto grado de independencia o autonomía de los órganos de la vida vegetativa puesto que la cavidad celómica los separa. El proceso, sin embargo, se produce de modo que quedan respetadas ciertas regiones (a lo largo de toda la línea media dorsal) que vinculan anatómicamente a la somatopleura y la esplacnopleura. Dichas regiones se denominan mesos. Esta vinculación anatómica permite la integración funcional entre ambos conjuntos de órganos a través de la circulación y la inervación. Desde el punto de vista fisiológico, la formación del celoma permite cierto grado de independencia de los órganos esplacnopleurales y algunos órganos originados por la asociación de los mesodermos intermedio y visceral. Ya hemos mencionado la importancia de la independencia en los desplazamientos (véase SC 3.1. El plan anatómico básico de los vertebrados). Cierto grado de autonomía se manifiesta también en el hecho de que el aparato digestivo, dada la variedad de regiones que posee, cuyas funciones deben coordinarse localmente, dispone de su propio sistema endocrino y nervioso. También dispone de un sistema inmunitario muy desarrollado pues, potencialmente, es una de las más importantes vías de entrada de gérmenes. Desde el punto de vista embriológico, la formación de los componentes somatopleural y esplacnopleural, además de definir el celoma, contribuye a segregar, desde temprano, estos dos conjuntos de poblaciones celulares embrionarias precursoras de órganos. En la figura SC 3-6-1 A, la línea de puntos muestra cómo, ya al principio del PS, a) los elementos ubicados en la línea media (placa neural, notocorda, somita) junto a la somatopleura, que forman las estructuras de la vida de relación, se segregan de b) la esplacnopleura y el mesodermo intermedio que forman los aparatos de la vida vegetativa. Las figuras SC 3-6-1 B a D muestran que a) cuando el embrión se pliega, el mesodermo intermedio y la hoja esplácnica del mesodermo lateral se asocian formando la cresta urogenital y que b) en la línea media se genera el meso que une a la somatopleura y la esplacnopleura.

Fig. SC 3-6-1. Esquemas de cortes transversales de embriones de diferentes edades (A. 22 días; B. 24 días; C. 28 días y D. 31). En B a D los cortes transversales pasan por el intestino posterior. La línea de puntos muestra la frontera entre las regiones embrionarias que originarán órganos de la vida de relación y de la vida vegetativa. Recomendamos al lector identificar y nombrar cada uno de los tejidos y estructuras embrionarias y analizar sus cambios de posición y tamaño durante el período considerado. Desde el punto de vista de la Biología del Desarrollo, la importancia de la formación de la somatopleura y la esplacnopleura radica en que por medio de este proceso se constituyen dos sistemas –bastante independientes y autónomos– de desarrollo interactivo. En efecto, cada uno de ellos está integrado por un par de elementos que

interactúan: un componente epitelial y un componente mesenquimático (somatopleura = ectodermo + hoja somática del mesodermo lateral y esplacnopleura = endodermo + hoja visceral del mesodermo lateral). Que estos dos elementos se desarrollan interactivamente se demuestra por el hecho de que la separación de los componentes epitelial y mesodérmico impide el desarrollo de ambos. Ello se debe a que ninguno de ambos tejidos se desarrolla sin las señales provenientes del otro. Las señales involucradas en las interacciones del desarrollo son en su mayoría moléculas difusibles de escaso rango de alcance. Vale decir, operan paracrinamente como mediadores locales. Debido a ello, una consecuencia importante de la deslaminación del mesodermo lateral es que la formación del celoma contribuye a separar el par de elementos interactivos somatopleurales del par de elementos interactivos esplacnopleurales. Esto contribuye a que las señales generadas en la esplacnopleura no operen sobre la somatopleura y recíprocamente (SC 3-11. La deslaminación del mesodermo lateral y la especificación de las hojas somáticas y esplácnicas del celoma).

Bibliografía Gasser RF. (1975). Atlas of human embryos. The endowment for human development, INC. O’Rahilly R, Muller F. (1987). Stages 8 to 12 in: Developmental stages in human embryos. Including a Revision of Streeter's ''Horizons" and a Survey of the Carnegie Collection. Carnegie Institution of Washington. SC 3.7. EL ORIGEN, LA PROGRAMACIÓN TEMPORAL Y LA ORGANIZACIÓN ESPACIAL DE LA SEGMENTACIÓN DEL MESODERMO PARAXIL. V. Flores, M. Rapacioli Se denomina somitogénesis el conjunto de eventos, correspondientes a los niveles de organización molecular, celular y tisular, que conducen a la formación de segmentos o somitas en el mesodermo paraxil. En sentido restringido se utiliza el término para aludir al proceso por medio del cual a partir del mesodemo presomítico o placa de segmentación se forman somitas. En sentido amplio el término incluye todos los procesos que acontecen desde la aparición de la población celular precursora del mesodermo paraxil (pcpMP), la formación del mesodermo presomítico, su programación, y su maduración en somita. La segmentación del mesodermo paraxil posótico progresa en sentido céfalo-caudal con periodicidad típica. En el hombre se originan tres pares de somitas por día; en promedio, un par de somitas cada ocho horas. Algunos experimentos de sección transversal del embrión indican que la pcpMP posótico, y responsable de su segmentación, se localiza en la región cefálica del surco primitivo. Existe una primera fase, hasta el estado de máxima longitud del surco primitivo, en la que la pcpMP se localiza en el epiblasto (Fig. SC 3-7-1 A). Las células que se invaginan durante esta fase originan el mesodermo paraxil preótico. Existe una segunda fase, desde el inicio de la regresión del surco primitivo y hasta la constitución del apéndice caudal, durante la cual el lugar que ocupa la pcpMP posótico es motivo de controversias. Algunos proponen la existencia de una pcpMP, ubicada en el surco primitivo, que origina las células del mesodermo presomítico. Las células más cefálicas originarían la región medial del mesodermo presomítico y las más caudales originarían la región lateral de dicho mesodermo. Otros autores aceptan la existencia de una pcpMP en la región cefálica del surco primitivo, que originará la región medial del mesodermo paraxil, pero consideran que las células de la región lateral de dicho mesodermo se origina a partir de células ubicadas más lateralmente, en el epiblasto (Fig. SC 3-7-1 B y C). En una tercera fase, constituido el apéndice caudal, todas las células del mesodermo paraxil ‒mediales y laterales‒ se originan a partir de una única pcpMP medial (Fig. SC 3-7-1 D). Existe coincidencia en que, en

todas estas fases, se respeta el plan general de la gastrulación: las células que se invaginan a través de la región cefálica del surco primitivo (y del apéndice caudal) adquieren posiciones mediales en el disco embrionario y las que se invaginan caudalmente adquieren posiciones laterales.

Fig. SC 3-7-1. La figura ilustra dos modelos sobre la localización y migración de las células precursoras del mesodermo paraxil. Ambos modelos coinciden en cuanto a la primera y la

última fases (A y D) y difieren en las fases intermedias (B y C). A. Primera fase, la pcpMP se halla en el epiblasto. B-C. Fase de regresión del surco primitivo. Un modelo –mitad izquierda del esquema– propone que las células que formarán la región medial del mesodermo paraxil (verde) se halla en la zona medial, y caudal al organizador, y que las células que formarán la región lateral del mesodermo paraxil (violeta) se hallan en la región del epiblasto adyacente al surco primitivo. Otro modelo –mitad derecha del esquema– propone que todas las células que formarán el mesodermo paraxil se hallan a lo largo del surco primitivo. Las más cefálicas originarían la región medial de dicho mesodermo (verde) y las más caudales formarán la región lateral del mesodermo (violeta). D. Fase de segmentación. En la última fase todas las células precursoras del mesodermo paraxil se hallan en la línea media cefálica del apéndice caudal, inmediatamente caudal al organizador. Ellas seguirían con una organización tal que las cefálicas y las caudales originarían zonas mediales (verde) y laterales (violeta), respectivamente, del mesodermo paraxil. Desde la formación del surco primitivo en adelante, la formación de somitas a partir de la pcpMP ocurre según la siguiente secuencia de eventos. Con el crecimiento en longitud del embrión, la ppMP se desplaza en sentido caudal y va dejando dos bandas mesodérmicas, el mesodermo presomítico o placa de segmentación, a ambos lados del mesodermo axil cordal (notocorda) y del surco neural. Las células del mesodermo presomítico forman un mesénquima laxo que progresivamente se compacta en hacia el extremo cefálico. Posteriormente, cuando las células van a formar un somita, sufren una transición mesenquimático-epitelial (SC La transformación del mesodermo presomítico en somita. CMD involucrados en la transición mesenquimático epitelial (T m-e)). Las células se adhieren fuertemente entre sí, se separan de las de los somitas adyacentes y forman una estructura epitelioide que luego se diferencia en un somita epitelial con una luz central, el miocele, ocupada por células mesenquimáticas. Los cambios temporales descritos, válidos para cada segmento, pueden visualizarse también recorriendo el espacio desde la región caudal a la cefálica del mesodermo presomítico (Fig. SC 3.7.2).

Fig. SC 3-7-2. A. Corte histológico parasagital del mesodermo paraxil de un embrión de pollo (33 horas). B. Vista dorsal de un embrión de pollo de la misma edad en la que la línea de puntos marca el plano del corte ilustrado en A. En A. se observa que el mesodermo paraxil posee una región caudal no segmentada, o mesodermo presomítico, y una porción segmentada. En el mesodermo presomítico, la flecha horizontal marca el límite entre la porción caudal laxa y la cefálica más compacta en donde se está iniciando el proceso de transición mesenquimático-epitelial. En la región cefálica a la flecha, las células adyacentes al ectodermo y endodermo gradualmente se compactan y forman un tejido epitelioide. Al llegar al extremo cefálico del mesodermo presomítico se constituye el segmento (somitómero) S0 (cero). Desde allí, en sentido cefálico, los somitas están numerados con números romanos. SI (uno) es el último segmento corporal formado. Diez segmentos más arriba de S0 se halla un somita maduro (S IX). Nótese que en la región ventral de los somitas X y XI ya se está disgregando el esclerotomo. En un nivel próximo al indicado por la flecha horizontal se halla el frente de determinación de la identidad de segmentos. Este frente se mantiene a distancia constante del organizador hasta la formación del somita número 25 (en el pollo). Posteriormente, junto con el acortamiento del mesodermo presomítico, se modifica hasta terminar desapareciendo. Flecha vertical: eje céfalo-caudal. Ec: ectodermo; En: endodermo. Fotografías reproducidas con autorización de Dra. M. Rapacioli. Durante el período somítico, el mesodermo presomítico se extiende desde el nódulo de Hensen hasta el último somitómero constituido. La longitud del mesodermo presomítico varía en función del tiempo y depende del balance entre dos factores: a) la velocidad a la cual se forman somitómeros (disminuye su longitud) y b) la velocidad de incorporación de nuevas células desde la ppMP al mesodermo presomítico (aumenta su extensión). Al principio del período somítico la longitud del mesodermo presomítico aumenta, luego se estabiliza y finalmente disminuye gradualmente. Dada la dinámica descrita, el proceso de somitogénesis: a) se cumple según un orden espacial (se forman a intervalos espaciales regulares) direccional (los nuevos se forman caudalmente a los precedentes); b) desde el punto de vista temporal es cíclico o periódico (se forman nuevos segmentos a intervalos de tiempo regulares); además c) exhibe una dinámica regulada bilateralmente (se forman segmentos de modo sincronizado en ambos lados del embrión). La existencia de un gradiente céfalo-caudal de segmentación ha hecho suponer que el proceso podría estar controlado por medio de estímulos originados en alguna parte de la región cefálica. Éstos, al propasarse, promoverían la formación de segmentos desde dicha región hacia el extremo opuesto. Un mecanismo de este tipo podría establecer un control temporal y un orden espacial en la formación somitas. En la actualidad se sabe que existe un control temporal que no depende de la propagación espacial de un estímulo. El tiempo preciso en el que cada segmento se forma parece estar determinado por un reloj biológico (SC 3.8 Somitogénesis. Evidencias moleculares de la existencia de un oscilador o reloj de segmentación; SC El reloj de segmentación. Vías de señalización que se activan cíclicamente y la sincronización intercelular de los ciclos; SC Somitogénesis. Bases moleculares del frente de determinación y de la instalación y mantenimiento de gradientes en la placa de segmentación del mesodermo paraxil; SC 3.9. Mecanismos de integración molecular entre el reloj de segmentación y el gradiente de somitogénesis). La existencia del reloj se dedujo a partir de experimentos en los que se produce una solución de continuidad (corte transversal) en el mesodermo paraxil en

segmentación y se estudia a continuación el patrón temporal de segmentación en los dos fragmentos resultantes. Tal manipulación experimental impediría la segmentación de la región caudal al punto de separación si a) se tratara de una onda que se propaga desde el extremo cefálico o si b) las células de un cierto nivel segmentario necesitaran alguna información proveniente del anterior para iniciar su segmentación. Estos experimentos no alteran el patrón temporal de segmentación en la región caudal al sitio de sección. Su segmentación se inicia en el momento en que normalmente se hubiera segmentado si hubiera estado en su posición normal (Fig. SC 3.7.3). Ello indica que las células del mesodermo paraxil se encuentran programadas a producir un segmento en un momento determinado. La existencia de tal programación indica que el mesodermo paraxil ya posee organización predecesora de la metamérica antes de que existan evidencias estructurales de segmentación.

Fig. SC 3-7-3. Representación esquemática de la programación temporal de la segmentación del mesodermo paraxil. A. Los somitas se constituyen como transiciones mesenquimático-epiteliales locales a partir del mesodermo presomítico. A intervalos regulares de tiempo (t1, t2 … tn) se van formando somitas desde el extremo cefálico al caudal. B-C. La separación, en dos bloques, del mesodermo paraxil, de modo que no haya interacciones entre ambos, no impide su segmentación. En B se separa al mesodermo paraxil en una porción cefálica que se está segmentando –ha llegado al S4– y una región caudal lejana al punto de formación del S4. En C se observa que, finalizada la segmentación de la región cefálica, que llega hasta el S6, inmediatamente la segmentación se inicia, con la formación de S7, en la región caudal. La separación experimental de las regiones cefálica y caudal del mesodermo paraxil no perturba la cronología de la segmentación. Este resultado muestra que la segmentación se halla programada desde antes de modo que diferentes regiones del mesodermo se comportan autónomamente. En coincidencia con los experimentos descritos, la inversión (rotación de 180º) del eje céfalo-caudal de porciones grandes del mesodermo presomítico ocasiona una inversión del progreso de la segmentación (de caudal a cefálico). Sin embargo, la inversión del eje céfalo-caudal de porciones pequeñas (longitud equivalente sólo a un segmento) origina resultados diferentes dependiendo de la región analizada. En regiones cefálicas, en donde la compactación ya se inició, ocasiona la inversión del eje céfalo-caudal del segmento. En regiones caudales, que se encuentran en fase mesenquimática, la inversión no produce ningún efecto. En regiones intermedias, el resultado es variable, en general con alteraciones en la segmentación. La discrepancia entre resultados de inversiones de porciones extensas o pequeñas y entre regiones cefálicas ya estabilizadas y caudales, aún lábiles, pone de manifiesto la existencia de Int c-c que tardan un cierto tiempo hasta que se estabilicen las especificaciones o programaciones realizadas a lo largo del eje céfalo-caudal. Estos resultados muestran la existencia de, al menos, dos regiones morfológica y funcionalmente diferentes en el mesodermo presomítico. Una región caudal, con características histológicas típicas de mesénquima, que presenta mayor plasticidad; y una región cefálica, donde el proceso de compactación ya ha comenzado, que ya posee organización segmentaria pero sin manifestaciones estructurales (véase SC Somitogénesis. Bases moleculares del frente de determinación y de la instalación y mantenimiento de gradientes en la placa de segmentación del mesodermo paraxil).

Bibliografía Limura T, Yang X, Weijer CJ, Pourquié O. (2007). Dual mode of paraxial mesoderm formation during chick gastrulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(8):2744-9. ourquié O. (2004). The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech Dev. 121(9):1069-79. -Spratt NT. (1955). Analysis of the organizer center in the early chick embryo I. Localisation of prospective notochord and somite cells. J Exp Zool. 128, 121-62. SC 3.8. SOMITOGÉNESIS. EVIDENCIAS MOLECULARES DE LA EXISTENCIA DE UN OSCILADOR O RELOJ DE SEGMENTACIÓN. V. Flores, M. Rapacioli

En anfibios, la eliminación de células de la blástula genera embriones pequeños con un número normal de somitas, pero el número células en cada somita es inferior al normal. Observaciones como esta y otras presentadas en SC 3.7. El origen, la programación temporal y la organización espacial de la segmentación del mesodermo paraxil han llevado a proponer la existencia de un “oscilador o reloj” que controlaría la periodicidad de la somitogénesis. El modelo propone que la expresión cíclica de algunas proteínas permitiría a las células oscilar entre dos estados: uno permisivo o apto para formar somitas y uno no permisivo. Otro aspecto del modelo plantea que, según el embrión crece longitudinalmente en sentido caudal, un “frente de maduración” se desplaza, también en sentido caudal y se mantiene a una cierta distancia de la población celular precursora del mesodermo paraxil (ppMP). Las células del mesodermo paraxil que llegan a dicho frente en estado permisivo se diferenciarían en somitas, las que llegan en estado no permisivo no. De ese modo se formarían somitas en forma periódica. Algunos estudios ulteriores mostraron la existencia de patrones de expresión génica cíclica que apoyan el modelo precedente (SC El reloj de segmentación. Vías de señalización que se activan cíclicamente y la sincronización intercelular de los ciclos). Tanto la ppMP como el mesodermo presomítico expresan algunos genes cíclicamente. Cada célula sintetiza y degrada cíclicamente ciertas proteínas produciendo una oscilación periódica en la concentración de éstas (SC Modelos de expresión génica oscilatoria o cíclica. Requisitos. Posibles sitios de regulación de los modelos). Las experiencias de disociación de células muestran que la capacidad de oscilar y la amplitud y frecuencia de las oscilaciones es intrínseca de cada célula; sin embargo, interactivamente pueden sincronizar sus ciclos. Como resultado de esta sincronización, en el mesodermo presomítico existen zonas cuyas células oscilan en fase (sincrónicamente). Mientras las células de la región caudal expresan simultáneamente un gen, las de la región cefálica no lo expresan. Cuando las células caudales cesan la expresión de dicho gen, las de la región cefálica inician su expresión. Ello genera la impresión de la existencia de ondas de propagación de expresión génica y síntesis de proteínas. Estos ciclos se repiten periódicamente y el período (longitud de onda) coincide con el de aparición de somitas (Fig. SC 3-8-1).

Fig. SC 3-8-1. Modelo de la formación periódica de somitas o de reloj de segmentación (Modelo experimental: Embrión de pollo). A. El esquema representa la región caudal del embrión en la que se halla el esbozo caudal (en la línea media) y las placas de segmentación y los segmentos más caudales derechos e izquierdos. Ilustra que periódicamente ‒cada 90 minutos‒ se forma un nuevo segmento. En negro se representa la zona de expresión de la proteína Hairy que forma parte del reloj. Este patrón de expresión se repite cada 90 minutos. Nótese que parece que se tratara de una onda que se propaga desde el extremo caudal al cefálico. B. Ilustra el período de tiempo que transcurre desde el momento en que una población celular, destinada a formar un cierto somita (círculo negro), emerge del extremo caudal hasta que se convierte en somita. Dicho período es de 18 horas.

Durante ese lapso se producen 12 ondas de expresión de Hairy y se forman 12 poblaciones celulares que formarán, a su debido tiempo, otros tantos segmentos. Cada población celular precursora de un somita se agrega al que lo precede a intervalos de 90 minutos. El proceso completo de formación de un somita puede explicarse de la siguiente forma. Periódicamente, en la ppMP o reloj de segmentación, se generan poblaciones celulares que formarán, con la misma periodicidad, sucesivos somitas. Dado que cada nuevo grupo se agrega caudalmente al que lo precede, ello genera la impresión de que las células que formarán cada somita se mueven en sentido cefálico cuando, en realidad, quedan fijos en su lugar mientras el proceso de formación de nuevos segmentos progresa en sentido caudal. Existe un lapso de tiempo durante el cual la longitud del mesodermo presomítico se mantiene constante. Durante ese lapso, entre el reloj de segmentación y el último somita formado existen doce grupos de células sincronizadas que formarán 12 somitas sucesivos según vayan llegando al frente de diferenciación de somitas. Cada uno de estos 12 grupos de células precursores de somitas, en el lapso de tiempo transcurrido entre el momento que abandonan el reloj de segmentación y el momento en que se diferencian en somita, cumplen 12 ciclos de expresión génica y síntesis de proteína. La extensión de las áreas de expresión génica sincronizada es más extensa en la región caudal donde se halla la ppMP o reloj de segmentación. Estos dominios de expresión se van estrechando hacia el extremo cefálico de modo que, al llegar a la zona de maduración de somitas, cada área ocupa sólo la mitad de un somita, específicamente la mitad caudal del somita naciente. Como se señaló, los ciclos de expresión génica alternante no representan desplazamientos celulares. Tampoco son el resultado de una señal que se propaga a lo largo del mesodermo presomítico sino que resultan de la sincronización local de una propiedad intrínseca de las células. Varios estudios de expresión de la proteína factor de transcripción c-hairy1 muestran que con la formación de cada grupo precursor de un somita, todo el mesodermo presomítico experimentará un ciclo (on-off) de expresión. En el intervalo de tiempo que transcurre entre a) el momento en que un grupo de células del reloj de segmentación se determina en mesodermo paraxil e ingresa al mesodermo presomítico y b) el momento en que dicho grupo se transforma en somita, sus células experimentan 12 ciclos de expresión de c-hairy. También en el mismo intervalo de tiempo se han producido 12 ciclos en todo el mesodermo presomítico y se han formado 12 nuevos somitas. Durante cada uno de estos ciclos, las células de la ppMP sufren un proceso de reprogramación o reseteo de la información genética por medio del cual se selecciona el conjunto o combinatoria típica de factores de transcripción Hox que establece la identidad de segmento de cada somita (SC Somitogénesis. Bases moleculares del frente de determinación y de la instalación y mantenimiento de gradientes en la placa de segmentación del mesodermo paraxil). Así, los sucesivos grupos precursores de sucesivos somitas surgen de la ppMP con una diferente identidad que depende del momento en que abandonan el reloj de segmentación.

Bibliografía Andrade RP, Pascoal S, Palmeirim I. (2005). Thinking clockwise. Brain Res Brain Res Rev. 49(2):114-9. Cooke J, Zeeman EC. (1976). A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58(2):455-76. Pourquié O. (2004). The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech Dev. 121(9):1069-79.

SC 3.9. MECANISMOS DE INTEGRACIÓN MOLECULAR ENTRE EL RELOJ DE SEGMENTACIÓN Y EL GRADIENTE DE SOMITOGÉNESIS. V. Flores, M. Rapacioli Las proteínas señal Fgf y Wnt, por un lado, instalan gradientes informativos en el mesodermo presomítico y, por otro, integran el oscilador o reloj de segmentación (SC 3.8. Somitogénesis. Evidencias moleculares de la existencia de un oscilador o reloj de segmentación; SC Somitogénesis. Bases moleculares del frente de determinación y de la instalación y mantenimiento de gradientes en la placa de segmentación del mesodermo paraxil). Este hecho posibilita la integración de ambos fenómenos informativos. El modelo propuesto pretende explicar algunos aspectos de la somitogénesis como, por ejemplo, su carácter periódico y la instalación y mantenimiento de diferencias a lo largo del eje cf-cd del embrión. Nos centraremos aquí en cuatro aspectos centrales: a) la asignación y la determinación de la identidad de segmento; b) la determinación del borde intersegmentario; c) el establecimiento del eje cf-cd de cada segmento, y d) la diferenciación del somita. En la figura SC 3-9-2 se ilustra esta secuencia de eventos a las que se incorporan algunos detalles que agregan precisión a la secuencia. a) Asignación de identidad de segmento. La identidad de segmento parece depender de la expresión de una combinación típica de factores de transcripción de la familia Hox. Se ha propuesto que la identidad de segmento se instala en dos etapas sucesivas: 1) en un primer paso, una combinación típica de genes Hox ingresa en un estado apto para la transcripción en las células de la ppMP o reloj de segmentación. Este hecho, que es reversible, asigna una especificación lábil; 2) en un segundo paso, en el frente de determinación, se produce la determinación de la identidad; vale decir, la combinatoria de genes Hox que identifica al segmento queda irreversiblemente establecida y se inicia la expresión de la combinatoria de factores de transcripción Hox que guiarán la morfogénesis del segmento. Durante la fase en la que el mesodermo presomítico tiene longitud estable, el frente de determinación se mantiene en una posición constante dentro de él (a una distancia constante respecto de la ppMP). Durante dicha fase, la aplicación de una microesfera embebida en Fgf8 al lado del mesodermo presomítico produce un aumento en la concentración local del Fgf8 y, en consecuencia, un desplazamiento, en sentido cefálico, del frente de determinación (Fig. SC 3-9-1 t1). Este hecho hace que el segmento corporal generado en esa ubicación adquiera una identidad de segmento más caudal que la que hubiera adquirido en condiciones normales (Fig. SC 3-9-1 t4). Este resultado se explica considerando que las células de la región realizarán un número mayor de ciclos celulares antes de su determinación en el frente de avance desplazado y, en consecuencia, adquieren una asignación de segmento más caudal. El resultado es compatible con la idea de que la asignación depende del tiempo de permanencia en la zona plástica o indeterminada del mesodermo presomítico. Ciertos experimentos en los que se altera la expresión cíclica de algunas proteínas del reloj de segmentación, como Lfng, alteran la secuencia en la identidad de vértebras a lo largo del eje céfalo-caudal.

Fig. SC 3-9-1. Esquema que ilustra modificaciones en la somitogénesis como consecuencia de modificaciones en la concentración local de Fgf8 en experimentos en los que se implanta una microesfera embebida en este factor (mitad derecha). En t1 se produce un desplazamiento en sentido cefálico del frente de determinación y, como consecuencia, la formación de segmentos 21 y 22 de menor tamaño (t1-t2). Las células de la zona vecina a la microesfera permanecen expuestas a concentraciones elevadas de Fgf8 durante más tiempo y realizan un número mayor de ciclos celulares antes de su determinación; en consecuencia adquieren una asignación de segmento más caudal (t4). b) Determinación del borde intersegmentario. El modelo propone que el intervalo entre somitas sucesivos depende de la distancia recorrida por el frente de determinación durante un ciclo del reloj de segmentación (Fig. SC 3-9-1 t1). Los resultados experimentales indican que el borde intersegmentario se define en el frente de determinación; la región donde la concentración de Wnt3a y Fgf8 es inferior al umbral necesario para que las células del mesodermo presomítico mantengan su estado plástico. En el experimento descrito en el punto anterior (desplazamiento en sentido cefálico del frente de determinación) no sólo se modifica la identidad de segmento sino también la posición de los bordes intersegmentarios y, en consecuencia, el tamaño de los somitas. Los somitas que se forman cefálicamente a la microesfera son más pequeños que lo normal, a éstos les sigue un somita de mayor tamaño (adyacente a la microesfera) y los restantes son normales. Este resultado parece ser consecuencia de que la onda de expresión génica cruza el frente de determinación cefálicamente respecto del lugar en el que lo hubiera cruzado en condiciones normales. En un experimento opuesto, la inhibición de la acción del Fgf8 hace que el frente de determinación se desplace en sentido caudal; en este caso se forman somitas más grandes que lo normal. La interpretación de este resultado es similar: la onda de expresión génica cruza el frente de determinación caudalmente con respecto al

lugar en el que lo hubiera cruzado en condiciones normales. Estos resultados sugieren que en el frente de determinación se definen los límites intersegmentarios y no la población celular que formará cada segmento. c) Compartimentalización y establecimiento del eje cf-cd del somita. Aparte del hecho de que la polaridad cf-cd global del mesodermo paraxil puede ser descrita en términos de la sucesión de diferentes somitas (S1, S2 ... Sn), cada somita tiene impresa en sí mismo una polaridad cf-cd. Cada somita posee un compartimento cefálico y uno caudal con diferentes propiedades de desarrollo y tales diferencias son consecuencia de una expresión génica diferencial entre ambas regiones. Dicha expresión génica diferencial se instala inmediatamente después de la definición del borde caudal del segmento y antes de iniciarse la compactación y segregación del somita del resto del mesodermo presomítico. Este fenómeno involucra algunas proteínas que participan del reloj de segmentación y otras cuya expresión se inicia recién después de cruzado el frente de determinación. Como ejemplo, el factor de transcripción Mesp2 se expresa cefálicamente al frente de determinación en todas las células que formarán un cierto segmento. Luego, su expresión queda restringida a la porción cefálica del segmento. El Mesp2 actúa seleccionando una de dos cascadas divergentes de la vía de señalización de Notch (activa una e inhibe otra). Ambas acciones producen, sinérgicamente, la inhibición de la expresión de la proteína Delta. Como resultado, la expresión de Mesp2 se restringe a la región cefálica y la de Delta a la región caudal de cada segmento. La expresión génica diferente en estas dos mitades posee, más tarde, efectos sobre la diferenciación y posterior evolución e interacción con tejidos vecinos. Como ejemplo, la diferente interacción con células de la cresta neural y los axones en crecimiento contribuye a la organización segmentaria del sistema nervioso periférico. Estas diferencias también son importantes a la hora de la resegmentación que involucra la formación de las vértebras. d) Diferenciación del somita. El somita diferenciado o maduro posee estructura de vesícula epitelial con miocele y células mesenquimáticas en su interior (Fig. SC 3-9-3). Esta organización epitelial es esencial para el establecimiento de subregiones con diferente potencia de desarrollo y a la evolución ulterior de cada una de ellas. La organización epitelial permite, por ejemplo, que el somita establezca Int c-c espacialmente ordenadas con tejidos vecinos.

Fig. SC 3-9-2. Secuencia de eventos que ocurren durante la somitogénesis. A. Representación esquemática de la sucesión temporal y organización espacial de etapas de la somitogénesis. Los números arábigos indican, por un lado, la sucesión temporal de etapas en cada nivel del eje céfalo-caudal y, por otro, cómo tales etapas quedan organizadas espacialmente a lo largo de dicho eje. B. Representación esquemática de los cambios histogenéticos que ocurren durante las etapas indicadas en la figura A. Las espirales representan expresión génica cíclica. Descripción en el texto.

Una vez superado el frente de determinación, las células que integraran un somita inician una condensación gradual. Las células ubicadas dorsal y ventralmente, es decir, las células que contactan con ectodermo y endodermo, comienzan a manifestar cambios en la adhesividad celular y adquieren carácter epitelioide. Poco después aparece el surco intersegmentario y las células que formarán un nuevo segmento se separan del resto del mesodermo presomítico. Producida esta segregación, continúa la T m-e completándose la polarización celular y la definición de un miocele (Fig. SC 3-9-3).

Fig. SC 3-9-3. Secuencia de eventos que ocurren durante la somitogénesis. A. Representación esquemática de la sucesión temporal y organización espacial de etapas de la somitogénesis. Los números arábigos indican, por un lado, la sucesión temporal de etapas en cada nivel del eje céfalo-caudal y, por otro, cómo tales etapas quedan organizadas espacialmente a lo largo de dicho eje. B. Representación esquemática de los cambios histogenéticos que ocurren durante las etapas indicadas en la figura A. Las espirales representan expresión génica cíclica. Descripción en el texto. Se han identificado algunos genes involucrados en la T m-e. Algunos de ellos se expresan como resultado de la activación de las vías de señalización de Notch y Wnt. El inicio de la T m-e coincide con un cambio global del patrón de expresión génica que sufren las células al superar el frente de determinación (SC La transformación del mesodermo presomítico en somita. CMD involucrados en la transición mesenquimático-epitelial (T m-e)).

Bibliografía Aulehla A, Herrmann BG. (2004). Segmentation in vertebrates: clock and gradient finally joined. Genes Dev. 18(17):2060-7. Dubrulle J, McGrew MJ, Pourquié O. (2001). FGF signaling controls somite boundary position and regulates segmentation clock control of spatiotemporal Hox gene activation. Cell. 106(2):219-32. Duester G. (2007). Retinoic acid regulation of the somitogenesis clock. Birth Defects Res C Embryo Today. 81(2):84-92. SC 3.10. CONCEPTOS DE MORFOGÉNESIS E HISTOGÉNESIS. LOS PRIMEROS PROCESOS HISTOGENÉTICOS. V. Flores

En términos simples, los conceptos de morfogénesis y de histogénesis aluden a procesos que generan cambios de forma y procesos por medio de los cuales se generan los diversos tejidos, respectivamente. Ambos conceptos son eminentemente morfológicos. El primero se refiere a la descripción de los cambios de forma tal como lo haría un anatomista y el segundo se refiere a cambios que corresponden al nivel de resolución de la microscopia. Obviamente, ambos procesos poseen bases celulares y moleculares y, en sentido estricto, consisten en abstracciones pues los procesos involucrados en la histogénesis habitualmente también participan en generar cambios de forma. La forma es, per se, una abstracción del objeto que se describe y elementos que corresponden a diversos niveles de organización (tejidos, células, organoides subcelulares, macromoléculas, etc.) admiten descripciones morfológicas. Sobre todo durante desarrollo embrionario temprano puede advertirse que muchos fenómenos que ocurren en el nivel de organización celular poseen un papel más morfogenético que histogenético o un papel mixto y no siempre es posible distinguir entre estos dos efectos. La noción de papel morfogenético alude a cambios que ocurren en las células de una población, en el nivel de organización molecular o celular, pero que contribuyen a generar cambios de forma de toda la población o estructura de modo tal que el cambio global admite una descripción microanatómica. El concepto de histogénesis, en sentido estricto, alude a los cambios (celulares y tisulares) que sufren los tejidos embrionarios y que conducen a la formación de los diversos tipos de células y tejidos terminalmente diferenciados. Es un concepto eminentemente morfológico que incluye los cambios estructurales y ultraestructurales involucrados en la diferenciación celular y tisular. Durante la histogénesis, las células que integran los diferentes tejidos embrionarios van adquiriendo las características típicas que permiten identificarlas por su estructura (p. ej., la formación de tejido mesenquimático a partir del mesodermo, la formación de diversos tipos de tejidos conectivos, o epiteliales, a partir del mesénquima, la formación de tejido muscular esquelético a partir de mioblastos, etc.). Nótese que estos ejemplos no aluden a ningún órgano en particular. Sin embargo, el término histogénesis también se utiliza, en otro nivel de organización, para aludir a descripciones acerca de cómo diversos tejidos se integran en la constitución de órganos definidos. Así, se habla de la histogénsis ovárica, renal, hepática, etc. En todos los casos se refieren a procesos que conducen a la diferenciación terminal y a la organización espacial de tejidos y órganos que les permiten cumplir sus funciones específicas. Los cambios que sufren las células o los tejidos en las etapas tempranas del desarrollo no tienen la consecuencia arriba mencionada en forma directa o inmediata. Durante el desarrollo embrionario temprano, los cambios que sufren las diversas poblaciones celulares en general tienen el sentido de un cambio de estado. En general se trata de procesos que llevan a cambios graduales y sucesivos de diferenciación parcial que muchas veces llevan a la formación de estructuras u organizaciones celulares transitorias que no se vinculan directamente a la diferenciación terminal sino al logro de estructuraciones espaciales que garantizan la ocurrencia de las interacciones necesarias para que el desarrollo prosiga con la direccionalidad que lo caracteriza. En este contexto se inscriben muchos cambios que ocurren durante el período presomítico (la formación de la mórula, la de la blástula, la constitución del trofoblasto (su polarización en un tejido de tipo epitelial, la formación de poblaciones de capas germinativas epiteliales en el macizo celular interno que llevan a la constitución del embrión bilaminar, etc.), o del período somítico (el plegamiento del embrión, la transformación del mesodermo presomítico en somitas, las transiciones epitelio-mesenquimáticas y mesenquimático-epiteliales en general, la formación de placodas, etc.) y aun fenómenos que ocurren en etapas más avanzadas. Así, en general, los cambios histológicos tempranos no tienen como función lograr las características de la diferenciación terminal sino, principalmente, dos efectos de desarrollo: a) asociar poblaciones celulares y concretar las interacciones celulares que permiten las reprogramaciones de la información genética que conducen a la elección de vías de desarrrollo y, luego de muchos estados de diferenciación parcial, llegar a la diferenciación terminal y b) lograr organizaciones espaciales transitorias de células y tejidos que, además de garantizar las interacciones celulares mencionadas, constituyen bases para las estructuraciones de los siguientes estados. Cada organización tisular transitoria observada durante el desarrollo y típica de un estado dado es la

base para las organizaciones transitorias características de los siguientes estados. Estas sucesivas diferenciaciones parciales conducen a los diversos estados de diferenciación terminal típicas de los diversos tejidos del adulto.

SC 3.11. LA DESLAMINACIÓN DEL MESODERMO LATERAL Y LA ESPECIFICACIÓN DE LAS HOJAS SOMÁTICAS Y ESPLÁCNICAS DEL CELOMA. V. Flores, M. Rapacioli En los vertebrados, el celoma se forma en la intimidad del mesodermo lateral. Éste es un tejido epitelioide localizado lateralmente al mesodermo intermedio. Una vez constituido, el mesodermo lateral se deslamina en dos hojas: una somática o parietal (HSML) y una visceral o esplácnica (HVML). La deslaminación progresa desde el extremo cefálico al caudal pero no coincide con el progreso de la metamerización del mesodermo paraxil. En embriones de pollo de 10 pares de somitas, el límite caudal de la deslaminación llega hasta el frente de determinación del mesodermo paraxil presomítico (SC 3.7. El origen, la programación temporal y la organización espacial de la segmentación del mesodermo paraxil; SC Somitogénesis. Bases moleculares del frente de determinación y de la instalación y mantenimiento de gradientes en la placa de segmentación del mesodermo paraxil); en el embrión de 20 pares de somitas, la deslaminación llega hasta el organizador primario. En el embrión humano, el proceso coincide aproximadamente con estos datos. En general se acepta que la deslaminación del mesodermo lateral es asimilable a procesos de transición mesenquimático-epitelial (T m-e) (Fig. 1). La deslaminación coincide temporalmente con la T m-e que sufren las células que contactan con las superficies basales del ectodermo y endodermo (SC 0.19. Transiciones reversibles mesenquimático-epitelial y epitelio-mesenquimática. CMD involucrados en su regulación). La región de estas células que contacta con las membranas basales del ectodermo y endodermo adquiere una polarización de tipo basal y, en consecuencia, las regiones opuestas adquieren características del dominio apical de las células polarizadas. Durante este proceso, entre superficies apicales de células enfrentadas se van generando espacios que confluyen hasta que se forma una cavidad única que separa a todas las células dorsales (en contacto con el ectodermo) de todas las ventrales (en contacto con el endodermo). Las dos láminas “epitelizadas” así formadas se despegan una de otra y el espacio generado entre ellas, el futuro celoma, se expande. La figura 3-10-1 muestra la secuencia de los hechos descritos.

Fig. SC 3-10-1. Secuencia de estados histogenéticos durante la formación del celoma embrionario. A-C. Ilustra las fases que transcurren desde el momento en que (A) termina la gastrulación y el mesodermo es una lámina epiteliode continua, (B) la fase en que se empiezan a distinguir estructuralmente las regiones paraxil, intermedia y lateral y el mesodermo lateral inicia la deslaminación y formación del celoma y (C) el momento en que las tres regiones se hallan diferenciadas y el mesodermo lateral se ha deslaminado completamente y formado el celoma embrionario. D. Detalle del inicio de la transición mesenquimático-epitelial que lleva a la formación de una cavidad apical que anuncia la formación del celoma. En la región marcada con asterisco, las células se hallan en fase mesenquimática; en la región ubicada entre las flechas verticales se observa la transformación epitelial y formación de una pequeña cavidad luminal. En la zona epitelizada, las células, inicialmente mesenquimáticas, se compactan, comparten mayor superficie de contacto debido al aumento en la fuerza de adhesión cel-cel, se orientan con su eje mayor paralelo al eje dorsoventral, comienza a definirse una membrana apical y las

células comienzan a segregarse en dos poblaciones epiteliales con una luz entre ambas. E. Este proceso no se produce simultáneamente a lo largo del eje medio-lateral sino que primero se generan pequeñas cavidades (flechas) que luego van confluyendo. Fotografías reproducidas con autorización de Dra. M. Rapacioli. Diversos experimentos indican que la deslaminación, la determinación de las hojas somática y visceral y su mantenimiento requieren interacciones con tejidos vecinos. Estas interacciones posibilitan la expresión diferencial de moléculas típicas de cada una de las dos hojas. Los componentes epiteliales y mesodérmicos de la somatopleura y esplacnopleura pueden ser disociados y luego cultivados en forma aislada o reagregados. También se han realizado disociaciones y recombinaciones recíprocas. Bajo dichas circunstancias se puede analizar si cambia la expresión génica típica de cada una de ellas. Experimentos de este tipo indican que la determinación de las hojas somática y visceral del mesodermo lateral, como tales, se produce luego de su deslaminación y que esto depende de su asociación con ectodermo y endodermo respectivamente (SC 3.12 Epitelización y deslaminación del mesodermo lateral. Cambios en el patrón de expresión de proteínas asociados a la especificación y determinación de las hojas somática y visceral del mesodermo lateral). Existe un período durante el cual la especificación establecida en estas hojas es lábil, vale decir, pasible de ser modificada. Si durante dicho período se disocian los componentes mesodérmicos de los epiteliales con los que interactúan, el mesodermo pierde las características especificadas. Por otro lado, si durante este período se asocia la HVML con el ectodermo somatopleural, el mesodermo puede ser reespecificado en sentido somático. Con la determinación, el patrón de expresión génica típica de cada una de las hojas se hace irreversible. Estos resultados ilustran la importancia que poseen las interacciones entre poblaciones celulares en los proceses de especificación y determinación que ocurren durante el desarrollo embrionario (SC 3.6. La celomización. Somatopleura y esplacnopleura. Significado biológico).

Bibliografía Mahlapuu M, Ormestad M, Enerbäck S, Carlsson P. (2001). The forkhead transcription factor Foxf1 is required for differentiation of extraembryonic and lateral plate mesoderm. Development. 128:155-66. Funayama N, Sato Y, Matsumoto K, Ogura T, Takahashi Y. (1999). Coelom formation: binary decision of the lateral plate mesoderm is controlled by the ectoderm. Development. 126: 4129-38. SC 3.12. EPITELIZACIÓN Y DESLAMINACIÓN DEL MESODERMO LATERAL. CAMBIOS EN EL PATRÓN DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS ASOCIADOS A LA ESPECIFICAIÓN Y DETERMINACIÓN DE LAS HOJAS SOMÁTICA Y VISCERAL DEL MESODERMO LATERAL. V. Flores, M. Rapacioli La deslaminación del mesodermo lateral, la especificación de las hojas somática (HSML) y visceral (HVML) y su mantenimiento requieren interacciones con tejidos vecinos. Estas interacciones promueven la expresión diferencial de proteínas en cada una de las dos hojas. Dicho fenómeno ha sido asimilado a un proceso de determinación. Los componentes epiteliales y mesodérmicos de la somatopleura y esplacnopleura pueden ser disociados y, luego, cultivados en forma aislada o reagregados. También se han realizado disociaciones y recombinaciones recíprocas. Bajo dichas circunstancias se pueden analizar cambios moleculares y celulares dependientes de interacciones. - Si se disocia la esplacnopleura de embriones de 23 pares de somitas, la HVML cultivada en forma aislada deja de expresar moléculas típicas de la HV. Si se cultiva la esplacnopleura completa, la HVML mantiene su patrón

de expresión génica. Este experimento indica que el endodermo participa del mantenimiento de la especificación de la HVML. - Si se disocian los componentes de la esplacnopleura y la HVML vecina a los somitas más caudales (embrión de 16 a 22 pares de somitas) se recombina con ectodermo somatopleural (embrión de 20 pares de somitas) se obtiene el siguiente resultado: se produce una disminución de la expresión de proteínas típicas de HVML, como el factor de transcripción Foxf1, y se estimula la expresión de proteínas típicas de la HSML como las homeoproteínas Prx1 y Irx3). - El mismo experimento realizado con HVML de embriones de 23 pares de somitas o más viejos ya no produce estas modificaciones; la HVML continúa con su patrón típico de expresión. Estos experimentos permiten concluir: a) que la región de la HVML, correspondiente al nivel de los somitas caudales de embriones de 22 pares de somitas o menos, ya está especificada como tal pero en forma lábil; b) que puede ser reespecificada como HSML por la acción de señales generadas por el ectodermo somatopleural y c) que la HVML se determina como tal en el estado de 23 pares de somitas, si se acepta la expresión de estas moléculas como indicio de determinación. - Si en experimentos similares al anterior se combina la HVML con ectodermo de la región dorsal (no somatopleural), la HVML no modifica su patón de expresión proteica. El resultado indica que el ectodermo somatopleural (lateral) es el tejido que posee la capacidad de redireccionar la HVML. - La asociación de la esplacnopleura completa (sin disociar sus componentes) con el ectodermo somatopleural no produce un cambio en el patrón de expresión génica en la HVML, vale decir, la HVML no es reespecificada. Este experimento permite concluir que, en presencia de señales provenientes del endodermo esplacnopleural, el ectodermo somatopleural no tiene capacidad de redireccionar o reespecificar la expresión génica de la HVML. Algunos experimentos similares se han realizado con los componentes de la somatopleura. - El cultivo en forma aislada de la HSML de embriones de menos de 23 pares de somitas da lugar a la desaparición del patrón de expresión de proteínas típico de esta hoja. El reagregado del ectodermo somatopleural a la HSML de estos tejidos revierte tal hecho. Estos resultados indican que el ectodermo somatopleural participa del mantenimiento de la especificación de la HSML. - Si el experimento anterior se realiza con embriones de más de 23 pares de somitas, la HSML no pierde la expresión de sus proteínas típicas. Este experimento parece indicar que la HSML se determina en este momento. - Si el cultivo de la HSML de embriones de menos de 23 pares de somitas se realiza en presencia de células productoras de BMP4 y BMP7, la HSML mantiene su patrón de expresión proteica. Esto sugiere que el mantenimiento de la especificación de HSML por parte del ectodermo somatopleural podría estar mediada por moléculas señal del tipo BMP. - Por el contrario, el cultivo de la HVML de embriones de menos de 23 pares de somitas en presencia de células productoras de BMP4 y BMP7 no produce una reespecificación de la expresión de proteínas. Este experimento sugiere que la reespecificación de la HVML por parte del ectodermo somatopleural no está mediada por señales del tipo BMP. Los embriones de ratón que poseen mutado el gen que codifica el factor de transcripción Foxf1 (HFH8) presentan alteraciones en la deslaminación del mesodermo lateral. En el ratón, esta molécula se expresa primero en las dos hojas del mesodermo lateral y luego su expresión se restringe a la HVML. Se ha propuesto que en las

etapas tempranas esta molécula participaría en la transición mesenquimático-epitelial. En el ratón, todas las células del mesodermo lateral expresan la proteína Irx3 que es considerada típica del HSML. Esto sugiere que la proteína Foxf1 está involucrada en la inhibición de la expresión de Irx3 en la HVML.

Bibliografía Mahlapuu M, Ormestad M, Enerbäck S, Carlsson P. (2001). The forkhead transcription factor Foxf1 is required for differentiation of extraembryonic and lateral plate mesoderm. Development. 128:155-66.z Funayama N, Sato Y, Matsumoto K, Ogura T, Yoshiko Takahashi Y. (1999). Coelom formation: binary decision of the lateral plate mesoderm is controlled by the ectoderm. Development. 126: 4129-38.

Capítulo 4. La quinta semana del desarrollo. El agregado de detalles al plan anatómico básico SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 4.1. El origen múltiple y la pluripotencialidad del mesénquima cefálico. El mesodermo paraxil preótico y la cresta neural craneal. V. Flores, M. Rapacioli SC 4.2. ¿Cómo se generan y cómo desaparecen las curvaturas del embrión? V. Flores SC 4.3. La subregionalización y la potencia evolutiva múltiple de las regiones del somita. V. Flores, M. Rapacioli SC 4.1. El origen múltiple y la pluripotencialidad del mesénquima cefálico. El mesodermo paraxil preótico y la cresta neural craneal. V. Flores, M. Rapacioli -El mesénquima cefálico. Se denomina mesénquima cefálico a aquel que ocupa la región cefálica del embrión. Se halla rodeando al encéfalo, y distribuido regularmente entre éste y el ectodermo epidérmico. En el ectodermo epidérmico de dicha región se localizan varias placodas que forman neuroepitelios receptores u otras estructuras asociadas a los órganos de los sentidos, además de otros varios tipos celulares. El mesénquima

cefálico posee origen múltiple. Sus células provienen de: a) las cresta neural craneal, principalmente la esqueletogénica facial, b) el mesodermo paraxil cefálico (craneal o preótico), c) el mesénquima axil precordal, d) algunas placodas y e) la cresta neural anterior o ANR (Anterior Neural Ridge) o zona organizadora del presencéfalo. La población celular mayoritaria corresponde al ectomesénquima originado en la cresta neural esqueletogénica facial (SC El patterning de la región craneofacial II. Factores de transcripción y factores de crecimiento intervinientes; SC El patterning de la cresta neural craneal. Regiones Hox(+) y Hox(-). Su relevancia filogenética y sus papeles de desarrollo). --El mesodermo paraxil cefálico. Es la subpoblación del mesodermo paraxil que ocupa la región preótica del embrión, con capacidad miogénica y encargada de formar músculos de la cara y cuello (cérvico-céfalo-óculo giria, auriculares, mímica, etc.). Clásicamente se considera que esta región forma pequeños bloques mesenquimáticos (somitómeros preóticos) cuyas células rápidamente se desagregan y migran. Sin embargo, basándose en estudios más recientes, algunos autores consideran que en esta región no existen indicios morfológicos de organización segmentaria. De todos modos, la zona exhibe una organización espacial definida ya que distintas subregiones de él poseen derivados musculares típicos (SC La organización segmentaria de la región cefálica: encéfalo, cresta neural y mesodermo paraxil craneales e intestino faríngeo). Estas células migran ventralmente acompañando a las células de la cresta neural craneal y aportan los mioblastos que originan músculos de cara y cuello, así como también células endoteliales. En pollo y ratón existen estudios que indican que el mesodermo paraxil cefálico origina también algunas estructuras óseas del neurocráneo.

-- La cresta neural craneal. La cresta neural craneal es una población de células progenitoras pluripotentes que origina una amplia gama de tipos celulares. Éstos pueden agruparse en tres categorías: a) ectomesenquimáticos, b) neurales y c) melanocíticos. a) Los derivados mesenquimáticos originan los tejidos conectivos, cartílagos y huesos del cráneo y cara y dentina. b) Los derivados neurales incluyen neuronas sensoriales y células gliales del sistema nervioso periférico de la vida de relación y del sistema nervioso autónomo. c) Los derivados de la línea melanocitogénica originan células pigmentarias de la dermis de la cabeza y del iris (Cuadro SC 4-1-1: Principales tipos celulares y tejidos derivados de la cresta neural craneal). Se ha postulado que la aparición, a lo largo de la evolución, del linaje ectomesenquimático constituyó una importante contribución al proceso de cefalización ya que origina los componentes tisulares que integran el aparato de la contención neurosensorial (SC La pluripotencialidad y la organización regional y segmentaria de la región cefálica de la cresta neural).

--El mesodermo axil precordal. Las células del mesodermo axil precordal inicialmente se ubican alrededor del extremo anterior de la notocorda en la región donde se formarán la adenohipófisis y la neurohipófisis. Desde dicha posición muchas células se disgregan y originan parte del mesénquima regional subyacente en el ectodermo del techo del estomodeo. Dicha región también es poblada por algunas células que se desprenden del ectodermo (de la zona ANR o cresta neural anterior) durante el cierre del neuroporo anterior. En esta zona también se han identificado células mesenquimáticas que proceden de la placoda olfatoria y células migrantes de naturaleza neural desprendidas del órgano vomeronasal. Las células de la cresta neural y del mesodermo paraxil craneales se hallan espacialmente organizadas, a lo largo de los ejes céfalo-caudal y dorso-ventral, y durante su migración mantienen posiciones típicas. La figura

SC 4-1-1 muestra las principales vías migratorias que ambas poblaciones celulares siguen durante su migración a los lugares que ocupan en el mesénquima cefálico.

Fig. SC 4-1-1. Ilustra la organización céfalo-caudal de las regiones cefálica y branquial del embrión. A lo largo del eje céfalo-caudal existen diferentes vías de migración en sentido dorso-ventral (flechas) para poblaciones de la cresta neural craneal (A) y el mesodermo paraxil cefálico (B) que ocupan las regiones craneal y branquial del embrión. Estos movimientos celulares organizados posibilitan que la organización segmentaria de las estructuras dorsales (tubo neural, cresta neural craneal y mesodermo paraxil cefálico) se transfiera a regiones laterales y ventrales del embrión. Los números romanos indican la denominación de la región (somitómero) sin aludir a un concepto estricto de metamerización. La figura SC 4-1-2 B y C muestra que las células del mesodermo paraxil migran ventralmente con respecto al ectomesénquima proveniente de la cresta neural y que las células de la cresta neural se distribuyen más superficialmente, vale decir, entre el mesodermo paraxil y el ectodermo. Estas dos poblaciones celulares exhiben una migración extensa, en sentido ventral, formando arcos faríngeos y prominencias faciales. La subpoblación neural de células de cresta neural se queda en una posición más dorsal, adyacente al tubo neural, donde forman los ganglios sensoriales de los nervios craneales. Las células de la cresta neural craneal se segregan del epitelio ectodérmico, específicamente, de la zona de transición entre el ectodermo neural y el ectodermo del área preplacodal (SC La instalación y el refinamiento de la organización espacial de competencias de desarrollo en el área preplacodal; SC La transformación del área preplacodal (área competente de formación de placodas) en línea wolffiana (área de placodas) del sistema sensorial cefálico). Estas células sufren una T e-m y migran desde los pliegues neurales al mesénquima antes del cierre definitivo del tubo neural. Estas células disponen de varias vías o patrones de migración a través de las cuales llegan a diferentes regiones del embrión, donde contribuyen a la formación de diversas estructuras. Las células de la cresta neural craneal que derivan del diencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo, difieren de la cresta neural del tronco en que tienen el potencial de diferenciarse en cartílago, hueso y tejido conectivo (véase Cuadro SC 4-1-1 y SC La potencia de desarrollo de la cresta neural craneal).

Fig. SC 4-1-2. Esquemas que ilustran la organización de los tejidos cefálicos mesenquimáticos y epiteliales. A. Vista dorsal de embrión de 4 somitas. Se ha eliminado el ectodermo general y el tubo neural, dejando al descubierto el mesodermo paraxil (rosa). Los corchetes indican los límites de supuestos somitómeros. B. Vista dorsal de la mitad izquierda de embrión de 10 somitas. El tubo neural se halla en su lugar (visible a la izquierda). El borde de avance de la cresta neural (gris) cubre parcialmente el mesodermo paraxil (rosa). C. Corte transversal, al nivel del posencéfalo, de un embrión de 10 somitas. Muestra las posiciones de las células de la cresta neural y del mesodermo paraxil y sus posiciones relativas respecto del tubo neural, el ectodermo epidérmico y el endodermo faríngeo.

Bibliografía Chai Y, Maxson RE Jr. (2006). Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn 235(9):2353-75. Creuzet S, Couly G, Le Douarin NM. (2005). Patterning the neural crest derivatives during development of the vertebrate head: insights from avian studies. J Anat 207(5):447-59. Helms JA, Cordero D, Tapadia MD. (2005). New insights into craniofacial morphogenesis. Development 132(5):851-61. Noden DM, Trainor PA. (2005). Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. J Anat 207(5):575-601. SC 4.2. ¿Cómo se generan y cómo desaparecen las curvaturas del embrión? V. Flores

Desde el fin de la 3ª SD (momento en que el embrión es plano) hasta el final de la 5ª SD, el embrión sufre un crecimiento diferencial que lo convierte en cilíndrico y con una curvatura de convexidad dorsal. Durante un tiempo, la curvatura dorsal se hace más pronunciada, luego se estabiliza y, finalmente, ya en etapa fetal, el esqueleto axil se rectifica gradualmente y la convexidad dorsal va desapareciendo. La aparición de la convexidad dorsal embrionaria resulta del hecho de que los elementos que ocupan la superficie dorsal del embrión crecen en longitud (eje céfalo-caudal) y transversalmente (ejes medio-laterales) bastante más que los que ocupan la superficie ventral. Nótese que las superficies laterales y ventral del embrión poseen pocas estructuras o tejidos en desarrollo y, proporcionalmente, ocupan poco volumen en relación con los que se ubican en la región dorsal. Basta analizar un corte transversal del embrión para notar que prácticamente todos los elementos, con excepción de algunas partes del tubo digestivo se encuentran en la pared dorsal (tubo neural, notocorda, mesodermo paraxil) o pegados a ella (cresta urogenital y la mayor parte del tubo digestivo). Sólo dos elementos, corazón e hígado, se ubican en la zona más ventral (Fig. SC 4-2-1).

Fig. SC 4-2-1. Secuencia de cortes transversales de embriones de edad creciente. Ilustra el crecimiento relativo de la región dorsal respecto de la ventral. Todos los esquemas están representados en la misma escala. El efecto del crecimiento diferencial en longitud (a lo largo del eje céfalo-caudal [cf-cd]) se nota aún más cuando se compara la disposición en el espacio de los dos elementos mediales dorsales: el tubo neural y la notocorda. La figura SC 4.2-2 muestra la disposición de ambas estructuras, proyectadas sobre el plano sagital, en embriones de diferentes edades (desde la 3ª SD al final de la 5ª SD) (Figura SC 4.2-2). Puede notarse que, durante el período considerado, el tubo neural crece en longitud visiblemente más que la notocorda. Debido a ello, al principio, prácticamente poseen la misma longitud en tanto que, al final, el trazado del contorno de la superficie dorsal del tubo neural posee una longitud visiblemente mayor que la longitud de la notocorda. Ésta es la razón por la que al final de la 5ª SD el extremo cefálico del tubo neural, la parte de éste que excede cefálicamente a la notocorda, se encuentra muy incurvada en la región cefálica del embrión. El mismo fenómeno puede observarse comparando la longitud de la superficie ventral y la de la superficie dorsal en los esquemas de la figura SC 4-2-2.

Fig. SC 4-2-2. Esquema de embriones de A. 3ª SD, B. mediados de 4ª SD, C. fines de 4ª SD y D. fines de 5ª SD. Las regiones dorsal y ventral a la notocorda están pintadas de diferente color. Las líneas negra, roja y amarilla representan el eje cf-cd del SNC, la notocorda y el tubo digestivo respectivamente. Nótese que crecen diferentemente en función del tiempo. Todos los esquemas están representados en la misma escala. Nótese que la situación descrita para el embrión como totalidad se cumple también para el tubo neural en particular: el crecimiento en longitud de la superficie dorsal del tubo neural (placa del techo o placa alar) es mayor que el de la región ventral (placa del piso o placas basales). Estas diferencias, en el crecimiento en longitud, entre placas alares y basales es sobre todo marcada en las estructuras posencefálicas y mesoencefálicas. De ahí, la marcada curvatura cervical (entre médula y mielencéfalo) y sobre todo la marcada curvatura cefálica y mesencefálica, debido a la ausencia de placa basal en el proencéfalo. Además de todos estos hechos, la mayor parte de las poblaciones celulares que formarán las porciones laterales y ventrales de la paredes corporales provienen de los somitas y, hasta la 5ª SD, ellas se encuentran en posición epiaxial (dorsal a la notocorda). Desde el final de la 5ª SD en adelante, las células correspondientes a todos los niveles segmentarios corporales empiezan a migrar masivamente en dirección ventral. Las células o grupos celulares que abandonan posiciones epiaxiales y pasan a ocupar posiciones hipoaxiales contribuyen con su desplazamiento a generar un crecimiento diferencial con predominio en la región ventral a expensas del crecimiento en la región dorsal. La figura SC 4-2-3 ilustra esquemáticamente este hecho.

Fig. SC 4-2-3. Representación esquemática que ilustra cómo la proliferación y la migración celular diferenciales tienen papel morfogenético. A. Ilustra cómo crece armónicamente (en forma recta) una estructura en la que las mitades derecha e izquierda proliferan similarmente. B. Entre A y B se ha producido una mayor proliferación en la región derecha. Se genera una curvatura de convexidad derecha. C. Entre B y C se ha producido un desplazamiento neto de elementos (migración dirigida) desde el lado derecho hacia el izquierdo. Este desplazamiento compensa el crecimiento en longitud de ambas mitades y el sistema se rectifica. En la figura SC 4-2.3 A, las líneas a y b se encuentran apareadas e, inicialmente, poseen similar cantidad unidades (segmentos que las componen); en B, el número de segmentos de la línea de la derecha aumentó al doble en tanto que la de la izquierda aumentó 1,5 veces. Este hecho produce una curvatura en la estructura. En

la figura SC 4-2-3 C un séptimo de los segmentos (2 de 14) fueron transferidos de la línea derecha a la línea izquierda. Este hecho tiene como resultado la desaparición de la curvatura característica de la figura SC 4-2.3 B. Un fenómeno, conceptualmente similar, pero más complejo debido a la naturaleza 3D del embrión y a la geometría bastante más complicada de sus tejidos y elementos constituyentes explica los cambios que conducen al embrión a incurvarse primero y a enderezarse después. Un fenómeno en todo similar al ejemplificado fue descrito como modelo para explicar la generación de la curvatura cefálica o mesencefálica durante el desarrollo del mesencéfalo del embrión de pollo.

Bibliografía Rapacioli M, Duarte S, Rodríguez Celín A, Fiore L, Teruel L, Scicolone G, Sánchez V, Flores V. (2012). Optic tectum morphogenesis: a step-by-step model based on the temporalspatial organization of the cell proliferation. Significance of deterministic and stochastic components subsumed in the spatial organization. Dev Dyn 241(6):1043-61. SC 4.3. La subregionalización y la potencia evolutiva múltiple de las regiones del somita. V. Flores, M. Rapacioli Finalizada la somitogénesis, las células de las diferentes regiones del somita exhiben diferentes CCD dependiendo de las vías de señalización a las que han estado sometidas durante el proceso. Los somitas reciben varias influencias espacialmente organizadas como consecuencia de que se hallan rodeados de varias poblaciones celulares que emiten diferentes señales con efectos de desarrollo. Las células del borde dorso-medial del dermomiotomo reciben señales de la notocorda y placa del piso (proteína señal Shh) y de la región dorsal del tubo neural y ectodermo (proteína señal Wnt) y evolucionan en sentido de miotomo epiaxil. Si bien se considera que estas señales constituyen estímulos determinantes, existen datos que indican que éstos podrían ser estímulos permisivos que promueven la proliferación y diferenciación del miotomo porque la expresión de proteínas específicas del músculo se inicia ya en el mesodermo presomítico. Algunos postulan que la diferenciación en sentido muscular no se inicia en el mesodermo presomítico debido a que la expresión de proteínas musculares es inhibida por la proteína señal BMP proveniente de tejidos laterales. La existencia de la proteína noggina en la región medial inhibe a BMP y ello permite la expresión de proteínas específicas de célula muscular esquelética; este proceso sería amplificado por las señales Shh y Wnt. Las células del borde ventro-lateral del dermomiotomo reciben señales del ectodermo (Wnt6) y del mesodermo lateral (Fgf5) y evolucionan en sentido de miotomo hipoaxil. En una siguiente etapa (Fig. SC 4-3-1 A) las células del borde dorso-medial se dividen con su huso mitótico orientado perpendicularmente a la lámina basal. Las células hijas que quedan ubicadas en la región apical del miocele son posmitóticas y se localizan bajo el dermomiotomo. Estas células se alargan en sentido céfalocaudal y comienzan a expresar proteínas típicas del músculo esquelético. Se consideran miotubos primarios. Luego ocurre lo mismo con las células del borde caudal del dermomiotomo, luego con las células del borde cefálico y finalmente con las del borde ventro-lateral. Las células originadas en el borde dorso-medial originan miotomo epiaxil, las originadas en el borde ventrolateral originan miotomo hipoaxil y las originadas en los bordes cefálico y caudal originan miotomo de ambos tipos (Fig. SC 4-3-1 B). Las células de los bordes dorso-medial y ventro-lateral retienen capacidad proliferativa y posteriormente originan células proliferantes del miotomo.

Fig. SC 4-3-1. Modelo de formación del miotomo y su segregación en varios tipos de miotubos. A. Ilustra la ubicación de las cuatro poblaciones celulares precursoras de miotubos -en cada uno de los cuatro bordes del dermomiotomo- y el cambio en la forma y orientación espacial de las células que lleva a la formación de los miotubos primarios. B. Ilustra el origen y la distribución de miotomos primarios (subyacente en el dermomiotomo) y el origen de los miotubos precursores del epímero e hipómero. En colores se ilustra la distribución espacial de las células que se originaron en el borde dorso-medial (rosa), en los bordes caudal y cefálico (verde) y en el borde ventro-lateral (celeste). Modificado de Gros y col., 2004. Clásicamente se ha considerado que las células de la región central del dermomiotomo constituyen el dermatomo. Estas células se dividen asimétricamente: a) las células que quedan en la región basal se diferencian en células de la dermis en respuesta a estímulos provenientes del ectodermo y de la región dorsal del tubo neural y b) las células que quedan en la región apical forman células proliferativas del miotomo y, según algunos investigadores, células del tejido conectivo del músculo y células satélite. Así, la región central del dermomiotomo no corresponde estrictamente a un dermatomo. Las células de la dermis se forman por deslaminación de las células superficiales de dicha región. Las células del miotomo (ubicadas bajo el dermomiotomo) son posmitóticas y células satélite. Los miotubos primarios se extienden a lo largo del eje céfalo-caudal de la región central del miotomo; en los extremos cefálico y caudal del miotomo existen poblaciones de células proliferantes. Los miotubos secretan la proteína señal Fgf8 y las células proliferantes expresan su receptor Frek. En respuesta a Fgf8, las células proliferantes envían señales que promueven la expresión del factor de transcripción Scleraxis en las células del

esclerotomo adyacente. De este modo se determina, a partir de las regiones cefálica y caudal de esclerotomo, el sindetomo (Fig. SC 4-3-2 A-C). Debido a este modo de determinación, el sindetomo queda ubicado entre bloques de miotomo y entre bloques de esclerotomo sucesivos; la ubicación apropiada para generar los fibroblastos que forman los tendones del raquis que unen los músculos a los huesos del raquis. No se sabe si el sindetomo también origina los fibroblastos que forman los ligamentos del raquis. En la región medial del esclerotomo, cerca de la superficie del tubo neural, se determina el meningotomo (Fig. SC 4-3-2 A-C). Esta región origina los fibroblastos que forman el tejido conectivo de las meninges y las células de los vasos que forman el plexo vascular perineural y que posteriormente invaden el tubo neural. La denominación enfatiza la capacidad de formar meninges ya que se sabe que todas las células del somita poseen la potencia para formar células vasculares (endoteliales o periendoteliales). Las células de la región dorsal del tubo neural, mediante la expresión de las proteínas señal Bmp4 y Wnts, promueven la expresión del receptor VEGFR-2 en las células del esclerotomo. La expresión de este receptor sería promovida posteriormente por la expresión de VEFG-A por parte del tubo neural y este proceso llevaría a la formación del plexo vascular. Las células del esclerotomo forman células endoteliales, pericitos y células musculares lisas de estos vasos. No se sabe si las células del esclerotomo que acompañan a estos vasos se determinan en fibroblastos de meninges ya en el esclerotomo o luego de su migración. Las células de la región ventral del esclerotomo proliferan, migran y rodean a la notocorda (Fig. SC 4-3-2). Este comportamiento depende de señales provenientes de la notocorda (Shh, Noggina y FGF8). Estas señales promueven la expresión de los factores de transcripción Pax1, Pax9, Twist y Mfh1 en las células del esclerotomo y promueven la proliferación celular. Las células de la región caudal del esclerotomo proliferan más y se agrupan más densamente que las de la región cefálica. Las células que del somitocele reciben el nombre de artrotomo (Fig. SC 4-3-2 B); se integran a la mitad caudal del esclerotomo, migran ventralmente, caudalmente a la fisura intevertebral (de von Ebner) y originan las articulaciones intervertebrales, los discos intervertebrales. Nótese que de este modo la región ventral del esclerotomo de un somita queda dividida en dos por el artrotomo. Así, cada vértebra se forma por la asociación del esclerotomo originado en 2 pares de somitas (véase en Capítulo 14). Según algunos investigadores, el artrotomo también origina la porción proximal de las costillas. Las células que forman el artrotomo expresan el receptor tipo II del TGF-beta. Las células de la región central del esclerotomo constituyen el neurótomo (Fig. SC 4-3-2 B-C). Estas células rodean la región ventro-lateral del tubo neural. Las células de la región caudal del esclerotomo que invaden esta región forman tejido esquelético (porción ventral del arco vertebral, apófisis transversa y porción proximal de las costillas). Estas células (de la región caudal) se hallan más densamente agrupadas que las de la región cefálica debido a que poseen una mayor tasa proliferativa y expresan diferentes moléculas de adhesión. La región caudal del esclerotomo expresan las proteínas efrinas B1 y B4 que impiden la migración de células de las crestas neurales y axones motores que expresan EphB2 y B3. Por el contrario, las células de la región cefálica, que forman el neurotomo, permiten el ingreso de células de la cresta neural y axones en crecimiento y reciben de ellos señales para su sobrevida y proliferación. En presencia de estos componentes las células de la región cefálica forman elementos del perineuro y endoneuro de los nervios y ganglios espinales. La región lateral del esclerotomo (Fig. SC 4-3-2) recibe señales del miotomo (PDGF-A y FGF) y mesodermos intermedio y lateral (BMP4 y VEGF). Un conjunto de estas células forma el resto de las costillas; otro conjunto de células expresa VEGF-R2 y forma células endoteliales. Las células de la región dorso-medial del esclerotomo (Fig. SC 4-3-2) migran dorsalmente al tubo neural y forman la región dorsal del arco vertebral y la apófisis espinosa. Este proceso está regulado por BMP4, que se expresa en la región dorsal del tubo neural y en el ectodermo superficial.

Fig. SC 4-3-2. A, B y C. Esquemas de cortes transversales que ilustran grados crecientes de diferenciación del somita. Las líneas de puntos indican los planos de corte de los esquemas que se representan en A’, B’ y C’. A y A’. Estado de somita epitelial en estado de diferenciacón temprana e inicio de la disgregación. B y B’. Somita compartimentalizado en estado de resegmentación. C y C’. Somita en resegmentación y diferenciación avanzada. Los componentes del somita rodean a la notocorda, al tubo neural e inician los desplazamientos que los conducen a sus posiciones definitivas. Modificado de Christ y cols., 2004. Bibliografía Ben-Yair R, Kalcheim C. (2005). Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development 132(4):689-701. Christ B, Huang R, Scaal M. (2004). Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anat Embryol (Berl) 208(5):333-50. Christ B, Huang R, Scaal M. (2007). Amniote somite derivatives. Dev Dyn 236(9):2382-96. Gros J, Scaal M, Marcelle C. (2004). A two-step mechanism for myotome formation in chick. Dev Cell 6(6):875-82. Hollway G, Currie P. (2005). Vertebrate myotome development. Birth Defects Res C Embryo Today 75(3):172-9.

Capítulo 5. Desarrollo del Sistema Circulatorio SÍNTESIS CONCEPTUALES

SC 5.1. El origen de las células que forman la placa cardiogénica. V. Flores SC 5.2. La determinación de la placa o campo cardiogénico. Comportamientos celulares y moleculares involucrados. V. Flores SC 5.3. La determinación progresiva de las células cardiogénicas: la placa cardiogénica, los campos cardiogénicos primario y secundario y otras estirpes

celulares. V. Flores SC 5.4. El origen múltiple de las poblaciones celulares que intervienen en la cardiogénesis. V. Flores SC 5.5. El área cefálica del campo cardiogénico secundario y sus derivados anatómicos e histológicos. V. Flores SC 5.6. La influencia de la asimetría derechaizquierda en la transformación del CTP recto en asa cardíaca. Comportamientos moleculares involucrados. F. Angelotti, A. García Roca SC 5.7. Las células de la cresta neural y de la población celular proepicárdica (pcPE) en el desarrollo del corazón. Su contribución al desarrollo de la vasculatura coronaria. F. Angelotti, A. García Roca SC 5.8. Un modelo integrado de eventos celulares y moleculares involucrados en la cardiogénesis. V. Flores SC 5.1. El origen de las células que forman la placa cardiogénica. V. Flores

Las células que forman el corazón han sido detectadas y seguidas desde la gastrulación en adelante. Inicialmente se hallan en el epiblasto, durante la gastrulación migran hacia la línea media y se invaginan a través del surco primitivo. Se postula que la posición de las células, a lo largo del eje céfalo-caudal, cuado se invaginan en el surco primitivo se relaciona con su futura ubicación en la placa cardiogénica y con la región del corazón que originarán. El modelo presentado en la figura SC 5-1-1 A y B ilustran dicha relación. En A se observa que las células que se invaginan medialmente, en el extremo del surco primitivo, forman la notocorda y, adyacentes a ellas, las células que formarán zonas mediales del endodermo. Por el modo como se producen los desplazamientos gastrulares ‒indicado por las flechas de la figura SC 5-1-1 A ‒ Las células que ocupan posiciones cefálicas del surco originarán regiones cefálicas de la placa y las que ocupan posición caudal originarán partes caudales de la placa. Así, las células ubicadas cefálicamente en el surco primitivo originarán la parte medial y cefálica de la placa cardiogénica; esta región originará el bulbo cardíaco (ventrículo derecho, cono y tronco de salida de los ventrículos y, probablemente, también la aurícula izquierda). Un poco más caudalmente se ubican las células que formarán el ventrículo primitivo (originará el ventrículo izquierdo) y, a continuacion, las que formarán aurículas (aurícula derecha) y, probablemente, senos venosos. Así, debido al modo como se producen los desplazamientos grastrulares, por la posición que ocupan las células en el surco primitivo puede deducirse qué regiones del corazón originarán. La figura SC 5-1-1 C ilustra este hecho y muestra cómo quedarán ubicadas dichas regiones cardíacas durante la torsión del corazón tubular primitivo.

Fig. SC 5.1.1. A-B. Origen epibástico de las células de la placa cardiogénica. La posición de estas células en el epiblasto se relaciona con la posición que ocupan en la placa y la región cardíaca que originan. C. El ordenamiento céfalo-caudal observable a lo largo del surco primitivo se repite en la placa cardiogénica y se traduce en el ordenamiento céfalocaudal de las cavidades del corazón tubular primitivo recto medial (CTP). D. Durante la torsión del CTP, las cavidades modifican sus posiciones relativas. Ello no implica, sin embargo, que las subpoblaciones celulares ubicadas a lo largo del surco primitivo ya estén determinadas a formar las distintas regiones mencionadas. Esta especificación ocurre más tarde (SC 5.2. La determinación de la placa o campo cardiogénico. Comportamientos celulares y moleculares involucrados). Al parecer, la especificación regional de las células cardiogénicas no se produce simultáneamente en todo el campo cardiogénico. Al menos las células ventriculares son especificadas antes que las auriculares (SC La determinación progresiva de las células procardiogénicas, las de los campos cardiogénicos primario y

secundario y restantes estirpes celulares que forman el corazón; SC Determinación y diferenciación de las células del área cefálica del campo cardiogénico secundario durante la formación del bulbo cardíaco). Las células de la futura placa cardiogénica parecen poseer cierto grado de determinación genérica en sentido cardiogénico, a juzgar por ciertos marcadores que expresan muy tempranamente, aún antes de la gastrulación. Por otro lado, existen estudios de linaje celular con marcadores retrovirales que sugieren que ya antes de la gastrulación es posible distinguir clones de células con diferente capacidad histogenética: endocardiogénicas y miocardiocitogénicas. Así, se ha propuesto que ya pregrastrularmente existirían células determinadas en sentido cardiogénico. Como puede apreciarse, estos diferentes estudios aluden a fenómenos de especificación y determinación de diferente naturaleza: a) por un lado, una determinación genérica en sentido cardiogénico, b) una especificación que alude a la definición de regiones y c) una especificación en el nivel tisular o histogenético.

