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Quimica Clinica Teoria, análisis y correlacion TERCERA EDICIÓN

Editores de la tercera edición en inglés: LAWRENCE A. KAPLAN Director, Laboratorio de Química Clínica y Toxicología Bellevue Hospital Profesor clínica, Departmento de Patología Universidad de Nuevo York Nuevo York, Nuevo York AMADEO J. PESCE Director, Laboratorio Adams County Hospital West Union, Ohio Director, Laboratorio Drake Hospital Center Cincinnati, Ohio Profesor, Departmento de Patología y Medicina de Laboratorio Universidad de Cincinnati Cincinnati, Ohio

Editor de los métodos: Steven C. Kazamierczak Director, Laboratorio Química Clínica Departmento de Patología y Medicina de Laboratorio Universidad del Este de Carolina Escuela de Médico Greenville, Carolina del Norte

Editor de la edición español: JAVIER ORTEGA-CESEñA

Titulo del original en englés CLINICAL CHEMISTRY Theory Analysis and Correlation Copyright © 1996 The C. V. Mosby Company St. Louis, Missouri USA

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CONSEJO EDITORIAL Gerado Barrachina ARGENTINA Manuel Morejon-Campa CUBA Andreas Rothstein COLOMBIA Rosa Sierra-Amor MéXICO Gustavo Diaz Gill PARAGUAY Zulema Coppes URUGUAY Q. F. Malega Cladera URUGUAY Clara S. de Grumberg URUGUAY Margarita Iturriza VENEZUELA

TRADUCTORES Danilo D’Amico Ujcich (VENEZUELA) License in Bioanálisis Labatorio Metropolitano, CA Calle A-I Urb Caurimare Caracas, Venezuela Capítulo 4, Técnicas Espectrales Gerardo Barrachina, Ph.D (ARGENTINA) Laboratorio de Análisis French-Echevarne

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French 2979 C1425AWI Buenos Aires, Argentina Capítulo 14, Medicíon de Propiedades Coligativas; Capítulo 34, Alcoholismo; Capítulo 37, Nutritión Humana; Capítulo 38, Elementes Traza; Capítulo 52, Addictión y Abuso de Substancias; Capítulo 56, Monitoreo de Drogas Terapéuticas Carmen Beatriz Briceño (VENEZUELA) License in Bioanálisis Laboratorio Clinico Briceño Barquisimeto, Venezuela Capítulo7, Cromatografía Gaseosa Fernando Brites (ARGENTINA) Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 53, Clasificación y Descripción de Proteinas, Lipidos e Hidratos de Carbona Fernando Bustos (ARGENTINA) Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 54, Enzimologia Tania Carreón –Valancia, Ph.D. (MEXICO) NIOSH Cincinnati, OH USA Capítulo 19, Estadástica de Laboratorio Osvaldo Cascone, Ph.D. (ARGENTINA) Facultad de Farmacia y Bioquimica Universidad de Buenos Aires Junin 956 Buenos Aires, Argentina Capítulo 6, Cromatograía Líquida; Capítulo 14, Medicíon de Propiedades Coligativas; Capítulo 56, Monitoreo de Drogas Terapéuticas Q. F. Malega Cladera, Ph.D. (URUGUAY) Montevideo, Uruguay Capítulo 40, Embarazo y Develomente Fetal Zulema Coppes, Ph.D. (URUGUAY) Profesora de Bioquímica Cátedra de Bioquímica Facultad de Química Universidad de Uruguay Presidente de la "Sociedad Uruguaya para la Nutrición y el Cáncer" Montevideo, Uruguay Capítulo 32, Diabetes Mellitus; Capítulo 35, Metabolismo del Hierro, Porfirina, y Bilirrubina; Capítulo 36, Hemoglobina; Capítulo 39, Vitaminas; Capítulo 47, Enfermedades de Origen Genético; Capítulo 48, Biolígia Molecular en el Laboratorio Clínica; Capítulo 49, Neoplasias

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Alicia Mabel Cruz (MEXICO) Laboratorio de Control de Calidad IMSS Ciudad de México, México Capítulo 1, Principios Básicos de Laboratorio and Técnicas; Capítulo 2, Adminisración del Laboratorio; Capítulo 3, Origen y Control de la Variación Pre-analítica; Capítulo 16, Automation; Capítulo 17, Uso de Preuas en la Lugar de Atención ap paciente Alicia Marcelina Diaz Garcia, Ph.D. (CUBA) Laboratorio Bioinorganica Facultad de Quimica Universidad de La Habana Zapata y G Ciudad de la Habana CP 10400 CUBA Capítulo 8, Espectrómetro de Masa Sylvia Falzoni, Ph.D. (ARGENTINA) Laboratorio de Análisis French-Echevarne French 2979 C1425AWI Buenos Aires, Argentina Capítulo 56, Monitoreo de Drogas Terapéuticas Mariano Fernández-Ulloa, M.D. (UNITED STATES) Departmento de Radiación y Medicina Nuclear Universidad de Cincinnati Cincinnati, Ohio USA Capítulo 44, Tiroides Blanca Beatriz Garciá, Ph.D. (COLOMBIA) Centro Médico Imbanaco Santiago de Cali, Bogatá, Colombia Capítulo 57, Análisis de Orina Gustavo Díaz-Gill Profesor de Inmunología Universidad Nacional de Asunción Asunción, Paraguay Capítulo 10, Electroforesis; Capítulo 11, Reacciones Immunológicas Aída Hernández-Tobías (MEXICO) Laboratorio Clínico Médica Sur Puente de Piedra 150 Tlalpan 4050 Mexico DF Mexico Capitulo 5, Cromatografía, Teoría y Práctica; Capitulo 15, Electroquímica Margarita Iturriza, Ph.D (VENEZUELA) Labatorio Metropolitano CA Calle A-I Urb Caurimare Caracas, Venezuela

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Capítulo 4, Técnicas Espectrales; Capítulo 25, Control para Base-ácido y Desordenes con Base-ácido; Capítulo 31, Enfermedades Cardíaca y Muscular Gladys Laverde de Arbelaez Labaratorio de Investigacíon Hormonal LIH Ltda Bogatá, D.C. Columbia Capítulo 43, Endocrinologia General Leticia Madalena (ARGENTINA) Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 53, Clasificación y descripción de Proteinas, Lipidos e Hidratos de Carbona Midori Mitsui, Ph.D. (PARAGUAY) Department of Immunology University of California at Los Angeles Los Angeles, California USA Capítulo 10, Electroforesis; Capítulo 11, Reacciones Immunológicas Lic. Manuel Morejon-Campa, Ph.D. Jefe Departamento Diagnosticadores Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos Apdo Postal 16 065 CP 11 600 Ciudad de La Habana, Cuba Capítulo 24, Fisiología y Fisiopatología del Agua y los Electrílitos Orgánicos Gustavo Negri, Ph.D (ARGENTINA) Profesor Titular Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 54, Enzimologia Javier Ortega-Ceseña (MEXICO) Department of Environmental Health University of Cincinnati Cincinnati, OH 45267 USA Capítulo 12, Técnicas Inmunoquímicas; Capítulo 13, Principios de los Ensayos de Unión Competitiva; Capítulo 44, La Tiroides; Capítulo 50, Evaluación de Laboratorio del Receptor y del Donante de Transplante; Capítulo 51, Toxicología; Capítulo 55, Isoenzimas e Isoformas Marco Pizzolato, Ph.D. (ARGENTINA) Profesor Titular Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 53, Clasificación y Descripción de Proteinas, Lipidos e Hidratos de Carbona; Capítulo 54, Enzimologia Maria Teresa Ramirez-Iglesias (MEXICO)

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Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán” Vasco de Quiroga 15 Tlalpan 14050 Mexico, DF Mexico Capítulo 29, La Pancreática: Función y Patología Química Guillermo Benito Robles-Diaz (MEXICO) Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán” Vasco de Quiroga 15 Tlalpan 14050 Mexico Df Mexico Capítulo 29, La Pancreática: Función y Patología Química Andreas Rothstein, B.S. Laboratorio Clinico Andreas Rothstein Bogatá, D.C. Columbia Capítulo 22, Evaluación de Metodos; Capítulo 27, Función Hepática Gerardo Sanchez (VENEZUELA) License in Bioanálisis Laboratory Sanchez Font Caracas, Venezuela Capítulo 25, Control para Base-ácido y Desordenes con Base-ácido Clara Schcolnik de Grumberg, Ph.D. Montevideo, Uruguay Capítulo 23, Interferiencias en el Análisis Chemical; Capítulo 26, Función Renal; Capítulo 30, Función Gastrointestinales y Enfermadad Digestivas; Capítulo 33, Enfermadades Coronario Arteriales y Desórdenes del Metabolismo Lipídico; Capítulo 46, Hipertensión Saúl López-Silva, Ph.D. (MEXICO) Centro de Innovación y Desarrollo Tecnológico en Salud Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Guerrero, Mexico Capítulo 18, Systems Informatión del Laboratorio, Capítulo 41, Líquidos Biológicos Extravasculares; Capítulo 42, Sistema Nervioso Rosa Sierra-Amor, Ph.D. (MEXICO) Labatorio de Ósea Metabolism Hospital del Niños Cincinnati, Ohio USA Capítulo 17, Uso de Preuas en la Lugar de Atención al Paciente; Capitulo 28, Enfermadad Ósea Elsa Velezquez, M.D. (PARAGUAY) Asunción, Paraguay Capítulo 45, Las Gónadas Viviana Yapur (ARGENTINA) Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 54, Enzimologia

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Fabiola Zambrano de Cajiao (COLUMBIA) Universidad Nacional de Columbia Bogatá, Columbia Capítulo 20, Intervalos de Referencia y Límites de Decisión Clínicos; Capítulo 21, Control de la Calidad en el Laboratorio Clínico

REVISORES Ignacio Arribas, MD, PhD Medical Staff Department of Análisis Clínicos Hospital Universitario Príncipe de Asturias Alcalá de Henares Madrid, España Capítulo 24, Fisiología y Fisiopatología del Agua y los Electrílitos Orgánicos; Capítulo 25, Control del Equilibrio ácido-base y Desórdenes del Equilibrio ácido-base; Capitulo 28, Enfermadad Ósea; Capítulo 29, El páncreas: Función y Patología Química; Capítulo 30, Función Gastrointestinal y Enfermadades Digestivas Carlos Calvo, Ph.D. Facultad de Farmacia Universidad de Concepción Concepción, Chile Capítulo 26, Función Renal; Capítulo 33, Enfermadades Coronario Arteriales y Desórdenes del Metabolismo Lipídico; Capítulo 36, Hemoglobina Fernando Cava, Ph.D. Area de Laboratorio Fundacion Hospital Alcorcon Madrid, España Capítulo 17, Uso de Preuas en la Lugar de Atención Appaciente; Capítulo 18, Sistemas de Información del Laboratorio; Capítulo 48, Biología Molecular en el Laboratorio Clínico Zulema Coppes, Ph.D. Facultidad de Química Clínica Universidad de Uruguay Montevideo, Uruguay Capítulo 28, Enfermadad Ósea; Capítulo 31, Enfermedades Cardíaca y Muscular; Capítulo 34, Alcoholismo Maria Carmen Herrero, Ph.D. Area de Laboratorio Fundacion Hospital Alcorcon Madrid, España Capítulo 18, Sistemas Informatión del Laboratorio; Capítulo 19, Estadística de Laboratorio Alberto Delgado-Iribarren, Ph.D. Area de Laboratorio Fundacion Hospital Alcorcon Madrid, España Capítulo 56, Monitoreo de Drogas Terapéuticas; Capítulo 52, Addictión y Abuso de Substancias

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José Manuel Gasalla Foundation Hospital Alcorcón Associate Professor University "Rey Juan Carlos I" Madrid, España Capítulo 12, Principales de Ensayos de Fijación Competitiva; Capítulo 44, Tiroides; Capítulo 45, Las Gonadas; Capítulo 48, Biología Molecular Blanca Beatriz Garciá, Ph.D. Centro Médico Imbanaco Santiago de Cali, Bogatá Capítulo 40, Embarazo y Develomente Fetal Maylor Graham (MEXICO) Atlanta, Georgia, USA Capítulo 1, Principios Básicos de Laboratorio and Técnicas; Capítulo 2, Adminisración del Laboratorio; Capítulo 3, Origen y Control de la Variación Pre-analítica Maria Luisa Casas Losada Facultativo Especialista Análisis Clínicos Area de Laboratorio Fundación Hospital Alcorcón Madrid, España Capítulo 11, Reacciones Immunológicas; Capítulo 34, Alcoholismo; Capítulo 48, Biología Molecular Emilia Martinez-Miranda (MEXICO) CARPERMOR Alfonso Herrera 75 Col. San Rafael 06470 Mexico, DF Mexico J. Manuel Moreno, Ph.D. Area de Laboratorio Fundacion Hospital Alcorcon Madrid, España Capítulo 10, Electroforesis Lic. Manuel Morejon-Campa, Ph.D. Jefe Departamento Diagnosticadores Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos Apdo Postal 16 065 CP 11 600 Ciudad de La Habana, Cuba Capítulo 8, Mass Spectrometry; Capítulo 21, Control de Calidad; Capítulo 36, Hemoglobina; Capítulo Capítulo 37, Nutritión Humana J. Carlos Moyano, M. D. Servicio Análisis Clínicos Hospital Los Montalvos Salamanca, España Capítulo 43, Endocrinologia General José A. Navajo, Ph.D. Salamanca Laboratorio Clinico