Bibliografía García-Martínez, V, Schoenwolf GC. (1993). Primitive-streak origin of the cardiovascular system in avian embryos. Dev Biol 159: 706-19. Cohen-Gould L, Mikawa T. (1996). The fate diversity of mesodermal cells within the heart field during chicken early embryogenesis. Dev Biol 177: 265-73. Gourdie RG, Kubalak S, Mikawa T. (1999). Conducting the embryonic heart: orchestrating development of specialized cardiac tissues. Trends Cardiovasc Med 9:18-26. Wei Y, Mikawa T. (2000). Fate diversity of primitive streak cells during heart field formation in ovo. Dev Dyn 219: 505-13. SC 5.2. La determinación de la placa o campo cardiogénico. Comportamientos celulares y moleculares involucrados. V. Flores El campo cardiogénico se constituye con células provenientes del epiblasto que durante la gastrulación forman el mesodermo lateral. Estas células migran cranealmente, convergen por delante de la placa precordal y forman la región semilunar denominada placa cardiogénica. En sentido estricto, es la hoja esplácnica resultante de la deslaminación de esa zona del mesodermo lateral la que debe recibir el nombre de campo cardiogénico. La hoja somática de dicha región no participa en el desarrollo cardíaco. La especificación y posición del campo cardiogénico depende de la posicón espacial de varias fuentes de señales positivas (activadoras) y negativas (inhibidoras) de la cardiogénesis. El modelo ilustrado en la figura SC 5-2-1, basado en el embrión de pollo, propone que la ubicación y forma del campo cardiogénico depende de los siguientes hechos: a) las células mesodérmicas de la región 1 no reciben señales, b) las células de la región 2 reciben ambos tipos de señales y c) las celulas de la región 3 reciben señales positivas y se hallan fuera del rango de acción de las negativas.

Fig.SC 5-2-1. Modelo de determinacion y localización especificacion del campo cardiogénico por medio de la acción de senáles activadoras (+) e inhibidoras (-) de la cardiogénesis. A. Distribución espacial de señales + y -. En la region 1 no existen señales cardiogénicas; en la 3 sí existen, pero son contrarrestadas por señales inhibidoras. En la 2 el mesodermo sólo recibe señales cargiogénicas. B. Ilustra la localización y la forma semilunar del campo cardiogénico resultante de la distribución espacial de señales + y -. Las células del campo cardiogénico están determinadas a formar sólo algunos tipos celulares del corazón definitivo. La capacidad citogénica del campo cardiogénico se ilustra en el cuadro SC 5-2-1. Las restantes células cardíacas son de origen extracampo cardiogénico, como las provienentes de la población proepicárdica y de la cresta neural cardiogénica, y dependen de fenómenos de determinación diferentes (SC 5.4. El origen múltiple de las poblaciones celulares que intervienen en la cardiogénesis; SC 5.3. La determinación progresiva de las células procardiogénicas, las de los campos cardiogénicos primario y secundario y restantes estirpes celulares que forman el corazón).

Cuadro SC 5-2-1. Ilustra la capacidad citogénica del campo cardiogénico originado durante la gastrulación a partir de precursores hipoblásticos N-Cadherina (+) y (-). (SC El origen múltiple de las poblaciones celulares que intervienen en la cardiogénesis). AT.: cambiar atrio-ventricular => atrioventricular; Población => Población Las señales involucradas y sus fuentes de origen. La figura SC 5-2-3 ilustra un modelo sobre la especificación y el patterning del campo cardiogénico en el ratón basado en la distribución espacial de señales cardiogénicas y anticardiogénicas. Las señales positivas (cardiogénicas) provienen fundamentalmente del endodermo e incluyen a la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), el factor de crecimiento fibroblástico 8 (FGF-8) y las proteínas Crescent y Cerberus, que son proteínas inhibitorias de la acción de las proteínas Wnt actuando sobre sus receptores. El ectodermo epidérmico también es fuente de BMP. Las señales negativas (anticardiogénicas) provienen fundamentalmente de a) el tubo neural, fuente de las proteínas Wnt3a y Wnt8 que promueven la formación de vasos sanguíneos e inhiben la del corazón y de b) el mesodermo axil cordal que secreta las proteínas señal Nogina y Cordina que inhiben a la señal BMP procedentes del endodermo.

AT. arriba: cambiar inhibidroes => inhibidores Fig. SC 5-2-3. Modelo de determinación, localización y modelación del campo cardiogénico. A. llustra esquemáticamente la posición y orientación del corte (línea de puntos) mostrado en B. B. Corte transversal del embrión. Se indican las posiciones de las poblaciones celulares señalizadoras (ectodermo, endodermo faríngeo, placa neural y mesodermo axil) y sus correspondientes señales estimulantes (flechas) e inhibitorias (barras T) de la cardiogénesis. El triángulo azul y la gradación de su color representan la variación en la intensidad del efecto cardiogénico resultante de la acción de dichas señales. Este fenómeno ubica y determina la extensión del campo cardiogénico a lo largo del corte (eje medio-lateral). Se observan el mesodermo deslaminado, el celoma pericárdico, la hoja esplácnica o campo cardiogénico que ya posee una población endocardiogénica adyacente al endodermo faríngeo y un epitelio miocardiocitogénico limitando ventralmente el celoma pericárdico. Las señales cardiogénicas se distribuyen en forma de gradiente látero  medial. La señal BMP es originada tanto en el ectodermo como en el endodermo del intestino anterior (faríngeo). Éste también secreta Fgf8 e inhibidores de Wnt. Puede apreciarse que el factor determinante del patterning del campo cardiogénico es la distribución de los tejidos fuente de las señales positivas y negativas: el papel de las señales positivas es estimular la cardiogénesis en el mesodermo esplácnico de la región cefálica y el papel de las señales negativas es delimitar la extensión del campo y definir el área apropiada. Las proteínas Bmp inducen la expresión de Fgf-8 en el endodermo y éste participa estimulando la expresión de las proteínas factores de transcripción Tal 1, Tboxs 2,3 y 5, Nkx 2.5 y cGATA que participan en la programación de la evolución en sentido cardíaco.

Se ha comprobado que esta combinatoria “cardiogénica” de factores de transcripción inicia una cascada de activación génica que incluye la expresión de varios genes que codifican proteínas específicas de músculo cardíaco (actina cardíaca, factor natriurético atrial y las cadenas de alfa-miosina y otras).

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La cardiogénesis incluye varios fenómenos determinantes y morfogenéticos que, como en otros casos, van de lo general a lo particular de acuerdo con criterios de ordenamiento temporoespacial. a) El proceso de especificación más temprano ocurre pregastrularmente: la aparición de células genéricamente procardiogénicas en el epiblasto. Esta población tempranamente se segrega en dos subpoblaciones: una endocardiogénica y otra miocardiocitogénica. Este fenómeno implica una especificación de tipos tisulares pero no instala una especificación regional. Este segundo aspecto empezaría a instalarse durante la gastrulación, dependiendo de la posición que ocupan las células migrantes a lo largo del eje céfalocaudal del surco primitivo. Sin embargo, tampoco este fenómeno implica un proceso de especificación sino más bien de relación probabilística entre posición inicial en el surco primitivo y posición final en la placa cardiogénica.

b) La segunda etapa es la especificación y patterning de la placa cardiogénica. Se trata de un conjunto de procesos de señalización espacialmente estructurados mediado por la distribución de señales cardiogénicas y anticardiogénicas en el que participan varios centros señalizadores, varias proteínas señal, sus respectivos receptores e inhibidores (SC 5.2. La determinación de la placa o campo cardiogénico. Comportamientos celulares y moleculares involucrados). Con respecto a la especificación de regiones en la placa cardiogénica, se ha propuesto un modelo según el cual la especificación se produce en sentido céfalo-caudal: primero la región del ventrículo primitivo y luego aurícula primitiva. También existe un modelo que propone que la parte final o senos venosos no sufren un proceso de especificación de tipo cardiogénico. Lo descrito hasta aquí corresponde al campo cardiogénico primario de la placa cardiogénica. c) Poco después se produce la determinación de las células del campo cardiogénico secundario. A medida que estas células se incorporan al CTP recto se determinarían en bulbo, cono y tronco arterioso. La determinación temprana de las células del campo secundario parece ser similar a la determinación de las del campo primario. Sin embargo, durante su incorporación al CTP recto, como tracto de salida de este último, sufren una reprogramación adicional que probablemente esté relacionada con su determinación y diferenciación en bulbo cardíaco (SC Determinación y diferenciación de las células del área cefálica del campo cardiogénico secundario durante la formación del bulbo cardíaco). d) Poco más tarde, mientras se van formando los arcos aórticos y sus correspondientes arcos branquiales, el mesénquima regional es invadido también por células provenientes de los 3 o 4 últimos segmentos de la cresta neural vagal. Estas células migran siguiendo el trayecto de los arcos aórticos, llegan al saco aórtico e invaden, desde el extremo cefálico al caudal, las paredes del tronco y cono, llegando profundamente hasta la región de los conductos auriculoventriculares. Las células de la región de cresta neural mencionada, denominada por dicho motivo cresta neural cardiogénica, participan aportando tejidos conectivo y muscular liso a los derivados del tronco-cono (porción proximal de grandes vasos). e) Finalmente, las células que forman el pericardio visceral o epicardio, el tejido conectivo perivascular de los vasos coronarios y, probablemetne, también su musculatura lisa vascular provienen de una población celular que ingresa en el corazón a través de su polo caudal. Estas células tienen su origen en una región diferenciada de mesénquima, denominada población proepicárdica, que rodea a los senos venosos y la superficie del septum transversum.

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Existen ejemplos de poblaciones celulares embrionarias que poseen una amplia potencia citogenética y que, en consecuencia, en forma divergente, originan varios tipos celulares que forman parte de distintos órganos. Existen, por otro lado, órganos que se forman como consecuencia de la confluencia, combinación e integración de poblaciones celulares que poseen su origen en diferentes poblaciones celulares. El desarrollo del corazón es un ejemplo que reúne ambas situaciones ya que, por un lado, a) su desarrollo requiere la participación varios tipos celulares de distinto origen embrionario que confluyen y se integran en la elaboración de los tejidos cardíacos y, por otro lado, b) varias poblaciones celulares embrionarias precursoras de células y tejidos cardíacos aportan también células que participan en el desarrollo de otros órganos. Entre las varias poblaciones que participan en el desarrollo del corazón están las siguientes. 1) Las células epiblásticas que forman la placa o campo cardiogénico. Estas células tienen la capacidad de formar en principio dos subpoblaciones: a) endocardiogénica o N-cadherina (-) y b) miocardiocitogénica o N-cadherina (+). Las primeras, N-cadherina (-), originan las células endocárdicas de todo el corazón, el tejido conectivo subendocárdico y el tejido conectivo de la porción profunda del miocardio (SC 5.3. La determinación progresiva de las células procardiogénicas, las de los campos cardiogénicos primario y secundario y restantes estirpes celulares que forman el corazón). Las segundas, N-cadherina (+), originan los miocardiocitos auriculares y ventriculares y las células del sistema de conducción auriculoventricular, el haz de His y las fibras de Purkinje de los ventrículos (Fig. SC 5-4-1).

Fig. SC 5-4-1. Esquema de la relación entre posición dentro del campo cardiogénico primario (C.C.1º), región cardíaca y tipo celular. Distintas regiones de la placa cardiogénica aportan diferentes tipos celulares a las diferentes regiones del corazón. 2) A estas células se les agregan luego las que se segregaron como campo cardiogénico secundario que forman algunos de los tipos celulares ya mencionados pero, en el ventrículo derecho y el cono y, además, células musculares lisas vasculares de los infundíbulos y porciones proximales de las arterias aorta y pulmonar (SC Determinación y diferenciación de las células del área cefálica del campo cardiogénico secundario durante la formación del bulbo cardíaco). El campo cardiogénico secundario es una adquisición

filogenética reciente, está asociado a la evolución del circuito pulmonar en relación con los cambios evolutivos sufridos en la transición de la forma de vida acuática a la terrestre. Desde esta perspectiva, se considera que también forman parte del campo cardiogénico secundario las células del mesoesófago ventral en la que se desarrolla la vasculatura pulmonar, que se continúan anatómicamente con el corazón y que se incorporan al mismo formando la mayor parte de la pared de la aurícula izquierda. Así, el campo cardiogénico secundario se ubica durante el período somítico temprano a lo largo del mesocardio dorsal y tiene dos regiones importantes: a) el área superior o cefálica o del tracto de salida origina al bulbo cardíaco del que luego derivan el tracto de salida del corazón y el ventrículo derecho, y b) el área inferior o caudal o del tracto de entrada y pulmonar, asociada al esbozo pulmonar, originaría parte importante de la aurícula izquierda. Vale decir, las dos cámaras cardíacas correspondientes al circuito pulmonar. Algunos investigadores sostienen, con argumentos valederos, que el área caudal del campo cardiogénico secundario incluye también la población celular proepicárdica asociada al seno venoso ubicado en el septum transversum (SC La formación de la población pcPE. Su relación con el campo cardiogénico secundario. Mecanismo de transferencia celular senovenoso  CTP en mamíferos) (Fig. SC 5-4-2).

Fig. SC 5-4-2. Representación esquemática de la capacidad citogenética de las células del campo cardiogénico secundario y su relación con las cavidades cardíacas. La población proepicárdica integra el campo cardiogénico secundario. Junto a estas células ingresan células endoteliales de los sinusoides hepáticos. 3) Una tercera población celular proviene de la cresta neural cardiogénica. Esta cresta está compuesta por los tres primeros segmentos occipitales que se encuentran incluidos en la cresta vagal. Ésta está integrada por los 7 primeros segmentos occipitales. Las células de la cresta neural cardiogénica migran ventralmente y, siguiendo el trayecto de los arcos aórticos 3º, 4º y 6º ingresan en el tronco-cono del corazón, migran a través de él por debajo del subendocardio y se introducen profundamente en el corazón (Fig. SC 5-4-2). Aportan células que

forman transitoriamente parte de las crestas troncoconales y llegan hasta la porción membranosa del tabique interventricular. Estas células acompañan la migración de las fibras vagales que ingresan en el corazón y, además, forman algunas de las neuronas parasimpáticas del corazón. En la región ascendente de las grandes arterias, aorta y pulmonar, estas células se diferencian en células musculares lisas vasculares de la túnica media (SC 5.7. Las células de la cresta neural y de la población celular proepicárdica (pcPE) en el desarrollo del corazón. Su contribución al desarrollo de la vasculatura coronaria) (Fig. SC 5-4-3).

Fig. SC 5-4-3. Ilustra la relación entre posición de las crestas cardiogénicas, los arcos aórticos a través de los cuales ingresan en el corazón, las regiones cardíacas y los tipos celulares que originan. 4) La población celular proepicárdica es una población de células mesenquimáticas aplanadas que forman parte del mesotelio, el septum transversum, en el polo venoso del corazón (en el límite con el seno venoso) (Fig. SC 5-4-2). Estas células invaden la superficie del corazón a modo de una monocapa de células planas y forman el revestimiento epicárdico del corazón. Junto con estas células ingresan también células endoteliales que forman el revestimiento endotelial de los vasos coronarios y el tejido conectivo perivascular. Muchas de estas células se transforman en las células musculares lisas de los vasos coronarios, fibroblastos perivasculares o miofibroblastos. Además aportan una parte importante de mesénquima que luego se diferencia en el tejido conectivo de la mayor parte del miocardio (SC 5.5 El área cefálica del campo cardiogénico secundario y sus derivados anatómicos e histológicos). Numerosas células que cumplen una función similar a éstas ingresan también en el corazón a partir del mesénquima que rodea el polo arterial del corazón

Bibliografía Schlueter J, Brand T. Origin and fates of the proepicardium, Aswan Heart Centre Science & Practice Series 2011:11 doi: http://dx.doi.org/10.5339/ahcsps.2011.11 Jiang X, Rowitch DH, Soriano P, McMahon AP, Sucov HM. (2000). Fate of the mammalian cardiac neural crest. Development 127: 1607-16.

Rossi JM, Dunn NR, Hogan BL, Zaret KS. (2001). Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev 15:1998-2009. SC 5.5. El área cefálica del campo cardiogénico secundario y sus derivados anatómicos e histológicos. V. Flores La placa cardiogénica posee una porción amplia, denominada campo cardiogénico primario, y una porción más pequeña, de ubicación medial, aunque bastante variable dependiente de las especies, denominada campo cardiogénico secundario. Varios estudios de seguimiento de células marcadas supravitalmente permiten mostrar que el campo primario origina el ventrículo primitivo (ventrículo izquierdo), el canal auriculoventricular, la aurícula primitiva (forma parte de las aurículas derecha e izquierda) y los senos venosos (parte de la aurícula derecha). En el campo cardiogénico secundario se han descrito dos o tres regiones diferentes, según distintos autores. En principio, este campo posee dos regiones: una superior o área cefálica y una inferior o área caudal. Algunos autores incluyen en esta última la población celular proepicárdica (SC La formación de la población pcPE. Su relación con el campo cardiogénico secundario. Mecanismo de transferencia celular seno-venoso  CTP en mamíferos). Con respecto al área cefálica del campo cardiogénico secundario, diversos estudios indican que el bulbo cardíaco del corazón tubular primitivo (CTP), incluyendo sus tres porciones (ventrículo derecho, los conos de salida de los ventrículos y el tronco arterioso), no derivan del campo primario sino del área cefálica del campo cardiogénico secundario. Durante la formación del CTP recto las células del campo secundario de la placa cardiogénica se distribuyen a lo largo de la zona media del piso de la faringe desde el 1º al 2º arco branquial (hasta la región caudal del 2º arco), un poco por detrás del extremo cefálico (tronco de salida) del CTP. Desde esta posición se incorporan luego al CTP durante el fenómeno denominado torsión en “C”. En la primera fase de la torsión cardíaca o formación del asa cardíaca (torsión en “C”), las células del campo cardiogénico secundario, que formarán el bulbo, se despegan del mesodermo ventral de la faringe y se agregan al extremo cefálico del CTP o ventrículo primitivo. El bulbo ingresa así en el celoma pericárdico y desvía la unión bulboventricular hacia la derecha y adelante formando el asa bulboventricular que constituye precisamente el fenómeno denominado “torsión en “C” (Fig. SC 5-5-1 A). La segunda fase de la torsión, o torsión en “S”, ocurre más tarde, cuando al extremo caudal del ventrículo primitivo se agrega la región auricular izquierda (Fig. SC 5-5-1 B). Ésta ingresa en el celoma pericárdico desplazando hacia la izquierda, hacia arriba y hacia el dorso la zona de unión auriculoventricular. La formación de la torsión en “S” conduce a la formación de otros dos surcos en el asa cardíaca: el surco ventriculoauricular, entre el ventrículo y la futura aurícula derecha, y el surco auriculosinusal, entre la aurícula izquierda y el seno venoso izquierdo. La figura SC 5-5-1 muestra cómo la formación de los tres surcos mencionados confieren la forma de “S” que didácticamente se atribuye al asa cardíaca. Más tarde, toda la región auricular asciende y se ubican dorsalmente a los ventrículos. Con dichos cambios concluye la torsión del corazón tubular primitivo. La formación del tracto de salida del corazón implica el agregado, en forma sucesiva, de las regiones del bulbo cardíaco, el cono y el tronco al extremo cefálico del CTP. Estas regiones se agregan al CTP antes de la llegada de una oleada de células migrantes provenientes de la cresta neural cardiogénica que también ingresan en el corazón a través de su extremo cefálico y participan de la histogénesis cardíaca y de los grandes vasos (aorta y pulmonar).

Fig. SC 5-5-1. A. Esquema de la torsión cardíaca en vista frontal. A. La incorporación del campo cardiogénico secundario al CTP produce la torsión en “C”. B-C. El agregado de la porción correspondiente a la aurícula izquierda produce la torsión en “S”.

Fig. SC 5-5-2. El miocardio del tracto de salida (bulbo y cono) deriva del mesodermo esplácnico adyacente al extremo cefálico del CTP recto (Modelo; Embrión de pollo). A. Diagrama del estado 14. Muestra la ubicación del campo del tracto de salida secundario (asterisco rojo) que genera el bulbo, el cono y el tronco. El campo se halla en relación con el segundo arco branquial. En este estado se inyecta un marcador celular supravital en la región del campo del tracto de salida secundario. B-F. Se ilustra cómo las células del campo secundario se van incorporando, como bulbo, cono y tronco, al extremo cefálico del CTP. Durante dicho proceso el sitio de unión a los arcos aórticos se corre desde el 1er arco hasta el 4º o 6º arco aórtico. Se indican los tejidos derivados del CTP recto (CC1º) y los que derivan del campo cardiogénico secundario (CC2º). Se considera que, en la especie humana, la zona en la que las paredes ventriculares se continúan con las arterias aorta y pulmonar constituye una zona de mezcla de poblaciones celulares diferentes que, integradamente, se

encargan de la histogénesis de dicha zona de transición. La musculatura cardíaca del tracto de salida de los ventrículos es diferente de la del resto del miocardio. Ello se debería a su diferente origen embrionario. Varios estudios detallados de los tejidos del corazón, tractos de salida y arterias emergentes del corazón permiten proponer el modelo de derivados ilustrado en la figura SC 5-5-3 sobre el posible origen de los tejidos musculares de dicha región en el hombre.

Fig. SC 5-5-3. Modelo de la morfogénesis e histogénesis del polo arterial (tracto de salida) del corazón en la especie humana. El campo cardiogénico secundario (CC2º) genera tejido muscular cardíaco del tracto de salida (celeste) y tejido muscular liso vascular (rojo) de la capa media de la porción proximal de los grandes vasos. El tejido muscular liso de la túnica media de la porción distal de la aorta y sus ramas (ramas del cayado aórtico) derivan de células provenientes de las crestas neurales cardiogénicas (gris). Se considera que las zonas de transición o de fusión entre estas diferentes regiones con diferente origen son zonas de debilidad (flechas) a lo largo de las cuales pueden producirse dehiscencias de los tejidos. Las células del campo cardiogénico secundario tienen capacidad de diferenciarse en miocardiocitos en la región del ventrículo derecho. Sin embargo, en la región del cono y parte proximal del tronco arterioso también exhiben capacidad para diferenciarse en células musculares lisas similares a las de las capas medias de las arterias. Allí participan formando la musculatura de las regiones proximales, de salida, de las arterias pulmonar y aorta. Las células musculares lisas de las porciones más distales de estos mismos vasos tienen un origen diferente; resultan de la diferenciación en células musculares lisas vasculares de las células de la cresta neural cardiogénica. En las zonas de encuentro entre estas tres regiones con diferente estructura histológica se hallan zonas anulares de debilidad que suelen ser asiento de disecciones patológicas de las paredes vasculares, especialmente aórticas.

Algunos autores describen una zona estrecha de mesodermo que circunda al campo cardiogénico secundario, el mesodermo parafaríngeo, que contribuiría con células a la región de transición miocárdico-arterial de nacimiento de los grandes vasos.

Bibliografía Waldo KL, Kumiski DH, Wallis KT, Stadt HA, Hutson MR, Platt DH, Kirby ML. (2001). Conotruncal myocardium arises from a secondary heart field. Development 128(16): 317988. Epstein JA, Parmacek MS. (2005). Recent Advances in Cardiac Development With Therapeutic Implications for Adult Cardiovascular Disease. Circulation 112(4):592-7. SC 5.6. La influencia de la asimetría derecha-izquierda en la transformación del CTP recto en asa cardíaca. Comportamientos moleculares involucrados. F. Angelotti, A. García Roca La torsión del CTP es la manifestación de la asimetría I-D sobre la morfogénesis cardíaca (Fig. SC 5-6-1 A-D). Este proceso morfogenético e histogenético se acompaña de la expresión de varias proteínas que están involucradas en la instalación estructural de la asimetría. La torsión del CTP es precedida por la expresión de las proteínas señal Nodal y Lefty-2 que parecen establecer la asimetría mencionada. Se sabe que la proteína factor de transcripción Nkx2.5, que forma parte de la combinatoria cardiogénica de factores de transcripción, regula la expresión de otros factores de transcripción, como Hand1 y Hand2, que están más directamente vinculados con la asimetría. Por un lado, la expresión de los factores de transcripción Hand son necesarios para un correcto desarrollo de los ventrículos pero, aparte de esto, durante la progreso de la torsión del CTP, existe una expresión diferencial entre los lados derecho e izquierdo del CTP. La expresión de Hand1 está restringida al ventrículo izquierdo y la de Hand2 al ventrículo derecho. Se propone que el factor de transcripción Pitx-2 también participa en la morfogénesis asimétrica y la torsión, ya que se expresa preferentemente en el lado izquierdo de la hoja esplácnica del mesodermo lateral. Por otro lado, el factor de transcripción Pitx-2 también regula la expresión de proteínas de la matriz extracelular, como la flectina, que son responsables de la resistencia a la tensión física de las distintas regiones de los tejidos cardíacos en desarrollo (SC 5.8. Un modelo integrado de eventos celulares y moleculares involucrados en la cardiogénesis). Asimismo durante la torsión se expresa el factor de transcripción Mef2c (myocyte enhancer factor 2c). Al parecer, este factor junto con el factor de transcripción Nkx2.5 también influyen en la expresión de la proteína Xin, que está involucrada en algunos cambios del citoesqueleto que al parecer son necesarios para la torsión cardíaca.

Fig. SC 5-6-1. La simetría bilateral de la placa cardiogénica y el desarrollo asimétrico del corazón. A-B. El campo cardiogénico está compuesto por dos mitades. Cuando se fusionan, forman un esbozo cardíaco común medial con simetría bilateral. (A: preparación in toto; B: corte transversal). C-D. Rápidamente el CTP medial exhibe diferencias entre ambas mitades y se genera un corazón asimétrico regulado por un solo eje de asimetría I-D que organiza a ambas mitades (C: preparación in toto; D: corte transversal). E. Experimentos de microcirugía en los que se separa a las mitades derecha e izquierda muestran que cada una de ellas tiene su propio eje medio-lateral y que, si no interactúan, cada uno organiza la morfogénesis sobre la base de su propio eje. Así resultan dos corazones que son imágenes especulares entre sí. Un hecho curioso relacionado con la asimetría izquierda derecha es que, al parecer, el campo cardíaco es en realidad un campo resultante de la fusión de dos campos, uno derecho y uno izquierdo, que naturalmente poseen sus propias asimetrías representadas por los ejes medio- laterales derecho e izquierdo. Así, el campo cardiogénico completo, correspondiente a la placa cardiogénica, podría poseer un comportamiento de desarrollo simétrico y resultar una organización con simetría bilateral. El desarrollo de los campos cardiogénicos primario y secundario, sin embargo, lleva a la formación de un corazón asimétrico debido al modo asimétrico como se produce la torsión cardíaca. Al parecer, la asimetría que expresa la placa cardiogénica durante la cardiogénesis se instala ya durante la gastrulación y se explica por la expresión asimétrica de dos vías de señalización determinanantes-de-lado derecho e izquierdo. En algunas especies, como en el embrión de pollo, el primer indicio de esta asimetría parece ser la aparición de la población celular epicardiogénica sólo en el lado derecho del seno venoso (SC 5.6. La influencia de la asimetría derecha-izquierda en la transformación del CTP recto en

asa cardíaca. Comportamientos moleculares involucrados; SC La formación de la pcPE en el embrión de pollo y la asimetría de los campos cardiogénicos primario y secundario). Que las mitades derecha e izquierda del campo cardiogénico son entidades asimétricas debido a la orientación especular de sus ejes medio-laterales se constata en experiencias de microcirugía en las que se impide que ambas mitades se fusionen y formen un único sistema de desarrollo integrado. En tales circunstancias, ambas mitades evolucionan independientemente y cada una de ellas genera un tubo endocárdico que, por sí solo, se comporta como un CTP que, a continuación, realiza la torsión y se transforma en un asa cardíaca. Este proceso lleva a la generación de una malformación, corazones duplicados, en la que ambos CTP poseen una organización especular respecto del otro (Fig. SC 5-6-1 E). Esto se debe a que cada mitad tiene impreso su propio eje medio-lateral. Sin embargo, cuando ambos se fusionan, como ocurre normalmente, uno de los ejes predomina sobre el otro y el corazón resultante es asimétrico. En la mayor parte de los casos predomina una asimetría que hace que el corazón ocupe la región izquierda del tórax. A veces, sin embargo, predomina la asimetría opuesta y se generan situaciones como la dextrocardia. Un cuadro más grave de esta alteración en la instalación de la asimetría I-D ocurre en el situs inversus en el que corazón, pulmón y tubo digestivo sufren una organización especular a la normal.

Bibliografía Satin J, Fujii S, DeHaan RL. (1988). Development of cardiac beat rate in early chick embryos is regulated by regional cues. Dev Biol 129(1):103-13. Isaac A, Sargent MG, Cooke J. (1997). Control of vertebrate left-right asymmetry by a snailrelated zinc finger gene. Science 275:1301-4. Patel K, Isaac A, Cooke J. (1999). Nodal signalling and the roles of the transcription factors SnR and Pitx2 in vertebrate left-right asymmetry. Curr Biol 9:609-12. SC 5.7. Las células de la cresta neural y de la población celular proepicárdica (pcPE) en el desarrollo del corazón. Su contribución al desarrollo de la vasculatura coronaria. F. Angelotti, A. García Roca Luego que se ha formado el CTP se inicia su torsión. Durante este proceso, células extracardíacas ingresan en él y participan de la morfogénesis y, sobre todo, de la histogénesis cardíaca. Las células extracardíacas tiene dos orígenes principales: la cresta neural cardiogénica (segmentos cardiogénicos de la cresta neural vagal) y la población celular proepicárdica (pcPE). Estas células provienen de la serosa que cubre el septum transversum y el seno venoso. Las células de la pcPE ingresan en el CTP migrando a través de puentes celulares ricos en matriz extracelular que se adhieren al CTP y luego migran, como una monocapa, sobre su superficie externa. Otra población celular, las células de la cresta neural (CN), migran hacia el esbozo cardíaco en etapas más tempranas de su desarrollo a través del mesénquima de los arcos branquiales en dirección hacia el mesocardio dorsal y luego ingresan a través del mesénquima que rodea a los arcos aórticos. Estas células provienen de la CN craneal y troncal, correspondiente a los niveles segmentarios 1 a 3, superponiéndose con la CN vagal. Esta región de la cresta neural es denominada “cresta neural cardiogénica” no porque migren exclusivamente al corazón, sino porque muchas de ellas se incorporan al corazón y son necesarias para su desarrollo. La extirpación experimental de esta población celular produce alteraciones variadas en varios órganos que se forman en la región branquial: aplasia o hipoplasia del timo, y de las glándulas paratiroides y tiroides, alteraciones faciales y malformaciones del tracto de salida (fenotipo DiGeorge y velocardiofacial). Las células de la CN cardiogénica también se incorporan al endotelio de los arcos aórticos y el tabique aorticopulmonar. La pcPE está compuesta por células mesoteliales con alta actividad proliferativa y con capacidad migratoria. Las células del epitelio miocardiocitogénico del CTP segregarían factores quimiotácticos para la pcPE. Ello les

permite invadir la superficie del corazón formando el epicardio. Entre el epicardio y el epitelio miocardiocitogénico existe un espacio delgado a lo largo del cual migran: células de la cresta neural, células endoteliales provenientes del esbozo hepático o senos venosos y otras no identificadas. Luego que la pcPE cubre, como una monocapa confluente, la superficie “epicárdica” del corazón, algunas de sus células sufren una T e-m y pasan al espacio subepicárdico. Estas células son genéricamente denominadas como células derivadas del epicardio o Epdc (Epicardial-derived cells). Las Epdc, junto a otras células de ubicación subepicárdica provenientes de la pcPE, invaden, en profundidad, en oleadas sucesivas, la pared muscular cardíaca, las almohadillas endocárdicas y el subendocardio. La T e-m de las Epdc está precedida por la expresión de los factores de transcripción Gata y Fog-2 (friend of Gata) en los miocardiocitos y de los factores de transcripción Ets1 y 2 en las Epdc y las células provenientes de la pcPE. Algunas investigaciones recientes indican que las células endoteliales de los vasos coronarios derivan de células que ingresan con la pcPE. Inicialmente, los vasos coronarios primitivos se hallan comunicados sólo con el seno venoso y, por lo tanto, el flujo sanguíneo depende de éste. Más tarde se establece la comunicación con la aorta y el sentido de la circulación se invierte y acelera. Se postula que la demanda de oxígeno miocárdica, por medio de factores inducibles por hipoxia (Hif-1α), y el factor de crecimiento vascular endotelial (Vegf) regulan estos procesos, aunque no se sabe qué factores guían a las células a generar los orificios arteriales que comunican con la aorta. Se sabe que una de las últimas oleadas, en profundidad, de las células de la pcPE ocurre en la zona de la unión atrioventricular y se relaciona con la formación de los orificios arteriales en los senos de Valsalva. Las células epicárdicas que invaden esta zona generan la musculatura lisa de las arterias coronarias y fibroblastos adventiciales de dicha región. Como se mencionó, el espacio subepicárdico es utilizado en el polo venoso para la migración de células endoteliales de la microvasculatura del esbozo hepático y del seno venoso. Estas células luego invaden el miocardio y originan fibroblastos intersticiales, plexos vasculares entre los cardiomiocitos, y las últimas establecen la comunicación con las arterias. Células derivadas del epicardio también invaden las almohadillas endocárdicas, se diferencian en fibroblastos y participan de la formación de la trama fibrosa que forma esqueleto de válvulas y valvas.

Bibliografía Lie-Venema H, Van den Akker NM, Bax NA, Winter EM, Maas S, Kekarainen T, Hoeben RC, deRuiter MC, Poelmann RE, Gittenberger-de Groot AC. (2007). Origin, fate, and function of epicardium-derived cells (EPDCs) in normal and abnormal cardiac development. Scientific World Journal 7:1777-98. Vincent SD, Buckingham ME. (2010). How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol 90:1-41. Bhattacharya S, Macdonald ST, Farthing CR. (2006). Molecular mechanisms controlling the coupled development of myocardium and coronary vasculature. Clin Sci (Lond) 111(1):35-46. SC 5.8. Un modelo integrado de eventos celulares y moleculares involucrados en la cardiogénesis. V. Flores Existen varios modelos de cascadas de eventos que conducen a la cardiogénesis. La figura SC 5-8-1 muestra una cascada de eventos en la que se integra información, proveniente de varios modelos, sobre factores que participan en la cardiogénesis.

1) Existen indicios de que algunos fenómenos involucrados en la cardiogénesis se inician ya en la etapa pregastrular. Así, se han publicado datos que indican que ya en el epiblasto es posible identificar clones de células que expresan algunas proteínas que se consideran marcadores de futuras células endocardiogénicas y miocardiocitogénicas. 2) Durante la gastrulación, las células precursoras arriba mencionadas se desplazan a la zona cefálica del mesodermo lateral que corresponde a la placa cardiogénica. En esta etapa, los principales eventos se refieren a la especificación, localización y modelación del campo cardiogénico que depende de la distribución espacial de vías de señalización procardiogénicas y anticardiogénicas. Durante este proceso se genera un campo cardiogénico primitivo (SC 5.2. La determinación de la placa o campo cardiogénico. Comportamientos celulares y moleculares involucrados). Según este modelo, las señales cardiogénicas (Bmp, Fgf, Cerberus, Nodal y otras) participan en la determinación de las células del mesodermo esplácnico en un mesodermo cardiogénico. 3) La especificación y/o determinación en sentido cardiogénico se asocia a la expresión de una combinatoria miocardiogénica de proteínas factores de transcripción entre los cuales están incluidos algunos como Gata4, Nkx2.5, y otros específicamente miocardiogénicos como Mef2c (myocyte-specific enhancer factor 2c), etcétera. 4) A esta combinatoria miocardiogénica de factores de transcripción le sigue una cascada genética de diferenciación en sentido miocárdico. La activación de la cascada genética de diferenciación cardiogénica se manifiesta por la síntesis de algunas proteínas específicas de tipo celular miocárdico. Para este momento el corazón se encontraría en el estado de CTP recto. 5) Simultáneamente o, a continuación, se expresa una variedad de factores que regulan fenómenos morfogenéticos tales como los que llevan a la pérdida de la simetría bilateral y la formación del asa cardíaca. Entre tales factores se cuentan proteínas de adhesión celular como las N-cadherinas, los factores de transcripción Hand 2 y Hand1, Pitx-2 y otros que, de un modo no dilucidado, participan en la torsión del CTP y la instalación del carácter derecho o izquierdo de las cámaras cardíacas. Algunos de esos factores reguladores actuarían a través de moléculas identificadas como efectoras de algunos de dichos cambios como la proteína intracelular Xin, que integra los complejos de adhesión intercelular y, junto con la vinculina y catenina, se halla involucrada en la torsión del CTP, y la proteína de la matriz extracelular flectina. Esta proteína influiría en la torsión en “C” depositándose diferencialmente a la derecha e izquierda de los surcos que se forman entre las regiones del CTP (SC 5.6. La influencia de la asimetría derecha-izquierda en la transformación del CTP recto en asa cardíaca. Comportamientos moleculares involucrados). Algunos reguladores morfogenéticos como la proteína factor de transcripción Hand-2 también participan en la torsión cardíaca y en el proceso de tabicamiento cardíaco.

Fig. SC 5-8-1. Modelo de la cascada de eventos involucrados en la cardiogénesis. El cuadro incluye diferentes tipos de factores (señales, receptores, factores de transcripción, etc.) que participan en diferentes etapas de la cardiogénesis, desde la especificación y determinación, la morfogénesis e histogénesis, la torsión del asa cardíaca, la formación de las cavidades derechas e izquierdas y su tabicamiento. Con respecto a los CCD que operan durante la cardiogénesis, es de destacar que la complejidad de las interacciones intercelulares aumenta en función del tiempo según se van agregando al corazón en desarrollo las poblaciones celulares extracardíacas que participan en la morfogénesis e histogénesis cardíaca (histogénesis del miocardio, formación de los tabiques, formación del sistema de conducción, la formación del epicardio y angiogénesis coronaria) (SC 5.4. El origen múltiple de las poblaciones celulares que intervienen en la cardiogénesis). 6) Finalmente, en la diferenciación de las características citogenéticas e histogenéticas propias de las diversas regiones cardíacas (aurículas, ventrículos, conductos auriculoventriculares, válvulas, haces de conducción, tractos de salida y grandes arterias, etc.) existen muchas particularidades que explican las diferencias regionales. Estas particularidades, naturalmente, dependen de diferencias en el nivel molecular del fenotipo. En ocasiones, cuando se comparan diferentes regiones, aun cuando posean características citológicas muy similares, expresan formas moleculares diferentes de ciertas proteínas específicas del corazón como, por ejemplo, diferentes tipos de miosinas y otras proteínas estructurales del miocardiocito (Fig. SC 5-8-2).

Fig. SC 5-8-2. La determinación en sentido auricular y ventricular precede a la citodiferenciación y las diferencias histogenéticas entre las cavidades auriculares y ventriculares y las sistémicas y pulmonares. Los miocardiocitos auriculares y ventriculares expresan diferentes tipos de miosina. A. La tinción específica para diferentes miosinas revela que ya durante la formación del CTP recto empieza la expresión diferencial de ambas. La expresión se superpone en la zona atrioventricular. B. Luego de la torsión se produce un refinamiento de la expresión y se delimitan con mayor precisión las regiones que expresan diferentes miosinas. La miosina auricular se expresa en el tracto de entrada y en las aurículas definitivas. La miosina ventricular se restringe a los ventrículos. La región del tronco arterioso que se está diferenciando en porción proximal de aorta y pulmonar no expresa ninguna de ambas. Bibliografía Xavier-Neto J, Neville CM, Shapiro MD, Houghton L, Wang GF, Nikovits W Jr, Stockdale FE, Rosenthal N. (1999). A retinoic acid-inducible transgenic marker of sino-atrial development in the mouse heart. Development 126(12):2677-87. Evans SM, Yelon D, Conlon FL, Kirby ML. (2010). Myocardial lineage development. Circ Res 107(12):1428-44.

Capítulo 6. Desarrollo de los Aparatos Digestivo y Respiratorio SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 6.1. Funciones de desarrollo de la proliferación celular y la muerte celular programada durante las fases sólida y de recanalización del tubo digestivo.

M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.2. El tabicamiento de la cloaca como resultado de crecimiento diferencial. M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.3. Efectos de desarrollo de las interacciones epitelio-mesenquimáticas en el desarrollo del tubo digestivo. V. Flores, M.P. Bidondo SC 6.4. Patrón de migración de las células precursoras de neuronas parasimpáticas en el tubo digestivo. M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.5. La derivación de los linajes celulares que integran el parénquima pulmonar a partir del componente epitelial endodérmico del esbozo pulmonar. La organización del proceso a lo largo del eje próximo-distal. V. Flores SC 6.6. Patterning del tubo digestivo I: la regionalización céfalo-caudal del tubo digestivo I. M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.7. Patterning del tubo digestivo II: la compartimentalización dorsoventral. M.P. Bidondo, V. Flores

SC 6.8. Patterning del tubo digestivo III: la asimetría izquierda-derecha. V. Flores, M.P. Bidondo SC 6.9. Patterning del tubo digestivo IV: la organización de la diferenciación celular a lo largo del eje radial. M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.10. Las malformaciones traqueoesofágicos son resultado de alteraciones en el patterning dorsoventral del intestino primitivo anterior. M.P. Bidondo, V. Flores SC 6.1. Funciones de desarrollo de la proliferación celular y la muerte celular programada durante las fases sólida y de recanalización del tubo digestivo. M.P. Bidondo, V. Flores Ya en 1900 Tandler describió la obliteración de la luz duodenal por la estratificación del epitelio. Definió la existencia de una fase sólida, maciza o cordonal, seguida de una fase de recanalización por vacuolización (formación de pequeñas cavidades confluentes). Las fallas en estos dos procesos fueron consideradas como patogenia de estenosis, atresias y duplicaciones duodenales. En la interpretación clásica, el proceso se realiza a través de fases resultantes de la operación de dos CCD en particular: en una 1ª fase, un aumento en la proliferación celular epitelial oblitera la luz; en una 2ª fase, un aumento en la muerte celular programada genera espacios libres o vacuolas; en una 3ª fase, de coalescencia de las cavidades, se produce la recanalización de la cavidad y aparición de vellosidades.

Fig. SC 6-1-1. Cambios histogenéticos descritos durante el desarrollo del duodeno humano. A-B. Estrechamiento de la luz hasta la forma semilunar. (Estados Carnegie 13-15). C-D. Fases de oclusión y vacuolización en la porción media (Estados Carnegie 16-17) e inferior (Estados Carnegie 18-19); en el tercio superior no existe fase de oclusión. E-G. Fase de coalescencia de cavidades primarias y formación de cavidades secundarias más amplias. HI. Recanalización y formación de vellosidades primarias. (Modificada de Matsumoto y cols., 2002).

Fig. SC 6-1-2. El gráfico ilustra el progreso, en función del estado de desarrollo, de las etapas mencionadas en las regiones céfalica, media y caudal del duodeno humano. Puede observarse que los estados progresan de acuerdo con un gradiente temporoespacial céfalocaudal. La región cefálica no posee fase de oclusión. En las tres regiones la recanalización ocurre simultáneamente con la fase de formación de vellosidades. Este proceso ha sido estudiado en los tercios superior medio y distal del duodeno de embriones humanos (del 30º al 52º día; estados 13 al 23 del Carnegie Institute) registrando la sucesión temporoespacial de los 5 estados histogenéticos incluidos en la histogénesis duodenal: 1) estrechamiento de la luz, 2) oclusión (obliteración completa), 3) vacuolización, 4) recanalización de la luz y 5) formación de vellosidades. La figura SC 6-1-1A-H muestra todos esos estados histogenéticos. La figura SC 6-1-2 muestra el progreso, en función del estado de desarrollo, de las etapas mencionadas en cada una de las regiones duodenales estudiadas y revela que: a) los estados progresan de acuerdo con un gradiente temporoespacial céfalo-caudal, b) la primera porción del duodeno no se ocluye completamente y c) la recanalización y formación de vellosidades ocurren simultáneamente. Diversos estudios cuantitativos sobre la densidad de células en proliferación y células apoptóticas en cada una de estas etapas y en cada una de estas regiones indican que durante el período de oclusión de la luz no existe un aumento de la proliferación en ninguna de las regiones estudiadas. Por otro lado, la proliferación aumenta luego de la fase maciza; cuando se inicia la vacuolización, recanallización y formación de vellosidades. Durante esta fase también aumenta el calibre del órgano. Por otro lado, la recanalización no se acompaña de aumento en la muerte celular. Este parámetro es fluctuante y no supera la tasa de muerte de las fases previas. En consecuencia, no son la proliferación y la muerte los CCD responsables de producir las fases sólida y de recanalización, respectivamente. El fenómeno más importante en ambos procesos parece ser un reordenamiento de las células epiteliales en el plano del epitelio (Fig. SC 6-1-1 A-H). Este proceso lleva a una estratificación y oclusión de la luz: 1) el sitio de

máxima acumulación de células epiteliales, y consiguiente engrosamiento, es la zona adyacente al mesoduodeno dorsal. De ahí la forma semilunar de la luz durante la fase de estrechamiento; 2) durante la oclusión total, las células centrales pierden su polaridad epitelial en tanto que las periféricas conservan su dominio basal y mantienen la regularidad epitelial; 3) por último, en la fase de recanalización, las células se redistribuyen intercalándose y posibilitando la elongación del sector. La muerte celular parece tener una función morfogenética durante la formación de vellosidades. Los sitios en los que aparecen las cavidades intraepiteliales se relacionan típicamente con sitios en los que el mesénquima crece en dirección hacia la luz. Este crecimiento centrípeto del mesénquima genera pliegues en el epitelio a partir de los cuales luego se modelan las vellosidades (puntas de flecha en figura SC 6-1-1 G y H). Así, el proceso de recanalización no implica sólo adquisición de la luz sino principalmente una modelación de la mucosa de modo que, al mismo tiempo que se recanaliza, se genera la morfología típica de la mucosa de cada región del tubo digestivo.

Bibliografía Matsumoto A, Hashimoto K, Yoshioka T, Otani H. (2002). Occlusion and subsequent recanalization in early duodenal development of human embryos: integrated organogenesis and histogenesis through a possible epithelial-mesenchymal interaction. Anat Embryol 205:53-65. Grosse AS, Pressprich MF, Curley LB, Hamilton KL, Margolis B, Hildebrand JD, Gumucio DL. (2011). Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development 138: 4423-32. SC 6.2. El tabicamiento de la cloaca como resultado de crecimiento diferencial. M.P. Bidondo, V. Flores El interés en comprender el tabicamiento de la cloaca se debe a su alta tasa de alteraciones fenotípicas y se remonta a principios del siglo xix. Las descripciones clásicas explican el tabicamiento de la cloaca como el crecimiento en sentido caudal (descendente) del tabique urorrectal: este tabique mesenquimático, recubierto por el endodermo, crecería en dirección a la membrana cloacal y se fusiona con ella. Otra interpretación propone la formación de dos tabiques laterales que se unen en la línea media en sentido descendente. Finalmente, otra reúne las dos interpretaciones y lo explica como resultado del crecimiento de los tres tabiques mencionados. Numerosos datos provenientes de la cirugía correctiva, la neonatología, la histopatología y de la experimentación en mamíferos ponen de manifiesto un proceso más elaborado y permiten una explicación diferente. En embriones humanos no existen tabiques laterales. El mesénquima que separa el seno vesicourogenital del seno rectal proviene del ángulo entre el alantaoides y el intestino posterior. Dicha zona está ocupada por a) mesénquima somático extraembrionario (del pedículo de fijación), b) mesénquima visceral (del intestino posterior) y c) mesénquima derivado de la zona inferior de la placoda corporal ectodémica o anillo ectodérmico umbilical que por invaginación se introducen en el mesénquima. Para detalles véase Normal and abnormal embryonic development of the anorectum in human embryos (Nievelstein R, 1998). El desarrollo de la cloaca involucra cambios morfológicos y de posición resultantes del crecimiento diferencial global del embrión y del crecimiento diferencial regional (región umbilical y apéndice caudal). Este crecimiento diferencial se aprecia en los siguientes hechos: a) en el período sómítico temprano, vista lateralmente, la cloaca posee contorno triangular y la membrana cloacal tiene una posición paralela al eje longitudinal del intestino posterior (Fig. SC 6-2-1 A-E).

b) Con la formación del tubérculo genital y de la pared abdominal infraumbilical, la cloaca adquiere un contorno más rectangular. c) La regresión del apéndice caudal y el consiguiente enderezamiento de la curvatura acompañan la adquisición del aspecto rectangular de la cloaca. Debido a estos crecimientos diferenciales, la membrana cloacal, desde la 6ª SD en adelante, pasa gradualmente a adquirir una posición perpendicular al eje longitudinal del intestino posterior (Fig. SC 6-2-1 F-G). d) A continuación se produce la disgregación de la membrana cloacal, por muerte celular programada, sin que ella tome contacto con el tabique urorrectal. Finalmente, e) el epitelio del extremo caudal de la cloaca, inmediatamente por encima del sitio donde se insertaba la membrana cloacal, prolifera, se engruesa, la luz se ocluye transitoriamente, pasa por una fase maciza y luego se recanaliza. Los cambios de posición y tamaños relativos asociados a los procesos descritos generan la impresión de que el septum urorrectal desciende en dirección a la membrana cloacal y contacta con ella dividiendo la cloaca en dos compartimentos .

Fig. SC 6-2-1. Representación esquemática, en vista lateral izquierda, del proceso morfogenético de tabicamiento de la cloaca y formación de los senos rectal y

vesicourogenital. En el ángulo que se forma entre el alantoides y el intestino posterior confluyen las poblaciones mesenquimáticas que forman el tabique urorrectal. La membrana cloacal pasa de poseer una posición paralela al eje longitudinal del intestino posterior a tener una posición perpendicular a él Bibliografía Beck F. (2002). Homeobox genes in gut development. Gut 51;450-4. Nievelstein RA, Van der Werff JF, Verbeek FJ, Valk J, Vermeij-Keers C. (1988). Normal and abnormal embryonic development of the anorectum in human embryos. Teratology 57(2):70-8. SC 6.3. Efectos de desarrollo de las interacciones epitelio-mesenquimáticas en el desarrollo del tubo digestivo. V. Flores, M.P. Bidondo En general, los órganos de origen esplacnopleural poseen parénquima epitelial derivado del endodermo y estroma conectivo derivado del mesénquima visceral. El desarrollo de estos órganos, como el de todo el tubo digestivo, resulta de cascadas de Int e-m entre ambas poblaciones celulares. Los papeles (emisor o receptor de señales; determinante o competente, etc.) que desempeñan el epitelio y el mesénquima en cada una de tales Int e-m varían en función de los órganos y las etapas de desarrollo. En la ejecución de algunos eventos, el epitelio es instructivo y el mesénquima competente. En otros eventos, los papeles pueden invertirse. Existen tipos diferentes de Int e-m a juzgar por los efectos de desarrollo que producen: a) fenómenos tróficos o de sobrevida mediados por factores de crecimiento que estimulan las funciones vitales y evitan ingresar en vías apoptóticas; b) fenómenos directivos, instructivos o determinantes que participan en la génesis de los esbozos; c) fenómenos permisivos que intervienen en los procesos de diferenciación; d) estímulos proliferativos mediados por la síntesis de factores de crecimiento; e) efectos morfogenéticos y de mantenimiento del estado de diferenciación terminal del parénquima epitelial; f) control de la organización espacial del órgano (patrón espacial de ramificaciones o patrón morfogenético de las mucosas). Ejemplificaremos cada uno de estos tipos de Int e-m. a) El mesénquima estimula las funciones vitales de las células epiteliales. Éstas son importantes para el mantenimiento y desarrollo de los esbozos. Extractos de embriones enriquecidos en componentes mesenquimáticos pueden reemplazar algunos efectos del mesénquima. Es probable se trate de efectos mediados por factores de crecimiento y/o componentes de la matriz extracelular. Existen ejemplos de esbozos en los que el aislamiento del epitelio respecto del mesénquima produce la degeneración o la muerte. En el caso de estructuras epiteliales macizas transitorias, las células que ocupan regiones centrales pierden su contacto con el mesénquima y pasado cierto tiempo ingresan en la vía de la apoptosis. El mesénquima es fuente de muchas sustancias que actúan como señales que garantizan la vitalidad de las células y otras que evitan que las células entren en apoptosis. b) Existen ejemplos de formación de esbozos en los que la señal determinante proviene del mesénquima y el endodermo actúa como población competente. Estos fenómenos instalan las diferencias entre distintas regiones del tubo digestivo. Clásicamente se considera que corresponde al mesénquima especificar las características regionales del tubo digestivo y de cada órgano anexo. Como ejemplo, si el endodermo de la región pancreática es disociado de su mesénquima, antes de la constitución del esbozo pancreático, y es asociado con mesénquima de otra región, en lugar de desarrollar un páncreas, adquiere las características de la región de donde procede el mesénquima. Estos ejemplos ilustran el papel determinante del mesénquima visceral.

c) La determinación de un esbozo no garantiza la completitud de su desarrollo (SC 0.5. El concepto de determinación. Potencia y significado evolutivos; SC 0.6.Concepto de acción celular determinante (A c-c D).). La reprogramación de la información genética sufrida por las células de un esbozo en el momento de su determinación no habilita toda la información necesaria para el desarrollo ulterior. En general, en la determinación sólo se seleccionan conjuntos de genes que actuarán en la etapa siguiente inmediata. El desarrollo ulterior habitualmente está regido por fenómenos interactivos permisivos que favorecen avances parciales de la diferenciación (SC 0.8. El perfil evolutivo del grado de diferenciación celular. El papel de las acciones celulares permisivas). El fenómeno de determinación por el que se constituye un esbozo en general es seguido por otros fenómenos de determinación que van de lo general a lo particular. Cada una de estas determinaciones son seguidas de sus correspondientes fases permisivas y correspondientes avances parciales en la diferenciación. La mayor parte de las interacciones que participan en procesos de morfogénesis e histogénesis y también en el mantenimiento del estado de diferenciación terminal son permisivas. Existen ejemplos que ponen de manifiesto la importancia de las interacciones permisivas. Algunos esbozos sólo pueden continuar su desarrollo en asociación con el mesénquima determinante. El grado de especificidad de las interacciones permisivas varía entre diferentes esbozos. d) La proliferación celular produce un aumento en el número de células de una población y, ejecutada diferencialmente y asociada a cambios de forma o de adhesividad celular, tiene varios efectos morfogenéticos. El tamaño y la forma de los órganos son dependientes de las tasas de proliferación que exhiben durante el desarrollo. El tamaño es función del número de células y éste depende del número de ciclos celulares cumplidos durante el desarrollo. El número medio de células de un órgano es el resultado del balance entre procesos contrapuestos de proliferación y muerte celular y, en el caso de órganos de parénquima epitelial, ambos procesos dependen de señales del mesénquima (factores mitogénicos, factores de crecimiento, factores de sobrevida, etc.). La influencia del mesénquima sobre la proliferación del epitelio se pone de manifiesto en experiencias de disociación y reasociación de endodermo y mesénquima. El epitelio separado del mesénquima o puesto en contacto con diferentes tipos de mesénquima muestra cambios significativos en la incorporación de timidina. e) Establecida la especificidad de órgano, o de región, las células epiteliales pueden tener varías vías posibles de diferenciación. En el epitelio intestinal hay enterocitos, células enteroendocrinas, caliciformes y de Paneth, etc. En general, el mesénquima tiene un papel en la diferenciación y en el mantenimiento del estado de diferenciación terminal del epitelio. Estos efectos del mesénquima también se revelan en situaciones de disociación de endodermo y mesénquima. Aislado del mesénquima, el epitelio pierde las características de diferenciación parcial o terminal. Las células epiteliales pueden volver a organizarse como epitelio, si son reasociadas con su mesénquima original. Estos efectos están mediados por fenómenos interactivos recíprocos entre ambas poblaciones. f) El mesénquima desempeña un papel central en la organización espacial del órgano, el patrón espacial de ramificaciones o patrón morfogenético de las mucosas, etc. (SC El papel morfogenético del mesénquima. La remodelación regulada de la matriz extracelular como mecanismo de control del patrón de ramificaciones de un órgano epitelial).

Bibliografía Roberts DJ. (2000). Molecular Mechanisms of Development of the Gastrointestinal Tract. Dev Dyn 219:109-20. Beck F, Tata F, Chawengsaksophak K. (2000). Homeobox genes and gut development. Bioessays 22:431-41. Ober, EA, Verkade H, Field HA, Stainier DY. (2006). Mesodermal Wnt2b signalling positively regulates liver specification Nature 442(7103):688-91.

SC 6.4. Patrón de migración de las células precursoras de neuronas parasimpáticas en el tubo digestivo. M.P. Bidondo, V. Flores En 1921 J.N. Langley describió el sistema nervioso entérico (SNE) como una parte del sistema nervioso autónomo. Se trata de un conjunto de plexos interconectados que asientan en la pared, a lo largo de las diversas regiones del tubo digestivo (plexos murales) y en los mesos (plexos extramurales). Los plexos murales se ubican preferentemente en la capa submucosa (plexo submucoso de Meissner) y entre las capas circular y longitudinal de la muscular (plexo mientérico de Auerbach). Estos plexos se forman durante la histogénesis del tejido muscular del tubo digestivo (SC La unidad motora peristáltica. Cuadro cronológico sobre su diferenciación). El SNE regula la motilidad, secreción, absorción, flujo sanguíneo, etc. e integra un sistema neuroendocrino-inmunitario en el aparato digestivo. Debido a que el SNE dispone de sus propias neuronas receptoras, neuronas de asociación y neuronas efectoras excitatorias e inhibitorias, es capaz de originar respuestas locales de un modo reflejo aun en ausencia de conexión con SNC. El SNE se origina a partir de dos poblaciones celulares precursoras específicas: la cresta neural vagal correspondiente a los niveles segmentarios occipitales (segmentos 1-7) y la cresta neural sacra correspondiente a los niveles desde 28 en sentido caudal. Esto no significa que las células de dichos segmentos estén determinadas a formar neuronas para el SNE. Varios experimentos de trasplante de células de la cresta vagal a la región troncal y de células de la cresta troncal a la cresta vagal muestran que estas células no están determinadas en el momento de su formación. En ambos casos, las células exhiben un comportamiento de desarrollo acorde con el lugar al que son trasplantadas. Ello indica que los medioambientes en los que las células son puestas y/o aquellos a través de los cuales migran, y/o las interacciones que realizan en los sitios que colonizan son los determinantes y/o permisivos. Resultados similares se obtienen en trasplantes celulares recíprocos entre células de la cresta sacra y células de la cresta troncal. Un ejemplo ilustrativo de la importancia del ambiente sobre la sobrevida y la diferenciación de las células precursoras del SNE lo ofrecen los componentes de la matriz extracelular a través de la cual migran. Tanto la población vagal como la sacra expresan la proteína receptor transmembrana Ret. Los componentes de la matriz celular a través de la cual migran se unen a dicho receptor activando una vía de señalización que, por un lado, mantiene la población y, por otro, actúa permisivamente en la diferenciación en sentido de SNE. El desarrollo del SNE procede a través de dos fases citogenéticas: a) la primera fase es de migración y colonización de los mesos y la pared del tubo digestivo (4ª a 7ª SD) y b) la segunda fase es específicamente histogenética o de formación de los plexos (7ª SD en adelante). Durante la etapa de migración y colonización, la población vagal invade primero el mesénquima de los arcos branquiales y en la 4ª SD ya se introduce en la esplacnopleura del intestino anterior. De ahí en más, la migración continúa en sentido caudal invadiendo todo el tubo digestivo al final de la 7ª SD. En la migración de las crestas neurales participan fenómenos de haptotaxis y de presión de población. El primero parece ser más importante como factor director de los desplazamientos ya que la inyección de una pequeña cantidad de células de la cresta neural vagal en el estómago de un tubo digestivo aganglionar permite ver que las células migran en sentido caudal aun sin el efecto de la presión de población. La población sacra en una primera fase sólo posee distribución extramural, luego invade también el intestino posterior en forma ascendente. Si bien al principio ocupan difusamente toda la región infraumbilical, finalmente quedan localizadas sólo a la porción final del intestino posterior. Sólo el 17 % de las neuronas del SNE se originan en la cresta neural sacra.

La etapa de formación de plexos es simultánea con la diferenciación de la musculatura lisa del tubo digestivo. Si bien la miogénesis no depende del desarrollo de los plexos nerviosos y de la inervación, ambos procesos se producen sincrónicamente. Con respecto a la regulación de la peristalsis, cuatro tipos celulares, dos originados en las crestas neurales y dos originados en el propio mesénquima visceral, interactúan y conforman la unidad motora peristáltica (véase SC La unidad motora peristáltica. Cuadro cronológico sobre su diferenciación). Varios estudios de inmunomarcación con anti-cKit (para células intersticiales de Cajal, anti-α-actina (para célula muscular lisa), anti-PGP9.5 (para neuronas) y anti-S100 (para glía) han permitido seguir la evolución de estos linajes celulares, analizar la cronología de su diferenciación, su organización espacial y la elaboración de la unidad motora peristáltica. En el embrión humano, éstas se estructuran entre la 7ª y 20ª SD período durante el cual simultáneamente se diferencian las capas musculares interna y externa, la muscular de la mucosa y los plexos del SNE. En la 7ª SD se inicia la diferenciación de las células intersticiales. Se diferencian en miofibroblastos fusiformes a partir de células del mesénquima visceral. Debido a ello sólo aparecen en la porción de tubo digestivo de origen esplacnopleural (intestino primitivo). Estas células generan varias prolongaciones que, por un lado, entran en contacto con varicosidades (terminales) de axones del SNE y, por otro, contactan y elaboran uniones nexo con otras células, también originadas en el mesénquima visceral, que se diferencian en músculo liso. Las células intersticiales se diferencian en células especializadas ramificadas que operan como marcapasos para la peristalsis. Generan impulsos eléctricos y lo propagan a través de los contactos de sus ramificaciones en forma de ondas desde la unión faringoesofágica hasta el esfínter anal interno. Las células intersticiales se diferencian en contigüidad con células de las crestas neurales aunque tal relación no parece ser indispensable pues también están presentes en intestinos aganglionares. Dicha relación al menos condiciona su distribución espacial; en la 7ª SD se encuentran en relación con las neuronas en diferenciación y posteriormente se ubican periféricamente a los plexos.

Bibliografía Burns AJ. (2005). Migration of neural crest-derived enteric nervous system precursor cells to and within the gastrointestinal tract. Int J Dev Biol 49: 143-50. Burns AJ, Delalande JM, Le Douarin NM. (2002). In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development 129: 2785-96. SC 6.5. La derivación de los linajes celulares que integran el parénquima pulmonar a partir del componente epitelial endodérmico del esbozo pulmonar. La organización del proceso a lo largo del eje próximo-distal. V. Flores

Corregir pseudoglandular => seudoglandular Fig. SC 6-5-1. Modelo de derivación de tipos celulares del parénquima pulmonar a partir del endodermo de los esbozos broncopulmonares. A. Representación esquemática del árbol de derivaciones. B. Representación gráfica del modo como se organiza en el espacio el

proceso de derivación ilustrado en A. Se incluyen los estados (asociados al transcurso del tiempo) y la ubicación espacial de las células a lo largo del eje próximo-distal del órgano. Se indican algunas de las vías de señalización y de los factores de transcripción que participan del proceso. Los esbozos broncopulmonares están compuestos por dos componentes: a) un componente epitelial que origina los tejidos que integran el parénquima y b) un componente mesenquimático que genera el estroma del órgano. Describiremos separadamente la evolución de la citogénesis (generación de tipos celulares en función del tiempo y espacio) en cada uno de ambos componentes; sin embargo, ambos procesos se realizan simultánea e interactivamente. Con respecto a la evolución del componente epitelial, la figura SC 6-5-1 A ofrece un panorama global esquemático sobre las sucesivas bifurcaciones que ocurren durante la generación de diversos linajes celulares del parénquima pulmonar. El modelo propone que hasta el final del estado seudoglandular, las células distales de los brotes epiteliales en crecimiento son células troncales progenitoras multipotentes (P1). La población celular P1 es mantenida por la expresión de una variedad de factores. La célula P1, por medio de divisiones asimétricas, se autorrenuevan y originan células progenitoras de tipo bronquiolar Sox2+ (expresan el factor de transcripción Sox2). Estas células, durante el crecimiento en longitud del brote, abandonan el extremo de crecimiento y pasan a ocupar zonas más proximales que formarán las vías de conducción aérea. La célula progenitora bronquiolar posee capacidad de originar todos los tipos celulares epiteliales que integrarán el epitelio bronquiolar. Llegado el estado canalicular/sacular, las células P1, como consecuencia de una reprogramación epigenética, pasan a constituir una segunda población de células troncales progenitoras (P2) o población troncal de tipo alveolar, que se encarga de generar las células epiteliales de las regiones alveolares. No se ha aclarado si esta reprogramación de célula troncal P1 a célula troncal alveolar (P2) se debe a factores externos o es resultado de un programa establecido con anterioridad; algunos experimentos sugieren que están involucradas las vías de señalización de Notch y Wnt. Con respecto a la evolución ulterior de las células progenitoras bronquiolares, un modelo propone que la primera decisión, en la que participa la vía Notch, es la elección entre un linaje neuroendocrino (NE) (Mash+) y un linaje no NE (Hes1+). A continuación, las células del linaje no NE realizan una segunda determinación, que también involucra a la vía Notch, en la se elige la vía evolutiva de la célula de Clara o la vía de la célula ciliada. Las otras vías de determinación indicadas en la figura también son posibles y planteadas en otros modelos de derivación de linajes. En este modelo se propone que las células de Clara se autorrenuevan por mucho tiempo y que, posnatalmente, originan células ciliadas. La célula de Clara originaría también las células mucosecretantes o caliciformes. Otros modelos admiten otras posibilidades. Con respecto a la evolución de las células progenitoras alveolares, algunos modelos proponen que ésta puede originar tanto los neumonocitos de tipo I y tipo II. Otros modelos proponen que la descendencia directa de la célula progenitora alveolar es el neumonocito tipo II que luego origina a los tipo I. Todos estos modelos tienen cierto grado de aceptación y requieren evidencia experimental adicional para su aceptación definitiva.

Bibliografía Morrisey EE, Hogan BLM. (2010). Preparing for the First Breath: Genetic and Cellular Mechanisms in Lung Development. Developmental Cell 18:8-23.

Warburton D, Wuenschell C, Flores-Delgado G, Anderson K. (1998). Commitment and differentiation of lung cell lineages. Biochem Cell Biol 76(6):971-95. Rawlins EL, Ostrowski LE, Randell SH, Hogan BL. (2007). Lung development and repair: contribution of the ciliated lineage. Proc Natl Acad Sci USA 104:410-7. SC 6.6. Patterning del tubo digestivo I: la regionalización céfalo-caudal del tubo digestivo I. M.P. Bidondo, V. Flores Durante la gastrulación ocurren procesos que inician la instalación de una polaridad céfalo-caudal en el endodermo embrionario. Algunos mapas de destino realizados en embriones de ave indican que tal polaridad se pone de manifiesto por la aparición de dos poblaciones diferentes que, en forma sucesiva, migran desde el epiblasto a la hoja ventral del disco embrionario originando el endodermo embrionario. Una de dichas poblaciones es identificable por la expresión del factor de transcripción Hex1+ (Hematopoietically expressed homeobox) y, la otra, por la expresión del factor de transcripción Fox A2+ (Forkhead box A2). La población Hex1+ corresponde a la primera oleada migratoria endodérmica, origina el endodermo de la cara ventral del intestino anterior e interviene, más tarde, en la determinación en sentido cardiogénico de la hoja esplácnica de la región cefálica del mesodermo lateral. La población Fox A2+ corresponde a la segunda oleada y origina el endodermo de la región dorsal del intestino anterior y el endodermo de los intestinos primitivos medio y posterior (Fig. SC 6-6-1).

Corregir pseudoglandular => seudoglandular Fig. SC 6-6-1. Durante la gastrulación se inicia la instalación de la polaridad cf-cd del intestino primitivo. La población Hex1+ corresponde a la primera oleada migratoria endodérmica, origina el endodermo de la cara ventral del intestino anterior. La población Fox A2+ corresponde a la segunda oleada y origina el endodermo del intestino primitivo medio y posterior. Durante el plegamiento del embrión, se forman los intestinos primitivos anterior, medio y posterior y, en los límites entre ellos, los portales intestinales anterior (PIA) y posterior (PIP). Estos portales son centros señalizadores que, por medio de la síntesis y secreción de la proteína señal Shh, participan en el establecimiento de las polaridades céfalo-caudal y dorsoventral del tubo digestivo. A su vez, el mesénquima visceral del tubo digestivo primitivo expresa la proteína receptor de Shh Patched (Ptc). La unión de Shh a su receptor inicia vías de señalización involucradas en dos fenómenos: a) expresión de la proteína señal BMP4 en el mesénquima circundante, hecho que está vinculado a la regulación de la diferenciación del mesénquima visceral en músculo liso del tubo digestivo y b) expresión de combinaciones de genes Hox tanto en el mesénquima como en el epitelio. Existen diferencias regionales en la respuesta del mesénquima visceral a la secreción de Shh. Estas diferencias podrían implicar que existe una regionalización previa puesta de manifiesto por la diferente competencia del mesénquima esplácnico a Shh. En respuesta al Shh, el mesénquima expresa Bmp4 a lo largo de casi todo el intestino primitivo excepto en la futura región gástrica. Dado que el estómago posee una musculatura más desarrollada, con tres capas en lugar de dos, se ha propuesto que podría tener una función reguladora negativa sobre la formación de músculo liso. b) la proteína señal Shh estimula la expresión de genes Hox. En el tubo digestivo en desarrollo, tanto el endodermo como el mesénquima visceral exhiben una expresión diferencial espacialmente organizada de combinatorias de genes Hox (Fig. SC 6-6-2). Este hecho regularía la elaboración de diferentes patrones de organización de tejidos a lo lardo del eje céfalo-caudal del tubo digestivo. El papel de la expresión diferencial de combinatorias de genes Hox en la regionalización del tubo digestivo se revela a través de experimentos en murinos transgénicos en los que la inactivación o la sobreexpresión de estos genes derivan en un desarrollo anómalo de la zona (homeosis). En seres humanos también existen datos al respecto. La mutación del gen Hoxa13 produce transformación homeótica en el tubo digestivo. El borde de expresión de las distintas combinatorias de proteínas Hox no siempre corresponden con las fronteras entre órganos, pero hay puntos en los que los bordes en la expresión de combinatorias de genes Hox se corresponde con cambios en la organización, como por ejemplo en las regiones que corresponden a futuros esfínteres (Fig. SC 6-6-2).

Fig. SC 6-6-2. La regionalización del tubo digestivo. El gráfico muestra un modelo de la correspondencia entre regiones del tubo digestivo en desarrollo y patrones de expresión de factores de transcripción Hox en el endodermo y el mesénquima (Modelo experimental: Embrión de pollo). Puede observarse la existencia de una expresión diferencial espacialmente organizada de combinatorias de factores para distintas regiones a lo largo del eje céfalo-caudal. Este hecho regularía la elaboración de diferentes patrones de organización de tejidos a lo lardo del eje céfalo-caudal del tubo digestivo. Este patrón de expresión diferencial en la esplacnopleura se produce en paralelo con la somitogénesis que ocurre en la placa de segmentación del mesodermo paraxil. La expresión de genes Hox en el mesénquima, en respuesta a la señal Shh producida por el endodermo, también varía en función de la posición. En los mamíferos, aunque la señal Shh se secreta en ambos portales intestinales, sólo en el posterior el mesénquima responde expresando genes Hox. Este hecho sugiere que en la

esplacnopleura hay diferencias regionales dependientes de diferencias en la competencia del mesénquima para responder Shh. Estas diferencias están instaladas antes de la expresión de genes Hox. La expresión de los genes Parahox, Pdx1 y Cdx2 por parte del endodermo también exhibe diferencias regionales. Estos genes también estimulan la expresión de genes Hox por el mesénquima adyacente. La distribución en forma de gradiente de la señal ácido retinoico también instala una expresión diferencial espacialmente organizada de genes Hox. Se sabe que dicho gradiente instala tendencias para desarrollar en sentido de intestino posterior; aunque se desconoce cómo produce dicho efecto. Se sabe que el ácido retinoico estimula la expresión de la proteína receptor del Fgf y que la activación de este receptor por su ligando activa una vía de señalización que regula la expresión de genes Hox y también la expresión de la proteína receptor de ácido retinoico. Aun no se ha dilucidado si el ácido retinoico actúa sobre el ectodermo o sobre el mesénquima visceral.

Bibliografía Grapin-Botton A. (2005). Antero-posterior patterning of the vertebrate digestive tract: 40 years after Nicole Le Douarin’s PhD thesis. Int J Dev Biol 49: 335-47. Roberts DJ. (2000). Molecular mechanisms of development of the gastrointestinal tract. Dev Dyn 219(2):109-20. Thomas PQ, Brown A, Beddington RS. (1998). Hex: a homeobox gene revealing periimplantation asymmetry in the mouse embryo and an early transient marker of endothelial cell precursors. Development 125(1):85-94. SC 6.7. Patterning del tubo digestivo II: la compartimentalización dorsoventral. M.P. Bidondo, V. Flores Si bien el endodermo aparece durante la evolución como una lámina epitelial que delimita una cavidad comunicada con el exterior en el que se alojan transitoriamente y se digieren sustancias externas, su papel en los organismos superiores no es sólo formar un aparato digestivo. Tanto desde el punto de vista filogenético como ontogenético, su importancia principal es la generación de órganos que sirven a la vida vegetativa. Son varios los órganos de parénquima epitelial endodérmico que no forman parte del aparato digestivo. El endodermo de la pared ventral del intestino anterior origina el parénquima de la tiroides, del pulmón, del hígado (que, aunque es una glándula exocrina del tubo digestivo, posee una gran cantidad de funciones de coordinación endocrina). Por otro lado, el endodermo de la pared ventral del intestino posterior origina el seno vesicourogenital del cual derivan órganos como la vejiga, vagina, uretra, vías espermáticas, próstata, etc. que tampoco pertenecen al aparato digestivo. El epitelio de la superficie dorsal de esas mismas regiones sí origina tejidos del tubo digestivo. Estos hechos indican la existencia de compartimentos o regiones con diferentes programas o tendencias de desarrollo instaladas a lo largo del eje dorsoventral del tubo digestivo. Una amplia variedad de moléculas informativas participan en este proceso de patterning diferencial entre el dorso y el vientre del epitelio endodérmico. Este proceso de patterning ha sido exhaustivamente estudiado en el caso del inicio del desarrollo del aparato respiratorio ya que brinda un ilustrativo ejemplo acerca de cómo las regiones dorsal y ventral del intestino primitivo anterior, que constituye un cilindro epitelial simple, debido a la información instalada por diferentes centros señalizadores, se segregan y forman un órgano dorsal, el esófago, y uno ventral, la tráquea (SC Patterning y morfogénesis temprana del intestino anterior; SC Patterning del intestino anterior ventral I: umbrales variables de factores de crecimiento y determinación de esbozos

respiratorio y hepático; SC 6.10. Las malformaciones traqueoesofágicas son resultado de alteraciones en el patterning dorsoventral del intestino primitivo anterior). Algunas investigaciones en curso están dedicadas a analizar el papel de varias proteínas señal que podrían participan en la instalación de tales diferencias. La proteína señal Shh y otras moléculas informativas estarían involucradas en la regionalización dorsoventral. La expresión de Shh por parte del epitelio endodérmico del tubo digestivo es al principio uniforme a lo largo del eje circunferencial. Posteriormente, su expresión queda restringida a la región dorsal, cercana a la notocorda, que es un sitio de alta secreción de Shh. y se instala una polaridad dorsoventral. Varios resultados experimentales indican que la distribución dorsoventral asimétrica de la señalización vía Shh podría depender de la expresión de factores inhibidores de la expresión o de la actividad de Shh en la región ventral. Existen otras moléculas con expresión espacial asimétrica. La proteína factor de transcripción Nkx2 se expresa sólo en el epitelio de la pared ventral del intestino anterior y se considera que su expresión es necesaria para el desarrollo de la glándula tiroides y del pulmón. Recuérdese que los tejidos que integran el parénquima de ambos se originan en el endodermo de la región ventral del intestino anterior. La asimetría dorsoventral no radica sólo en el endodermo. El epitelio ventral, que origina el hígado, está asociado al mesénquima ventral cardiogénico. La asociación in vitro de estas dos poblaciones permite el inicio del desarrollo de tejido hepático. Si se agrega mesénquima de la región dorsal del tubo digestivo el desarrollo hepático se inhibe; si se elimina el mesénquima dorsal, el desarrollo en sentido hepático continúa. Estos datos indican que el mesénquima se halla regionalizado y posee diferentes propiedades de desarrollo. El mesénquima del meso dorsal estimula el desarrollo del páncreas e inhibe el del hígado. El mesénquima ventral estimula el desarrollo del hígado e inhibe el del páncreas. El desarrollo del páncreas implica la formación de dos esbozos que crecen en el meso dorsal; aunque uno nace en la región dorsal del endodermo y el otro en la región ventral. La homeoproteína factor de transcripción Pdx1 participa en el desarrollo de ambos esbozos pancreáticos. Se expresa en las regiones epiteliales ventral y dorsal donde se forman los esbozos en tanto que en las regiones laterales, donde se expresa la proteína señal Shh, Pdx1 no se expresa.