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Salamanca, España Capítulo 4, Técnicas Espectrales Marco Pizzolato, Ph.D. (ARGENTINA) Profesor Titular Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires Buenos Aires, Argentina Capítulo 27, Función Hepática Andreas Rothstein, B.S. Laboratorio Clinico Andreas Rothstein Bogatá, Columbia Capítulo 32, Diabetes Mellitus Saúl López-Silva, Ph.D. (MEXICO) Centro de Innovación y Desarrollo Tecnológico en Salud Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Guerrero, Mexico Capítulo 22, Evaluación de Metodos Araceli Sierra-Amor (MEXICO) Laboratorios LAQUIMS S.A. de C.V. Ave. Washington 312 91940 Veracruz, Ver. Mexico José F. Valverde, M.D. Fundación Hospital de Alcorcon Madrid, España Capítulo 19, Estadística para Laboratorio

Prefacio de CD-ROM Esta traducción de nuestro libro de texto, "Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation", fue impulsada por nuestra visita a Paraguay y Uruguay en 1998. Durante esa visita extraordinaria, advertimos que los químicos clínicos y estudiantes en América Latina aún estaban usando la antigua traducción en español de la primera edición de nuestro libro. Desde luego, la vieja versión del libro no respondía de manera adecuada a las demandas de la química clínica avanzada que se practica en estos países. Además, muchos de nuestros colegas de América Latina preguntaban sobre una nueva traducción. Por lo tanto, decidimos realizar una Edición en Español de la tercera edición de nuestro libro de texto (publicada en 1996). Nuestros objetivos para la nueva edición en español eran que ésta fuese accesible a los estudiantes y que se pudiera actualizar más fácilmente que el tradicional libro de texto. Para alcanzar dichos objetivos optamos por publicarlo en una versión electrónica. Esto reduce el costo considerablemente al eliminar la impresión, almacenamiento y gastos de envío. Además, la publicación electrónica nos permite crear nuevas versiones actualizadas del libro. Por 9

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ejemplo, la cuarta edición en inglés de "Clinical Chemistry: theory, analysis, and correlation" se publicará aproximadamente dentro de un año. La versión electrónica de la cuarta edición en español estará disponible probablemente a finales de 2001. Elegimos publicar el libro en el formato Folio( Infobase debido a que dicho formato proporciona tres ventajas al usuario: (1) permite una recuperación extraordinariamente rápida de información mediante herramientas de búsqueda eficaces, (2) ofrece al usuario la capacidad de imprimir fácilmente las páginas deseadas y (3) permite confeccionar un perfil de información a la medida del usuario. La interfase de Folio es usada comúnmente en publicaciones electrónicas y en la red o "web". Todos los programas requeridos para leer, imprimir y modificar la Infobase están incluidos en el CD-ROM. La producción de esta edición en CD-ROM de "Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation" ha sido un proyecto largo, pero fascinante. Nos ha dado la oportunidad de conocer y trabajar con un talentoso grupo de químicos clínicos del mundo de habla hispana. Estas personas proporcionaron el apoyo crucial al traducir los diversos componentes del texto original en inglés y revisar dichas traducciones. Agradecemos de manera especial y hacemos un reconocimiento a nuestro talentoso consejo editorial, quienes nos ayudaron a encontrar los numerosos colegas que participaron en este proyecto. Estos profesionales de la química clínica se enumeran, junto con los capítulos en que trabajaron. A ellos les debemos nuestra enorme gratitud. Hacemos un reconocimiento especial a la Dra. Rosa Sierra-Amor, que reunió a un gran número de colegas de México para traducir gran parte del libro. También, deseamos reconocer a nuestro colega español, el Dr. Fernando Cava, que convenció a varios de sus colegas para que proporcionaran mucha de la revisión requerida en las traducciones. Traducir es un proceso que plantea diversos retos ya que a menudo existen diferentes acepciones para una palabra o un término. La adopción y uso en español de términos acuñados en química clínica y disciplinas afines en cada país, también representó dificultades adicionales con las que hubo que contender. Por lo tanto, agradecemos el excelente trabajo realizado por Javier Ortega-Ceseña, que fungió como Editor general en español de esta edición. La organización de la versión electrónica del texto y las tablas también es una tarea compleja y difícil. Agradecemos a Stefanie Rosmarin, que participó como Coordinadora de Producción, por su excelente trabajo en la realización de una gran parte del producto final. Finalmente, agradecemos la paciencia y amor de nuestras esposas, Judith Kaplan y Anna Pesce, por apoyarnos siempre en este proyecto. Así pues, este proyecto es, en última instancia, un regalo de ellas para ustedes. Todos nosotros esperamos que disfruten este trabajo de amor.

Prefacio 3rd ed preface Ha transcurrido más de una década desde que fue publicada la primera edición de este 10

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libro de texto. Durante ese tiempo hemos recibido la apreciación de nuestros lectores, de la cual nos sentimos agradecidos. En esta edición de Química Clínica hemos modificado el contenido en respuesta tanto a las críticas constructivas que hemos recibido como a la continua evolución del campo. Los recientes cambios en la química clínica reflejan las presiones económicas para continuar las tendencias históricas a fin de incrementar la automatización y consolidación de los laboratorios, así como el fuerte efecto de las fuerzas de regulación, creando la necesidad de profesionales en química clínica que posean experiencia como administradores. Por lo tanto ha sido agregado un nuevo capítulo sobre Administración de Laboratorio (capítulo 2) y se ha actualizado todo el texto que refleja las regulaciones de la CLIA '88. El capítulo de administración puede ser usado por todos los lectores, de cualquier nivel, para contender mejor con la naturaleza cada vez más regulatoria de la profesión. El nuevo capítulo Espectrometría de Masas (capítulo8) refleja el uso más amplio de esta metodología. La revisión de los nuevos capítulos Evaluación de Laboratorio del Recipiente y Donador de Trasplante (capítulo 50) y Adicción y Sustancias de Abuso (capítulo 52) ayudará a los lectores a entender los cambios y el crecimiento de estas disciplinas clínicas. El usuario encontrará que casi todos los capítulos han sido revisados para incorporar los avances clínicos y técnicos más recientes. Deseamos señalar que los capítulos Cromatografía de Líquidos (capítulo 6), Técnicas inmunoquímicas (capítulo 12) y Automatización (capítulo 16), han sido extensamente revisados para incorporar la gran cantidad de cambios técnicos que han ocurrido en estas áreas desde la segunda edición. El capítulo 19, Estadística para Laboratorio, se ha escrito de nuevo para proporcionar a los estudiantes ejemplos prácticos de la aplicación de la estadística en el laboratorio clínico. El capítulo 20, Intervalos de referencia y Límites de Decisión Clínicos, se ha revisado para incorporar los lineamientos del NCCLS. Como un cambio importante con respecto a la edición previa, hemos eliminado la sección separada de "métodos" y situamos la descripción de métodos individuales en los capítulos clínicos donde se discuten el uso de los compuestos a analizar. Este cambio nos permitió destinar más espacio para actualizar los capítulos técnicos y clínicos, y nos permitió agregar los nuevos capítulos que mencionamos anteriormente. A fin de que el estudiante tenga un fácil acceso a las revisiones de los métodos, colocamos una revisión al final del capítulo clínico correspondiente en una sección nueva e independiente, Métodos de Análisis. Creemos que los instructores apreciarán esta modificación de Química Clínica, la cual responde a los continuos cambios en el laboratorio hacia el uso de reactivos pre-empacados, les permitirá enfocarse sobre los aspectos más importantes para los estudiantes que se inician en el campo de la química clínica. Queremos reconocer la importante contribución del Dr. Steven C. Kazmierczak, que colaboró como editor de las áreas de métodos del libro en esta edición. Con su ayuda, hemos tratado de seleccionar los métodos que serán más útiles para la enseñanza de los principios del análisis moderno. Continuamos con el uso abundante de las tablas de resúmenes del texto y de los cuadros y figuras con la convicción de que estos elementos representan una ayuda importante en el proceso de aprendizaje. El resumen del capítulo y el glosario de términos clave, a los cuales nuestros educadores y colegas han respondido tan favorablemente, se mantienen y se expanden a los nuevos capítulos. El resultado de estos cambios es, por una parte, un libro de texto que será muy familiar 11

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a quienes han usado las ediciones anteriores, permitiendo a los educadores volver a utilizar sus planes actuales de enseñanza. Por otra parte, los cambios aseguran que el estudiante aprenderá de un libro de texto que reflejará los cambios más recientes en el área. También creemos que, más que nunca, este libro puede continuar ocupando su lugar como texto de enseñanza para estudiantes de tecnología médica y como un libro de referencia actualizado para estudiantes avanzados y para individuos dedicados a la práctica de la química clínica. Deseamos expresar nuestro agradecimiento a los directores de nuestros departamentos académicos de patología (doctores Vittorio Defendi y John Pearson, New York University, y Dr. Fenoglio-Priser, University of Cincinnati) por proporcionar una atmósfera en la cual fue posible realizar este trabajo. No podemos agradecer lo suficiente a todos nuestros autores que han aportado su valiosa experiencia al lector. Agradecemos a Judith E. Kaplan, por asegurar que el libro se presente en la manera más disfrutable al usuario, y a nuestro editor, el Sr. James F. Shanahan por su paciencia en los años pasados. Agradecemos al Dr. Myer Horowitz por su ayuda en la revisión de los manuscritos y al excelente trabajo en el procesador de textos de Georgia Coddington y Diane Gorman. Lawrence A. Kaplan Amadeo J. Pesce

Clinical Chemistry Theory, analysis and correlation Third edition

Editors:

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Lawrence A. Kaplan, Ph.D. Director, Clinical Chemistry and Toxicology Laboratories, Bellevue Hospital; Department of Pathology, New York University New York, New York

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Amadeo J. Pesce, Ph.D. Director, Clinical Toxicology Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Hospital Cincinnati, Ohio

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Methods editor:

Steven C. Kazmierczak, Ph.D. Scientific Director, Clinical Chemistry, Department of Pathology and Laboratory Medicine, East Carolina University School of Medicine Greenville, North Carolina

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with 527 illustrations Spanish edition of the Third edition of Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation Copyrighted 1999 by Pesce Kaplan Publishers, Inc Pesce Kaplan Publishers, Inc. Cincinnati

New York

THIRD EDITION Copyright 1996 by Mosby©Year Book, Inc. Previous editions copyrighted 1984, 1989 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without prior written permission from the publisher. Permission to photocopy or reproduce solely for internal or personal use is permitted for libraries or other users registered with the Copyright Clearance Center, provided that the base fee of $4.00 per chapter plus $.10 per page is paid directly to the Copyright Clearance Center, 27 Congress Street, Salem, MA 01970. This consent does not extend to other kinds of copying, such as copying for general distribution, for advertising or promotional purposes, for creating new collected works, or for resale. Printed in the United States of America Composition by Clarinda Company Printing/binding by Maplevail Press Mosby-Year Book, Inc.11830 Westline Industrial DriveSt. Louis, Missouri 63146

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Library of Congress Cataloging©in©Publication Data: Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation / [edited by] Lawrence A. Kaplan, Amadeo J. Pesce. 3rd ed. ‘cm. Includes bibliographical references and index. ISBN 0©8151©5243©4 Clinical chemistry. I . Kaplan, Lawrence A., 1944© II. Pesce, Amadeo J. Chemistry, Clinical. QY 90 C6415 1996] RB40.C58 1996 616.07'56\Mdc20 DNLM/DLC

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PRODUCTION STAFF, SPANISH EDITION Editors: James F. Shanahan, Jennifer Roche Developmental Editor: Sandra J. Parker Editorial Assistant: Jennifer McCartney Project Manager: Dana Peick Production Editors: Carl Masthay, Blair Woodcock Manuscript Editor: Judith E. Kaplan Designer: Amy Buxton Cover Designer: Frank Loose/Frank Loose Design Manufacturing Supervisor: Betty Richmond

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Contributors Nancy W. Alcock, Ph.D. Director, Nutrition Laboratory, Department of Preventive Medicine and Community Health, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas Chapter 37 Human nutrition Chapter 38 Trace elements David J. Anderson, Ph.D. Associate Professor, Director of Clinical Chemistry, Department of Chemistry, Cleveland State University, Cleveland, Ohio Chapter 6 Liquid chromatography F. Phillip Anderson, M.S. Department of Pathology, Medical College of Virginia, Richmond, Virginia Methods: Chapter 24 Victor W. Armstrong Georg-August-Universidat Gottingen, Gottingen, Federal Republic of Germany Chapter 56 Therapeutic drug monitoring (TDM): Practical aspects of TDM Susan Bassion, Ph.D. [affiliations unavailable] Chapter 11 Immunological reactions Larry D. Bowers, Ph.D. Professor, Department of Pathology, Indiana University Medical Center, Indianapolis, Indiana Chapter 6 Liquid chromatography John M. Brewer, Ph.D. Professor of Biochemistry, Department of Biochemistry,

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University of Georgia, Athens, Georgia Chapter 10 Electrophoresis Marge A. Brewster, Ph.D. Professor, Departments of Pathology and Pediatrics, University of Arkansas for Medical Sciences; Clinical Biochemist, Arkansas Children\'s Hospital, Little Rock, Arkansas Chapter 39 Vitamins Elizabeth Ann Byrne, M.S., C.L.S. Assistant Professor, Biology Department, College of Mount St. Joseph, Mount St. Joseph, Ohio Chapter 1 Basic laboratory principles and techniques (Part II: Calculations in clinical chemistry) R. Neill Carey, Ph.D. Clinical Chemist, Department of Pathology, Peninsula Regional Medical Center, Salisbury, Maryland Chapter 22 Evaluation of methods John F. Chapman, Dr.P.H. Associate Professor of Pathology, University of North Carolina at Chapel Hill; Director, Clinical Chemistry Laboratories, University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, North Carolina Chapter 31 Cardiac and muscle disease Chapter 40 Pregnancy and fetal development Chapter 55 Isoenzymes and isoforms I-Wen Chen, Ph.D. Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 9 Radioisotopes in clinical chemistry Methods: Chapters 31, 39, 44 Kee Cheung, Ph.D. University of Queensland, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 27

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David Chou, M.D. Division of Pathology and Laboratory Medicine, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio Chapter 18 Laboratory information system Robert H. Christenson, Ph.D. Associate Professor of Pathology, University of Maryland School of Medicine; Director, Clinical Chemistry Laboratories, University of Maryland Medical Center, Baltimore, Maryland Chapter 31 Cardiac and muscle diseases Chapter 55 Isoenzymes and isoforms Lawrence J. Crolla, Ph.D. Managing Director, World-Wide Health Care Consulting, Surprise, Arizona Chapter 2 Laboratory Management Donald Davis, Ph.C. Department of Clinical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 51 Laurence M. Demers, Ph.D. Department of Pathology, Milton S. Hershey Medical Center, Pennsylvania State University, Hershey, Pennsylvania Chapter 43 General endocrinology Joseph R. DiPersio, Ph.D. Microbiologist, Akron City Hospital, Akron, Ohio Methods: Chapter 56 Helen M. Dodds, Department of Clinical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 51

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Richard F. Dods, Ph.D. Chemistry Team Leader for Curriculum Development, Illinois Mathematics and Science Academy, Palatine, Illinois Chapter 32 Diabetes mellitus David R. Dufour, M.D. Chief, Laboratory Services, Department of Pathology, Veterans Affairs Medical Center, Washington, D.C. Chapter 3 Sources and control of preanalytical variation Carolyn S. Feldkamp, Ph.D. Pathology Department, Henry Ford Hospital, Detroit, Michigan Chapter 12 Immunochemical techniques Mariano Fernandez-Ulloa, M.D. Department of Radiation/Nuclear Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio Chapter 44 Thyroid M. Roy First, M.D. Professor, Department of Internal Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 26 Renal function Chapter 50 Laboratory evaluation of the transplant recipient and donor Donald T. Forman, Ph.D. Professor, Division of Laboratory Medicine, Department of Pathology, University of North Carolina Chapel Hill, North Carolina Methods: Chapter 49 Christopher S. Frings, Ph.D. President, Chris Frings and Associates; Clinical Professor, Departments of Pathology and Allied Health Sciences,

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University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama Chapter 4 Spectral techniques Carl C. Garber, Ph.D. Laboratory Administration, MetPath, Teterboro, New Jersey Chapter 22 Evaluation of methods Jack Gauldie, Ph.D. Associate Professor, Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada Chapter 4 Spectral techniques Lewis Glasser, M.D. Chief, Hematopathology Laboratories, Department of Pathology, Arizona Health Sciences Center, University of Arizona, Tucson, Arizona Chapter 41 Extravascular biological fluids R. Jeffrey Goldsmith, Ph.D. Associate Professor, Department of Psychiatry, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 52 Addiction and substance abuse F. Michael Hassan, M.T.(ASCP) Assistant Director of Toxicology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Methods: Chapter 51 William R. Heineman, Ph.D. Distinguished Research Professor, Department of Chemistry, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio Chapter 15 Electrochemistry: principles and measurements

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Linda A. Heminger, B.S.(CNMT) Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Methods: Chapters 27, 31 Peter Hickman, Ph.D. Clinical Associate Professor of Pathology, University of Queensland; Director of Chemical Pathology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapters 27, 31 W. Edward Highsmith, Jr., Ph.D. Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, School of Medicine, University of Maryland at Baltimore, Baltimore, Maryland Chapter 48 Molecular biology in the clinical laboratory Gregory A. Hobbs, Ph.D. Department of Pathology, University of Louisville School of Medicine, Louisville, Kentucky Methods: Chapter 49 David C. Hohnadel, Ph.D. Director, Clinical Chemistry, Department of Pathology, The Genesee Hospital, Rochester, New York Chapter 54 Clinical enzymology Oussama Itani, M.D. Instructor in Pediatrics, Department of Pediatrics, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio; Director of Nurseries, St. Luke's Hospital, Ft. Thomas, Kentucky Chapter 28 Bone disease Gayle Jackson, M.S.

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Supervisor, Clinical Laboratory, Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio Methods: Chapter 49 Ellis Jacobs, Ph.D. Department of Pathology, Director, Stat Laboratory, Mt. Sinai School of Medicine, Mt. Sinai Hospital, New York, New York Chapter 17 Point-of-care (near-patient) testing Mark A. Jandreski, Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology, Loyola University of Chicago, Director, Special Chemistry and Immunoserology, Foster G. McGaw Hospital, Loyola University Medical Center, Maywood, Illinois Chapter 19 Laboratory statistics Sarah H. Jenkins, Ph.D. Assistant Professor, Director of Primary Services Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio Chapter 15 Electrochemistry: principles and measurements William R. Johnson, Ph.D. Department of Pathology, University of Louisville School of Medicine, Louisville, Kentucky Methods: Chapter 49 Saeed A. Jortani, Ph.D. Department of Pathology, University of Louisville, School of Medicine, Louisville, Kentucky Methods: Chapter 56 Stephen E. Kahn, Ph.D. Associate Professor, Pathology and Biochemistry, Loyola University of Chicago;

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Associate Director, Clinical Chemistry, Foster G. McGaw Hospital, Loyola University Medical Center, Maywood, Illinois Chapter 19 Laboratory statistics Lawrence A. Kaplan, Ph.D. Associate Professor, Director, Clinical Chemistry and Toxicology Laboratories, Bellevue Hospital; Department of Pathology New York University, New York, New York Chapter 14 Measurement of colligative properties Chapter 23 Interferences in chemical analysis Chapter 53 Classifications and description of proteins, lipids, and carbohydrates (Part I: Proteins; Part III: Carbohydrates) Methods: Chapter 24 Steven C. Kazmierczak, Ph.D. Associate Professor, Scientific Director, Clinical Chemistry, Department of Pathology and Laboratory Medicine, East Carolina University School of Medicine, Greenville, North Carolina Methods: Chapters 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 36, 39, 47, 56 Thaddeus E. Kelly, M.D., Ph.D. Professor, Department of Pediatrics, University of Virginia Medical Center, Charlottesville, Virginia Chapter 47 Diseases of genetic origin Jon R. Kirchhoff, Ph.D. Associate Professor, Department of Chemistry, University of Toledo, Toledo, Ohio Chapter 15 Electrochemistry: principles and measurements Leonard I. Kleinman, M.D. Professor and Director of Newborn Services, Department of Pediatrics, State University of NY at Stony Brook School of Medicine, Stony Brook, New York Chapter 24 Physiology and pathophysiology of body water and electrolytes

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Christian Kohler, M.D. Department of Psychiatry, Mental Health Clinical Research Center, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania Chapter 42 Nervous system William J. Korzum, Ph.D. Department of Pathology, Medical College of Virginia, Richmond, Virginia Methods: Chapters 24, 25 Robert W. Lang, M.T.(ASCP), M.B.A., C.L.S.(NCA) Administrative Director of Laboratory Services, LaGrange Memorial Hospital, LaGrange, Illinois Chapter 2 Laboratory management Michael Lehrer, Ph.D. Chief, Division of Biochemistry, Department of Pathology, Long Island Jewish Medical Center, New Hyde Park, New York Chapter 8 Mass spectrometry Mark W. Linder, Ph.D. Department of Pathology, University of Louisville, School of Medicine, Louisville, Kentucky Methods: Chapter 42 John M. Lorenz, M.D. Associate Professor of Pediatrics, Director, Division of Neonatology, Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University; Medical Director, Regional Newborn Intensive Care Services, Sparrow Hospital, Lansing, Michigan Chapter 24 Physiology and pathophysiology of body water and electrolytes John A. Lott, Ph.D. Professor of Pathology,

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The Ohio State University; Director, Clinical Chemistry, The Ohio State University Hospitals, Columbus, Ohio Chapter 29 The pancreas: function and chemical pathology Methods: Chapters 27, 31, 49 Marvin H. Lucas, M.D. Internal Medicine, Premier Medical Associates, Cincinnati, Ohio Chapter 44 Thyroid Michael D.D. McNeely, M.D. Head, Chemistry and Immunology, Metro-McNair Clinical Laboratories, Victoria, British Columbia, Canada Chapter 30 Gastrointestinal function and digestive disease Craig E. Lunte, Ph.D. Associate Professor, Department of Chemistry, University of Kansas, Lawrence, Kansas Chapter 15 Electrochemistry: principles and measurements Charles L. Mendenhall, M.D. Director of Hepatic Research, Department of Digestive Diseases, Veterans Affairs Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 34 Alcoholism M. Gregory Miller, Ph.D. Associate Professor, Department of Pathology, Medical College of Virginia, Richmond, Virginia Methods: Chapters 24, 25 Patricia A. Miller-Canfield, M.D. Staff Pathologist, Department of Pathology, Terra Haute Medical Labs, Terra Haute, Indiana Chapter 36 Hemoglobin

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Herbert K. Naito, Ph.D. Director, Clinical Chemistry, Department of Laboratory Services, Department of Veterans Affairs Medical Center, Cleveland, Ohio Chapter 33 Coronary artery disease and disorders of lipid metabolism Chapter 53 Classifications and descriptions of proteins, lipids, and carbohydrates (Part II: Lipids) Karen L. Nickel, Ph.D. Chief, Laboratory Field Services, California State Department of Health Services, Berkeley, California Chapter 45 Gonads Steven A. Noel, Ph.D. Department of Pathology, Greater Baltimore Medical Center, Baltimore, Maryland Methods: Chapter 49 Ross L.G. Norris Chief Scientist, Department of Clinical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 51 Michael Oellerich, Ph.D. Professor, Georg-August-Universidat Gottingen, Gottingen, Federal Republic of Germany Chapter 56 Therapeutic drug monitoring (TDM): Practical aspects of TDM Kalpana Panigrahi, Ph.D. Fellow, Clinical Chemistry, Department of Pathology, University of Maryland, Baltimore, Maryland Chapter 55 Isoenzymes and isoforms K. Michael Parker, Ph.D. Professor, Department of Pathology, Oklahoma Medical Center Oklahoma City, Oklahoma Methods: Chapter 34