Bibliografía Roberts DJ. (2000). Molecular Mechanisms of Development of the Gastrointestinal Tract. Dev Dyn 219:109-20. Harmon EB, Ko AH, Kim SK. (2002). Hedgehog signaling in gastrointestinal development and disease. Curr Mol Med 2(1):67-82. Deutsch G, Jung J, Zheng M, Lóra J, Zaret KS. (2001). A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm. Development 128(6):871-81. SC 6.8. Patterning del tubo digestivo III: la asimetría izquierda-derecha. V. Flores, M.P. Bidondo La simetría bilateral es una característica típica de los cordados. Durante el período somítico se pone de manifiesto un plan estructural básico con simetría bilateral en todos los tejidos embrionarios. Durante el desarrollo ulterior, las estructuras que forman parte de la vida de relación retienen la simetría bilateral, pero las que derivan de la esplacnopleura (corazón, pulmón y porciones del aparato digestivo de origen esplacnopleural) se desarrollan asimétricamente. Dicha asimetría, que implica que las regiones ubicadas a ambos lados del plano

sagital no son imágenes especulares, se denomina asimetría derecha-izquierda. En términos más estrictos, las estructuras que expresan asimetría derecha-izquierda carecen de plano sagital. En la especie humana existen varias anomalías anatómicas congénitas como la dextrocardia o el situs inversus, o los síndromes de Ivermark o de Kartagener, que son manifestaciones de fallas en la instalación de la asimetría derecha-izquierda. La asimetría derecha-izquierda se empieza a instalar en estados de desarrollo muy tempranos, como la gastrulación, aunque existen datos que sugieren que se inicia durante la segmentación de la célula huevo. Se ha propuesto la siguiente secuencia de eventos que se inicia ya en la primera división de la célula huevo: a) durante la fecundación se produce una redistribución de organoides y macromoléculas sintetizadas durante la gametogénesis y almacenadas en el citoplasma; entre ellas, los ARNm para proteínas canales iónicos. La distribución citoplasmática de tales ARNm se hace asimétrica; b) ello produce diferencias de concentración de algunos ARNm para proteínas de varios canales iónicos en las blastómeras; c) el inicio de la síntesis de proteínas a partir de dichos ARNm genera diferencias en la concentración de canales (canales de K+, de Ca+2, transportador K+/H+, bomba de Na+/K+ ATPasa) entre blastómeras; d) la síntesis asimétrica de proteínas canal genera gradientes de concentración iónica, de voltaje y de pH; e) los gradientes mencionados determinan que las cilias de la región del nódulo de Hensen del epiblasto (nodo ventral) batan hacia la izquierda concentrando sustancias, entre ellas morfógenos, en el lado izquierdo; f) la asimetría en la distribución de morfógenos generaría una expresión génica diferencial a ambos lados de la línea media; g) la asimetría en la distribución de morfógenos instalada tempranamente es mantenida luego por la asimetría espacial en la expresión de varias proteínas, entre ellas Fgf/Snail1, Nodal/ Pitx2, Left A, Left B etc. en el epiblasto y luego a lo largo del mesodermo lateral. Los productos de estos genes participan en cascadas de regulación intracitoplasmáticas que conducirían a programaciones diferentes del desarrollo en las mitades derecha e izquierda de la esplacnopleura. Las diferencias anatómicas resultantes de estas diferencias en los CCD se notan recién desde el inicio del período somítico para el caso de corazón (rotación del asa cardíaca) y hacia fines de la 5ª SD para el caso del tubo digestivo (rotación del asa vitelina). La expresión diferencial de estas proteínas en ambos lados del cuerpo podría influir sobre ciertos CCD (ventajas proliferativas, por ejemplo) que podrían generar crecimientos diferenciales, rotaciones y distribución diferente de las vísceras, etc. En la especie humana, las alteraciones en la expresión de las moléculas señaladas explican sólo un pequeño porcentaje de defectos de la lateralidad. Por ello se considera que muchos aspectos de la instalación de la asimetría derecha-izquierda son aún desconocidos.

Bibliografía Levin M. (2004). The embryonic origins of the left-right asymmetry. Crit Rev Oral Biol Med 15(4):197-206.

Levin M, Johnson RL, Stern CD, Kuehn M, Tabin C. (1995). A Molecular Pathway Determining Left-Right Asymmetry in Chick Embryogenesis. Cell 82:803-14. SC 6.9. Patterning del tubo digestivo IV: la organización de la diferenciación celular a lo largo del eje radial. M.P. Bidondo, V. Flores La pared del tubo digestivo pose una estructura histológica básica común a lo largo del eje céfalo-caudal aunque con diferencias regionales relacionadas con las funciones específicas de cada región. La esplacnopleura dispone, intrínsecamente, de la capacidad para organizarse en las cuatro capas principales (y sus subcapas) que desde el punto de vista estructural definen el eje radial. El mesénquima, una delgada capa de pocos micrómetros de grosor, origina la una variedad de tejidos que se organizan en capas concéntricas (lámina propia, muscular de la mucosa, submucosa, muscular interna, muscular externa, conectivo de la serosa y mesotelio). En la esplacnopleura, tanto el endodermo como el mesénquima visceral se comportan como emisores y receptores de señales y esta interacción es radial. Son señales de este tipo las involucradas en la generación de diferencias a lo largo del eje radial. Algunas de estas señales ya han sido mencionadas en relación con otros temas (véanse SC 6.6. Patterning del tubo digestivo I: la regionalización céfalo-caudal del tubo digestivo I; SC La unidad motora peristáltica. Cuadro cronológico sobre su diferenciación). Nótese que las diferencias regionales a lo largo del eje céfalo-caudal resultan, en realidad, de diferencias o particularidades en el modo como se producen las interacciones radiales en las distintas regiones del eje céfalocaudal. La figura SC 6-9-1A muestra cómo las especificaciones regionales se instalan tempranamente, durante la formación del mesodermo esplácnico (región caudal del embrión adyacente al mesodermo paraxil no segmentado aún). En lafigura SC 6-9-1B se indica que esas diferentes programaciones se traducen en diferencias estructurales regionales sólo en etapas más tardías. La figura SC 6-9-1C muestra que la aparición de las diferencias a lo largo del eje céfalo-caudal requiere la interacción entre componentes epiteliales y mesenquimáticos a lo largo del eje radial (SC Funciones de la señal Shh de los factores de transcripción Pdx en la diferenciación de la esplacnopleura. La determinación del esbozo pancreático).

Fig. SC 6-9-1. Modelo de comportamientos moleculares involucrados en la determinación de regiones a lo largo del eje céfalo-caudal y de las interacciones celulares a lo largo del

eje radial durante la diferenciación del tubo digestivo. A. La especificación y determinación de regiones se instala durante el período somítico temprano en el mesodermo esplácnico adyacente al mesodermo paraxil presomítico (placa de segmentación). Dichas programaciones implican la expresión de diferentes combinatorias de factores de transcripción Hox. B. Recién hacia el final del período somítico se hacen aparentes las diferencias estructurales resultantes de las diferentes programaciones instaladas en el mesodermo esplácnico. C. Las diferencias estructurales regionales son elaboradas por interacciones radiales entre el endodermo, el mesodermo y otros tejidos que invaden la esplacnopleura. La diferenciación de los tejidos que integran la pared del tubo digestivo, aunque tiene una fuerte asimetría céfalo-caudal que instala diferencias regionales a lo largo de dicho eje, también requiere interacciones regionales o locales que operan a lo largo del eje radial bidireccionalmente (endodermo  mesodermo y endodermo  mesodermo). Todas las Int e-m tienen este carácter. La figura SC 6-9-1C ilustra una secuencia de eventos interactivos epitelio-mesenquimáticos que participan en la especificación y diferenciación regional del tubo digestivo. Estos fenómenos procederían de acuerdo con la siguiente sucesión de eventos: 1) secreción de la proteína Shh por parte del endodermo, 2) adquisición de competencia por parte del mesénquima mediada por la expresión de la proteína receptor patched, receptor de Shh, 3) activación de la expresión combinatoria de proteínas factores de transcripción Hox por parte del mesénquima; este fenómeno instalaría 4) propiedades morfogenéticas particulares a la región, 5) secreción de proteínas señal como, por ejemplo, Bmp y Fgf por parte del mesénquima, que actúan sobre el endodermo, 6) adquisición de competencia por parte del endodermo y estabilización de las propiedades regionales, 7) secreción de nuevas señales que, actuando paracrinamente, llevan a la elaboración del patterning local (distintos tipos de vellosidades, de mucosas, diferentes grosores de capas conectivas y musculares, etc.). Nótese que la citodiferenciación epitelial, aunque es un fenómeno que tiene lugar a lo largo del eje circunferencial, también depende de I e-m que operan a lo largo del eje radial. La expresión de Shh tiene también una polaridad radial. Dado que su expresión queda restringida a la población de células epiteliales progenitoras, la concentración de Shh disminuye tanto hacia el extremo de las vellosidades en formación como hacia la submucosa, mucosa, etc. Esto es así debido a que la proteína Shh no se expresa en las poblaciones que ya han progresado en su diferenciación. Debido a este comportamiento, la polaridad radial se pone también de manifiesto a través de las diferencias estructurales en el epitelio desde el fondo de las glándulas o criptas hasta el extremo de las vellosidades intestinales o en las diferencias en la distribución de tipos celulares en las glándulas fúndicas desde el fondo de éstas hasta su desembocadura en la luz. La organización del proceso de reparación fisiológica que retienen las células del epitelio del tubo digestivo muestra a las claras la influencia de la organización radial. Las células troncales a partir de las cuales se repara normalmente el epitelio no se distribuyen regularmente en el eje circunferencial sino que se concentran en puntos definidos de éste, en el fondo de las criptas. Allí proliferan asimétricamente, generan poblaciones de células epiteliales posmitóticas que se intercalan en el epitelio. Éstas inician allí su diferenciación mientras se van desplazando a lo largo del eje longitudinal de las vellosidades que coincide con el eje radial de la pared. Simultáneamente, las células envejecidas, y ya deterioradas, se descaman en los extremos de las vellosidades y van siendo reemplazadas por las nuevas. Así, la estructura de las vellosidades típicas del tubo digestivo son el resultado estabilizado de un proceso dinámico de recambio permanente y flujo de células a lo largo del eje radial, desde el fondo de las criptas al extremo de las vellosidades.

Bibliografía Fu M, Tam PKH, Sham MH, Lui VCH. (2004). Embryonic development of the ganglion plexuses and the concentric layer structure of human gut: a topographical study.

Anat Embryol 208:33-41. Sukegawa A, Narita T, Kameda T, Saitoh K, Nohno T, Iba H, Yasugi S, Fukuda K. (2000). The concentric structure of the developing gut is regulated by Sonic hedgehog derived from endodermal epithelium. Development 127(9):1971-80. SC 6.10. Las malformaciones traqueoesofágicos son resultado de alteraciones en el patterning dorsoventral del intestino primitivo anterior. M.P. Bidondo, V. Flores El tabicamiento traqueoesofágico se produce en el marco del patterning dorsoventral del intestino anterior. Las regiones dorsal y ventral del esófago primitivo son, desde su constitución, entidades de desarrollo diferentes. Estructuralmente forman un cilindro pero desde el punto de vista biológico se comportan como hemicilindros yuxtapuestos con propiedades de desarrollo diferentes debido a que se hallan sometidos a centros señalizadores diferentes. Poseen, en consecuencia, diferente información posicional y durante el desarrollo sufren diferentes tipos de patterning. Este hecho se manifiesta por las diferencias en la distribución espacial de la expresión de los factores de transcripción tales como Nkx2.1, de expresión restringida a la región ventral, y de Sox 2, de expresión a la región dorsal. Estas áreas de expresión marcan tempranamente la frontera dorsoventral (Fig. SC 6-10-1 A-D).

Fig. SC 6-10-1. Expresión diferencial de factores de transcripción y remodelación del intestino anterior que lleva a la formación de esófago y tráquea a partir del esófago primitivo. A. Embrión de fines del período somítico. Las líneas B a D marcan las posiciones de las líneas de sección transversal ilustradas en las figuras B a D. Los cortes muestran la marca específica de las células que expresan el factor de transcripción Nkx2.1. B. El

esófago y la tráquea tienen un epitelio continuo (comparten la luz), pero el factor de transcripción se expresa sólo en el epitelio de la región ventral que formará la tráquea. C. El revestimiento epitelial original se segrega en dos tubos: esófago y tráquea. El proceso implica una remodelación local del epitelio y el mesénquima. D. Más caudalmente, el esbozo respiratorio se ha bifurcado. Los epitelios de esofágo y tráquea se han separado completamente. A lo largo del proceso, la expresión del factor de transcripción Nkx2.1 queda restringida al epitelio del esbozo respiratorio. Estas diferencias parecen depender, por un lado, del hecho de que la notocorda secreta señales que especificarían y mantendrían el carácter dorsal: a) la secreción de la proteína señal Nogina mantiene la expresión de Sox2 (marcador dorsal) y b) la secreción de la proteína señal Shh inhibe la expresión de Nkx2.1 (marcador ventral). Por otro lado, el mesénquima de la la zona ventral del mesoesófago secreta las proteínas señal Fgf y Bmp y enzimas de síntesis de ácido retinoico. Estas señales asignan carácter ventral al epitelio e inhiben la expresión de Sox2 (marcador dorsal). Aparte de estos hechos, el epitelio de la zona ventral se halla sometido a diferentes concentraciones de Fgf y de acuerdo con dichas diferentes estimulaciones se determina en los diferentes esbozos típicos de la superficie ventral (tiroides, respiratorio y hepático) (SC Patterning del intestino anterior ventral I: umbrales variables de factores de crecimiento y determinación de esbozos respiratorio y hepático). La separación de la tráquea y el esófago, que transcurre entre la 4ª y la 8ª SD, involucra varios procesos morfogenéticos e histogenéticos y crecimientos diferenciales. Entre éstos merecen citarse: el crecimiento en longitud del esbozo traqueal y el crecimiento de su extremo distal (mediado por Fgf10), remodelación local de la matriz extracelular y del epitelio y mesénquima locales, y el crecimiento diferencial de estructuras vecinas (crecimiento del corazón, el crecimiento de la cavidad pleural, dilatación del estómago). Durante todos estos procesos se separan ambos tubos epiteliales y entre ambos queda una banda de mesénquima que se ha dado en llamar “tabique traqueoesofágico”. Sin embargo, diversos estudios realizados en ratones y análisis de enfermedades monogénicas humanas apoyan la hipótesis de que la separación de ambos depende del patterning dorsoventral: a) La proteína señal Bmp4 inhibe la acción dorsalizante de la proteína Nogina. La señal Bmp4 incrementa el tamaño y la adhesión celular en tanto que Nogina inhibe, en la región dorsal, la acción de Bmp4. Estos dos efectos harían, por un lado, que la forma de células dorsales (planas) y ventrales (altas) difiera sustancialmente y, por otro, promueven una expresión diferencial de moléculas de adhesión lleva a que la intensidad de las Fif c-c entre las células de la región dorsal y las de la región ventral difiera sustancialmente y lleven a ambas poblaciones a una situación de segregación (separación o “sorting-out”). Estos hechos disminuyen la probabilidad de que ambas regiones epiteliales continúen una con la otra. La señalización vía BMP4 también produciría un crecimiento longitudinal diferencial entre las regiones dorsal y ventral que contribuiría a su separación. Se ha propuesto que la vía del Bmp4 contribuye a la separación de ambos epitelios promoviendo diferencias histogenéticas entre los mesénquimas dorsal y ventral (musculatura lisa y condrogénesis). En embriones con mutación de la proteína Nogina se forman nódulos de tejido cartílago ectópico en el mesénquima dorsal. b) El fármaco antineoplásico adriamicina inhibe la proliferación celular uniéndose al ADN. Administrado experimentalmente durante el desarrollo, es un agente teratógeno. Produce una malformación traqueoesofágica en la que la porción proximal del esófago termina en fondo de saco y su porción distal desarrolla características histológicas de tráquea. Estos embriones presentan un síndrome malformativo similar a la asociación

VACTERL en seres humanos (acrónimo de las alteraciones asociadas: Vértebras, Anorrecto, Corazón, TRáqueo-Esófago, Riñón y Limb: miembros). En algunos casos esta asociación es, en sentido estricto un “síndrome VACTERL” que tiene como causa mutaciones en genes codificantes de las proteínas factores de transcripción Gli 2 y Gli 3 que participan de la vía de señalización Shh. Estos resultados apoyan la idea de que la separación de tráquea y esófago es resultado de la operación de vías de señalización diferentes en las regiones dorsal y ventral del intestino primitivo anterior. La patología humana autosómica dominante llamada síndrome de Pallister Hall es causada, al parecer, por mutaciones del gen del factor Gli3. El síndrome incluye polidactilias o metacarpos con huesos en forma de V, hamartomas hipotalámicos, ano imperforado, fisuras laríngeas y anomalías en la lobulación pulmonar y otras alteraciones. c) Existen experiencias en ratón en las que la disminución de la expresión del factor de transcripción Sox2 en la región dorsal da lugar a la expresión ectópica dorsal de Nkx2.1. Este hecho cambia los comportamientos celulares de la zona con ventralización de la zona y aparición de fístulas traqueoesofágicas. Por otro lado, en pacientes humanos heterocigotas (mutación sin sentido/alelo normal) para una mutación del factor Sox2 presentan anomalías oculares (anoftalmia-microoftalmia), anomalías genitales y fistula traqueoesofágica. Bibliogfrafía Que J, Choi M, Ziel JW, Klingensmith J, Hogan BL. (2006). Morphogenesis of the trachea and esophagus: current players and new roles for noggin and Bmps. Differentiation 74(7):422-37. Cardoso WV, Lu J. (2006). Regulation of early lung morphogenesis: questions, facts and controversies. Development 133:1611-24. Miller LA, Wert SE, Clark JC, Xu Y, Perl AK, Whitsett JA. (2004). Role of Sonic hedgehog in patterning of tracheal-bronchial cartilage and the peripheral lung. Dev Dyn 231:57-71.

Capítulo 7. Desarrollo del aparato excretor SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 7.1. La composición celular compleja del esbozo renal y la regulación del balance proliferación/sobrevida/muerte celular programada. Factores de crecimiento y proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas. V. Flores, R. Rey SC 7.2. Factores de transcripción, factores de crecimiento y sus receptores y proteínas de la matriz extracelular regulan dinámicamente el patrón de ramificaciones del brote ureteral. V. Flores, R. Rey

SC 7.3. La constitución del esbozo renal requiere una sucesión de interacciones celulares. V. Flores SC 7.4. El mesénquima metanéfrico participa en la determinación y formación del brote ureteral a partir del conducto mesonéfrico. V. Flores SC 7.5. El brote ureteral permite la formación del blastema metanéfrico; éste permite el crecimiento y ramificación del brote ureteral. V. Flores SC 7.6. Una red de vías de señalización regula la formación del brote ureteral y la constitución del blastema metanefrogénico. V. Flores SC 7.1. La composición celular compleja del esbozo renal y la regulación del balance proliferación/sobrevida/muerte celular programada. Factores de crecimiento y proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas. V. Flores, R. Rey El desarrollo normal de cualquier esbozo requiere un equilibrio entre la proliferación celular, la diferenciación celular y la apoptosis. En general las células del esbozo cumplen esos comportamientos celulares con una dinámica que caracteriza a toda la población. La sincronización en la dinámica de comportamientos celulares que caracteriza a cada esbozo en particular es fácil explicar en los casos en los que las células del esbozo tienen un origen embrionario común. Sin embargo, en la constitución de los esbozos de la mayoría de los órganos, las células no poseen un origen embrionario común. En muchos casos provienen de varias poblaciones celulares que, en alguna etapa del desarrollo previo, se segregaron y determinaron diferentemente. Por ejemplo, durante la gastrulación se segregan y determinan diferentemente las tres capas germinativas, cada una de ellas posee dinámicas de proliferación, procesos morfogenéticos y de apoptosis diferentes. Sin embargo, muchos esbozos se forman más tarde como consecuencia de la integración de subpoblaciones celulares provenientes de diferentes capas germinativas, y los CCD mencionados se sincronizan una vez constituido el esbozo. El ejemplo del riñón es muy notable en este aspecto debido a que en la formación del esbozo renal participan al menos 4 categorías o subpoblaciones celulares diferentes, cada una con sus respectivas programaciones: a) células del brote ureteral. Estas células tienen su origen en el mesodermo intermedio. Las células de la región mesonéfrica del cordón nefrógeno tempranamente originan el conducto mesonéfrico y éste, a su vez, origina el brote ureteral; b) células de la región metanéfrica del cordón nefrógeno. Estas células se determinan en sentido metanéfrico como consecuencia de interacciones locales, probablemente con la cloaca y tienen la

capacidad de originar, entre otras cosas, nefrones; c) células de niveles caudales del mesodermo paraxil que se interacalan con células del metanefros; al parecer carecen de la capacidad para formar nefrones; d) células de la cresta neural que también integran el mesénquima del metanefros. De no ser por el uso de marcadores específicos y del uso de mapas de destinos modernos sería muy difícil distinguir estos tres últimos tipos celulares. Sin embargo, parecen exhibir tasas de proliferación y apoptosis similares, lo que sugiere que ambos CCD se regulan interactivamente. Las células que integran el mesénquima metanéfrico tienen al principio una tasa de proliferación. Luego, durante la morfogénesis y la histogénesis renal aparecen diferencias regionales significativas que también se regulan interactivamente (SC 7.5. El brote ureteral promueve la formación de las células troncales del blastema metanefrogénico). No todas las células del mesénquima metanéfrico inicial aportan descendientes al riñón definitivo. De las células que nacen en el mesénquima metanéfrico, una cantidad importante se eliminanpor apoptosis. Las que sobreviven siguen proliferando, se diferencian y forman parte del parénquima o del estroma renal. En el balance proliferación/apoptosis del mesénquima metanéfrico participan por un lado ciertos factores de crecimiento, las proteínas que integran el control central del ciclo celular y también las que regulan la apoptosis. Entre los factores de crecimiento, las proteínas señal factor de crecimiento fibroblástico 2 (Fgf2), la proteína morfogenética del hueso 7 (Bmp7) y, probablemente también, la proteína señal factor neurotrófico derivado de la glía o Gdnf (Gdnf: Glial cell line-derived neurotrophic factor) parecen cumplir en forma directa un papel central en la regulación de la proliferación. Por otro lado, se considera que los factores de crecimiento Fgf2 y Bmp7 también influyen en el balance proliferación/apoptosis manteniendo activa la expresión de la proteína factor de transcripción Wt1 (WT: de tumor de Wilms). Este factor de transcripción se expresa específicamente en el mesodermo intermedio y contrarresta el ingreso a la vía de la apoptosis inhibiendo a algunas proteínas proapotóticas. Con respecto a la expresión de las proteínas que intervienen en la apoptosis renal, se asigna un papel importante a una combinatoria de factores de transcripción entre los cuales parece poseer papel crucial la proteína factor de transcripción Pax2. Este factor regula el balance proliferación/apoptosis debido a que reprime la expresión de la proteína proapoptótica p53 que facilita el ingreso de las células en la vía de la apoptosis. Las células mesonéfricas y metanéfricas que expresan Pax2 no entran en apoptosis. Por el contrario, la deficiencia en la expresión o la función de esta proteína ocasiona el aumento de la muerte celular y fallas en el desarrollo de los derivados mesonéfricos y metanéfricos (agenesia renal y gonadal). En esta situación también se afecta el desarrollo de los derivados de los conductos de Wolff y de Müller. Otro factor con función antiapoptótica expresado en el blastema metanéfrico y en el brote ureteral es la proteína de la membrana mitocondrial bcl2. También participa en el desarrollo del mesodermo intermedio la proteína factor de transcripción Lim-1; su deficiencia genera una anomalía de la formación del mesonefros y del metanefros (algo similar a lo que ocurre con la deficiencia de Pax2). Los factores mencionados no participan sólo en el desarrollo del riñón, sino también en el de muchas otras estructuras del organismo. Debido a ello, las mutaciones en dichos genes pueden generar malformaciones múltiples y diversas en varios órganos. Señalamos que en el blastema metanefrogénico se expresa el factor de transcripción Wt1, codificado por el gen supresor de tumores del mismo nombre. La proteína Wt1 tiene varias funciones: por un lado es una proteína antiapoptótica ya que se une a la proteína proapoptótica p53 y la inactiva. El gen Wt-1 se expresa

específicamente en derivados del mesodermo intermedio, por lo cual sus mutaciones afectan solamente el desarrollo de estructuras urogenitales. Otros datos que indican que la muerte celular en el riñón está regulada por interacciones entre tipos celulares está ejemplificado por el hecho de que la metaloproteasa de la matriz 9 o Mmp9, que participa en las Int e-m en el desarrollo del riñón, también influye sobre la tasa de apoptosis en las etapas tempranas del desarrollo. Los embriones deficientes en Mmp9 sufren un gran aumento en la apoptosis renal que se traduce en una disminución del 20% del peso del órgano y una disminución del 30% del número de nefrones. En los riñones de embriones deficientes en Mmp9 se detecta una disminución de la forma activada del receptor c-kit, receptor de la proteína factor de célula troncal o Scf (Stem cell factor) acompañada de un aumento de la Scf unida a membrana. Este resultado es compatible con resultados de cultivos organotípicos de riñones de estos embriones en los que se detecta un déficit en la secreción de Scf. Estos datos indican que el Mmp9, además de estimular el desarrollo de ramificaciones del brote ureteral, también protege a las células del mesénquima metanefrogénico, las que tienen capacidad de formar nefrones, de la apoptosis.

Bibliografía Sorenson CM, Rogers SA, Korsmeyer SJ, Hammerman MR. (1995). Fulminant metanephric apoptosis and abnormal kidney development in bcl-2-deficient mice. Am J Physiol Renal Physiol 268:(1) F73-F81. Arnould C, Lelièvre-Pégorier M, Ronco P, Lelongt B. (2009). MMP9 Limits Apoptosis and Stimulates Branching Morphogenesis During Kidney Development. J Am Soc Nephrol 20(10):2171-80. engatta S, Arnould C, Letavernier E, Monge M, Martinan de Préneuf H, Werb Z, Ronco P, Lelongt B. (2009). MMP9 and SCF protect from apoptosis in acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 20:787-97. SC 7.2. Factores de transcripción, factores de crecimiento y sus receptores y proteínas de la matriz extracelular regulan dinámicamente el patrón de ramificaciones del brote ureteral. V. Flores, R. Rey Las células mesenquimáticas de la región metanéfrica expresan la proteína factor de transcripción Wt-1 codificada por el gen supresor de tumores homónimo. El factor Wt1 cumple varias funciones. Una de ellas es posibilitar las interacciones recíprocas que ocurren entre las poblaciones celulares que forman el esbozo renal. Su expresión le permite, por un lado, la generación de señales que tienen como población competente el brote ureteral y, por otro, responder a señales provenientes del brote ureteral. También, indirectamente, inhibiendo a proteínas proapoptóticas, participa del balance sobrevida/muerte celular durante el desarrollo renal. Una de las funciones de la proteína Wt-1 es la regulación de la síntesis de dos proteínas señal que genera el blastema metanéfrico: el factor neurotrófico derivado de la glía (Gdnf) y el factor de crecimiento del hepatocito (Hgf). Las células epiteliales del brote ureteral, a su vez, expresan en sus membranas plasmáticas las proteínas receptor de estas señales: el receptor Ret, al que se une el Gdnf, y el receptor c-Met, cuyo ligando es el Hgf. Los dos factores de crecimiento liberados por el mesénquima metanéfrico actúan sobre las células epiteliales del brote ureteral; estimulan la proliferación celular, el crecimiento en longitud de los brotes y su ramificación dicotómica. En este último proceso también participan las proteínas señal denominadas factores de crecimiento transformantes beta (Tgfβ), que poseen efectos contrapuestos a los anteriormente mencionados.

El crecimiento, morfogénesis y patrón de ramificaciones del brote ureteral también depende de las características de la matriz extracelular del blastema metanétrico (Véase SC El papel morfogenético del mesénquima. La remodelación regulada de la matriz extracelular como mecanismo de control del patrón de ramificaciones de un órgano epitelial). Por ejemplo, la síntesis, secreción y deposición de proteínas de matriz extracelular como la laminina es esencial, pues, cuando el brote ureteral se ramifica y da origen a los tubos colectores, éstos expresan la proteína integral de membrana fibroquistina. Las moléculas de fibroquistina que se insertan en la región basal de la membrana plasmática poseen la función de realizar interacciones con la laminina y otras proteínas de la matriz extracelular e iniciar vías de señalización intracelulares que controlan muchos de los CCD involucrados en todos los aspectos de la morfogénesis y diferenciación de los túbulos renales. Las que se insertan en las regiones laterales y apical de la membrana poseen otra función (SC Proteínas complejas polifuncionales y sus alteraciones como bases moleculares de la enfermedad renal poliquística). La importancia de los componentes de la matriz extracelular en el desarrollo de los derivados del brote ureteral se pone de manifiesto con claridad cuando se analiza el efecto de los factores arriba mencionados en medios de cultivo. Por ejemplo, el factor Hgf promueve la formación de estructuras tubulares ramificadas (similares a ramas del brote ureteral) en los cultivos celulares de riñón (línea celular MDKC: Madin-Darby canine kidney). Este efecto se observa cuando los cultivos se realizan sobre un sustrato con colágeno tipo I. Cuando son cultivadas sobre un extracto de membrana basal de composición compleja (Matrigel) no se produce este efecto. La extracción sucesiva de distintos compuestos del Matrigel y su adición ulterior al sustrato de colágeno tipo I permitió detectar qué sustancia del primero inhibe la tubulogénesis inducida por Hgf en el segundo. Este procedimiento permite constatar que: a) algunas proteínas de la matriz extracelular tales como laminina, fibronectina y entactina facilitan la formación de ramificaciones y, en consecuencia, aumentan la complejidad del patrón de ramas; b) otros componentes, como por ejemplo, colágeno tipo IV, proteoglucanos de heparán sulfato, vitronectina y otros, producen una marcada inhibición de las ramificaciones y c) la proteína señal factor transformante β (Tgf-β), por un lado, reduce el crecimiento de las ramas y, por otro, en el caso de las ramas que sí se forman, tienen menos ramificaciones. Todos estos resultados sugieren que el proceso de crecimiento y ramificación del conducto ureteral y sus ramas está regulado dinámicamente por un conjunto de factores que operan positivamente (lo estimulan) y negativamente (lo inhiben) (Fig. SC 7-2-1). Habría algunos morfógenos tubulogénicos, o señales positivas, como Gdnf y Hgf, y factores antitubulogénicos, o señales negativas, como el Tgf β que, actuando dentro de contexto de una matriz extracelular de composición cambiante, como el que rige durante los procesos de desarrollo de estructuras epiteliales, modularían dinámicamente las características que definen el patrón de ramificaciones: formación de túbulos, longitud de éstos, la frecuencia de ramificaciones y la extensión global de la arborización.

Fig. SC 7-2-1. Representación esquemática del modelo que plantea que el desarrollo del brote ureteral y sus ramas es el resultado regulado de fenómenos estimulantes e inhibitorios del desarrollo. Bibliografía Santos OF, Nigam SK. (1993). HGF-Induced Tubulogenesis and Branching of Epithelial Cells Is Modulated by Extracellular Matrix and TGF-β. Dev Biol 160 (2):293-302. Sakurai H, Nigam SK. (1997). Transforming growth factor-beta selectively inhibits branching morphogenesis but not tubulogenesis. Am J Physiol 272(1 Pt 2):F139-46. SC 7.3. La constitución del esbozo renal requiere una sucesión de interacciones celulares. V. Flores En la constitución del esbozo renal participan al menos dos poblaciones celulares, el blastema metanéfrico y el brote ureteral. La primera de ellas, sin embargo, de acuerdo con estudios modernos de marcación y seguimiento de linajes celulares, es una población heterogénea de células mesenquimáticas de diverso origen: las propias del mesénquima metanéfrico con el agregado de otras provenientes del mesodermo paraxil y de la cresta neural. La constitución del mesénquima metanéfrico. El cordón nefrógeno del mesodermo intermedio se extiende a lo largo de casi toda la extensión del embrión. Su extremo caudal se ubica a ambos lados de la cloaca. Sólo el mesodermo intermedio del extremo caudal del cordón nefrógeno posee la capacidad de formar nefrones metanéfricos cuando es puesto a interactuar con el brote ureteral. Trabajos clásicos de disociación y

reasociación de tejidos embrionarios sugieren que tal capacidad del mesodermo intermedio es adquirida sólo en el entorno de la cloaca, por lo cual el mesodermo intermedio sería determinado en sentido metanéfrico por el epitelio cloacal u otra población celular de la región. A esta región del mesodermo intermedio se agregan luego células originadas en los segmentos caudales de la cresta neural y del mesodermo paraxil. La incorporación de células de la cresta neural al mesénquima metanéfrico es considerada por algunos investigadores como fenómeno asociado al hecho de que el uréter que deriva del conducto mesonéfrico posee en sus capas musculares plexos nerviosos y neuronas parasimpáticas derivadas de la cresta neural. La formación del brote ureteral. El siguiente paso es la determinación del brote ureteral en el epitelio del conducto mesonéfrico y su ulterior crecimiento hacia el mesénquima metanefrénico. En este proceso, el mesénquima metanéfrico actuaría como población determinante y el brote ureteral como población competente. Una vez constituidos el brote ureteral y el blastema metanefrogénico, el proceso de formación del riñón implica una sucesión de interacciones entre ambas poblaciones. Si bien es imposible conocer la secuencia completa de eventos interactivos, con fines didácticos algunos proponen cuatro categorías de eventos sucesivos: a) El primero de ellos, probablemente mediado por señales de relativamente largo alcance, está mediado por señales generadas en el blastema que llevan a la formación del brote ureteral a partir del conducto mesonéfrico. Este fenómeno implicaría, por un lado, un efecto determinante y, por otro, un efecto estimulante de la proliferación y un efecto quimiotáctico de orientación del crecimiento hacia el blastema. El fenómeno involucra varias señales y se ha propuesto que podría estar bajo el control de un conjunto de factores de transcripción entre los cuales se cuenta el factor de transcripción Wt1. b) El segundo de los fenómenos, que también sería de largo rango de alcance, consiste en la producción de señales por parte de las células del brote ureteral que estimularían a las células del mesénquima metanéfrico del entorno a ingresar en una fase de célula troncal (autorrenovante y con alta tasa proliferativa). Durante esta fase también se inhibirían los procesos de muerte celular generando un aumento de la masa crítica de células necesarias para la constitución del blastema metanefrogénico. c) El tercero de estos fenómenos implicaría la generación de señales adicionales por parte de las células del brote ureteral, en este caso de corto rango de acción, que llevarían a las células del blastema metanefrogénico, inmediatamente adyacentes a los extremos de crecimiento de las ramas del brote ureteral, a agregarse y formar condensaciones mesenquimáticas o nódulos nefronogénicos determinados a formar nefrones. d) El cuarto de estos fenómenos consistiría en la producción de señales por parte del blastema metanefrogénico que regularían el crecimiento y las ramificaciones dicotómicas sucesivas de las ramas del brote ureteral. Estas últimas interacciones regularían el patrón de bifurcaciones y la extensión global de las ramificaciones y, en consecuencia, de la masa de parénquima renal funcionante. La clasificación precedente intenta resumir, en un cuadro relativamente claro y simple, los procesos interactivos involucrados en el desarrollo renal (Fig. SC 7-3-1). Ciertamente el panorama es más complejo y se omiten muchos fenómenos interactivos conocidos.

Fig. SC 7-3-1. Modelo de la sucesión de interacciones que podrían ocurrir durante el desarrollo del parénquima renal.

Muchas experiencias sugieren que la acción del brote ureteral sobre el mesénquima metanéfrico, promoviendo la formación del blastema metanefrogénico en su entorno inmediato, no es un fenómeno determinante sino permisivo. De acuerdo con esta interpretación, el mesénquima metanéfrico del cordón nefrógeno ya está determinado en sentido metanefrogénico, vale decir, determinado a formar nefrones, antes de su interacción con el brote ureteral. Se funda esta idea en que el hecho de que, si experimentalmente se asocia el mesénquima metanéfrico con una variedad de otros tejidos, en mucho casos el mesénquima metanéfrico responde formando nefrones o, por el contrario, no responde y no se diferencia. Estos resultados sugieren que el mesénquima ya está determinado a formar nefrones y que todas las diversas o variadas señales que puede recibir de varios tejidos embrionarios probablemente son todas permisivas. Vale decir, permiten expresar una vía previamente elegida. Se considera que la potencia del meséquima metanéfrico para responder a dichos estímulos formando nefrones depende de la expresión de la proteína factor de transcripción Wt1. Este factor de transcripción se expresa en el mesénquima desde antes de su interacción con el brote ureteral. Sin embargo, la expresión de la proteína Wt1 no es suficiente para adquirir la determinación (o la competencia) en sentido renal. Probablemente sea la combinatoria de factores de transcripción, en la cual está incluida, la que confiere determinación o competencia al blastema metanefrogénico. Que la expresión de la proteína Wt1 por sí solo no es suficiente está demostrado por el hecho de que otras poblaciones celulares embrionarias como el blastema gonadal y el epitelio celómico también lo expresan y no por eso se diferencian en riñón.

Bibliografía Bard JB, Davies JA, Karavanova I, Lehtonen E, Sariola H and Vainio S. (1996). Kidney development: the inductive interactions. Cell Dev Biol 7:195-202. Sainio K, Nonclercq D, Saarma M, Palgi J, Saxén L, Sariola H. (1994). Neuronal characteristics in embryonic renal stroma. Int J Dev Biol 38(1):77-84. SC 7.4. El mesénquima metanéfrico participa en la determinación y formación del brote ureteral a partir del conducto mesonéfrico. V. Flores Algunos autores consideran que el mesénquima metanéfrico genera las señales que promueven el desarrollo del brote ureteral a partir del conducto mesonéfrico. El mesénquima metanéfrico se caracteriza, desde temprano, por la expresión del factor de transcripción Wt1 codificado por el gen supresor de tumores del mismo nombre. Se considera que el factor Wt1 posee varias funciones de desarrollo. Una de las funciones de la proteína Wt1 en el desarrollo del riñón sería participar en la génesis de algunas de las señales que operan sobre el conducto mesonéfrico. La proteína Wt1 regularía la expresión de las proteínas señal factor neurotrófico derivado de la glía (Gdnf) y factor de crecimiento de hepatocito (Hgf). Por su parte, el conducto mesonéfrico posee competencia para responder a estas señales pues sintetiza las proteínas receptor c-Ret (receptor de Gdnf) y c-met (receptor de Hgf). Así, el mesénquima metanéfrico podría actuar sobre el epitelio del conducto mesonéfrico determinándolo a formar el brote ureteral. Una vez generado el brote ureteral, la expresión de las proteínas receptor mencionadas queda restringida a los extremos de crecimiento del brote y de sus ramificaciones (Fig. SC 7-4-1 A-E), vale decir, en los sitios de crecimiento en los que las interacciones de desarrollo entre ambas poblaciones prosiguen.

Fig. SC 7-4-1. Modelo del efecto localizador del sitio de formación del brote ureteral por medio de variaciones en la concentración de la proteína Gdnf y de su receptor Ret. La secreción local de Gdnf, por parte del blastema metanéfrico, y la expresión polarizada de su receptor Ret, con un máximo en el extremo caudal del cordón nefrógeno, determina el sitio de origen del esbozo ureteral a partir del conducto mesonéfrico. Sólo en la región adyacente al mesénquima metanéfrico la activación de la señalización vía Gdnf alcanza el umbral requerido para la determinación del brote ureteral. El modelo considera que, una vez producida la inducción, según se va ramificando el brote ureteral, sólo en sus extremos queda activo el sistema de interacción Gdnf-Ret. La expresión de este último es inhibida en las zonas ya determinadas. (Modificado de Schuchardt y cols., 1996).

Una red de interacciones moleculares en las que participan proteínas señal, sus receptores, correceptores y reguladores de la transcripción, generadas en tanto en el blastema, en el brote y en los tejidos circundantes, contribuyen a definir la localización del sitio de formación del esbozo del riñón (SC 7.6. Una red de vías de señalización regula la formación del brote ureteral y la constitución del blastema metanefrogénico). La atribución de las funciones de desarrollo mencionadas a las moléculas señal y sus receptores citados se debe a que las alteraciones en la expresión de dichas moléculas, debida a mutaciones o a su inhibición con anticuerpos en forma experimental, lleva a la producción de agenesias o a la ausencia bilateral de riñón. La figura SC 7-4-1 muestra que la formación del brote ureteral y de todo el sistema colector renal depende de la expresión de la proteína Gdnf por parte del mesénquima metanéfrico y de la expresión de su receptor Ret por parte del epitelio ureteral. La figura también muestra que la localización del sitio de formación del brote ureteral en la región caudal del conducto mesonéfrico depende, por un lado, de la alta concentración de Gdnf en la región caudal y, también, de la existencia de un gradiente de expresión del receptor Rec, el receptor del Gdnf. Este receptor exhibe su máximo nivel de expresión en el extremo caudal, único lugar en el que las células del conducto mesonéfrico alcanzan el nivel de expresión umbral necesario para que se produzca el efecto del factor Gdnf. Así, ambos hechos, concentración de la señal Gdnf y de su receptor, contribuyen a definir el sitio de nacimiento del brote ureteral. La figura SC 7-4-2 ilustra la importancia de la proteína Gdnf, secretada por el blastema metanéfrico, en la formación, crecimiento y el patrón de ramificaciones del brote ureteral. La figura muestra que los ratones heterocigotas para una mutación que anula la función del factor Gdnf presentan un crecimiento en longitud deficiente del brote ureteral y una disminución del número y longitud de sus ramificaciones. Por otro lado, los ratones homocigotas para dicha mutación muestran drástica abolición del desarrollo del brote ureteral (SC 7.6. Una red de vías de señalización regula la formación del brote ureteral y la constitución del blastema metanefrogénico).

Fig. SC 7-4-2. Representación esquemática del déficit de la proteína Gdnf sobre el desarrollo del esbozo ureteral. A. Ilustra el desarrollo del brote ureteral y sus ramas en el esbozo renal mantenido en cultivo durante 3 días. El esbozo fue obtenido de un ratón silvestre (normal). B. Ilustra el desarrollo del brote ureteral, en las mismas condiciones que en A, pero en un esbozo renal obtenido de un ratón heterocigota para una mutación del gen codificante de Gdnf. El tamaño y longitud del brote ureteral y el número y longitud de sus

ramas se reducen. C. Desarrollo del brote ureteral, en las mismas condiciones que en A, pero, en este caso, de un ratón con ambas copias del gen codificante de Gdnf mutados. Puede observarse que el conducto mesonéfrico se halla intacto pero no se forma el brote ureteral debido a la falta de la señal apropiada generada en el mesénquima metanéfrico. Bibliografía Pichel JG, Shen L, Sheng HZ, Granholm AC, Drago J, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP, Saarma M, Hoffer BJ, Sariola H, Westphal H. (1996). Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 382(6586):73-6. Schuchardt A, D'Agati V, Pachnis V, Costantini F. (1996). Renal agenesis and hypodysplasia in ret-k- mutant mice result from defects in ureteric bud development. Development 122(6):1919-29. SC 7.5. El brote ureteral permite la formación del blastema metanéfrico; éste permite el crecimiento y ramificación del brote ureteral. V. Flores Luego de la constitución del brote ureteral, los siguientes pasos son a) la admisión de su crecimiento en la intimidad del blastema metanéfrico y b) la formación de varias generaciones de ramificaciones dicotómicas dentro del mesénquima. En general, los procesos por medio de los cuales los tejidos epiteliales crecen y se ramifican dentro del mesénquima requieren la participación activa de este último (SC El papel morfogenético del mesénquima. La remodelación regulada de la matriz extracelular como mecanismo de control del patrón de ramificaciones de un órgano epitelial). En el caso del desarrollo del riñón, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, por medio de Int e-m, regulan todo el proceso de generación del sistema de túbulos colectores del riñón. En el ratón existe una mutación, la mutación Danforth, que fenotípicamente se expresa, en el nivel anatómico, como ausencia de riñón. Esta alteración fenotípica ilustra la dificultad en cuanto a diferenciar si la ausencia de un órgano es consecuencia de a) una agenesia de éste, que conceptualmente se debe a una falla en la determinación y constitución del esbozo del órgano o si, por el contrario, se debe a b) diversas alteraciones que pueden afectar el desarrollo del esbozo. La mutación Danforth del ratón, por ejemplo, tiene como característica fenotípica relevante la ausencia de riñón. Sin embargo, no es el resultado de una falla en la formación del brote ureteral. El brote ureteral se forma normalmente ‒es visible morfológicamente con forma, tamaño y posición normales‒ pero no crece debido a que no posee la capacidad de introducirse ni de ramificarse dentro del mesénquima metanefrogénico. Durante la morfogénesis y la histogénesis renal, el brote ureteral y sus ramificaciones crecen gracias a la actividad de las células localizadas en sus extremos. Vale decir, poseen un “extremo de crecimiento” integrado por células con propiedades biológicas diferentes de las que integran los “tallos” de las ramificaciones. Se sabe que el brote ureteral, una vez constituido, empieza a sintetizar la proteína señal Wnt11 que, al parecer, es necesaria para las interacciones que permiten su crecimiento dentro del mesénquima metanéfrico. También se sabe que el mesénquima sintetiza y deposita proteoglucanos de la matriz extracelular que permiten la síntesis y secreción sostenida de Wnt11 por las células del extremo de crecimiento del brote ureteral, primero, y de cada una de las sucesivas ramificaciones después.

En la mutación Danforth, el extremo de crecimiento del brote ureteral no expresa Wnt11; en consecuencia, no se introduce en el mesénquima, no prosigue su desarrollo y a ello se debe la ausencia del riñón. La interacción Wnt11-proteoglucanos es sólo una de un conjunto de interacciones moleculares que regulan el desarrollo integrado de brote ureteral y mesénquima metanéfrico. Nótese que la normalidad del riñón no requiere sólo que el brote ureteral pueda crecer y ramificarse, sino también la elaboración de un patrón de ramificaciones dicotómicas típico del sistema colector renal. La proteína señal factor neurotrófico derivado de la glía o Gdnf (Glial cell-derived neurotrophic factor) aparte de determinar la formación del brote ureteral (Fig. 1) también participa promoviendo el desarrollo sus ramificaciones. La proteína Gdnf se une directamente a su receptor Ret que es expresado por las células de los extremos del brote ureteral y luego de sus ramas. Promueve de esta forma la formación de nuevas ramas a partir de las preexistentes.

Fig. SC 7-5-1. Efecto de diversos factores de crecimiento sobre el desarrollo del sistema colector del rinón. A. Una microesfera de gel embebido en Gdnf estimula la formación de un brote epitelial (similar al ureteral) en la región caudal del conducto mesonéfrico mantenido en cultivo de tejido. B. Un fenómeno similar al mostrado en A ocurre en la región cefálica del conducto mesonéfrico. Se forma un brote epitelial amplio y deformado. C. Una microesfera embebida en Hgf o en TgfB1 no posee capacidad de estimular el desarrollo de un brote epitelial. Por otro lado, actuando como agente quimiotáctico, promueve el crecimiento de los brotes hacia zonas de alta concentración de Gdnf en éstas y promueve la formación de brotes (Fig. SC 7.5.2). También se ha mostrado en medios de cultivo que tiene el efecto de aumentar la adhesividad entre las células del epitelio ureteral garantizando su estabilidad. No se ha mostrado que aumente significativamente la proliferación de las células del brote ureteral.

Fig. SC 7-5-2. Efecto del Gdnf sobre el pattern de ramificaciones del sistema colector del riñón. Explantes de esbozos de rinón mantenidos durante 2 días en cultivo. A. Ilustra esquemáticamente que una microesfera control, no embebida en Gdnf (señalada en círculo de línea de puntos), no altera significativamente el patrón de ramificaciones del brote ureteral. B. Muestra el resultado de un cultivo en similares condiciones pero con una microesfera embebida en Gdnf. Se observa un desarrollo exagerado de las ramas del brote ureteral en derrededor de la microesfera (zona de alta concentración de Gdnf). (Modificado de Sainio K, et al. 1997). La proteína Gdnf sería el factor de crecimiento que actuaría en primer término. Participaría en el inicio de la formación del esbozo ureteral y sus ramas, en tanto que otros factores como el factor de crecimiento de hepatocitos o Hgf/Sf (Hepatocyte growth factor) y el factor transformante β1 o Tgf β1 (Transforming growth factor Beta 1) actuarían a continuación modulando o regulando el proceso, favoreciendo o contrarrestando el efecto de Gdnf. La proteína señal factor de crecimiento transformante β1 o Tgfβ1, por ejemplo, tendría funciones antagónicas al Gdnf en la modulación del proceso de generación de ramificaciones. Este factor, por un lado, inhibe las proteasas extracelulares denominadas metaloproteasas de la matriz extracelular (Mmp) que degradan el colágeno y, además, estimulan la síntesis de proteínas de la matriz extracelular; de esa forma estabilizan la matriz y el epitelio evitando que éste siga creciendo y ramificándose. La proteína de la matriz extracelular activina también participa en este proceso pues su exceso o su déficit en condiciones experimentales alteran la morfología de las ramificaciones. Lo mismo ocurre con otras varias proteínas que forman parte de la matriz extracelular o de la lámina basal.

Bibliografía Sainio K, Suvanto P, Davies J, Wartiovaara J, Wartiovaara K, Saarma M, Arumäe U, Meng X, Lindahl M, Pachnis V, Sariola H. (1997). Glial-cell-line-derived neurotrophic factor is required for bud initiation from ureteric epithelium. Development 124(20):4077-87. Vega QC, Worby CA, Lechner MS, Dixon JE, Dressler GR. (1996). Glial cell line-derived

neurotrophic factor activates the receptor tyrosine kinase RET and promotes kidney morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 93(20):10657-61. SC 7.6. Una red de vías de señalización regula la formación del brote ureteral y la constitución del blastema metanefrogénico. V. Flores La constitución del esbozo renal requiere la aparición e integración de tres poblaciones: a) la formación del mesénquima metanéfrico en el extremo caudal del mesodermo intermedio, b) la formación del brote ureteral en el extremo caudal del conducto mesonéfrico y c) la constitución del blastema metanefrogénico, como subpoblación segregada a partir del mesénquima metanéfrico como consecuencia de su interacción con el brote ureteral. La primera población, por un lado, da origen a la tercera y, por otro, origina el estroma del órgano. Las dos últimas están encargadas de formar el parénquima del órgano (el sistema colector y el sistema de nefrones). A estas poblaciones celulares se agregan luego otras dos subpoblaciones, que no participan en la formación del parénquima renal: una proviene del mesodermo paraxil y la otra de la cresta neural de la región lumbar y/o sacra (SC 7.1. La composición celular compleja del esbozo renal y la regulación del balance proliferación/sobrevida/muerte celular programada. Factores de crecimiento y proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas). A continuación examinaremos las etapas de formación de las tres poblaciones que originan el parénquima y estroma renal. a) Formación del mesénquima metanéfrico. La formación del metanefros o porción caudal del cordón nefrógeno precede a la del blastema metanefrogénico que resulta de su interacción con el brote ureteral. La potencia del meséquima metanéfrico para responder a la interacción con el brote ureteral depende de la expresión previa de la proteína factor de transcripción Wt1. Ésta, sin embargo, no confiere, por sí sola, determinación en sentido renal. Probablemente sea la combinatoria de factores de transcripción, en la cual está incluida, la que le confiere este carácter. Se sabe que la expresión de Wt1 inicia una cascada de interacciones que termina en la constitución del blastema metanefrogénico. La proteína Wt1 regula la expresión de las proteínas señal factor neurotrófico derivado de la glía (Gdnf) y factor de crecimiento de hepatocito (Hgf). A su vez, el conducto mesonéfrico expresa los receptores de estas señales, las proteínas receptor c-Ret (receptor de Gdnf) y c-met (receptor de Hgf). Así, el blastema mesonéfrico podría poseer una acción determinante sobre el conducto mesonéfrico determinándolo a formar el brote ureteral. b) La formación del brote ureteral. La determinación, y localización, del brote ureteral a partir del conducto mesonéfrico depende de una red de interacciones entre varias vías de señalización. Se sabe que la proteína Wt1 estimula la expresión de la proteína Gdnf y otros factores de crecimiento, por parte del mesénquima metanéfrico y que el conducto mesonéfrico expresa los receptores a dichos factores de crecimiento. Entre ellos tiene un papel central la proteína receptor tirosina-quinasa Ret que opera como uno de los receptores específicos de Gdnf. La acción de Gdnf requiere también la participación de la proteína receptor Gfrα1 (receptor α1de Gdnf) que es expresada tanto por el mesénquima como por el brote ureteral. Este receptor actúa reforzando la acción señalizada a partir de la activación del receptor Ret. La distribución espacial de la expresión y actividad del receptor Ret tiene también efecto localizador de la formación del brote ureteral pues se expresa en forma de gradiente que hace que sólo en su extremo caudal posea un grado de actividad suficiente como para producir la determinación y consiguiente crecimiento e invasión del blastema. Esto es así debido a que la activación de Ret se requiere para estimular la actividad de la enzima fosfatidil inositol-3 quinasa (PI3-K) que promueve la migración celular y la invasión del epitelio dentro del mesénquima metanéfrico (Fig. SC 7-6-1).

La localización del sitio de determinación y formación del brote ureteral depende de la distribución espacial de la actividad de ambos, Gdnf y Ret. La actividad de Gdnf está restringida en el espacio ya que, por un lado, es activada por el factor de transcripción Pax2 que es expresada en el propio mesénquima metanéfrico pero, por otro, es inhibida por el factor de transcripción FoxC que se expresa a lo largo de la frontera cefálica del mesénquima metanéfrico restringiendo la acción de Gdnf a la región caudal. Con respecto al receptor Ret, por un lado, su actividad depende de concentraciones apropiadas de Gdnf que se alcanzan sólo en la región caudal y, por otro, su actividad es inhibida por la proteína señal Bmp4, que también se expresa en la frontera cefálica de la región metanéfrica; este hecho restringe la activación de Ret a la región caudal. Así, la distribución especial de Bmp4 también contribuye a definir el sitio de nacimiento del brote ureteral. Una vez constituido el brote ureteral, la expresión del receptor Ret queda restringida a su extremo, y al extremo de sus ramas, en tanto que inhibida en el resto del epitelio mesonéfrico. c) Formación del blastema metanefrogénico. Una vez constituido, el brote ureteral ejerce un efecto permisivo sobre el mesénquima metanéfrico que, entonces, se diferencia en blastema metanefrogénico. Este fenómeno se repite con cada rama del brote ureteral. Se trata de un efecto, de escaso rango de alcance que permite que cada rama del brote ureteral en crecimiento posea un casquete de blastema metanefrogénico en su extremo. El proceso garantiza que cada rama posea una unidad generadora de nefroges (unidad nefronogénica) asociada. El paso siguiente es la abolición de la expresión de Gdnf en las células del blastema metanefrogénico pero su mantenimiento en las células que se ubican periféricamente a él. Esto genera un gradiente de Gdnf, con un máximo en la periferia, que sigue estimulando el crecimiento radial de las ramas del brote ureteral hacia regiones periféricas. A esto se debe el crecimiento centrífugo del riñón y la existencia de una gradiente de diferenciación de unidades funcionales desde la médula hacia la corteza renal. Este proceso resulta del hecho de que, una vez determinado el brote ureteral, sus células inician la expresión de la proteína señal Wnt11. Esta actividad queda luego restringida a su extremo pero, con cada bifurcación, se transfiere al extremo de sus ramas. Este fenómeno depende del modo como se conforma la población de células de cada extremo durante cada bifurcación (SC El control de la morfogénesis y la composición celular durante las bifurcaciones dicotómicas de las ramas del brote ureteral). Dichas células constituyen un “extremo de crecimiento” y realizan las interacciones que permiten su crecimiento dentro del mesénquima metanéfrico. El mesénquima, por su parte, sintetiza y deposita una combinación de proteoglucanos de la matriz extracelular que, a su vez, permiten la síntesis y secreción sostenida de Wnt11 por las células de los extremos de crecimiento del brote ureteral y de sus sucesivas ramificaciones después. La interacción Wnt11-proteoglucanos es sólo una de un conjunto de interacciones moleculares que regulan el desarrollo integrado de brote ureteral y mesénquima metanéfrico. Sin embargo, tienen un papel importante ya que sus alteraciones pueden impedir el desarrollo del riñón.

Fig. SC 7-6-1. Esquema de la organización espacial de la red de interacciones entre las vías de señalización que determinan y localizan la formación del brote ureteral a partir de la región caudal del conducto mesonéfrico. A. La molécula señal Bmp4 inhibe la expresión del receptor tirosina-quinasa Ret y la restringe al extremo caudal del conducto mesonéfrico. Los factores de transcripción FoxC1/C2 reprimen la expresión de Gdnf, que queda restringida a la región caudal. En dicha zona, la expresión de Gdnf es estimulada por el factor de transcripción Pax2 y la proteína Eya1. A su vez, en la región caudal del brote ureteral, los receptores Ret estimulan la actividad de Pl3k, que promueve el crecimiento del brote ureteral dentro del mesénquima. La acción conjunta de todas estas moléculas de expresión espacial restringida contribuyen a localizar la zona de formación del brote ureteral y del blastema metanefrogénico. B. A medida que el brote ureteral y sus ramas invaden el mesénquima emiten señales que continúan promoviendo la formación de más mesénquima metanefrogénico en derrededor del extremo de cada nuevo brote. Luego en la zona central (tallo de las ramificaciones) se suprime la expresión de Gdnf, que sólo persiste en la periferia del blastema. De este modo se promovería el crecimiento en forma radial (hacia zonas de alta expresión de Gdnf) de nuevos brotes. Bibliografía Dressler G. (2002). Tubulogenesis in the developing mammalian kidney. Trends Cell Biol 12(8):390-5. Brophy PD, Ostrom L, Lang KM, Dressler GR. (2001). Regulation of ureteric bud outgrowth by Pax2-dependent activation of the glial derived neurotrophic factor gene. Development 128:4747-56.

Capítulo 8. Desarrollo del aparato reproductor SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 8.1. Criterios que definen el sexo de un individuo. V. Flores SC 8.2. Combinatorias de factores de transcripción involucrados en la regulación de la determinación y diferenciación sexual de las gónadas. R. Rey, V. Flores. SC 8.3. Regulación del desarrollo del aparato reproductor durante la fase bipotencial. V. Flores, R. Rey SC 8.4. Regulación hormonal de la diferenciación sexual. Claves para relacionar alteraciones hormonales y alteraciones de la diferenciación sexual. R. Rey SC 8.5. Varones XX y Mujeres XY. Regulación genética y hormonal de la determinación y diferenciación sexual. R. Rey SC 8.6. Efectos de la expresión del gen SRY en el nivel de organización celular. R. Rey

SC 8.7. Constitución del esbozo gonadal. El origen de las poblaciones celulares que integran el esbozo. V. Flores SC 8.8. La formación de la uretra peneana: procesos complejos, anomalías frecuentes. V. Flores SC 8.1. Criterios que definen el sexo de un individuo. V. Flores El genotipo se expresa en todos los niveles de organización en los que se estructura el fenotipo. El dimorfismo sexual se manifiesta en prácticamente todos esos niveles y, en consecuencia, en todos ellos, desde el molecular al anatómico, se pueden definir criterios sobre la base de los cuales se diagnostica el sexo de un individuo. La vida en sociedad implica permanentes diagnósticos del sexo de los individuos con los que interactuamos y decisiones, aun inconscientes, de la conducta social. Los seres humanos diagnosticamos el sexo de los demás en forma instantánea, sin realizar ningún análisis profundo, tomando en cuenta, aunque no lo hagamos consciente, varios criterios. Entre ellos los más importantes son: a) las características anatómicas externas, forma corporal (hombros, cintura, caderas, senos, relieves musculares y óseos), b) la distribución pilosa (barba, bigotes, etc.), c) el tono de la voz, d) las posturas corporales, las actitudes y la conducta en general, entre otros. Muy accesoriamente tomamos en cuenta la vestimenta. Con estos criterios, en general, realizamos correctamente diagnósticos de sexo y reconocemos a un varón, aunque esté vestido como mujer o a una mujer aunque esté vestida como varón. Todas las cualidades mencionadas, sin embargo, son características sexuales secundarias y, desde el punto de vista médico, cuando se consideran aisladamente pueden conducir a error, aun cuando se tomen en cuenta los órganos genitales externos. En el momento del nacimiento, el médico define el sexo al que pertenece una persona y, en ese momento, no dispone de ninguna de las características sexuales secundarias que permiten diagnosticar el sexo. Pero el médico dispone de la inspección de los órganos genitales externos. En el caso de individuos normales, la decisión médica es correcta. Sin embargo, existen recién nacidos que presentan “ambigüedad” en los órganos genitales externos y resulta difícil, o imposible, definir el sexo sin el auxilio de otros criterios. También existen recién nacidos que no presentan ambigüedad, no generan duda, y el diagnóstico es incorrecto. Por todos estos motivos, cuando se alude al sexo de una persona, en el área de la medicina se recomienda especificar el o los criterios tomados en cuenta para realizar el diagnóstico. Así, se habla del sexo cromosómico o gonadal, por ejemplo. Algunos autores describen esta situación diciendo que hay varios sexos (cromosómico, gonadal, etc.). Tal conceptualización es incorrecta, la especie humana posee dimorfismo sexual y los seres humanos corresponden a una de dos categorías: el sexo masculino o el femenino. No existen varios sexos. Existen varios criterios que definen el sexo del individuo. Entre los criterios para considerar se pueden mencionar los siguientes:

- El criterio genético. Sólo es posible aplicarlo por medio de un análisis genético. En la actualidad se recurre a enunciar la presencia o ausencia del gen Sry identificado como el encargado de la determinación en sentido masculino (presencia de Sry = masculino; ausencia de Sry = femenino). Sin embargo, con el avance del conocimiento sobre cómo se regula la expresión de factores de transcripción involucrados en la determinación sexual es de suponer que, con el tiempo, se defina un conjunto de genes responsables de la diferenciación para cada sexo. En la actualidad se considera que el gen Dax es crucial en cuanto a la diferenciación en sentido femenino. - Criterios de regulación de la expresión génica. Cada vez más es necesario tomar en cuenta este criterio pues alude, como se indica en el punto anterior, a las combinatorias de factores de transcripción que instalan redes de regulación de la expresión génica responsables de determinación y diferenciación de tipo masculino o femenino. Estas redes de regulación de la expresión génica al modo masculino o femenino se instalan recién desde la 7ª SD en adelante cuando cesa el período bipotencial del desarrollo gonadal. - Criterio cromosómico. Se realiza por medio del análisis del cariotipo. Los individuos con cariotipo XY o XX son respectivamente masculinos o femeninos desde este criterio. - Criterio gonadal. Alude al modo como se produjo la histogénesis gonadal. El sexo masculino se caracteriza por la diferenciación gonadal en sentido testicular y el femenino por la diferenciación en sentido ovárico. - Criterio genital interno. En condiciones normales depende de, y es coherente con, la diferenciación gonadal. Alude al modo como se selecciona el tipo desarrollo de los conductos genitales internos: el modo de desarrollo de tipo femenino (atrofia de conductos de Wolff y desarrollo de conductos de Müller) o el desarrollo de tipo masculino (desarrollo de conductos de Wolff e involución de conductos de Müller. De acuerdo con estas modalidades de desarrollo el sexo masculino se define por la presencia del epidídimo, conducto deferente, etc. y el femenino por la presencia de trompas, útero, vagina. - Criterio genital externo. En condiciones normales depende de, y es coherente con, la diferenciación gonadal. Alude a la modalidad según la cual se diferencian el tubérculo genital y las eminencias uretrales y genitales. En la modalidad masculina se desarrollan el pene, la uretra peneana y las bolsas escrotales; en la modalidad femenina: el clítoris, los labios menores y mayores. En condiciones normales es el criterio que aplica el médico para definir el sexo de un individuo recién nacido. Ante dudas en esta instancia se recurre a evaluar otros criterios. En la especie humana se aplican también los términos sexo legal, sexo de crianza, sexo social, sexo psicológico y otros que no siempre tienen definición precisa en el campo de la biología humana. Los términos sexo legal y sexo de crianza no aluden a criterios biológicos que definen el sexo. Se denomina sexo legal o civil al que se asigna a la persona en el momento del nacimiento y que figura en su documento de identidad. El sexo de crianza, a su vez, deriva del sexo legal. Alude al, y resulta del, modo como se educa al individuo en la familia, la escuela, etc. Los términos sexo psicológico y sexo social están muy relacionados y aluden a la modalidad y/o rol masculino o femenino con que el individuo maneja su conducta general en su vida privada y/o se presenta y desempeña en su vida en sociedad. En consonancia con modificaciones legales introducidas recientemente en nuestro país, en la actualidad existe también el concepto de “identidad de género”. Este concepto alude al derecho que asiste a las personas, en nuestra sociedad, de elegir una “condición social” de tipo femenino o masculino, independientemente de su sexo biológico, de acuerdo con las características psicológicas, sociales, preferencias sexuales, etc., que el individuo elija como más apropiada a su persona. Vale decir, como una elección de una forma de vida que posibilita satisfacer sus expectativas de realización como ser humano.

- Criterio conductual o de diferenciación del sistema nervioso central. En los animales cuya conducta sexual implica la realización de un cortejo integrado por un conjunto típico de actos estereotipados que conducen a la cópula, se define también un criterio denominado conductual. Este criterio pone de manifiesto principalmente el tipo de determinación y diferenciación sexual que experimentó el sistema nervioso (SC La diferenciación sexual del sistema nervioso central). El sistema nervioso central sufre un proceso de determinación sexual que, al igual que otros órganos que exhiben dimorfismo sexual, depende de la presencia o ausencia de hormonas masculinizantes durante un período crítico breve. Algunos autores incluyen otros dos criterios: el criterio cromatínico y el criterio hormonal. El criterio cromatínico alude al hecho de que el examen de la cromatina de células interfásicas descamadas permite ver con facilidad el corpúsculo de Barr (un cromosoma X condensado). El número de corpúsculos de Barr informa cuántos cromosomas X posee la célula. El criterio hormonal alude a que tanto en varones como en mujeres, si bien ambos producen hormonas masculinas y femeninas, existe un patrón (o combinación) típico de concentraciones de hormonas de tipo masculino y otro de tipo femenino. Tomando en consideración todos estos criterios resulta claro que la definición del sexo de cualquier individuo depende de la coherencia con la que se expresan. Desde el punto de vista biológico, la coherencia en la modalidad de expresión de dichos criterios define la normalidad y el individuo es de sexo masculino o femenino: a) es de sexo masculino aquel individuo en el que todos los criterios se expresan al modo masculino y b) es de sexo femenino aquel individuo en el que todos los criterios se expresan al modo femenino. Los individuos en los que tales criterios se expresan incoherentemente padecen de alguna de las alteraciones de la determinación o la diferenciación sexual analizados en el capítulo 8, o alguna otra que por motivos de espacio o relevancia no han sido incluidas. En los animales, la incoherencia en la expresión entre criterios que permiten definir el sexo se denomina genéricamente estado intersexual. Éste incluye básicamente todo el conjunto de patologías congénitas de la diferenciación sexual presentes en la especie humana.

Bibliografía Lee PA, Houk CP, Ahmed SF, Hughes IA. (2006). Consensus Statement on Management of Intersex Disorders. In collaboration with the participants in the International Consensus Conference on Intersex organized by the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society and the European Society for Paediatric Endocrinology. Pediatrics 118;e488-e500. Link http://www.pediatrics.org/cgi/content/full/118/2/e488

SC 8.2. Combinatorias de factores de transcripción involucrados en la regulación de la determinación y diferenciación sexual de las gónadas. R. Rey, V. Flores. Clásicamente se considera que existe un sexo básico, el femenino, y que la diferenciación en sentido masculino es consecuencia de un redireccionamiento del sexo básico. El concepto clásico es que la diferenciación en sentido masculino requiere algún factor determinante testicular (TDF) en tanto que la omisión de éste produce diferenciación en sentido ovárico. La existencia de un TDF fue un requisito de la concepción clásica. Más de un “factor” ha ocupado, en los últimos tiempos, el lugar del TDF. Así, en la literatura clásica en general se menciona el término determinación sólo para referirse al desarrollo en sentido testicular. Últimamente, sin embargo, han aparecido trabajos en los que se habla también de determinación ovárica.

La determinación del sexo en sentido masculino no es consecuencia de la expresión de alguna molécula en particular, sino consecuencia de la expresión de una combinatoria de factores de transcripción, entre los cuales se halla la proteína Sry. Los genes codificantes de dichos factores de transcripción están localizados tanto en cromosomas sexuales como en autosomas. De modo similar, la determinación del sexo en sentido femenino también es consecuencia de la expresión de otra combinatoria de factores de transcripción, entre los cuales se halla la proteína Dax. También en este caso los genes codificantes de dichas proteínas se hallan en cromosomas sexuales y autosomas. El período bipotente de las gónadas. Antes de la determinación del sexo existe un período de tiempo durante el cual las gónadas inician su diferenciación pero aún no están determinadas. Dicho período se denomina bipotente ya que la gónada retiene potencia para determinarse y diferenciarse en cualquiera de ambos tipo de gónadas (Fig. SC 8-2-1). Durante el período bipotente, las gónadas de individuos XX o XY expresan la misma combinatoria de proteínas factores de transcripción Wt1 y Gata4.

Fig. SC 8-2-1. Esquema de los comportamientos moleculares involucrados en la determinación y diferenciación sexual en sentido masculino. La determinación sexual de las gónadas en sentido masculino. También se denomina determinación primaria (Fig. SC 8-2-1)

- Se inicia con la expresión del factor de transcripción Sry en las células del epitelio celómico que son precursoras de las células de Sertoli. - El factor Sry estimula la expresión de la proteína factor de transcripción Sox9 en las células del epitelio celómico y estimula su diferenciación en células de Sertoli. - La expresión de la proteína Sry es transitoria, pero inicia una cascada génica de diferenciación en sentido masculino en la que se expresan varias otras proteínas que participan en la diferenciación de todos los tejidos testiculares. - Las células del epitelio celómico inician la expresión de la proteína señal factor de crecimiento fibroblástico 9 (Fgf9), que atraería quimiotácticamente a las células del mesodermo intermedio que forman el blastema gonadal. - La proteína señal Dhh, secretada por las células de Sertoli, y la proteína receptor Patched2 (receptor de Dhh), expresada por las células germinales, las peritubulares y las intersticiales, participarían en las interacciones celulares por medio de las cuales se sintetizan y depositan los componentes de la membrana basal necesarios para el armado y mantenimiento de los cordones testiculares. - Las células de Sertoli en diferenciación también expresan las proteínas de membrana vanina-1 y nexina-1 que también participarían en el mantenimiento de la membrana basal que rodea los cordones testiculares y en la adhesión a las células peritubulares. - El factor de transcripción Sox9 expresado por las células de Sertoli estimula la síntesis y secreción de la proteína señal hormona antimülleriana (AMH) por parte de estas células. La proteína Sox9 también estimula la expresión de la proteína factor esteroidogénico 1 (Sf1). - La proteína Sf1, a su vez, en las células de Leydig en diferenciación, estimula la expresión de las enzimas responsables de la producción de hormonas esteroideas, como la testosterona. - Los factores de transcripción Gata4 y Wt1 y también Sf1 modulan positivamente y refuerzan la expresión de AMH inducida por Sox9. - Las señales Fgf9 y Dhh generadas por las células de Sertoli estimulan la diferenciación de las células de Leydig, secretantes de andrógenos, a partir del mesénquima del blastema gonadal. La señalización vía Hedgehog (Hh) es responsable de estimular la diferenciación de las células progenitoras Sf1+ del blastema gonadal en células de Leydig fetales. Sin embargo, no todas las células progenitoras Sf1+ se diferencian en células de Leydig fetales. Algunas de ellas permanecen indiferenciadas durante todo el desarrollo. Se ha postulado que estas últimas originan a las células de Leydig adultas y que la señalización vía Hh participaría dinámicamente en modular las proporciones en la generación de ambos tipos de células a partir de las progenitoras Sf1+. - La expresión del factor de transcripción Sry antagoniza la acción del factor de transcripción Dax1 que, indirectamente, instala una inhibición a la expresión del Sf1. - Así, la expresión de Sf1 actúa sin freno en las células de Leydig y aumenta la síntesis de testosterona necesaria para la diferenciación testicular y de los restantes órganos sexuales masculinos internos y externos. - La diferenciación de las células de Leydig incluye la expresión de la proteína receptor de las hormonas luteinizante/gonadotrofina coriónica (HCG). Estas hormonas aumentan la proliferación de las células de Leydig y estimulan una alta secreción de andrógenos. La HCG, de origen placentario, activa la síntesis de andrógenos

por parte de las células de Leydig durante los dos primeros trimestres de la gestación. La LH producida por la hipófisis fetal lo hace durante el último trimestre. Así, dos hechos principales en la diferenciación testicular son a) la constitución de los cordones de células de Sertoli a partir del epitelio celómico y b) la diferenciación de las células de Leydig a partir del mesénquima. Del normal funcionamiento de estas dos poblaciones celulares depende la correcta diferenciación de los restantes órganos del aparato reproductor masculino y la coherencia en la diferenciación sexual de éstos (véase SC 8.1. Criterios que definen el sexo de un individuo).

Fig. SC 8-2-2. Esquema de los comportamientos moleculares involucrados en la determinación y diferenciación sexual en sentido femenino. La determinación sexual de las gónadas en sentido femenino. También depende de la expresión de una combinatoria de factores de transcripción que antagonizan el efecto de los que estimulan la determinación en sentido masculino (Fig. SC 8-2-2).

- Incluida en dicha combinatoria de factores de transcripción se halla la proteína Dax1 que algunos han propuesto como el factor determinante ovárico por su papel antagonista de los efectos de Sry. - La acción del factor Sry es antagonizada por los factores de transcripción Dax1, Wnt4, Foxl2 y Sox3. - La proteína Dax1 estimula la expresión del factor de transcripción Wnt4. - La proteína Wnt4, a su vez, inhibe la expresión de Sf1 que de este modo se ve impedido de estimular la diferenciación de células o de estimular en las células del mesénquima la expresión de las enzimas responsables de la producción de testosterona. - La histogénesis ovárica, específicamente la constitución de folículos integrados por células germinales rodeadas por células del epitelio celómico, es dependiente de la presencia de células germinales primitivas al esbozo de gónada. - Por ello, todas las señales quimiotácticas e interacciones necesarias para la migración y proliferación de las células germinales primitivas son indispensables para la diferenciación ovárica. - Además, ciertos factores como las proteínas Dazla, Figla y Msh5 que participan de la regulación de la meiosis y los factores de crecimiento como Bmp15 y Gdf9 son importantes reguladores de la foliculogénesis. La falta de cualquiera de ellos ocasiona anomalías del desarrollo ovárico.