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Richard B. Passey, Ph.D. Professor of Pathology, Director, Clinical Chemistry Laboratory, University of Oklahoma; Director, Clinical Chemistry, University Hospital, Oklahoma City, Oklahoma Chapter 21 Quality control for the clinical chemistry laboratory Monika Payne, M.T. Technologist, Midwestern Regional Medical Center, Zion, Illinois Formerly in Department of Chemical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 31 Gerardo Perrotta, M.T.(ASCP), S.H., Coordinator, Primary Service Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Hospital, Cincinnati, Ohio Methods: Chapters 35, 36 Amadeo J. Pesce, Ph.D. Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 4 Spectral techniques Chapter 23 Interferences in chemical analysis Chapter 51 Toxicology Methods: Chapter 31 Michael A. Pesce, Ph.D. Professor, Director of Laboratories, Department of Pathology, Columbia Presbyterian Medical Center, New York, New York Chapter 16 Automation Alphonse Poklis, Ph.D. Associate Professor, Department of Pathology,

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Affiliate Professor, Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Virginia; Director, Toxicology Laboratory, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond, Virginia Chapter 7 Gas chromatography Chapter 51 Toxicology Julia M. Potter, Ph.D. Department of Chemical Pathology, Royal Brisbane Hospital, Herston, Queensland, Australia Methods: Chapters 51, 56 Michael D. Privitera, M.D. Associate Professor, Department of Neurology, University of Cincinnati Medical Center; Staff Neurologist, Director, Epilepsy Treatment Center, University of Cincinnati Hospital, Cincinnati, Ohio Chapter 42 Nervous system Morris R. Pudek, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology, University of British Columbia; Clinical Chemist, Vancouver General Hospital, Vancouver, British Columbia, Canada Chapter 46 Adrenal hormones and hypertension Wolfgang A. Ritschel, M.D., Ph.D. Professor of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics; Head, Division of Pharmaceutics and Drug Delivery Systems, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 56 Therapeutic drug monitoring (TDM): Basic overview of principles Andrea Rose, Ph.D. Department of Pathology, University of Louisville School of Medicine, Louisville, Kentucky Methods: Chapter 32 Stephen J. Rossi, Pharm.D. Division of Nephrology,

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University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, Michigan Chapter 50 Laboratory evaluation of the transplant recipient and donor Donald L. Rucknagel, Ph.D. Director, Sickle Center, Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 47 Diseases of genetic origin Paul Salm Department of Clinical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 56 Edward A. Sasse, Ph.D. Associate Professor, Department of Pathology, Medical College of Wisconsin; Chief, Chemistry Section, Pathology and Laboratory Medicine Service, Milwaukee Veterans Affairs Medical Center, Milwaukee, Wisconsin Chapter 20 Reference intervals and clinical decision limits Kevin T. Schleuter, Ph.D. Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio Chapter 50 Laboratory evaluation of the transplant recipient and donor William E. Schreiber, M.D. Associate Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada Chapter 35 Iron, porphyrin, and bilirubin metabolism Timothy J. Schroeder, M.S. Associate Professor, Director, Transplant Division, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 50 Laboratory evaluation of the transplant recipient and donor Arnold L. Schultz, Ph.D. Associate Professor,

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Department of Pathology, University of Colorado Health Sciences Center, Denver, Colorado Methods: Chapter 26 Harold R. Schumacher, M.D. Professor, Director, Hematology Division, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 36 Hemoglobin G. Berry Schumann, M.D. Dianon Systems, Stratford, Connecticut Chapter 57 Examination of urine Susan C. Schweitzer, M.S., M.T.(ASCP) Department of Pathology, University of Colorado Health Science Center, Denver, Colorado Chapter 57 Examination of urine Bette Seamonds, Ph.D. Assistant Professor, Department of Laboratory Sciences, Thomas Jefferson University, Philadelphia, Pennsylvania Chapter 1 Basic laboratory principles and techniques (Part I: Basic laboratory principles) Lester Shaw, Ph.D. Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania; William Pepper Laboratory, Hospital of the University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania Methods: Chapter 56 John E. Sherwin, Ph.D. Consultant, Westlake Village, California Chapter 25 Acid-base control and acid-base disorders Chapter 27 Liver function Methods: Chapter 31

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Lawrence M. Silverman, Ph.D. Professor, Director, Special Chemistry, Department of Pathology, North Carolina Memorial Hospital, Chapel Hill, North Carolina Chapter 31 Cardiac and muscle disease Chapter 48 Molecular biology in the clinical laboratory Chapter 55 Isoenzymes and isoforms David A. Smith, M.S., Captain Laboratory Science Officer, United States Army Medical Service Corps, Fort Sam Houston, San Antonio, Texas Methods: Chapter 49 Juan R. Sobenes, M.D. Associate Clinical Professor, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Valley Medical Center, Fresno, University of California, Fresno, California Chapter 27 Liver function Bernard E. Statland, M.D. National Reference Laboratories, Nashville, Tennessee Chapter 49 Neoplasia Paul W. Stiffler, Ph.D. Microbiology Consultant, LaGrange Memorial Hospital, LaGrange, Illinois Chapter 2 Laboratory management Jay Stoerker, Ph.D. Applied Technology Genetics Corporation, Malvern, Pennsylvania Chapter 48 Molecular biology in the clinical laboratory M. Wilson Tabor, Ph.D. Associate Professor of Environmental Health, Director of Environmental Analytical Chemistry, Institute of Environmental Health, University of Cincinnati Medical Center, Cincinnati, Ohio

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Chapter 5 Chromatography: theory and practice Methods: Chapter 51 Paul J. Taylor Department of Clinical Pharmacology, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, Queensland, Australia Methods: Chapter 56 Stephan G. Thompson, Ph.D. Staff Scientist, Coulter Corporation, Hialeah, Florida Chapter 13 Principles for competitive-binding assays Reginald C. Tsang, M.D. Gamble Professor of Neonatology, Obstetrics, and Gynecology, University of Cincinnati Medical Center; Director of Neonatology, Associate Chairman of Pediatrics, Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 28 Bone disease Gregory J. Tsongalis, Ph.D. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Hartford Hospital, Hartford, Connecticut Chapter 40 Pregnancy and fetal development Kory M. Ward, Ph.D. Associate Professor, Division of Medical Technology, School of Allied Medical Professions, Ohio State University, Columbus, Ohio Methods: Chapters 31, 54, 55 Robert E. Weesner, M.D. Assistant Professor, Department of Internal Medicine, University of Cincinnati Medical Center; Director, GI Endoscopy Services, Veterans Affairs Medical Center, Cincinnati, Ohio Chapter 34 Alcoholism John F. Wheeler, Ph.D. Assistant Professor,

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Department of Chemistry, Furman University, Greenville, South Carolina Chapter 15 Electrochemistry: principles and measurements Per Winkel, M.D., Doc. Med. Sci. Clinical Chemistry Department, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Chapter 49 Neoplasia Delores Wishart, M.T.(ASCP) Laboratory Administrative Director, Alexian Brothers Medical Center, Elk Grove Village, Illinois Chapter 2 Laboratory management Steven H.Y. Wong, Ph.D. Professor, Pathology and Psychiatry & Behavioral Medicine, Director, Clinical Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Department of Pathology, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin Chapter 51 Toxicology

To our wives Judith E. Kaplan and Anna Pesce whose love and support have not diminished in these years and our mentors Samuel Natelson and George F. Grannis whose imparted knowledge continues to serve us and future generations.

Preface It has been more than a decade since the first edition of the textbook was published. In 36

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the ensuing time we have been very gratified by the response from our readership. We have changed the text of this edition of Clinical Chemistry in response to both the constructive criticisms that we have received and the continued evolution of the field. Recent changes in clinical chemistry reflect both the economic pressures for continuing the historic trends for increased automation and laboratory consolidation, and the strong effect of regulatory forces, which requires clinical chemists to have expertise as managers. Therefore we have added a new chapter on Laboratory Management (Chapter 2) and upgraded all the text to reflect CLIA\'88 regulations. The management chapter can be used by all readers, at all levels, to better cope with the increasing regulatory nature of the profession. The new chapter on Mass Spectrometry (Chapter 8) reflects the more widespread use of this technique. The new chapters reviewing Laboratory Evaluation of the Transplant Recipient and Donor (Chapter 50) and Addiction and Substance Abuse (Chapter 52) will help readers understand the changes and growth of these clinical disciplines. Readers will find that almost all the chapters have been revised to incorporate the latest clinical and technical advances. We would like to point out the chapters on Liquid Chrmatography (Chapter 6), Immunochemical Techniques (Chapter 12), and Automation (Chapter 16), which have been extensively revised to incorporate the many technical changes that have occurred in these areas since the second edition. Laboratory Statistics, has been rewritten to provide students with practical examples of statistics as applied in the clinical laboratory. Chapter 20, Reference Intervals and Clinical Decision Limits, has been revised to incorporate NCCLS guidelines. In a major change from the previous edition, we have deleted the separate "methods" section and placed the description of individual methods in the clinical chapters where the use of these analytes are discussed. This change allowed more space to be allotted to updating the clinical and technical chapters and allowed us to add the new chapters noted above. To facilitate ready access by students to the method reviews, we have placed each review at the end of the appropriate clinical chapter in a new, discrete chapter section, Methods of Analysis. We believe that educators will appreciate that this modification of Clinical Chemistry, responding to the continued change in laboratories toward the use of prepackaged reagents, will allow them to focus on what is important for students entering the field of clinical chemistry. We would like to recognize the important contribution of Dr. Steven C. Kazmierczak, who served as the editor of the methods areas of the text, to this edition. With his help, we have tried to choose methods for review that will be most useful for teaching the modern principles of analysis. We continue the liberal use throughout the text of summary tables and boxes and figures in the belief that these are useful aids to the learning process. The chapter outlines and glossary of key terms, to which our educator colleagues have responded so favorably, are continued and expanded to all new chapters. The result of these changes is, on one hand, a textbook that will be very familiar to those who have used the previous editions. This will allow educators to reuse current teaching plans. On the other hand, the changes ensure that students will be learning from a textbook that will reflect the most recent changes in the field. We believe, therefore, that more than ever, this text can continue to take its place as both a teaching text for students in 37

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medical technology and an up-to-date reference book for advanced students and for individuals already practicing clinical chemistry. We would like to thank the directors of our academic departments of pathology (Drs. Vittorio Defendi and John Pearson, New York University, and Dr. Fenoglio-Priser, University of Cincinnati) for providing an atmosphere in which this work could be completed. We cannot give enough thanks to our many authors who have provided the reader with their expertise. We thank Judith E. Kaplan, for once again ensuring that the text would be most readable, and to our editor, Mr. James F. Shanahan for his forbearance over the past years. We acknowledge Dr. Myer Horowitz for his help in reviewing manuscripts and the expert word processing of Georgia Coddington and Diane Gorman.

SECCIÓN 1 CAPÍTULO 1

1. Principios y Técnicas Básicas del Laboratorio Bette Seamonds Elizabeth Ann Byrne

Parte I:

Principios y técnicas básicas del laboratorio

Agua como reactivo Agua con grado de reactivo Proceso de purificación Grados de pureza del agua Almacenamiento y manejo del agua como reactivo Sugerencias de uso Control de calidad y pruebas de impureza Sistema de documentación y almacenamiento de registros Materiales de laboratorio químico Sustancias químicas Estándares primarios Materiales para estándares de referencia Solventes orgánicos Gases Seguridad en el manejo de sustancias químicas Desecantes

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Limpieza y composición del material de vidrio y plástico laboratorio Utensilios de laboratorio Pipetas Micropipetas Diluidores y dispensadores Técnicas volumétricas Pipetas de clase A Micropipetas Procedimientos generales para la preparación de soluciones Control de calidad de micropipetas, dispensadores y diluidores Unidades de medidas Unidades SI Unidades SI en el laboratorio clínico Medición de masas Tipos de balanzas Requisitos para la operación Procedimientos de mantenimiento Termometría Tipos de termómetros Calibración de termómetros de líquido en vidrio Baños de agua, placas térmicas y hornos Centrífugas Tipos Componentes de una centrífuga Mantenimiento y aseguramiento de la calidad del trabajo del laboratorio en general Principios de centrifugación Seguridad en el laboratorio Prácticas generales de seguridad Plan de higiene de sustancias químicas Procedimientos estándares de operación Inventario Almacenamiento de sustancias químicas Requisitos de etiquetado y manejo Control de sustancias químicas y desechos Protección contra desechos de contaminantes biológicos Parte II: Cálculos en química clínica

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Dilución Otras aplicaciones de las diluciones Ejercicios Pesos y concentraciones Definiciones y ejemplos Ejercicios Ejemplos de cálculos Cálculos basados en mediciones fotométricas (Ley de Beer) Colorimetría Absorbancia y transmitancia Coeficiente de extinción molar Ejercicios Amortiguadores Cálculos enzimáticos Curvas estándar Gráficas Cálculos para pruebas de depuración renal Pruebas urinarias usando el factor tiempo Ejercicios adicionales Apéndice: Solución de los problemas

OBJETIVOS Describir los métodos usados para la purificación del agua, las especificaciones, usos, almacenamiento y manejo de procedimientos asociados con los diferentes grados del agua como reactivo. Describir los procedimientos para el análisis de impurezas y control de calidad usados para los diferentes grados del agua como reactivo. Enlistar los suministros comúnmente usados en el laboratorio y describir los procedimientos para su uso apropiado, control de calidad, limpieza, y mantenimiento. Comparar y contrastar el uso y cuidado del material de vidrio y plástico. Describir las especificaciones asociadas con la calidad de las sustancias químicas y solventes. Conocer los procedimientos apropiados para el uso de pipetas. Describir la operación y mantenimiento de balanzas, centrífugas, baños de agua, y placas térmicas en el laboratorio clínico. Describir el uso y calibración de termómetros. Conocer las regulaciones generales de seguridad del laboratorio, los componentes obligatorios de OSHA del Plan de Higiene de Sustancias Químicas, y el plan de protección contra microorganismos patógenos.

Términos clave 40

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balanzas Instrumentos mecánicos o electrónicos usados para obtener medidas exactas de peso. baño de agua Un aparato con temperatura controlada llenado con agua, usado para calentar y mantener materiales a una temperatura específica. bureta Utensilio del laboratorio utilizado para dispensar un extenso rango de volúmenes en forma exacta. cilindro graduado Utensilio de laboratorio utilizado para medir líquidos. desecante Material utilizado en el desecador para absorber la humedad del ambiente. desecador Recipiente grande utilizado para almacenar material en un ambiente libre de agua. dilución Proceso para preparar soluciones de menor concentración a partir de una solución de mayor concentración. embudo Utensilio de laboratorio usado para transferir líquidos o sólidos a otro recipiente. jeringa Un artículo usado para extraer una cantidad específica de líquido y después vaciarlo volumétricamente. matraz Erlenmeyer Utensilio de laboratorio empleado para contener líquidos. matraz volumétrico Material de laboratorio usado para contener un volumen específico de líquido. microorganismos patógenos Agentes potencialmente infecciosos en la sangre y fluidos corporales. OSHA La Administración de la Salud y Seguridad Ocupacional ("Occupational Safety and Health Administration"). Agencia del gobierno estadounidense responsable de emitir las regulaciones para promover la seguridad de los lugares de trabajo. pipeta Utensilio de laboratorio usado para transferir un volumen específico de líquido. placa térmica Un aparato con temperatura controlada para mantener materiales a una temperatura determinada. Plan de Higiene de Sustancias Químicas Regulaciones ordenadas por la OSHA para proteger a los empleados de riesgos contra sustancias químicas peligrosas. pureza de agua Se definen tres niveles de pureza, los cuales se basan en la cantidad de material biológico, orgánico e inorgánico disuelto presente en el agua. pureza química El grado de pureza o homogeneidad de una sustancia es designado por varias agencias científicas como la Sociedad Americana de Química ("American Chemical Society") y el Instituto de Estándares y Tecnología (“National Institute of Standards and Technology”). purificación del agua Un proceso de tratamiento (destilación, desionización, ósmosis inversa, tratamiento UV, ultrafiltración, u ozonólisis) usado para eliminar contaminantes del agua. sanidad El proceso usado para mantener la limpieza del sistema de purificación del agua. Sistema Internacional de Unidades ("Systeme International d'Unités") Sistema de medidas internacionalmente aceptado. sistema métrico Sistema usado para medir pesos, distancias y volumen. termómetro Un aparato físico, electrónico, u óptico que se usa para medir la temperatura. vaso de precipitado Utensilio del laboratorio usado para contener líquidos o sólidos. 41

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Parte 1: Principios y técnicas básicas del laboratorio BETTE SEAMONDS

Para proveer datos clínicos exactos y precisos, el laboratorio de química clínica debe interesarse en los componentes y métodos analíticos utilizados para obtener tales datos. La familiaridad con la pureza de las sustancias químicas, solventes, y agua con grado de reactivo es esencial. Además, la selección y el uso del equipo analítico apropiado, y las prácticas de seguridad en el trabajo, son de gran importancia.

El Agua Como Reactivo El agua es uno de los reactivos más importantes y comúnmente usados en el laboratorio clínico. Debido a su importancia como reactivo en el laboratorio y, porque frecuentemente se "produce" dentro de cada laboratorio, el agua es discutida más ampliamente en la siguiente sección. Agua con grado de reactivo Las impurezas, tanto orgánicas como inorgánicas, en el agua usada como reactivo puede producir errores significativos en un análisis. Algunas impurezas son fáciles de identificar, pero otras son mucho más difíciles. La necesidad del agua como reactivo altamente puro en el laboratorio clínico debe ser sumamente enfatizada. Los sistemas de agua diseñados en forma inapropiada o con mantenimiento inadecuado pueden añadir contaminantes que originalmente no existían en el agua que alimenta el sistema. De este modo la calidad del agua como reactivo producida por diferentes sistemas de purificación puede presentar marcadas diferencias. En general, los sistemas que continuamente recirculan el agua proveen protección contra su estancamiento y, consecuentemente, minimizan el crecimiento bacteriano. Sin embargo, siempre es necesario descontaminar el sistema a intervalos regulares. El material de las tuberías es importante; plásticos tales como cloruro polivinílico ( más conocido por su abreviatura inglesa como "PVC") se usan comúnmente pero no son necesariamente la mejor opción. El PVC, en particular, deja escapar impurezas orgánicas en el agua purificada. Además tiene una superficie porosa, la cual tiende a albergar bacterias y otras impurezas orgánicas. Para información más detallada refiérase a la guía: Preparación y Pruebas de agua como reactivo para Laboratorio, publicado por el Comité Nacional de Estándares para el Laboratorio Clínico ("National Committee for Clinical Laboratory Standards" o "NCCLS", en inglés). ref(1) La calidad del agua no es sinónimo del proceso de purificación usado. Pueden emplearse diferentes tipos de procesos de purificación y en varios laboratorios a menudo se usan procesos múltiples. La calidad de la fuente de obtención del agua (alimentación de agua) es de gran importancia, ya que frecuentemente con base en ellos se determina que procesos de purificación deberán usarse y finalmente que tipo de contaminantes posiblemente permanecerán. Varias de las características de fuentes de obtención del agua serán afectadas por variaciones geográficas o de la estación. La variabilidad debida a la estación depende de parámetros tales como lluvias, drenajes, depuración de aguas residuales y desechos 42

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industriales, mientras que la localización geográfica determinará la dureza (contenido mineral) del agua suministrada. La Tabla 1-1 resume la efectividad de siete procesos de purificación para remover contaminantes del agua suministrada. El laboratorio deberá trabajar muy de cerca con un buen fabricante de sistemas de purificación de agua para diseñar un sistema que cumpla con las necesidades específicas del laboratorio.

Proceso de purificación Destilación. La destilación del agua en vidrio elimina efectivamente bacterias, pirógenos, material particulado, sólidos ionizados disueltos, y en menor proporción, contaminantes orgánicos disueltos. No es útil para la eliminación de gases ionizados disueltos tales como amoniaco, dióxido de carbono y cloro o compuestos orgánicos con bajo punto de ebullición. Desionización. En el proceso de desionización, el agua es pasada a través de una capa de resinas de intercambio iónico. Los iones hidrógeno e hidroxilo en la superficie de la resina son desplazados por impurezas catiónicas y aniónicas. Este proceso es excelente para remover sólidos y gases ionizados disueltos pero es ineficaz para todos los demás contaminantes. Además, la capacidad de unión de la resina se agota rápidamente, siendo necesario regenerarla o reemplazaría frecuentemente. La desionización se usa en conjunto con la absorción de carbono, proceso que es muy efectivo para remover compuestos orgánicos disueltos. Las características del carbono empleado determinan la eficacia para remover diferentes contaminantes orgánicos. Ni la desionización ni la absorción por carbono removerán el material particulado, bacterias o pirógenos. Ósmosis inversa. En la ósmosis inversa, el agua se pasa a presión a través de una membrana semipermeable dejando detrás residuos orgánicos disueltos iónicos e impurezas suspendidas, incluyendo contaminantes microbianos y virales. La ósmosis inversa, sin embargo, no remueve gases disueltos en forma efectiva. Este método se usa frecuentemente para pretratar agua antes de purificarla por desionización. Ultrafiltración. En la ultrafiltración, el agua es pasada a través de una membrana semipermeable con un tamaño de poro 8 hr) en ácido ya que esto hace al plástico quebradizo. El plástico también puede limpiarse con alcohol, álcalis o álcalis alcohólicos para remover trazas de contaminantes orgánicos que contribuyen a la absorción de los elementos traza. Limpieza de los utensilios de plástico y vidrio. Todo el material de vidrio debe ser lavado completamente antes de ser usado en procedimientos analíticos. Un material sucio puede conducir a una contaminación química. Además, si el material de vidrio no está limpio, la superficie del vidrio no estará uniformemente húmeda, causando errores volumétricos debido al drenaje incompleto de los artículos dispensadores o habrá una distorsión en los meniscos de aforo. Los utensilios sucios deben ser enjuagados inmediatamente después de su uso y ser sumergidos ya sea en un detergente de solución débil o en una solución de cloro al 10%. Cualquier bandeja donde se haya dejado material contaminado debe manejarse separadamente para evitar exposiciones involuntarias a los agentes contaminantes. Hay un gran número de agentes limpiadores disponibles para lavar material de vidrio y plástico del laboratorio. Algunos artículos, como las pipetas, requieren de una inmersión adicional antes de ser lavadas. En varias instituciones el lavado del material de vidrio se lleva a cabo por medio de una lavadora automática. Los fabricantes de lavadoras automáticas generalmente recomiendan el uso de detergentes específicos. En general, se usan los detergentes libres de metales que son no-iónicos y que no están altamente alcalinizados. La lavadora debe estar equipada con ciclos de enjuague con agua purificada para evitar la contaminación. Si los utensilios son lavados manualmente, deben enjuagarse completamente con agua de la llave y después enjuagarlas 5 veces con agua purificada preferentemente de tipo I. Cuando el material de vidrio está limpio, el agua purificada drena como una capa continua, mientras que los recipientes mal lavados pueden tener pequeñas gotas de agua adheridas en su superficie. Después del secado, la presencia de manchas indica que el material de vidrio está sucio, posiblemente debido a un enjuague inadecuado. Este procedimiento no es recomendable para plásticos impermeables. Los restos de detergente en el material de vidrio se pueden identificar enjuagando un artículo de vidrio con un colorante en solución acuosa diluida (20 mg/L) como la sulfobromoftaleína (Bromosulfophtalein, “BSP”, en inglés) o algún otro indicador ácido-base o midiendo el pH del agua purificada con la que se enjuagó el material. Como se dijo previamente un lavado ácido puede ser necesario en algunos casos. Preferentemente use HCl o HNO3 (1 M) diluidos. El uso del ácido crómico ha sido 52

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descontinuado para este procedimiento debido a la contaminación residual y a los riesgos en su manejo y preparación Los limpiadores ultrasónicos pueden ser usados para suplementar la acción de los detergentes. Estos pueden ser particularmente útiles en la limpieza de los utensilios cubiertos con proteínas. Tanto el material de vidrio como el de plástico deberá ser secado, ya sea a temperatura ambiente o a temperaturas menores de 100o C, evitando así la degradación del plástico y cambios en los volúmenes designados al material de vidrio. Sí se usan solventes para ayudar al secado, éstos deben ser de alta calidad y miscibles con el agua. Cualquier gas usado también deberá ser de alta pureza.