Bibliografía Barsoum IB, Kaur J, Ge RS, Cooke PS, Yao HH. (2013). Dynamic changes in fetal Leydig cell populations influence adult Leydig cell populations in mice. FASEB J 27(7):2657-66. Park SY, Tong M, Jameson JL. (2006). Distinct Roles for Steroidogenic factor 1 and Desert hedgehog Pathways in Fetal and Adult Leydig Cell Development. Endocrinology 148(8):3704-10. SC 8.3. Regulación del desarrollo del aparato reproductor durante la fase bipotencial. V. Flores, R. Rey La población celular integrante del aparato reproductor que más temprano aparece es la de células geminales (2ª SD). Durante la 3ª SD ya se generan poblaciones celulares somáticas que integrarán el aparato reproductor y en la 4ª SD empiezan los primeros procesos de determinación. La más temprana probablemente sea el mesodermo intermedio. Estos procesos de determinación no aluden al sexo sino sólo a su carácter de integrantes del aparato reproductor. El carácter sexual (masculino o femenino) se determina más tarde. Ello se debe a que, con excepción de los conductos genitales internos, los órganos de los aparatos reproductor masculino y femenino no son distintos órganos sino los mismos pero diferentemente diferenciados. Debido a ello, los esbozos de los órganos del aparato reproductor, desde el punto de vista de su carácter sexual, pasan por dos etapas: una primera fase bipotencial en la que los esbozos son bipotentes (poseen capacidad para determinarse y diferenciarse en cualquiera de ambos sexos) y una segunda fase de determinación y diferenciación sexual. Ingresados en esta segunda fase, los esbozos sólo pueden diferenciarse normalmente en uno de ambos sexos. La fase bipotencial. Se extiende hasta la 7ª SD o un poco más dependiendo de qué órgano se trate. El órgano que más temprano se determina sexualmente y del cual depende la diferenciación de los demás es el testículo. En la regulación de los procesos de desarrollo que ocurren durante la etapa bipotencial participan factores morfogenéticos generales que participan en el desarrollo de otras regiones corporales u otros aparatos o sistemas. Vale decir, no están específicamente vinculadas a la diferenciación sexual. Las alteraciones de la

diferenciación sexual ocurren después de dicho período. La fase bipotencial incluye la formación de varios esbozos bipotentes. Constitución del esbozo gonadal. Requiere la asociación de tres poblaciones celulares: a) el mesénquima del mesodermo intermedio (blastema gonadal), b) la hoja visceral del mesodermo lateral que lo cubre superficialmente (epitelio celómico) y c) las células germinales primitivas. a) Determinación del mesodermo intermedio. Ocurre durante la transición del período presomítico al somítico. Las células que van a formar el mesodermo intermedio, al ingresar a través del surco primitivo ya toman una posición intermedia entre el mesodermo paraxil y el lateral: las células del mesodermo paraxil y del mesodermo lateral se ubican en posición cefálica y caudal, respectivamente, con respecto al mesodermo intermedio. Ya en el período somítico, el mesodermo intermedio se extiende desde los segmentos cervicales hacia el extremo caudal. En su determinación parecen participar tanto señales mediales, de origen axial o paraxial, como laterales, originadas en el mesodermo lateral caudal. La expresión de los factores de transcripción Pax2, o Lim1, considerados marcadores del mesodermo intermedio depende de señales mediales. Cuando el mesodermo intermedio es separado, por una incisión quirúrgica, del mesodermo paraxil no expresan dichos marcadores. b) Determinación del mesodermo lateral. Una vez formado el mesodermo, a lo largo del eje medio-lateral se instala un gradiente L  m de expresión de la proteína señal Bmp4 (Bone Morphogenetic Protein: proteína morfogenética del hueso). Algunos experimentos indican que los elementos mesodérmicos distribuidos a lo largo de dicho eje (región medial y lateral del somita, mesodermo intermedio y mesodermo lateral) se determinan y localizan en forma dependiente de las diferencias en la actividad de la vía de señalización del Bmp. La determinación de los mesodermos lateral, intermedio y paraxil requeriría concentraciones altas, intermedias y bajas de Bmp4, respectivamente. Aumentando la concentración de Bmp4 a lo largo de dicho eje se puede disminuir la extensión de los elementos mediales o, incluso, convertirlos en los más laterales. En presencia de alta concentración de Bmp4, todo el mesodermo se transforma en mesodermo lateral. El proceso de determinación del mesodermo lateral y de sus subregiones procede de lo general a lo particular. Tempranamente, debido a la expresión diferencial, espacialmente organizada, de factores de transcripción se segregan las regiones correspondientes a la placa cardiogénica (corresponde a la región torácica) y el mesodermo lateral posterior o caudal (corresponde a la región abdominal). A continuación, esta última se deslamina en las hojas somática y visceral del mesodermo lateral caudal. De ambas, la visceral se fusiona con el blastema gonadal y pasa a formar transitoriamente el esbozo gonadal. c) Formación de las células germinales primordiales (CGP). Su migración a la cresta gonadal. Las CGP se generan a partir de una subpoblación de células epiblásticas pluripotentes localizada cerca del extremo caudal del epiblasto pregastrular. Su aparición en el epiblasto está promovida por señales del ectodermo extraembrionario, como las proteínas señal Bmp2, 4 y 8, que estimulan la expresión de la proteína transmembrana inducible por interferón Fragilis Al parecer esta proteína marca el inicio de la competencia, o de la determinación, en sentido de germinal. A continuación, estas células, por medio de interacciones homotípicas, se segregan de las células somáticas vecinas. Sólo aquellas que expresan alta concentración de Fragilis empiezan la expresión de la proteína Stella, considerada como marcador de determinación de la vía germinal. Algunos autores niegan esta posibilidad. Las células Stella+, a continuación, sufren una represión irreversible de los genes con caja homeótica. Algunos consideran este hecho como indicio de represión de la vía somática y elección de la germinal. Sólo unas 40 células del epiblasto realizan este proceso. Varias investigaciones recientes indican que la expresión de la proteína Stella no es esencial en la determinación de células germinales. Otras proteínas, quizá más importantes, participarían en este proceso. Durante la gastrulación, las CGP del epiblasto migran al mesénquima extraembrionario y se ubican cerca de la base del alantoides. Según algunos autores, recién en este lugar se produce la determinación definitiva en sentido germinal ya que, al parecer, algunas de estas células aún pueden evolucionar como mesénquima extraembrionario.

Con el plegamiento del embrión, la región ocupada por las CGP es llevada al interior del embrión. Desde allí migran a través de la hoja visceral y llegan hasta la región del epitelio celómico de la cresta gonadal. Durante su migración las CGP proliferan, pero no se diferencian. La proteína señal factor de células madre (SCF), expresada en el mesénquima visceral y en el epitelio celómico del esbozo de gónada, estimula la proliferación y migración de las CGP. Éstas, a su vez, expresan en su membrana el receptor de SCF, la proteína receptor c-kit. La migración dirigida de las CGP también depende de interacciones con las proteínas de la matriz extracelular laminina y fibronectina. El número de CGP que llega y se incorpora a la cresta gonadal depende del balance entre la proliferación y la apoptosis durante su migración. En este balance interviene un conjunto de proteínas factor de crecimiento y otras; como ejemplos pueden citarse Fgfb, Egf, Il4, Tnf, Gdnf, Bcl/Bax, etcétera. Cuando las CGP llegan a la cresta gonadal, junto con los otros tejidos, integran el esbozo gonadal y se inicia la fase bipotencial del esbozo de gónada. Con respecto a la fase de diferenciación sexual, se considera que las CGP son indispensables para la histogénesis del ovario pero prescindibles para la del testículo (SC 8.2. Combinatorias de factores de transcripción involucrados en la regulación de la determinación y diferenciación sexual de las gónadas; SC Regulación hormonal de la diferenciación sexual. Claves para relacionar alteraciones hormonales y alteraciones de la diferenciación sexual). Constitución de los esbozos de gonaductos. La formación de los conductos mesonéfricos (Wolff) está mediada por T m-e que se producen en los extremos de crecimiento de los conductos pronéfricos mientras éstos invaden el mesénquima mesonéfrico. El crecimiento y formación de cada conducto implica un proceso de migración celular dirigido seguido de una T m-e. Los factores transcripción Emx2 y Pax2 y otras varias proteínas expresadas en el mesénquima participan de dicha T m-e (SC 0.19 Transiciones reversibles mesenquimático-epitelial y epitelio-mesenquimática. CMD involucrados en su regulación). Las células mesenquimáticas que han iniciado la T m-e inician la diferenciación de un dominio basal de la membrana plasmática acompañada de la formación de una lámina basal en las zonas periféricas que quedan en contacto con el mesénquima. En este proceso de generación y estabilización de una interfaz de interacción entre epitelio y mesénquima desempeñan un papel importante las proteínas de matriz extracelular laminina, fibronectina, nidógeno 1 (entactina), proteoglucanos, colágeno tipo IV y otras. La expresión de las proteínas homeóticas Hox10 y Hoxd13 es también necesaria para una normal morfogénesis de los conductos de Wolff. Del tubo epitelial resultante de esta T m-e deriva el epitelio de revestimiento de las estructuras glandulares de la mayor parte de las vías espermáticas. La región del mesénquima peritubular, que no se epiteliza, originará las capas de tejido conectivo y de músculo liso de las vías espermáticas. Estas células tienen una importante función en la respuesta a los andrógenos de origen testicular que estimulan el crecimiento y diferenciación de los conductos de Wolff. Los conductos paramesonéfricos (Müller) se forman como resultado de invaginaciones longitudinales del epitelio celómico de disposición paralela a los conductos mesonéfricos de cada lado del cuerpo. Dicha disposición parece deberse a que éstos estimulan el desarrollo de aquéllos. El mesénquima del mesodermo intermedio también estimula, a través de la liberación de la proteína señal Wnt4, la formación de los conductos paramesonéfricos. La expresión de proteínas homeóticas Hoxa13, y otras, es necesaria para el desarrollo temprano de los conductos de Müller. Una vez constituido el conducto de Müller, su epitelio de revestimiento secreta la proteína señal Wnt7a que estimula en el mesénquima circundante la expresión de la proteína receptor de la AMH (hormona antimülleriana). En el caso del sexo masculino, la expresión de este receptor conduce a muerte celular y

desaparición del conducto paramesonéfrico por acción de la proteína AMH secretada por las células de Sertoli. Este efecto se produce a lo largo de un período sensible de sólo una semana o un poco más. En el caso del sexo femenino, en ausencia de la proteína AMH, los conductos paramesonéfricos siguen su desarrollo en tanto que la ausencia de andrógenos llevan a la atrofia de los conductos mesonéfricos. Constitución de los esbozos de órganos genitales externos El tubérculo genital y los pliegues uretrales y labioescrotales están formados por condensaciones mesenquimáticas recubiertas por epitelio ectodérmico. Durante la fase bipotencial del desarrollo del tubérculo genital participan varias proteínas. Entre ellas figuran la proteína homeótica factor de transcripción Hox4 y la proteína señal factor de crecimiento fibroblástico 8 (Fgf8). Este factor de crecimiento es sintetizado por el epitelio y estimula, en el mesénquima subyacente, la expresión de otros factores de crecimiento como Fgf10, Bmp4, y de las homeoproteínas factores de transcripción Msx1 y Hoxd13. Éstas participan en la morfogénesis del tubérculo genital y también de los esbozos de los otros órganos genitales externos.

Bibliografía Onimaru K, Shoguchi E, Kuratani S, Tanaka M. (2011). Evolution of Developmental Control Mechanisms. Development and evolution of the lateral plate mesoderm: Comparative analysis of amphioxus and lamprey with implications for the acquisition of paired fins. Dev Biol 359 (1):124-36. Meehan T, Schlatt S, O'Bryan MK, de Kretser DM, Loveland KL. (2000). Regulation of Germ Cell and Sertoli Cell Development by Activin, Follistatin and FSH. Dev Biol 220 (2):225-37. Saitou M, Barton SC, Surani MA. (2002). A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice. Nature 418(6895):293-300. Mauch TJ, Yang G, Wright M, Smith D, Schoenwolf GC. (2000). Signals from Trunk Paraxial Mesoderm Induce Pronephros Formation in Chick Intermediate Mesoderm. Dev Biol 220:62-75 SC 8.4. Regulación hormonal de la diferenciación sexual. Claves para relacionar alteraciones hormonales y alteraciones de la diferenciación sexual. R. Rey Diferenciación sexual masculina. El testículo fetal secreta dos hormonas principales. Las células de Sertoli de los cordones seminíferos producen la proteína señal hormona antimüllerriana (AMH) y las células de Leydig del intersticio sintetizan la hormona esteroidea masculina testosterona. La AMH se une a su receptor presente en los conductos de Müller, provocando su regresión. La testosterona, al unirse a sus receptores en los conductos de Wolff, permite su diferenciación en epidídimos, conductos deferentes, vesículas seminales y conductos eyaculadores. En el seno urogenital y en los esbozos de los genitales externos, la testosterona es transformada, por la enzima 5-alfa-reductasa tipo 2 en otra hormona esteroidea masculina dihidrotestosterona (Dht), un andrógeno más potente que se une al receptor de andrógenos con más afinidad. La Dht estimula a) la diferenciación de la próstata, b) el crecimiento del tubérculo genital (que forma el pene), c) el crecimiento de la lámina uretral endodérmica y d) la fusión completa de los pliegues uretrales que forman así la uretra peneana y la fusión completa de los pliegues labioescrotales que se diferencian en escroto. También interviene en f) el descenso testicular a través del conducto inguinal en el 3er trimestre de la gestación. Durante los dos primeros trimestres de la gestación, la producción de andrógenos depende de la estimulación de las células de Leydig por la proteína hormona gonadótrofina coriónica (HCG). En el último trimestre depende de la secreción de la proteína hormona luteinizante (LH) secretada por la hipófisis fetal.

Diferenciación sexual femenina. Los ovarios secretan muy pequeñas cantidades de andrógenos y de AMH a partir de la 36ª SD. Los ovarios secretan estrógenos pero éstos no determinan el sexo en sentido femenino. El ovario fetal no produce sustancias que influyan en la diferenciación sexual. La diferenciación en sentido femenino de los órganos genitales se produce normalmente en ausencia de ovarios. Lo mismo ocurre en embriones XY castrados antes de que se produzca la determinación sexual. La ausencia de las hormonas de origen testicular es suficiente para la diferenciación en sentido femenino: a) la ausencia de AMH permite la estabilización, el desarrollo y diferenciación de los conductos paramesonéfricos que forman útero, trompas y parte superior de la vagina y b) la ausencia de andrógenos produce la regresión del conducto mesonéfrico. Por otro lado, c) el seno urogenital origina la porción inferior de la vagina. Por su parte, d) el tubérculo genital crece muy poco y forma el clítoris, mientras que e) los repliegues urogenitales y labioescrotales apenas se fusionan en sus extremos dando lugar a la formación de los labios menores y mayores de la vulva. Claves para interpretar algunas fallas de la diferenciación sexual. a) Las anomalías del desarrollo sexual fetal con disgenesia gonadal (fallas en la diferenciación de las gónadas) implican fallas en el desarrollo de las 2 poblaciones celulares endocrinas del testículo: células de Sertoli productoras de AMH y células de Leydig productoras de andrógenos. En estos casos, los conductos genitales internos, el seno urogenital y los genitales externos se desarrollan en sentido femenino (o con deficiencia en la masculinización). b) En cambio, las anomalías sin disgenesias gonadales, debidas a mutaciones que afectan la síntesis de –o la sensibilidad a– sólo una de las 2 hormonas testiculares, se caracterizan por una incongruencia entre el desarrollo de los derivados de conductos paramesonéfricos, mesonéfricos, del seno urogenital y de los genitales externos. c) En caso de exceso de andrógenos en un feto XX con ovarios provocará una masculinización de los derivados del conducto mesonéfrico, del seno urogenital y de los genitales externos, sin afectar el desarrollo del útero y trompas. d) En caso de deficiencia del sistema de la AMH debido a mutaciones que afecta la síntesis de –o la sensibilidad a‒ AMH en un individuo XY, por lo demás normal, permitirá el desarrollo de los derivados de los conductos paramesonéfricos sin afectar el desarrollo de los derivados del conducto mesonéfrico, del seno urogenital ni de los órganos sexuales externos. Descenso de las gónadas. La primera fase, intraabdominal, del descenso testicular, hasta el orificio del conducto peritoneo-vaginal (futuro orificio profundo del conducto inguinal) se debe en parte a la regresión del ligamento suspensorio craneal de la gónada. La regresión de este ligamento depende de la acción de la hormona factor símil insulina 3 o Insl3 producido por las células de Leydig del testículo. Algunos autores postulan que la AMH secretada por las células de Sertoli también desempeña un papel, pero éste es un tema no aclarado. Durante la fase inguinal del descenso testicular participan, por un lado, el aumento de la presión intraabdominal que tiene lugar cuando se desarrolla la musculatura de la cincha abdominal. Esta presión empuja los testículos hacia el escroto. Por otro lado, la acción de los andrógenos sobre el gubernaculum testis también es importante. Existen indicios de que los andrógenos también pueden actuar por un mecanismo neuroendocrino a través del núcleo espinal del nervio genitofemoral que posee fibras que se distribuyen a lo largo del gubernaculum testis.

Bibliografía Rey RA, Grinspon RP. (2011). Normal male sexual differentiation and aetiology of disorders of sex development. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 25:221-38.

SC 8.5. Varones XX y Mujeres XY. Regulación genética y hormonal de la determinación y diferenciación sexual. R. Rey En todo embrión con testículos funcionantes, independientemente del cariotipo que posea el individuo, desde la 7ª SD en adelante, se produce la diferenciación de las células de Sertoli y se inicia la secreción de la proteína señal hormona antimülleriana (AMH). Ésta actúa sobre las células mesenquimáticas, que expresan el receptor de AMH, circundantes a los conductos de Müller. Las células mesenquimáticas activadas sintetizan una proteína señal que actúa sobre las células epiteliales de los conductos de Müller y promueven en ellas el ingreso en la vía de la apoptosis o el ingreso e una T e-m. El resultado de esta sucesión de eventos es la desagregación del epitelio de los conductos y su desaparición. En los testículos se inicia también la síntesis y secreción de testosterona por parte de las células de Leydig. La testosterona actúa directamente sobre el receptor de andrógenos presente en las células de los conductos de Wolff, provocando su diferenciación en epidídimo, conducto deferente, vesícula seminal y conducto eyaculador. En las células del seno urogenital y de los esbozos de los órganos genitales externos, la testosterona es transformada en otro andrógeno más potente, la dihidrotestosterona (Dht), por la enzima 5-α-reductasa tipo 2. La Dht se une al receptor de andrógenos y provoca el desarrollo de la próstata y la masculinización de los genitales externos. ¿Puede un embrión XX desarrollar testículos funcionantes? En condiciones normales tal situación es imposible. Pero existen patologías en las que ese hecho ocurre. Existe un cuadro denominado “Varón XX” en el que el paciente tiene cariotipo 46, XX y posee testículos. En el 80% de tales casos el paciente posee un gen SRY anormalmente ubicado en uno de los cromosomas X. ¿Cómo puede ocurrir tal cosa si la ubicación normal del gen SRY es el brazo corto del cromosoma Y! La explicación se encuentra en una alteración ocurrida en el padre del paciente: una anomalía de la meiosis de la espermatogénesis en el padre. En efecto, el gen SRY asienta en una región del cromosoma Y que no realiza intercambio genético (crossing-over) con el cromosoma X durante la meiosis. Sin embargo, su ubicación es muy cercana a una región del cromosoma Y que sí realiza intercambio genético durante la meiosis, la región seudoautosómica 1 (PAR 1). Un error en la localización de la zona de apareamiento y crossing-over entre los cromosomas X e Y, en alguno de los millones de espermatocitos paternos, puede dar lugar a una translocación del gen SRY desde el cromosoma Y al cromosoma X. Si esto ocurriera, y ocurre en un porcentaje bajo de casos, al final de la espermatogénesis habrá un espermatozoide cuyo cromosoma X tendrá un gen SRY y un espermatozoide cuyo cromosoma Y carecerá del gen SRY. Si el espermatozoide X con gen SRY participa de una fecundación con un ovocito normal (aporta un cromosoma X normal), se formará un embrión XX que contendrá un gen SRY. Este gen se expresará en el esbozo gonadal bipotente en la 7ª SD, producirá la determinación de la gónada en sentido testicular y desencadenará la serie de procesos que concluyen en la diferenciación del testículo (proliferación del epitelio celómico, quimiotaxis de células del mesodermo mesonéfrico, interacción de ambos tipos celulares y formación de cordones en los que se diferencian las células de Sertoli con la ulterior diferenciación de las células de Leydig en el intersticio). Este cuadro es el de un Hombre XX. Si el espermatozoide fecundante fuera el cromosoma Y que carece del gen SRY, entonces la célula huevo tendrá un cariotipo 46, XY pero carecerá de gen SRY. En el embrión XY, en el esbozo gonadal no se expresará el gen SRY, se diferenciará en sentido ovárico, no habrá hormonas masculinas y, en consecuencia, los genitales internos y externos se diferenciarán en sentido femenino. Este cuadro es el de una Mujer XY.

Bibliografía Rey RA, Grinspon RP. (2011). Normal male sexual differentiation and aetiology of disorders of sex development. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 25:221–238. Achermann JC, Ito M, Ito M, Hindmarsh PC, Jameson JL. (1999). A mutation in the gene encoding steroidogenic factor-1 causes XY sex reversal and adrenal failure in humans. Nat. Genet.22, 125–126.

SC 8.6. Efectos de la expresión del gen SRY en el nivel de organización celular. R. Rey El papel del gen SRY (Sexual Region-on-chromosome Y) como factor determinante testicular o Tdf (Tdf: Testicular determining factor) se empezó a conocer a principios de los 90. Pasaron varios años antes de que se empezara a entender cómo participa la proteína Sry en el dimorfismo sexual del esbozo gonadal. En mamíferos XY (ratón), la proteína Sry se expresa durante un día en células del epitelio celómico de la cresta gonadal y estimula la proliferación de dicho epitelio. En los individuos XX, las células del epitelio celómico no expresan la proteína Sry y prolifera con menor intensidad. Las experiencias de disociación y asociación de tejidos en medios de cultivo permitieron entender algunos CCD y CMD involucrados en la diferenciación sexual. En efecto, los experimentos de disociación y recombinación recíproca entre células mesonéfricas y células del epitelio celómico de ratones XY (machos) y XX (hembras) dan los siguientes resultados: - La reasociación, en un medio de cultivo, del tejido mesonéfrico de un embrión XY (masculino) con epitelio celómico de un embrión XX (femenino) deriva en una intensa actividad proliferativa por parte de las células del epitelio celómico (XX). El tejido mesonéfrico en cuestión es el que normalmente da origen al blastema gonadal del esbozo del testículo. - La reasociación, en un medio de cultivo, de tejido mesonéfrico de un embrión XX (femenino) con epitelio celómico de un embrión XY (masculino) no se traduce en una estimulación de la proliferación del epitelio celómico (XY). El tejido mesonéfrico en cuestión es el que normalmente da origen al blastema gonadal del esbozo del ovario. Estos resultados indican que a) las células de mesénquima mesonéfrico, las que luego se constituyen en blastema gonadal, generan alguna(s) señal(es) que estimula(n) la proliferación de células del epitelio celómico que lo recubre superficialmente y que b) tanto las células del epitelio celómico de embriones XY como las de embriones XX son capaces de responder a la señal generada en las células mesonéfricas. Esta exacerbación de la proliferación del epitelio celómico es el primer CCD que se pone en acción como resultado de la activación del gen SRY y genera los primeros cambios citológicos (proliferación), histológicos (engrosamiento del epitelio celómico) y anatómicos (aumento de tamaño gonadal) que constituyen el primer indicio de diferenciación en sentido masculino. El aumento del tamaño gonadal también es manifestación de la migración del mesénquima mesonéfrico hacia el epitelio celómico del esbozo gonadal. En efecto, a la proliferación del epitelio celómico, le sigue una migración dirigida de las células del mesénquima mesonéfrico hacia la gónada en formación. Las experiencias de reasociación in vitro para analizar este proceso dan el siguiente resultado: - En experimentos de reasociación de una gónada XY + una gónada XX + un mesonefros (XX o XY), dispuestos de modo que la gónada XX quede entre los otros dos tejidos embrionarios, se observa que las células del mesonefros migran hacia la gónada XX, y que en ésta se forman estructuras cordonales epiteliales con depósito de laminina en su entorno similares a los cordones seminíferos. A continuación, las células de los cordones comienzan la expresión de Sox9, una proteína típica de la célula de Sertoli. Estos fenómenos que ocurren en la gónada XX, en estas condiciones de cultivo, son similares a los que ocurren naturalmente en las gónadas XY. Este resultado indica que una vez iniciada la diferenciación masculina caracterizada por la proliferación del epitelio celómico, éstas regulan la diferenciación testicular estimulando la migración dirigida de las restantes células somáticas con la consiguiente formación de cordones epiteliales y su diferenciación en células de Sertoli. Así, las células del epitelio celómico pueden ser consideradas como un centro señalizador para la histogénesis y citodiferenciación de la gónada masculina.

La activación de la expresión de la proteína Sry en las células del epitelio celómico es sólo el inicio de un conjunto de vías de señalización que llevan a la diferenciación testicular. Existen varios modelos sobre la cascada de eventos que siguen a la expresión de Sry (SC 8.2. Combinatorias de factores de transcripción involucrados en la regulación de la determinación y diferenciación sexual de las gónadas). Se considera que entre las vías de señalización involucradas están las de varios factores de crecimiento.

Bibliografía Tilmann C, Capel B. (1999). Mesonephric cell migration induces testis cord formation and Sertoli cell differentiation in the mammalian gonad. Development 126: 2883-90. Tilmann C, Capel B. (2002). Cellular and molecular pathways regulating mammalian sex determination. Recent Prog Horm Res 57: 1-18. SC 8.7. Constitución del esbozo gonadal. El origen de las poblaciones celulares que integran el esbozo. V. Flores El esbozo gonadal aparece en el mesodermo intermedio a la altura de los niveles segmentarios en los que, en el cordón nefrógeno, se forma el mesonefros. A lo largo de dichos niveles segmentarios, un poco más medialmente, se origina el esbozo de la glándula suprarrenal. La relación es tan íntima desde el punto de vista embriológico y funcional que, en algunas especies (roedores), se considera que todo el mesénquima de dicha región corresponde al mesonefros que, en consecuencia, aportaría células a los otros dos esbozos de órganos. Hasta el momento de la determinación sexual, las gónadas de embriones XY o XX son indistinguibles y tienen la capacidad de diferenciarse en cualquiera de ambos sexos, de ahí la designación de dicho intervalo temporal como período bipotencial. La determinación en sentido masculino se inicia con la expresión de una combinatoria de factores transcripción que incluye el factor gen Sry, en algunas de las células del epitelio celómico. Estas células se diferencian entonces en células pre-Sertoli que abandonan el epitelio y luego se diferencian en células de Sertoli. Las células pre-Sertoli y luego las de Sertoli se comportan como centro señalizador de las demás células del esbozo gonadal dirigiendo su comportamiento proliferativo, migratorio, formas de asociarse en el espacio, etc., y, en definitiva su modo de diferenciación sexual. Las células de Sertoli también tienen la capacidad de dirigir el comportamiento de otras células del epitelio celómico ya que la proteína Sry no sólo cumple función masculinizante en la célula que la expresa (no requiere ser autónoma de la célula). Las células del epitelio celómico que expresan la proteína Sry pueden reclutar a las demás a convertirse en células de Sertoli, aun cuando no expresen el factor Sry, como es el caso de las quimeras formadas por células XX y XY que se diferencian en testículos. En estos casos hay un gran porcentaje de células de Sertoli XY pero también se encuentran células de Sertoli XX. Las células que más tempranamente expresan la proteína Sry se hallan debajo del epitelio celómico (pre-Sertoli) que probablemente estimulan a las otras células del epitelio y quizá también a células del mesénquima mesonéfrico. Probablemente se requiera su desprendimiento del epitelio para iniciar la síntesis de Sry. Las células homólogas a las de Sertoli en el sexo femenino son las células foliculares. Las células de Leydig son tempranamente identificadas como células del mesénquima mesonéfrico que exhiben alta expresión de la proteína factor esteroideogénico Sf1. Estas células probablemente sean también precursoras de células esteroidogénicas de la corteza suprarrenal. Las células de Leydig tienen como función secretar andrógenos y estimular la diferenciación en sentido masculino de los gonaductos, seno urogenital y

órganos genitales externos. Las células homólogas en el sexo femenino son las células de la teca interna de los folículos ováricos. Otra población de células somáticas que aparece tempranamente en la gónada XY y que también proviene del mesénquima mesonéfrico es precursora de células mioides peritubulares. Se distribuyen alrededor de los cordones seminíferos y contribuyen a su estabilización. No hay células homólogas en el sexo femenino. También aparecen tempranamente, en ambos sexos, células del mesénquima mesonéfrico vasculogénicas (las más tempranas son endoteliogénicas). Si bien aparecen en ambos, la vasculatura que generan es diferente, su grado de desarrollo es mayor y más temprano en la gonada XY. Las células germinales primordiales tienen el mismo origen en ambos sexos. La diferenciación y el comportamiento proliferativo de estas células como ovogonias o espermatogonias no depende de su genotipo XX o XY sino del genotipo de las células del epitelio celómico. Los primeros signos de diferenciación sexual aparecen en el sexo masculino y consisten en un aumento de tamaño debido al ingreso de células del mesonefros, el incremento en la proliferación de las células del epitelio celómico, la formación de cordones epiteliales y la formación de una red vascular característica.

Bibliografía Bullejos M, Koopman P. (2001). Spatially dynamic expression of Sry in mouse genital ridges. Dev Dyn 221(2):201-5. Hacker A, Capel B, Goodfellow P, Lovell-Badge R. (1995). Expression of Sry, the mouse sex determining gene. Development 121(6):1603-14. Koopman P, Münsterberg A, Capel B, Vivian N, Lovell-Badge R. (1990). Expression of a candidate sex-determining gene during mouse testis differentiation. Nature 348(6300):4502. SC 8.8. La formación de la uretra peneana: procesos complejos, anomalías frecuentes. V. Flores Una malformación frecuente en el varón es el hipospadias. Frecuentemente es un componente de síndromes debidos a alteraciones de la regulación hormonal de la diferenciación sexual, pero también puede ocurrir en ausencia de alteraciones hormonales. En general, cuantas más poblaciones participan de un proceso y cuantos más CCD estén involucrados, más complejo es el proceso y, también en general, cuando más complejo es un proceso de desarrollo, más frecuentemente falla. En las situaciones en las que poblaciones celulares bilaterales ‒ que están ubicadas superficialmente y recubiertas por ectodermo‒ deben fusionarse con las del lado opuesto (como en el caso de los genitales externos en el varón, o el cierre del tubo neural) o estructuras mediales deben fusionarse con otras laterales (como en el caso del labio superior), muy frecuentemente se producen alteraciones que derivan en una falla de la fusión con la formación de de un orificio o de un surco anormal que asienta a lo largo de lo que normalmente debería ser la línea de fusión. La figura SC 8-8-1 A corresponde a un esquema del contorno del seno urogenital y del tubérculo genital en vista lateral y la figura SC 8-8-1 B ilustra, en un corte transversal del tubérculo genital, cómo se organizan las tres poblaciones celulares (ectodermo, mesodermo y endodermo) que lo integran. La lámina uretral endodérmica se constituye como una prolongación epitelial endodérmica medial y maciza que crece a partir del ángulo entre la cara anterior del seno urogenital y la membrana uretral. Esta lámina tiene disposición medial; ventralmente entra en contacto directo con el ectodermo del surco uretral; éste se encuentra bordeado por los

pliegues uretrales. En todo el resto de su contorno, la lámina uretral está separada del ectodermo epidérmico por el mesénquima del tubérculo genital.

Fig. SC 8-8-1. A. Vista lateral derecha del seno urogenital y el tubérculo genital. B. Corte transversal del tubérculo genital según el plano indicado con línea de puntos en A. La formación de la uretra peneana implica la producción, a partir del estado inicial (Fig. SC 8-8-1B), de un conjunto de fenómenos ordenados en tiempo y espacio (Fig. SC 8-8-2 A-F): a) inducción de muerte celular en la zona central de la lámina uretral endodérmica; b) muerte celular del ectodermo superficial; c) unión o continuidad transitoria entre los epitelios endodérmico y ectodérmico y la formación de un surco uretral rodeado por endodermo; d) a continuación, fusión de los bordes derecho e izquierdo del epitelio ectodérmico de los bordes uretrales y e) formación transitoria de un cordón macizo ectodérmico en la zona de fusión; f) inducción de muerte celular y T e-m en el cordón ectodérmico macizo con separación de los epitelios endodérmico y ectodérmico e interposición del mesénquima entre ambos epitelios.

Fig. SC 8-8-2. Secuencia de eventos involucrados en la formación de la uretra peneana. AF. Desarrollo normal. Todos estos procesos permiten que el mesénquima de los lados derecho e izquierdo se fusionen y separen los epitelios endodérmico ‒que delimita la futura uretra‒ y ectodérmico ‒que formará la epidermis de la piel del pene‒. Una vez constituida dicha línea de fusión, o rafe, a lo largo de ella deben estructurarse los procesos histogenéticos involucrados en la diferenciación de las capas de la uretra, las capas de la piel, el cuervo esponjoso, etcétera.

Todos los CCD mencionados en cada una de las poblaciones celulares se encuentran relacionados entre sí temporal y espacialmente por medio de señales. Todos ellos se presentan en una sucesión temporal precisa y progresan en el espacio desde la base al extremo distal del tubérculo genital. Cualquier desfase en el curso temporal de alguno de dichos procesos puede comprometer la secuencia completa y derivar en una falla del cierre de la uretra. Entre estas fallas se hallan los hipospadias, de los cuales existen diversos tipos, que consisten en la existencia de una comunicación entre la luz de la uretra peneana y la superficie ventral del pene. En estas circunstancias, la uretra permanece abierta con un aspecto similar al que se ilustra en la figura SC 8-8-2 c.

Bibliografía Baskin LS. (2000). Hypospadias and urethral development. J Urology 163 (3):951-6. Baskin LS, Ebbers MB. (2006). Hypospadias: anatomy, etiology, and technique. J Pediatr Surg 41(3):463-72. Kalfa N, Philibert P, Sultan C. (2009). Is hypospadias a genetic, endocrine or environmental disease, or still an unexplained malformation? Int J Androl 32(3):187-97

Capítulo 9. Desarrollo del sistema nervioso SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 9.1. El cierre del tubo neural. V. Flores SC 9.2. Poblaciones celulares organizadoras (pcO) y la regionalización y determinación progresiva del tubo neural. V. Flores SC 9.3. La metamerización del SNC. V. Flores SC 9.4. Las placas alares y basales. Su función de desarrollo. Su evolución diferencial en función del espacio (eje céfalo-caudal). V. Flores SC 9.5. Origen y formación de la cresta neural. Determinación y migración temprana. V. Flores

SC 9.6. Regionalización de la cresta neural. V. Flores SC 9.7. La remodelación de circuitos dependiente de la actividad espontánea durante el desarrollo embrionario y el refinamiento de circuitos dependiente de la estimulación ambiental posnatal. V. Flores SC 9.8. La fase proliferativa del desarrollo del SNC. Subfases y tipos de proliferación celular durante la neuronogénesis y gliogénesis. V. Flores SC 9.9. La fase migratoria del desarrollo del SNC I. Tipos de comportamientos migratorios. La translocación del soma. V. Flores SC 9.10. Especificación/determinación y diferenciación de tipos celulares en el sistema nervioso. Las fases de la diferenciación neuronal. V. Flores SC 9.11. Bases celulares y moleculares de la neuritogénesis. El comportamiento del cono de crecimiento axonal. V. Sánchez

SC 9.1. El cierre del tubo neural. V. Flores Luego de su formación (determinación y diferenciación parcial) y modelación, la placa neural, debido a interacciones con tejidos adyacentes con los cuales contacta, se transforma en tubo neural. El proceso global consta de varios fenómenos: a) generación de un surco medial, b) sobreelevación de los bordes de la placa y formación de los pliegues o labios del surco neural, c) acercamiento de los pliegues neurales a la línea media, d) fusión de los pliegues en la línea media, e) segregación de las tres poblaciones celulares que integran los labios del surco neural (ectodermo neural, cresta neural y ectodermo epidérmico), f) fusión de los lados derecho e izquierdo de la placa neural y del ectodermo epidérmico, g) migración de las células de la cresta neural y h) recomposición y estabilización de los epitelios. - Al principio, la placa neural es plana (Fig. SC 9-1-1 A). La formación del tubo neural se inicia con la formación del surco medial en la placa neural. Este fenómeno depende principalmente del comportamiento de células que ocupan la línea media de la placa neural. En la región cefálica de la placa neural –la zona que interactúa con el mesodermo precordal y que dará origen al prosencéfalo–, las células mediales se originan directamente del ectodermo neural. En la región caudal –la que interactúa con la notocorda y que originará al cerebro posterior y la médula– las células mediales provienen del nódulo de Hensen. Éste genera tanto las células de la notocorda como también las de la placa del piso. Las células mediales, independientemente de su origen, sufren cambios de forma promovidos por el mesodermo subyacente, de cilíndricas pasan a ser cónicas o piramidales truncas y, como consecuencia, la placa se pliega generándose un surco medial, el surco neural. El sitio en que se genera el surco neural opera como eje de giro de las mitades derecha e izquierda de la placa neural; debido a ello se denomina “bisagra medial” (Fig. SC 9-1-1 A-B). - Los bordes de la placa neural –la zona de transición entre ésta y el ectodermo epidérmico– se encuentran ocupados por una población celular determinada a formar la cresta neural. Tres conjuntos de fuerzas, actuando simultáneamente, podrían producir la elevación hacia el dorso de los bordes del surco neural (Fig. SC 9-1.1 B): 1) el efecto de la bisagra medial eleva los bordes de la placa neural hacia el dorso, 2) la notocorda y la placa del piso se encuentran fuertemente adheridas y al conjunto se lo denomina “notoplaca” (Fig. SC 9-1-1 B). Ésta, en el momento en que empiezan a sobreelevarse los pliegues neurales, sufre un proceso de rápida elongación. Durante dicho proceso, la notoplaca es la estructura más rígida del embrión. Las regiones no mediales de la placa neural, por el contrario, exhiben un comportamiento elástico. La notoplaca realiza una fuerza de tracción que genera una línea de tensión generalizada a lo largo de la línea media y las regiones laterales de la placa, debido a su comportamiento elástico, descomponen dicha fuerza a lo largo de arcos o curvas orientadas perpendicularmente a la línea de tensión medial. La placa neural adopta la forma de dichos arcos y se pliega. Este efecto puede ser apreciado por una experiencia simple: se sugiere al lector que tense una lámina elástica generando una tracción sobre ella. A lo largo de la línea de tensión se generará un surco (corresponde al surco medial de la placa); lateralmente a éste se formarán dos pliegues (corresponden a los pliegues neurales); 3) debido a la acción de estas dos fuerzas, los bordes de la placa se elevan, dejan de estar en contacto con el mesodermo paraxil y ello permite que la superficie basal de la placa neural realice interacciones de adhesión directa con la superficie basal del ectodermo epidérmico (Fig. SC 9-1-1 C-D). Estas interacciones generan fuerzas de adhesión intersuperficiales que contribuyen a acentuar los pliegues neurales que entonces sobresalen hacia el dorso. Si se cultivan pequeños trozos del borde de la placa neural que contienen la zona de transición y el ectodermo epidérmico, ambos se adosan fuertemente y forman pliegues similares a los pliegues neurales. - El acercamiento de los pliegues neurales hacia la línea media podría ser consecuencia de la operación de tres conjuntos de fuerza: 1) el incremento en la adhesión entre las dos hojas que forman cada pliegue neural hace que aumente la superficie de contacto entre ambas y que los bordes libres de cada pliegue se curven hacia la línea media (Fig. SC 9-1-1 D); 2) en las regiones laterales de la placa, promovidas por el contacto con el ectodermo epidérmico, se generan, a cada lado, cambios de forma celular que producen el mismo efecto descrito en la bisagra medial. Estas dos regiones se denominan “bisagras laterales” (Fig. SC 9-1-1 D); ellas generan fuerzas que curvan el borde libre del pliegue hacia la línea media; 3) los dos efectos descritos sólo son

efectivos porque el surco medial de la placa se mantiene fuertemente unido en profundidad a la notocorda que sigue operando como elemento rígido (Fig. SC 9-1-1 D-G). La interacción con la notocorda hace que la línea media de la placa quede adherida profundamente en la línea media ventral; simultáneamente las fuerzas de adhesión entre las superficies basales de la placa neural y del ectodermo epidérmico y las bisagras laterales hacen que los pliegues se aproximen a la línea media dorsal (Fig. SC 9-1-1 D-E). Por otro lado, estos efectos son posibles debido que el resto del ectodermo epidérmico en este momento se comporta como un material viscoso, se acomoda a las tracciones generadas sobre toda la superficie corporal, se distiende fácilmente y las tracciones desaparecen. - Una vez que los labios del surco neural contactan en la línea media, ellos se adosan fuertemente (Fig. SC 9-1-1 E-F). En la zona de contacto, el epitelio se desestabiliza debido a cambios en las propiedades de adhesión de las tres poblaciones celulares que se localizan en los bordes que contactan (células de la placa neural, de la cresta neural y del ectodermo epidérmico). Mientras las células de la placa neural expresan E-cadherinas, su continuidad con el ectodermo epidérmico se mantiene estabilizada. A medida que los bordes de los pliegues neurales se aproximan hacia la línea media, las células de la placa neural cambian sus propiedades de adhesión. Cesa la síntesis de E-cadherinas e inician la expresión de N-cadherinas y N-CAM. Esto desestabiliza la zona de continuidad de los epitelios y se produce un fenómeno de segregación y reagregación por adhesividad diferencial. De esa forma, las células de los bordes derecho e izquierdo de la placa neural se desprenden del ectodermo epidérmico y se fusionan entre sí (Fig. SC 9-1-1 F-G). - Este proceso de desagregación y reagregación de los epitelios está acompañado de una degradación de la membrana basal. Durante dicho proceso se pierde transitoriamente, en sitios localizados, la separación neta entre epitelio y mesénquima; las células de la cresta neural abandonan entonces el epitelio y se introducen en el compartimento mesenquimático (Fig. SC 9-1-1 F). Una vez que migran las células de la cresta neural se reconstruye, en la línea media dorsal, la continuidad entre los bordes derecho e izquierdo del ectodermo epidérmico (Fig. SC 9-1-1 F-G). De esta forma, el ectodermo epidérmico cubre la superficie dorsal (este ectodermo genera señales que tienen importante influencia en el desarrollo ulterior de la cresta neural y el tubo neural) y se constituye el tubo neural que queda cubierto por el ectodermo. Entre ambos quedan las células de la cresta neural. En la región cefálica las células de la cresta neural abandonan el epitelio antes que se cierre el tubo neural, en la región medular lo hacen recién cuando los labios derecho e izquierdo se fusionan.

Fig. SC 9-1-1. Representación esquemática de los diversos cambios que llevan a la formación del tubo neural a partir de la invaginación de la placa neural. Durante dicho proceso se forman también la cresta neural y los segmentos bilaterales de cresta que llevan a la formación de los ganglios (espinales y craneales) de neuronas sensoriales primarias. - Finalmente, las células de la cresta neural migran lateralmente y se ubican a ambos lados del tubo neural. Mientras tanto, en los somitas del mesodermo paraxil, que quedan ubicados a ambos lados del tubo neural, se constituye el dermatomo. Una parte de las células del dermatomo migran medialmente entre el ectodermo epidérmico y el tubo neural y generan el mesénquima que contribuye a separarlos. Al mismo tiempo se refuerzan la membrana basal y la matriz extracelular subyacente a dichos epitelios. En dicho mesénquima, más tarde se introducen poblaciones de células del esclerotomo; éstas contribuyen a generar las cubiertas cartilaginosas y luego óseas que forman los huesos que delimitan el conducto raquídeo. En la región craneal dichos tejidos provienen del mesénquima cefálico que generan las propias células de la cresta neural. Puede apreciarse que el proceso descrito, aunque morfológicamente simple, resulta de muchos CCD que actúan en forma integrada en el tiempo y en el espacio. Los CCD más directamente implicados son el cambio de forma celular, la adhesividad intercelular diferencial, la proliferación diferencial y otros. Todos estos CCD dependen, a su vez, de procesos biomoleculares sincronizados en tiempo y espacio y que se regulan interactivamente entre las poblaciones celulares participantes. En teoría, las alteraciones en cualquiera de las moléculas involucradas en la ejecución o control de los CCD señalados pueden ocasionar alteraciones de la línea media dorsal denominadas genéricamente disrafias (véase Capítulo 9, Desarrollo del sistema nervioso). BibliografíaBibliografía Detrick RJ, Dickey D, Kintner CR. (1990). The effects of N-cadherin misexpression on morphogenesis in Xenopus embryos. Neuron 4(4):493-506. Jacobson AG, Moury JD. (1995). Tissue boundaries and cell behavior during neurulation. Dev Biol 171(1):98110. Moury JD, Schoenwolf GC. (1995). Cooperative model of epithelial shaping and bending during avian neurulation: autonomous movements of the neural plate, autonomous movements of the epidermis, and interactions in the neural plate/epidermis transition zone. Dev Dyn 204(3):323-37. Smith JL, Schoenwolf GC. (1989). Notochordal induction of cell wedging in the chick neural plate and its role in neural tube formation. J Exp Zool 250(1):49-62.

SC 9.2. Poblaciones celulares organizadoras (pcO) y la regionalización y determinación progresiva del tubo neural. V. Flores El inicio del desarrollo del sistema nervioso central está marcado por el efecto determinante ejercido por un conjunto de señales provenientes del organizador clásicamente denominado primario o nódulo de Hensen. Este efecto consiste en la determinación en sentido neural o “neuralización” y no implica, al parecer, ninguna especificación particular adicional (como por ejemplo regiones o categorías o tipos celulares básicos). Este fenómeno se produce antes de la gastrulación; cuando las células de la futura notocorda aún se encuentran en la hoja dorsal del embrión. Vale decir, es un efecto de señalización por medio de señales que difunden en el plano del epitelio dorsal del embrión o epiblasto. Se ha estimado que en algunas especies alrededor del 50% de las células epiblásticas experimentan neuralización. Las restantes células corresponderían al ectodermo epidérmico. Sin embargo, una parte de las células que ocupan la zona de transición entre los ectodermos neural y epidérmico se determina en sentido de cresta neural. Con respecto a la organización longitudinal o céfalo-caudal del tubo neural, el siguiente paso en la determinación progresiva de regiones corresponde a la especificación de los cerebros anterior, por un lado, y de cerebro posterior y médula espinal, por otro. En el principio de la gastrulación, el mesodermo precordal (prolongación cefálica) migra en sentido cefálico y se ubica por debajo del epiblasto neuralizado. Dicha región

ectodérmica, que ya en el epiblasto pregastrular se encuentra cefálicamente al nódulo de Hensen, originará la región cefálica ensanchada de la placa neural. Ella formará el cerebro anterior o prosencéfalo y deriva en su totalidad del epiblasto neuralizado. La gastrulación continúa con la regresión del surco primitivo y, a medida que el nódulo de Hensen se desplaza en sentido caudal, va dejando una población de células delante de él. Algunas de ellas quedan en la superficie y forman la línea media de la placa neural (futura placa del piso). Las otras se invaginan debajo de las primeras y van formando la notocorda. Esta región de la placa se determina en cerebro posterior y médula por efecto de señales provenientes de la notocorda. Durante la gastrulación esta región de la placa, junto con la notocorda, crecen en sentido caudal. La región caudal de la placa tiene, en consecuencia, dos orígenes: a) la zona medial que contacta con la notocorda, junto con ésta, deriva de células del nódulo de Hensen y b) las zonas laterales de la placa derivan del epiblasto superficial. Las especificaciones que siguen, que agregan más detalles a la organización longitudinal del tubo neural, depende de la aparición de nuevas pCO. Las pcO mejor conocidas son la ANR (Anterior Neural Ridge: engrosamiento neural anterior), la ZLI (Zona Limitans Intratalámica: zona limitante intratalámica) y el IsO (Isthmic Organizer: organizador ístmico). Con el tiempo aparecen nuevas pcO involucradas en la subregionalización de las diferentes regiones. Aparte de estas existen pcO a lo largo de las zonas mediales dorsal y ventral del tubo neural que instalan el patterning dorsoventral del tubo neural. La ANR es una región semilunar engrosada que bordea cefálicamente a la placa neural, en el límite con el ectodermo epidérmico. La ANR genera señales que especifican los segmentos más cefálicos del prosencéfalo (p4-6). La ANR secreta la proteína señal Fgf-8 en respuesta a la cual las células de la zona más cefálica de la región prosencefálica expresan la proteína factor de transcripción Brain Factor 1 (BF1), que participa en al regulación de los CCD en dicha región. Hay indicios de que en la región prosencefálica de la placa neural existen dos zonas con diferente competencia. Las zonas cefálica y caudal de la región prosencefálica ofrecen diferentes respuestas a las proteínas señal Fgf-8 y Shh. En el límite entre ambas zonas se forma la ZLI, que corresponde a la frontera entre los prosómeros 2 y 3 (frontera p2/3). Con respecto a los derivados de estos segmentos prosencefálicos véase SC La metamerización del SNC. Más caudalmente se forma otra pcO, el IsO, en el límite entre el mesencéfalo y el posencéfalo. Esta pcO instala el patterning del mesencéfalo y de los dos primeros segmentos posencefálicos (r1 y r2). El IsO instala dos gradientes decrecientes de morfógeno, uno en sentido cefálico y otro en sentido caudal. Ambos tienen su máximo en el IsO. El mesencefálico tiene su mínimo en el límite con el diencéfalo y organiza los CCD que ejecutan las células del mesencéfalo. El segundo gradiente posee un rango de alcance que llega sólo hasta el 2º segmento posencefálico o r2 y organiza los CCD de las células de dichos segmentos. El patterning de los restantes segmentos del posencéfalo y de los de la médula depende de la expresión de un patrón típico de genes Hox que asignan identidad de segmento.

Fig. SC 9-2-1. El patterning céfalo-caudal del SNC. A. Esquema de vista dorsal de la placa neural. Se representan las poblaciones celulares organizadoras que instalan el patterning de varias regiones del encéfalo y las moléculas señal que operan como morfógenos en este proceso. Se ilustran también las posibles regiones precursoras de diferentes grupos de neurómeros. B. Esquema de vista lateral de la región encefálica del embrión. Se representan las regiones del encéfalo, los centros organizadores, la distribución espacial de señales involucradas en el patterning y la ubicación de los neurómeros. Este esquema se ha construido a partir de datos de distribución de morfógenos en el SNC de embrión de ratón. Con respecto a la organización dorsoventral del tubo neural, también existen poblaciones celulares y señales organizadoras que los especifican y determinan. La organización típica de cada segmento del sistema nervioso comprende una población de neuronas periféricas (neuronas sensitivas o sensoriales primarias o aferentes) y dos poblaciones de neuronas centrales, una de neuronas de asociación y una de neuronas eferentes (motoras). Esta organización también se especifica tempranamente durante el inicio del desarrollo. Mientras se cierra el tubo neural, se genera la población de células de la cresta neural que originarán, entre otros tipos celulares, a las neuronas sensoriales primarias de los ganglios sensitivos de los nervios craneales y raquídeos. Con respecto a las neuronas intrínsecas del tubo neural, ellas adquieren carácter de neuronas de asociación o eferentes dependiendo de la posición que ocupan entre las líneas medias dorsal y ventral del tubo. El ectodermo epidérmico de la zona medial dorsal y la notocorda, en la zona medial ventral del tubo, generan señales difusibles que especifican el carácter asociativo (placa alar) o eferente (placa basal) de las neuronas del tubo neural. Estas proteínas señal (BMP4, BMP7, Dorsalin, Sonic hedgehog y otras) operan paracrinamente. Se distribuyen en forma de gradientes con un máximo en el sitio en el que son secretadas y un mínimo en la zona opuesta. Poseen acciones antagónicas y el efecto final sobre las neuronas depende de la concentración relativa de ambas señales en el sitio en el que cada neurona se encuentre. Así, el destino de cada neurona, como alar (asociativa) o basal (eferente), depende de su posición dentro de un par de gradientes cruzados de señales con efectos opuestos (Fig. SC 9-2-1 A). Estas señales proveen un grado de especificidad aún mayor que el correspondiente a la organización de las neuronas en las placas alares y basales. Ambas placas tienen organización columnar con diferentes subtipos de neuronas. Las diferentes combinaciones de valores de concentraciones relativas de ambas señales, actuando

a través de sus vías de señalización, generarían la expresión de diferentes combinaciones de factores de transcripción. De estas diferentes combinaciones de factores de transcripción dependería también la especificación de cada uno de los subtipos de neuronas de ambas placas (Fig. SC 9-2-2 A-C).

Fig. SC 9-2-2. Representación esquemática del patterning transversal (dorsoventral) de la médula espinal. A. El tubo neural recibe señales de poblaciones celulares vecinas (ectodermo, somitas, notocorda). Un gradiente D  V de señales originadas en el ectodermo y la placa del techo (Wnt, Bmp y otros) determina a las células troncales neurales pluripotentes en sentido alar e instala un proceso de determinación de tipo neuronal

dependiente de la posición en la placa alar. Un gradiente V  D de señales originadas en la notocorda y la placa del piso (Shh) determina a las células troncales neurales pluripotentes en sentido basal e instala un proceso de determinación de tipo neuronal dependiente de la posición en la placa basal. B. La diferente posición de las células troncales neurales pluripontes dentro de los gradientes indicados hace que éstas se hallen sometidas a diferentes concentraciones de morfógenos que promueven la expresión de diferentes combinatorias de factores de transcripción a lo largo del eje dorso-ventral del tubo neural. C. Cada combinatoria de factores de transcripción especifica un tipo neuronal definido, con una posición característica dentro de ambas placas. De este modo se produce un proceso de determinación de tipo neuronal espacialmente organizado. Dp: cTNP dorsales, Vp: cTNP ventrales, pMN: cNT precursora de neurona motora, RA: ácido retinoico. BibliografíaBibliografía Dessaud E, McMahon AP, Briscoe J. (2008). Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development 135(15):2489-2503. Jessell TM. (2000). Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat Rev Genet 1(1):20-9. Le Dréau G, Garcia-Campmany L, Rabadán MA, Ferronha T, Tozer S, Briscoe J, Martí E. (2012). Canonical BMP7 activity is required for the generation of discrete neuronal populations in the dorsal spinal cord. Development 139(2):259-68. Placzek M, Tessier-Lavigne M, Yamada T, Jessell T, Dodd J. (1990). Mesodermal control of neural cell identity: floor plate induction by the notochord. Science. 250(4983):985-8.

SC 9.3. La metamerización del SNC. V. Flores A la regionalización y subregionalización del tubo neural le sigue el proceso de metamerización. Este fenómeno agrega un mayor grado de detalle y especialización en la organización céfalo-caudal del SNC. En el SNC se forma una metámera para cada segmento corporal. Cada metámera es capaz de formar las categorías neuronales básicas que inervan una metámera o segmento corporal. La metamerización consiste en la definición de bloques o poblaciones celulares con organización simétrica bilateral que se reiteran a lo largo del eje céfalo-caudal. Aunque son estructuralmente similares, cada segmento es único y posee identidad. Ésta le es asignada por la expresión de una combinatoria particular de factores de transcripción que operan durante el desarrollo embrionario y que tienen específicamente dicha función. La metamerización acontece en cada una de las regiones y subregiones definidas a lo largo del eje céfalo-caudal. La designación genérica para los segmentos del tubo neural es el de “neurómeros”. La designación genérica correspondiente a cada región es la de prosómero (segmento prosencefálico), mesómero (segmento mesencefálico), rombómero (segmento posencefálico) y medulómero o mielómero (segmento medular). Sin embargo, dado que cada segmento posee identidad (es único), cada uno de ellos posee una denominación propia que está integrada por tres elementos: a) un prefijo que alude a la región a la que pertenece, b) la raíz “mero” (que alude a metámera) y c) un número ordinal que alude a su orden de aparición en la región o, lo que es lo mismo, la ubicación espacial que le corresponde, en su región, a lo largo del eje céfalo-caudal. El modo como se ordenan estos tres elementos en la designación de la metámera depende del idioma que se utilice, pero en cualquier idioma está compuesto por los tres elementos. Así, por ejemplo, el tercer segmento que aparece en el prosencéfalo se denomina “prosómero 3º” o “tercer prosómero”. El concepto de organización segmentaria del sistema nervioso central es clásico. Tal idea permitió aclarar la existencia de correspondencias entre: (a) “sitios de origen de las neuronas motoras” y “grupos musculares que inervan”, y (b)“regiones de inervación sensorial” y “segmentos medulares”. Tales correspondencias anatómicas y funcionales resultan del hecho de que a) durante el desarrollo embrionario, somitas (que forman músculos esqueléticos y dermis), segmentos del SNC y segmentos de células de la cresta neural poseen correspondencia espacial muy precisa y b) ellas se conservan, aunque a veces en forma enmascarada, en el adulto. Clásicamente, la definición de segmentos en el tubo neural en desarrollo tuvo bases estructurales; se basó en que, al igual que los somitas, los rombómeros y los medulómeros son identificables morfológicamente como poblaciones

celulares con simetría bilateral, repetidas a la lo largo del eje céfalo-caudal. Esta definición estructural es aplicable sin dificultad en el cerebro posterior y los segmentos medulares. En las regiones más cefálicas las manifestaciones morfológicas de organización segmentaria son menos claras. Las regiones cefálicas del SNC recibieron clásicamente el nombre de estructuras suprasegmentarias. Una denominación eminentemente fisiológica, relacionada con el concepto de nivel de organización funcional. Alude a que, si bien los segmentos medulares pueden funcionar autónomamente, respondiendo en forma refleja a los estímulos provenientes del propio segmento corporal, en general no funcionan de esa forma sino en forma coordinada e integrada. En efecto, la mayor parte de los actos voluntarios de la vida son respuestas complejas que requieren el procesamiento e integración de información que ingresa en el sistema por múltiples vías. Tal capacidad de procesamiento, integración y elaboración de respuestas complejas no radica en los segmentos medulares sino en las regiones “superiores” del SNC. A dichas regiones se las denominaba suprasegmentarias debido a que, en el esquema de organización funcional del sistema, corresponden a un nivel de organización superior al de segmento. La identidad de cada segmento y, en consecuencia, el modo de desarrollo particular de cada uno de ellos está asociado a la expresión de una combinatoria particular de homeoproteínas factores de transcripción Hox. Diversos estudios de biología molecular sobre la distribución espacial de la expresión de estos factores de transcripción permiten una identificación de los segmentos aun antes de que la metamerización pueda ser apreciada morfológicamente. La información proveniente de estos estudios, integrada a estudios estructurales y de expresión de diversos marcadores, permite la identificación de 6 prosómeros, el cerebro medio (corresponde a un mesómero), 7-8 rombómeros y un número de mielómeros igual al número de segmentos corporales. Los prosómeros 1 a 3 forman parte del diencéfalo; los prosómeros 4 a 6 forman, en la región ventral, la porción anterior del piso del hipotálamo y, en la región lateral, originan el telencéfalo.

Fig. SC 9-3-1. El patterning del SNC. La regionalización y la metamerización del tubo neural. Esquema de vista lateral de las regiones del tubo neural. Se representan las regiones del encéfalo, sus subregiones (proencéfalo, mesencéfalo y posencéfalo), la médula espinal y la ubicación de sus neurómeros. p: prosómero; r: rombómero; m: mielómero. BibliografíaBibliografía Carstens MH. (2004). Neural tube programming and craniofacial cleft formation. I. The neuromeric organization of the head and neck. Eur J Paediatr Neurol 8(4):181-210; discussion 179-180. Echevarría D, Vieira C, Gimeno L, Martínez S. (2003). Neuroepithelial secondary organizers and cell fate specification in the developing brain. Brain Res Brain Res Rev 43(2):179-91. Puelles L, Rubenstein JL. (2003). Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends Neurosci 26(9):469-76.

SC 9.4. Las placas alares y basales. Su función de desarrollo. Su evolución diferencial en función del espacio (eje céfalo-caudal). V. Flores En los mamíferos existen tres categorías principales de neuronas tanto para el sistema nervioso de la vida de relación como para el de la vida vegetativa. En el caso del SN de la vida de relación dichas categorías de neuronas corresponden a a) las neuronas aferentes, b) las de asociación y c) las eferentes. a) Las neuronas aferentes o sensoriales primarias corresponden al SNP y se localizan en su mayor parte en los ganglios de los nervios craneales y raquídeos. Estas neuronas poseen un soma ubicado, en general, en un ganglio, una dendrita que conecta con un receptor periférico y un axón que ingresa en el SNC y que conecta con una neurona eferente y una o más neuronas de asociación (conexión monosináptica entre input y output) o conecta sólo con una o más neuronas de asociación (conexión polisináptica entre input y output). Esta categoría de neuronas deriva en su mayor parte de la cresta neural. Un grupo de estas neuronas se genera a partir de una población celular proliferativa de la línea media dorsal del tubo neural. b) las neuronas de asociación son intrínsecas del SNC y se ubican entre la neurona aferente y la eferente. Sus dendritas y axones se hallan dentro del SNC y forman todos los circuitos tanto de proyección como locales que existen en el SNC. Todos los circuitos neurales intrínsecos del SNC constituyen una gran red de interconexiones entre neuronas de asociación que se encargan de recibir información de las neuronas aferentes, procesar e integrar dicha información y elaborar respuestas que se transmiten a las neuronas eferentes. Esta categoría de neuronas se genera a partir de las células neuroepiteliales placas alares del tubo neural. c) Las neuronas eferentes son neuronas que poseen árbol dendrítico y soma en el SNC y un axón largo que emerge del SNC y, a través de un nervio periférico inerva un efector periférico, en general, muscular. Esta categoría de neuronas se genera a partir de las células neuroepiteliales de las placas basales del tubo neural. El número de neuronas y la complejidad estructural de los circuitos que se hallan a lo largo del eje céfalo-caudal varía en relación con la riqueza de la información que ingresa en el SNC y con la amplitud del campo periférico para inervar en cada región. Así, en el caso de la médula espinal, los engrosamientos cervical y lumbar de donde nacen los plexos braquial y crural son un ejemplo de mayor riqueza de inputs y de campos de inervación periféricos más amplios. Si bien los segmentos medulares tienen cierto grado de independencia funcional, aparte de la organización segmentaria (segmentos distribuidos a lo largo del eje céfalo-caudal), el SNC dispone también de estructuras denominadas clásicamente suprasegmentarias, formadas por neuronas de asociación o alares, que se encargan de organizar un comportamiento integrado de los segmentos (SC 9.2. Poblaciones celulares organizadoras (pcO) y la regionalización y determinación progresiva del tubo neural).

A lo largo de la evolución filogenética de los cordados se produjo una concentración de funciones de recepción de estímulos ambientales y de procesamiento de dicha información en la región cefálica del embrión y del SNC. Dicho proceso implicó cambios significativos en los CCD del SNC, especialmente en la intensidad de la actividad proliferativa de las placas alares y basales. En efecto, el desarrollo de las neuronas de asociación generadas a partir de las placas alares se hizo mucho más intenso en las regiones cefálicas que en las caudales. Este fenómeno posibilitó el desarrollo de grandes poblaciones de neuronas que forman las estructuras de asociación de los hemisferios cerebelosos (a partir del posencéfalo) y los tubérculos cuadrigéminos (a partir del mesencéfalo), y también posibilitó el desarrollo, desde cefalocordados en adelante, de una gran estructura exclusivamente alar o asociativa, el telencéfalo. El desarrollo de la corteza cerebral y de los ganglios de la base contenidos en los hemisferios cerebrales depende exclusivamente del desarrollo de neuronas alares. El componente basal del tubo neural no se extiende en los cordados superiores hasta el extremo cefálico del tubo neural. Se extiende sólo hasta el mesencéfalo. En efecto, las neuronas eferentes (derivadas de placas basales) más cefálicas son las que corresponden al núcleo motor del III par craneal o motor ocular común. Desde dicho nivel, en sentido cefálico, no existen poblaciones neuronales eferentes. Este hecho se explica, desde el punto de vista ontogenético, por el hecho de que la región más cefálica de la placa neural, la que corresponde al prosencéfalo o cerebro anterior, se origina exclusivamente del epiblasto y que no posee en la línea media una placa del piso originada a partir del nódulo de Hensen. El nódulo de Hensen origina la notocorda y la placa del piso de la placa neural caudal al cerebro anterior. Dado que ambas estructuras –notocorda y placa del piso– están implicadas secuencialmente en la especificación de las placas basales, su ausencia en la región prosencefálica se acompaña de ausencia de placas basales y en consecuencia de neuronas eferentes, en la región del tubo neural derivada del prosencéfalo (Fig. SC 9-4-1 A-E).

Fig. SC 9-4-1. Representación esquemática de proporciones relativas de poblaciones neuronales ventrales (basales) y dorsales (alares) en diversas regiones del neuroeje de un embrión humano de la 7ª SD. A. Vista lateral derecha del encéfalo y médula cervical. Las líneas de puntos B a E corresponden a los sitios en los que se realizaron las secciones ilustradas abajo. B-E. Secciones transversales del tubo neural. La línea roja corresponde al nivel del surco limitante que separa las regiones alar y basal en las secciones B a D. En el caso E la línea roja

corresponde al nivel del surco hipotalámico que representa la continuación cefálica del surco limitante del mesencéfalo. B. Médula espinal cervical. C. Prosencéfalo. Dorsalmente a la línea roja se observan los labios rómbicos que originarán a los hemisferios cerebelosos. D. Mesencéfalo. La región alar originará los tubérculos cuadrigéminos. E. Prosencéfalo. La región dorsal originará los hemisferios cerebrales. Nótese que las diferencias en volumen y en número de neuronas entre las regiones alares y basales en la médula y en las estructuras suprasegmentarias se incrementará aún más en etapas más avanzadas del desarrollo BibliografíaBibliografía Jessell TM. (2000). Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat Rev Genet 1(1):20-9. Rubenstein JL, Shimamura K, Martinez S, Puelles L. (1998). Regionalization of the prosencephalic neural plate. Annu Rev Neurosci 21:445-77.

SC 9.5. Origen y formación de la cresta neural. Determinación y migración temprana. V. Flores Las células de la cresta neural se originan en la hoja dorsal del embrión, en la zona de transición entre el ectodermo de la placa neural y el ectodermo epidérmico. Al parecer es necesaria la constitución de estas dos poblaciones celulares para que, interactivamente, generen a las células de la cresta. Si ambas poblaciones son cultivadas separadamente no se forman células de la cresta neural. Por el contrario, si ambas poblaciones están juntas e interactúan, a lo largo de la zona de contacto entre ambas se generan células de la cresta neural. Tanto la placa neural como el ectodermo epidérmico tienen la potencia para formar células de cresta neural. Durante el plegamiento y el crecimiento en longitud de la placa neural a lo largo de todo su borde se forman los pliegues o labios del surco neural. Dado que a lo largo de los pliegues neurales existe una fuerte adhesión entre las dos poblaciones celulares interactuantes, durante dicho proceso se siguen formando células de la cresta neural. Una vez generadas una cantidad abundante de estas células, cambian sus propiedades de adhesión respecto de la placa neural y del ectodermo epidérmico, se desprenden de dichos tejidos y abandonan el compartimento epitelial. En la región encefálica o craneal esta migración ocurre ya durante el cierre del tubo neural; en las regiones posóticas ocurre recién luego del cierre. Ya durante la formación de la placa neural se observa que, a lo largo del borde entre la placa y el ectodermo epidérmico, éste expresa y secreta las proteínas señal BMP4 y BMP7. Algunos consideran que estas proteínas tienen algún papel en la determinación de las células de la cresta neural. Otros le asignan un rol modelador de la forma de la placa neural. También se sabe que estas proteínas desempeñan un papel en el control de la migración temprana de las células de la cresta. Dado que las células de la cresta neural migran a lo largo de distancias considerables y que diversas subpoblaciones de células de la cresta migran a lo largo de diferentes trayectos, son muchas y variadas las señales que controlan la migración de estas células desde su sitio de origen hasta los varios y disímiles sitios de localización definitiva. Se ha propuesto que el inicio de la migración se asocia a la pérdida de la adhesión de estas células respecto de las otras que componen el epitelio. Esta adhesividad está mediada, por un lado, por moléculas de adhesión celular como la proteína de membrana N-cadherina y también por la existencia de zónulas occludens entre ellas. El inicio de la migración se asocia al cese de la síntesis de N-cadherina y al desensamblado de las uniones estrechas. El estado ensamblado de estas uniones depende de factores que las estabilizan y otros que los desestabilizan. La transformación del fenotipo epitelial al de cresta neural requiere la expresión de los factores de transcripción (tipo dedos de zinc) Snail y Slug. Algunos autores asignan a estos factores un papel en la determinación de las células de la cresta neural, aunque otros consideran que poseen un papel más general pues comúnmente se expresarían en todos los procesos que involucran una transformación epitelio-mesenquimática (SC 0.19 Transiciones reversibles mesenquimático-epitelial y epitelio-mesenquimática. CMD involucrados en su regulación). Ambas proteínas actúan como represores de la transcripción de las proteínas de adhesión E-

cadherina que participan en la unión entre células epiteliales y, en consecuencia, desencadenan transiciones epitelio-mesenquimáticas. La proteína Slug participa en el inicio de la migración activando a ciertos factores que desestabilizan a los complejos de unión (desmosomas, uniones estrechas.,etc.). Estas uniones se desensamblan y las células adquieren la posibilidad de migrar. Esto sin embargo no es suficiente para la migración. También interviene la proteína de señalización celular Rho B, que participaría en la reorganización del citoesqueleto necesaria para la migración. Ambas proteínas, la Rho B y la Slug son necesarias para la migración. Ambas proteínas son expresadas por las células de la cresta neural cuando son sometidas a la acción de las proteínas BMP4 y BMP7. Todos estos procesos habilitan a las células de la cresta neural a abandonar el epitelio, a introducirse en el compartimento mesenquimático y disponerse longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal entre el ectodermo epidérmico y el tubo neural. Desde ese momento en adelante, otro conjunto de interacciones con la matriz extracelular del entorno guían a las células de la cresta neural hacia diversos lugares y además posibilitan que las células de la cresta adquieran organización metamérica (SC Factores que controlan la migración de las células de la cresta neural).

Fig. SC 9-5-1. Esquema de los fenómenos de señalización y comportamientos moleculares involucrados en la transición epitelio-mesenquimática durante la formación e inicio de la migración de las células de la cresta neural. BibliografíaBibliografía

Bolós V, Peinado H, Pérez-Moreno MA, Fraga MF, Esteller M, Cano A. (2003). The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci 116(Pt 3):499-511. Hall A. (2012). Rho family GTPases. Biochem Soc Trans 40(6):1378-82. Liu JP, Jessell TM. (1998). A role for rhoB in the delamination of neural crest cells from the dorsal neural tube. Development 125(24):5055-67. Savagner P, Yamada KM, Thiery JP. (1997). The zinc-finger protein slug causes desmosome dissociation, an initial and necessary step for growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition. J Cell Biol 137(6):140319.

SC 9.6. Regionalización de la cresta neural. V. Flores La cresta neural es la población celular que transitoriamente, durante el período somítico, ocupa la región dorsal del embrión entre el tubo neural y el ectodermo epidérmico. No es una población celular homogénea. Por un lado, es la población celular embrionaria precursora del sistema nervioso periférico: genera las neuronas y células gliales de los ganglios y plexos del sistema nervioso de la vida de relación y del sistema nervioso autónomo (vegetativo). Por otro lado, es capaz de originar una variedad de tipos celulares no neurales que también están vinculados a la vida de relación o la vegetativa. La categorización regional más básica que puede realizarse respecto de las células de la cresta neural se refiere a la existencia de una cresta neural craneal (cráneo-facial, preótica o preoccipital) y una cresta neural troncal (posótica o posoccipital). Esta categorización tiene bases estructurales y funcionales y también bases filogenéticas y ontogenéticas. En el adulto existen significativas diferencias estructurales y funcionales entre las neuronas derivadas de las crestas neurales craneal y troncal. La primera genera las neuronas encargadas de la inervación denominada especial. Ésta corresponde a todas las estructuras derivadas de la región branquial (véase Capítulo 9, Desarrollo del sistema nervioso). Este tipo de inervación está ausente en la región troncal del organismo. Desde el punto de vista ontogenético también existen diferencias significativas entre las propiedades de desarrollo de ambas regiones. Se considera que estas diferencias encuentran su explicación en la evolución filogenética. Se propone que, desde la aparición de los procordados en adelante, los estímulos ambientales han constituido una presión selectiva muy importante en la modelación del extremo cefálico de los vertebrados (cordados superiores). Ello ha hecho que se seleccione un conjunto diferente de estrategias de desarrollo para las células que elaboran el fenotipo de esta nueva región corporal que aparece recién en los vertebrados (SC 13.1 La cefalización. La hipótesis de la nueva cabeza. La aparición y evolución de la cresta neural craneal). La cresta neural craneal, también denominada cefálica, preótica o preoccipital, corresponde a los segmentos más cefálicos que se extienden desde el diencéfalo hasta el extremo caudal del posencéfalo. Constituye una adquisición evolutiva relativamente reciente. En rigor en dicha región existe una región estrictamente preótica que origina la cara y parte del cuello, hasta la r5 y una región posótica correspondiente a r6 a r8 (SC El patterning de la cresta neural craneal. Regiones Hox(+) y Hox(-). Su relevancia filogenética y sus funciones de desarrollo).

La cresta neural troncal se extiende desde el extremo caudal del posencéfalo hasta el extremo caudal del tubo neural. Posee varias regiones, localizadas a lo largo de segmentos corporales definidos, que exhiben diferentes propiedades de desarrollo y, de acuerdo con ello, reciben diferentes designaciones. Estas designaciones cambian dependiendo de las subpoblaciones celulares y tipos de derivados que se consideren, por ejemplo, si aluden a células que invaden la somatopleura (vida de relación) o invaden la esplacnopleura (vida vegetativa). Las células de cresta neural vinculadas a la vida de relación se distribuyen a lo largo del todo el tronco y reciben simplemente el nombre de cresta neural troncal. Las células de esta población siguen una de dos vías migratorias preferenciales: a) una en sentido dorsolateral y otra b) en sentido ventral. La primera es seguida por las células precursoras de melanocitos que migran sobre el dermatomo y luego invaden la somatopleura. La segunda es seguida por el resto de las células de la cresta neural, correspondientes a la vida de relación, y lo hacen bordeando la superficie de la mitad cefálica de cada esclerotomo (SC Factores que controlan la migración de las células de la cresta neural). Las células que se detienen en ese lugar originan las neuronas sensoriales primarias y las células gliales de los ganglios espinales y las células de Schwann de los nervios sensitivos y motores que invaden la somatopleura. Este conjunto de segmentos de crestas neurales, dado que sus células se distribuyen a lo largo de todo el tronco, suelen recibir el nombre de crestas neurales troncales. Esta población celular adopta el patrón metamérico impuesto por el mesodermo paraxil y, al igual que los somitas, están distribuidos en las siguientes regiones: cervical, torácica, lumbar y sacra. Con respecto a las subpoblaciones de células de cresta neural que generan el sistema nervioso periférico vegetativo, las crestas neurales troncales poseen una regionalización diferente: existen segmentos de crestas neurales que originan las neuronas del sistema simpático y otros que originan las del sistema parasimpático. Incluidos entre estos últimos se encuentran algunos segmentos de cresta neural que se denominan “cardíacos”. La cresta neural simpática. Se extiende desde los segmentos cervicales hasta los lumbares. Estas células no se detienen a ambos lados del tubo neural. Se desplazan en sentido ventral y forman, por delante del esclerotomo, los ganglios de las cadenas simpáticas laterovertebrales cervicales y toracolumbares. Algunas células que migran más ventralmente llegan al plano de los grandes vasos y forman un conjunto de plexos y ganglios periaórticos. Las que corresponden a los segmentos 14 a 21 (T6 a L1) migran más ventralmente aún y allí forman las células argentafines o cromafines de la médula adrenal. Las crestas neurales parasimpáticas. Tienen una distribución discontinua a lo largo del eje céfalo-caudal. La cresta neural vagal se ubica en los segmentos corporales 1º al 7º. Las células de estos segmentos migran ventralmente e invaden el mesénquima de la esplacnopleura. Forman las neuronas parasimpáticas de los plexos de Meissner y Auerbach a lo largo de todas las regiones del tubo digestivo derivadas del intestino primitivo (desde el esófago hasta el recto). La cresta neural sacra se extiende desde el segmento 28º al extremo caudal. Estos segmentos generan células que migran similarmente a las vagales e invaden las regiones del tubo digestivo caudales al pedículo vitelino. La porción cefálica de la cresta vagal, correspondiente a los segmentos 1º al 3º, reciben también el nombre de cresta neural cardíaca. Ellas generan células que migran ventralmente a ambos lados de la faringe y siguiendo el trayecto de los arcos aórticos (principalmente 3º y 4º) llegan hasta el corazón, se introducen profundamente y forman el tejido conectivo del tabique troncoconal del corazón. También originan células de los tejidos conectivo y muscular de las grandes vasos (arterias aorta y pulmonar) en la zona proximal al corazón. Algunas de estas células, que forman el mesénquima de los arcos branquiales, generan estructuras conectivas, cartilaginosas y óseas de la cara, oído, cuello, etcétera.

Fig. SC 9-6-1. Ilustra esquemáticamente las regiones y subregiones de la cresta neural, sus sitios de origen y de destino. A. Embrión de pollo (Período somítico). B. Embrión humano (Quinta semana de desarrollo). BibliografíaBibliografía Le Douarin NM, Teillet MA. (1973). The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J Embryol Exp Morphol 30(1):31-48. Le Lièvre CS, Le Douarin NM. (1975). Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J Embryol Exp Morphol 34(1):125-54. Kirby ML. (1987). Cardiac morphogenesis--recent research advances. Pediatr Res 21(3):219-24. Kirby ML, Waldo KL. (1990). Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation 82(2):332-40. Pomeranz HD, Rothman TP, Gershon MD. (1991). Colonization of the post-umbilical bowel by cells derived from the sacral neural crest: direct tracing of cell migration using an intercalating probe and a replicationdeficient retrovirus. Development 111(3):647-55.

SC 9.7. La remodelación de circuitos dependiente de la actividad espontánea durante el desarrollo embrionario y el refinamiento de circuitos dependiente de la estimulación ambiental posnatal. V. Flores En general, cuando los axones aferentes a una región acceden a las cercanías de sus blancos potenciales, o incluso antes, emiten ramificaciones delgadas por medio de las cuales pueden establecer contactos lábiles transitorios con las neuronas del entorno que encuentran a su paso. Se considera que estas prolongaciones

delgadas son ramas exploradoras cuya función es la búsqueda de blancos potenciales con las que, eventualmente, generar contactos estables. Podrá advertirse que si todos los axones se comportan de esa forma, en cualquier región considerada, habrá un exceso de ramificaciones con respecto al número de axones. Correspondientemente, cada neurona blanco recibirá un exceso de ramas y de contactos transitorios. Esta fase transitoria de “sobreinervación” o de “redundancia de contactos” lábiles es seguida luego de una fase de “eliminación de la redundancia”. En general se considera que la eliminación de algunos contactos transitorios y el mantenimiento de otros es consecuencia de fenómenos de competición entre axones respecto de sus neuronas blanco. La fase de eliminación de contactos redundantes, depende esencialmente del inicio del funcionamiento del sistema y se funda en el hecho de que los axones, por un lado, compiten entre sí por sus neuronas blanco y, por otro, cooperan entre sí y se refuerzan mutuamente. La eliminación o, por el contrario, la estabilización y el mantenimiento de una sinapsis lábil es el resultado neto de varios tipos de interacciones que se ponen en marcha una vez que se inicia el funcionamiento del sistema. En consecuencia, dependiendo del grado de maduración y diferenciación de un circuito y de la fase en la que éste se encuentra es posible distinguir al menos dos etapas diferentes de distinto significado biológico. La primera fase se denomina habitualmente “remodelación de circuitos dependiente de la actividad espontánea” y se produce durante el desarrollo embrionario cuando en el sistema empiezan a funcionar espontáneamente las neuronas y producen fenómenos de estimulación de las neuronas a las que inervan. La segunda fase se denomina “refinamiento de circuitos dependiente de la estimulación ambiental” y es el resultado de la activación de neuronas como consecuencia del ingreso de información proveniente de la estimulación ambiental posnatal. Remodelación de circuitos dependiente de la actividad espontánea de las neuronas en desarrollo. La mayor parte de las neuronas inician y “ensayan” una actividad espontánea cuando llegan a un cierto grado de diferenciación durante el desarrollo prenatal. El inicio de la actividad espontánea y de la transmisión sináptica posibilita que nuevos factores entren en juego con respecto a la evolución y el mantenimiento de contactos previamente establecidos. En este sentido es importante la “afinidad” funcional entre neurona inervante e inervada, ya que no todas las sinapsis que llegan a una zona y contactan con una neurona funcionan en forma similar. El funcionamiento de las sinapsis, y su efecto sobre las neuronas a las que inervan, depende estrechamente del patrón de descargas (frecuencia de pulsos, frecuencia de trenes de descarga y duración de trenes) y de la respuesta de la neurona postsináptica a tal actividad. Esto es así debido a que el resultado de la actividad sináptica no es sólo la transmisión neural; la sinapsis es también lugar de inicio de muchas vías de señalización intracelular que repercuten globalmente en el funcionamiento de la neurona postsináptica. Por dicho motivo, el tipo de estimulación que una neurona recibe a través de una sinapsis puede facilitar o aumentar su funcionamiento y derivar en su reforzamiento y estabilización o, por el contrario, producir efectos opuestos que pueden desestabilizarla hasta el punto de que no es mantenida. En este caso el contacto se pierde, la sinapsis desaparece y ello puede ser seguido de la retracción de la fibra presináptica. Un factor importante que hace al mantenimiento cooperativo entre sinapsis es la coincidencia temporoespacial. Ello significa que, si un par de sinapsis que poseen similar patrón de descargas se hallan en la misma zona (o en la misma neurona postsináptica) y además descargan simultáneamente, entonces ambas reciben el efecto beneficioso de las señales provenientes de la postsinapsis y tienden a estabilizarse. Las sinapsis cuyos funcionamientos no coinciden temporalmente carecen de este efecto cooperativo; el resultado es la competición y su consecuencia, el mantenimiento de una y la eliminación de otra.

Por los motivos expuestos, ocurre que, una vez remodelado el mapa crudo, las neuronas que poseen similar patrón de descarga en general terminan juntas; recíprocamente, las sinapsis con patrones de descarga diferentes en general se hallan separadas. Cuanto más similares más cerca, y cuando más diferentes, más lejos. Sobre la base de estos principios se produce la remodelación de los mapas de proyección crudos. Como puede apreciarse, se trata de un ordenamiento al cual se arriba como consecuencia de un proceso de autoensamblado o autoorganización regido exclusivamente por interacciones locales. No existen factores organizantes externos a los propios elementos interactuantes. Ésta es una característica típica de los sistemas de comportamientos complejos autoorganizables. Refinamiento de circuitos dependiente de la actividad neuronal resultante de la estimulación ambiental. En el momento del nacimiento, las neuronas del SNC y los receptores periféricos no están terminalmente diferenciados. La diferenciación terminal y su estabilización incluyen modificaciones promovidas por la estimulación ambiental posnatal. Los patrones de estimulación de los receptores periféricos luego del nacimiento son bastante más complejos que los prenatales ya que los estímulos del mundo externo son bastante más ricos, complejos y cambiantes que los que se podrían recibir durante el desarrollo embrionario. Ello se debe a que, para cualquier tipo de estimulación que se considere (visual, auditiva, táctil, etc.), la estimulación ambiental es permanentemente cambiante, en función del tiempo. Por otro lado, para un instante dado, las propiedades de la estimulación ambiental cambian en función de la posición dentro del campo receptivo. Así, se suele decir que la estimulación ambiental, para cualquiera de sus modalidades (visión, audición, equilibrio, etc.) posee “patrón”, vale decir, posee organización temporal y espacial. Tal organización y complejidad requieren capacidades de recepción, conducción y procesamiento de la información bastante más complejas y eficaces que los que permiten la organización estructural y el régimen de funcionamiento del sistema antes del nacimiento. Debido a todos los hechos mencionados, un apropiado funcionamiento del sistema luego del nacimiento requiere una nueva adaptación de éste a las condiciones y las características de los estímulos del mundo que permitan su recepción, conducción, transmisión, procesamiento e integración. Así, el sistema adapta su organización tanto funcional como estructural a las características y complejidad de la información para procesar durante la vida posnatal. Debe notarse que existe una correlación estrecha entre el grado de desarrollo de los sistemas nerviosos de diferentes especies, la complejidad de su relación con el medio y la complejidad de sus relaciones sociales. Cuanto mayor es la organización y complejidad social y cuanto mayor es la complejidad de los medios de comunicación que utilizan, mayor es la complejidad del SNC y mayor es la extensión del período de desarrollo posnatal del sistema. Los cambios conductuales observables, en la mayor parte de las especies, desde el nacimiento a la adultez tienen como correlato cambios en la organización de los circuitos involucrados en la ejecución de dichas conductas. La mayor parte de los cambios posnatales de dichos circuitos son promovidos por las características de la estimulación ambiental y, por ello, denominados “refinamiento de circuitos dependiente de la estimulación ambiental”. Se trata de una “sintonía fina” que ajusta las características y “detalles” funcionales de los circuitos a las características de la estimulación ambiental que debe procesar. BibliografíaBibliografía Zhang ZW. (2006). Canadian Association of Neurosciences review: postnatal development of the mammalian neocortex: role of activity revisited. Can J Neurol Sci 33(2):158-69. Hensch TK. (2004). Critical period regulation. Annu Rev Neurosci 27:549-79. Maffei A, Turrigiano G. (2008). The age of plasticity: developmental regulation of synaptic plasticity in neocortical microcircuits. Prog Brain Res 169:211-223. Uesaka N, Ruthazer ES, Yamamoto N. (2006). The role of neural activity in cortical axon branching. Neuroscientist 12(2):102-6.

Ruthazer ES. (2005). You're perfect, now change--redefining the role of developmental plasticity. Neuron 45(6):825-8.

SC 9.8. La fase proliferativa del desarrollo del SNC. Subfases y tipos de proliferación celular durante la neuronogénesis y gliogénesis. V. Flores Completadas las etapas iniciales de a) inducción neural, b) patterning de la placa neural, c) cierre del tubo neural, se inicia la fase proliferativa del neuroepitelio. Se trata de un período de intensa actividad proliferativa que consta de varias fases caracterizadas por diferentes tipos de proliferación. En una primera fase, la población de células troncales neurales pluripotentes (cTNp) se amplifica, el neuroepitelio se expande planarmente y el tubo neural aumenta su tamaño tanto en longitud como en su sección transversal. En fases subsiguientes se ponen en marcha diferentes tipos de proliferación por medio de las cuales se generan neurona y células gliales. Este período del desarrollo también se caracteriza por el hecho de que, dentro del marco provisto por el patterning inicial de la placa neural, se constituyen nuevas pcO que proveen de nuevos marcos de referencia temporoespacial a las poblaciones celulares que van surgiendo durante la fase proliferativa (Véase SC El patterning del sistema nervioso central II. La aparición de centros señalizadores o poblaciones celulares organizadoras (pcO) secundarias y la regionalización del encéfalo y la médula). La actividad proliferativa se cumple con peculiaridades temporales y espaciales que generan diferencias estructurales y funcionales entre regiones o áreas específicas del SNC. En términos generales, la fase proliferativa posee subfases y en cada una de ellas predomina un tipo particular de división celular. a) Durante la subfase más temprana, las células neuroepiteliales o células troncales neurales pluripotenciales (cTNp) realizan un tipo de mitosis denominada división simétrica inicial. En este caso, la cTNp al dividirse origina dos cTNp. Este tipo de proliferación tiene como función expandir la población de cTNp y aumentar en el plano tangencial la extensión del neuroepitelio (Fig. SC 9-8-1 A). Esta modalidad de mitosis, en general, corresponde a la que realizan las células neuroepiteliales presentes durante la etapa temprana del desarrollo y durante la subfase neuronogénica directa. Cuando se inicia la neurogénesis, en general, las células neuroepiteliales evolucionan hacia otro tipo celular, denominada glía radial, que también se comporta como cTN pero en general con una potencia más restringida. b) La siguiente fase se denomina de división asimétrica neuronogénica directa. En este caso, la cTNp origina una cTNp y una célula de estirpe neuronal. Ésta abandona el ciclo proliferativo y debido a ello se denomina posmitótica Fig. SC 9-8-1 B). La célula resultante de este tipo de división se denomina neurona joven posmitótica-premigratoria. Esta modalidad de proliferación mantiene constante el número de cTN y genera una neurona en cada ciclo de división de la cTN. Una cTN origina tantas neuronas como ciclos realiza. El orden temporal de aparición de nuevas neuronas, con la migración ulterior, se transforma en un orden espacial a lo largo del eje radial de la pared del tubo neural (Fig. SC 9-8-1 B). Como, en este caso, la neurona se origina directamente de la división de una cNTp, el proceso se denomina neuronogénesis directa. Este tipo de divisiones corresponde a las más tempranas de la fase neuronogénica y en general se forman macroneuronas que constituyen las eferencias de la región. c) Más tarde se producen mitosis denominadas división asimétrica neuronogénica indirecta. Se trata de un proceso más complejo en el que la cTNp origina una célula similar y una célula de estirpe neuronal con capacidad proliferativa. Esta célula se denomina progenitor intermedio amplificador neuronogénico (o neuroprogenitor intermedio amplificador). En general, los progenitores intermedios amplificadores son premigratorios y se acumulan formando una zona adicional en el neuroepitelio denominada zona subventricular. La función del neuroprogenitor intermedio es amplificar algunos tipos neuronales en particular.

A partir de un neuroprogenitor amplificador se generan varias células del mismo tipo. La amplificación producida depende de cuántos ciclos proliferativos cumple el progenitor intermedio antes de diferenciarse en una neurona posmitótica premigratoria. Este modo de proliferación en general da origen a neuronas de circuitos locales de áreas superiores del SNC.

Fig. SC 9-8-1. Modalidades de proliferación celular propuestas para explicar la corticogénesis en mamíferos (Modelo experimental: ratón). A. División simétrica inicial o expansiva. Aumenta el número de cTNp y se expande el neuroepitelio. B. División asimétrica neuronogénica directa. Mantiene constante el número de cTNp y genera una neurona en cada ciclo de división de la cTNp. La numeración indica el orden temporal de generación de nuevas neuronas. C-D. División asimétrica neuronogénica indirecta. La cTNp origina, en cada ciclo, un progenitor intermedio amplificador cuya función es aumentar la población de un tipo neuronal en particular. (C con un ciclo; D con dos ciclos). La numeración indica el orden temporal de generación de nuevas neuronas. Flechas horizontales: expansión planar del neuroepitelio; flechas verticales: expansión del eje radial. Modificado de Kriegstein y cols., Nature Review Neuroscience 2006. Este modelo propone que, en ambos casos de neuronogénesis (directa e indirecta), las células que poseen fechas de nacimiento similares realizan similares procesos de migración y, en consecuencia, terminan integrando la misma capa de la corteza. El modelo también propone que las neuronas que sucesivamente (en función del tiempo) son generadas en la misma zona de la membrana limitante interna, dado el orden que impone la glía radial a la migración radial gliofílica, terminan ocupando distintas posiciones a lo largo de una columna cortical. --En general, las células gliales aparecen más tarde que las neuronales y se forman por división asimétrica gliogénica. En este caso también, en algunas especies, se han descrito progenitores intermedios amplificadores gliogénicos. --El final de cada uno de estos tipos de proliferación se caracteriza por divisiones simétricas terminales. Tanto células NE como progenitores intermedios (neuronogénicos y gliogénicos) originan al final dos células posmitóticas similares. En el caso de la célula NE se originan dos células ependimarias. Es de destacar que en algunas regiones definidas de los hemisferios cerebrales algunas cTNp se mantienen durante la vida y pueden producir procesos de neuronogénesis y gliogénesis posnatal. Sirven al efecto de facilitar el recambio de algunas neuronas que entran en apoptosis y facilitan los procesos de remodelación de circuitos vinculados a procesos de aprendizaje que ocurren en etapas posnatales. BibliografíaBibliografía Takahashi T, Nowakowski RS, Caviness VS Jr. (1996). The leaving or Q fraction of the murine cerebral proliferative epithelium: a general model of neocortical neuronogenesis. J. Neurosci 16:6183-96. Kriegstein A, S Noctor S, Martínez-Cerdeño V. (2006). Patterns of neural stem and progenitor cell division may underlie evolutionary cortical expansion. Nature Rev Neurosci 7:883-90. Pontious A, Kowalczyk T, Englund C, Hevner RF. (2008). Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Dev Neurosci 30:24-32.

SC 9.9. La fase migratoria del desarrollo del SNC I. Tipos de comportamientos migratorios. La translocación del soma. V. Flores Clásicamente se consideraba que la fase de migración del SNC en desarrollo se caracterizaba sólo, o principalmente, por un desplazamiento radial de las neuronas posmitóticas. En la actualidad se sabe que el comportamiento migratorio es bastante más versátil, que existen varios diferentes tipos de desplazamientos y que ello depende de las regiones que se consideren y/o de los tipos neuronales que se analicen. Para cada región del SNC, luego del pico de la fase proliferativa, se inicia la fase migratoria de las neuronas posmitóticas. Toda la superficie interna del tubo neural, la zona de generación (ZG) puede ser considerada un gran centro proliferativo. La zona ventricular (ZV), donde se producen las mitosis de las células neuroepiteliales, y la zona subventricular (ZsV), donde proliferan los progenitores intermedios, constituyen la ZG del neuroepitelio. En la ZG nacen todas las neuronas y células gliales del SNC, permancen allí durante un

tiempo como células premigratorias y luego se desplazan a ocupar lugares definidos del plano tangencial del neuroepitelio y posiciones definidas a lo largo de su eje radial. Estos lugares y posiciones dependen del lugar y fecha de nacimiento de cada cohorte de neuronas y células gliales. Se describen dos tipos genéricos de migración neuronal posmitótica: a) la migración radial, coincidente con la orientación de las células neuroepiteliales (NE), o célula glía radial (GR) según el momento, extendidas entre ambas limitantes y b) la migración tangencial, paralela a las membranas limitantes y al eje medio-lateral del neuroepitelio. La migración radial comprende dos tipos de desplazamientos: 1) La translocación del soma es un tipo de migración que ocurre, en general, durante la fase temprana del desarrollo, cuando la pared del tubo neural está formada por células NE, aún no es muy gruesa y las neuronas posmitóticas no deben realizar un largo desplazamiento radial. En el caso de la corticogénesis, la translocación del soma es el principal modo de migración durante la fase temprana en la que se constituye el patterning inicial o protomapa. En general, este modo de migración realizan las neuronas que nacen durante la fase inicial de proliferación neuronogénica directa que se diferencian en macroneuronas eferentes de cada región (SC 9.8. La fase proliferativa del desarrollo del SNC. Subfases y tipos de proliferación celular durante la neuronogénesis y gliogénesis). Este tipo de desplazamiento es, en general, realizado por neuronas posmitóticas que luego de la división de una célula NE heredan una prolongación basal que se halla unida a la limitante externa. También puede ocurrir en neuronas que luego de su nacimiento emiten una prolongación que crece radialmente, llega a la membrana limitante externa, se ancla en ella y luego genera una translocación del soma. La translocación consiste en un desplazamiento del pericarion de la neurona dentro de la prolongación basal de la neurona. Al mismo tiempo la prolongación se retrae ( Fig. SC 9-9-1). En este tipo de desplazamiento radial, el extremo de la prolongación líder, o basal, posee una posición fija en la membrana limitante externa, se acorta durante el proceso, y el soma que se desplaza no presenta una prolongación trailer.

Fig. SC 9-9-1. Representación esquemática de la migración radial por translocación del soma. Los esquemas reproducen imágenes sucesivas de microfotografías tomadas a intervalos de un minuto. La experiencia consiste en teñir una célula con un colorante (Oregon Green BAPTA-1 488 AM) para su identificación y seguimiento en función del tiempo. Barra: 10 μm.

BibliografíaBibliografía Nadarajah B, Parnavelas JG. (2002). Modes of neuronal migration in the developing cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience 3:423-32. Kriegstein AR, Noctor SC. (2004). Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends in Neurosciences 27:392-9. doi:10.1016/j.tins.2004.05.001. McDermott KW, Barry DS, McMahon SS. (2005). Role of radial glia in cytogenesis, patterning and boundary formation in the developing spinal cord. J Anat 207:241-50.

SC 9.10. Especificación/determinación y diferenciación de tipos celulares en el sistema nervioso. Las fases de la diferenciación neuronal. V. Flores Como en otros sistemas, la diferenciación celular es precedida por procesos de patterning (regionalización, subregionalización, adquisición de identidad de lugar, etc.), y luego de especificación y determinación de tipos celulares locales correspondientes a cada región (núcleo, área cortical, etc.) del sistema. Si bien en el sistema nervioso en desarrollo es posible hacer un árbol de derivación de tipos celulares en forma genérica, tal como ilustra el árbol de derivación de linajes de la figura SC 9-10-1, el cuadro resultante oculta, en gran medida, la complejidad global del proceso debido a que la categoría celular “neurona” es casi tan, o quizá más, amplia que todos los otros tipos celulares del organismo.

Fig. SC 9-10-1. Representación esquemática del árbol de derivación de linajes celulares durante el desarrollo del SNC. El punto de partida es la célula neuroepitelial que integra el neuroepitelio. A partir de ella se forman diversos tipos de células troncales neurales y gliales. Luego aparecen los progenitores intermedios neuronogénicos y gliogénicos. (Basado en Cameron R, Rakic P. Glial cell lineage in the cerebral cortex: a review and synthesis. Glia 1991; 4:124-7.) La complejidad del proceso de generación de linajes neuronales se simplifica a través de varios pasos. Éstos se hallan asociados a los sucesivos fenómenos de patterning, en los que se van generando diferentes categorías de neuronas. Por un lado, de lo general a lo particular, se van especificando y adquiriendo identidad de lugar o posición los conjuntos de neuronas que corresponderán a cada una de las regiones o posiciones del eje céfalocaudal (de prosencéfalo a médula) y, por otro, para cada región en particular, se van definiendo las categorías básicas correspondientes a macroneuronas o neuronas de proyección (que constituirán la eferencia principal de la región) y microneuronas (interneuronas o neuronas de asociación) que originarán a las neuronas de circuito local. Recuérdese que una tercera categoría de neuronas, las neuronas sensitivas o sensoriales primarias, vale decir, las que toman contacto directo con los receptores sensoriales, pertenecen al sistema nervioso periférico y se segregan tempranamente de la placa neural y del ectodermo epidérmico durante la formación de la cresta neural.

Estos fenómenos de especificación/determinación ocurren tempranamente, durante la fase proliferativa del neuroepitelio, previamente al nacimiento de las neuronas posmitóticas. Ello implica que la mayoría de los fenómenos de señalización celular que regulan los procesos de especificación/determinación operan sobre poblaciones de células troncales neurales pluriponteciales (cTNp) o sobre sus derivadas, células neuroprogenitoras o glioprogenitoras con potencia más restringida. Estos neuroprogenitores o glioprogenitores van experimentando sucesivos procesos de restricción de potencia en función del tiempo/estado de desarrollo. Tanto en las fases de especificación/determinación como en la de diferenciación, operan combinaciones típicas de señales, de vías de señalización y de factores de transcripción para cada una de las decisiones vinculadas a la elección de diferentes vías de desarrollo, vale decir, a) vía neuronal vs. glial, b) macroneurona vs. microneurona, c) oligodendrocito vs. astrocito, etcétera. El proceso descrito implica que al momento de su nacimiento (última mitosis o de conversión posmitótica), la neurona ya tiene parte de sus comportamientos ulteriores programados. Estos comportamientos se refieren a características migratorias, sitios de residencia y etapas iniciales de diferenciación. Estos procesos poseen una gran variabilidad que depende de las categorías de neuronas que se consideren y también del tipo particular de neurona. En general, las neuronas sufren muchos cambios morfológicos tempranos, luego de su nacimiento, y no todos ellos son específicamente cambios de diferenciación. Muchos de ellos corresponden al comportamiento migratorio y a interacciones celulares transitorias que las neuronas realizan durante su migración posmitótica. Estas modificaciones morfológicas transitorias, por llamativas que sean, no deben ser consideradas parte de la diferenciación neuronal. Muchos tipos neuronales, sobre todo las macroneuronas, inician la fase de diferenciación celular recién cuando llegan a sus sitios de residencia definitivos o zona posmigratoria. Allí, se desprenden de la célula GR sobre la cual migran. Se convierten, entonces, en neuronas posmigratorias, inician su diferenciación morfológica y emiten sus prolongaciones. La diferenciación neuronal posee varias fases cuya complejidad y duración difiere sustancialmente dependiendo de la categoría neuronal (macroneurona o microneurona) y del tipo celular en particular. Para el caso de las macroneuronas de proyección, en general, existe una fase de diferenciación temprana del soma que incluye los cambios que ya están, hasta cierto punto, programados en el momento en que la neurona abandona la zona de generación o la zona premigratoria. Esta fase transcurre antes de que la neurona se integre a un circuito. Vale decir, antes de que establezca interacciones con las células con las que normalmente debería formar circuitos estables. Luego ocurre una segunda fase denominada de modelación de la forma final de la neurona o de establecimento de circuitos. Esta fase incluye los cambios producidos en la neurona como consecuencia de las interacciones, con otras neuronas y células gliales, que le permiten integrarse en circuitos de proyección o circuitos locales, dependiendo de su determinación previa. La fase de establecimiento de circuitos, a su vez pose cuatro subfases: a) una fase de neuritogénesis (formación de fibras), b) una fase de sinaptogénesis lábil o no estabilizada y c) una fase de poda de ramificaciones y eliminación de sinapsis redundantes y d) estabilización de sinapsis “definitivas”. Si bien todos estos fenómenos forman parte de la diferenciación de las neuronas, por su complejidad y extensión son, en general, tratados como otras etapas (neuritogénesis, sinaptogénesis, remodelación y refinamiento de circuitos) de la neurogénesis. Debido a este hecho, el ítem diferenciación neuronal frecuentemente alude, en forma restringida, a los cambios que ocurren en el soma neuronal y en las ramas proximales del árbol de ramificaciones. Estos cambios podrían resumirse en forma genérica de la siguiente manera (Fig. SC 9-10-2):

Fig. SC 9-10-2. Representación esquemática simplificada de algunos de los cambios involucrados en la diferenciación del soma neuronal y de los segmentos proximales de axones y dendritas. La polarización del soma, la diferenciación del citoesqueleto y la elaboración de los sistemas de transporte que llevan organoides y sustancias informativas y estructurales a lo largo de las neuritas en diferenciación son elementos fundamentales de la diferenciación neuronal a) Polarización del soma. En general, al finalizar la última mitosis y al finalizar sus desplazamientos la neurona joven posee forma aproximadamente esférica. El primer fenómeno consiste en la ruptura de la simetría esférica. De esta forma, la neurona adquiere la organización polar esencial para su futura función de conducción de información en un único sentido. El fenómeno consiste en la definición de una zona de la superficie neuronal que originará los elementos en los que la información fluirán en forma centrípeta o aferente (árbol dendrítico) y una que tendrá un flujo de información centrífugo o eferente (cono axónico y axón). La instalación de esta polaridad depende de cambios en la organización de componentes moleculares de la superficie neuronal. Este fenómeno es el resultado de la localización de componentes moleculares en una zona frontera definida del citoesqueleto y la membrana plasmática. Estos componentes son similares a aquellos que en las células epiteliales definen la frontera entre los dominios apical y laterobasal de la membrana plasmática.

b) Diferenciación molecular y reorganización espacial del citoesqueleto. Otro cambio se observa en la expresión de proteínas que son componentes esenciales del citoesqueleto neuronal. Hay varios tipos de proteínas que forman filamentos intermedios y microtúbulos que son específicos de las neuronas. Estos cambios en la expresión de proteínas específicas de tipo celular son, precisamente, los que producen los cambios estructurales y organizativos del citoesqueleto. Dado que la formación de prolongaciones dendríticas y axones depende de la organización del citoesqueleto, los tipos neuronales con diferentes patrones de crecimiento de prolongaciones exhiben también diferente organización del citoesqueleto. c) Desarrollo y organización espacial del sistema de endomembranas y organoides. Dos características de las macroneuronas son el gran volumen de citoplasma alojado en sus prolongaciones y la gran extensión de éstas. Debido a ello en el soma ocurre un gran desarrollo del sistema de endomembrana y de otros organoides ya que deben producir una gran cantidad de materiales que luego son exportados a las fibras nerviosas y sus terminales. Es típica la abundancia de retículo endoplasmático rugoso (sustancia de Nissl) y gran cantidad de aparatos de Golgi y otros elementos. d) El punto anterior explica el gran crecimiento que experimentan las macroneuronas durante su diferenciación. El crecimiento se acompaña, en general, de un primer modelado del soma. Ambos fenómenos, crecimiento y modelado, se deben, por un lado, a la gran cantidad de organoides, y sus productos, que se acumulan en el pericarion antes de ser direccionados a las fibras nerviosas y, por otro, al inicio de la emisión de la primera generación de prolongaciones. e) Durante de desarrollo de la primera generación de dendritas y del axón, estas prolongaciones, en general, tienen dimensiones y posiciones tan típicas que confieren al soma características morfológicas que contribuyen a designarlas con nombres particulares (fusiformes, bipolares, monopolares, multipolares, piramidales, mitrales, etc.). El tamaño y la forma de los distintos tipos de neuronas exhiben una gran variedad que, naturalmente, depende de sus distintas funciones y modos de integrase en redes locales o de proyección. f) Otra característica principal de la diferenciación es el ensamblado de sistemas de transporte intracitoplasmáticos que facilitan el rápido traslado de elementos del soma a las prolongaciones y viceversa. Estos sistemas de transporte dependen de la organización de: los microtúbulos, los filamentos intermedios y distintos tipos de miosina y otras moléculas motor. Los sistemas moleculares de transporte de sustancias y elementos formes (organoides) exhiben una gran especialización. Algunos de ellos sirven al efecto del transporte anterógrado (centrífugo) y otros retrógrados (centrípetos). Algunos sirven al efecto de direccionar elementos a las dendritas o a los axones, etc. Por otro lado, exhiben diferentes velocidades (rápidos, lentos e intermedios). Es importante notar que, sin estos sistemas de transporte, las neuronas no podrían mantener las funciones metabólicas vitales ni la estructura de sus prolongaciones. g) Como parte de la diferenciación terminal de la neurona queda su integración funcional a un circuito neural. Este fenómeno está caracterizado por cambios morfológicos y ultraestructurales vinculados a la sinaptogénesis e importantes cambios en la expresión génica vinculados, a su vez, a la elección de un sistema de neurotransmisión en particular y eventualmente la síntesis y secreción de sustancias neuromoduladoras. Entre los fenómenos de integración funcional se incluyen también la expresión de todos los componentes moleculares involucrados en la elaboración de medios de comunicación con las células gliales. Recuérdese que las neuronas desarrollan sus funciones en forma interdependiente con las células gliales. h) Otros cambios morfológicos específicos de tipo neuronal. Aparte de los hechos genéricos que hemos citado, muchas neuronas poseen características específicas que las distinguen y que por lo común también permiten designarlas con nombres típicos. Las macroneuronas en general poseen forma bastante definida o constante. Debido a ello son fácilmente identificables por su forma, tamaño, posición, conexiones, etc. y poseen nombres propios. Las microneuronas son más difíciles de identificar con la precisión con que lo son las macroneuronas debido a su número, polimorfismo y plasticidad. Sin embargo, aun así, es razonable suponer que cada una de ellas corresponde a un tipo neuronal definido (SC La definición de neurona y de tipo neuronal).

Lecturas adicionales Cameron R, Rakic P. (1991). Glial cell lineage in the cerebral cortex: a review and synthesis. Glia 4:124-7. Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, et al. (editors). (2001). The Initial Differentiation of Neurons and Glia. In: Neuroscience 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates. Politis PK1, Thomaidou D, Matsas R. (2008). Coordination of cell cycle exit and differentiation of neuronal progenitors. Cell Cycle 7(6):691-7. The Initial Differentiation of Neurons and Glia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK11144/

SC 9.11. Bases celulares y moleculares de la neuritogénesis. El comportamiento del cono de crecimiento axonal. V. Sánchez Durante el desarrollo del sistema nervioso, cada neurona extiende su axón para encontrar su célula blanco en medio de un entorno complejo y cambiante. En la punta de cada axón se encuentra el cono de crecimiento que, con un comportamiento dinámico y la capacidad de responder a múltiples fuentes de información espacial, permite que el axón encuentre su objetivo con un gran nivel de precisión. El crecimiento del cono axonal sólo es posible si existen moléculas de señalización posicional y moléculas de adhesión celular (CAM) que lo relacionen tanto con células vecinas como con la matriz extracelular circundante. La estructura del cono de crecimiento es fundamental para su función. El frente de avance se compone de estructuras dinámicas denominadas filopodias que exploran el camino por adelante; entre los filopodios se encuentran láminas de membrana denominadas lamelipodios. Teniendo en cuenta la distribución de los distintos componentes del citoesqueleto, dentro del cono de crecimiento se pueden ubicar tres dominios. el dominio periférico (P) contiene haces de filamentos de F-actina que conforman los filopodios, así como también una malla o red de F-actina que da estructura a los lamelipodios. Además, presenta un grupo de microtúbulos (MT) 'pioneros' muy dinámicos que exploran esta región, generalmente avanzando sobre los paquetes de F-actina. El dominio central (C) encierra un paquete estable de MT que entran en el cono de crecimiento desde el eje del axón. Además presenta numerosas organelas, vesículas y haces de actina centrales. Por último, la zona de transición (T) se ubica en la interfaz entre los dominios P y C, posee estructuras contráctiles de actina-miosina que forman una estructura semicircunferencial. La dinámica entre todos estos componentes determina la forma del cono de crecimiento y su motilidad durante el viaje hacia su célula blanco cumpliendo un papel fundamental en la elongación y la dirección que toma éste. Durante su crecimiento, el cono axonal progresa a través de un ciclo de avance constituido por 3 etapas: protrusión, expansión y consolidación. A fin de que el cono de crecimiento pueda navegar censando puntos de referencia espaciales, los componentes del citoesqueleto que impulsan el movimiento hacia adelante deben tener la capacidad para distribuirse espacialmente en forma asimétrica para lograr una dirección precisa. Durante el desplazamiento celular, en los filamentos de actina y los microtúbulos ocurre un fenómeno denominado “treadmilling”. Este fenómeno se produce cuando un extremo de un filamento crece en longitud, mientras que el otro se encoge dando como resultado el "movimiento" aparente de dicho filamento a lo largo del filopodio. Esto se debe a la eliminación constante de subunidades de la proteína en cuestión (actina o tubulina) de un extremo, mientras que subunidades de la misma proteína se añaden constantemente en el otro extremo. En el caso del cono de crecimiento este “movimiento” se produce por la polimerización de actina en el frente de avance, el desensamblado de subunidades de actina en la zona T del cono y el reciclaje de estas subunidades a nivel del nuevo frente de avance. Si el flujo retrógrado y las fuerzas de polimerización están en equilibrio, no se produce protrusión del cono pero cuando algún filopodio encuentra un sustrato adhesivo, los receptores del cono de crecimiento se unen al sustrato y se acoplan a F-actina a través de proteínas de anclaje. Este acoplamiento de F-actina en el frente de avance con respecto al sustrato atenúa de flujo retrógrado de F-actina. Además de la polimerización de F-actina se produce un avance de la membrana hacia adelante. Esto da como

resultado el crecimiento del cono. Los MT periféricos del dominio P exploran entre los haces F-actina de los filopodios y podrían estar actuando como sensores y andamios para el posterior reclutamiento de MT adicionales a la región. Los microtúbulos, por su parte, proporcionan apoyo estructural y actúan como sustratos para el transporte axonal rápido de organelas. Algunos estudios farmacológicos han revelado que el avance axonal depende de la dinámica polimerización-despolimerización en los extremos de los microtúbulos y la regulación, por lo menos en parte, de la actividad de proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP). Las MAP parecen estar distribuidas diferencialmente en los diversos compartimentos neuronales. MAP2 se ubica preferentemente en dendritas, mientras que Tau es más abundante en los axones. Varios experimentos in vivo como in vitro indican que, cuando los conos de crecimiento responden a señales extracelulares de quimiotaxis, se produce un reordenamientos rápido de actina y MT. Los MT se reorientan y se extienden hacia la región T del cono axonal, mientras aumenta la malla de F-actina en esa zona. Se han propuesto diferentes modelos para explicar cómo ocurre la elongación de los MT durante el crecimiento axonal, y, en todos los casos, el desarrollo de tensión en la red de F-actina como resultado de su interacción adhesiva con el sustrato subyacente parece ser un elemento esencial. Los receptores membrana y moléculas de adhesión presentes en el cono de crecimiento, al unirse a moléculas de la matriz extracelular como: fibronectina, vitronectina y laminina entre otras, establecen complejos macromoleculares funcionales que estimulan la polimerización de actina, la estabilización de las mallas de F-actina formadas y la inhibición de su flujo retrógrado. Las moléculas de adhesión, además de vincular mecánicamente la célula con la matriz extracelular, pueden ser consideradas verdaderos receptores capaces de activar cascadas de señalización intracelular que involucran la fosforilación de quinasas y la actividad de GTPasas. Entre las moléculas de adhesión, el sistema mejor caracterizado lo constituye la familia de las integrinas que participan en el acoplamiento entre el espacio extracelular y el citoesqueleto. Otra familia de receptores de adhesión es el de las cadherinas y está relacionada con el F- actina a través de las cateninas. Durante la generación de neuritas, las neuronas deben ampliar su superficie rápidamente para posibilitar el crecimiento axonal. Esto requiere el reclutamiento de membrana recién sintetizada a la superficie celular. Cierta evidencia experimental indica que la incorporación de membrana se lleva a cabo por la fusión de vesículas diferentes de las vesículas sinápticas denominadas “vesículas precursoras de membrana” siguiendo la vía secretora constitutiva. La incorporación de nueva membrana en el axón en crecimiento se lleva a cabo a través de un mecanismo de fusión similar al empleado para la fusión de vesículas sinápticas. Se han sugerido varios modelos para explicar el agregado de membrana a los axones durante su elongación. Uno de ellos (el de mayor aceptación) sugiere que el lugar de incorporación de membrana se lleva a cabo preferencialmente a nivel del cono de crecimiento. Otro modelo propone que la incorporación de nueva membrana ocurre en la región del axón más cercano al cuerpo celular y, por último, también se plantea la posibilidad de que la membrana se intercala a lo largo del axón en crecimiento. En cualquiera de los casos propuestos, el agregado de memebrana a la membrana plasmática se produce con la participación de las vesículas precursoras de membrana plasmática que, antes de su fusión a la superficie, viajan a lo largo de los MT. Dentro del cono de crecimiento axonal también se produce el reciclado de membrana en forma asimétrica y focal facilitando de este modo la remodelación del cono en función de su entorno como respuesta a factores quimioatrayentes o repelentes. Estos procesos requieren una rápida y muy dinámica remodelación de la membrana del terminal con un gran gasto energético que involucra la activación de GTPasas de la familia Rho. Por otra parte, los factores inhibidores de crecimiento pueden estimular una recuperación mayor de la membrana e inducir el colapso del cono de crecimiento.

Si bien se ha avanzado mucho en comprender los eventos que se llevan a cabo dentro del cono de crecimiento durante la extensión de axones, los procesos que median la remodelación del citoesqueleto y la incorporación de membrana local siguen estando parcialmente definidos. BibliografíaBibliografía Pfenninger KH. (2009). Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nat Rev Neurosci 10(4):25161. Vitriol EA, Zheng JQ. (2012). Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron 73(6):1068-81. Dent EW, Gupton SL, Gertler FB. (2011). The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol 3(3). pii: a001800.

Capítulo 10. Desarrollo del ojo y de sus anexos SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 10.1. La influencia de la asimetría sobre la organización espacial de los CCD: el eje superficieprofundidad de la vesícula lental. V. Flores, M. Rapacioli SC 10.2. El campo lental del extremo cefálico del embrión. Interacciones celulares y vías de señalización involucradas en su constitución y evolución. V. Flores SC 10.3. El papel del mesénquima cefálico periocular como integrador de la morfogénesis y la histogénesis ocular. V. Flores SC 10.4. El campo ocular del extremo cefálico de la placa neural. V. Flores

SC 10.5. El papel morfogenético del contacto placoda lental-vesícula óptica. V. Flores SC 10.6. La elaboración de mapas de proyección receptor periférico-centro: el mapa retinogeniculado. V. Flores SC 10.7. Principios de histogénesis corneal y translucidez de la córnea. V. Flores SC 10.1. La influencia de la asimetría sobre la organización espacial de los CCD: el eje superficie-profundidad de la vesícula lental. V. Flores, M. Rapacioli El desarrollo de la vesícula lental ofrece un ejemplo acerca de cómo las características fisicoquímicas del ambiente de las células en desarrollo influyen sobre sus CCD. Las células de la vesícula lental exhiben desde temprano una diferencia en sus CCD según ocupen la porción superficial o profunda de ella. Las del hemisferio superficial se mantienen durante mucho tiempo con capacidad proliferativa y sin capacidad de diferenciarse, en tanto que las células del hemisferio profundo cesan rápidamente la proliferación y se diferencian en fibras del cristalino. En otros términos, la lente exhibe un gradiente de desarrollo tal que se encuentra más avanzado en el polo profundo. Dicho cambio de comportamiento se produce en la zona del ecuador entre ambos casquetes (superficial y profundo). Como las células de la superficie anterior proliferan, se van desplazando hacia el ecuador, las que llegan al ecuador cambian bruscamente de comportamiento: dejan de comportarse como pertenecientes a la población superficial y adquieren la conducta típica de las de la región profunda. Es como si la superficie anterior sólo proveyera las células que se diferencian sólo en la región profunda. Las células que llegan al polo profundo se diferencian, el citoesqueleto va adquiriendo una estructura cristalina integrada por un conjunto típico de proteínas específicas de la lente (cristalinas), pierde vitalidad el núcleo y los organotes se disgregan y se transforman en estructuras con propiedades de fibras ópticas. En sentido estricto, las fibras del cristalino no son células sino el resto que queda de las células una vez que mueren. El epitelio anterior de la vesícula lental sigue proliferando y produciendo nuevas células por mucho más tiempo. Como resultado de la intercalación de las nuevas células, el epitelio anterior se expande y las células más viejas van corriéndose hacia el borde o ecuador del cristalino. Una vez allí inician la diferenciación. Así, a lo largo del desarrollo se van agregando nuevas cohortes de células a lo largo de toda la banda ecuatorial como nuevas capas concéntricas de nuevas fibras ópticas. ¿Están determinadas a comportarse diferentemente las células lentales de las regiones superficial y profunda? Algunas experiencias de rotación de la lente durante el desarrollo indican que no. La microcirugía permite extraer la lente y reubicarla en una posición diferente. Si durante el desarrollo se extrae la lente, que ya ha iniciado su desarrollo, y exhibe claras diferencias entre células superficiales (no diferenciadas y proliferantes) y fibras profundas (ya diferenciadas) y se la rota 180º de modo que el hemisferio profundo pase a ser superficial y viceversa, ocurre el siguiente fenómeno: a) las células que se encontraban en la cara

superficial pasan a estar ubicadas en el interior de la copa óptica; allí cesan su proliferación y rápidamente se diferencian; b) las células que se encontraban en el hemisferio profundo y que ya se habían convertido en fibras del cristalino (elementos inertes sin vitalidad) quedan como están, pero ahora en la superficie anterior; c) un fenómeno significativo ocurre en la población de células que ocupan el ecuador de la lente en desarrollo. Las células de la banda del ecuador siguen en el ecuador pero con una polaridad espacial superficie  profundidad invertida. Las células que estaban pasando de la cara anterior a la posterior estaban cesando su proliferación e iniciando la diferenciación. Al producirse la inversión del eje superficieprofundidad de la lente, las células que estaban de la región superficial del ecuador, que aún proliferaban, pasan a iniciar la diferenciación, y las células que estaban en la región profunda del borde, que estaban iniciando la diferenciación, reasumen la proliferación. Así se genera una nueva población de células lentales en desarrollo con una polaridad invertida con respecto a las que habían iniciado el desarrollo de la lente. Las nuevas células profundas inician la formación de un nuevo núcleo de fibras primarias a las cuales se agregan luego nuevas fibras secundarias. Las nuevas células superficiales regeneran un nuevo epitelio anterior que se extiende sobre la superficie de la exporción profunda ya diferenciada. Estas dos nuevas poblaciones celulares continúan el desarrollo de una lente que se construye sobre la que se había formado inicialmente y que consiste en una lente mixta con un doble carácter, ya que las fibras ópticas formadas antes de la inversión tienen una orientación espacial y las que se formaron luego de la inversión tienen la orientación opuesta. Este resultado experimental ilustra con claridad la importancia de la organización espacial de los CCD y la dependencia de dicha organización respecto de las vías de señalización espacialmente estructuradas que “imprimen” una asimetría en el entorno de las células en desarrollo (Fig. SC 10-1-1).

Fig. SC 10-1-1. Representación esquemática de la experiencia de rotación de la lente. A. Estado inicial: lente en su posición normal. B. Estado inmediato posterior a la cirugía: lente rotada 180º. C. Seis días después de la cirugía: las células que inicialmente formaban el epitelio anterior (proliferativo) se diferencian en “nuevas células profundas” e inician la formación de un “nuevo” núcleo de fibras primarias y las “nuevas células superficiales del

ecuador” reasumen la proliferación y regeneran un nuevo epitelio anterior. D. Diez días después de la cirugía. Bibliografía Coulombre AJ, Coulombre JL. (1963). Lens development: fiber elongation and lens orientation. Science 142: 1489-90. Lovicu FJ, McAvoy JW, de Iongh RU. (2011). Understanding the role of growth factors in embryonic development: insights from the lens. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 366(1568):1204-18. Wang Q, McAvoy JW, Lovicu FJ. (2010). Growth factor signaling in vitreous humorinduced lens fiber differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci 51(7):3599-3610. SC 10.2. El campo lental del extremo cefálico del embrión. Interacciones celulares y vías de señalización involucradas en su constitución y evolución. V. Flores El ectodermo epidérmico de las regiones laterales del prosencéfalo, la zona que cubre las vesículas ópticas adquiere, desde muy temprano, potencia para formar la lente. Dicha región ectodérmica integra la zona denominada línea de Wolff que origina placodas ectodérmicas. Las placodas ectodérmicas generan células que luego se diferencian en a) neuroepitelios receptores periféricos (olfatorio, auditivo, del equilibrio, etc.), b) células que se invaginan e incorporan a ganglios sensoriales craneales (placodas óticas, placodas epibranquiales) y, además, generan células que c) contribuyen a amplificar las poblaciones mesenquimáticas cefálica y branquial. El área de ectodermo que durante el período somítico forma la línea de Wolff deriva de la zona ectodérmica, ya definida durante la gastrulación, denominada área preplacodal. Esta área, en estados más tempranos, ocupa la región del ectodermo epidérmico que bordea, a modo de herradura, el extremo cefálico de la placa neural (SC 11.4. Modelo de inducción de la región preplacodal). La zona llamada línea de Wolff está integrada por el ectodermo epidérmico y una delgada capa de mesénquima subyacente con la que interactúa. Este mesénquima está formado mayoritariamente por células provenientes de la cresta neural preótica o craneal. En la región encefálica, las células de la cresta neural se segregan del compartimento epitelial incluso antes de que se cierre el tubo neural. Parte de estas células se distribuyen en superficie por debajo del ectodermo y junto con él forman parte de la línea de Wolff. Algunos experimentos clásicos muestran que, cuando dicha región ectodérmica es trasplantada muy tempranamente (antes de la interacción con su correspondiente mesénquima), no se transforma en placodas sino simplemente en epidermis de la región a la que fueron trasplantadas. Por el contrario, cuando se explantan o trasplantan, en estados más avanzados, porciones definidas de la línea de Wolff, estos tejidos originan las placodas que hubieran formado en sus lugares de origen. Este segundo resultado implica que se hallaban determinadas antes del trasplante. Se sabe que para que la determinación ocurra el ectodermo del área preplacodal debe recibir previamente diferentes tipos de estímulos de tejidos mesodérmicos y ectodérmicos adyacentes. Entre estas señales existen algunas positivas (+) que son determinantes y existen algunas que son inhibitorias o negativas (-). Las primeras posibilitan que las células expresen la combinatoria de factores de transcripción correspondiente al área placodal. Las segundas sirven para localizar la acción de modo que el área no se extienda más de lo normal.

En el caso concreto de la placoda lental, se considera que uno de los factores transcripción incluidos en la combinatoria de factores que participa en su determinación es el factor Pax6. Casi simultáneamente, las células de la región ocular de la placa neural, región precursora de la vesícula óptica, expresan Pax6. No se sabe si la expresión de este factor indica determinación en sentido lental o adquisición de competencia para responder a la acción determinante del mesénquima cefálico. De todos modos, se sabe que si el ectodermo de dicha región es trasplantado a la región de la placoda auditiva, el ectodermo se diferencia en placoda (aun sin interacción con la vesícula óptica) reteniendo su carácter lental. Este hecho muestra que la región ya está determinada antes de su interacción con la vesícula óptica. Estos experimentos también indican que la población celular determinante que restringe la potencia del ectodermo epidérmico y lo determina en sentido lental es el mesénquima cefálico regional. También existen experimentos que indican que la región posee propiedades de campo, vale decir, antes de la constitución de la placoda lental ya está determinada pero con propiedades regulativas. Acciones permisivas y diferenciación de la placoda lental. Una vez determinada la evolución en sentido lental, la etapa siguiente es la diferenciación en placoda lental. A este fenómeno le siguen la invaginación de la placoda, la formación de la vesícula lental y la diferenciación de ésta en lente. En este proceso participa, al parecer permisivamente, el neuroepitelio de la vesícula óptica. El carácter permisivo de tal acción es supuesto a partir del hecho que: a) no asigna carácter lental pues ya lo posee desde antes y b) en condiciones experimentales, el efecto del neuroepitelio de la vesícula óptica puede ser reemplazado exitosamente por señales generadas por una diversidad de otros tejidos. Se considera que durante la diferenciación las células del campo lental reciben señales de la vesícula óptica ya que ésta secreta varias proteínas señal (p. ej., proteína señal Bmp4) que estimulan la expresión de nuevos factores de transcripción como Sox2, Pax, la proteína factor de transcripción KLF6 (Krüppel-like factor-6) y otros. La formación de la fosa y la vesícula lental. Los procesos que conducen a la formación de la fosa y vesícula lental, si bien pueden producirse en otros lugares en los que la placoda es trasplantada, no se cumplen de la misma forma. Ello se debe a que la precisión de dichos procesos morfogenéticos está regulada por medio de interacciones de adhesión, fuerzas interfaciales de intensidad regulada que sólo se logran a través de interacciones con la vesícula óptica y el ectodermo regional (SC 10.5. El papel morfogenético del contacto placoda lental-vesícula óptica).

Bibliografía Bhattacharyya S, Bronner-Fraser M. (2004). Hierarchy of regulatory events in sensory placode development. Curr Opin Genet Dev 14 (5): 520-6. Jacobson AG. (1966). Inductive processes in embryonic development. Science 152(3718):25-34. McKeehan MS. (1951). Cytological aspects of embryonic lens induction in the chick. J. Exp. Zool 117: 31-64. Ogino H, Yasuda K. (2000). Sequential activation of transcription factors in lens induction. Dev Growth Differ 42(5):437-48.

SC 10.3. El papel del mesénquima cefálico periocular como integrador de la morfogénesis y la histogénesis ocular. V. Flores El mesénquima cefálico es una adquisición evolutiva relativamente reciente. Se ha desarrollado a lo largo del proceso de cefalización que ocurrió desde la aparición de los cefalocordados en adelante. Cumple un papel primordial en la morfogénesis y la histogénesis del aparato de la contención neurosensorial y la de los propios órganos de los sentidos.

En el caso del desarrollo del ojo, que posee varias cubiertas conectivas con importantes diferencias interespecíficas, el mesénquima cefálico ha sufrido varias adaptaciones vinculadas a los cambios evolutivos del sistema visual. Varias son las instancias en las que células del mesénquima cefálico desempeñan papeles importantes durante el desarrollo del sistema visual. a) El efecto más temprano conocido es la escisión del campo ocular (retiniano) del extremo cefálico (prosencefálico) de la placa neural en dos porciones, derecha e izquierda, con capacidad para formar un par de ojos con simetría bilateral. Tempranamente, dicha región tiene capacidad de campo y forma un único ojo medial. Ulteriormente es escindido en dos mitades simétricas y bilaterales. Esta función al parecer es cumplida por células del mesodermo axil precordal (proceso cefálico o notocorda anterior) que, a través de la señalización celular vía Shh, que es un importante morfógeno de la región ventral del tubo neural, tienen un efecto en la generación de la línea media y la formación de estructuras especulares o bilaterales respecto de ella. Las alteraciones en este proceso de señalización conducen a malformaciones en las que no es posible distinguir una línea media como la ciclopía aislada o asociada a otras malformaciones más graves como la holoprosencefalia. Por otro lado, se ha postulado que este mesénquima también contribuye con células musculares a la musculatura extrínseca del ojo. b) El siguiente efecto es su participación, como generador de señales determinantes y localizadoras del área preplacodal y luego, durante la formación de la línea de Wolff, como generadora de señales determinantes y localizadoras del campo lental en el ectodermo del área preplacodal (SC 10.2. El campo lental del extremo cefálico del embrión. Interacciones celulares y vías de señalización involucradas en su constitución y evolución). Este efecto, denominado “localizador” de la capacidad formadora de lente y diferenciación de la placoda lental es muy importante ya que, inicialmente, el campo lental es bastante más extenso que la placoda y se extiende a zonas aledañas en las que coexisten células que luego forman parte de otras placodas. Esta delimitación más precisa de regiones se ha denominado también como “refinamiento” en la distribución de potencias de desarrollo. c) Luego de dicho efecto, el mesénquima cefálico desaparece casi por completo de la región interpuesta entre la placoda lental y la vesícula óptica. De esta forma ambas estructuras epiteliales, ya determinadas, interactúan directamente e inician una serie de interacciones que poseen tanto efecto morfogenético como histogenético (SC 10.5. El papel morfogenético del contacto placoda lental-vesícula óptica). d) El contacto entre los epitelios de la placoda lental y de la vesícula óptica produce efectos de desarrollo sobre ambos. Por un lado, la vesícula óptica actúa como población celular permisiva sobre el campo lental y estimula su diferenciación en placoda lental. Por otro lado, señales de la placoda operan en forma determinante y/o permisiva sobre el neuroepitelio de la vesícula óptica y hacen que se diferencie en sentido de retina neural. Esta acción de la placoda se pone de manifiesto cuando se impide el contacto de la vesícula óptica con el campo lental; en ese caso la región superficial de la vesícula óptica no se diferencia en retina neural sino que adquiere las características del epitelio pigmentario de la retina. e) El hecho señalado indica que el mesénquima cefálico periocular tiene la capacidad de redireccionar la evolución del neuroepitelio de la vesícula óptica en sentido de epitelio pigmentario. Esta acción se pone de manifiesto en experimentos en los que se elimina la placoda lental y toda la vesícula es rodeada por el mesénquima cefálico periocular. En esta situación, la vesícula óptica no se invagina y todo el epitelio de la vesícula se diferencia en una capa de epitelio pigmentario. Vale decir, no se forma retina neural. Este efecto se deduce también observando el desarrollo normal; normalmente la región de vesícula óptica que entra en contacto con la placoda lental se diferencia en retina neural, mientras que la que queda rodeada por mesénquima periocular se diferencia en epitelio pigmentario de la retina. Estas acciones diferentes de la placoda y el mesénquima periocular tienen efecto morfogenético e histogenético ya que garantizan que en la hoja interna de la copa óptica (que recibió la acción de la placoda) se forme la retina y que la hoja externa (que recibe la acción del mesénquima) rodee externamente a la retina neural.

f) El mesénquima periocular desempeña también un papel central en el desarrollo de la retinotopía; vale decir, en la instalación de las polaridades (dorsoventral y nasotemporal) que definen el patterning de las células ganglionares de la retina necesario para la elaboración de los mapas de proyección retinogeniculada derecha e izquierda. La función visual requiere que las conexiones retinogeniculadas se realicen entre neuronas que ocupan puntos correspondientes de la retina y del núcleo geniculado lateral. Esto es posible debido a que en ambos órganos se instalan polaridades espaciales que asignan propiedades específicas de lugar o posición a las neuronas que ocupan diferentes posiciones a lo largo de dos ejes espaciales. Estos ejes son instalados en la población de células ganglionares de la retina por medio de sistemas de señalización celular espacialmente organizados o gradientes generados por el mesénquima periocular. g) El mesénquima cefálico-periocular participa también en el patterning de la lente controlando la ejecución diferencial, en función del espacio, de las actividades de proliferación y diferenciación celular (SC 10.1. La influencia de la asimetría sobre la organización espacial de los CCD: el eje superficie-profundidad de la vesícula lental). h) Finalmente, desde el punto de vista estructural, el mesénquima cefálico periocular participa en el desarrollo del ojo con una versatilidad llamativa. Analizado a lo largo del eje radial del ojo, genera una variedad de tejidos conectivos estructuralmente diferentes y con distintas funciones; considérense las diferentes cubiertas oculares y el humor vítreo. Por otro lado, cada una de estas cubiertas posee diferencias estructurales y funcionales típicas en diferentes regiones a lo largo de la circunferencia que va desde el centro de la córnea al nervio óptico. También participa en la generación de estructuras específicas del ojo como la zónula de Zinn, cápsulas de la lente y del humor vítreo, entre otras.

Bibliografía Heavner W, Pevny L. (2012). Eye development and retinogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol 4(12). pii: a008391. Tripathi BJ, Tripathi RC, Livingston AM, Borisuth NS. (1991). The role of growth factors in the embryogenesis and differentiation of the eye. Am J Anat 192(4):442-71. Vladimir Flores. (1988). Actualizaciones en biología del desarrollo. Buenos Aires: Libreros López Editores.. SC 10.4. El campo ocular del extremo cefálico de la placa neural. V. Flores Algunos experimentos clásicos mostraron que el extremo cefálico de la placa neural posee potencia para generar retina neural y que, además, posee propiedades de campo. Cuando el extremo cefálico (prosencefálico) de la placa neural, de las etapas de fines de la gastrulación, es disecado y llevado a un medio de cultivo rodeado de mesénquima (explanto), se diferencia en una estructura vesicular epitelial similar a la vesícula óptica. El explanto así cultivado, pese a que a) está formado por las dos mitades, derecha e izquierda, del extremo de la placa neural, y que b) durante el desarrollo embrionario normalmente origina dos vesículas ópticas que luego generan dos retinas con simetría bilateral, en las condiciones de cultivo señaladas solo origina una vesícula óptica. Cuando en el explanto arriba señalado (extremo anterior de la placa neural) antes del cultivo es dividido en sus dos mitades, derecha e izquierda, cada mitad exhibe capacidad para originar una vesícula óptica. Estos experimentos muestran, tempranamente, durante la gastrulación, que el extremo anterior de la placa neural se comporta como un campo morfogenético. Por dicho motivo, el extremo anterior de la placa neural

fue denominado clásicamente, por algunos investigadores, como territorio presuntivo ocular de la placa neural y, por otros, como campo ocular (Fig. SC 10-4-1 A). Cuando los experimentos arriba descritos se repiten en función del tiempo, se constata que la propiedad de campo se mantiene durante un cierto período y luego desaparece. Sobre la base de otros resultados experimentales de cultivos de explantos, combinados con análisis de biología celular y molecular, se ha postulado que la escisión del campo ocular en dos campos, uno derecho y uno izquierdo, depende de una acción ejercida por el mesodermo axil precordal que normalmente subyace en dicha región de la placa neural. Por un lado, las alteraciones espontáneas en la formación de dicho mesodermo se asocian estadísticamente a fallas en la escisión del campo ocular y, por otro, cuando se interfiere experimentalmente la migración del mesénquima precordal se mantiene por más tiempo la propiedad de campo. Las observaciones mencionadas permitieron proponer que la ciclopía (presencia de un único ojo de ubicación medial) podría ser el resultado de una falla en el proceso por medio cual el campo ocular se escinde en dos. En tales circunstancias se formaría una sola vesícula óptica y, en consecuencia una sola copa óptica y, en rededor de la misma, el mesénquima cefálico se organizaría formando las cubiertas de un único ojo medial. Varias observaciones recientes, con nueva tecnología, llegan a conclusiones similares. Confirman la existencia de una región del extremo cefálico de la placa neural precursora de las células que integrarán las vesículas ópticas. Esta región puede ser identificada por la expresión local selectiva de las proteínas factores de transcripción Pax2 y Pax6. Poco tiempo luego de la expresión de estos factores, las células de la placa precordal, que se continúa caudalmente con el mesénquima precorda,l inician la síntesis de la proteína señal Shh. Al parecer, la activación de la vía de señalización de la señal Shh en las células de la región medial del campo ocular, de un modo no conocido, inhibe el desarrollo en sentido ocular y escinde el territorio o campo ocular inicial en dos regiones laterales con potencia para formar retina (Fig. SC 10-4-1 B). Una vez activada la señalización vía Shh en la línea media, desaparece en dicha región la expresión de los factores de transcripción Pax2 y Pax6, en tanto que en las regiones derecha e izquierda continúa su expresión. El factor de transcripción Pax2 se expresa selectivamente en la región ocupada por células que quedarán confinadas al pedículo óptico, y el factor Pax6 se expresa en células que integrarán la copa óptica. Éstas últimas son las que, dependiendo de interacciones celulares ulteriores, con el mesénquima cefálico regional o con la placoda lental, originarán diferentes tipos celulares de la retina (SC10.3. El papel del mesénquima cefálicoperiocular como integrador de la morfogénesis y la histogénesis ocular).

Fig. SC 10-4-1. Representación esquemática de la ubicación del campo ocular. Vista dorsal. A. Mediados de 3ª SD. B. Fines de 3ª SD. Bibliografía Hirsch N, Harris WA. (1997). Xenopus Pax-6 and retinal development. J Neurobiol 32(1):45-61. Belecky-Adams T, Tomarev S, Li HS, Ploder L, McInnes RR, Sundin O, Adler R. (1997). Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells. Invest Ophthalmol. Vis Sci 38(7):1293-303. SC 10.5. El papel morfogenético del contacto placoda lental-vesícula óptica. V. Flores Las interacciones placoda lental-vesícula óptica no poseen solo papeles permisivos o determinantes referidos al destino futuro de las células que los componen. Las propiedades adhesivas y las intensidades de las fuerzas interfaciales entre los epitelios interactuantes también poseen un papel morfogenético. Tal papel resulta del hecho de que las fuerzas desarrolladas a) modelan temprana y transitoriamente a las poblaciones interactuantes, b) los cambios de forma tempranos, al ser base de procesos futuros, repercuten más adelante en la morfogénesis

global y c) generan disposiciones espaciales de los tejidos que posibilitan interacciones futuras con otras poblaciones celulares. Entre las interacciones con papel morfogenético merecen comentarse las siguientes (varias otras figuran en la literatura): a) La adhesión entre las superficies basales del ectodermo prelental y del epitelio neural de la vesícula óptica no es solo resultado de la intensidad de la fuerza interfacial entre ambas. Este proceso es facilitado por un desplazamiento de las células del mesénquima cefálico, fuera del área de contacto epitelial, que favorece la adhesión. El desplazamiento del mesénquima fuera del área de contacto y la consiguiente adhesión entre los dos epitelios permiten que las fuerzas morfogenéticas necesarias para la invaginación, generadas en cualquiera de los dos epitelios, se transmita también al otro. Se considera que este fenómeno explica cómo ambos epitelios se curvan, simultáneamente, como láminas concéntricas con el mismo radio de curvatura. b) Otro fenómeno involucrado en el control de la invaginación conjunta de ambos epitelios es la tensión que ejerce el ectodermo perilental sobre los bordes de la placoda lental durante la invaginación. Durante la invaginación aparece una tensión, en el plano del epitelio perilental, que se revela por el hecho de que si, en el momento de la invaginación, se realiza una pequeña incisión rectilínea de orientación tangencial al borde de la placoda, la línea de incisión se transforma rápidamente en un ojal. Este hecho revela que los bordes de la incisura están sometidos a tensión (Fig. SC 10-5-1). La importancia morfogenética de la tensión ejercida sobre los bordes de la placoda se revela por el hecho de que una incisión realizada en derrededor de la placoda ocasiona una invaginación acelerada y excesiva. La vesícula lental, en lugar de quedar ubicada en posición normal, rodeada por los bordes de la copa óptica, queda completamente incluida dentro de ella. Vale decir, completamente rodeada por la hoja interna de la copa óptica, ocupando el lugar que correspondería al humor vítreo. Así, la tensión y el tiempo durante el cual la placoda se mantiene unida al ectodermo parece poseer un efecto sobre la intensidad del plegamiento de ambos epitelios.

Fig. SC 10-5-1. Representación esquemática de la experiencia de sección del epitelio ectodérmico perilental. A-C. Invaginación normal de la placoda lental. B’. Ilustra el estado

inmediato posterior a la cirugía. C’. Evolución luego de la cirugía. La invaginación de la copa óptica es exagerada y encierra a la vesícula lental. c) El contacto entre las superficies basales de ambos epitelios permite interacciones que generan cambios en el patrón de proteínas que ambos epitelios expresan en sus superficies basales y que secretan hacia el mesénquima y conforman sus respectivas membranas basales. La evidencia experimental indica que la composición molecular de dichas membranas basales es importante en cuanto a definir interacciones futuras con el mesénquima circundante: 1) en el caso de la hoja interna de la copa óptica, con la cara profunda del cristalino y el mesénquima precursor del cuerpo vítreo y 2) en el caso de la cara anterior del cristalino y la superficie basal del ectodermo (futura córnea) con el mesénquima que forma los estromas de la córnea y del iris (véase siguiente punto). d) Un fenómeno similar al descrito ocurre en la zona de contacto transitorio entre las superficies basales del epitelio del borde de la fosa o la vesícula lental recién formada y el epitelio ectodérmico superficial antes de que ambos se desprendan. En dicha interfaz, al principio, no se introduce el mesénquima circundante. Durante dicho tiempo de interacción, los epitelios interactuantes generan membranas basales que programan el reingreso de mesénquima en dicha zona. El reingreso del mesénquima cefálico se produce en forma de dos capas deslaminadas: 1) una de las láminas migra sobre la superficie anterior de la lente y forma la membrana iridopupilar; 2) la otra lámina migra sobre la membrana basal del ectodermo superficial y formará el estroma de la córnea. Este fenómeno modela también la cámara anterior del ojo que queda ubicada entre las dos láminas de mesénquima mencionadas. Estos ejemplos ilustran cómo las interacciones mencionadas en c y d programan futuras interacciones con otros tejidos y estructuraciones espaciales futuras de éstos (Fig. SC 10-5-2).

Fig. SC 10-5-2. A. Esquema que ilustra las oleadas migratorias de mesénquima cefálico que forman el estroma de la córnea y del iris. La primera oleada formó el endotelio corneal. La segunda oleada forma el estroma del iris y la tercera oleada forma el estroma corneal. B. Fotografía de corte histológico del borde superficial de la copa óptica, el limbo esclerocorneal y la vesícula lental (Embrión humano; 8ª SD). Entre el endotelio corneal y la

membrana iridopupilar en formación se está formando la cámara anterior. En el limbo esclerocorneal se observa un plexo capilar que se comunica con ramas del plexo vascular hialoideo. La hoja externa de la copa óptica es un epitelio pigmentado. e) Se considera que la extensión del área de contacto entre la vesícula óptica y la placoda lental posee papel morfogenético. Dado que se trata de poblaciones celulares que, desde el punto de vista físico, se comportan como materiales maleables, la intensidad de la fuerza interfacial opera como variable que regula el área de contacto entre ambas superficies. Por otro lado, se considera que la presión hidrostática del líquido contenido en cavidades epiteliales también posee papel morfogenético ya que genera una tensión tangencial sobre las células que puede modificar significativamente sus comportamientos de desarrollo. En el caso de la vesícula óptica se considera que la presión hidrostática posee una connotación adicional. El proceso morfogenético de adhesión entre el ectodermo prelental y la vesícula óptica, y la extensión del área de contacto entre ambos, depende, por un lado, de la intensidad de la fuerza de adhesión interfacial entre ambas y, por otro, de la posibilidad de que cada uno de dichos epitelios se adapte a la forma del otro; cuanto mejor se adapten uno al otro, mayor será la superficie de contacto entre ellas. Una vesícula óptica con presión interna normal tiene un área de contacto diferente del de una vesícula “desinflada” que se amolda mejor al epitelio. Este efecto se pone de manifiesto cuando se realiza un pequeño orificio en la pared de la vesícula que permite la filtración del líquido interno. Esta situación conduce a diversos tipos de malformaciones oculares. Se ha postulado que una presión intravesicular relativamente baja permitiría una zona de contacto amplia y ello conduciría a vesículas lentales grandes y hojas internas de la copa óptica también de mayor tamaño. Por el contrario, una presión intraocular alta llevaría a situaciones inversas. En ambos casos, en los demás tejidos se producirían modificaciones compensatorias en el crecimiento de los tejidos tendientes a lograr la armonía entre todos los elementos que componen el ojo. La imposibilidad de lograr tal armonía llevaría a diversas alteraciones que incluyen tamaño anormal de los ojos. f) El hecho planteado en el punto precedente ha sido señalado también como una característica peculiar del ojo en el sentido de que la influencia recíproca entre epitelio ectodérmico prelental y epitelio de la vesícula óptica, además del carácter localizador (SC 10.2. El campo lental del extremo cefálico del embrión. Interacciones celulares y vías de señalización involucradas en su constitución y evolución. Véase también el punto precedente) posibilita una cierta armonía en las proporciones de los órganos derivados de ellos. Este hecho se pone de manifiesto cuando, experimentalmente, se realizan disociaciones de los epitelios prelental y vesículas ópticas de animales que tienen ojos grandes y pequeños y se los reasocia en recombinaciones recíprocas. De dichas asociaciones surgen copas ópticas y lentes armónicos que no poseen el tamaño de los ojos grandes ni pequeños de los animales de los que se obtuvieron los elementos interactuantes sino tamaños intermedios. Todos los hechos experimentales señalados ponen de manifiesto la enorme importancia y los diversos efectos de desarrollo, que poseen las interacciones mediadas por contactos a veces muy transitorios entre poblaciones celulares en desarrollo.

Bibliografía Twitty VC, Schwind JL. (1931). The growth of eyes and limbs transplanted heteroplastically between two species of Amblystoma. J Exp Zool 59: 61-82. McKeehan MS. (1951). Cytological aspects of embryonic lens induction in the chick. J Exp Zool 117, 31-64. Spemann, H. (1962). Embryonic development and induction. New York: Hafner Pub. Co. SC 10.6. La elaboración de mapas de proyección receptor periférico-centro: el mapa retinogeniculado. V. Flores

La visión es el sentido que con mayor precisión y rapidez permite analizar información espacial. La visión integra información proveniente de todos los puntos del espacio que conforman el campo visual. Para la conducta animal, es vital discriminar con precisión las posiciones relativas de los puntos que emiten, o reflejan, luz. Ello permite percibir los objetos del mundo en sus posiciones relativas reales. La retina, y el resto de las estructuras oculares, poseen una organización que permite discriminar y registrar con eficiencia los puntos del campo visual. La información visual “registrada” en la retina en forma espacialmente discriminada es luego enviada al centro por medio del nervio óptico. De nada serviría la discriminación espacial lograda en la retina si la ésta no se conservara a lo largo de la vía visual hasta llegar a la corteza visual. La información visual captada por cada célula fotorreceptora es transferida hasta las columnas corticales del área visual primaria de la corteza occipital, a través de cadenas de neuronas conectadas por varias sinapsis. La información visual es procesada, en parte, en la propia retina y, desde la neurona ganglionar de la retina (NGR) es llevada al núcleo de relevo, el núcleo geniculado lateral (NGL), que luego la transfiere al área 17 de la corteza occipital o área visual primaria o V1. Dado el carácter polisináptico de la vía visual, existen estrategias de establecimiento y mantenimiento de contactos sinápticos tendientes a lograr que la discriminación espacial lograda en la retina no se pierda en el trayecto desde las células fotorreceptoras a las columnas corticales del área V1. Es decir, que la información proveniente de distintos puntos del campo visual no se “mezcle” pues se perdería la información referida a las posiciones relativas de dichos puntos en el campo visual. A lo largo de la evolución se han seleccionado estrategias de desarrollo que tienden a lograr una correspondencia topográfica entre “puntos” de los neuroepitelios receptores de los órganos de los sentidos y “puntos” de las áreas centrales a las que dicha información es proyectada. Tales correspondencias topográficas entre puntos de uno y otro se denominan mapas de proyección. En el caso de la vía visual existe un mapa de proyección retino-geniculado y también un mapa de proyección genículo-cortical (Recomendamos consultar en textos de Anatomía la organización de la vía visual y, en textos de Histología y Fisiología, la organización de la retina, del núcleo geniculado lateral y de la corteza visual). La posibilidad de elaborar mapas de proyección entre neuroepitelios receptores periféricos y áreas de proyección centrales depende de procesos que operan en diferentes niveles de regulación del desarrollo de circuitos en el sistema nervioso central: a) la definición de categorías de neuronas que relacionen un neuroepitelio receptor (p. ej., NGR) con un área central (interneurona del NGL), b) la existencia de mecanismos de guía para el crecimiento axonal que conduzcan a los conos de crecimiento de los axones desde la retina, a través de un trayecto sinuoso (nervios, quiasma y cintillas ópticos), hasta el NGL, finalmente, c) la existencia de mecanismos que generen una tendencia a que los axones provenientes de una zona particular de la retina establezcan contactos preferentemente con neuronas de una zona particular del NGL y que las posiciones relativas de las NGR (que emiten los axones) se correspondan con las posiciones relativas de las neuronas del NGL (que reciben los axones). El mismo problema se repite cuando se considera cómo las neuronas del NGL establecen conexiones específicas con neuronas del área cortical. a) La definición de categorías de neuronas Varias son las propiedades que definen un tipo neuronal terminalmente diferenciado (SC La definición de neurona y de tipo neuronal). Muchas de ellas se elaboran epigenéticamente por medio de interacciones entre neuronas en desarrollo. Sin embargo las macroneuronas (como las NGR que son eferentes de la retina al NGL, y también las neuronas eferentes del NGL a la corteza) nacen con un programa que les permite desarrollar un conjunto básico de características específicas de tipo neuronal. Entre estas características básicas se incluye la expresión de proteínas de membrana (receptores y/o ligandos) que permiten a las neuronas en desarrollo realizar interacciones célula-sustrato (con componentes de la matriz extracelular) e interacciones célula-célula con otras poblaciones celulares que son potenciales blancos para inervar. Las dos propiedades mencionadas están incluidas en la programación de CCD por medio de los cuales los axones en crecimiento recorren trayectos hasta llegar a sus órganos blanco (SC 9.11. Bases celulares y moleculares de la neuritogénesis. El

comportamiento del cono de crecimiento axonal). Proteínas de este tipo les permiten también realizar las interacciones con células blanco potenciales de modo tal que se elabora una primera organización espacial de contactos o “mapa crudo” de proyección. Este mapa es pasible de ser modificado luego epigenéticamente de un modo dependiente de la actividad (Véase SC. La fase de neuritogénesis II. La actividad exploratoria del cono de crecimiento. Exploración y seguimiento. Quimioatracción y quimiorrepulsión. Zonas de inclusión y de exclusión de conos de crecimiento). b) El crecimiento axónico dirigido desde la retina al NGL El crecimiento de los axones de las NGR es dirigido por medio de interacciones con proteínas de la matriz celular o de la superficie celular de células que encuentran en su camino o también por medio de interacciones laterales con otros axones en crecimiento. Esto es así ya sea cuando crecen en el plano tangencial de la retina o a lo largo de la capa marginal del neuroepitelio (futura capa fibrosa interna), como también cuando ingresan al nervio óptico, se decusan, o no, en el quiasma y siguen por los tractos ópticos hasta el NGL. En la primera fase, los axones siguen caminos curvos, migran tangencialmente en forma ordenada, manteniendo sus posiciones relativas, sin mezclarse, a través de la capa marginal del neuroepitelio. Así van generando la capa fibrosa interna de la retina, y confluyen hacia el pedículo óptico. En la segunda fase, dentro del nervio, quiasma y tracto ópticos, los axones mantienen un cierto orden vinculado al de sus neuronas de origen en la retina. Se ha propuesto que algunos componentes de la matriz extracelular (laminita y fibronectina, vitronectina y condroitín sulfato, y heparán sulfato) contribuyen a la fasciculación disminuyendo la probabilidad de mezcla de axones. Esto aumentaría la probabilidad de que los axones que emergen juntos de una cierta región de la retina mantengan sus posiciones relativas durante todo el trayecto y arriben juntos a la misma región del núcleo geniculado. Este fenómeno podría contribuir en cierta medida al establecimiento de la retinotopía. Existen varios modelos propuestos para explicar cómo los axones se guían realizando interacciones con componentes de la matriz extracelular que generan zonas que admiten el ingreso de conos de crecimiento de axones en crecimiento (zonas de admisión) y componentes que generan un ambiente que no admite el ingreso de ciertos conos de crecimiento (zonas de exclusión) (SC La fase de neuritogénesis II. La actividad exploratoria del cono de crecimiento. Exploración y seguimiento. Quimioatracción y quimiorrepulsión. Zonas de inclusión y de exclusión de conos de crecimiento). c) La instalación de propiedades de lugar en la retina y en el geniculado. La distribución de axones en el área blanco. Las características de desarrollo arriba mencionadas, consideradas cualitativamente, caracterizan genéricamente a las NGR como la población neuronal aferente al NGL. Sin embargo, no permiten distinguir las NGR temporales de las nasales ni las dorsales de las ventrales. Tampoco permitirían explicar las correspondencias topográficas que definen el mapa de proyección retino-geniculado. Para entender estas diferencias es pertinente señalar que las propiedades mencionadas en los puntos anteriores, tales como la expresión de proteínas receptores y/o ligandos, etc. no son solo cualitativas sino que se expresan con diferente intensidad a lo largo del plano tangencial de la retina. Existe una batería de varias proteínas involucradas en fenómenos interactivos de reconocimiento célula-matriz extracelular o célula-célula, que se expresan, tanto en la retina como en el NGL, en forma de gradientes. La expresión diferencial de las proteínas mencionadas en función del espacio definido a lo largo de ejes espaciales nasaltemporal y dorsoventral opera como sistema de referencia que asigna diferencias dependientes de posición a las NGR que ocupan diferentes regiones de la retina. Estas diferencias dependientes de posición confieren identidad o individualidad a las NGR y a las interneuronas del NGL y, en consecuencia, posibilitan que NGR e interneuronas del NGL establezcan contactos de un modo selectivo o preferencial. La figura SC 10-

6-1 muestra un modelo sobre cómo, basado en la estrategia señalada, se pueden establecer mapas de proyección crudos que luego son pasibles de remodelación y refinamiento.