Utensilios de Laboratorio Vasos de precipitados. Estos vasos (Fig. 1-1, D) son de boca ancha y paredes rectas; los hay también cilíndricos y están disponibles en vidrio y plástico. Sus volúmenes varían de 5mL a varios litros. Se usan para mezclas generales y preparación de reactivos líquidos no volumétricos. Embudos. El uso más común de los embudos es en la transferencia de líquidos o sólidos de un recipiente a otro. Los embudos de filtrado (Fig. 1-1,G) tienen generalmente un ángulo de 58 ó 60 grados con un tallo, ya sea largo o corto. Se usan con papel filtro para remover partículas de una solución. Varios embudos tienen crestas para incrementar la superficie de filtración. Los embudos de polvo son usados en la transferencia de sólidos (Fig. 1-1,H) tienen un tallo con boca ancha para facilitar el paso de sólidos. La superficie interna de estos embudos es lisa. Tanto los embudos de filtrado como los embudos de polvos están disponibles en vidrio y plástico. Los embudos de separación (Fig. 1-1,B) son fabricados con un orificio abierto, con un tapón de vidrio en un extremo y una llave de paso en el otro. Estos artículos son usados para extracciones manuales líquido- líquido de volúmenes relativamente grandes de muestras. La fase inferior es separada de la superior a través de la llave de paso, permitiendo la recuperación de una de ellas. Desecadores. Los desecadores (Fig. 1-1, J ) son usados para secar o mantener secos materiales sólidos o líquidos. El desecante generalmente se coloca en la parte inferior del desecador y en un estante puesto arriba del desecante se puede apoyar el material que se desea mantener seco. La parte superior del desecador tiene una tapa de vidrio amplia y plana con un labio ancho que encaja con el borde opuesto en el fondo del desecador. Se acostumbra colocar una llave de paso engrasada en la superficie de los bordes para proveer un sello contra el paso de aire. Varios desecadores tienen también un una llave de salida en la parte superior para permitir la evacuación de los desecadores. Resulta conveniente para el laboratorio contar con varios desecadores para poder almacenar materiales a diferentes temperaturas incluyendo: temperatura ambiente, de refrigeración, y de congelación. Los tipos de desecadores 53

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disponibles están descritos en la Tabla 1-4. Probetas Graduadas. Las probetas graduadas son angostas, de paredes rectas y son usadas para medir volúmenes específicos (Fig. 1-1, E). Están disponibles en plástico o vidrio en volúmenes desde 5 mL hasta varios litros. Pueden estar calibradas para transferir (PT) o para contener (PC) el volumen está indicado a temperaturas específicas y las hay graduadas en subdivisiones de aproximadamente 100 divisiones del volumen total de la probeta. Algunas de ella están diseñadas con tapones que son usados para preparar soluciones no volumétricas. Buretas. Las buretas tradicionales son grandes, con tubos de vidrio graduado y una llave de paso en un extremo (Fig. 1-1, I). Están diseñadas para transferir exactamente cantidades conocidas de líquido en un recipiente. Midiendo de una línea graduada a otra línea graduada, se pueden dispensar fracciones de volúmenes de menos de 1mL con un alto grado de exactitud. Ahora existen buretas automáticas que son controladas por un microprocesador con una exactitud tan alta como 0.1%. Los volúmenes dispensados son monitoreados en un ordenador digital capaz de leer hasta 0.001 mL. Matraces. En el laboratorio se usan varios tipos de matraces; los más comúnmente usados son los volumétricos y Erlenmeyer mostrados en Fig. 1-1, F y A. Los matraces de fondo redondo son usados para evaporar muestras hasta sequedad. Los tamaños de los matraces varían desde 1 mL hasta varios litros. Matraces volumétricos. Son esencialmente para la preparación exacta de soluciones de concentración conocida. Las especificaciones de clase A para matraces volumétricos están definidas por el NIST e impresas en el matraz. Estas especificaciones son exactas sólo a la temperatura especificada en el matraz (Tabla 1-7). Los matraces volumétricos son usados para contener (“To Contain” o “TC”, en inglés) un volumen exacto cuando el matraz se llena hasta la marca. Tales matraces por lo tanto no dispensan volúmenes exactos y no pueden usarse para transferir líquidos. La parte superior del matraz volumétrico está cubierta por una tapa delgada de vidrio o Teflón, lo cual permite la inversión del matraz sin pérdida de líquido. Estos matraces no deben ser calentados bajo ninguna circunstancia, porque puede causar la distorsión de su forma y volumen. Los matraces volumétricos no deben ser usados para almacenar reactivos. Jeringas. Estas pueden usarse para medir volúmenes exactos tales como la inyección de pequeños volúmenes de líquido para análisis cromatográfico. Hay jeringas disponibles en tamaños desde 1 hasta 500 L. Están hechas de vidrio y tienen un orificio perforado con precisión en el cual es colocado un émbolo que encaja justamente. La punta de la jeringa que dispensa el contenido es una aguja de metal de diámetro fino, la cual está diseñada para traspasar el tapón del recipiente a inyectar. Para las jeringas de volumen mayor de 5 L, los 54

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fabricantes aseguran que la inexactitud no excede el 1% del volumen total de la jeringa y las mediciones repetidas no difieren por más del 1% del volumen dispensado. Para jeringas de volumen menor de 5 L, la inexactitud mejor alcanzada fue del 2%. En general, las jeringas no están calibradas porque los estándares internos empleados en procedimientos cromatográficos, permiten la corrección del error. Para el trabajo en cromatografía de gas (GC) con muestras volátiles, las jeringas deben ser herméticas al aire.

Pipetas La mayoría de las pipetas están hechas de vidrio, sin embargo hay pipetas serológicas de plástico. Hay definidas dos categorías de pipetas manuales: de transferencia (volumétrica) y de medición. Dentro de estas categorías hay tres subclasificaciones: para contener (PC), para transferir (PT), y para transferir/con soplado (PT con soplado). Las pipetas PC o pipetas de enjuague deben volverse a llenar o enjuagarse con un solvente apropiado después de que el líquido inicial ha sido drenado. Estas pipetas contienen o retienen una cantidad exacta de líquido el cual debe ser transferido en su totalidad para hacer una medición exacta. Algunos ejemplos de éstas son, la pipeta de Sahli para hemoglobina y la de Lang-Levy. Ninguna de estas pipetas cumple con las especificaciones de clase A. Las pipetas PT con soplado son llenadas, después se dejan drenar y luego se les sopla para dejar salir el fluido remanente en la punta. Éstas transfieren o dispensan una cantidad exacta de líquido y no se enjuagan. Las pipetas que pertenecen a este grupo incluye Ostwald-Folin y las pipetas serológicas. Son fácilmente identificables por las dos bandas esmeriladas cercanas a la boquilla de la pipeta (Fig. 1-3). Las pipetas serológicas son tubos largos de vidrio (o plástico) de diámetro uniforme. En estas pipetas las graduaciones del volumen están a lo largo de la pipeta incluyendo la punta de ésta. De esta manera la última gota de líquido que fue soplada, está incluida en el volumen transferido. Estas pipetas vienen con una punta alargada y estrechada y tienen varios tamaños del orificio de salida para controlar la cantidad de líquido transferido. Las pipetas con orificio de salida más amplio son usadas para dispensar fluidos viscosos. Las pipetas PT son cargadas y después drenadas por gravedad. Para asegurar un drenado completo, hay que seguir la velocidad de flujo especificada por el NIST. Las pipetas deben sostenerse verticalmente y la punta debe apoyarse contra la pared del envase receptor pero sin tocar el líquido del mismo. Ejemplos de estas son: las pipetas volumétricas de transferencias, pipetas Mohr y pipetas serológicas. (Figs. 1-3 y 1-4). Las pipetas PT si cumplen los estándares de la clase A. Las Pipetas volumétricas (PT) (Figs. 1-3 y 1-4) tienen un bulbo con extremo abierto, el cual sostiene la mayor parte del líquido, un tubo largo de vidrio en un extremo y con una marca o línea que indica hasta donde se debe llenar la pipeta y con la porción para transferir el líquido más afinada. Después de drenarla, esta pipeta transfiere el volumen especificado con un alto grado de exactitud (Tabla 1-8). Las pipetas Ostwald-Folin (PT) tienen apariencia similar a las volumétricas, pero tienen el bulbo cerca de la punta. Son usadas para la medición exacta de líquidos viscosos como sangre o suero y requieren ser sopladas para dispensar el contenido total. Así pues, tienen bandas grabadas cerca de la parte superior. Para asegurar la transferencia completa de fluidos viscosos, el líquido es soplado después que la pipeta ha sido drenada libremente por gravedad hasta la última gota. 55

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Las Pipetas Mohr (PT) son uniformes en diámetro, con el extremo de transferencia afinado. Las graduaciones están insertadas en el tallo a intervalos uniformes, así que la calibración ocurre en la parte superior pero no incluye la punta. La exactitud establecida para estas pipetas es válida solo cuando la pipeta esta llena. Si se dispensan volúmenes menores, la exactitud decrece proporcionalmente. Las pipetas Mohr con puntas largas se usan para dispensar líquidos en recipientes pequeños. Estas pipetas son menos exactas que las pipetas comunes de punta afinada. Las pipetas Mohr nunca deben ser utilizadas como si fueran del tipo de soplado. La exactitud de éstas y otras pipetas están resumidas en la Tabla 1-8.

Micropipetas Las micropipetas contienen o dispensan pequeños volúmenes de líquido empezando por 1 L hasta 1,000 L. Las micropipetas reusables de vidrio ya no se usan en el laboratorio clínico, sin embargo, sus características están descritas.ref(12) Ahora existen tubos desechables, baratos, y con demarcaciones para volúmenes específicos. Éstas se llenan por capilaridad y el líquido es forzado a salir por medio de un bulbo parecido al de los goteros. El tipo más común de micropipetas es la semi-automatizada que usa el desplazamiento de aire o desplazamiento positivo para dispensar el líquido contenido. Hay algunos modelos disponibles con ajustes digitales del volumen a usar. Existen varias marcas de pipetas de desplazamiento de aire, pero todas son operadas por pistones. Se coloca una punta desechable e intercambiable de polipropileno al final de la pipeta y entonces se carga el líquido y se dispensa a través de esta punta desechable (Fig. 1-5). Algunos instrumentos pueden expulsar automáticamente la punta de la pipeta usada y cargar una nueva, minimizando la contaminación analítica. Existen también varias marcas de pipetas de desplazamiento positivo. Las puntas capilares pueden ser hechas de plástico, vidrio o vidrio siliconizado, y es posible reusarlas. Estas son particularmente útiles en el manejo de reactivos que pueden reaccionar con plásticos. Las micropipetas de desplazamiento positivo dispensan líquido por medio de un émbolo con una punta de Teflón que entra exactamente en el capilar. El acarreo de líquidos es insignificante en instrumentos con mantenimiento apropiado. En algunas ocasiones se usa un procedimiento de lavado entre las muestras. La precisión y exactitud de estos aparatos es excelente si son mantenidos en forma apropiada. La recuperación de la muestra es por lo menos del 99%, con una reproducibilidad del 0.6% al 0.3% para volúmenes entre 10 mL y 500 L. Para volúmenes menores de 10 mL los errores son significativamente mayores. Por esta razón, deben evitarse los procedimientos manuales involucrando volúmenes pequeños.

Diluidores y dispensadores Los dispensadores y pipeteadores manuales son frecuentemente usados en el laboratorio para adicionar volúmenes específicos de reactivo o diluyente en forma repetida a una solución (Fig. 1-6). Hay varios tipos disponibles comercialmente, pero todos consisten en un frasco de reactivo el cual tiene anexo un émbolo con un sistema de válvula. El dispensador tiene adaptado un tubo o popote que alcanza el fondo del frasco. Éste debe ser purgado con líquido para asegurar la ausencia de burbujas de aire. Una vez purgado, al presionar el émbolo, se dispensa la cantidad seleccionada de líquido. Regresando el émbolo a su posición 56

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original se vuelve a llenar la cámara dispensadora. Los fabricantes le atribuyen un error del 1% y una reproducibilidad del 0.1%. Los dispensadores manuales requieren limpieza frecuente para eliminar el material que pueda obstaculizar la acción del pistón . Los pipeteadores que dispensan líquidos en forma repetitiva son útiles en el manejo de volúmenes relativamente pequeños. El volumen a dispensar se determina por el ajuste del pipeteadores y por el tamaño de la punta, tipo jeringa desechable, la cual también actúa como el reservorio del líquido. Los Diluidores-dispensadores automáticos son útiles para preparar un gran número de muestras para análisis. Tales accesorios pueden ser parte integral de un analizador químico automatizado. Los dispensadores pipetean un volumen de muestra y diluyente preestablecido en un recipiente o instrumento. El dispensador de pistón doble frecuentemente usado, permite el ajuste de volúmenes de ambos; muestra y diluyente (Fig. 1-7). Una jeringa movida por un motor procesa la muestra y otra procesa el diluyente. Las jeringas son activadas por un microprocesador permitiendo que cada pistón llene las jeringas simultáneamente. Una segunda señal reacomoda las válvulas para permitir que el diluyente fluya por la jeringa de la muestra. Esto desplaza la muestra, forzándola a través de la punta de la pipeta y se enjuaga en preparación para la próxima muestra. Pueden seleccionarse varias proporciones entre muestra y diluyente, sin embargo, un volumen de 10 partes del diluyente asegura un buen enjuague y un acarreo insignificante de la muestra anterior. Se considera que el error en el volumen dispensado es menor del 0.5% mientras que la reproducibilidad es de 0.05% del volumen total de la jeringa ó 0.1% cuando se dispensa al menos el 10% del volumen de la jeringa.

Técnicas Volumétricas Pipetas de clase A Los procedimientos analíticos en química clínica requieren de mediciones volumétricas y transferencias exactas para asegurar la exactitud en los resultados, este trabajo requiere el uso de material de vidrio de clase A. De hecho, El Colegio de Patólogos Americanos ("CAP") especifica que las pipetas volumétricas deben ser de exactitud certificada (Clase A) o los volúmenes de los artículos deben ser verificados (por ejemplo, a través de un procedimiento gravimétrico). Además, las pipetas automáticas y artículos usados en diluciones deben ser revisados periódicamente para garantizar la precisión y exactitud. Por lo tanto, la mayoría de los laboratorios utilizan material de vidrio de clase A en forma rutinaria. Además, el material de vidrio debe ser escrupulosamente lavado para evitar la adherencia de líquido a las paredes sucias de los recipientes y pipetas resultando en mediciones inexactas. Las pipetas de vidrio de borosilicato deben ser inspeccionadas frecuentemente. Si las puntas de las pipetas están rotas o el vidrio rallado deben desecharse. Las pipetas de clase A se llenan con la ayuda de bulbos de hule o algún artículo semejante. Bajo ninguna circunstancia se permite el pipeteo con la boca. El bulbo se usa para llenar la pipeta por arriba de la marca de calibración. La pipeta es sostenida con los dedos pulgar y medio, colocando el dedo índice sobre el orificio superior, para controlar al mismo tiempo el flujo del líquido (Fig.1-8). Una vez que la pipeta se ha llenado por arriba de la marca, se limpia la punta con un papel que no deje residuos para eliminar el exceso de 57

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fluido. Entonces se deja drenar el líquido hasta que la parte inferior del menisco quede exactamente en la marca; esto se realiza con la pipeta en posición vertical, sujetándola a la altura del ojo. Se continúa sosteniendo la pipeta en posición vertical, con la punta contra la pared del vaso receptor y se drena el líquido a medida que el dedo índice va liberando el orificio de la pipeta . Las pipetas PT deben sostenerse por un tiempo suficiente (~2 seg) para permitir dispensar el volumen especificado. Con las pipetas PC o pipetas de soplar, el bulbo de hule se usa para soplar los restos de solución después que el drenado ha sido completado. Micropipetas Las micropipetas de desplazamiento por aire pueden ser usadas en dos formas, hacia adelante o en reversa. La forma reversa se usa solamente en sistemas con mecanismos compuestos de doble pulso o presión. La precisión de éstas en la forma hacia adelante depende del drenado preciso causado por la presión del aire y también son relativamente sensibles a las características físicas del líquido que ésta siendo pipeteado. La forma reversa de operación, por otro lado es considerablemente menos sensible al tipo de líquido que está siendo dispensado. En el funcionamiento hacia adelante el pistón es oprimido hasta el primer tope; en sistemas con mecanismos compuestos por dos pulsos, la punta se descansa en el líquido y se deja subir el pistón lentamente hasta su posición original. Este movimiento llena la punta con el volumen designado de líquido. Entonces se saca la punta deslizándola por la pared del vaso de tal forma que cualquier adherencia de líquido sea removida. Si hay cualquier gotita, limpiar la punta cuidadosamente con un papel que no deje residuos, teniendo cuidado de no extraer ninguna muestra de la punta de la pipeta. Se coloca entonces la punta en la pared del vaso receptor, se empuja el pistón suavemente hasta el primer tope en los mecanismos con dos pulsos, dejando drenar el líquido. Después, se deja pasar un segundo antes de empujar el pistón hasta el segundo tope, liberando el líquido residual. Cuando se usa la forma reversa, el líquido es aspirado después que se ha llevado al pistón hasta el segundo pulso. Esto sobrecarga la pipeta con la muestra. Para dispensar el líquido, empujar el pistón hasta el primer tope y liberarlo después de esperar un segundo. Las micropipetas de desplazamiento positivo se usan de la misma forma que las micropipetas con desplazamiento de aire hacia adelante. De nuevo, la limpieza cuidadosa de la punta es crucial para no tocar la parte de la muestra contenida en ella. El mantenimiento necesario para las puntas de Teflón debe ser suficientemente enfatizado. Información más detallada sobre esta técnica está publicada.ref(13) Procedimientos generales para la preparación de soluciones La preparación de soluciones requiere de mediciones exactas de solvente y soluto. El grado de exactitud requerido dictará que material de vidrio debe ser usado específicamente. 1. Medir el soluto pesándolo, pipeteándolo, o dispensandolo de una probeta o pipetear ( ver ejemplos). 2. Preparar soluciones volumétricas transfiriendo cuantitativamente el soluto al matraz receptor. Si el soluto existe como una solución concentrada, usar una pipeta volumétrica para la transferencia. 3. Añadir suficiente solvente para disolver el soluto cuando sea necesario. 58

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4. Cuando el matraz receptor es volumétrico, los sólidos o líquidos son adicionados al matraz y el diluyente se adiciona hasta aproximadamente dos tercios del volumen del matraz. La disolución del sólido o líquido puede ser efectuada agitando el líquido. Después de la disolución, se adiciona diluyente hasta que el menisco alcance la línea del grabada en el cuello del matraz, visto al nivel del ojo. Para mezclar completamente la solución hay que tapar la boca del matraz. Sostenerlo del cuello con una mano, simultáneamente hacer girar el líquido e invertir el matraz. Como alternativa, la dilución o disolución de un sólido en el diluyente puede llevarse a cabo en un matraz Erlenmeyer. Luego, la solución se transfiere a un matraz volumétrico, seguido de varios lavados del matraz Erlenmeyer con diluyente y transfiriendo el líquido usado en los lavados, al matraz volumétrico. 5. Llevar la solución a volumen después de que el soluto está completamente disuelto. 6. Si es necesario el uso de una barra magnética, sacar la barra y enjuagarla con solvente antes de llevar la solución al volumen determinado. 7. Llevar al volumen una solución solamente a temperatura ambiente. 8. Mezclar bien la solución para asegurar su homogeneidad. 9. Transferirla a un recipiente apropiado para su almacenamiento (ámbar/claro, plástico/vidrio).

Control de calidad de micropipetas, dispensadore, y diluidores General. La exactitud y precisión de cada micropipeta manual debe ser verificada al adquirirla y durante el curso del año. La frecuencia de la verificación dependerá de que tanto se use. Aquellas de uso constante se pueden verificar cada mes, mientras que las raramente usadas se pueden verificar un o dos veces al año, a menos que una agencia de inspección ordene una mayor frecuencia. Los fabricantes de pipetas más recientes aseguran una calibración estable por dos años. Está pendiente determinar si estas afirmaciones son aceptadas por las agencias de inspección. El mantenimiento de rutina es crítico. Las pipetas de desplazamiento de aire tienen una longitud fija del tope que debe ser mantenida. Además, hay sellos para evitar el paso del aire a la pipeta cuando se mueve el pistón. Este debe ser engrasado para mantener su funcionamiento apropiado. El fabricante proveerá una guía para llevar a cabo el mantenimiento. Cualquier parte gastada debe ser reemplazada y las pipetas que no cubran las especificaciones de precisión y exactitud, generalmente requerirán servicio por parte del fabricante. Las pipetas de desplazamiento positivo, necesitan prácticamente el mismo mantenimiento con respecto a la verificación del resorte y reemplaziamiento de las puntas de Teflón. Muchos de estos artículos también se suministran con alambre deslizable para hacer una rápida verificación del émbolo. Estas revisiones no deben ser usadas en lugar de las verificaciones de rutina. Los fabricantes proveen de guías para realizar el mantenimiento de rutina. Validación del control de calidad. El método primario para la validación del funcionamiento de las pipetas es una técnica 59

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gravimétrica.ref(14) Un método secundario es un procedimiento espectrofotométrico con dicromato de potasio. El último método es inaceptable para volúmenes menores de 10 L. El siguiente protocolo describe el método gravimétrico basado en los lineamientos del NCCLS: Determinación del Funcionamiento del Equipo Volumétrico.ref(15) 1. Asegurarse de que todos los materiales (agua, frascos pequeños para pesar y pipetas) a usar estén a temperatura ambiente 2. Todas las mediciones requieren de agua Tipo I. 3. Medir y registrar la presión barométrica y la temperatura ambiente (t) del agua a 0.1o C. 4. Para minimizar los errores de evaporación colocar una pequeña cantidad de agua en los frascos pequeños para pesar (entre 2 y 30 volúmenes de muestra o un mínimo de 0.5 mL. Cubrir (por ejemplo con un papel Parafilm o con un tapón). Asegurarse de que las manipulaciones se lleven a cabo sin tocar los frascos directamente. 5. Pesar los frascos (agua y cubierta) y registrar el peso llevándolo hasta la acotación de 0.1 mg (Pv) más cercana o tarar el peso del frasco, agua y cubierta. 6. Transferir la alícuota de agua que se va a medir al frasco de pesado, usando la pipeta en prueba. Tapar nuevamente el frasco. 7. Pesar de nuevo el frasco a la décima de mg más cercana y registrar el peso (Pt) 8. Repetir las mediciones Pv y Pt hasta obtener 10 lecturas para poder evaluar la precisión y exactitud. (Para una "verificación rápida" pueden hacerse 4 lecturas que darán una idea aproximada de la precisión) 9. Referirse a “El Manual de Física y Química”ref(16) para obtener el factor de corrección para la temperatura del agua. Evaluar el factor de conversión z ( l/mg) incorporando la densidad del agua a la temperatura y presión de la prueba. 10. Cálcule el volumen medido como sigue: _ _ Volumen Promedio,Vt = Peso Promedio Pt · z _ donde Pt = P1

11. La exactitud se calcula evaluando la diferencia entre el volumen promedio real medido y el volumen nominal, expresado en %: Volumen promedio ––––––––––––––––– x 100% Volumen nominal

12. La precisión se deriva de la distribución de los pesos individuales con respecto a su media y expresado en porcentaje de coeficiente de variación. (%CV). En general, un error de 0.1% o menos en la exactitud puede ser ignorado al usar la pipeta. Los errores más grandes deben evaluarse en forma crítica y ajustar la pipeta si es necesario para lograr una mayor exactitud en el volumen. Los fabricantes pueden usar mercurio en lugar de agua para evaluar el funcionamiento de las pipetas. Esta práctica no se recomienda para un laboratorio de rutina. El uso de radioisótopos y enzimas es inaceptable por el gran error inherente y la 60

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escasa estandarización. Otros métodos tales como la titulación ácido-base, fotometría de flama, y colorimetría han sido sugeridas, pero todavía no hay suficiente documentación para validar estos métodos . La exactitud de un dispensador puede también ser evaluada por un procedimiento gravimétrico. Se prepara el volumen a ser probado y la pieza se purga para eliminar la presencia de burbujas de aire. Entonces se despacha el agua cuidadosamente en un tubo prepesado y se determinan los volúmenes usando la misma ecuación de la prueba para las pipetas. Se puede obtener una idea aproximada del funcionamiento del despachador usando una probeta. Este procedimiento es útil cuando se hacen ajustes de volumen al dispensador, el cual también provee un mecanismo de verificación diaria. El procedimiento gravimétrico debe efectuarse a intervalos regulares (mensual, trimestral), dependiendo del uso del pipeteador. Los Diluidores automáticos son mejor evaluados usando un método espectrofotométrico con dicromato de potasio. Se prepara una serie de diluciones (n = 20) con el diluidor, se miden espectrofotométricamente, y entonces se comparan con una dilución manual hecha con las mismas proporciones de volúmenes. La dilución manual debe prepararse en matraces volumétricos en volúmenes suficientemente grandes de muestra (no menos de 1 mL) para asegurar la exactitud. Se compara entonces la absorbancia de la muestra preparada usando el diluidor automático con la de la muestra diluida manualmente y se calcula la exactitud del diluidor automático de la forma previamente descrita. Debe haber una correlación del 2%. Similarmente se calcula la precisión usando la distribución individual de las absorbancias con relación a su media, expresada como %CV. El %CV no debe ser mayor del 1%. Este procedimiento puede ser usado para evaluar algunos sistemas diluidores que se incorporan a instrumentos automatizados. De nuevo, los procedimientos que involucran el uso de enzimas son inaceptables. La frecuencia de verificación se determinará por la frecuencia del uso. Las determinaciones mensuales serán suficientes para la mayoría de los materiales, incluyendo los diluidores incorporados a los analizadores automatizados. Las pipetas, diluidores, y dispensadores deben ser reevaluados cada vez que sean sometidos a una reparación o servicio. Todos los procedimientos deben ser registrados y archivados de acuerdo a los lineamientos de las agencias de inspección federales, estatales y locales.