Fig. SC 10-6-1. Esquema simplificado de un modelo sobre el modo como se establecería un mapa o correspondencia topográfica entre una población inervante y su campo de inervación o blanco (Modelo: mapa retino-tectal en las aves). El modelo ilustrado se basa en la existencia de gradientes opuestos de expresión de receptores Eph y sus ligandos, las efrinas. Los axones de la retina temporal expresan altos niveles de EphA (verde). Los conos de crecimiento de estos axones son repelidos (excluidos) y no pueden ingresar en las regiones caudales del tectum que expresan altos niveles de efrina A (azul). Debido a ello se distribuyen en la región cefálica del tectum. Los axones de la retina nasal, por el contrario, expresan bajos niveles de EphA e invaden preferentemente las regiones caudales del tectum. Por otro lado, los axones de la mitad ventral de la retina expresan altos niveles de EphB (amarillo) e invaden fácilmente la mitad medial del tectum que expresa altos niveles de efrina B (rojo). A su vez, los axones de la mitad dorsal de la retina, que expresan bajos niveles de EphB invaden fácilmente la región lateral del tectum. Todos estos aspectos fueron conceptualmente planteados en la hipótesis de la quimioafinidad planteada en la década de los años 1940 por Sperry. El mapa de proyección crudo se establecería del siguiente modo. La expresión diferencial de proteínas en los conos de crecimiento de los axones de las NGR, y también en las interneuronas del NGL, haría que algunas zonas del NGL se comporten como zonas de admisión para cierta subpoblación de axones retinales y como zona de exclusión para otras subpoblaciones de axones. Si se considera que otras zonas del NGL se comportan inversamente, puede advertirse que diferentes tipos de axones se detendrán en diferentes regiones del blanco. De esta forma los extremos de crecimiento de diferentes subpoblaciones de axones pueden ir segregándose dentro del campo por inervar. Así, axones con propiedades de superficie similares tendrán mayor probabilidad de ser admitidos en, o excluidos juntos de las zonas mencionadas y separados de los axones que poseen propiedades de superficie diferentes. Se propone que, cuanto más parecidos sean los axones, más cercanos serán sus sitios de proyección. Recíprocamente, cuanto más disímiles sean en sus propiedades de superficie más lejos quedarán sus sitios de proyección. Ésta sería la estrategia de elaboración de los mapas crudos que, en general, no depende de la actividad del sistema. Se basa en la existencia de diferencias dependientes de posición tanto en el neuroepitelio periférico como en el área central de inervación. Con respecto al proceso por medio del cual se instalan las polaridades arriba señaladas tanto en la retina como en el tectum, en general se considera que éstas derivan de otros sistemas de referencia espacial previamente establecidos. En el caso de la retina, el origen de la polaridad es atribuida a información de posición establecida por medio de moléculas señal o morfógenos secretados por el mesénquima cefálico periocular. Estas señales se distribuyen en forma de gradiente espacial y las diferencias en la concentración de las señales asignan diferente información de posición a las NGR recién nacidas. Esta modalidad de asignación de información posicional, dependiente de la posición dentro de un sistema de referencia (o de la distancia respecto de un centro señalizador) externo, opera durante un período crítico breve. Pasado el período crítico, los ejes de referencia quedan determinados intrínsecamente en el plano tangencial de la retina y ya no dependen de una señalización externa. La instalación y determinación de las polaridades de la retina ocurren tempranamente, cuando la retina está recién en el estado de copa óptica y sólo ha nacido el 1% de

la población de NGR. Se considera que las NGR que nacen más tarde adquieren su información de posición de las NGR que nacieron y se especificaron antes. Vale decir, las NGR que nacen luego del estado de copa óptica adquieren sus propiedades de lugar, a medida que van naciendo, por interacciones con las que nacieron antes y ya se hallan especificadas. Se ha propuesto que esta asignación de información de posición está mediada por señales que las NGR más viejas transfieren a las más nuevas a través de uniones nexo. Se sabe que la retina crece expandiéndose en forma centrífuga desde los bordes de la copa óptica. A lo largo de dicho borde se mantendría una comunicación, vía uniones nexo, entre NGR ya especificadas y las NGR que van naciendo y agregándose al borde de crecimiento.

Bibliografía Sakurai T, Wong E, Drescher U, Tanaka H, Jay DG. (2002). Ephrin-A5 restricts topographically specific arborization in the chick retinotectal projection in vivo. Proc Natl Acad Sci 99(16):10795-800. Chilton JK. 2006. Molecular mechanisms of axon guidance. Dev Biol 292(1):13-24. essier-Lavigne M, Goodman CS. (1996). The molecular biology of axon guidance. Science 274:1123-33. SC 10.7. Principios de histogénesis corneal y translucidez de la córnea. V. Flores El mantenimiento de las características físicas, como por ejemplo la elasticidad, la viscosidad, la dureza o la translucidez de los elementos que componen los medios ópticos del ojo, depende de la actividad biológica de las células que los generan. La translucidez de la lente, por ejemplo, depende del hecho de que las células que la componen, antes de expulsar el núcleo y morir, sintetizan una gran cantidad de RNAm de larga vida media para la síntesis de una familia de proteínas denominadas genéricamente cristalinas. Estas proteínas se organizan en el citoesqueleto en una disposición tridimensional cristalina que les permite comportarse como un medio físico óptico. La translucidez de la córnea es un fenómeno distinto. En este caso depende del modo como se organizan en el espacio las células de los epitelios que la componen y, sobre todo, de la organización espacial de las fibras de colágeno del tejido conectivo que forman el estroma de la córnea. Se trata de un tipo particular de tejido conectivo denso denominado laminado, por el modo como las fibras se organizan en el espacio en forma de láminas concéntricas ordenadas. Esta disposición espacial les permite comportarse como medio óptico. El modo como se organizan en el espacio las fibras colágenas depende de las características de la matriz celular en la que ellas son depositadas y ambas cosas dependen, a su vez, de los comportamientos celulares de desarrollo y de las propiedades biológicas de las células. Son las células en desarrollo de la región de la córnea las que generan las condiciones fisicoquímicas para que un tejido conectivo sea translúcido. La córnea se continúa sin límite histológico neto con la esclerótica y, sin embargo, la esclerótica posee propiedades que le confieren opacidad a la luz. De ahí el carácter transparente de la córnea y el color blanco de la esclerótica. La transparencia de la córnea depende también, aparte del ordenamiento espacial de las fibras de colágeno, del grado de hidratación del estroma corneal, y esta propiedad depende de la composición en proteoglucanos de la matriz extracelular. Luego de la invaginación de la placoda lental, el ectodermo superficial (capa basal de células cúbicas y peridermo) realiza interacciones con el epitelio superficial de la vesícula lental y, entre ambos epitelios, empiezan a secretar una matriz extracelular de composición bastante definida. Por su importancia de desarrollo, esta matriz extracelular se denomina estroma primario corneal acelular.

Fig. SC 10-7-1. A-D. Ilustración esquemática de los estados histogenéticos de la córnea. Los esquemas muestran las dos ondas migratorias sucesivas que generan la córnea. E. Estado de diferenciación terminal de los tejidos corneales. El estroma primario cubre la superficie basal del ectodermo precorneal y, por su composición de proteínas y glucosaminoglucanos, se comporta como una zona migratoria permisiva para la primera oleada de células del mesénquima cefálico que formarán el endotelio de la córnea. De esta capa de células dependerá primordialmente la translucidez del estroma definitivo. Primitivamente, el endotelio secreta grandes cantidades de ácido hialurónico, molécula que debido a la abundancia de cargas posee alta afinidad por el agua y la retiene en la matriz extracelular. Una segunda oleada de células, que poseen diferentes propiedades biológicas, genera cantidades abundantes de la enzima hialuronidasa, que degrada al ácido hialurónico y además secreta otros componentes de la matriz extracelular y deposita las fibras colágenas típicas del estroma corneal. La degradación del ácido hialurónico permite la eliminación de parte del agua retenida en la matriz extracelular, el estroma primario se adelgaza y se convierte en estroma secundario. Recién en ese momento se adquiere la translucidez típica de la córnea. A esta primera deshidratación mediada por la lisis del ácido hialurónico le sigue una segunda que está estimulada por la hormona tiroidea T4. Luego, el endotelio corneal, la capa más profunda de la córnea y que delimita por delante a la cámara anterior del humor acuoso se encarga de mantener, en forma permanente, un grado de hidratación (80%) óptimo para la translucidez corneal. Así, finalmente, el endotelio corneal, mediante un bombeo activo de iones y agua desde la córnea hacia la cámara anterior del humor acuoso, se encarga de mantener el carácter de medio óptico de la córnea.

Bibliografía Kidson SH, Kume T, Deng K, Winfrey V, Hogan BL. 1999. The forkhead/winged-helix gene, Mf1, is necessary for the normal development of the cornea and formation of the anterior chamber in the mouse eye. Dev Biol 211(2):306-22. Bahn CF, Glassman RM, MacCallum DK, Lillie JH, Meyer RF, Robinson BJ, Rich NM. 1986. Postnatal development of corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 27(1):4451. Cvekl A, Tamm ER. (2004). Anterior eye development and ocular mesenchyme: new insights from mouse models and human diseases. Bioessays 26(4):374-86. Gage PJ, Zacharias AL. (2009). Signaling "cross-talk" is integrated by transcription factors in the development of the anterior segment in the eye. Dev Dyn 238(9):2149-62.

Capítulo 11. Desarrollo del Aparato Auditivo y Vestibular SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 11.1. La instalación y el refinamiento de la organización espacial de competencias de desarrollo en el área preplacodal. V. Flores, M. Rapacioli SC 11.2. La transformación del área preplacodal (área competente de formación de placodas) en línea wolffiana (área de placodas) del sistema sensorial cefálico. V. Flores SC 11.3. La potencia citogenética del área preplacodal. Su contribución a la citogénesis, histogénesis y organogénesis de la región cefálica. V. Flores SC 11.4. Modelo de inducción de la región

preplacodal. V. Flores SC 11.5. Papel del posencéfalo y tejidos adyacentes en el patterning del otocisto. V. Flores SC 11.6. Señales difusibles y factores de transcripción involucrados en la determinación de la placoda ótica. V. Flores SC 11.7. Un modelo de compartimentos y fronteras (bordes) para explicar el patterning y la morfogénesis del oído interno. V. Flores, M. Rapacioli SC 11.1. La instalación y el refinamiento de la organización espacial de competencias de desarrollo en el área preplacodal. V. Flores, M. Rapacioli

Fig. SC 11-1-1. La organización espacial de competencias del área preplacodal (Modelo: Embrión de pollo). A. A fines de la gastrulación se instalan zonas en las que coexisten células que pertenecerán a distintas placodas. B-C. Estas zonas sufren luego un refinamiento en la distribución espacial de las potencias de desarrollo correspondientes a distintas placodas. D. A fines del período somítico, las células derivadas de dichas placodas forman parte de órganos sensoriales periféricos o ganglios sensoriales craneales. Se denomina área preplacodal a la región ectodérmica, de fines de la gastrulación o de principios del período somítico, que bordea, a modo de herradura, el extremo cefálico de la placa neural. Se trata de una región estrecha en la que coexisten competencias para responder a diversas señales provenientes de tejidos adyacentes y determinarse en diferentes tipos de poblaciones celulares ectodérmicas. Entre estas poblaciones celulares se hallan las que forman engrosamientos ectodérmicos (placodas) constituidas por células con una potencia de desarrollo restringida a la formación de algún órgano sensorial en particular. Algunas de estas placodas también tienen una potencia neuronogénica, vale decir, una potencia citogenética que incluye la generación de poblaciones de neuronas sensoriales primarias que integran diversos ganglios sensoriales craneales. Los esquemas de la figura SC 11-1-1 A-D ilustran cómo, según progresa el desarrollo, el área preplacodal sufre un proceso de refinamiento en la distribución planar de potencias de desarrollo. Estas áreas se hallan inicialmente superpuestas pero, gradualmente, se van separando de modo que hacia el final del período somítico, las poblaciones celulares con diferente determinación se hallan en zonas no superpuestas y bien delimitadas. La figura SC 11-1-1 ilustra este proceso tal como ha sido descrito en el embrión de pollo. En etapa temprana del desarrollo (A: día 1 del embrión de pollo; fin de gastrulación; inicio de período somítico; 1.er par de somitas) existe una zona cefálica y medial que bordea la placa neural que es común para varias futuras placodas. En la región más cefálica y medial, cerca del extremo de la placa neural, se hallan las células que luego formarán las futuras placodas olfatoria y lental (área roja y rosa). Más caudalmente, en la zona adyacente al primer par de somitas, aunque ocupando un área de mayor extensión, se halla un territorio preplacodal común a la placoda

ótica o auditiva y a las placodas epibranquiales. Entre las dos zonas mencionadas se halla la región en la que se constituirá, un poco más tarde, el territorio precursor de la placoda trigeminal. Hacia el estado de 10 pares de somitas (B), algunas áreas se han segregado y ahora ocupan diferentes regiones. Las células correspondientes a las placodas olfatorias se localizan en el ectodermo del extremo cefálico del embrión mientras que las de las placodas lentales pasaron a ubicarse en las regiones laterales del futuro diencéfalo. Es ésta una región crítica ya que se hallan suprayaciendo a las vesículas ópticas con las que ulteriormente deben interactuar para un desarrollo sincrónico y armónico de la lente y la retina. Por otro lado, en este momento ya se han formado las placodas trigeminales en el ectodermo adyacente al posencéfalo. Puede observarse que las placodas óticas quedan ubicadas a la altura de las rombómeras 4/5 y rodeadas de varios dominios ectodérmicos correspondientes a otras tantas placodas neuronogénicas epibranquiales. Un poco más tarde, a mediados del período somítico, cuando ya se formado la curvatura cefálica y las prominencias cardíacas (C), las placodas están localizadas y reconocibles como zonas ectodérmicas engrosadas asociadas típicamente a otras poblaciones celulares con las que evolucionan integradamente. Hacia estados más tardíos, comparables a la 5.ª SD humano (D), las placodas olfatorias lentales auditivas han dado sus derivados y las neuronogénicas epibranquiales han originado masas ganglionares de nervios craneales (trigeminal, estatoacústico o cócleo-vestibular, glosofaríngea, facial y vagal).

Bibliografía Bhattacharyya S, Bailey AP, Bronner-Fraser M, Streit, A. (2004). Segregation of lens and olfactory precursors from a common territory: cell sorting and reciprocity of Dlx5 and Pax6 expression. Dev Biol 271: 403-14. D’Amico-Martel A, Noden DM. (1983). Contributions of placodal and neural crest cells to avian cranial peripheral ganglia. Am J Anat 166: 445-68. SC 11.2. La transformación del área preplacodal (área competente de formación de placodas) en línea wolffiana (área de placodas) del sistema sensorial cefálico. V. Flores El concepto de línea de Wolff (línea wolffiana) alude a la existencia de una zona que, con simetría bilateral, recorre la región cefálica del embrión. La línea de Wolff se inicia en la línea media del proceso frontal y recorre, a modo de arco, las caras laterales de la prominencia frontal y, luego, las regiones laterales de la región branquial (Fig. SC 11-2-1). La línea de Wolff es la zona en la que se distribuyen, desde el período somítico, las placodas que son precursoras de los neuroepitelios receptores periféricos de los órganos de los sentidos o estructuras asociadas a los órganos de los sentidos, como por ejemplo la lente del ojo. En algunas especies (peces y algunos anfibios), la línea de Wolff se continúa, desde la región branquial, en sentido caudal, a lo largo de casi toda la región lateral del cuerpo y da origen al órgano sensorial denominado línea lateral. Los receptores ubicados a lo largo de la línea lateral de diferentes especies han sufrido adaptaciones divergentes que permiten detectar distintos tipos de perturbaciones del ambiente (movimientos o vibraciones del agua, campos eléctricos, campos magnéticos, etc.). A través de esos estímulos es posible registrar características relevantes del medio, detectar presas o depredadores o comunicarse con otros individuos de la especie. La línea de Wolff, descrita clásicamente en el extremo cefálico del embrión del período somítico, es el resultado de la reubicación del área que, en la actualidad, se describe como área preplacodal que se constituye hacia fines de la gastrulación. La figura SC 11-2-1 A-D muestra las transformaciones y cambios de posición que experimenta el área preplacodal desde el momento de su aparición, al final de la gastrulación, hasta el final del período somítico. La

figura SC 11-2-1 A muestra la ubicación del área preplacodal a fines de la gastrulación y la ubicación, dentro ella, de tres subáreas, una cefálica y una caudal, que originarán diferentes grupos de placodas; entre ambas (línea de puntos) se halla una subárea intermedia en la que aparecerá más tarde otra placoda. La figura SC 11-21 B ilustra el proceso de refinamiento o delimitación de subáreas, correspondientes a algunas placodas, que acontece durante el transcurso del período somítico. La figura ilustra un esquema que corresponde a la ubicación de las células que originarán diferentes placodas en un embrión del estado de 10 a 13 pares de somitas (corresponde a un estado de aproximadamente 23-24 días del embrión humano). Las poblaciones celulares precursoras de diferentes placodas ya se han segregado en diferentes dominios del ectodermo de la región cefálica. En la región o subárea cefálica se han separado las células de las placodas olfatoria y lental. En la región o subárea caudal, las placodas ótica y epibranquiales también se han separado y estas últimas se han escindido en las tres áreas neuronogénicas correspondientes a los ganglios craneales geniculado (VII par craneal), petroso (IX par craneal) y nodoso (X par craneal). Recuérdese que estos ganglios quedan integrados por neuronas sensoriales primarias provenientes de dos orígenes diferentes: por un lado de las crestas neurales y por otro de las placodas neuronogénicas epibranquiales. En este momento, en la región o subárea intermedia, entre los dos grupos de placodas mencionados (las derivadas de las subárea cefálica y caudal), se han especificado las células que corresponden a la placoda trigeminal con sus divisiones oftálmica, maxilar y mandibular. En estados más avanzados (Fig. SC 11-2-1 C), que corresponden a un esquema de fines del período somítico, las células que integran los derivados de las placodas señaladas en la figura anterior ya han tomado posiciones definitivas y se relacionan con las poblaciones celulares con las que se desarrollarán interactivamente y han iniciado las etapas iniciales de su diferenciación: a) La placoda olfatoria ha iniciado su transformación en fosa olfatoria y se ubica en posición adyacente al futuro bulbo olfatorio del prosencéfalo. b) La placoda lental se ha transformado en vesícula lental y se halla ubicada en la concavidad de la copa óptica diencefálica. c) La placoda ótica se ha invaginado y forma el otocisto que se halla adosado a la pared lateral o alar del posencéfalo. d) Las placodas epibranquiales, que se ubican en los extremos dorsales de los surcos branquiales, han originado precursores que se invaginan en el mesénquima y se asocian a células de la cresta neural con las que forman los ganglios de los nervios craneales mencionados más arriba. e) En otras especies, caudalmente a la región branquial, se desarrollan los receptores que integran la línea lateral.

Fig. SC 11-2-1. Ubicación del área preplacodal, de sus subáreas cefálica y caudal y de las placodas derivadas de cada una de ellas. La secuencia de figuras A-D muestran: a) los cambios de posición del área preplacodal y su transformación en la línea de Wolff y b) el proceso de refinamiento (segregación de área placodales) que acontece durante el período somítico. (Modelo: Embrión de pollo). Bibliografía Bhattacharyya S, Bailey AP, Bronner-Fraser M, Streit A. (2004). Segregation of lens and olfactory precursors from a common territory: cell sorting and reciprocity of Dlx5 and Pax6 expression. Dev Biol 271; 403-14. D’Amico-Martel A, Noden DM. (1983). Contributions of placodal and neural crest cells to avian cranial peripheral ganglia. Am J Anat 166: 445-68. Schlosser G. (2010). Making senses development of vertebrate cranial placodes. Int Rev Cell Mol Biol 283:129-34. SC 11.3. La potencia citogenética del área preplacodal. Su contribución a la citogénesis, histogénesis y organogénesis de la región cefálica. V. Flores El área preplacodal contribuye con más de diez categorías de células a la histogénesis de diversas estructuras que integran el extremo cefálico del embrión. Ello pone de relieve el papel central que ha tenido en el proceso de cefalización (encefalización) que incluye, entre otros aspectos, el desarrollo de a) el sistema sensorial cefálico, b) el aparato de la contención neurosensorial y c) la formación de estructuras que vinculan los sentidos con el sistema nervioso central y la integración neuroendocrina necesaria para elaborar respuestas integradas a los estímulos provenientes de un ambiente permanentemente cambiante.

La figura SC 11-3-1 ilustra esquemáticamente las etapas tempranas de la morfogénesis de diferentes tipos de placodas y la capacidad citogenética de éstas. Algunas placodas precursoras de neuroepitelios receptores y de células endocrinas sufren una invaginación y luego se diferencian. Otras, además de invaginarse, experimentan T e-m y aportan células migrantes al epitelio mesenquimático. En estos casos, las células que quedan formando parte del epitelio invaginado, en general, se diferencian en células sensoriales (células sensoriales de laberinto membranoso) o neuronas sensoriales como las olfatorias; diferentemente, las células que sufren T e-m, en algunos casos forman células mesenquimáticas y en otros casos originan neuronas sensoriales primarias o células gliales de ganglios craneales. Con el objeto aportar mayor precisión a esta descripción, analizaremos los diferentes tipos celulares generados a partir de cada uno de los diferentes tipos de placodas. 1) Placodas sensoriales y neuronogénicas como las olfatorias y óticas. Se invaginan totalmente (ótica) o parcialmente (olfatoria) y originan neuroepitelios sensoriales y neuronas asociadas (células sensoriales, sus células de sostén, neuronas sensoriales primarias y células gliales de los ganglios asociados y nervios aferentes). 2) Placodas neuronogénicas. Poseen función específicamente neuronogénica. Existen dos grupos: a) el grupo dorsal o trigeminal, que aporta neuronas sensoriales primarias al ganglio del trigémino (Gasser) en sus porciones oftálmica, maxilar y mandibular y b) el grupo epibranquial, que origina las neuronas sensoriales primarias de las porciones distales de los ganglios de los nervios craneales (geniculado, nodoso, petroso). 3) Placoda endocrina o hipofisaria. Tiene una función de integración neuroendocrina. Origina los diversos tipos de células endocrinas de la adenohipófisis que se hallan reguladas por las neuronas hipotalámicas y que, a su vez, regulan a las glándulas endocrinas o los órganos blancos periféricos. 4) Placoda lental. Tiene como función generar células que se diferencian, forman las fibras del cristalino y durante dicho proceso mueren. 5) Placodas formadoras de mesénquima. En algunas especies existen placodas cuya función específica es realizar T e-m y amplificar la masa de mesénquima que forma el aparato de la contención neurosensorial. En vertebrados superiores, con excepción de la placoda lental, todas las demás tienen capacidad de aportar mesénquima que contribuye a generar el tejido conectivo que forma las cubiertas de los órganos de los sentidos o glándulas mencionadas.

Fig. SC 11-3-1. El gráfico ilustra esquemáticamente las etapas tempranas de la morfogénesis de diferentes tipos de placodas y su amplia capacidad citogenética. Las placodas han sido ordenadas de modo que la complejidad morfo-histogenética del proceso y la potencia citogenética de las placodas aumentan de arriba abajo del esquema. Algunas placodas de órganos sensoriales o glándulas endocrinas sólo sufren una invaginación y luego se diferencian como la placoda lental y la hipofisaria. Otras se invaginan pero algunas de sus células sufren T e-m e ingresan al compartimento mesenquimático. Las células que quedan formando parte del epitelio invaginado en general se diferencian en

células sensoriales (células sensoriales de laberinto membranoso) o neuronas sensoriales como las olfatorias. Las células que sufren T e-m, en algunos casos, forman células mesenquimáticas y, en otros casos, originan neuronas sensoriales primarias o células gliales de ganglios craneales. La figura muestra distintos tipos de evolución que realizan las diferentes regiones ectodérmicas de la zona preplacodal. Algunas a) evolucionan sólo hasta el estado de placoda (engrosamiento ectodérmico) y luego liberan células que migran y forman células mesenquimáticas de la región branquial u otros tipos celulares especializados tales como células endocrinas, neuronas, células gliales, etc. Otras b), luego del estado de placoda, sufren una invaginación, se convierten en una fosa que luego se suelta del ectodermo superficial y se introduce en el mesénquima. Allí forman una vesícula que luego se diferencia en un órgano definido. Finalmente, c) otras tienen un comportamiento mezcla de los dos anteriores: además de formar fosas y vesículas, liberan células que adquieren diferentes vías evolutivas dependiendo de la placoda que las originó. El diferente comportamiento morfogenético y citogenético de las distintas placodas se debe a que las poblaciones celulares que las constituyen ya están determinadas hacia una evolución definida. En general, la determinación de las células que ocupan las diferentes regiones precede a las manifestaciones estructurales mencionadas (formación de placoda, invaginación, formación de vesícula, etc.). El fenómeno de formación del área preplacodal, sus subáreas y las placodas que dentro de ellas se desarrollan se encuentra dentro del marco general de determinación progresiva que experimenta el ectodermo de la región cefálica del embrión, asociado a la cefalización. Si bien existen particularidades para cada una de las placodas, en general, tempranamente, en un área definida pueden coexistir células que luego forman parte de diferentes placodas y diferentes órganos definitivos. La expresión de combinatorias específicas de factores de transcripción como por ejemplo los factores Dlx3, Dlx5, Pax6 y la proteína marcador panneuronal Hu, que es considerado un marcador temprano de determinación en sentido neuronal, han sido utilizados para analizar cómo gradualmente se determina la potencia citogenética de diversas placodas en función del tiempo. El estudio de la expresión de estos marcadores aplicados a situaciones experimentales de trasplante de las áreas preplacodales a distintas regiones del embrión permite ver que tempranamente las áreas poseen una potencia amplia y que gradualmente se va restringiendo a un destino cada vez más estrecho y mejor definido. El proceso de determinación progresiva en el ectodermo de la región cefálica implica las siguientes etapas: a) Una determinación y restricción de destinos correspondientes a ectodermo neural y ectodermo no-neural. b) En la zona de transición entre ambas se determina a continuación la zona correspondiente a la cresta neural. c) A continuación, en la zona lateral del ectodermo no neural, se genera el área preplacodal. Ésta posee dos subáreas celulares, una cefálica y otra caudal, de potencias superpuestas correspondientes a conjuntos de placodas. d) A continuación, en las áreas cefálica y caudal se determinan y delimitan topográficamente cada una de las placodas que de ellas derivan. Además, en la zona comprendida entre las dos subáreas mencionadas, se constituyen nuevas placodas. e) El resto del ectodermo no nerual de dicha región, que no sufrió las determinaciones mencionadas, queda como el ectodermo epidérmico que originará la dermis y las glándulas anexas de la piel de dicha región.

Bibliografía Bhattacharyya S, Bronner-Fraser M. (2008). Competence, specification and commitment to an olfactory

placode fate. Development 135:4165-77. Schlosser G. (2006). Induction and specification of cranial placodes. Dev Biol 294(2):30351. Schlosser G. (2010). Making senses development of vertebrate cranial placodes. Int Rev Cell Mol Biol 283:129-34. SC 11.4. Modelo de inducción de la región preplacodal. V. Flores

Fig. SC 11-4-1. A. Representación esquemática de una sección transversal de la región preplacodal del embrión (Estado de 2-4 somitas). B. Panel superior: señales y factores de transcripción que operan en el ectodermo del borde de la placa neural. Panel inferior: reprogramación de la expresión y direccionamiento en sentido de cresta neural y de región preplacodal. Varios estudios realizados en el embrión de pollo sobre la distribución de las áreas de expresión de diferentes proteínas señal, sus receptores, proteínas de señalización intracelular y de factores de transcripción han llevado a proponer un modelo provisorio acerca de cómo se determina y localiza el área generadora de placodas (área preplacodal) en el ectodermo del extremo cefálico del embrión. El modelo propone que el área preplacodal se determina entre el final de la gastrulación y el período somítico temprano (Estados de 2-4 somitas; Embrión de pollo). Según el modelo, un conjunto de señales positivas (estimulantes del desarrollo) y negativas (inhibitorias del desarrollo) contribuyen a determinar el área preplacodal y a localizarlo entre el territorio correspondiente a la crestas neural craneal y el resto del ectodermo epidérmico. En el lado derecho de la figura SC 11-4-1A se muestra que las proteínas señal Cer, Dan, Fgf y otras, generadas en el mesodermo subyacente en el área preplacodal participan positivamente en la determinación y el desarrollo del área preplacodal. Por el contrario, el mesodermo de las regiones lateral y caudal generan la proteína señal Wnt que inhibe la evolución en sentido preplacodal. En el lado izquierdo de la figura SC 11-4-1A se ilustra que

el ectodermo de las regiones lateral y caudal y los pliegues neurales también generan señales inhibitorias (Wnt y Bmp) que contribuyen a limitar y localizar la extensión del área preplacodal. Por el contrario, el factor Fgf y otras proteínas inhibitorias de Wnt y BMP protegen al área preplacodal de la acción inhibitoria de estas últimas y permiten la formación de poblaciones celulares precursoras de placodas. En el esquema B de la figura SC 11-4-1 se ilustra parcialmente el proceso de determinación progresiva y refinamiento de la región. En el panel superior se indica que tanto las señales Fgf como Bmp actúan conjuntamente promoviendo la expresión de una combinatoria de factores de transcripción que caracteriza a la región borde de la placa neural. A partir de esta combinatoria de factores de transcripción, las células pueden experimentar reprogramaciones que las guían a determinarse en sentido de cresta neural o, por el contrario, a determinarse en área preplacodal. Como se ilustra en el panel inferior, esta dicotomía depende de si las células se hallan en una zona con niveles locales altos de actividad de las señales Bmp y Wnt o, por el contrario, en una zona con niveles locales altos de actividad de sus inhibidores (proteínas anti-Bmp y anti-Wnt). De las relaciones entre estas actividades contrapuestas depende que las células de la zona de transición placa neural-ectodermo epidérmico se determinen en zona precursora de placa neural o área preplacodal.

Bibliografía Streit A. (2007). The preplacodal region: an ectodermal domain with multipotential progenitors that contribute to sense organs and cranial sensory ganglia. Int J Dev Biol 51(6-7):447-61. Litsiou A, Hanson S, Streit A. (2005). A balance of FGF, BMP and WNT signalling positions the future placode territory in the head. Development 132(18):4051-62. McCabe KL, Bronner-Fraser M. (2009). Molecular and tissue interactions governing induction of cranial ectodermal placodes. Dev Biol 332(2):189-95. SC 11.5. Papel del posencéfalo y tejidos adyacentes en el patterning del otocisto. V. Flores La combinación de métodos experimentales dirigidos a la elaboración de mapas de destino y al análisis de la organización espacial de la expresión de factores de transcripción ha permitido acumular información suficiente para proponer un modelo del modo como se organiza el patterning del otocisto, vale decir, cómo se organiza en el espacio el proceso de determinación de las diferentes regiones que lo integran. Las figuras SC 11-5-1 a SC 11-5-3 ilustran modelos sobre la posible influencia del posencéfalo y otros tejidos adyacentes, en la determinación de compartimentos con diferente potencia evolutiva en el campo ótico. Este proceso de determinación se produciría en forma progresiva.

Fig. SC 11-5-1. A-C. Ilustra la fase de contacto entre placoda ótica y posencéfalo y la determinación de los compartimentos dorsal, dorsal-cefálico y dorsal-caudal en relación con las rombómeras 5 y 6 (flechas).

Fig. SC 11-5-2. A-B. Ilustra la determinación de los compartimentos medial y lateral durante la invaginación de la placoda ótica y formación del otocisto. La zona ventral aún indeterminada será la futura región sensorial.

Fig. SC 11-5-3. La serie de esquemas ilustra el proceso de cierre de la fosa ótica, en el polo dorsal del otocisto, y la redistribución espacial de sus compartimentos diferentemente determinados. Éstos expresan diferentes patrones de expresión de señales y factores de transcripción. Establecimiento de los compartimentos cefálico-medial y caudal-medial. La figura SC 11-5-1 A muestra que las superficies basales de la porción medial-dorsal de la placoda y del posencéfalo se hallan en íntimo contacto pues carecen de una membrana basal bien desarrollada (línea de puntos). Se considera que este hecho permite o facilita las interacciones entre ambas poblaciones celulares. Durante esta etapa temprana se imprimiría en la placoda, por la acción de señales provenientes del posencéfalo (flechas), el carácter medial o propiedades de lugar mediales. Durante dicho contacto se instalaría también un borde de determinación diferente entre las propiedades cefálica y caudal en la zona medial de la placoda. En las figuras SC 11-5-1 B y C se ilustra que los límites entre sucesivas rombómeras están instalados por la expresión regional alternante y nítidamente delimitada de las proteínas receptores Ephs y sus proteínas ligandos ephrinas. Obsérvese que la placoda ótica está en contacto directo con las rombómeras 5 y 6 y el límite entre ambas coincide con el límite entre las porciones cefálica y caudal de la placoda de la región dorsal de la placoda. Debido a ello se propone que este segundo proceso de compartimentalización de potencias podría deberse a señales determinantes (flechas) provenientes de las rombómeras 5 y 6 (flechas). Establecimiento del compartimento lateral y las zonas con competencia sensorial. La figura SC 11-5-2 muestra que durante la invaginación de la placoda ótica se genera una región longitudinal que opera como bisagra de giro entre sus mitades dorsal y ventral. Durante dicho proceso, la mitad inferior del campo ótico se aproximaría a tejidos ventrales generadores de otras señales determinantes (SC El patterning del otocisto. Organización espacial de las regiones precursoras sensoriales en la vesícula ótica). Recién entonces, como resultado de la acción de dichas señales, la porción lateral del campo ótico adquiriría la identidad correspondiente al compartimento lateral. Esto ocurriría mientras la placoda se invagina y adquiere forma de copa. La zona profunda de la copa, ubicada entre los compartimentos medial y lateral, se determinaría luego en sentido sensorial. Si bien se desconoce con exactitud la naturaleza y el origen de estas señales, se sabe que existen conjuntos se señales de diferente origen que se expresan durante estos procesos y promueven la expresión de diferentes combinatorias de factores de transcripción en distintas regiones del otocisto en formación (SC 11.6. Señales difusibles y factores de transcripción involucrados en la determinación de la placoda ótica).

Cierre de la fosa ótica y redistribución de compartimentos. Durante el cierre de la fosa ótica, las regiones con diferente identidad arriba mencionadas (compartimento o cuadrantes cefálico-medial y caudal-medial, la mitad ventral y la zona sensorial) sufren cambios de posición relativa y terminan ordenándose como ilustra la figura SC 11-5-3. En la zona de cierre, que pasa a ocupar una posición dorsal, confluyen y entran en contacto los tres primeros compartimentos señalados. Las regiones sensoriales pasan a ocupar entonces las regiones ecuatorial y ventral del otocisto. Es probable que estas últimas sean las que generan las células que se liberan del otocisto y pasan a formar parte de las neuronas sensoriales primarias de los ganglios acústico y vestibular.

Bibliografía Bok J, Bronner-Fraser M, Wu DK. (2005). Role of the hindbrain in dorsoventral but not anteroposterior axial specification of the inner ear. Development 132:2115-24. Brigande JV, Iten LE, Fekete DM. (2000). A fate map of chick otic cup closure reveals lineage boundaries in the dorsal otocyst. Dev Biol 227:256-70. SC 11.6. Señales difusibles y factores de transcripción involucrados en la determinación de la placoda ótica. V. Flores La inducción y ulterior desarrollo de la placoda ótica a partir del ectodermo preplacodal depende de una sucesión de procesos de señalización mediados por señales generadas en varios tejidos adyacentes al campo ótico. La inducción y localización temprana del campo ótico dentro del área preplacodal depende, al menos en parte, de la secreción de la proteína señal Fgf3 a partir del posencéfalo (SC La extensión del campo ótico y la determinación y localización de la placoda ótica. Papel del factor de crecimiento fibroblástico 3). En relación con esta señalización, las células del campo ótico, a su vez, se caracterizan por la expresión de una combinatoria típica de factores de transcripción de los tipos Dlx y Fox (Dlx3, Dlx4, Sox9, Foxi1). El Fgf3 no es la única señal de esta familia que se secreta en la región y que influye en el patterning del otocisto; por ejemplo, el mesénquima periótico, ubicado entre el posencéfalo y el área preplacodal también, cumple un papel importante en esta señalización ya que secreta las proteínas Fgf 10, 15 y 19. Se considera que la expresión combinada de todos los Fgf (3, 10,15 y 19) secretados por el posencéfalo y el mesénquima preótico constituye un código de señales Fgf que estimula el desarrollo de la placoda ótica y, además, contribuye a generar una expresión diferencial espacialmente organizada de factores de transcripción que establece varios compartimentos diferentemente determinados (SC Expresión combinatoria de factores de transcripción y especificación de compartimentos en el otocisto). A continuación se agregan otros fenómenos de señalización que agregan mayor especificidad regional al otocisto. Por ejemplo, la secreción de la proteína señal Shh, por parte de la notocorda y la placa del piso del tubo neural, tiene un rango de alcance que llega hasta el otocisto en formación. En relación con esta estimulación, que alcanza a la región ventral del otocisto, esta región inicia la expresión de ciertos factores como, por ejemplo, el factor de transcripción Six1 que, al parecer, participa en determinar la identidad de dicha región o compartimento. Existen resultados experimentales que muestran que una variedad de otros factores de transcripción se expresan en regiones definidas del otocisto y contribuyen a especificar combinatoriamente los diferentes compartimientos del otocisto (SC Expresión combinatoria de factores de transcripción y especificación de compartimentos en el otocisto).

Fig. SC 11-6-1. Modelo del patterning del otocisto mediado por una combinatoria de proteínas señal secretadas por distintas poblaciones organizadoras cercanas al campo ótico y de expresión diferencial de factores de transcripción. La organización espacial de las señales genera una organización espacial de diferentes compartimentos en el otocisto. Código: A. Posencéfalo: FGF3, ectodermo preplacodal: expresa Dlx3, Dlx4, Sox9, Foxi1. B. El mesénquima periódico: produce FGF 10-19-15. C. La expresión combinada de FGF3 y FGF10-19-15 genera un código que induce el desarrollo placodal en una región específica del ectodermo. D. La región ventral se especifica por la expresión combinada de Six1 en el otocisto y por la expresión a distancia de Shh proveniente de la placa del piso y notocorda. Bibliografía Barald KF, Kelley MW. (2004). From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development 131:4119-30. Álvarez Y, Alonso MT, Vendrell V, Zelarayán LC, Chamero P, Theil T, Bösl MR, Kato S, Maconochie M, Riethmacher D, Schimmang T. (2003). Requirements for FGF3 and FGF10 during inner ear formation. Development 130:6329-38.

SC 11.7. Un modelo de compartimentos y fronteras (bordes) para explicar el patterning y la morfogénesis del oído interno. V. Flores, M. Rapacioli El proceso de morfogénesis que sufre el epitelio del otocisto, que lo lleva a transformarse en el revestimiento epitelial del laberinto membranoso, está entre los más difíciles de explicar. Basta considerar la a) complejidad estructural del laberinto membranoso, b) la diversidad de tejidos y células que lo componen, c) la disposición espacial de cada una de ellas y d) la armonía estructural requerida para una correcta integración estructurafunción para notar cuántos y cuán complejos deberían ser los cambios a fin de que una pequeña esfera epitelial origine todos esos componentes adecuadamente ensamblados. Los CCD que cumplen las células del otocisto se hallan temporoespacialmente organizados por medio de la acción de varias poblaciones celulares señalizadoras localizadas en las adyacencias del otocisto y que imprimen polaridades (ejes) y determinan compartimentos en la estructura del otocisto (SC 11.5. Papel del postencéfalo y tejidos adyacentes en el patterning del otocisto; SC 11.6. Señales difusibles y factores de transcripción involucrados en la determinación de la placoda ótica). Estas polaridades derivan de las propias polaridades céfalo-caudal, medio-lateral y dorso-ventral global del embrión. Las polaridades mencionadas se traducen, a continuación, en las diversas combinatorias de factores de transcripción que definen diversos dominios o compartimentos del otocisto (SC Expresión combinatoria de factores de transcripción y especificación de compartimentos en el otocisto). Con el objeto de analizar el patterning del otocisto, desde el punto de vista teórico, se pueden considerar, como referencia espacial, los tres planos perpendiculares a cada uno de los ejes o polaridades arriba especificados: cfcd, d-v y md-lt. Estos tres planos son perpendiculares entre sí y cada uno de ellos divide al otocisto en dos hemisferios. Vale decir, los planos son concebidos como fronteras entre hemisferios homónimos a los ejes mencionados. Así, un plano perpendicular ‒el eje céfalo-caudal (o anteroposterior)‒ corresponde a la frontera entre los hemisferios cefálico (anterior) y caudal (posterior). Otros dos planos, perpendiculares a los ejes md-lt y d-v antes mencionados, corresponden a las fronteras entre los hemisferios medial y lateral, por un lado, y entre los hemisferios dorsal y ventral, por otro. Como puede apreciarse en la figura SC 11-7-1, la intersección entre esos tres planos o fronteras determinan en la superficie esférica del otocisto ocho compartimentos teóricos denominados octantes.

Fig. SC 11-7-1. Visión anteromedial del otocisto derecho. Ilustra la ubicación de las tres fronteras y los 8 compartimentos, resultantes de las intersecciones entre los tres planos. Se ha supuesto que los compartimentos teóricos mencionados podrían corresponder a otras tantas poblaciones celulares diferentemente determinadas de acuerdo con un código instalado por la combinatoria de las influencias recibidas de los tres ejes espaciales. La figura SC 11-7-1 A muestra una visión anteromedial (del otocisto derecho), la ubicación de las tres fronteras antes mencionadas (cf-cd, md-lt y d-v) y los 8 compartimentos, resultantes de las intersecciones de los tres planos. El conducto endolinfático nace cerca del polo dorsal pero en el hemisferio medial de éste. La frontera cf-cd dividiría e conducto endolinfático en dos mitades homónimas, una mitad cefálica y una caudal. La figura SC 11-7-2 muestra un modelo, basado en mapas de destino realizados en diversas especies, en el que se señalan distintas regiones del laberinto originadas a partir de algunas de las regiones identificadas en la superficie del otocisto. Algunas de estas derivaciones son hipotéticas ya que no existen datos precisos y constantes al respecto y sí algunas dudas con respecto a la localización precisa de las poblaciones precursoras sensoriales en el otocisto, que están representadas en color gris.

Fig. SC 11-7-2. Modelo, basado en mapas de destino realizados en diversas especies, en el que se señalan distintas regiones del laberinto originadas a partir de algunas de las regiones identificadas en la superficie del otocisto. Bibliografía Fekete DM, Wu DK. (2002). Revisiting cell fate specification in the inner ear. Curr Opin Neurobiol 12(1):35-42. Represa J, Frenz DA, Van De Water TR. (2000). Genetic Patterning of Embryonic Inner Ear Development. Acta Otolaryngol 120(1):5-10.

Capítulo 12. Desarrollo del sistema endócrino

SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 12.1. Organización espacial de la determinación de linajes celulares adenohipofisarios. V. Flores SC 12.2. La expresión temporal y espacialmente organizada de combinatorias de factores de transcripción durante la determinación de linajes celulares de la adenohipófisis. V. Flores SC 12.3. La morfogénesis hipofisaria y la determinación progresiva de los tipos celulares de la adenohipófisis. V. Flores, M. Rapacioli SC 12.4. Bases moleculares y celulares de la patogenia del síndrome de Kallman. V. Flores SC 12.5. Las etapas del desarrollo de la corteza suprarrenal. Cronología de los cambios histogenéticos. V. Flores SC 12.6. La función de la corteza suprarrenal fetal y la diferenciación posnatal de la corteza definitiva. V. Flores SC 12.1. Organización espacial de la determinación de linajes celulares adenohipofisarios. V. Flores

La hipófisis está compuesta por varios tipos celulares que sintetizan y secretan las distintas hormonas hipofisarias. Estos diferentes tipos celulares se generan en un orden temporal y espacial bien definido a partir de un esbozo epitelial aparentemente homogéneo, la bolsa hipofisaria. Existe evidencia experimental de que en tal ordenamiento temporal y espacial están involucradas vías de señalización generadas a partir de tejidos adyacentes que operan como centros señalizadores: a) el infundíbulo del diencéfalo que inicialmente secreta la proteínas señal Bmp4 y más tarde la proteína Fgf8 y b) el mesénquima ventral yuxtahipofisario que secreta las señales Bmp2 y Bmp7. Durante mucho tiempo prevaleció la idea de que cada tipo celular de la hipófisis secreta exclusivamente una hormona y que deriva de un linaje celular completamente independiente de los otros. Tal idea ha cambiado sustancialmente. En la actualidad se sabe que existe una regulación combinatoria de la determinación celular, que tal proceso implica la expresión de diferentes combinatorias de factores de transcripción para diferentes tipos celulares y que ello revela una deriva de diferentes tipos celulares a partir de precursores comunes de diversa jerarquía (SC El árbol genealógico de las células endocrinas de la adenohipófisis). Tales factores de transcripción tienen como blancos específicos a genes que codifican hormonas y genes que codifican enzimas necesarias para las síntesis de hormonas. Se han descrito tres vías principales de citodiferenciación que se ejecutan en forma espacialmente estructurada. Vale decir, las diferentes vías tienen territorios de expresión definidos dentro del esbozo de la adenohipófisis. a) Las células que ocupan la región profunda de la fosa hipofisaria cursan la vía de diferenciación de las células corticotropas (productoras de ACTH y MSH) y en su determinación están involucradas las proteínas genéricamente denominadas como Cute (Corticotropin upstream transcription-binding elements) entre los cuales se incluyen los factores transcripción NeuroD1/Β2. b) Las células que ocupan la región intermedia de la fosa hipofisaria cursan preferentemente la vía de diferenciación de las células somatotropas, somatomamotropas, lactotropas y tirotropas. Derivan de una población celular precursora que expresa el factor de transcripción Pit-1. De esta población celular, las que adicionalmente expresan el receptor de estrógeno ERα secretan especialmente la hormona prolactina; las que adicionalmente expresan el factor de transcripción embrionario tirotrofo (Tef) secretan principalmente la hormona estimulante de la tiroides o Tsh. En sentido estricto el factor Tef estimula la expresión de la subunidad Tsh-β de la hormona Tsh. c) Las células que ocupan la región superficial de la fosa hipofisaria cursan la vía de diferenciación de las células gonadotropas bihormonales y en su determinación está involucrado el factor de transcripción esteroidogénico (Sf-1). Esta organización espacial de la citodiferenciación se basa en un proceso previo de expresión, también espacialmente organizada, de determinaciones mediadas por la expresión combinatoria de factores de transcripción (SC 12.2. La expresión temporal y espacialmente organizada de combinatorias de factores de transcripción durante la determinación de linajes celulares de la adenohipófisis). Es interesante que estas combinatorias de factores de transcripción y sus efectos sobre la secreción de hormonas son coherentes con datos conocidos sobre el comportamiento secretorio de adenomas hipofisarios y proveen de un marco apropiado para clasificarlos desde el punto de vista patogénico.

Bibliografía Asa SL, Ezzat S. (1999). Molecular Determinants of Pituitary Cytodifferentiation. Pituitary 1(3-4):159-68.

Ericson J, Norlin S, Jessell TM, Edlund T. (1998). Integrated FGF and BMP signaling controls the progression of progenitor cell differentiation and the emergence of pattern in the embryonic anterior pituitary. Development 125(6):1005-15. SC 12.2. La expresión temporal y espacialmente organizada de combinatorias de factores de transcripción durante la determinación de linajes celulares de la adenohipófisis. V. Flores El proceso de determinación de tipos celulares hipofisarios se halla espacialmente organizado por medio de dos centros organizadores que instalan gradientes de señales, uno dorsal o profundo y uno ventral o superficial. Entre ambos, de un modo dependiente de concentración, instalan tres regiones principales en las que se expresan diferentes combinatorias de factores de transcripción. La figura SC 12-2-1A-B ilustra un modelo sobre cómo se estructura en el espacio el proceso de determinación de linajes celulares hipofisarios (ratón). El ectodermo del techo del estomodeo con competencia para formar placoda hipofisaria se caracteriza por la expresión de la proteína señal Shh y el factor de transcripción P-Otx (a). Las señales Wnt5a y Bmp4 generadas en el neuroepitelio del piso del diencéfalo (centro organizador dorsal)(esbozo de la neurohipófisis) suspenden la expresión de Shh y activan la expresión del factor de transcripción P-Lim/Lhx3 en la zona adyacente del ectodermo (b). Se forma así la placoda hipofisaria (esbozo de la adenohipófisis) y se inicia la invaginación de la fosa hipofisaria (bolsa de Rathke). La frontera entre las zona Shh positiva y la zona Shh negativa que delimita la entrada a la fosa hipofisaria se transforma en centro organizador ventral y secreta la proteína señal Bmp2.

Fig. SC 12-2-1. Modelo sobre la instalación de un proceso espacialmente organizado de determinación celular en la bolsa hipofisaria. La existencia de gradientes cruzados de señales con efectos contrapuestos, generadas a partir de centros de señalización dorsales y

ventrales posibilitan la aparición de subpoblaciones celulares diferentemente determinadas en distintas regiones, profunda, media y superficial, del la bolsa hipofisaria. Más tarde (c), cuando se profundiza la bolsa hipofisaria y se forma el infundíbulo, éste opera como centro señalizador de Fgf8 y el centro organizador ventral incrementa su secreción de la proteína señal Bmp2. Se generan así dos gradientes: un gradiente DV de Fgf8 y uno VD de Bmp2. Ambos gradientes generan una expresión diferencial de factores transcripción “de expresión dorsal” y “de expresión ventral” que instalan zonas con diferente identidad (Fig. SC 12-2-1 C y Fig. SC 12-2-2). Se propone que la expresión espacialmente estructurada de las combinatorias de factores de transcripción mostradas en la figura SC 12-2-2, que ocurre durante este período del desarrollo, explica la aparición de distintos tipos de células hipofisarias en distintas regiones de la adenohipófisis (d). En (d) se ilustra que, a continuación, el gradiente VD de Bmp2 es reforzado por la secreción de dicha señal en el mesénquima ventral a la vesícula hipofisaria y que, además, la acción de Bmp2 es contrarrestada por la acción de señales caudales, como la proteína señal cordina, que ahora es secretada por células del extremo anterior del mesodermo cordal y por la señal Fgf8 cuya expresión se desplaza hacia la zona caudal de la vesícula hipofisaria debido al crecimiento del infundíbulo. Este hecho instala también diferencias a lo largo del eje céfalo-caudal (anteroposterior) de la fosa hipofisaria que se revelan por el modo como se distribuyen los diferentes tipos celulares. Así: En la región profunda y caudal se determinan células melatonotropas. En la región profunda y cefálica, células corticotropas. En la región intermedia se forman células lactotropas y somatotropas. En la región superficial y cefálica se determinan células tirotropas y en la región superficial y caudal se determinan células gonadotropas.

Fig. SC 12-2-2. La figura muestra cómo las señales dorsales y ventrales estimulan la expresión de diferentes factores de transcripción y, dependiendo del rango de acción de dichos efectos (flechas verticales ascendentes y descendentes), en distintas regiones del epitelio de la fosa hipofisaria se expresan diferentes combinatorias de factores de transcripción. Ello hace que dichas regiones den origen a diferentes tipos celulares cuya distribución espacial depende de la de los factores de transcripción que los determinan. Bibliografía Pulichino AM, Vallette-Kasic S, Tsai JP, Couture C, Gauthier Y, Drouin J. (2003). Tpit determines alternate fates during pituitary cell differentiation. Genes Dev 17(6):738-47. Le Bot N. (2012). A pituitary gland in a dish. Nature Cell Biol Research Highlights 14:50. doi:10.1038/ncb2416. Treier M, Gleiberman AS, O'Connell SM, Szeto DP, McMahon JA, McMahon AP, Rosenfeld MG. (1998). Multistep signaling requirements for pituitary organogenesis in vivo. Genes Dev 12:1691-1704 SC 12.3. La morfogénesis hipofisaria y la determinación progresiva de los tipos celulares de la adenohipófisis. V. Flores, M. Rapacioli El proceso de determinación progresiva de los diversos tipos celulares de la adenohipófisis se relaciona estrechamente con los cambios morfogenéticos tempranos. Dado que la citogénesis de la glándula depende de interacciones con varios centros señalizadores que circundan el esbozo, los cambios morfogenéticos que éste sufre implican cambios de posición que hacen que diferentes regiones se acerquen, se pongan en contacto estrecho y reciban señales de los centros señalizadores que imprimen el patterning del esbozo. El proceso global, morfogenético e histogenético, ha sido categorizado como un proceso multi-paso con eventos definidos en cada uno de ellos. Fase 1. Consiste en la determinación de la placoda hipofisaria en una zona restringida del ectodermo del techo del estomodeo. El evento sobresaliente es la activación de la vía del Bmp4 en las células del ectodermo estimulado por la secreción de dicha señal por las células de la línea media del diencéfalo ventral. Esta acción lleva a la abolición de la expresión de la señal Shh (típica del ectodermo) por el inicio de la expresión de los factores de transcripción Rpx (Hesx1), Pitx e Isl1. Así se determina la placoda hipofisaria y se inicia su invaginación y la formación de la fosa hipofisaria (Fig. SC 12-3-1 A). Fase 2. La formación de la fosa hipofisaria (Rathke) hace que el centro de la placoda, que pasa a ser el fondo de la fosa, se profundice, se acerque al diencéfalo y refuerce la acción de las señales dorsales. Al mismo tiempo, la región periférica de la placoda queda en la superficie y se aleja de las señales dorsales. En simultáneo se agregan más señales al proceso. En el diencéfalo se agrega la liberación de la señal factor de crecimiento fibroblástico 8 o Fgf8, mientras que las células del borde de la placoda, que quedan bordeando el orificio de la fosa, expresan la proteína señal Bmp2. Estos cambios de posición de dos centros señalizadores, uno dorsal y otro ventral, llevan a la formación de dos gradientes cruzados de las señales mencionadas. Las células que quedan ubicadas en diferentes posiciones de dichos gradientes sufren diferentes procesos de reprogramación genética y expresan diferentes factores de transcripción. Típicamente, las células profundas expresan el factor de transcripción Pax6 y las superficiales expresan el factor de transcripción Gata2 (>Fig. SC 12.3.1B). Otros factores de transcripción acompañan a los mencionados y conforman los dos dominios superficial y

profundo. Cada uno de estos dominios generarán células progenitoras que originan diferentes conjuntos de células endocrinas y que secretan diferentes categorías de hormonas. Fase 3. De especificación de precursores de células endocrinas. Durante esta fase se especifican las tres zonas citogenéticas principales de la adenohipófisis. A los centros señalizadores superficial (Bmp2) y profundo (Fgf8) se agrega, en la región caudal de la fosa, la secreción de la proteína señal cordina a partir del extremo anterior del mesodermo axil cordal (Fig. SC 12-3-1 C). Se definen así tres regiones delineadas por tres combinatorias diferentes de factores de transcripción indicadas en lafigura Sc 12-3-1 C. La zona profunda o adenohipófisis dorsal, caracterizada por la expresión de Pax6 y otros factores, se halla poblada por precursores Pomc; la zona superficial o hipófisis ventral, caracterizada por la expresión de Gata2, genera precursores α-Gsu. Entre ambas queda una zona intermedia, caracterizada por la expresión del factor de transcripción Pit1 que genera otros precursores, pero relacionados con los de la zona superficial. Fase 4. Durante esta fase a) disminuye significativamente la actividad proliferativa de las poblaciones de células precursoras y b) se inicia la expresión génica diferencial, en cada uno de los grupos precursores, de modo que a partir de cada uno de ellos se determinan cada uno de los tipos celulares correspondientes a las ramas terminales del árbol genealógico. Los precursores Pomc originan a las células corticotropas y melanotropas. El grupo precursor superficial α-Gsu da origen a las células gonadotropas y tirotropas. Las células del grupo intermedio, que algunos clasifican también como derivados tardíos del grupo α-Gsu, dan origen a las células somatotropas y lactotropas. Durante esta fase se definen también las regiones topográficas de la glándula y la distribución definitiva de los diversos tipos celulares (Fig. SC 12-3-1 D).

Fig. SC 12-3-1. Representación esquemática de la organización espacial del proceso de determinación progresiva de los tipos celulares de la adenohipófisis. Se ilustran fases sucesivas del proceso morfogenético e histogenético. Descripción en el texto. Bibliografía Rosenfeld MG, Briata P, Dasen J, Gleiberman AS, Kioussi C, Lin C, O'Connell SM, Ryan A, Szeto DP, Treier M. (2000). Multistep signaling and transcriptional requirements for pituitary organogenesis in vivo. Recent Prog Horm Res 55:1-13. Cohen LE, Radovick S. (2002). Molecular basis of combined pituitary hormone deficiencies. Endocr Rev 23(4):431-42. Kioussi C, Carrière C, Rosenfeld MG. (1999). A model for the development of the hypothalamic-pituitary axis: transcribing the hypophysis. Mech Dev 81(1-2):23-35. Dasen JS, Rosenfeld MG. (2001). Signaling and transcriptional mechanisms in pituitary development. Annu Rev Neurosci 24:327-55. Kioussi C, O'Connell S, St-Onge L, Treier M, Gleiberman AS, Gruss P, Rosenfeld MG. (1999). Pax6 is essential for establishing ventral-dorsal cell boundaries in pituitary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A 96(25):14378-82. SC 12.4. Bases moleculares y celulares de la patogenia del síndrome de Kallman. V. Flores Desde fines del siglo xviii se conoce un síndrome clínico que incluye hipogonadismo (desarrollo deficitario de gónadas y órganos genitales), ausencia de nervios olfatorios, anosmia (falta de olfato), ocasionalmente, con aplasia renal (falta de desarrollo del riñón) y algunos otros síntomas (Krafft-Ebing, 1886). Este síndrome es, en la actualidad, denominado síndrome de Kallman. La patogenia del síndrome, integrado por anomalías fenotípicas tan disímiles y, aparentemente, inconexas se explica teniendo en cuenta que a lo largo de la evolución biológica el sentido del olfato y la reproducción evolucionaron en forma asociada. El olfato desempeña un papel importante en la madurez de la conducta sexual de la mayor parte de las especies. Recién a fines del siglo pasado, a partir de estudios realizados en ratón y mono, e incluso en el hombre, se empezó a dilucidar, en parte, la patogenia del síndrome de Kallman. Desde el punto de vista tisular u orgánico, el síndrome tiene como causa primaria una falla en el desarrollo de la placoda olfatoria, hecho que ocurre durante el período somítico. Normalmente, la placoda olfatoria origina neuronas sensoriales primarias sensibles a los olores (neuronas olfatorias). Éstas residen en el propio epitelio olfatorio de la mucosa nasal derivado de la placoda y emiten sus axones, que integran el nervio olfatorio. Éste se halla integrado por fascículos que atraviesan la lámina cribosa del etmoides y llegan al bulbo olfatorio (rinencéfalo). Allí, los axones de las neuronas sensoriales primarias establecen sinapsis con neuronas sensoriales secundarias. Las neuronas secundarias, a su vez, envían sus axones, a través de los tractos olfatorios a las estructuras corticales del rinencéfalo (Fig. 1). Un dato importante en la génesis de este cuadro compuesto de anosmia a hipogonadismo deriva del hecho de que el desarrollo y la sobrevida de las neuronas olfatorias secundarias del bulbo olfatorio depende de los estímulos nerviosos y señales provenientes de las neuronas olfatorias primarias. En la mayor parte de los vertebrados, la placoda olfatoria posee una región definida que origina un órgano quimiorreceptor denominado órgano vomeronasal. Éste cumple una función central en la conducta reproductiva de la mayor parte de los mamíferos ya que detecta las feromonas que permiten sincronizar la conducta reproductiva y la realización del cortejo que culmina en la cópula y ulterior reproducción. El

neuroepitelio del órgano vomeronasal también genera células precursoras neuronales que abandonan el neuroepitelio receptor olfatorio y, siguiendo el trayecto de los axones de las neuronas sensoriales secundarias del bulbo olfatorio, llegan hasta la región medial del telencéfalo. Una vez allí, colonizan el hipotálamo y se ubican, preferentemente, en el área preóptica del hipotálamo anterior. Al diferenciarse, estas neuronas sintetizan la hormona peptídica hormona liberadora de goadotrofinas (GnRH); a través de sus axones que se dirigen hacia el tallo hipofisario, la GnRH es liberada hacia los vasos del sistema porta hipofisario y llega a la adenohipófisis. La GnRH tiene como blanco (diana) a las células gonadotropas de la adenohipófisis en las que estimula la liberación de gonadotrofinas (hormona foliculoestimulante [FSH] y hormona luteinizante [Lh]). Estas hormonas son esenciales para el desarrollo gonadal y la producción de las hormonas testiculares y ováricas necesarias para la madurez sexual que acontece en la pubertad. En ausencia de las hormonas ováricas y testiculares, los órganos sexuales secundarios no se desarrollan. En la especie humana el órgano vomeronasal se desarrolla hasta la 20ª SD, aproximadamente, y luego involuciona como tal. Sin embargo, antes de ello participa del proceso arriba descrito. De esta forma se explica cómo se asocian el hipogonadismo y la anosmia que son los datos cardinales del síndrome de Kallman: la ausencia de placoda olfatoria produce anosmia y suspende la cadena de eventos descrita en el párrafo anterior que culmina la inmadurez sexual.

Fig. SC 12-4-1. La figura ilustra esquemáticamente la expresión de la proteína anosmina-1 revelada en estudios inmunocitoquímicos con anticuerpos monoclonales antianosmina-1 en embriones de ratón. En el día 11 se observa la expresión en la matriz extracelular en la región de formación del bulbo olfatorio. En esta región del rinencéfalo se forman las neuronas sensoriales secundarias que proyectan al centro. En días sucesivos, la distribución de la expresión de la anosmina sigue el trayecto de migración de los axones de las neuronas sensoriales secundarias y el de las células que desde la placoda olfatoria migran hasta el hipotálamo.

El síndrome de Kallman se debe a una mutacíón que afecta a la proteína anosmina-1 codificada por el gen Kal1. La anosmina-1 es una glucoproteína con organización modular. Algunos estudios inmunocitoquímicos con anticuerpos antianosmina-1 han permitido revelar su distribución en embriones humanos desde la 4ª a la 10ª SD. Desde la 5ª AD se expresa, como componente de la matriz extracelular, a lo largo del trayecto de migración de las células que van desde el órgano vomeronasal al hipotálamo anterior (área preótica). Como componente de la matriz extracelular, la anosmina-1 participa en procesos de adhesión intercelular, de adhesión célulamatriz extracelular, adhesión axón-axón y axón-matriz extracelular. De ahí su importancia en la migración celular desde el órgano vomeronasal hasta el hipotálamo. La anosmina cumple funciones de desarrollo más amplias que las que el propio síndrome de Kallman revela. Así, por ejemplo, durante el desarrollo de las crestas neurales, exhibe un patrón de expresión temporoespacial típico. La anosmina-1 secretada a la matriz extracelular, por un lado, exacerba la actividad de la proteína señal Fgf8 promoviendo su unión al receptor de Fgf tipo 1 y la formación del complejo Fgf8-FgfR1 y, por otro, inhibe la actividad de las proteínas señal Bmp5 y Wnt3A. Regulando estas actividades, la anosmina-1 participa en procesos de transiciones reversibles epitelio-mesenquimática y mesenquimático-epitelial durante la formación de la cresta neural y la evolución ulterior de sus células. La anosmina-1 también es expresada como proteína de superficie de algunos órganos epiteliales en desarrollo como, por ejemplo, el brote ureteral. Aquí también parece cumplir algún papel de desarrollo ya que un tercio de los mutantes que padecen el síndrome de Kallman padecen también aplasia renal.

Bibliografía Endo Y, Ishiwata-Endo H, Yamada KM. (2012). Extracellular matrix protein anosmin promotes neural crest formation and regulates FGF, BMP, and WNT activities. Dev Cell 23(2):305-16. Hardelin JP. (2001). Kallmann syndrome: towards molecular pathogenesis. Mol Cell Endocrinol 179(1-2):75-81. Bouloux PM, Munroe P, Kirk J, Besser GM. (1992). Sex and smell – an enigma resolved. J Endocrinol 133: 323-6. Schwanzel-Fukuda M. (1999). Origin and migration of luteinizing hormone-releasing hormone neurons in mammals. Microsc Res Tech 44(1):2-10. Stout RP, Graziadei PP. (1980). Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience 5(12):2175-86. Links Datos sobre investigaciones vinculadas al síndrome de Kallman se hallan en: Online Mendelian Inheritance in Man database. SC 12.5. Las etapas del desarrollo de la corteza suprarrenal. Cronología de los cambios histogenéticos. V. Flores La glándula suprarrenal adulta representa, desde el punto de vista estructural y funcional, un ejemplo de integración neuroendocrina. Posee dos regiones básicas: a) la médula, que forma parte del sistema nervioso autonómo simpático, representa un ganglio simpático modificado por el entorno esteroidogénico y secreta catecolaminas (adrenalina y noradrenalina); b) la corteza es una típica glándula endocrina con tres regiones

funcionalmente distintas que integran una red de síntesis de hormonas esteroideas (mineralocorticoides, glucocorticoides y hormonas sexuales). Todas estas hormonas medulares y corticales son esenciales para la vida y, pese a sus distintas funciones, actúan de forma integrada. La corteza suprarrenal terminalmente diferenciada posee tres zonas: una externa o glomerular (secreta aldosterona), una media o fasciculada (secreta cortisol) y una interna o reticulada (secreta andrógenos). La corteza suprarrenal fetal funciona intensamente durante el desarrollo embrionario y debido a ello sufre una hiperplasia e hipertrofia transitoria con respecto a la corteza definitiva. Su estructura, sin embargo, es más simple que la de la corteza definitiva. Su desarrollo se inicia con la formación del mesodermo intermedio y la deslaminación del mesodermo lateral en una hoja esplácnica y una somática. Las dos primeras son la principal fuente de células que forman el esbozo adrenocortical. La figura SC 12-5-1 ilustra gráficamente la cronología de los eventos histogenéticos durante el desarrollo de la glándula suprarrenal.

Fig. SC 12-5-1. Representación esquemática de las etapas histogenéticas de la glándula suprarrenal humana. Algunas células de la suprarrenal tienen un origen común con el riñón y la gónada, el mesodermo intermedio o adrenogononefrotomo. A continuación se segregan de los otros componentes y se asocian al epitelio celómico con el cual constituyen un esbozo adrenocortical. Ulteriormente se incorporan las células de la cresta neural troncal que forman el esbozo del parénquima adrenomedular. El componente epitelial del esbozo adrenocortical origina la corteza fetal y la zona definitiva. Desde este momento hasta la adrenarca, que ocurre recién a los 6 años de vida posnatal, la glándula sufre una sucesión ordenada de eventos histogenéticos. Entre estos se incluye la atrofia de la corteza fetal y el desarrollo y diferenciación de las tres capas de la corteza definitiva. Descripción en el texto. AT.: en fig.1 C cambiar Blastema adrenal => Blastema suprarrenal Las células que originan el blastema de la suprarrenal inicialmente forman parte del mesodermo intermedio que constituye un adrenogononefrotomo (Fig. SC 12-5-1 A). Estas células son identificadas, ya durante el período somítico, debido a que expresan el factor de transcripción esteroidogénico 1 o Sf1. El mesénquima del mesodermo intermedio rápidamente se escinde en un esbozo nefrógeno y un esbozo o blastema adrenogonadal (Fig. SC 12-5-1 B). Éste luego se escinde en un esbozo gonadal y un esbozo adrenocortical (Fig. SC 12-5-1 C). Este esbozo tiene un componente epitelial superficial y un blastema subyacente. Hacia la 8ª SD, las células del epitelio celómico sufren transición epitelio-mesenquimática y empiezan a introducirse en el blastema suprarrenal (Fig. SC 12-5-1 D). En la 9ª SD, la zona central del blastema es invadido por células de la cresta neural troncal constituyéndose así el esbozo adrenomedular (Fig. Sc 12-5-1 D-E). Las células del epitelio celómico del esbozo adrenocortical que invadieron el blastema se organizan entonces en dos capas alrededor del esbozo adrenomedular: una capa fetal o profunda (zona fetal) y una capa superficial o “definitiva” (precursora de las capas definitivas) que se diferencia más tarde (Fig. SC 12-5-1 F). Constituidos los esbozos adrenomedular y adrenocortical, todo el complejo es rodeado o encapsulado por tejido mesenquimático más compacto o cápsula. La zona fetal prolifera activamente y alcanza un tamaño proporcionalmente mayor que el de etapas ulteriores. La corteza aumenta en volumen hasta el 3.er trimestre de la gestación. Durante el 3.er trimestre se forma una zona de transición entre las capas o zonas fetal y “definitiva” (Fig. SC 12-5-1 G). La corteza suprarrenal empieza a producir cortisol desde la 24-26.ª SD. En el momento del nacimiento aún posee un tamaño exagerado en relación con el de la corteza suprarrenal adulta y los otros órganos (pesa el doble que la corteza suprarrenal adulta). Luego del nacimiento, la zona fetal adrenocortical involuciona rápidamente hasta desaparecer alrededor del 6.º mes de vida posnatal. Simultáneamente se van desarrollando, a partir de la zona “definitiva”, las capas glomerular (secretante de mineralocorticoides) y fascicular (secretante de glucocorticoides) de la corteza definitiva. La zona más profunda de la corteza definitiva, la capa reticular, no empieza a desarrollarse hasta los 6 años (Fig. SC 12-5-1 H-I). En ese momento se inicia la síntesis de andrógenos de origen adrenal. Dicho evento ha sido denominado “adrenarca”.

Bibliografía Sucheston ME, Cannon MS. (1968). Development of zonular patterns in the human adrenal gland. J Morphol 126:477-91.

Kempná P, Flück CE. (2008). Adrenal gland development and defects. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 22(1):77-93. SC 12.6. La función de la corteza suprarrenal fetal y la diferenciación posnatal de la corteza definitiva. V. Flores La aparición de las distintas funciones esteroidogénicas de la corteza suprarrenal sigue al desarrollo y maduración funcional de sus diversas capas. La zona fetal de la corteza despliega una activa síntesis de esteroides desde la 7.ª SD en adelante. La zona “definitiva”, que es una población celular en desarrollo, pero en latencia hasta luego del nacimiento, no produce esteroides hasta cerca del momento del nacimiento. La zona de transición empieza a sintetizar cortisol recién hacia el final del desarrollo fetal. Sólo posnatalmente se originan las tres capas de la corteza definitiva. Hay divergencias respecto de la génesis de la regionalización y de los tipos celulares que integran el parénquima de las distintas zonas. Ello se debe a que existen estudios realizados en diferentes especies que no siempre coinciden. Algunos investigadores proponen la existencia de oleadas de células diferentes a partir del epitelio celómico. Otros proponen la existencia de un patterning o regionalización previo a la formación de los diferentes tipos celulares. Según esta visión, existirían células troncales pluripotenciales en la región subcapsular y, dependiendo del lugar donde queden ubicadas sus descendientes, se diferenciarán en células de las distintas capas. Finalmente, otros postulan la existencia de subpoblaciones de células troncales progenitoras intermedias específicas para cada capa y que sus descendientes migrarían centrípetamente y se ubicarían en zonas definitivas para tipo celular. La corteza suprarrenal fetal es un centro productor de andrógenos. Las enzimas esteroidogénicas se hallan en cantidades significativas desde la 7.ª SD. Desde entonces se detecta una síntesis de cortisol que ya está sujeta a control por medio de la ACTH hipofisaria. Existe una fase transitoria de alta producción de cortisol, que se extiende desde la 8.ª a la 12.ª SD. Esta fase de alta secreción se debe a la expresión transitoria de la enzima 3βhidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (3βHSD2) durante dicho período. Esta ventana temporal es crítica para la diferenciación de los esbozos de los órganos sexuales y se ha postulado que la alta actividad de la enzima posee un efecto protector que evita la potencial virilización de los órganos genitales de los fetos femeninos. El déficit en la actividad funcional de esta enzima produce virilización. En condiciones normales, durante esta ventana temporal sólo el feto masculino produce andrógenos testiculares en cantidades suficientes para producir virilización. Luego de la 12.ª SD en la corteza fetal disminuye la enzima 3βHSD2 y las actividades enzimáticas favorecen la síntesis de andrógenos produciendo dehidroepiandrosterona (DHEA) y sulfato de dehidroepiandrosterona (S-DHEA) en abundancia. Luego del nacimiento, la zona fetal involuciona y desaparece alrededor de los 6 años. Simultáneamente, la zona definitiva junto con la transicional se desarrollan y forman las capas glomerular y fasciculada. Éstas completan su diferenciación terminal hacia los 3 años de edad. La producción posnatal de esteroides por la zona glomerular (mineralocorticoides) y por la fasciculada (glucocorticoides) no sufre cambios bruscos con la edad. Sin embargo, la producción de andrógenos por la reticular posee un patrón temporal típico. La zona reticulada recién empieza a formarse alrededor de los 4 años. Pero la producción significativa de andrógenos de origen suprarrenal, denominada “adrenarca”, sólo se inicia a los 6-8 años de edad. La zona reticulada tiene un largo desarrollo posnatal y su diferenciación terminal se logra recién alrededor de los 15

años. Desde los 30 años se produce una declinación en la secreción de andrógenos suprarrenales, denominada “adrenopausia”, que se acentúa con la edad.

Bibliografía Kempná P, Flück CE. (2008). Adrenal gland development and defects. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 22(1):77-93. Chamoux E, Breault L, Lehoux JG, Gallo-Payet N. (1999). Involvement of the Angiotensin II Type 2 Receptor in Apoptosis during Human Fetal Adrenal Gland Development. J Clin Endocrinol Metab 84(12): 4722-30. Ishimoto H, Jaffe RB. (2011). Development and Function of the Human Fetal Adrenal Cortex: A Key Component in the Feto-Placental Unit. Endocr Rev 32: 317-55.

Capítulo 13. Desarrollo del aparato de la contención neurosensorial: cabeza y cuello SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 13.1. La cefalización. La hipótesis de la nueva cabeza. La aparición y evolución de la cresta neural (CN) craneal. V.Flores SC 13.2. El síndrome de deleción 22q11.2 (DiGeorge). Síndromes con alteraciones fenotípicas combinadas. V. Flores, J. Halfón SC 13.3. Morfogénesis dental. El código homeótico odontogenético y las proteínas señal asociadas. V. Flores, J. Halfón SC 13.4. La disostosis mandibulofacial o síndrome de Treacher Collins (STC). Bases celulares y moleculares de su patogenia. V. Flores, J. Halfón SC 13.5. El patterning de la región craneofacial I. Proteínas señal y factores de transcripción involucrados en la especificación de la cresta neural craneal y sus derivados. J. Halfón, V. Flores SC 13.6. El patterning de la región craneofacial II. Factores de transcripción y factores de crecimiento intervinientes. J. Halfón, V. Flores

SC 13.1. La cefalización. La hipótesis de la nueva cabeza. La aparición y evolución de la cresta neural (CN) craneal. V.Flores Se postula que el proceso de cefalización, en la línea evolutiva que corresponde a los vertebrados (cordados superiores), se inició desde los procordados en adelante. El proceso de cefalización consistió en una diversidad de cambios adaptativos vinculados al desplazamiento en una dirección preferencial y a la concentración de funciones de recepción (órganos de los sentidos especializados), de integración y procesamiento de información proveniente del medioambiente y elaboración de respuestas (hemisferios cerebrales) en la región cefálica. La cefalización se acompañó de la aparición de nuevas estructuras óseas, cartilaginosas y conectivas que conformaron el aparato de la contención neurosensorial que forma las cubiertas protectoras del encéfalo y los órganos de los sentidos, vale decir, buena parte del cráneo y la cara con todas las cavidades (órbitas oculares, fosas nasales, cavidad bucal, laberinto óseo). Todas estas estructuras se formaron a partir de una población celular “nueva”, la CN preótica, que apareció y evolucionó desde los Agnatos (peces sin mandíbula) en adelante y que adquirió características de desarrollo similares, en alguna medida, a las del mesodermo. De acuerdo con la hipótesis evolutiva denominada de la Nueva Cabeza, los vertebrados (cordados superiores) evolucionaron a partir de un cefalocordado, similar al anfioxo actual, que pudo haber sido la transición entre los urocordados y los vertebrados. Urocordados y cefalocordados son subtipos del clado Procordados. Los cefalocordados son animales cilíndricos, con una cuerda dorsal o notocorda que se extiende hasta el extremo cefálico; de ahí su designación taxonómica. Poseen un sistema nervioso, ubicado dorsalmente a la cuerda dorsal, formado por un cordón nervioso y con una vesícula cerebral en el extremo cefálico. Estos animales carecen de cráneo y de mandíbulas, de ahí que se denominan también Acranios y son clasificados entre los Agnatos. La boca posee cirros móviles que desplazan partículas alimenticias hacia el interior del tubo digestivo. Este animal precursor de los vertebrados, al igual que el anfioxo, carecería de vesículas telencefálicas y de la musculatura que mueve el agua a través de las branquias. De acuerdo con la hipótesis mencionada, el salto evolutivo significativo consistió en un cambio en el carácter filtrador de agua por el de predador. Esta nueva característica incluyó el desarrollo de órganos de los sentidos más desarrollados para la detección de la presa, nuevas estructuras neurales para procesamiento de información y elaboración de respuestas y un aparato mandibular de rápida respuesta para la captura de la presa. El desarrollo de todas estas estructuras de recepción de estímulos y de procesamiento de información neural se acompañó del desarrollo de estructuras conectivas, cartilaginosas y óseas que operarán de contención de las nuevas estructuras neurales. Un supuesto central de esta hipótesis es que algún o algunos tipos celulares ya presentes en las especies predecesoras tuvieron que haber evolucionado en relación con la aparición y evolución de la cabeza. Una de tales poblaciones celulares podría haber sido precursora de las actuales células de la CN preótica. Las ascidias, urocordados primitivos, poseen un tipo celular que se origina a partir del tubo neural, que migra y luego se diferencia en células pigmentarias. Estas células expresan proteínas, como hnk y Zic1, que algunos autores consideran marcadores de células de CN. Tales células serían precursoras filogenéticas de la CN que, a lo largo de la evolución, fueron adquiriendo mayor potencia evolutiva y nuevas formas de evolución ontogenética. Se propone que los primeros vertebrados pudieron haber sido similares a los actuales peces sin mandíbula (Agnatos, Fig. SC 13-1-1), como las lampreas actuales que son agnatos pero ya poseen CN. Estos peces, aunque no tienen mandíbulas, poseen la boca circundada por labios superiores e inferiores en cuyo desarrollo participan células de la CN preótica correspondiente a las regiones proencefálica y mesencefálica del SNC.

En los peces con mandíbulas (teleósteos), que corresponderían a un estado más avanzado de la evolución filogenética, los arcos faríngeos que originan las mandíbulas derivan de porciones más caudales de la CN. A lo largo de la evolución filogenética se habrían producido mutaciones que derivaron en cambios en la expresión de genes Hox y Dlx que están involucrados en el patterning de estructuras derivadas de CN. Entre Agnatos (peces sin mandíbula) y Gnatostoms (desde peces con mandíbulas hasta mamíferos) (véase Fig. SC 131-1) existen cambios regionales en la expresión de la proteína señal y factor de crecimiento Fgf8 en la epidermis del extremo cefálico. El Fgf8 es un regulador de la expresión de la proteína factor de transcripción Dlx1 tanto en Agnatos como Gnatostomados. Entre Agnatos y Gnatostomados también existen diferencias regionales en la expresión de genes Hox. En los Agnatos (cefalocordados como los anfioxos y cordados primitivos como las lampreas), la expresión de genes Hox se extiende cefálicamente hasta el primer arco branquial. En la mayoría de los gnatostomados, la expresión de genes Hox llega sólo hasta el segundo arco branquial. En los mamíferos, la porción más cefálica de la CN craneal, desde la región diencefálica hasta el segmento correspondiente a r2, es Hox negativa. Ésta es la región de CN craneal encargada de formar todo el aparato de la contención neurosensorial constituido por cráneo y cara. Así, además de los cambios regionales en la expresión del Fgf8 y de factores de transcripción Dlx, la pérdida de la expresión de factores de transcripción Hox en la CN craneal también sería causa del cambio de destinos o de nuevas formas de evolución ontogenética de células de la región cefálica de la CN craneal.

Fig. SC 13-1-1. Esquema que ilustra que algunos agnatos, como la lamprea, poseen crestas neurales. El esquema ilustra también que en la mayoría de los Agnatos la expresión de genes Hox se extiende hasta el primer arco branquial (1.er AB) mientras que en los Gnatostomados las células del 1.er AB son Hox. Modificado de Helms y cols., 2005. La CN preótica, por un lado, retuvo algunas características de desarrollo de la CN posótica y por ese motivo tienen la capacidad de originar células pigmentarias (melanocitos), neuronas sensoriales primarias y células gliales de los ganglios de los nervios craneales. Por otro lado, adquirió las capacidades de desarrollo del dermatomo y esclerotomo de los somitas posóticos. Por ello, es capaz de originar el mesénquima cefálico – rodea todo el prosencéfalo y mesencéfalo– y la parte del mesénquima branquial que forma cara y cuello. Este mesénquima originado en la cresta preótica se diferencia en los tejidos conectivo, cartílago y huesos del cráneo y cara, de las mandíbulas y huesos del oído medio. También origina el tejido conectivo que forma el estroma de la adenohipófisis, tiroides, paratiroides y timo. Origina, además, los odontoblastos de los esbozos dentales.

Bibliografía Cohn MJ. (2002). Evolutionary biology: lamprey Hox genes and the origin of jaws. Nature 416(6879):386-7. Ferrier DE, Minguillón C, Holland PW, Garcia-Fernández J. (2000). The amphioxus Hox cluster: deuterostome posterior flexibility and Hox14. Evol Dev 2(5):284-93. Gans C, Northcutt RG. (1983). Neural crest and the origin of vertebrates: a new head. Science 220(4594):268-73. Helms JA, Cordero D, Tapadia MD. (2005). New insights into craniofacial morphogenesis. Development 132(5):851-61. Kuratani S, Nobusada Y, Horigome N, Shigetani Y. (2001). Embryology of the lamprey and evolution of the vertebrate jaw: insights from molecular and developmental perspectives. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356(1414):1615-32. Northcutt RG. (2005). The new head hypothesis revisited. J Exp Zool B Mol Dev Evol 304(4):274-97. SC 13.2. El síndrome de deleción 22q11.2 (DiGeorge). Síndromes con alteraciones fenotípicas combinadas. V. Flores, J. Halfón Las células de la cresta neural de los primeros segmentos corporales participan en la formación de los derivados de los arcos faríngeos (esqueleto facial), de las bolsas faríngeas (timo, paratiroides) y del tronco de salida del corazón. Debido a ello, las fallas del desarrollo (déficits en la proliferación, migración celular, exceso de muerte celular) de la cresta neural de dicha región conducen a combinaciones bastante variadas de alteraciones en todas esas estructuras. El síndrome de DiGeorge, por ejemplo, incluye alteraciones faciales (“boca y filtrum pequeños”, fisura palatina, implantación auricular baja), defectos troncoconales, hipoplasia tímica, hipoplasia de las paratiroides y consiguiente hipocalcemia. En el hombre, algunos genes de desarrollo ubicados en la región 11.2 del brazo largo del cromosoma 22 participan en el desarrollo de los derivados de la cresta neural craneal y sus deleciones se asocian a varios síndromes. Por ello, dichos síndromes también reciben genéricamente el nombre de síndrome de la deleción 22q11.2. Dado que el síndrome de DiGeorge es paradigmático de este conjunto de malformaciones, la región cromosómica mencionada ha sido denominada DGCR (DiGeorge syndrome Chromosome Región). La similitud que presentan estos síndromes y la gran variabilidad que exhiben ha hecho plantear explicaciones alternativas. Por un lado se ha planteado que las diferencias se deben a que no todas las deleciones son idénticas en el sentido de que podrían ser de diferente longitud involucrando a diferentes genes de dicha región cromosómica. Por otro lado, se ha planteado también de que aun una misma deleción podría generar, en los diferentes contextos genómicos de diferentes individuos, variaciones del mismo cuadro patogénico. La variabilidad del síndrome ha sido también explicada considerando el hecho de que las microdeleciones de la región 22q11.2 pueden alterar la expresión de unos 30 a 40 genes. Uno de ellos, por ejemplo el que codifica la proteína factor de transcripción Tbx1, está involucrado en varias alteraciones físicas del síndrome (cardíacas, del paladar hendido, etc.). Otro de los genes de la región, el que codifica la enzima Catechol-Omethyltransferasa (Comt), implicado en la síntesis del neurotransmisor dopamina, es responsable de las alteraciones cognitivas y enfermedades mentales del síndrome.

En la región DGCR se localizan varios genes que estarían involucrados en la migración de las células de la cresta neural. La proteína factor de transcripción Tbx1 se expresa en los arcos y bolsas faríngeos y en la vesícula ótica y, presuntamente, está involucrado en algunas de las alteraciones debidas a las deleciones 22q11. Se ha mostrado que la mayoría de las deleciones 22q incluyen el gen codificante del factor Tbx1 y que las mutaciones de dicha proteína producen alteraciones similares a las del síndrome de la deleción 22q11. El factor Tbx1 se expresa en el endodermo faríngeo y en el mesénquima de los arcos branquiales pero no en la cresta neural craneal. Se ha mostrado también que la deleción del gen Tbx1 en ratones reproduce las alteraciones fenotípicas correspondientes al síndrome de la deleción 22q. En ratones, el knockout de un alelo codificante del factor de transcripción Tbx1 suele producir malformaciones troncoconales y el knockout de los dos alelos produce casi todos los componentes del síndrome de DiGeorge. El gen del factor de transcripción Hes (Homologue of Enchancer of Split), que se expresa transitoriamente en el tronco-cono y tejidos de la cara en derivados de la cresta neural, también se halla en la región DGCR. El gen codificante de la proteína de adhesión celular DGCR2 y otros genes que se ubican en dicha región también estarían involucrados en el desarrollo de la cresta neural craneal y sus alteraciones. Las mutaciones en genes que no se hallan localizados en la región cromosómica señalada también pueden alterar el desarrollo de las células de la cresta neural craneal y producir alteraciones como las que integran el síndrome de DiGeorge. Así, el knockout del gen codificante del factor de transcripción Hoxa3 que participa en la morfogénesis de los derivados de la región correspondiente al 3.er arco y bolsa faríngeos produce algunas alteraciones incluidas en dicho síndrome. Agentes teratógenos como el ácido retinoico y el alcohol etílico también producen algunas malformaciones similares debido a que alteran el desarrollo de las células de la cresta neural craneal. Se ha mostrado también que en el endodermo faríngeo existen dominios de expresión superpuestos de Tbx1 y Fgf8 y que la deleción de Tbx1 ocasiona la pérdida de la expresión de Fgf8 en el endodermo faríngeo. Esto sugiere que la proteína factor de transcripción Tbx1 está involucrada en el inicio y el mantenimiento de la expresión de la proteína señal Fgf8. La expresión de Fgf8 es necesaria para el normal desarrollo craneofacial, pues la ausencia de expresión de Fgf8 en el dominio de expresión de Tbx1, en el endodermo faríngeo, produce anomalías cardíacas semejantes a las que poseen los pacientes con síndrome de DiGeorge.

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SC 13.3. Morfogénesis dental. El código homeótico odontogenético y las proteínas señal asociadas. V. Flores, J. Halfón Los procesos morfogenéticos e histogenéticos, en general, dependen para su concreción de interacciones entre los elementos tisulares participantes. En general se trata de interacciones epitelio-mesenquimáticas en las que el componente epitelial corresponde al ectodermo o al endodermo y el mesénquima es el que subyace inmediatamente en el epitelio ya que se trata de interacciones paracrinas o yuxtacrinas. La morfogénesis dental es un ejemplo de tales interacciones. Existen trabajos que indican que, en este caso particular, al ectodermo de la región oral le corresponde tempranamente un papel determinante (estimular la odontogénesis y determinar el tipo de diente) aun antes de que existan signos morfológicos de formación de esbozo. En esta etapa, el mesénquima cumple el papel de población celular competente. Luego los roles se invierten (Fig. SC 13.3.1).

Fig. SC 13-3-1. Modelo de odontogénesis mediado por interacciones epiteliomesenquimáticas en las que los papeles determinante y competente se suceden temporalmente (Modelo: ratón). A. En una primera etapa (etapas previas al día 12.5) el epitelio actúa en forma determinante y puede inducir la formación de un esbozo de diente en un mesénquima extraño (no dental). B. Más tarde (etapas ulteriores al día 12.5), el mesénquima que ya ha sido estimulado a generar diente es capaz de actuar sobre un epitelio extraño (no dental) e inducirlo a formar juntos un esbozo dental. El experimento indica que, en este modelo, la inversión de los papeles determinantes se produce en el día 12.5. Una vez formado el esbozo existe una cascada de interacciones entre el epitelio y el mesénquima del primer arco branquial. Llegada esta etapa existe una inversión en los papeles determinantes y competentes Se ha descrito un “código homeótico odontogénico” consistente en la expresión de combinatorias de factores de transcripción de los tipos Dlx, Barx, Msx y Alx. La expresión local de una combinación específica de estos factores de transcripción, por parte del mesénquima de la región formadora de dientes del primer arco branquial, especifica qué tipo de diente se genera en cada región formadora de dientes. Por ejemplo, se ha constatado que la especificación de molares es establecida por la expresión de la combinatoria de factores Dlx-1, Dlx-2 y Barx-

1 y que para la especificación de incisivos se requiere la expresión de la combinatoria de factores Msx-1, Msx-2 y Alx-3. La formación de dientes requiere la acción de otras proteínas que colaboran con la expresión de los factores de transcripción mencionados. Por ejemplo, antes de la formación de los dientes, la proteína señal Bmp-4 se expresa en forma selectiva en la región formadora de dientes. Primero se expresa en el ectodermo de la región formadora de incisivos y poco después en el de la región formadora de molares. Luego, la expresión de Bmp-4 se activa en el mesénquima. Se postula que la expresión del factor de transcripción Msx-1 influye, de alguna manera no conocida, sobre la expresión de Bmp-4 específicamente debajo de las placodas o engrosamientos ectodérmicos dentarios. Éste parece ser un fenómeno interactivo ya que la proteína Bmp-4 también induce la expresión de Msx-1 en el mesénquima. Una vez que la expresión de Bmp-4 y de Msx-1 se traslada al mesénquima, la expresión de ambas proteínas se independiza de señales provenientes del ectodermo. La importancia de estas interacciones en la odontogénesis se pone de manifiesto por el hecho de que la abolición o el déficit de la acción de Msx-1 produce una detención del desarrollo dentario en el estado de esbozo. Algo similar ocurre con la expresión del factor de transcripción Lef-1. Éste, al principio también se expresa sólo en el ectodermo pero luego la proteína Bmp-4 estimula su expresión en el mesénquima. Finalmente, el factor Lef-1 se expresa en el nódulo del esmalte. Esta proteína es otra de las tantas involucradas en la acción del mesénquima durante la formación de la papila dentaria. Otra proteína necesaria durante la odontogénesis es la proteína señal Shh. Esta proteína se expresa en sitios o dominios restringidos estimulando la proliferación localizada del ectodermo dental en zona de formación de esbozos dentales. Su expresión altamente localizada depende de la interacción con otra proteína señal Wnt-7b y la activación de esta vía de señalización. Durante la morfogénesis del diente la lámina dental genera un diente con una morfología característica. Este proceso tiene varias etapas. De ellas, la transición del estado de brote al estadio de caperuza y la formación del nódulo del esmalte primario es crítica ya que éste se convierte en un centro señalizador que integra la odontogénesis. El nódulo del esmalte es un centro señalizador discreto (local), transitorio y no proliferativo, formado por las células ectodérmicas localizadas en el extremo del epitelio dental interno. Este nódulo dirige la formación del esbozo en el estadio de caperuza por medio de la expresión de varias proteínas señal entre las que se cuentan Shh, Bmp-2, Bmp-4, Bmp-7, Fgf-4, Fgf-9 y Wnt. El nódulo del esmalte progresivamente desaparece por apoptosis regulada por Bmp-4. En dientes con más de una cúspide, luego de la desaparición del nódulo del esmalte primario, en el estadio de caperuza tardío se forman nódulos del esmalte secundarios dentro del epitelio dental interno. Los nódulos secundarios regulan la formación del diente en el estadio de campana, son no proliferativos, expresan Fgf-4 y son eliminados por apoptosis a través de la acción de Bmp-4. Los nódulos secundarios marcan los sitios de ubicación de las futuras cúspides. Vale decir, establecen el patrón espacial de posición de cúspides específico de especie y de tipo dental.

Bibliografía Zhang YD, Chen Z, Song YQ, Liu C, Chen YP. (2005). Making a tooth: growth factors, transcription factors, and stem cells. Cell Res 15(5):301-16. Thesleff I, Vaahtokari A, Partanen AM. (1995). Regulation of organogenesis. Common molecular mechanisms regulating the development of teeth and other organs. Int J Dev Biol 39(1):35-50. Zeichner-David M, Diekwisch T, Fincham A, Lau E, MacDougall M, Moradian-Oldak J,

Simmer J, Snead M, Slavkin HC. (1995). Control of ameloblast differentiation. Int J Dev Biol 39(1):69-92. SC 13.4. La disostosis mandibulofacial o síndrome de Treacher Collins (STC). Bases celulares y moleculares de su patogenia. V. Flores, J. Halfón Varios estudios histopatológicos de embriones con síndrome de disostosis mandibulofacial, bilateral y simétrico (distinguibles de las que presentan alteraciones asimétricas) o síndrome de Treacher Collins (STC), sugieren un mecanismo patogénico que opera tempranamente durante el desarrollo facial y que actúa uniformemente sobre el mesénquima de los dos primeros arcos branquiales. En animales de experimentación (ratón) existen malformaciones similares al STC tanto de causa ambiental como genética. La vitamina A, administrada a ratas en dosis teratogénicas, produce una fenocopia del STC. Algunos estudios histopatológicos de estos embriones muestran focos de muerte celular en los dos primeros arcos branquiales que producen un déficit en células de la cresta neural y cambios de posición y deformaciones de las prominencias faciales y auriculares. Estas alteraciones dan lugar a un esqueleto facial simétrico, pero anormal, muy similar al del STC en el ser humano. No se ha dilucidado cómo la vitamina A altera las células de la cresta neural de los arcos mencionados. La malformación facial de causa genética del ratón considerada homóloga a la disostosis mandibulofacial se debe a una mutación del gen Tcof1 que codifica la proteína Treacle. Los ratones heterocigotos para esta mutación mueren perinatalmente con una severa malformación craneofacial. En estos ratones, las células precursoras de la cresta neural sufren muerte celular antes de abandonar el tubo neural. Ello reduce significativamente la población de células correspondientes al 1.er arco faríngeo. En el ser humano la disostosis mandibulofacial se caracteriza por hipoplasia bilateral de las estructuras faciales derivadas del 1.erº arco faríngeo y se debería a mutaciones del gen Tcof1 que está localizado entre las regiones 32 y 31 del brazo largo (q) del cromosoma 5. Como en el ratón, la causa respondería a una alteración de la proteína Treacle, una fosfoproteína, de localización nucleolar, involucrada en la regulación de la síntesis de ARN ribosómico. La pérdida de la función de la proteína reduciría la síntesis de ARNr afectando más o menos selectivamente a ciertas poblaciones celulares en desarrollo, entre ellas, afectando seriamente y produciendo la muerte de las células de la cresta neural que participan en el desarrollo craneofacial. No se conoce la patogenia por medio de la cual la alteración en la proteína Treacle conduce a la muerte de estas células y no afecta, o afecta levemente, a otras. El STC en el ser humano presenta una gran variabilidad y debido a ello se ha especulado que podrían ser varios los genes involucrados como causa del STC. Una posible fuente de tal variabilidad podría resultar del hecho de que el transcripto primario de Treacle, normalmente, puede sufrir varios procesamientos alternativos generando al menos tres diversas isoformas funcionales de la proteína. Se ha postulado que cada una de ellas podría ser alterada diferentemente por distintas mutaciones. Esta postulación se basa en el hecho de que ciertos estudios genéticos en pacientes con STC han identificado hasta la fecha más de 150 mutaciones del gen Tcfo1 consistentes en inserciones o deleciones de pequeños segmentos de ADN.

Bibliografía Poswillo D. (1975). The pathogenesis of the Treacher Collins syndrome (Mandibulofacial dysostosis). Br J Oral Surg 13 (1):1-26. Sulik KK, Johnston MC, Smiley SJ, Speight HS, Jarvis BE. (1987), Mandibulofacial

dysostosis (Treacher Collins syndrome): A new proposal for its pathogenesis. Am J Med Genet 27:359-72. SC 13.5. El patterning de la región craneofacial I. Proteínas señal y factores de transcripción involucrados en la especificación de la cresta neural craneal y sus derivados. J. Halfón, V. Flores El código Hox establece la identidad de segmentos del tubo neural y de la cresta neural desde el segmento rombomérico 3 (r3) hasta el extremo caudal de ambas estructuras. Los segmentos de la cresta neural y del tubo neural correspondientes al mismo nivel segmentario comparten el mismo código Hox (SC El código Hox participa en la morfogénesis del aparato de la cérvico-céfalo-giria y órganos cervicales; SC El patterning de la cresta neural craneal. Regiones Hox(+) y Hox(-). Su relevancia filogenética y sus papeles de desarrollo). Dado que las células de la cresta neural craneal se organizan en corrientes migratorias ordenadas, cuando migran desde su posición dorsal inicial hacia las paredes laterales y ventromediales, transfieren su identidad de segmento a los tejidos que ellas originan en las regiones que invaden. Así, las células de la cresta neural “transportan” su código Hox al mesénquima de los arcos branquiales. Nótese que el proceso descrito no instala diferencias en la información posicional a lo largo del eje dorsoventral. Todas las células derivadas de un cierto segmento de cresta neural poseen el mismo código Hox a lo largo del territorio que invaden desde el dorso al vientre. La especificación de la información posicional a lo largo del eje dorso-ventral de los tejidos derivados de la cresta neural craneal depende de la expresión diferencial y espacialmente organizada, de combinatorias de otros factores de transcripción, entre los cuales desempeñan un papel central los factores de transcripción del grupo Dlx (Distal less homebox). La asignación de información de posición mediada por estos dos sistemas de referencia no se produce simultáneamente en los tejidos derivados de la cresta neural craneal. El código Hox queda especificado en las células de la cresta neural antes de iniciar su migración. La especificación de la información posicional a lo largo del eje dorso-ventral, por medio de combinatorias de factores Dlx, se especifica más tarde. Así, todas las células de la cresta neural que integrarán un arco branquial y derivan de un mismo segmento de cresta neural comparten el mismo código Hox antes de iniciar su migración. Por el contrario, la expresión diferencial de genes Dlx a lo largo del eje dorso-ventral de la región que invaden se inicia recién durante la migración. Esta expresión diferencial depende de señales provenientes del epitelio circundante con el que van interactuando durante la migración. La identidad de segmento provista con la participación de los factores de transcripción del código Hox establece diferencias entre arcos branquiales sucesivos a lo largo del eje cf-cd. La expresión diferencial de factores de transcripción Dlx establece, para cada arco branquial, diferencias a lo largo del eje dorso-ventral. Esto ocurre sin que los factores de transcripción Dlx interfieran con la identidad de segmento provista por los factores de transcripción Hox. Así, la expresión diferencial, espacialmente organizada, de combinatorias de dos conjuntos de diferentes tipos de factores de transcripción provee un sistema de referencia espacial que semeja un sistema ortogonal en el que un código (Hox) establece diferencias a lo largo del eje céfalo-caudal en tanto que el otro código (Dlx) establece diferencias a lo largo del eje dorso-ventral del sistema de referencia ortogonal. Un ejemplo de establecimiento de diferencias a lo largo del eje dorso-ventral en la región de la cresta neural craneal lo ofrecen ciertos peces en los que el epitelio de los arcos branquiales sintetizan la proteína señal

endotelina-1 (Et-1) en forma de gradiente ventrodorsal (valor máximo en la región ventral). Este gradiente de endotelina-1 actúa sobre el mesénquima branquial derivado de las crestas neurales y participa en la especificación de diferencias en el modo de desarrollo de las estructuras esqueléticas a lo largo del eje dorsoventral. Diferentes rangos de concentración de endotelina-1 promueven diferentes modos de desarrollo en estructuras cartilaginosas y articulares. En la región dorsal, la baja concentración de Et-1 permite la expresión de la proteína factor de transcripción Bapx1 que participa en la regulación de la expresión de proteínas vinculadas al desarrollo de articulaciones. En la región ventral, la alta concentración de Et-1 activa la expresión de la proteína factor de transcripción Hand2, que reprime la expresión de Bapx1 y promueve la formación de cartílago. Así, el gradiente de Et-1 establece la posición espacial de articulaciones y cartílagos. La Et-1 también tiene un papel clave en el establecimiento de la polaridad dorso-ventral en los 2 primeros arcos faríngeos en aves y mamíferos a través de una cascada genética en la que están involucradas las proteínas factores de transcripción Dlx6, dHand y Msx1. Otros ejemplos de polaridad y patterning en la región craneofacial los ofrece la distribución de la proteína señal Fgf8. El Fgf8 se expresa en el ectodermo oral antes de que se forme la cavidad bucal y antes de que arribe el mesénquima de las crestas neurales y la proteína señal Bmp4 delimite su dominio de expresión. La distribución de ambas señales provee información de posición al mesénquima que origina estructuras orales. El Fgf8 se expresa también en el ectodermo y en las bolsas faríngeas y opera como señal de supervivencia y estímulo para la expresión de genes participantes en diferenciación de las células de la cresta neural. El Fgf8 instala una polaridad en el eje céfalo-caudal del 1.er arco faríngeo. En el borde oral (cefálico) del 1.er arco en el que se forman, la lámina dental se distingue del borde aboral (caudal) que forma el esqueleto óseo en el que se implantan los dientes. Por otro lado, el Fgf8, en altas concentraciones, estimula la expresión de los genes codificantes de las proteínas factor de transcripción Lhx6/7 en las células de la región dorsal; por el contrario, en bajas concentraciones estimula la expresión de la proteína factor de transcripción Goosecoid, en la región ventral. Este factor de transcripción participa en la condrogénesis craneofacial.

Bibliografía Talbot JC, Johnson SL, Kimmel CB. (2010). Hand2 and Dlx genes specify dorsal, intermediate and ventral domains within zebrafish pharyngeal arches. Development 137:2507-17. Ozeki H, Kurihara Y, Tonami K, Watatani S, Kurihara H. (2004). Endothelin-1 regulates the dorsoventral branchial arch patterning in mice. Mech Dev 121:387-95. Sato T, Kurihara Y, Asai R, Kawamura Y, Tonami K, Uchijima Y, Heude E, Ekker M, Levi G, Kurihara H. (2008). An endothelin-1 switch specifies maxillomandibular identity. Proc Natl Acad Sci USA 105:18806-11. SC 13.6. El patterning de la región craneofacial II. Factores de transcripción y factores de crecimiento intervinientes. J. Halfón, V. Flores La cresta neural es una población celular con potencia evolutiva amplia. Sus diversos modos de evolución dependen de las interacciones que puedan realizar con otros tejidos durante el desarrollo. La variabilidad en cuanto a los posibles papeles de desarrollo es sobre todo llamativa en la región correspondiente a la cresta neural craneal (SC El origen múltiple y la pluripotencialidad del mesénquima cefálico. El mesodermo paraxil preótico y la cresta neural craneal).

La cresta neural craneal posee dos regiones principales limitadas por el segmento rombomérico 3 (r3). La región cefálica a r3 (región diencefálica, mesencefálicas anterior y posterior y parte del posencéfalo, hasta r3) no expresa factores de transcripción Hox, es comúnmente denominada Hox(-) y su especificación es independiente de los genes Hox. La región caudal a r3 sí está subordinada al código de factores de transcripción Hox y es denominada Hox(+). La cresta neural craneal cefálica Hox(-) ha sido designada cresta neural esqueletogénica facial ya que origina la mayor parte del cartílago y huesos membranosos de la cara y mandíbula y región frontal del cráneo. La extirpación completa de la cresta neural craneal Hox(-) deriva en la ausencia del esqueleto facial indicando que esta capacidad está restringida a la zona Hox(-) y que la cresta neural Hox-positiva no posee capacidad esqueletogénica facial. Por otro lado, también se ha mostrado experimentalmente que la cresta neural craneal Hox(-) se comporta como una población celular equipotente (potencia evolutiva equivalente). La extirpación de la mayor parte de la cresta neural Hox(-) no conduce a fallas en el desarrollo craneofacial, siempre que se deje alguna porción remanente de ella. Esto indica que cualquier porción remanente de la cresta neural craneal Hox(-) es capaz de generar los componentes esqueléticos y conectivos que hubieran sido formados por la porción extirpada. La proteína factor de crecimiento Fgf-8 está involucrada en las interacciones epitelio- mesenquimáticas que ocurren durante el desarrollo de la región craneofacial. Por un lado la cresta neural craneal Hox(-) estimula y mantiene la expresión de Fgf-8 por parte del ectodermo de la región de la cresta neural anterior o ANR (Anterior Neural Ridge) y, por otro lado, el propio desarrollo de la cresta neural craneal Hox(-) es dependiente de Fgf-8. La extirpación de la cresta neural Hox(-) reduce la expresión de Fgf8 en el ectodermo de la región cefálica. Pero, la extirpación de la cresta neural craneal Hox(-) acompañada de la aplicación de Fgf8 exógeno, en el territorio del 1.er arco branquial, permite que la población celular del segmento de r3 regenere buena parte del esqueleto facial. Por el contrario, algunos experimentos de sobreexpresión de genes Hox en la región Hox(-) negativa hacen que dicha región pierda la capacidad esqueletogénica facial. Al parecer, el factor de crecimiento Fgf-8 estimula la expresión de las proteínas factores de transcripción Ptx1 y Lhx6 que se expresan específicamente en la región del 1.er arco faríngeo. La porción de cresta neural craneal que forma el 2.º arco faríngeo y que origina las estructuras óseas del oído medio y el hioides expresa la proteína factor de transcripción Hoxa2. Este factor está involucrado en el establecimiento de la identidad del 2.º arco. En ausencia de expresión de esta proteína, las células del 2.º arco modifican su desarrollo y originan derivados típicos del 1.er arco. Por otro lado, la expresión ectópica de este factor de transcripción en la región correspondiente al 1.er arco hace que estas células originen derivados del 2.º arco. Como consecuencia de estos resultados se ha propuesto que en la región mencionada existe un programa de desarrollo que por omisión de Hoxa2 evoluciona en sentido del 1.er arco faríngeo pero que ante la expresión de Hoxa2 adquiere el desarrollo correspondiente al 2.º arco. El factor de transcripción Hoxa2 antagoniza la acción del Fgf8 reprimiendo la expresión de los factores de transcripción Ptx1 y Lhx6 que contribuyen a establecer la identidad del 1.er arco. El factor Hoxa2 también inhibe la expresión del factor de transcripción Sox9 que participa en la diferenciación del cartílago. Por otro lado, Hoxa2 también estimula la expresión de la proteína factor de transcripción goosecoid, que es típica del 2.º arco. De esta manera, la formación de los derivados del 2.º arco requeriría que Hoxa2 inhiba el potencial esqueletogénico facial y module espacial y temporalmente la proliferación y diferenciación de la cresta neural.

La proteína factor de transcripción Otx2 se expresa en las células de la cresta neural craneal que forman el mesénquima de la prominencia frontonasal y en las de la cresta neural mesencefálica que forman el 1.er arco faríngeo. El mesénquima del 1.er arco tiene dos componentes: su región ventral está integrada por células provenientes de la cresta neural mencionada que expresa Otx2; la porción dorsal de dicho arco es de origen rombomérico (prosencefálico). En las mutaciones de Hoxa2, la transformación del 2.º arco en 1.er arco se limita a las estructuras dorsales. Ello indica que en la región ventral prevalece la especificación asignada por la expresión adicional de Otx2. Los segmentos de la cresta neural que forman el 3.er arco expresan genes Hox de los grupos 2 y 3. Este arco contribuye con menos células a la formación del esqueleto cervical. La cresta neural troncal, que expresa genes Hox más posteriores, no genera estructuras esqueléticas.

Bibliografía Yan YL, Willoughby J, Liu D, Crump JG, Wilson C, Miller CT, Singer A, Kimmel C, Westerfield M, Postlethwait JH. (2005). A pair of Sox: distinct and overlapping functions of zebrafish sox9 co-orthologs in craniofacial and pectoral fin development. Development 132:1069-83. Creuzet S, Schuler B, Couly G, Le Douarin NM. (2004). Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proc Natl Acad Sci USA 101(14):4843-7. Francis-West P, Ladher R, Barlow A, Graveson A. (1998). Signalling interactions during facial development. Mech Dev 75(1-2):3-28.

Capítulo 14. Desarrollo de los Aparatos Locomotor y Tegumentario SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 14.1. Vías de señalización y factores de transcripción involucrados en la compartimentalización del somita y su ulterior evolución. V. Flores SC 14.2. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético I. Asignación de información posicional y programación temporoespacial de la morfohistogénesis. V. Flores, M. Rapacioli

SC 14.3. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético II. La asignación de información posicional a lo largo del eje próximodistal. V. Flores SC 14.4. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético III. La asignación de información posicional a lo largo del eje cefálocaudal (anteroposterior). V. Flores SC 14.5. El papel del mesodermo en las interacciones epitelio-mesenquimáticas (Int e–m) durante el desarrollo de la piel. El patterning progresivo de la piel. V. Flores, M. Rapacioli SC 14.6. El micropatterning y la morfogénesis de los órganos anexos cutáneos. La distribución y la inclinación pilosa son manifestaciones de polaridad planar. M. Rapacioli SC 14.7. Factores de crecimiento y de transcripción involucrados en la formación de anexos cutáneos. M. Rapacioli SC 14.1. Vías de señalización y factores de transcripción involucrados en la compartimentalización del somita y su ulterior evolución. V. Flores

Los somitas se hallan sometidos a redes de señalización espacialmente organizadas que influyen diferentemente sobre las células de sus distintas regiones. Ello hace que un somita posea compartimentos o dominios celulares diferentemente especificados que cumplen distintas funciones de desarrollo (esclerotomo, miotomo, dermatomo, sindetomo, etc.). Una vez que el somita madura, las células de sus diferentes regiones realizan diferentes tipos de comportamientos y migran a diferentes regiones corporales. Este proceso de migración está precedido de una T e-m que las regiones del somita sufren en distintos momentos. La compartimentalización del somita depende de la acción de señales provenientes de centros organizadores de posición dorsal, ventral, medial y lateral que habitualmente poseen efectos contrapuestos. La figura SC 14-1-1. ilustra la complejidad y la organización espacial de la red de señalización involucrada en la compartimentación del somita.

Fig. SC 14-1-1. Ilustra las principales poblaciones celulares que conforman el “entorno” del mesodermo paraxil y que actúan como las poblaciones celulares organizadoras que

generan la red de señalización celular que instalan el patterning de los somitas. Las flechas indican las diversas influencias locales recibidas por las células de las diversas regiones del somita. Véase descripción en el texto. El patrón morfogenético D-V es instalado interactivamente entre la señalización vía Wnt (desde el ectodermo superficial dorsal y el tubo neural dorsal) y la señalización vía Shh y Noggin (desde el mesodermo axil ventral). El patrón morfogenético M-L es instalado interactivamente entre la señalización vía Shh proveniente de la notocorda y placa basal del tubo neural y la señalización vía Bmp proveniente del mesodermo somatopleural. Estas distintas influencias hacen que en el somita aparezcan regiones diferentemente especificadas. La especificación del esclerotomo. El esclerotomo es especificado por varias señales mediales y ventrales provenientes de la notocorda y placa del piso del tubo neural. Depende principalmente de la activación de la vía Shh que promueve, o al menos mantiene, la expresión del factor de transcripción Pax1. Otro blanco de la vía Shh es el factor de transcripción Pax9 que también se expresa en el esclerotomo. La activación de la vía Shh también contribuye al patterning D-V inhibiendo la expresión de factores de transcripción dorsales como Pax3, Pax7 y MyoD que se expresan en el dorso (dermatomiotomo). La especificación del dermatomiotomo. La especificación del dermatomiotomo requiere la proteína señal Wnt proveniente del ectodermo y del tubo neural dorsales que estimulan la expresión de los factores de transcripción Pax3, Pax7 y Paraxis. El dermatomiotomo luego se segrega, debido a influencias adicionales, en miotomo y dermatomo. La especificación del dermatomo. La especificación del dermatomo dependería, por un lado, de la proteína señal neurotrofina que es secretada por la placa del techo del tubo neural y que estimula la expresión del factor de transcripción Pax3 y, por otro, de la señal Bmp4 secretada por el ectodermo adyacente. Una vez especificado por la acción de dichas señales se inicia la migración de las células del dermatomo que recubre la superficie basal del ectodermo de la región dorsal. Estas células ulteriormente se diferenciarán en el tejido conectivo de la dermis dorsal. La especificación del miotomo. La especificación del miotomo involucra, por un lado, a) su especificación en sentido muscular, por otro, b) su especificación como epímero o hipómero y, además, sufren luego una c) T em que permite su segregación o desprendimiento desde el dermomiotomo y los convierte en mioblastos proliferantes migratorios. La región del labio dorsal-medial o epiaxial del dermomiotomo, debido a la acción de las señales dorsales mencionadas, expresa tempranamente factores de transcripción miogénicos de la familia MyoD de cuya expresión depende, al parecer, su especificación como epímero (subpoblación precursora de mioblastos que originan músculos dorsales o extensores del raquis). Por otro lado, la región del labio ventral-lateral o hipoaxial del dermomiotomo, con el concurso de la activación de la vía de señalización del Bmp, secretado a partir del mesodermo somatopleural, se especifica en hipómero (subpoblación precursora de mioblastos que forman los músculos anterolaterales [flexores del raquis, los de los miembros, el diafragma y la lengua]). El mesodermo somatopleural también secreta el factor de crecimiento fibroblástico 5 o Fgf5. El efecto de la estimulación del miotomo por el mesodermo somatopleural, por un lado, retarda la expresión de los factores de transcripción miogénicos del tipo MyoD (que se expresan tempranamente en el dorso) y, por otro, estimula la expresión de la proteína receptor c-met. Este receptor habilita a las células que lo expresan a responder al factor de crecimiento de hepatocito (Hgf/Sf) que estimula su migración. Esta proteína señal es emitida por el mesénquima del esbozo de miembro. Así, estas señales serían las responsables de estimular la

expansión proliferativa y migratoria de las células del hipómero hacia la somatopleura y hacia los esbozos de los miembros. El proceso de migración dirigida de los mioblastos embrionarios, antes de iniciar su diferenciación, requiere una T e-m previa y una amplificación y expansión proliferativa de la población. En la estimulación de esta expansión proliferativa participan también las proteínas señal factores de crecimiento fibroblástico y transformante tipo beta (Fgf y Tgf-β). Cuando los mioblastos cesan su proliferación y se transforman en mioblastos posmitóticos, inician la síntesis de los factores de transcripción miogénicos del tipo MyoD. Estos factores de transcripción inician una cascada de expresión de diversas proteínas que permiten el avance a través de las diferentes fases de la citodiferenciación del miocito esquelético. Los factores de transcripción MyoD tienen como función modificar el patrón de actividad génica de modo que ésta sea, en sucesivos pasos, dirigida a la activación de los genes necesarios para la síntesis de las diversas proteínas específicas del miocito. Los factores de transcripción miogénicos son a su vez modulados por otras proteínas que exacerban o disminuyen su actividad. Además de estos hechos, vinculados a la citodiferenciación, también se pone en juego la expresión de otros genes del tipo Hox, involucrados en la organización espacial de la diferenciación de los diversos grupos musculares del cuerpo. Los factores de transcripción Hoxa-11 y 13 se hallan involucrados en la represión transitoria de MyoD durante el desarrollo temprano de los músculos de las extremidades.

Bibliografía McMahon JA, Takada S, Zimmerman LB, Fan CM, Harland RM, McMahon AP. (1998). Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev 12(10):1438-52. Schmidt C, McGonnell I, Allen S, Patel K. (2008). The role of Wnt signalling in the development of somites and neural crest. Adv Anat Embryol Cell Biol 195:1-64. Geetha-Loganathan P, Nimmagadda S, Scaal M, Huang R, Christ B. (2008). Wnt signaling in somite development. Ann Anat 190 (3): 208-22. SC 14.2. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético I. Asignación de información posicional y programación temporoespacial de la morfohistogénesis. V. Flores, M. Rapacioli El esbozo de miembro aparece hacia el final del período somítico (en la especie humana, durante la 5ª SD) como una pequeña prominencia en la región lateral del embrión. Dicha prominencia está formada por un acúmulo de células mesodérmicas revestidas por el ectodermo epidérmico. En el ectodermo del extremo distal del esbozo se forma tempranamente un engrosamiento lineal, denominado cresta apical ectodérmica (Cae), a lo largo del límite entre las superficies dorsal y ventral del esbozo. Luego se produce la elongación del esbozo, demarcándose en él dos zonas que, en el caso del miembro superior, corresponden a la mano (la distal) y al brazo (la proximal). En el mesénquima del esbozo se distinguen una zona externa, compacta y pobremente vascularizada, y una zona central laxa. Cuando el esbozo crece en longitud, la parte central se transforma en una condensación mesenquimática que indica el inicio de la formación de cartílago. La formación de condensaciones mesenquimáticas progresa en sentido distal hasta la aparición de los precursores cartilaginosos de los dedos de la mano. El desarrollo subsiguiente incluye la formación de los huesos, el crecimiento de éstos en longitud (por adición epifisaria), el crecimiento de los dedos, la pérdida de tejido interdigital, etc., hasta la diferenciación de

todas las regiones del miembro. Durante este proceso, el esbozo de miembro es invadido por otros tejidos (mioblastos, nervios, vasos, etc.). El esbozo de miembro, un modelo de campo morfogenético. El esbozo de miembro, en el momento de su formación, posee propiedades de campo morfogenético (SC El patrón como sistema de referencia que asigna información posicional dentro de un campo. El modelo de la bandera francesa; SC 3.4. Concepto de campo morfogenético). Entre estas propiedades se cuentan las siguientes: a) Es autodiferenciante, es decir, posee la capacidad de elaborar su patrón de organización estructural básico en forma independiente de las otras estructuras. El esbozo de miembro trasplantado a otra región del embrión o a un medio de cultivo, se desarrolla y forma la estructura completa. Ello indica que en él radican los elementos informativos y estructurales necesarios para desarrollar, interactivamente, la estructura completa. b) Posee capacidad regulativa, vale decir, capacidad para formar una estructura completa ante excesos o déficits en las poblaciones celulares que lo componen. El esbozo de miembro se comporta como un sistema de regulación hasta un estado del desarrollo relativamente tardío. Algunos experimentos realizados en el embrión de pollo (estados 19-20) en los que se elimina 30- 80% del mesénquima del centro del esbozo miembro, dan como resultado miembros normales. Otros experimentos similares realizados desde el estado 22 en adelante dan como resultado miembros con diversos déficits. A medida que avanza el desarrollo, la capacidad regulativa disminuye (para la lectura detallada de estos experimentos véanse referencias: - Zwilling E. (1961). Limb morphogenesis. Advan Morphogenesis 1:301-30. - Bodemer C. (1968); Inductive Interactions and Progressive Determination. In: Modern Embryology. Holt,Rinehart & Winston of Canada Ltd. - Hamburger V. (1938). Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. J Exp Zool 77:379-99. - Hampé A. (1959). Contribution to the study of the development and the regulation of deficiencies and excesses in the feet of chick embryos. Arch Anat Microsc Morphol Exp 48:345478. - Amprino R, Camosso M. (1959). On the role of the "apical ridge" in the development of the chick embryo limb bud. Acta Anat (Basel) 38:280-8. - Saunders JW Jr. (1948). The proximo-distal sequence of origin of the parts of the chick wing and the role of the ectoderm. J Exp Zool 108(3):363-403. La capacidad regulativa tiende a la formación de una estructura completa y armónica. Si experimentalmente se divide un esbozo de miembro inferior en tres porciones (proximal, media y distal), la porción media, cultivada en la membrana corioalantoidea, origina una articulación femorotibial. Si las porciones proximal y distal se fusionan, ambas forman un miembro con articulación femorotibial, aunque sin peroné. Estos resultados se obtienen sólo durante un período de tiempo. c) El esbozo de miembro experimenta un proceso de determinación progresiva, vale decir, sus distintas regiones se van determinando y diferenciando gradualmente en el tiempo. La Cae situada en el extremo distal del miembro es esencial para su desarrollo. Si se extirpa la Cae, el desarrollo del miembro se detiene. El resultado de la eliminación de la Cae depende del momento en que se realiza la extirpación. Cuanto más temprano se realiza la extirpación mayor es la cantidad de regiones faltantes. Vale decir, cuanto más tarde se elimina la Cae, más segmentos posee el miembro terminalmente desarrollado. Esto sugiere que las estructuras se determinan y desarrollan según una secuencia temporal y próximo-distal. Los miembros superiores e inferiores son entidades diferentes. A su vez, cada uno de ellos está compuesto por varias regiones anatómicamente diferentes. Sin embargo, los tejidos y los tipos celulares que los constituyen son los mismos. Ello implica que los procesos de determinación celular y citodiferenciación involucrados en el desarrollo son básicamente similares. Así, una explicación de las diferencias estructurales entre miembros superiores e inferiores o de las diferencias entre sus regiones no se funda en diferencias en la citodiferenciación sino en el modo como los procesos de determinación y diferenciación se organizan en el espacio. Dicho fenómeno se denomina “patterning” y depende del modo como los CCD se organizan temporal y espacialmente.

Ello implica que el proceso de patterning se ejecuta diferentemente en cada miembro y en cada una de sus diferentes regiones. La existencia de un patterning remite a la existencia de procesos de control epigenético, tanto temporales como espaciales, de los CCD. El proceso de patterning, en consecuencia, requiere sistemas de referencia espacial y temporal que regulan la operación organizada de las combinatorias de CCD involucrados en el desarrollo de una cierta estructura. Se ha propuesto que el patterning es un proceso multipaso que implicaría varias fases: a) Constitución del esbozo o campo morfogenético de la estructura global, en este caso, el campo del miembro superior o inferior. En esta fase se asocian las poblaciones mesenquimáticas y ectodérmicas que constituyen el campo y, como consecuencia de procesos de señalización instalados por poblaciones organizadoras exteriores al campo, éste se determina. La determinación se refiere al nivel de organización correspondiente al “miembro”, pero no a sus niveles subalternos (regiones y subregiones del miembro). b) La formación del esbozo de miembro implica también la constitución de 1) subpoblaciones celulares con función informativa (integran centros señalizadores internos del esbozo de miembro, como la zona de actividad polarizante [zAP]) y 2) la subpoblación con función estructural (células sensibles a las señales generadas dentro del campo y que elaboran su estructura). c) Instalación del pattern o gradiente de morfógeno y asignación de información de posición. Este es un proceso de señalización celular espacialmente organizado por medio del cual, por un lado, las células informativas (de los centros señalizadores del campo) generan gradientes de morfógenos y, por otro, las células con función estructural, que ocupan diferentes posiciones dentro del campo, vale decir, sometidas a diferentes concentraciones de morfógeno, adquieren la propiedad denominada información posicional. d) La adquisición de información posicional implica experimentar diferentes tipos de reprogramaciones epigenéticas (especificaciones lábiles) que habilitan, a las células que ocupan diferentes posiciones del campo, a ejecutar diferentes modos de organización de los CCD que participan de la morfogénesis y la histogénesis. La adquisición de diferente información posicional (en distintas regiones del esbozo) implica que las células diferentemente posicionadas, pese a retener transitoriamente similar potencia citogenética, son no equivalentes en el sentido de que ejecutarán diferentemente los procesos morfogenéticos e histogenéticos y, en consecuencia, generarán diferencias estructurales regionales en el miembro. e) Finalmente, las subpoblaciones celulares no equivalentes, diferentemente posicionadas en el campo, sufren un proceso de determinación. Vale decir, las reprogramaciones epigenéticas sufridas son fijadas irreversiblemente. En dicho momento, el campo deja de existir como tal y pasa a constituirse como un sistema mosaico. f) El paso final consiste en ejecutar los procesos de morfogénesis e histogénesis acordes con las programaciones del desarrollo determinadas para cada región y, en consecuencia, la elaboración de los diferentes niveles de organización del fenotipo del miembro. Durante esta fase, el pattern informativo inicial y las diferencias en la información posicional del campo, se “traducen” en el patrón de organización estructural típico de cada región. Desde el punto de vista filogenético, una de las implicaciones teóricas del modelo de establecimiento de patrones basado en asignación de información de posición por medio de gradientes de morfógenos, es que esta estrategia parece hallarse bastante difundida en la naturaleza. Así, no sólo las estrategias sino también las señales que participan en el establecimiento del patrón de esbozos de miembro en general podrían ser eficaces y compartidas entre diferentes especies, aun relativamente poco emparentadas. Las diferencias anatómicas entre miembros de distintas especies se deberían a diferentes modos de interpretar una misma señal simple con función morfogenética. Algunos experimentos en los que se han realizado trasplantes de zAP entre distintas

especies de vertebrados han demostrado que la zAP de una especie puede ser biológicamente eficaz en otra especie. En los vertebrados, la señal parece ser la misma y lo que ha cambiado durante la evolución es, al parecer, el modo de ejecutar la respuesta a la señal.

Bibliografía Searls RL. (1968). Development of the embryonic chick limb bud in avascular culture. Dev Biol 17(4):382-99. Hampé A. (1958). Development of the fibula in experiments on regulation of deficiencies & excesses in the chicken leg. J Embryol Exp Morphol 6(2):215-22. Schaller SA, Li S, Ngo-Muller V, Han MJ, Omi M, Anderson R, Muneoka K. (2001). Cell biology of limb patterning. Int Rev Cytol 203:483-517. SC 14.3. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético II. La asignación de información posicional a lo largo del eje próximo-distal. V. Flores Existen resultados experimentales que pueden ser interpretados en el sentido de que la organización espacial de los procesos involucrados en la morfogénesis e histogénesis del esbozo de miembro se realiza sobre la base de al menos tres sistemas de referencia espacial. Cada uno de ellos se vincularía a los tres ejes del espacio que habitualmente se utilizan como referencia para describir los miembros: a) un eje próximo distal (de hombro a punta de los dedos), b) un eje céfalo-caudal o anteroposterior (de dedo pulgar [primer dedo] a dedo meñique [quinto dedo]) y c) un eje dorso-ventral (de dorso a palma de la mano). De acuerdo con esto, se podría suponer que la morfohistogénesis en el esbozo de la extremidad se organiza sobre la base de CCD que se hallan sometidos a un sistema de referencia espacial que tendría las características de un sistema tridimensional de coordenadas ortogonales. La información disponible sugiere que esto no es necesariamente así sino que la información posicional es asignada de un modo más simple, como si la información referida a los tres ejes mencionados fueran asignados por tres sistemas de referencia lineales o unidimensionales, con modalidades diferentes de asignación de información posicional.

El crecimiento en longitud del miembro en gran medida depende de la actividad proliferativa de las poblaciones celulares mesenquimáticas y ectodérmicas que ocupan la región distal del miembro. La actividad proliferativa en dicha región va generando subpoblaciones de células que se van agregando al extremo distal del miembro en crecimiento en función del tiempo. Por tal motivo a dicha región se la denomina zona de crecimiento. Esa zona está ocupada por una población celular mesenquimática autorrenovante, denominada zona de progreso (zP), que se halla envuelta por una placoda o engrosamiento ectodérmico denominado cresta apical ectodérmica (Cae). El mantenimiento de ambas poblaciones se realiza interactivamente por medio de procesos de señalización celular recíproca entre ambas. Por un lado, la formación de la Cae depende de señales generadas en la zP y, por otro, la Cae mantiene a la zP. La zP ocupa una región espacial discoidal, de sólo unos 300 micrómetros, restringida la zona subectodérmica de la Cae. Su extensión depende del alcance (zona de influencia o rango de acción) de las señales generadas en la Cae. Se postula la siguiente sucesión de interacciones (Fig. SC 14-3-1):

Fig. SC 14-3-1. A. Inducción de la Cae en la región ventral del anillo ectodérmico. B. Aparición de la zAP y fase de crecimiento del esbozo. C. Fase de finalización del mantenimiento de la Cae y la zAP. En todos los casos se indican las principales vías de señalización y algunos de los principales factores de transcripción que son potenciales efectores de dichas vías. Descripción en el texto. Inducción de la Cae en la región ventral del anillo ectodérmico. El Fgf10 secretado por el mesénquima promueve en el ectodermo la expresión de Wnt3. La activación de la vía Wnt3/Beta catenina estimula la expresión del Fgf8 en el ectodermo. El Fgf8 promueve la expresión de Fgf10 en el mesénquima y así se constituye un circuito retroalimentación positiva (estimulación recíproca). La formación de la Cae requiere, además, la acción de la Bmp secretada por el mesénquima y el ectodermo ventral. Aparición de la zona de actividad polarizante (zAP) y fase de crecimiento del esbozo. En la constitución de la zAP (véase SC 14.4. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético III. La asignación de información posicional a lo largo del eje cefálo-caudal (anteroposterior)) participan Fgfs secretados por la Cae y factores de transcripción dHand, Hoxd y Hox8b. La zAP secreta Shh que estimula la expresión de factores de transcripción que mantienen la expresión del Fgf10 y de la proteína gremlina 1 (Grem1). Así, durante la fase de crecimiento del esbozo, por un lado, se mantiene el ciclo de estimulación recíproca entre Fgf10 y Fgf8 y, por otro, se crea un ciclo de retroalimentación positiva (estimulación recíproca) entre la Cae y la zAP que se mantienen mutuamente. Además se bloquea la acción de la Bmp, que inhibiría a los Fgf de la Cae. Fase de finalización del mantenimiento de la Cae y la zAP. Hacia el final del desarrollo del esbozo, la alta actividad de los Fgf sobrepasaría un umbral e inhibiría, directa o indirectamente, la actividad de la gremlina. Así, las Bmp inhibirían la acción de los Fgf de la Cae. Ésta involucionaría y ya no mantendría a la zAP. Otra hipótesis postula que las Bmp estimularían la expresión del factor de transcripción Tbx y que éste inhibiría la expresión de la proteína gremlina.

Algunos datos experimentales indican que el proceso de asignación de información posicional a lo largo del eje próximo-distal está asociado a la generación, en forma sucesiva, de las subpoblaciones celulares que integrarán las diferentes regiones del miembro desde la zona proximal (hombro) a la distal (extremo digital). Esta asignación se establecería en forma dependiente del tiempo de permanencia de las células en la zP. En la zona de crecimiento del miembro existen señales correspondientes a vías de señalización que posibilitan que las células de dicha región, por un lado, mantengan una intensa actividad proliferativa asimétrica y, por otro, experimenten sucesivas reprogramaciones epigenéticas. El mecanismo que se propone es el siguiente (Fig. SC 14-3-2):

Fig. SC 14-3-2. Modelo de asignación de información posicional a lo largo del eje próximodistal. Las diferentes zonas del eje próximo-distal (A, B y C) van pasando por diferentes estados: 1) de programación/reprogramación, 2) de especificación o programación lábil y 3) de determinación o programación fija. Descripción en el texto. a) Dada la intensa actividad proliferativa en la zP, esta población se halla en expansión permanente y ocupa un espacio cada vez mayor. b) Dado que las características que definen la zP dependen de fenómenos de señalización que operan exclusivamente en la zona de interacción con la Cae, las células que adquieren posiciones que van más allá de dicho rango de acción pueden ser consideradas como células que abandonan la zP. c) De esta forma, diversas subpoblaciones celulares abandonan la zP en función del tiempo o en función del número de ciclos proliferativos. Naturalmente, las células que abandonan la zP tempranamente generan regiones del miembro que son proximales con respecto a las regiones generadas por células que abandonan la zP en períodos más tardíos.

d) Las células que sucesivamente, en función del tiempo, abandonan la zP quedan fuera del rango de acción de las señales que regulan sus funciones de desarrollo, en consecuencia: modifican su dinámica proliferativa y quedan con la programación epigenética correspondiente al momento en que abandonaron la zP. e) De las diferentes programaciones epigenéticas con la que las células abandonan la zP dependen los diferentes procesos morfohistogenéticos de las regiones correspondientes a diferentes posiciones del eje próximo-distal. Cuando las células abandonan la zP, dicha programación es lábil, vale decir, las células pueden ser reprogramables, pero pasado cierto tiempo, o llegado a una cierta distancia respecto de la zP, el programa queda fijo en forma irreversible. De esta forma se determinan en forma sucesiva en el tiempo las subpoblaciones celulares que generan las diversas regiones correspondientes al eje próximo-distal. Debido al modo como ocurren los procesos descritos en los puntos “a” a “e”, se propone que la determinación de regiones a lo largo del eje próximo  distal depende de un proceso de asignación de información posicional dependiente del tiempo de permanencia de las células en la zP. Debido a ello se establece que el proceso de determinación es progresivo, vale decir, no se determinan todas las regiones del eje simultáneamente, sino que progresa en función del tiempo siguiendo la asimetría próximo  distal. Así, la asignación de información de posición referida al eje próximo-distal tendría lugar sólo dentro de la zP y las células que la abandonan, en condiciones normales, ya no se reprograman. De esta forma, las células mesenquimáticas que inicialmente ocupan el esbozo, luego de los primeros ciclos proliferativos quedan fuera de la zP y forman la región que articula el miembro con el tronco (hombro o cintura escapulohumeral). Las que a continuación abandonan la zP forman el brazo, luego el antebrazo, y así sucesivamente hasta completarse las programaciones correspondientes a cada una de las regiones anatómicamente distinguibles a lo largo del eje próximo-distal. El modo como se estructuran los eventos de desarrollo descritos más arriba explicaría cómo la eliminación de la Cae, y la consiguiente desaparición de la zP, deriva en una interrupción del desarrollo y de la formación de las sucesivas regiones del miembro. Al eliminarse las poblaciones mencionadas disminuye la proliferación y cesan las sucesivas reprogramaciones que sólo ocurren en la zP. El comportamiento arriba descrito también explica cómo, cuando se extirpa la zP de un esbozo “joven” (en el que sólo se ha determinado el segmento proximal 1 y en su lugar se trasplanta la zP de un esbozo viejo en el que ya se han determinado los segmentos 1, 2 y 3, el desarrollo del esbozo del miembro continúa con la formación de las células correspondientes a los segmentos 4 y los más distales. Vale decir, el resultado es la formación de un miembro con una “discontinuidad anatómica” resultante del hecho de que faltan los segmentos que hubieran sido especificados por la zP del esbozo “joven”. Tal discontinuidad anatómica resulta de la “discontinuidad en los valores de información de posición” instalada por el trasplante. El comportamiento descrito en los puntos “a” a “e” explica también el resultado obtenido en el experimento inverso: eliminación de la zP de un esbozo de miembro “viejo” (en el que ya se ha asignado la información de posición correspondiente a los segmentos 1, 2, y 3 y su reemplazo por la zP de un esbozo “joven”, en el que recién se ha asignado la información de posición correspondiente al segmento proximal 1. En este caso, el resultado del intercambio de las zP lleva a la formación de un miembro con una duplicación de algunas regiones del eje próximo-distal: los segmentos 2 y 3 se hallan repetidos debido a que la información de posición necesaria para su formación se ha asignado dos veces. Estos resultados confirman que la asignación de información de posición a lo largo del eje pd depende de interacciones de corto rango de alcance y reprogramaciones que se producen autónomamente en las células de la zP. No se detecta acción alguna de las células mesenquimáticas que ya han abandonado la zP sobre las células de esta última. Vale decir, la zP realiza sucesivas reprogramaciones epigenéticas, en función del tiempo, en forma autónoma, independientemente de los tejidos que ya se han determinado o de los que falta determinar.

Existen algunos resultados experimentales clásicos de irradiación de esbozos de miembros seguidos de trasplantes que también darían sustento al modelo planteado. La irradiación de esbozos de miembros, con dosis subletales de raxos X, seguidos de su trasplante a embriones no irradiados, da lugar a miembros en los que faltan segmentos proximales y desarrollo normal de los distales. En estos experimentos se constata que la extensión de la región proximal faltante se relaciona con la intensidad de la dosis de radiación: cuanto mayor es la dosis de radiación mayor es el número de segmentos proximales faltantes. Una interpretación de estos resultados propone que la radiación eliminaría un cierto porcentaje de células de la zP y que a mayor dosis de radiación se produciría porcentaje mayor de muerte celular. En estas circunstancias, las células sobrevivientes deberían, primero, a) repoblar la zP hasta alcanzar el tamaño normal y luego b) abandonar la zP con una información de posición “más vieja” que la que hubieran recibido en condiciones normales. Así, cuanto mayor es la dosis de radiación, menor es el número de células sobrevivientes y mayor el número de ciclos proliferativos y el tiempo de permanencia de las células en la zP. De esta forma, faltarían los segmentos proximales cuyas reprogramaciones ocurren durante el período de tiempo en el que ninguna célula abandona la zP y, las que salen de la zP ya lo hacen con información correspondiente a los más distales. El modelo descrito proporciona algunas pistas sobre la posible patogenia de ciertas malformaciones congénitas de las extremidades como por ejemplo la focomelia. La droga talidomida administrada a una mujer gestante causa focomelia, entre otras anormalidades. Se desconoce su modo de acción, pero estos resultados sugieren que de alguna manera podría actuar de manera similar a la radiación destruyendo las células del esbozo temprano de la extremidad.

Bibliografía Zwilling E. (1956). Reciprocal dependence of ectoderm and mesoderm during chick embryo limb development. Amer Nat 90: 257-65. Zeller R, López-Ríos J, Zuniga A. (2009). Vertebrate limb bud development: moving towards integrative analysis of organogenesis. Nat Rev Genet 10(12):845-58. Duboc V, Logan MP. (2009). Building limb morphology through integration of signalling modules. Curr Opin Genet Dev 19(5):497-503. SC 14.4. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético III. La asignación de información posicional a lo largo del eje cefálo-caudal (anteroposterior). V. Flores Los esbozos de los miembros, tanto anteriores como posteriores, se constituyen por medio de la asociación del mesénquima somatopleural con el ectodermo. Varios datos indican que, de los dos componentes del esbozo, el que primero adquiere la especificidad de esbozo de miembro es el mesénquima somatopleural. Tal especificidad es adquirida como consecuencia de señales originadas en poblaciones celulares circundantes a las regiones en las que los esbozos se forman. Los sitios de formación de los esbozos superiores e inferiores están definidos con bastante precisión: a) ocupan una zona definida del eje céfalo-caudal del embrión y b) a lo largo de la zona frontera entre las regiones dorsal y ventral del embrión. El mesénquima del esbozo, una vez asignada la identidad de componente del miembro, prolifera activamente y el esbozo sobresale, como una pequeña prominencia, a lo largo del borde mencionado. La adquisición del carácter de “mesénquima del esbozo de miembro” produce, como manifestaciones más tempranas, a) un cambio en la actividad proliferativa y b) la adquisición de la capacidad de “inducir”, en el ectodermo suprayacente la formación de una placoda ectodérmica. Dicha placoda ocupa, durante todo el desarrollo del miembro, el extremo distal o apical del esbozo. Debido a ello, recibe el nombre de cresta apical ectodérmica (Cae). La Cae se ubica como un engrosamiento lineal del extremo del esbozo, a lo largo de la frontera entre las superficies dorsal y ventral de éste.

La adquisición de identidad, por parte del mesénquima y la inducción de la Cae, en el ectodermo, constituyen las primeras manifestaciones del inicio de las interacciones necesarias para el desarrollo del miembro. Dichas interacciones se mantienen hasta que quedan constituidas todas las poblaciones celulares con la información de posición necesaria para formar todas las regiones anatómicas del miembro. Si tales interacciones son interrumpidas experimentalmente, por eliminación de alguno de los dos componentes (por ejemplo: extirpación de la Cae), el crecimiento del miembro y la formación de sus diferentes regiones se detiene. La asignación de información de posición referida al desarrollo del miembro es un fenómeno que requiere la instalación de al menos tres polaridades: las correspondientes a los tres ejes anatómicos sobre la base de los cuales se organizan los tejidos (SC 14.2. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético I. Asignación de información posicional y programación temporoespacial de la morfohistogénesis; SC 14.3. El esbozo de miembro como modelo de campo morfogenético II. La asignación de información posicional a lo largo del eje próximo-distal). En esta síntesis nos ocuparemos específicamente de algunos resultados experimentales que aclaran algunos aspectos sobre cómo se instala la polaridad cf-cd y cómo se asigna información de posición a lo largo de dicho eje espacial. Un modelo muy difundido para el análisis de este fenómeno es el esbozo del ala (miembro superior) del embrión de pollo y la formación de los dedos que se distribuyen, precisamente a lo largo del eje cf-cd. Tal eje, en el caso de la mano humana, se extiende desde el pulgar al meñique. En la región caudal del borde apical del esbozo ‒a lo largo del cual se halla la Cae‒ del ala del pollo se ha detectado la existencia de una pequeña población celular que, al ser extirpada, o ser trasplantada a una región alejada del extremo del esbozo, determina que no se formen los dedos. Varios resultados experimentales indican que dicha región, denominada zona de actividad polarizante (zAP) debido a que instala la polaridad cfcd, es un centro señalizador que genera gradiente(s) de morfógeno(s). El gradiente de morfógeno instalado por la zAP sería la entidad informativa que asigna la información de posición referida a la especificación de los diferentes dedos a lo largo del eje cf-cd. Así, tal asignación dependería de la distancia, o la posición, que ocupan las células del campo respecto de la zAP o, mejor, de la concentración de morfógeno a la cual se hallan sometidas las células que ocupan diferentes posiciones a lo largo del eje mencionado. Se postula que la zAP produce y libera un morfógeno que, distribuyéndose en forma de gradiente, proporciona el mecanismo para el establecimiento de valores de información a lo largo del eje cf-cd. Según este modelo, los distintos dedos estarían especificados por distintos umbrales al factor morfógeno. En el pollo, los dedos son designados con los números 2, 3 y 4. El dedo 4 es el que se halla ubicado más caudalmente y, en consecuencia, su esbozo es el más próximo a la zAP (Fig. SC 14-4-1).

Fig. SC 14-4-1. Ala de pollo. Esquema general que señala los elementos cartilaginosos y los dedos (2, 3 y 4) que son marcadores idóneos para el estudio experimental de la formación de estructuras a lo largo del eje próximo-distal y céfalo-caudal (anteroposterior), respectivamente. Si la información de posición se asigna en términos de diferencias en la concentración de un morfógeno establecidas a lo largo de un gradiente espacial, entonces la programación para la morfogénesis del dedo 4 debería poseer el umbral más alto y la del dedo 2 el umbral más bajo (Fig. SC 14-4-2).

Fig. SC 14-4-2. Zona de actividad polarizante (zAP): se considera que es la fuente de un morfógeno cuyo gradiente establece la información de posición cf-cd. La zAP ubicada normalmente en el margen caudal (posterior) del esbozo establece un gradiente (curva de trazo continuo). Los puntos remarcados en la curva corresponden a las diferentes

concentraciones del morfógeno que corresponden a los distintos dedos de acuerdo con el umbral propio de cada uno de ellos. Los dedos que se forman (realizando la lectura de la margen caudal a la cefálica) son: 4-3-2. Con estos datos se han planteado las siguientes hipótesis: a) Si se trasplanta una zAP adicional al borde anterior del esbozo de miembro, a una distancia tal que el extremo del miembro esté fuera del radio de influencia o de acción de la zAP trasplantada, el desarrollo de los dedos debería ser normal. b) Si se realizan trasplantes de una zAP adicional a lugares cada vez más cercanos al extremo del miembro, debería llegarse a un punto –la distancia a la cual la influencia de la zAP ya afecta las células sensibles al morfógeno‒ en el que se tendría que producir un dedo adicional o supernumerario. Este dedo debería ser el 2 ya que su programación es la que posee un umbral más bajo. A continuación, si la zAP se sigue acercando, el siguiente dedo debería ser el 3. c) Si la zAP adicional es trasplantada a la región cefálica del eje cf-cd, en una posición opuesta a la zAP propia del miembro, debería originarse una duplicación especular de todos los dedos: los dedos deberían ordenarse del siguiente modo: 4-3-2-2-3-4 (Fig. SC 14-4-3).

Fig. SC 14-4-3. El injerto de una zAP adicional en la región cefálica (anterior) del esbozo de miembro origina un gradiente diferente del normal. En la figura se observa la curva de trazos discontinuos representando el gradiente resultante de la actividad de la zAP normal y adicional. La curva de trazos continuos representa el gradiente normal si no se hallara presente la zAP adicional. Los dedos que se forman (realizando la lectura de la margen caudal a la cefálica) son: 4-3-2-2-3-4.

d) Si se trasplanta una zAP adicional en el centro del extremo del esbozo –la zona media del eje cf-cd– la distribución de concentraciones del morfógeno a lo largo del borde de crecimiento debería ser tal que la secuencia de dedos, desde el borde cefálico al caudal, debería seguir la secuencia: 2-3-4-4-3-3-4 o, al menos, una secuencia similar (Fig. SC 14-4-4).

Fig. SC 14-4-4. El injerto de una zAP adicional en la región central del esbozo de miembro origina un gradiente diferente del normal. En la figura se observa la curva de trazos discontinuos que presenta en el gráfico una porción a la izquierda de la zAP adicional que representa el gradiente resultante de la actividad de la zAP normal y de la adicional y otra, ubicada en la zona derecha que representa el gradiente resultante de la actividad exclusiva de la zAP adicional. La curva de trazo continuo representa el gradiente normal si no se hallara presente la zAP adicional. Los dedos que se forman (realizando la lectura de la margen caudal a la cefálica) son: 4-3-3-4-4-3-2. Las cuatro hipótesis planteadas en los párrafos precedentes han sido contrastadas y validadas por los resultados experimentales obtenidos. Algunas observaciones adicionales apoyan la idea de que la asignación de información posicional depende de una señal graduada: a) Si se coloca una zAP extra al lado de la zAP original, la primera no tiene efecto aparente. Nótese que este resultado sería esperable si la zAP actuara como fuente de un morfógeno cuya concentración se regula y permanece fija. b) Si se produjeran modificaciones controladas en la intensidad de la señal (concentración de morfógeno) debería alterarse, sucesivamente, la formación de los dedos: primero el 4, luego el 3 y, finalmente, el 2. Algunos experimentos indican la existencia de una relación dosis-respuesta entre la concentración del factor morfógeno y la actividad morfogénica. Varios experimentos clásicos han intentado estimar el número de células necesario para la especificación de los dedos del ala de pollo. Se obtuvieron células de la zAP y se mezclaron con otras células (externas a la zAP) del borde anterior del esbozo del ala y luego fueron injertadas en la región anterior de varios esbozos de miembro. En estas circunstancias, el dedo 4 se forma cuando el 100% de las células son de la zAP, para la formación del dedo 3 se requiere que un 50% de las células pertenezcan a la zAP y, con un 25% de células de la zAP es suficiente para asignar la especificidad correspondiente el dedo 2. c) Si se irradian zAP a diferentes dosis de radiación se produce un proceso de muerte celular dependiente de la dosis. Si las zAP irradiadas son luego injertadas en esbozos de miembro no irradiados, se observa que sólo las zAP que recibieron dosis muy bajas forman los dedos 4 y 3. El dedo 2 se forma con mayor facilidad ya que su programación morfogenética posee un umbral más bajo. En la actualidad se considera que la proteína señal sonic hedgehog (Shh), entre otras, desempeña un papel importante en la señalización a partir de la zAP. La proteína Shh se distribuye en forma de gradiente en el extremo del miembro. Exhibe un alto nivel de actividad en el borde posterior, bajo nivel en el centro y nulo en el borde anterior. Este gradiente de actividad morfogénica se instala en el esbozo del ala del pollo a partir del 5.o día (estadio 26-27 HH) del desarrollo embrionario, un período del desarrollo equivalente al período somítico del embrión humano. La señal Shh es producida a lo largo del borde posterior del ala del pollo, zona de ubicación de la zAP, y desde esa fuente difunde hacia el centro. La existencia de un proceso de difusión se revela por el hecho de que el perfil de la concentración de morfógeno se altera en situaciones experimentales en las que se interfiere con el proceso de difusión por medio de una membrana semipermeable u otros medios.

Bibliografía

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SC 14.5. El papel del mesodermo en las interacciones epitelio-mesenquimáticas (Int e–m) durante el desarrollo de la piel. El patterning progresivo de la piel. V. Flores, M. Rapacioli La piel es considerada por algunos como un órgano y designada como “órgano cutáneo”. Sin embargo, pese su continuidad anatómica que permite recubrir toda la superficie corporal, posee regiones estructural y funcionalmente tan disímiles que muchos piensan que es más apropiado considerarla un aparato, el “aparato tegumentario”. Las importantes diferencias regionales que exhibe la piel resultan del hecho de que los CCD involucrados en su desarrollo, entre ellos las interacciones epitelio-mesenquimáticas (Int e-m), se ejecutan con particularidades en diferentes regiones. Estas diferencias dependientes-de-espacio revelan la existencia de un patrón morfogenético o polaridad “unidimensional o bidimensional” impresa en el plano de la piel denominada genéricamente polaridad planar. En el caso de la piel en desarrollo, el concepto de patterning alude a que, aunque los tejidos que la componen son los mismos en toda su extensión, exhibe diferencias, tanto en la estructura histológica de sus diversas capas como de los anexos cutáneos, que dependen de la posición que ocupan en la superficie corporal. El patterning que gobierna el desarrollo de la piel se instala progresivamente e incluye aspectos que van desde la definición de grandes regiones corporales (macropatterning), subregiones, distribución de anexos (pelos, glándulas, etc.) (micropatterning) dentro de cada subregión, etc. hasta la regulación de la morfogénesis de cada anexo cutáneo en particular. Para cada tipo de anexo, el patterning alude por un lado al desarrollo del conjunto de propiedades (densidad, distribución espacial, tamaño y orientación respecto de los ejes corporales, etc.) que son típicamente diferentes y dependientes de las coordenadas espaciales en las que se desarrollan. Para ilustrar estos hechos vinculados a los distintos aspectos de patterning considérense dos regiones corporales (1) cabeza y 2) miembro superior) y las subregiones que incluyen cada una de ellas: por un lado a) cuero cabelludo, cejas, pestañas, bigotes, barba, narinas, etc. y, por otro, b) axilas, dorso y vientre de brazo y antebrazo, dorso y palma de las manos, dedos, etc. Estas comparaciones muestran que en cada una de las regiones mencionadas, existe un patterning diferente de las mismas estructuras compuestas por los mismos tipos celulares. Sus diferencias no residen sólo en diferentes formas de citodiferenciación sino, principalmente, en una organización espacial distinta de la diferenciación celular y la histogénesis. En términos generales, la morfogénesis de la piel se resuelve, como en otros sistemas de desarrollo, estableciendo el patterning, en sucesivas etapas, de lo general a lo particular. El proceso global incluye series de Int e-m que han sido clasificadas en tres o más etapas principales: Fase 1. Macropattern. Durante este proceso se instalan en el campo global de la dermis los campos correspondientes a las diversas regiones corporales de la piel. Durante este proceso se asocia la dermis densa que se asocia al epitelio ectodérmico superficial (futura epidermis). Fase 2. Micropattern. Aparición de los esbozos de primordios dentro de los campos regionales homogéneos. Se genera una heterogeneidad en cada región debido a la aparición de esbozos de anexos a distancias interplacodas y distribución topográfica típica. Fase 3. Organogénesis y diferenciación de las propiedades de cada esbozo de órgano anexo. Existen descripciones más elaboradas de este proceso de patterning progresivo de lo general a lo particular (SC 14.6. El micropatterning y la morfogénesis de los órganos anexos cutáneos. La distribución y la inclinación pilosa son

manifestaciones de polaridad planar; SC La instalación progresiva del pattern del desarrollo piloso: de la definición de regiones a la morfogénesis del pelo. El carácter cíclico del mantenimiento de los pelos). La instalación del patterning es un proceso interactivo. Depende de Int e–m que se cumplen con características locales en cada región, y las diferencias regionales pueden ser explicadas, pero sólo en parte, como debidas al diferente origen de los tejidos de las distintas regiones. Son conocidas las diferencias en el origen embrionario del mesénquima precursor de la dermis. El mesénquima subectodérmico, aunque es un tejido continuo, sin límites regionales precisos, tiene múltiples orígenes: a) en la región cefálica y branquial proviene de la cresta neural y el mesodermo paraxil craneales y otros componentes, b) en las regiones anterolaterales del cuerpo es eminentemente somatopleural en tanto que c) en el dorso corporal proviene en su mayor parte del dermatomo del mesodermo paraxil (SC La potencia citogenética de la cresta neural; SC La regionalización y la potencia evolutiva múltiple del mesodermo paraxil, de sus segmentos preóticos y posóticos y de los somitas individuales). Las diferencias de origen mencionadas, sin embargo, no explican la gran variedad de patrones morfogenéticos que exhibe la piel durante su desarrollo. La piel como órgano externo sujeto a interacción permanente con el medio ha sufrido el efecto de una presión selectiva diferencial en distintas regiones del planeta y distintas regiones del propio cuerpo. Debido a ello, a lo largo de la evolución filogenética se han seleccionado diferentes tipos de patrones morfogenéticos en distintas regiones de la piel. Estos diferentes patrones morfogenéticos explican las diferentes características estructurales en relación con las diferentes funciones de la piel de diversas regiones corporales. Un ejemplo simple ilustra este hecho evolutivo. Hasta donde se sabe, el mesénquima de los miembros superiores (o inferiores), o simplemente el de la mano o más acotadamente aún el de los dedos, poseen el mismo origen embrionario. Sin embargo, se han seleccionado patrones morfogenéticos que hacen que en el dorso de los dedos se generen uñas y pelos, elementos rígidos que protegen de diversos tipos de lesiones. Las uñas además son elementos de defensa y pueden ser usadas como herramientas para diversos fines. La yema de los dedos, sin embargo, carece de dichos elementos y, por el contrario, está especializada en la función prensil y en el reconocimiento de objetos por medio de sentido del tacto epicrítico. Pese a que puede suponerse que la presión selectiva pudo haber operado principalmente sobre el componente superficial, el ectodermo, existe evidencia experimental que indica que el mesénquima subectodérmico cumple un papel central en la instalación de los patrones morfogenéticos del tegumento de las diversas regiones corporales. No sólo los tejidos mesenquimáticos subepidérmicos arriba mencionados participan en el desarrollo de la piel. Ello resulta claro en el caso de las regiones de la piel de origen somatopleural. Durante el desarrollo de las paredes corporales anterolaterales, la somatopleura es invadida por mioblastos provenientes del hipómero de los somitas. Aunque estas células sólo poseen potencia miogénica y no participan de la estructura de la piel, la invasión de la somatopleura por células de los somitas es una condición necesaria para la normal citodiferenciación e histogénesis de los tejidos somatopleurales de la piel. En ausencia de células provenientes de los somitas, la somatopleura de la región ventral de la pared abdominal no se diferencia normalmente en tegumentos y queda reducida a una estructura similar al amnios.

Bibliografía Dhouailly D, Olivera-Martínez I, Fliniaux I, Missier S, Viallet JP, Thélu J. (2004). Skin field formation: morphogenetic events. Int J Dev Biol 48: 85-91. Olivera-Martínez I, Viallet JP, Michon F, Pearton DJ, Dhouailly D. (2004). The different steps of skin formation in vertebrates. Int J Dev Biol 48: 107-15. Lin CM, Jiang TX, Widelitz RB, Chuong CM. (2006). Molecular signaling in feather morphogenesis. Curr Opin Cell Biol 18:730-41.

SC 14.6. El micropatterning y la morfogénesis de los órganos anexos cutáneos. La distribución y la inclinación pilosa son manifestaciones de polaridad planar. M. Rapacioli La formación de los folículos pilosos depende de interacciones entre el ectodermo epidérmico y el mesénquima subepidérmico. En los sitios de formación de folículos pilosos, las células mesenquimáticas se aglomeran y secretan señales que actúan sobre la epidermis. Ésta responde secretando señales que difunden y promueven cambios en las células basales de la epidermis que forman placodas a intervalos regulares de 275-350 µm. Se ha propuesto que tal regularidad en la distribución de placodas probablemente dependa del hecho de que los procesos de señalización involucrados se organicen espacialmente al modo de los procesos de reaccióndifusión. Esta postulación se funda principalmente en dos hechos: a) Las observaciones detalladas acerca del modo como se separan las placodas de anexos cutáneos durante el crecimiento planar de la piel muestran que, a medida que la piel se expande, el intervalo interplacodas aumenta y, al alcanzar una distancia umbral, típica para cada región corporal, aparecen nuevas placodas en sitios equidistantes de las preexistentes. b) Ciertas experiencias de simulación in silico basadas en modelos de reacción-difusión permiten reproducir con fidelidad la distribución de diversos órganos cutáneos y los fenómenos descritos en el punto precedente. Las placodas epidérmicas, a su vez, emiten señales que promueven la agrupación de células dérmicas y la formación de una condensación dérmica en relación con cada placoda (Fig.1). Las condensaciones dérmicas, a su vez, emiten señales que estimulan la proliferación de las células epidérmicas. A continuación, las células epidérmicas del anexo proliferan y generan un cordón epitelial de células concéntricas que crece y se introduce en la dermis. Inicialmente las placodas son simétricas pero rápidamente se generan dos compartimentos funcionales con células que poseen citoesqueleto diferentemente organizado, diferente patrón de expresión génica y diferente forma. En la zona superficial del cordón, las células basales del polo anterior se adelgazan y las células del polo posterior adoptan una estructura columnar (Fig. SC 14-6-1). Este hecho produce un crecimiento inclinado del cordón epitelial y define la orientación del pelo. Si bien el fenómeno descrito ocurre en cada folículo piloso, existe una coordinación entre folículos vecinos de modo que cada región corporal exhibe una inclinación típica.

Fig. SC 14-6-1. Morfogénesis temprana del folículo piloso. A. Inicialmente las placodas no exhiben signos de polaridad planar. B-C. Cambios de forma celular diferencial en la zona periférica de las placodas (cabeza de flecha, zonas azul y amarilla) hacen que se produzca

un cambio en la orientación espacial del crecimiento del folículo. Este proceso determina la orientación y grado de inclinación del pelo. Modificado de Devenport y Fuchs, 2008. Este desarrollo asimétrico de los pelos depende de la existencia de una polaridad planar preexistente en las células basales de la epidermis. La polaridad planar implica la existencia de referencias bidimensionales que instalan asimetrías en las células y permiten alinearlas localmente respecto de sus vecinas y globalmente respecto de ejes corporales. Este proceso depende de la expresión de conjuntos de proteínas específicamente involucradas en la polaridad planar (SC Bases moleculares de la instalación, mantenimiento y propagación de la polaridad planar).

Bibliografía DeRouen MC, Zhen H, Tan SH, Williams S, Marinkovich MP, Oro AE. (2010). Laminin-511 and integrin beta-1 in hair follicle development and basal cell carcinoma formation. BMC Dev Biol 10:112. Chen J, Chuong CM. (2012). Patterning skin by planar cell polarity: the multi-talented hair designer. Exp Dermatol 21(2):81-5. SC 14.7. Factores de crecimiento y de transcripción involucrados en la formación de anexos cutáneos. M. Rapacioli Una gran variedad de familias de proteínas con función de desarrollo participan en los procesos por medio de los cuales se determinan, proliferan y diferencian las células que componen la piel y sus órganos anexos. En general, la mayor parte de las proteínas están involucradas en Int e-m y se activan o inhiben como consecuencia de tales interacciones. Muchas de esas proteínas son señales que activan vías de desarrollo, otras son proteínas receptores para dichas señales y otras son factores de transcripción que se expresan en respuesta a las vías de señalización activadas. Estos factores de transcripción, a continuación, actúan sobre sus correspondientes genes blanco (diana) que, a su vez, codifican otras proteínas con función de desarrollo. La generación de esbozos de anexos cutáneos, denominado “micropatterning” está inscrito dentro del contexto de un proceso de patterning de orden más general denominado macropatterning (patterning macroscópico). Algunas proteínas factor de transcripción de la familia Hox y Lef intervienen en la determinación de la variedad y distribución de los diferentes tipos de pelos correspondientes a diferentes regiones corporales, vale decir, en el macropatterning del aparato tegumentario. El micropatterning es resultado de Int e-m localizadas, cada una de ellas restringida a un pequeño dominio del tegumento en el que se forma un esbozo de anexo cutáneo. Sin embargo, la formación de cada esbozo de anexo no es un fenómeno totalmente independiente de la formación de los demás ya que, en conjunto, muestran distribución topográfica, espacios interesbozos y organización espacial típicos para cada región del macropatterning. Los esbozos de los anexos cutáneos son zonas restringidas del tegumento integrados por pequeñas condensaciones mesenquimáticas asociadas a pequeñas regiones ectodérmicas. Tales asociaciones están mediadas por Int e-m en las que las condensaciones mesenquimáticas se comportan como pcD que ejercen una acción determinante sobre el ectodermo suprayacente (que opera como pcC) formándose así pequeñas placodas ectodérmicas. Éstas, a continuación, originan brotes epiteliales primarios que se introducen y crecen en la intimidad del mesénquima. La importancia de las Int e-m en la constitución de estos esbozos se revela por el hecho de que el ectodermo, aislado experimentalmente del mesénquima, y cultivado en un medio de cultivo no se diferencia en epidermis y

no genera esbozos de órganos anexos cutáneos. Por el contrario, cuando el ectodermo es reasociado con el mesénquima de la dermis en el medio de cultivo, entonces sí es capaz de formar los brotes epiteliales precursores de los anexos cutáneos. El agregado de la proteína señal Bmp en los medios de cultivo de explantos de epidermis aislados produce un efecto similar al cultivo en presencia de dermis o de matriz extracelular de la dermis. Así, la proteína Bmp participaría en la determinación de las células ectodérmicas que originarán anexos cutáneos. Entre los pasos iniciales de la formación de los brotes de folículos pilosos están la producción, por parte del mesénquima, de proteínas señal como factores de crecimiento fibroblásticos (Fgf) y Bmp. Estos factores estimulan la proliferación del ectodermo y del mesénquima. El gen con caja homeótica que codifica la proteína factor de transcripción Msx también se expresa durante el desarrollo de los esbozos de los anexos cutáneos. El brote epidérmico, por su parte, libera señales que actúan sobre el mesénquima y conducen a la formación de las papilas. Entre ellas, una proteína señal de la familia Fgf producida por el epitelio actúa sobre el mesénquima subyacente produciendo un aumento de la densidad celular seguida por la expresión de proteínas específicas en dichas células. Otras proteínas, como Frem1, son componentes de membranas basales de algunos órganos. En el caso de la piel estaría involucrada en la constitución de la unión dermoepidérmica y en los procesos de interacción entre dermis y epidermis requeridos para la adhesión de estas dos capas. Algunas de las proteínas de la familia Bmp también están involucradas en los fenómenos de apoptosis que experimentan algunas regiones de la epidermis durante el desarrollo, como en el caso de las membranas interdigitales. Estos factores intervienen asimismo en el control de la iniciación de la fase de crecimiento folicular posnatal. La proliferación de los queratinocitos epidérmicos está sometida a una regulación que involucra factores estimuladores e inhibidores. Entre los primeros pueden citarse las proteínas factor de crecimiento epidérmico (Egf), similar a la insulina (Igf) y fibroblástico (Fgf). Entre los inhibidores se cuentan las proteínas señal factor de crecimiento transformante (Tgf-), factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón.

Bibliografía Stelnicki EJ, Kömüves LG, Holmes D, Clavin W, Harrison MR, Adzick NS, Largman C. (1997). The human homeobox genes MSX-1, MSX-2, and MOX-1 are differentially expressed in the dermis and epidermis in fetal and adult skin. Differentiation 62(1):33-41. van Genderen C, Okamura RM, Fariñas I, Quo RG, Parslow TG, Bruhn L, Grosschedl R. (1994). Development of several organs that require inductive epithelial-mesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice. Genes & Dev 8: 2691-2703. Rogers GE, Hynd PI. (2001). Animal Models and Culture Methods in the Study of Hair Growth. Clinics in Dermatology 19:105-19.

Capítulo 15. Implantación y desarrollo de la placenta Fisiología placentaria Inmunología de la gestación SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 15.1. La implantación del embrión. Significado biológico. Complejidad y etapas del proceso. V.Flores SC 15.2. La adhesión blastocisto-endometrio: fijación y orientación del blastocisto respecto del endometrio. V. Flores SC 15.3. La degradación de la membrana pelúcida. Acciones enzimáticas sinérgicas. La reacción decidual primaria. V. Flores SC 15.4. La diferenciación preimplantatoria del trofoblasto. La reacción decidual primaria. El establecimiento del contacto trofoblasto-endometrio y la invasión temprana. V. Flores SC 15.5. Nociones sobre histogénesis placentaria. Tipos de vellosidades y patrón temporal de diferenciación. V. Flores SC 15.6. La organización estructural y funcional del placentomo. Su variabilidad. Hipótesis sobre la génesis de la morfología del lóbulo placentario. V. Flores

SC 15.7. La diferenciación estructural y funcional de la placenta de término. Los nódulos sincitiales y la membrana vasculosincitial. V. Flores SC 15.8. Los tipos celulares derivados del citotrofoblasto y su especialización funcional. V. Flores, M. Rapacioli SC 15.1. La implantación del embrión. Significado biológico. Complejidad y etapas del proceso. V.Flores La concepción de la implantación como fenómeno integrado en el cual participan activamente el endometrio y el blastocisto proviene de fines del siglo pasado. En 1883, Spee señaló que “el embrión está rodeado en el endometrio de una cavidad de implantación en los bordes de la cual los tejidos uterinos muestran signos de degeneración y lisis"; enfatizó “la aparente actividad histolítica y citolítica del trofoblasto", supuso la existencia de influencias del embrión sobre el endometrio y postuló la ocurrencia en el endometrio de “procesos bioquímicos … [en el útero] … estimulados por [el embrión]". Las ideas planteadas por Spee sobre qué papeles desempeñan el endometrio y el blastocisto durante la implantación, y la importancia de las interacciones entre ambos siguen vigentes. Sus ideas han estimulado innumerables investigaciones que todavía continúan con el objeto de elaborar un modelo que permita interpretar el proceso en toda su complejidad. La implantación consiste en… a)… un conjunto de procesos por medio de los cuales el trofoblasto se introduce en el endometrio, b)… se pone en contacto directo con el medio interno materno y c)… posibilita que el embrión obtenga de la madre todos los elementos necesarios para su desarrollo normal. El embrión no se pone en contacto directo con el medio interno materno. Se vincula con él a través del corion, derivado trofoblástico que establece y regula las interacciones con la madre. Si bien es el trofoblasto, y no el embrión propiamente dicho, el que contacta con la madre, al estar aquél formado por células de una composición genética distinta de la de la madre, la implantación implica el contacto directo entre dos individuos genéticamente distintos. Esto involucra aspectos inmunitarios en el proceso de implantación. La implantación ocurre en un contexto hormonal delicadamente controlado. Las funciones tubáricas y la maduración del endometrio están regulados hormonalmente. El éxito de la implantación requiere una sincronización entre estos procesos y la maduración del embrión.

La regulación de la implantación requiere fenómenos que involucran interacciones locales paracrinas y acciones endocrinas que se realizan a larga distancia. En las etapas iniciales de la implantación, el endometrio y el blastocisto interactúan localmente por medio de agentes de diversa naturaleza química. Todos estos procesos deben ocurrir en una secuencia ordenada para que ocurra una implantación normal. Constituyen las características que hacen considerar a la implantación como un proceso biológico dinámico de alta complejidad en el que tanto blastocisto como endometrio participan activamente.

La secuencia de interacciones endometrio-trofoblasto durante la implantación del embrión Con fines descriptivos, en el proceso de implantación se han definido varias etapas. Los límites entre ellas son convencionales y su número depende del grado de detalle de la descripción y análisis: a) Los acontecimientos a los cuales se suele asignar el carácter de signos de inicio de la implantación son, por parte del embrión, la expansión del blastocisto y, por parte del endometrio, la aparición de diferenciaciones de la membrana apical de las células del epitelio uterino denominadas pinópodos (SC El período de receptividad del endometrio. Características ultraestructurales y moleculares de la ventana de implantación). b) A este fenómeno sigue más o menos inmediatamente la degradación de la membrana pelúcida y la eclosión del blastocisto. c) Una vez libre el blastocisto, se inicia la adhesión blastocisto-endomentrio. A continuación se produce la penetración en el endometrio simultáneamente con la diferenciación del trofoblasto en un sincitio. En algunas especies se produce una reacción sincitial localizada en las células endometriales en las proximidades del blastocisto. d) En la especie humana, luego del contacto trofoblasto-epitelio endometrial, las superficies laterales de las células epiteliales endometriales se separan y entre ellas se introducen prolongaciones y células trofoblásticas. e) A continuación se produce una erosión del epitelio, debido a la degeneración y descamación de células epiteliales, en la zona de contacto endometrio- blastocisto. f) Luego, el trofoblasto sincitial toma contacto con el estroma y se inicia la invasión de éste. g) Una vez que la vesícula coriónica ha penetrado completamente en el endometrio, la zona de erosión superficial se repara. El embrión queda entonces totalmente incluido en la mucosa uterina. h) Como etapa final, los derivados del trofoblasto (citotrofoblasto y sincitiotrofoblasto) se asocian al mesodermo extraembrionario somático. Los tres tejidos se organizan en tres capas que, en conjunto, forman el corion. Las etapas mencionadas están en parte superpuestas temporalmente: mientras el blastocisto se aproxima al endometrio, se inicia la diferenciación temprana del trofoblasto polar, el blastocisto se expande y se disuelve la membrana pelúcida. Sólo por conveniencia didáctica se las separa de esta forma.

Bibliografía Carson DD, Bagchi I, Dey SK, Enders AC, Fazleabas AT, Lessey BA & Yoshinaga K. (2000). Embryo implantation. Dev Biol 223(2):217-37.

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Existen trabajos que, con enfoque y metodología eminentemente biofísicos, han permitido calcular la intensidad de las fuerzas que se desarrollan entre líneas celulares derivadas del epitelio uterino y células trofoblásticas humanas en distintos momentos del ciclo. El método consiste en aproximar las superficies apicales de ambos epitelios y, a través de sucesivos ciclos de aproximación-separación, de diferente duración, estimar, por medio del uso del microscopio de fuerza atómica, la intensidad de las fuerzas de repulsión y adhesión entre las superficies apicales de ambos tipos celulares. Estos estudios muestran que, cuando los epitelios están suficientemente cerca, aparecen fuerzas repulsivas pero que, una vez superadas éstas, aparecen fuerzas de adhesión de diversa intensidad. Estos estudios permiten comprobar que existen fuerzas de atracción intensas y que sus valores de intensidad dependen de las características del glucocáliz y también de las diferenciaciones de las membranas apicales.

Fig. SC 15-2-1. Esquema de la adhesión-orientación del blastocisto respecto del endometrio. A. El endometrio posee zonas de alta afinidad respecto del trofoblasto polar del blastocisto. Ello aumenta la probabilidad de implantación en un sitio ricamente vascularizado. B. El trofoblasto posee un sitio de alta afinidad, el trofoblasto polar, respecto del endometrio. Ello aumenta la probabilidad de que el embrión quede en la zona más profunda y mejor vascularizada del endometrio. Así, las características adhesivas de las superficies del blastocisto y del epitelio endometrial por un lado dependen de fenómenos sistémicos, como los niveles hormonales maternos en el momento de la implantación, y también de fenómenos locales regulados por moléculas que operan como mediadores locales. La composición química de las superficies interactuantes, trofoblasto del blastocisto y epitelio endomentrial, no sólo regulan el sitio de implantación y la orientación del blastocisto, sino también el momento o período de tiempo, denominado ventana de implantación, en el que dicho proceso se produce con mayor probabilidad. Dicho período de tiempo, de máxima receptividad del endometrio, se caracteriza también por la expresión de una combinatoria típica de proteínas integrinas, componentes integrales de la membrana apical de las células del epitelio uterino. Dichas proteínas confieren al epitelio uterino la posibilidad de realizar procesos de adhesión y de señalización celular entre las células embrionarias y maternas.

Bibliografía Thie M, Röspel R, Dettmann W, Benoit M, Ludwig M, Gaub HE, Denker HW. (1998). Interactions between trophoblast and uterine epithelium: monitoring of adhesive forces. Hum Reprod 13(11):3211-19. Denker HW, Thie M. (2001). The regulatory function of the uterine epithelium for trophoblast attachment: experimental approaches. Ital J Anat Embryol 106(2-Suppl 2):291306. SC 15.3. La degradación de la membrana pelúcida. Acciones enzimáticas sinérgicas. La reacción decidual primaria. V. Flores Algunos estudios bioquímicos realizados en el líquido intrauterino muestran que en él se encuentran prácticamente todas las enzimas necesarias para la degradación de la membrana pelúcida: una variedad de enzimas genéricamente denominadas glucosidasas y proteasas (exopeptidasas y endopeptidasas). La concentración de estas enzimas varía con el ciclo sexual. También existen variaciones asociadas a la presencia del blastocisto en la cavidad uterina. Ciertos estudios histoquímicos tendientes a identificar las células que sintetizan estas enzimas han puesto de manifiesto que, con diferencias para las distintas especies y enzimas en su síntesis, participan activa y coordinadamente el endometrio y el blastocisto. Por parte del endometrio, tanto el epitelio como el estroma participan en su síntesis y secreción. En el blastocisto, la fuente fundamental de enzimas es el trofoblasto. En las secreciones uterinas también se ha encontrado un patrón característico de uteroglobinas. Estas proteínas tendrían funciones regulatorias de las interacciones entre endometrio y blastocisto. La síntesis de uteroglobinas también es sensible a las variaciones en los niveles hormonales maternos. Varios estudios bioquímicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos realizados en úteros de animales preñados ‒ en los cuales existe un blastocisto en la cavidad uterina‒ y seudopreñados –en los cuales no hay blastocisto en la cavidad uterina‒ muestran que el blastocisto ejerce un efecto estimulante de la síntesis y liberación de algunas de las enzimas antes mencionadas. Estos estudios muestran que el efecto estimulante de la síntesis y secreción de enzimas, ejercido por el blastocisto, se produce a) antes de que exista contacto físico entre blastocisto y endometrio y, significativamente, b) sólo se produce en las proximidades del blastocisto. Estas dos circunstancias sugieren que dicho efecto está mediado por moléculas señal difusibles liberadas por el blastocisto y que éstas tienen escaso rango de acción. Los cambios locales que sufre el endometrio en respuesta a señales difusibles del blastocisto, antes de que éste tome contacto con el epitelio endometrial se denominan reacción decidual primaria para distinguirlos de los cambios denominados reacción decidual que sufre el endometrio cuando ya es invadido por el blastocisto. Algunos estudios realizados para investigar el papel funcional de estas enzimas (tratamiento enzimático de membranas pelúcidas in vitro, inyección intrauterina de inhibidores de las distintas enzimas, etc.) muestran que las glucosidasas por sí solas no son capaces de lisar la membrana pelúcida y que las exopeptidasas (fundamentalmente aminopeptidasas) tampoco la disgregan completamente. Las endopeptidasas, sobre todo las sintetizadas por el blastocisto, poseen un efecto más intenso sobre la membrana pelúcida. Varios estudios de este tipo muestran que las enzimas actúan sinérgicamente durante la degradación de la membrana pelúcida. Las glucosidasas y exopeptidasas actúan en las fases preparatorias produciendo la

degradación parcial de algunos de los componentes de la membrana. A continuación, la acción de las endopeptidasas la disgregaría por completo.

Figura SC 15.3.1. Modelo de las acciones sinérgicas, y en cascada, de las diversos tipos de enzimas que participan en la degradación de los componentes específicos de la membrana pelúcida. Diversos estudios muestran que tanto el blastocisto como el endometrio participan activamente aportando enzimas que degradan la membrana pelúcida. La figura precedente ilustra esquemáticamente un modelo de la acción sinérgica (en cascada) de las enzimas que participan en la degradación de la membrana pelúcida. El modelo propone la siguiente secuencia de eventos: 1) La acción de las glucosidasas tendría como efecto la eliminación sucesiva de los distintos monosacáridos constituyentes de las cadenas laterales de oligosacáridos. 2) Una enzima en particular, la O-seril-N-acetilgalactosaminidasa, rompería la unión del azúcar al aminoácido serina (SER) de la proteína. 3) Una vez que la proteína está desprovista de las cadenas laterales de oligosacáridos, estaría expuesta a las exopeptidasas (aminopeptidasas y carboxipeptidasas) que actuarían con mayor eficacia. 4) Finalmente, las endopeptidasas la degradarían por completo actuando en varios puntos de su estructura.

Bibliografía Perona RM, Wassarman PM. (1986). Mouse blastocysts hatch in vitro by using a trypsinlike proteinase associated with cells of mural trophectoderm. Dev Biol 114(1):42-52. Seshagiri PB, Roy SS, Sireesha G, Rao RP. (2009). Cellular and molecular regulation of mammalian blastocyst hatching. J Reprod Immunol 83(1-2):79-84. SC 15.4. La diferenciación preimplantatoria del trofoblasto. La reacción decidual primaria. El establecimiento del contacto trofoblasto-endometrio y la invasión temprana. V. Flores La diferenciación temprana, o preimplantatoria, del trofoblasto, previa a la eclosión del blastocisto, lleva a la adquisición de la capacidad para degradar la membrana pelúcida y, precisamente, conduce a la eclosión. La diferenciación prosigue luego, pero con otras características, durante el contacto con el endometrio y su penetración. La diferenciación temprana se inicia con la proliferación de algunas regiones del trofoblasto y la formación de engrosamientos o botones trofoblásticos compuestos por células redondeadas. En algunas especies, este fenómeno se produce en varias zonas del trofoblasto. En la especie humana ocurre sólo en el trofoblasto polar que recubre el disco embrionario. A continuación, las células crecen. Aumenta el tamaño del citoplasma y del núcleo y secretan las enzimas que producen la degradación de la membrana pelúcida y la eclosión del blastocisto. La reacción decidual primaria es respuesta a estímulos provenientes del embrión. Simultáneamente con la maduración del blastocisto y la degradación de la membrana pelúcida en el endometrio se producen varios

cambios. En las cercanías del blastocisto, el estroma se vuelve edematoso, los vasos se dilatan, se congestionan, y la actividad secretoria de las glándulas aumenta. Estas modificaciones se inician antes de cualquier contacto efectivo entre blastocisto y endometrio y depende de la liberación de sustancias difusibles que median tales interacciones. El blastocisto produce y libera factores de crecimiento, hormonas peptídicas (gonadotrofina coriónica), hormonas esteroideas (estrógenos), prostaglandina, histamina, etc., que actúan en el endometrio en forma local, También se ha demostrado una importante actividad secretoria por parte de los mastocitos y otras células endometriales con la secreción de citoquinas proinflamatorias. Tal actividad coadyuvaría a la acción de las sustancias provenientes del blastocisto. El endometrio no actúa pasivamente. Durante esta fase temprana, las células de revestimiento epitelial uterino sufren a) una importante diferenciación molecular puesta de manifiesto por la expresión de un patrón típico de proteínas transmembrana, como las integrinas y b) una diferenciación ultraestructural del dominio apical de la membrana plasmática con la formación de prolongaciones o abultamientos de la membrana apical que exhiben alta adhesividad respecto del trofoblasto. Precisamente la aparición de ambas diferenciaciones es considerada como indicio, por parte del endometrio, del inicio de la “ventana de implantación” o “período de receptividad” para la implantación. El contacto blastocisto-endometrio tiene dos etapas: a) una primera etapa de adhesión lábil en la que ambos pueden unirse en forma débil y pueden volver a separarse y b) una segunda etapa unión estable en la que el contacto es irreversible y va seguido de la invasión del epitelio. La adhesión lábil estaría mediada por interacciones entre los componentes de los glucocálices de ambos epitelios y la unión estable consiste en el contacto directo entre componentes de las membranas plasmáticas, formación de interdigitaciones y diferenciaciones de unión de las superficies apicales de ambas poblaciones celulares (microvellosidades del trofoblasto y pinópodos de las células endometriales) (SC 15.2. La adhesión blastocisto-endometrio: fijación y orientación del blastocisto respecto del endometrio). Luego de la unión estable entre las células maternas y embrionarias, en la que las membranas quedan transitoriamente interdigitadas, las membranas se alisan, se adosan íntimamente y las diferenciaciones de unión permanecen durante un tiempo. A continuación, prolongaciones de las células trofoblásticas se introducen entre las células del epitelio uterino. En algunas especies, el epitelio uterino sufre una reacción sincitial. En otras se descama dejando el estroma expuesto. En mamíferos se han identificado al menos cuatro variantes de estrategias por medio de las cuales las células del trofoblasto atraviesan el epitelio uterino y entran en contacto con el estroma endometrial. Estas cuatro variantes básicas están ilustradas por el modo como se produce este fenómeno en otros tantos conjuntos de especies (ratas y ratones, hámsteres, conejos y primates).

x Fig. 15-4-1. Estrategias básicas de contacto y penetración del epitelio uterino en diferentes especies. En todos los casos se trata de poner al embrión en contacto con el medio interno materno. Estos modelos se basan en análisis realizados al nivel de la microscopia electrónica de transmisión. Las células del trofoblasto generan una discontinuidad en el epitelio uterino induciendo apoptosis, emitiendo brotes, fusionándose con las células uterinas o realizando una reacción sincitial e intercalándose con las células epiteliales. A. Adhesión-orientación del blastocisto al endometrio. B. Detalle de la penetración del trofoblasto en el epitelio endometrial. C-E. Ilustran el proceso en otras especies. AT.: dentro de la fig. cambiar pellúcida  pelúcida En todos los casos las células epiteliales se agrandan, se vuelven vesiculosas y se llenan de lisosomas y lisofagosomas. Algunas modificaciones similares se observan en las células del estroma subepitelial. Se discute si las células endometriales son eliminadas exclusivamente por la acción enzimática del blastocisto, o si es fundamentalmente un fenómeno de autodegradación en respuesta a estímulos provenientes de éste, pero existe consenso en la idea de que en el proceso participan activamente el trofoblasto y el epitelio y estroma endometriales. La invasión del estroma. El control enzimático de la degradación de la matriz extracelular. La penetración del blastocisto en el endometrio requiere la desintegración de la matriz extracelular y de las fibras del tejido conectivo que constituyen su soporte. Dicho proceso es llevado a cabo por la acción de enzimas liberadas al intersticio. Se trata de actividades enzimáticas similares, en algunos casos, a las involucradas en la degradación de la membrana pelúcida. Por medio de diversos ensayos bioquímicos ‒prueba de afinidad de sustrato‒ se ha podido determinar que algunas son de origen materno y otras de origen embrionario. Describimos a continuación un ejemplo sobre cómo una enzima de origen embrionario puede actuar integradamente con las maternas.

Se sabe que el trofoblasto es capaz de sintetizar y secretar una enzima denominada activador del plasminógeno (PA). Se trata de una enzima con capacidad para degradar proteínas (proteasa) extracelulares que cumple un papel importante en la invasión del endometrio. El PA es una enzima de alta especificidad de sustrato, vale decir, capaz de actuar sobre un rango muy reducido de sustratos posibles. Sin embargo, se postula que participa en la degradación de una variedad muy grande de componentes de la matriz extracelular. Ello es posible debido a que puede iniciar una cascada de actividades enzimáticas de origen materno. El gráfico que sigue ilustra esquemáticamente el proceso. El modelo, representado esquemáticamente, propone la siguiente sucesión de eventos: >a) El PA ‒de origen embrionario‒ actúa sobre el plasminógeno (de origen materno) activándolo a plasmina. >b) La plasmina, que posee amplio rango de sustrato, degrada varios componentes de la matriz extracelular (glucoproteínas, proteoglucanos, laminina, fibronectina, etc.) >c) La plasmina, además, es capaz de activar algunas proenzimas como las procolagenasas tipos VI y V que se transforman en colagenasas >d) Las colagenasas degradan las fibras del intersticio endometrial y de las membranas basales de los vasos uterinos. e) La degradación de todos los componentes mencionados conduce a la desorganización de la matriz extracelular del estroma uterino y de las paredes de los vasos endometriales (SC Procesos regulados de proteólisis extracelular y de remodelación de la matriz extracelular). Este ejemplo ilustra cómo la implantación requiere la acción conjunta de sistemas enzimáticos de origen embrionario y materno.

Bibliografía Norwitz ER, Schust DJ, Fisher SJ. (2001). Implantation and the Survival of Early Pregnancy. New Eng J Med 345(19):1400-8. van Mourik MS, Macklon NS, Heijnen CJ. (2009). Embryonic implantation: cytokines, adhesion molecules, and immune cells in establishing an implantation environment. J. Leukoc Biol 85:4-19. Carson DD, Bagchi I, Dey SK, Enders AC, Fazleabas AT, Lessey BA, Yoshinaga K. (2000). Embryo implantation. Dev Biol 223(2):217-37. SC 15.5. Nociones sobre histogénesis placentaria. Tipos de vellosidades y patrón temporal de diferenciación. V. Flores El corion se desarrolla durante toda la gestación y sufre cambios adaptativos a los requerimientos fetales. Una vez que el corion llega a su máxima eficacia funcional en la especie humana posee al menos 5 tipos diferentes de organización de vellosidades coriales. Estos diferentes tipos de vellosidades van apareciendo unos a continuación de los otros o, en algunos casos, unos diferenciándose en otros. La figura SC 15-5-1 ilustra esquemáticamente la organización básica de un placentomo (lóbulo placentario o unidad anatomofuncional placentaria) y de la organización de las vellosidadades en su región periférica. (SC 15.6. La organización estructural y funcional del placentomo. Su variabilidad. Hipótesis sobre la génesis de la morfología del lóbulo placentario). Posee un tronco central a través del cual nacen elementos periféricos que, según van madurando van transformándose y, además, generan nuevas ramas con organización menos diferenciada.

Una vellosidad troncal ocupa el centro de la unidad y posee un extremo terminal en constante crecimiento (vellosidad intermedia inmadura) y ramas más diferenciadas (vellosidad intermedia madura) de las que brotan vellosidades terminales. Éstas constituyen diferenciaciones estructurales y funcionales en las que asientan las membranas vasculosincitiales especializadas en el transporte de gases y nutrientes.

Fig. 15-5-1. A. Esquema de la organización de un lóbulo placentario o placentomo. B. Esquema de la organización de región periférica de un lóbulo placentario. 1. En el centro del esquema, región superior, se ilustra una gruesa vellosidad correspondiente a una vellosidad troncal (rama de un tronco vellositario principal). 2. La vellosidad troncal se continúa, centro de la región inferior, con una estructuración diferente, y más inmadura de sus tejidos, en una vellosidad intermedia inmadura. 3. Como ramas de la vellosidad troncal surgen las vellosidades intermedias maduras. 4. Estas últimas dan nacimiento a vellosidades terminales en las que asientan zonas con membrana vasculosincitial. 5. En los extremos de las vellosidades intermedias maduras e inmaduras, como manifestación de crecimiento permanente de la placenta, se hallan las vellosidades mesenquimáticas. Poseen una estructura similar a las primitivas vellosidades que se forman durante la implantación y, como ellas, se clasifican en 1.ª, 2.ª y 3.ª. La figura SC 15-5-2 muestra esquemáticamente la estructura básica de cada tipo de vellosidad. 1) Vellosidades coriales troncales. Corresponden a las primeras ramificaciones (unas cuatro generaciones) cortas y gruesas que sostienen todo el árbol velloso. Representan un tercio del volumen total del tejido velloso de la placenta madura. Ocupan la región central subcorial del lóbulo placentario. Poseen un eje de mesénquima compacto con arterias, venas, arteriolas y vénulas y algunos capilares superficiales. 2) Vellosidades intermedias maduras. Son ramas laterales (periféricas) de las vellosidades troncales sobre las cuales asienta la mayor parte de las vellosidades terminales. Tienen un diámetro de 60-150 μm. Representan un cuarto de las vellosidades coriales de la placenta madura; tienen un eje de mesénquima muy laxo que ocupa el

50% del volumen de la vellosidad a través del cual corren arteriolas, vénulas y capilares. El CTB es discontinuo en partes y el SCTB posee un grosor uniforme con núcleos regularmente distribuidos. 3) Vellosidades terminales. Son las ramas finales (hojas) del árbol velloso; nacen de las vellosidades intermedias maduras como protrusiones vesiculosas debido a que contienen capilares sinusoidales muy dilatados que ocupan la mayor parte de la vellosidad. El SCTB posee la típica estructura diferenciada en nódulos sincitiales y membrana vasculosincitial (SC 15.7. La diferenciación estructural y funcional de la placenta de término. Los nódulos sincitiales y la membrana vasculosincitial). A estas vellosidades, que empiezan a aparecer en la 27.ª SD, les corresponde un 30-40% del volumen del árbol velloso, un 50% de la superficie sincitial total y constituyen un 60% de las vellosidades en el corion maduro. 4) Vellosidades intermedias inmaduras. Corresponden a la región terminal de las vellosidades troncales. Predominan en las placentas inmaduras. Poseen un eje de mesénquima laxo y abundante con muchos macrófagos y un lecho vascular de arteriolas, vénulas y capilares. Tienen una capa de CTB y un SCTB de grosor regular y núcleos homogéneamente distribuidos. 5) Vellosidades mesenquimáticas. Corresponden a un estado de desarrollo temprano, y transitorio, de la vellosidad corial. A este tipo corresponde la primera generación de vellosidades coriales. Son, relativamente, más abundantes al principio, pero se siguen formando durante toda la gestación, preferentemente, en los extremos terminales de las últimas ramas (las más jóvenes) de las vellosidades intermedias inmaduras. Pasan por los tres estados básicos descritos para la primera generación de vellosidades: a) de proliferación CTB, b) invasión de mesénquima y c) vascularización. Desde sus extremos de crecimiento terminales de forma cónica, en dirección proximal, se siguen observando estas tres estructuraciones mencionadas. A continuación, se diferencian en vellosidades intermedias maduras y, las que quedan en el extremo de crecimiento del árbol, en vellosidades intermedias inmaduras. Éstas siguen formando nuevas vellosidades mesenquimáticas hasta que crece y se diferencia en parte del tronco velloso. El eje de mesénquima es laxo, abundante, con pocos macrófagos y una red capilar en formación. Poseen una capa continua de CTB y, por afuera, un SCTB de grosor regular y núcleos homogéneamente descritos.

Fig. SC 15-5-2. Representación esquemática de la estructura histológica de los distintos tipos de vellosidades que integran la región periférica del lóbulo placentario o placentomo. (Modificado de Haines & Taylor. Textbook of Obstetrical and Gynaecological Pathology. 4th ed. 1995). El patrón temporal de diferenciación de vellosidades coriales. Durante las primeras semanas todas las vellosidades (1.ª, 2.ª y 3.ª) son mesenquimáticas. Desde la 8.ª SD en adelante, poco antes de que se inicie la circulación sanguínea, las que se han formado primero empiezan a diferenciarse en vellosidades intermedias inmaduras que, poco más tarde, se diferencian en troncos vellosos. Mientras tanto, en los extremos de vellosidades intermedias inmaduras se van formando nuevas vellosidades mesenquimáticas que, a su vez, siguen el patrón de diferenciación de las primeras (mesenquimáticas intermedias inmaduras  troncos vellosos). La formación de nuevas vellosidades mesenquimáticas y su diferenciación ulterior en intermedias inmaduras empieza a disminuir al final del 2.º trimestre, pero siempre continúa a un ritmo menor en las zonas centrales del lóbulo placentario. Desde el principio del 3.er trimestre, las vellosidades mesenquimáticas se diferencian preferentemente en intermedias maduras, que originan a las vellosidades terminales. Estas últimas son las que predominan en la placenta de término. Cada lóbulo placentario sigue esta secuencia de eventos aunque a un ritmo diferente según se trate de la región central o periférica de la placenta. Nótese que la zona central de la placenta es siempre más “vieja” que la periférica y, en consecuencia, posee un mayor desarrollo y crecimiento de todas las estructuras mencionadas.

Bibliografía Fox H. (1997). Aging of the placenta. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 77:171-5. Kaufmann P. (1982). Development and differentiation of the human placental villous tree.

Bibl Anat 22:29-39. Kaufmann P, Sen DK, Schweikhart G. (1979). Classification of human placental villi. I. Histology and scanning electron microscopy. Cell Tissue Res 200:409-23. SC 15.6. La organización estructural y funcional del placentomo. Su variabilidad. Hipótesis sobre la génesis de la morfología del lóbulo placentario. V. Flores El cotiledón placentario. Clásicamente se consideró a los cotiledones placentarios como las unidades anatomofuncionales de la placenta incluso se enfatizado, en la práctica obstétrica, la importancia de contar el número de cotiledones con el objeto de constatar que ninguno se haya desprendido de la placa corial y retenido en el útero. El número de cotiledones, sin embargo, no es constante sino, por el contrario, muy variable. Cuando están bien demarcados su número oscila, de acuerdo con Boyd y Hamilton, entre 10 y 38. Estos autores, sin embargo, admiten que los cotiledones se hallan integrados por unidades anatomofuncionales o "placentomos", también denominados “lóbulo placentario” o “vellón” (SC 15.5. Nociones sobre histogénesis placentaria. Tipos de vellosidades y patrón temporal de diferenciación). Se ha señalado que la placenta de término puede poseer alrededor de 200 lóbulos y que los "cotiledones" observables a simple vista, sobre su superficie decidual, resultan simplemente de la superposición de lóbulos. En la placenta de término existirían alrededor de 20-40 troncos vellositarios principales. Los más voluminosos de estos troncos principales podrían originar hasta cinco lóbulos mientras que los más pequeños forman uno solo. El término cotiledón será usado aquí sólo para designar las regiones delimitadas por tabiques placentarios. La estructura lobular del corion. La organización lobular de la placa corial se relaciona típicamente con la distribución de las desembocaduras de los vasos maternos arteriales y venosos en el espacio intervelloso (Véase la figura 15-14, B del texto impreso). En su forma más simple (Fig. SC 15-6-1), un lóbulo placentario está compuesto por un tronco vellositario principal que nace de la placa corial y da origen a 3-5 generaciones de troncos vellositarios secundarios.

Fig. SC 15-6-1. Esquema de la organización de un lóbulo placentario simple. Éstos se originan a partir de troncos vellositarios principales relativamente pequeños de los que surgen pocas ramas secundarias, la mayoría de las cuales son vellosidades de anclaje. Con el propósito de dejar ver con claridad la disposición en barril de las vellosidades de anclaje, se representa sólo parcialmente la organización vellositaria periférica del lóbulo. Los troncos vellositarios voluminosos pueden originar placentomos más complejos (Véase figura SC 15-6-2). Éstos, o algunos de éstos, a su vez originan troncos vellositarios de anclaje que desde el sitio de su nacimiento en el tronco principal, o un tronco secundario, se dirigen hasta la placa basal en la cual se anclan. Los troncos vellositarios de anclaje, típicamente, describen trayectorias curvilíneas. Ello confiere al lóbulo una forma global de barril ("tambours", "baskets", "barrels", etc. son términos comúnmente usados para describirlos) con una zona media ancha y dos extremos más delgados. Se ha propuesto que tal disposición es una adaptación al modo como circula la sangre en el espacio intervelloso (EIV). Los puntos de inserción de los troncos vellositarios de anclaje que conforman un lóbulo describen en la decidua una zona aproximadamente circular denominada "corona de implantación". Los lóbulos placentarios poseen tamaño y estructura variable. En placentas próximas al término se han contado alrededor de 200 lóbulos, entre los cuales existen alrededor de 10 grandes, unos 50 medianos y los demás pequeños. La mayor parte de la masa del corion está representada por los grandes y medianos. Algunos estudios describen alrededor de 20 a 40 troncos vellositarios principales en placentas de cualquier edad. Los troncos vellositarios principales grandes originan troncos vellositarios secundarios que pueden originar varios lóbulos dependientes de un único tronco vellositario principal (Fig. SC 15.6.2). En la placenta de término, algunos troncos vellosos muy voluminosos pueden originar hasta 4 o 5 troncos vellosos secundarios que originan otros tantos lóbulos. Los más pequeños sin embargo forman sólo uno, como se ilustra en lafigura SC 15-6-1.

Fig. SC 15-6-2. Esquema de la organización de un placentomo complejo. Los troncos vellosos principales muy voluminosos pueden generar troncos vellositarios de diversa generación (secundarios, terciarios, etc.), que dan origen a vellosidades de anclaje que se

distribuyen en varios lóbulos adyacentes. Los troncos principales pequeños, en general, forman un solo lóbulo (Véase figura SC15-6-1). Un tronco vellositario principal voluminoso no necesariamente origina vellosidades de anclaje para un único lóbulo. Esta condición se cumple casi exclusivamente en los lóbulos pequeños. En la placenta de término se pueden hallar lóbulos placentarios cuyas vellosidades de anclaje provienen de diferentes troncos vellosos principales (Fig. 3). Esta circunstancia probablemente ocurra en la periferia del área de distribución de un tronco principal que abastece a varios lóbulos, vale decir, en zonas limítrofes donde se superponen vellosidades de anclaje originadas a partir de troncos vellosos principales adyacentes.

Fig. SC 15-6-3. Muchos lóbulos están integrados por vellosidades de anclaje que provienen de ramas de troncos vellositarios principales diferentes. Dada la disposición curvilínea de las vellosidades de anclaje ‒que definen la forma del lóbulo placentario‒ y dado que de ellas nacen las vellosidades libres y sus subdivisiones, la densidad de vellosidades en el EIV dista mucho de ser homogénea (Fig. SC 15.6.4). En el espacio comprendido entre las dos placas de la placenta, la organización de lóbulos adyacentes permite definir las 5 regiones ilustradas en la figura SC 15.6.4. Cada lóbulo está ocupado en su periferia por una densa masa de vellosidades libres pequeñas que son en su mayoría ramas terminales. La mayor parte de los lóbulos poseen una región central laxa, con una densidad de vellosidades baja. Las zonas interlobulares que también poseen una baja densidad se continúan con la región subcorial de aspecto similar. La región basal del lóbulo, vale decir aquella circunscrita a la corona de implantación, posee una densidad alta.

Fig. SC 15.6-4. Representación esquemática del modo como se distribuyen en el espacio intervelloso las vellosidades coriales. En el espacio intervelloso de la placenta humana se pueden detectar zonas con diferente densidad de vellosidades libres. (Descripción en el texto). Hipótesis sobre el desarrollo de la arquitectura lobular de la placenta. La correspondencia topográfica entre sitios de desembocadura de arterias maternas y sitios de inserción de vellosidades de anclaje (véase Fig. SC 15.6.4 B del texto impreso) ha llevado a postular una hipótesis sobre cómo se desarrolla la estructura lobular de la placa corial. El desarrollo de la placenta involucra, por un lado, un aumento del grosor y, por el otro, una expansión circunferencial más allá de los límites de la zona de implantación original. La expansión involucra tanto a la placa corial como a la placa basal. Es posible suponer que durante el crecimiento de la placenta las vellosidades de anclaje primitivas originan otras que también se insertan en la placa basal. Si los sitios de inserción de estas últimas, durante la expansión circunferencial de la placa basal, se separan unas de otras y si ellas se forman y persisten sólo en aquellas zonas mejor irrigadas ‒vale decir, en la zona de orificios arteriales‒, se explicaría la correspondencia entre localización de vellosidad de anclaje y de arterias maternas. La forma relativamente circular del lóbulo y la corona de implantación podría explicarse como consecuencia de la modelación recíproca entre conjuntos de vellosidades de anclaje originadas a partir de troncos vellositarios principales adyacentes. La forma particular de cada lóbulo, con vellosidades de anclaje periféricas que describen arcos de circunferencia, podría ser explicada por la operación de fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo arterial. Vale decir, la forma de las vellosidades de anclaje se correspondería con la de los vectores que representan las fuerzas generadas por el flujo arterial. Si el desarrollo y mantenimiento de las vellosidades libres fuera afectado por la calidad de la sangre que las baña se podría explicar también la existencia de zonas con diferente densidad de vellosidades en el EIV. Las zonas mejor irrigadas tendrían alta densidad (periferia lobular) y las peor irrigadas (centro lobular y zonas subcorial e interlobular) tendrían baja densidad.

Bibliografía Boyd JD, Hamilton WJ. (1967). Development and structure of the human placenta from the end of the 3rd month of gestation. J Obstet Gynaecol Br Commonw 74(2):161-26. Wynn RM. (1975). Principles of placentation and early human placental development. In: “The placenta and its maternal supply line”. (Ed. P Gruenwald), pp.18-34. Edinburgh: Medical and Technical Publishing Co. Ltd. Gruenwald P. (1975). Lobular architecture of primates placentas. In: “The placenta and its maternal supply line”. (Ed. P Gruenwald), pp 35-55. Edinburgh: Medical and Technical Publishing Co. Ltd. Aherne W. (1975). Morphometry. In: “The placenta and its maternal supply line”. (Ed. P Gruenwald), pp 80-97. Edinburgh: Medical and Technical Publishing Co. Ltd. Crawford JM. (1962). Vascular anatomy of the human placenta. Am J Obstet Gynecol 84:1543-67. Wilkin P (1965) Pathologie du Placenta: Etude Clinique et Anatomique. Paris: Mason SC 15.7. La diferenciación estructural y funcional de la placenta de término. Los nódulos sincitiales y la membrana vasculosincitial. V. Flores Desde fines del primer trimestre el citotrofoblasto (CTB) disminuye, relativamente, en las vellosidades y se hace discontinuo. Sólo quedan islotes de CTB que siguen funcionando como fuente de células para la expansión del sincitiotrofoblasto (SCTB). En las zonas de discontinuidad del CTB, el SCTB toma contacto directo con la membrana basal. Simultáneamente, el número y calibre de los capilares fetales aumenta produciendo una disminución relativa de la masa y espesor del mesénquima vellositario. El crecimiento de los capilares se produce de modo que pasan a ocupar una posición excéntrica. Se observa además una reducción del grosor de la capa endotelial. Por otro, en las zonas en las que desaparece el CTB, los capilares fetales de las vellosidades terminales toman contacto directo con la membrana basal sobre el cual asienta el SCTB. De esta forma, hacia el final del segundo trimestre, queda constituida una “nueva” unidad estructural de intercambio, denominada membrana vasculosincitial (M V-S) (Fig. SC 15-7-1), constituida por el SCTB adelgazado, las membranas basales del SCTB y del endotelio capilar adosadas e incluso fusionadas y el endotelio del capilar fetal.

Fig. SC 15-7-1. Esquema de la diferenciación ultraestructural del SCTB en el tercer trimestre de la gestación. En la zona izquierda del esquema se ilustra la organización de las regiones especializadas en las funciones de síntesis de la placenta (nódulos sincitiales). En la zona derecha del esquema se representa una zona especializada en las funciones de transporte de la placenta o membrana vasculosincitial. Nótese que existe cierta similitud estructural entre la M V-S y la membrana alveolocapilar del pulmón o la membrana de filtración del glomérulo renal. En algunos casos se han descrito prolongaciones basales del SCTB similares a las que presentan los podocitos del riñón. Simultáneamente con estos cambios adaptativos que aumentan la eficacia de los intercambios, hacia el final de la gestación también se producen cambios que son signos de envejecimiento ya que disminuyen la eficacia funcional del corion. La placenta, como órgano transitorio con funciones vinculadas exclusivamente a la gestación, parece estar programada epigenéticamente para una vida media no mayor de 9 meses y, debido a ello, hacia el final de la gestación aparecen cambios atribuibles al envejecimiento. Estos cambios son:

engrosamientos en la membrana basal del endotelio capilar y del SCTB, obliteración de vasos fetales y maternos, depósito de material fibrinoide en el EIV, entre las vellosidades y sobre las placas basal y corial, etcétera. Adaptaciones que aumentan las funciones metabólicas y de síntesis de hormonas. Algunas modificaciones de la placa corial constituyen adaptaciones tendientes a aumentar la eficacia de algunas funciones metabólicas o endocrinas del corion. Entre los principales cambios de este tipo se pueden describir la formación de zonas engrosadas o nódulos sincitiales. Éstos son engrosamientos localizados del SCTB distribuidos más o menos regularmente sobre la superficie de las vellosidades. Entre los nódulos sincitiales se encuentran las zonas que corresponden a M V-S. En los nódulos se concentran la mayor parte de los núcleos y de los organoides del SCTB. Ellos poseen las características ultraestructurales típicas de las células que sintetizan proteínas y esteroides; las hormonas que sintetiza la placenta son, precisamente, peptídicas y esteroideas. La membrana apical en los nódulos presenta microvellosidades asociadas a vesículas pinocíticas. El SCTB posee la diferenciación adecuada para la síntesis de proteínas y lípidos y se lo considera un tejido endocrino. Otros componentes del corion –CTB y mesénquima somático‒ como también la decidua basal contribuyen sintetizando algunas hormonas (SC Función endocrina de la placenta. Principales hormonas y sus funciones básicas; SC La red de regulación endocrina intrínseca del corion. Secreción de gonadotrofina coriónica y progesterona). En general, se considera que todos los elementos del corion participan integradamente en una diversidad de funciones coordinadas que mantienen la homeostasis fetal ante diversas variaciones. En condiciones de hipoxia prolongada, por ejemplo, el CTB reacciona generando más rápidamente células de transición que aumentan la superficie del SCTB. Por otro lado, en situaciones en las que existen alteraciones ultraestructurales de las células mesenquimáticas, tanto las funciones de síntesis como las de transporte se alteran significativamente. Ello indicaría que el mesénquima de las vellosidades puede contribuir a la síntesis o al transporte de elementos de acuerdo con la demanda funcional. Las hormonas producidas por el SCTB se liberan en su mayor parte a la sangre materna ‒al EIV‒ y en menor proporción hacia el compartimento vascular fetal. La permeabilidad de la M V-S. Durante toda la gestación, el corion mantiene su función básica de intercambio selectivo. Las circulaciones materna y fetal son independientes. Sin embargo, en el 50% de las mujeres embarazadas se detectan eritrocitos fetales circulantes (este porcentaje aumenta con la gestación) y el 4% de los fetos posee en su circulación eritrocitos maternos. Así, una pequeña cantidad, no estimada, de sangre se intercambia entre ambos compartimentos indicando que en algún momento la M V-S presenta soluciones de continuidad. No se sabe si la mezcla es consecuencia de un proceso específico o sólo es causada por roturas microscópicas accidentales de los vasos vellositarios atribuibles a incrementos transitorios de la presión sanguínea fetal. Tampoco se sabe si el intercambio de células entre madre y feto posee algún papel biológico específico o si sólo es accidental. En opinión de algunos, podría tener una función importante en procesos inmunitarios asociados al mantenimiento del embarazo aunque el volumen de mezcla sea insignificante como fenómeno de intercambio.

Bibliografía Wynn RM. (1975). Fine structure of the placenta. In: “The placenta and its maternal supply line”. (Ed. P Gruenwald), pp 56-79. Edinburgh: Medical and Technical Publishing Co. Ltd. Burton GJ, Tham SW. (1992). Formation of vasculo-syncytial membranes in the human placenta. J Dev Physiol 18(1):43-47. Fox H. (1967). The incidence and significance of vasculo-syncytial membranes in the human placenta. J Obstet Gynaecol Br Commonw 74(1):28-33.

SC 15.8. Los tipos celulares derivados del citotrofoblasto y su especialización funcional. V. Flores, M. Rapacioli El trofoblasto se comporta como población celular troncal. Una vez que se diferencia en citotrofoblasto (CTB), éste mantiene dicha propiedad y origina células que exhiben diferentes tipos de diferenciación dependiendo de la posición que ocupan dentro de la placa corial, la placa basal y los tejidos maternos (Cuadro SC 15-8-1).

Tipos celulares de la placa corial. 1) El CTB velloso. De los tipos celulares de la placa corial, el CTB velloso es el que recubre las vellosidades coriales. Esta población celular se comporta como población celular troncal ya que por un lado genera células similares a sí mismas y células de transición. 2) Las células de transición son originadas a partir del CTB velloso. Las células de transición se generan y se incorporan al sincitiotrtfoblasto (SCTB) con una dinámica que depende de varios factores: momento de la gestación, condiciones de circulación en el espacio intervelloso, concentración de O2, nutrientes, etc. Estas células expresan moléculas de superficie que permiten reconocer receptores de la membrana basal del SCTB y permiten su fusión. Este fenómeno permite adaptar el volumen o masa sincicial al momento del desarrollo y a las condiciones locales. 3) El sincitiotrofoblasto. Aunque el SCTB no es, en sentido estricto, un “tipo celular”, es una forma de organización “tisular” especializada en a) por un lado, “aislar” al embrión de ciertas moléculas que podrían difundir sin control a través del espacio que existe entre las células de un epitelio (vía paracelular) y, por otro, b) en mantener con alta eficacia los diversos tipos de transporte o intercambios entre la madre y el embrión (SC La incorporación de moléculas al embrión. El significado biológico de la reacción sincitial). Durante las etapas tempranas de la implantación, el SCTB está en contacto directo con el estroma endometrial. Luego es sobrepasado por las células de la coraza CTB. El SCTB cumple a) funciones de transporte selectivo de sustancias y, junto con el mesénquima y el CTB velloso, b) constituyen un sistema endocrino placentario que produce hormonas peptídicas y esteroideas que mantienen la gestación (SC Función endocrina de la placenta. Principales hormonas y sus funciones básicas; SC La red de regulación endocrina intrínseca del corion. Secreción de gonadotrofina coriónica y progesterona), c) es una línea de defensa ante anticuerpos maternos antifeto y ante células citotóxicas de la interfase materno-fetal y sitio de síntesis de sustancias inmunosupresoras no hormonales (SC Efectos inmunorregulatorios de las proteínas HLA-G expresadas por el citotrofoblasto). El SCTB, además, constituye una restricción efectiva, no absoluta, al pasaje de células entre sangre materna y fetal. Tipos celulares de la placa basal (citotrofoblasto no velloso). 4) Células columnares. El CTB velloso origina células proliferativas que gradualmente se desplazan hacia el extremo de las vellosidades de anclaje donde forman las columnas (CTB columnar) que lo conectan a la decidua basal y hacen la transición entre el CTB velloso y el escudo o coraza citotrofoblástico. Estas células son diferentes en muchos aspectos, sobre todo en la composición química de superficie, de las que forman el CTB velloso y el SCTB. 5) Células del escudo citotrofoblástico. Se caracterizan por la ubicación que poseen; están formadas por varias capas de células y la capa más superficial integra la interfase embriomaterna. Cumple importantes funciones de regulación de la respuesta inmunitaria materna ante los tejidos del feto. En las células de la superficie del escudo citotrofoblástico se intensifican los cambios en la organización química de superficie que les permite

generar células intersticiales que invaden la decidua y otros tejidos maternos (SC Cambios en el perfil de expresión de proteínas de superficie celular durante la transición de CTB velloso a CTB no velloso endovascular). 6) Células del CTB intersticial. Son células del CTB no velloso que se desprenden del escudo citotrofoblástico e invaden el estroma de la decidua basal; se considera que también cumplen funciones inmunitarias modulando la respuesta inmunitaria materna ante tejidos fetales. Liberan sustancias que estimulan a las células hematopoyéticas deciduales a generar células del sistema inmunitario materno inmunodepresoras con función de protección del corion. 7) Células del CTB endovascular. Poseen una organización química de superficie con una expresión combinatoria de proteínas integrinas que les permite intercalarse con las células de los vasos maternos. Algunas de estas células reciben el nombre de CTB vascular mural pues se entremezclan con las células musculares de la capa media de las arterias espiraladas uterinas. Otras células forman un CTB vascular endotelial que recubre la superficie interna de los vasos intercalándose con, o reemplazando a, las células endoteliales maternas. Ambas poblaciones del CTB endovascular producen una remodelación de los vasos, ajustan su estructura, diámetros y tono a los requerimientos de la circulación uteroplacentaria según avanza el embarazo. 8) Células del CTB miometrial. Algunas células del CTB invaden más profundamente el útero y se introducen en el tejido conectivo del miometrio. Se ha postulado que probablemente ejerzan una función regulatoria sobre la contractilidad de la musculatura durante la gestación. 9) Células del CTB circulantes. Finalmente, algunas células del CTB pueden ingresar a la circulación sanguínea materna y colonizar algunos órganos. Estas células se pueden encontrar en el tejido conectivo de algunos órganos y aportar una pequeña cantidad de células circulantes. En algunas mujeres, estas células, que han sido denominadas células progenitoras asociadas a la gestación o Papc (Pregnancy-associated progenitor cells) han sido encontradas varias décadas después del embarazo. Es probable que su función sea favorecer una forma modulada de funcionamiento del sistema inmunitario adaptativo ante un nuevo eventual embarazo.

Cuadro SC 15-8-1. Ilustra el linaje y la ubicación espacial de los diferentes tipos celulares derivados del citotrofoblasto. Bibliografia Redman CW, McMichael AJ, Stirrat GM, Sunderland CA, Ting A. (1984). Class 1 major histocompatibility complex antigens on human extra-villous trophoblast. Immunology 52:457-68. Pijnenborg R, Dixon G, Robertson WB, Brosens I. (1980). Trophoblastic invasion of human decidua from 8 to 18 weeks of pregnancy. Placenta 1(1):3-19. Kaufmann P, Black S and Huppertz B. (2003). Endovascular Trophoblast Invasion: Implications for the Pathogenesis of Intrauterine Growth Retardation and Preeclampsia. Biol Reprod 69:1-7. Bianchi DW. (2004). Fetomaternal cell traffic, pregnancy-associated progenitor cells, and autoimmune disease. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 18(6):959-75. Adams KM, Nelson JL. (2004). Microchimerism: an investigative frontier in autoimmunity and transplantation. JAMA 291(9):1127-31.

Capítulo 16. Genética y Teratología SÍNTESIS CONCEPTUAL

SC 16.1. Concepto de imprinting genético. Las gametas masculina y femenina son no equivalentes y complementarias desde el punto de vista de la información genética que aportan. V. Flores SC 16.2. Genes pasibles de sufrir imprinting. Funciones de la metilación en el imprinting. M. Rapacioli SC 16.1. Concepto de imprinting genético. Las gametas masculina y femenina son no equivalentes y complementarias desde el punto de vista de la información genética que aportan. V. Flores En las especies diploides, el fenotipo se elabora con información genética proveniente de ambos progenitores. Para la gran mayoría de los genes, la posibilidad de expresarse y la tasa de expresión es similar para los dos alelos del gen, el de origen materno (aportado por el ovocito) y el de origen paterno (aportado por el espermatozoide). Existen, sin embargo, algunos genes, que cumplen importantes funciones durante el desarrollo, cuyos alelos de origen materno y paterno no tienen igual posibilidad de expresión. Ello se debe a que las células germinales masculinas y femeninas programan la expresión de estos genes de modo diferente y complementario. A este fenómeno por medio del cual algunos genes son diferentemente programados en las células germinales masculina y femenina se ha denominado “imprinting”. Sólo algunos genes son susceptibles de sufrir imprinting y genéricamente se los denomina “genes de imprinting”. El proceso de imprinting ha sido en parte aclarado. En pocos vertebrados y en varios invertebrados existe un tipo de reproducción, llamada partenogenética, por medio de la cual el ovocito, sin la participación el espermatozoide, se activa, inicia el programa de desarrollo y genera un nuevo individuo. Ello implica que en dichas especies el ovocito posee habilitados, con capacidad de expresarse en el momento que corresponda, todos los genes que participan del desarrollo. En dichas especies, la reproducción sexual, realizada con la participación del espermatozoide, introduce variabilidad genética, pero no es esencial para que el desarrollo se complete. Los mamíferos no realizan partenogénesis en forma espontánea y tampoco se ha logrado experimentalmente. Es posible activar ovocitos de mamíferos en medios de cultivo e inhibir la eliminación del segundo glóbulo polar. El ovocito activado resultante es diploide y, al igual que una célula huevo, inicia el desarrollo; sin embargo, se forma un embrión con muchas alteraciones (con sólo algunos tejidos y órganos parcialmente diferenciados) que se desorganiza y rápidamente muere. Experimentos de trasplante nuclear han permitido corroborar que los pronúcleos masculinos y femeninos no son equivalentes y que poseen programaciones complementarias. La micromanipulación permite la extracción y/o inyección de núcleos en la célula huevo. Si a la célula huevo se le extrae el pronúcleo masculino y se le inyecta un pronúcleo femenino extraído de otra célula huevo, pasa a ser una célula diploide con cromosomas de origen

exclusivamente femenino (bimaternal). También se puede obtener una célula huevo bipaternal –con cromosomas de origen exclusivamente masculino– si la célula huevo posee dos pronúcleos masculinos. Estas células huevo también inician el desarrollo, aunque expresan diferentes modos de evolución, y tempranamente detienen su desarrollo y mueren. Las células huevos bimaternas evolucionan originando principalmente tejidos similares a los que derivan del embrioblasto y las bipaternas preferentemente forman tejidos derivados trofoblásticos. En la naturaleza ocurre espontáneamente una situación parecida a la de las células huevos bipaternas. Existen tumores benignos localizados en el útero de mujeres que teóricamente están gestando y que son estructuras quísticas formadas por tejidos similares a los placentarios. De acuerdo con estudios citogenéticos estos tumores, denominados mola hidatidiforme completa o androgenética, son el resultado del desarrollo de células huevos que perdieron la información genética materna y sólo poseen información aportada por el espermatozoide. En el 90% de los casos son diploides (46, XX) y los cromosomas son de origen paterno. Se considera que son el resultado de la fecundación entre un ovocito que ha perdido el pronúcleo femenino y un espermatozoide (22,X) que luego de la fecundación sufrió una duplicación de la información genética antes del inicio de la segmentación. En el 10% restante de los casos se considera que es el resultado de la fecundación del ovocito por dos espermatozoides que generan un cariotipo 46,XX o 46,XY. Estas células huevos androgenéticas diploides sobreviven, proliferan pero no generan tejidos correspondientes a derivados embrioblásticos sino sólo tejidos similares a los que derivan del trofoblasto. Todos estos hechos indican que a) la información genética proveniente de sólo uno de los progenitores (masculino o femenino), aun cuando la célula huevo sea diploide, es insuficiente para regular el desarrollo normal, que b) la información aportada por cada gameta es diferente o no equivalente y que c) el déficit en la información genética aportada por cada gameta es suplida por la información aportada por la otra gameta, vale decir, son complementarias. El fenómeno de imprinting está mediado por un proceso denominado metilación del ADN (Véase SC 16.2. Genes pasibles de sufrir imprinting. Funciones de la metilación en el imprinting) que instala una represión irreversible en los genes que lo sufren. Los genes de imprinting son de expresión monoalélica. En términos generales, el imprinting ocurre de modo tal que, si en las células germinales femeninas los genes pasibles de sufrir imprinting son programados con un estado apto para la expresión, el alelo correspondiente en las células germinales masculinas sufre una inhibición irreversible y recíprocamente. En consecuencia, si en una población celular en desarrollo se activa un gen pasible de sufrir imprinting, sólo se expresará el alelo proveniente del progenitor que lo programó para ser expresado; el que proviene del otro progenitor estará reprimido (expresión monoalélica). Para diferentes genes pasibles de sufrir imprinting, en algunas poblaciones celulares en desarrollo sólo se expresará el alelo de la madre y, en otras poblaciones celulares, se expresará sólo el alelo que viene por línea paterna. Así, si en una población celular en desarrollo sólo se expresa el alelo proveniente de la madre pero el genoma proviene sólo del padre, aunque la población celular sea diploide, sufrirá un déficit grave debido a que los alelos que posee, para una cierta función, se encuentran ambos reprimidos. En resumen, el concepto de no equivalencia de la gametas alude al hecho de que la información genética aportada por los conjuntos cromosómicos materno y paterno, para el caso de algunos genes pasibles de sufrir imprinting, no posee la misma capacidad de expresarse en las células del nuevo individuo y que la información que aportan las gametas es diferente y complementaria. Puede notarse que este fenómeno, que se ha seleccionado a lo largo de la evolución filogenética, y que caracteriza a la mayor parte de las especies más evolucionadas, garantiza la variabilidad intraespecífica evitando que existan individuos con la misma información genética. Es sabido que, considerando períodos prolongados de tiempo, la existencia de individuos con similar información genética disminuye las probabilidades de adaptación a las condiciones cambiantes del medio (Véase SC Ventajas de la diploidía, de la reproducción sexual y de la exogamia).

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El mecanismo general del imprinting involucra una secuencia de pasos que incluye: 1. Establecimiento del imprinting (programación génica diferencial en alelos de distinto origen parental). 2. Mantenimiento del imprinting en las células derivadas de la célula huevo. 3. Reconocimiento del imprinting por la maquinaria de transcripción y expresión monoalélica del gen. 4. Eliminación y reseteo del imprinting en las células germinales. Las alteraciones en cualquiera de estos mecanismos puede llevar a la pérdida de expresión monoalélica (LOI de Loss Of Imprinting). Estas alteraciones conducen a patologías que difieren si se altera la expresión del alelo paterno o materno.

El establecimiento del imprinting: la metilación del ADN. Se han caracterizado varios mecanismos de programación genética diferencial en alelos de distinto origen parental. El mejor conocido es la metilación diferencial del ADN en las citosinas (C) de secuencias 5’CG3’ también denominadas CpG (p indica el fosfato de la unión fosfodiéster). Nótese que por complementariedad de bases, la secuencia 5’CpG3’ de una cadena del ADN se aparea con una secuencia 5CpG’3’ de la cadena complementaria. La metilación del ADN modifica la expresión génica mediante dos mecanismos fundamentales: a) modifica la unión de proteínas reguladoras de la expresión génica y b) recluta proteínas del complejo de remodelación de la cromatina.

La metilación del ADN es heredable. Dada la duplicación semiconservadora del ADN, una de las cadenas de ambas moléculas de ADN generadas en la duplicación mantendrá la metilación. Existen enzimas (ADN metiltransferasas de mantenimiento) que reconocen las CpG metiladas en una cadena y metilan a la CpG de la cadena complementaria. En los clusters donde se localizan los genes de imprinting existen una o más regiones de metilación diferencial o regiones diferencialmente metiladas (DMR). Estas regiones poseen patrones de metilación complementarios en alelos maternos y paternos. Se denominan también regiones de control de imprinting (ICR). La metilación de los genes de imprinting es eliminada, y restablecida, en cada generación, durante la gametogénesis. Las células germinales primitivas heredan alelos maternos y paternos con sus respectivos patrones de metilación. Durante la gametogénesis, las células germinales eliminan los patrones de imprinting de cada progenitor y se establece el patrón propio del sexo del embrión. El patrón de imprinting de los progenitores es eliminado gradualmente mientras las células germinales primitivas migran hacia las gónadas. El reseteo en el patrón de metilación se produce diferentemente en diferentes clusters de genes de imprinting. En células germinales que no llegan a las gónadas, algunos clusters de genes de imprinting no se desmetilan. Éste sería un indicio de que la gónada en desarrollo posee algún efecto sobre el patrón de metilación de las células germinales. En el caso de la ovogénesis, el patrón de metilación se establece en sucesivas fases durante el desarrollo folicular: algunos clusters se metilan durante la fase de folículo primordial/primario, otros durante el estado de folículo secundario, otros durante el estado de folículo antral temprano y otros durante el estado de folículo antral tardío. En el caso de la espermatogénesis, se ha observado que la eliminación del patrón de metilación heredado se realiza ya en el estado de espermatogonias fetales. Se han encontrado clusters en los que el patrón de metilación se establece recién en el estado de espermatogonias adultas. La metilación se mantiene en el cito I, cito II, espermátides y espermatozoides.

No se conocen los mecanismos que determinan la metilación diferencial en células germinales masculinas y femeninas, pero es de suponer que existen procesos que determinen diferentes patrones de metilación. Se han postulado los siguientes: 1. Expresión diferencial o splicing alternativo de ADN metiltransferasas. 2. Actividad diferencial de ADN metiltransferasas dependiente de expresión diferencial de proteínas que regulan su actividad. 3. Expresión diferencial de proteínas histónicas que modificarían la susceptibilidad a metilación de las regiones de metilación diferencial. 4. Expresión diferencial de proteínas responsables de la desmetilación (eliminación del patrón de metilación heredado).

Mantenimiento de la metilación. Luego de la fecundación, el genoma sufre un proceso global de desmetilación. Sólo las regiones de imprinting mantienen su metilación debido a la existencia de determinadas ADN metiltransferasas de mantenimiento que reconocen estas regiones.

Efecto de la metilación diferencial de las regiones de control de imprinting. Ejemplos de expresión monoalélica debida a metilación diferencial se hallan en la expresión del factor de crecimiento símil insulina tipo II (Igf-2) y su receptor Igf2r en el ratón. El Igf2 estimula el desarrollo y crecimiento de los tejidos embrionarios, pero sólo se halla activo, en la mayor parte de los tejidos embrionarios, el alelo del Igf2 de origen paterno. En estos tejidos, el alelo de origen materno se halla inactivo. Así, si un ratón hereda de su madre un alelo de Igf2 mutado, la mutación no se expresa en el fenotipo. Por el contrario, la mutación en el alelo heredado del padre sí produce un crecimiento deficiente. El receptor de Igf2 presenta un patrón de expresión opuesto: el alelo de origen paterno se expresa muy poco mientras que el de origen materno tiene una alta tasa de expresión. Diferentes clusters de genes de imprinting poseen diferentes mecanismos de regulación de la expresión génica que son modificados mediante metilación diferencial del ADN. Ilustraremos aquí dos ejemplos.

Fig. SC 16-2-1. Expresión monoalélica de Igf2 a partir del alelo de origen paterno como consecuencia de la metilación diferencial de una secuencia aislante. En la figura SC 16-2-1 puede observarse que los genes de la proteína factor de crecimiento insulínico tipo 2 (Igf2) y del ARN no- codificante H19 están regulados por la misma secuencia reguladora de expresión génica. Entre los promotores de ambos genes hay una secuencia aislante (insulator) que se metila diferencialmente en ovocitos y espermatozoides. En las células somáticas, la secuencia aislante del cromosoma de origen materno no se halla metilada. Esto permite la unión de la proteína factor de transcripción represor CTCF (un factor de transcripción de tipo dedos de zinc) que reconoce secuencias CCCTF no metiladas y le otorga actividad a la secuencia aislante. En estas condiciones, la secuencia de regulación de expresión génica no puede interactuar con el promotor del gen de Igf2 y en consecuencia el alelo materno de este gen Igf2 no transcribe. Esta secuencia sí puede interactuar con el promotor del gen de H19 y en consecuencia el alelo materno de H19 sí transcribe.

El cromosoma de origen paterno, por el contrario, posee la secuencia aislante metilada. Esta metilación se produce durante la espermatogénesis. Este hecho impide la unión de la proteína CTCF a la secuencia aislante y ésta queda inactivada (no funciona como aislante). Por consiguiente, la secuencia de regulación de expresión génica puede interactuar con el promotor de Igf2 y el alelo paterno de Igf2 sí transcribe. Durante las etapas tempranas del desarrollo, luego de la implantación, la metilación de la secuencia aislante se expande hacia el promotor de H19 y en consecuencia se forma una estructura de cromatina cerrada inaccesible para los factores de transcripción. Como consecuencia de este hecho el alelo paterno de H19 no transcribe.

Fig. SC 16-2-2. Expresión monoalélica de Igf2r a partir del alelo de origen materno como consecuencia de la metilación diferencial del promotor de un gen de un ARN antisentido. En la figura SC 16-2-2 se ilustra que en el gen codificante de la proteína receptor del Igf2 o Ifgr2 hay, en el segundo intrón, una ICR que es, además, promotor del gen de un ARN no codificante Air que transcribe en sentido inverso al gen Igf2r por lo que Air tiene secuencia complementaria o antisentido a Igf2r. En el cromosoma de origen materno, el promotor del gen Air está metilado, en consecuencia el alelo materno de Air no se transcribe. El alelo materno de Igf2r sí transcribe. Otros tres genes del mismo cluster, Slc22a1, Slc22a2 y Slc22a3 sí transcriben. En el cromosoma paterno, el promotor de Air no está metilado. El alelo paterno de Air sí transcribe y su transcripto interactúa con el transcripto del gen Igf2r quedando éste inactivo. Secundariamente se metila el promotor de Igf2r y, en consecuencia, el alelo paterno de Igf2r no transcribe. Slc22a1 permanece activo pero Slc22a2 y Slc22a3 se inactivan.

Bibliografía Mann JR. (2001). Imprinting in the Germ Line. Stem Cells 19(4):287-94. Pauler FM, Barlow DP. (2010). Imprinting mechanisms--it only takes two. Genes Dev 20(10):1203-06. DeChiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A. (1991). Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell 64(4):849-59. ●

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