Unidades de medición Unidades SI Hay siete unidades básicas del sistema SIref(17) (Tabla 1-9). Pueden combinarse dos o más unidades básicas por multiplicación o división para las formar unidades SI derivadas (Tabla 1-10). Las unidades básicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeñas para su uso conveniente. Se permite el uso de prefijos que forman múltiplos o submúltiplos (Tabla 1-11). Se han conservado algunas unidades que no son SI (no SI) por las dificultades encontradas en su conversión a unidades SI o por la amplia difusión de su uso. Algunas unidades no-SI relevantes en química clínica y sus símbolos son las unidades de tiempo, expresadas en minutos (min), horas (h), o días (d) y las unidades de volumen, expresado como litros (L). La Conferencia General de Pesos y Medidas ("Conferencia Générale des Poids et 61

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Mésures" o “CGPM”, en francés) ha aprobado l, l, o L como designación para volumen, sin embargo, L es la abreviación oficial aceptada en los Estados Unidos.

Unidades SI en el laboratorio clínicorefs(18) La unidad SI describe la concentración de los constituyentes del cuerpo en términos del número de moléculas disueltas, medidas en moles (mol, mol, etc) más bien, que en términos de cantidad de masa disuelta (mg, g, etc.). Una mol de una sustancia química contiene el número de gramos equivalentes a la masa de su formula (ver Tabla 1-10, pág. 36). La unidad SI de actividad enzimática es el katal, el cual se define como la cantidad de enzima que catalizará la transformación de una mol de sustrato por segundo en un sistema de análisis. Esta terminología ha sido aprobada por la Comisión Conjunta sobre la Nomenclatura de Sustancias Químicas de la Unión Internacional de Bioquímica ("Joint Commission on Biochemical Nomenclature of the International Union of Biochemistry," o"IUB", en inglés) y la IUPAC pero no ha sido aprobada por la CGPM. Por lo tanto el uso de las unidades internacionales, UI ("IU" en inglés), para describir actividad enzimática continuará indudablemente (ver Capítulo 54). Existe una relación constante entre katal y UI (1 katal = 16.67 UI) cuando se miden bajo condiciones idénticas de temperatura, pH, y concentración de sustrato y coenzima. Es frecuente que las unidades SI no se usen cuando el peso molecular de una proteína es incierto. Sin embargo, aún bajo estas condiciones es posible expresar la concentración de una sustancia más que la concentración de la masa, asumiendo que el peso molecular aproximado es incluido en la documentación. Esta aproximación también aplica para las hormonas; las Unidades Internacionales se usan para expresar actividad enzimática mientras que las unidades SI se usan para reportar osmolalidad. La unidad SI para reportar presión es el pascal. Sin embargo, los valores numéricos expresados en pascales para presión sanguínea y presiones parciales de gases sanguíneos son muy grandes y se prefiere usar la unidad kilopascal. Para mayor información relacionada con el sistema de unidades SI, consultar la publicación del NIST: “Guía para el Uso de Unidades del Sistema Internacional.ref(19)

Mediciones de masa La Masa puede ser definida como la cantidad de materia. El peso es una función de la masa bajo la influencia de la gravedad, como se expresa en la siguiente ecuación: Peso = Masa x Gravedad Así, dos objetos de igual masa que están sujetos a la misma fuerza gravitacional tienen pesos iguales. El gramo es una unidad de masa. Las mediciones de masa o peso, se llevan a cabo usando una balanza. El tipo de balanza seleccionada dependerá de la función que se esté desempeñando. Se requieren diferentes balanzas para medir pesos en kilogramos (por ejemplo, para análisis de grasa fecal) y pesos en microgramos (por ejemplo, para preparar estándares de drogas para análisis toxicológico). Por lo tanto el laboratorio estará equipado 62

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con diferentes balanzas para poder llevar a cabo todas las mediciones de pesos necesarias.

Tipos de balanzas Hay dos tipos de balanzas de uso común en el laboratorio: mecánica y electrónica. Las balanzas mecánicas incluyen las variedades siguientes: balanza granataria, balanza de platillo único, balanzas de torsión, y balanzas analíticas. Los pesos que requieren menos precisión se pueden hacer con una balanza granataria o con una de platillo único. Estas balanzas han sido previamente descritas.ref(20) La mayoría de los laboratorios han reemplazado las balanzas analíticas por las electrónicas. Estas pueden ser de diseño analítico o de carga superior (Fig. 1-9). Las balanzas electrónicas tienen un solo platillo que usa una fuerza electromagnética en lugar de las pesas para contrabalancear la carga colocada en el platillo. El platillo está unido directamente a un carrete suspendido en un campo con un imán permanente. Una corriente pasa a través del carrete, produciendo una fuerza electromagnética que mantiene el platillo en una misma posición. Cuando se deposita una carga en el platillo, una celda fotoeléctrica registradora, sujetada al brazo de la palanca, cambia la posición y transmite una corriente a un amplificador que incrementa el flujo a través del carrete y regresa el platillo a su posición original. Esta corriente es proporcional al peso de la carga en el platillo y produce un voltaje cuantificable que es convertido por un microprocesador a datos numéricos que indican la masa de la carga. La exactitud de una balanza electrónica depende de la linealidad del motor y del voltímetro digital. Algunas balanzas electrónicas tienen un regulador electrónico de vibración. La vibración excesiva puede ser detectada cuando se observa variación del indicador u oscilación de números en el último lugar decimal. La mayoría de las balanzas electrónicas tienen incluido un sistema para tarar el peso de los vasos a usarse los cuales se llevarán a cero. Esto tiene una enorme conveniencia cuando se quieren determinar múltiples pesos, tales como calibración de pipetas. Además, las balanzas electrónicas pueden estar en interface con un equipo procesador de datos, proporcionando así, cálculos como peso promedio y análisis estadístico de mediciones múltiples. Una balanza electrónica es al menos 5 veces más rápida que un instrumento mecánico. Cada peso es registrado en cinco segundos o menos. La Tabla 1-12 resume los tipos de balanzas y sus características de ejecución.

Requisitos de operación Todas las balanzas deben estar localizadas en un lugar protegido del sol y de corrientes de aire que puedan interferir con el proceso de pesado. Las balanzas analíticas deben ser ubicadas en un lugar libre de vibraciones, preferentemente aisladas en una placa pesada (como el mármol). Entre más sensible sea la balanza, más críticos serán los requerimientos. Antes de usar una balanza, debe nivelarse ajustando los tornillos de las bases centrando la burbuja en el indicador de nivelación. Se debe verificar también el cero óptico. Todos los pesos deben hacerse usando papel para pesar, recipientes de plásticos, vasos de precipitados, o algún otro recipiente. Bajo ninguna circunstancia debe colocarse una sustancia química directamente en el platillo. Después de completar el proceso de pesado, todos los cristales derramados deben ser retirados del área de la balanza. Igualmente los derrames de líquidos, especialmente los 63

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corrosivos, deben limpiarse inmediatamente para evitar que se dañen los platillos. Las pesas deben manejarse con pinzas, nunca directamente con las manos. El contacto directo con la piel deposita aceites, sales, y humedad en las pesas. Entre más pequeño sea el peso, más significativo será el error. Procedimientos de mantenimiento Además de los procedimientos ya descritos, las balanzas deben recibir servicio cada año como mínimo, o más frecuentemente si el uso es constante. El servicio debe ser otorgado por el fabricante o su representante. También se requieren verificaciones periódicas de exactitud en el peso como también se deben mantener registros documentando el control de calidad y procedimientos de mantenimiento. Estas verificaciones deben realizarse al menos cada mes y antes de un procedimiento analítico crítico. La verificación del funcionamiento requiere el uso de pesas NIST de clase S. EL CAP requiere que los laboratorios aprobados validen el funcionamiento de sus balanzas usando pesas de clase S.ref(21) Una pesa de 100 g debe pesar 100 g +0.5 mg. Las pesas clase S deben ser revisadas para verificar que sus pesos aparentes estén dentro de las especificaciones del NIST (Tabla 1-13). Un funcionamiento inaceptable indica la necesidad de servicio. Algunas balanzas modernas tienen incluida una sola pesa para llevar a cabo esta función. Tales balanzas aun requieren la verificación del resto de las pesas.

Termómetría Tipos de termómetros Los baños de agua y placas de calentamiento deben mantenerse a temperatura constante cuando se realizan análisis sensibles a la temperatura. Los refrigeradores y congeladores deben mantenerse a temperatura constante cuando se usen para almacenar materiales sensibles a la temperatura. Los Termómetros de líquido en vidrio, termostatos, y termómetros digitales electrónicos se usan para controlar la temperatura de estos aparatos. Diariamente, como parte de los procedimientos de control de calidad del laboratorio, debe llevarse un registro de las temperaturas de todos los aparatos utilizados en la medición de la misma, igual que cualquier acción correctiva. La exactitud de los termómetros usados para controlar el calor de los baños debe ser verificado a intervalos regulares, generalmente cada 6 a 12 meses. Se ha recomendadoref(22) que el termómetro tenga un intervalo de exactitud equivalente a la mitad del intervalo deseado para el baño. Por ejemplo, si la exactitud deseada para el baño es de +0.1o C, el termómetro debe tener un máximo de incertidumbre de +0.05o C. Los termómetros de líquido en vidrio están disponibles para inmersión total o parcial. Los termómetros de inmersión parcial se usan para medir la temperatura de los baños, placas, y hornos. La profundidad de inmersión está grabada en el tallo y se localiza aproximadamente a unos 76 mm del bulbo. Los termómetros de inmersión total se usan generalmente para verificar temperaturas de congeladores y refrigeradores, pero pueden ser sustituidos por termómetros de inmersión parcial si se verifican a la misma profundidad de inmersión a la que 64

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Calibración de los termómetros de líquido-en-vidrio La calibración de los termómetros requiere el uso de un termómetro NIST certificado o de origen NIST. Como parte del programa del NIST de Materiales Estándares de Referencia (SRM), hay termómetros certificados que pueden ser usados para calibrar termómetros a 0o C y en un intervalo de 24o C a 38o C. Los termómetros que se rigen por el NIST tienen un intervalo de operación más amplio. El siguiente procedimiento establece las etapas necesarias para validar los termómetros no certificados y está basado en los estándares del NCCLS: “Temperatura de los Baños de Agua y su Calibración y Instrumentos y Sensores de Temperatura.ref(23) 1. Verificar que la columna de mercurio esté libre de segmentos o burbujas. (Si hay alguna presente, consultar los estándares del NCCLS para el procedimiento de corrección del problema). 2. Hacer una determinación en hielo.ref(24) Con esto serán verificados los cambios de volumen en el bulbo. Después de realizar este procedimiento dejar el termómetro afuera por unos cuantos días para asegurar una recuperación del bulbo 3. Ajustar el baño a la temperatura requerida para el análisis. Es importante que el volumen del baño sea al menos 100 veces mayor que el volumen del fluido en el cual el termómetro está siendo calibrado. Eso asegurará el mantenimiento de una temperatura uniforme en el baño. 4. Colocar el termómetro de referencia y el no certificado en tubos de ensayo llenados con agua, hasta la profundidad apropiada. Los termómetros deben colocarse uno cerca del otro pero con suficiente espacio entre ellos para asegurar la circulación en el baño. 5. Si se está calibrando un termómetro de inmersión total para ser usado como de inmersión parcial, éste debe ser sumergido en el baño a la misma profundidad usada en la aplicación de las pruebas. La inmersión apropiada del termómetro es esencial. 6. Después de alcanzar el equilibrio térmico (el cual necesitará de varios minutos para los termómetros de líquido en vidrio), determinar la lectura de las temperaturas para ambos termómetros. 7. Los termómetros electrónicos que usan sondas de termostatos pueden ser calibrados de la misma forma. El equilibrio térmico de éstos ocurre en pocos milisegundos. Los termómetros que tengan una diferencia de más de 1o C con respecto al termómetro de referencia deben ser desechados o devueltos al proveedor. Se requiere de una concordancia del 0.1o C para propósitos críticos, como el análisis de enzimas. Si las discrepancias son entre 0.2o C y 1o C, el termómetro puede ser usado para funciones menos críticas tales como monitorio de hornos, refrigeradores, y congeladores. Asignar a cada termómetro un número de registro y enlistar éste y los resultados de la calibración en un libro de registro de termómetros lo cual será útil para propósitos de inspección. También está disponible, a través de NIST, una celda de punto de fusión de galio que puede ser usada para calibrar las sondas de termostatos electrónicos a temperaturas de 29.772o C. Estas sondas pueden ser usadas para verificar la exactitud de los termómetros de líquido en vidrio en un intervalo de 20o C a 40o C.ref(25) 65

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Baños de agua, placas térmicas, y hornos Los baños de agua pueden ser diseñados con o sin circulación. Para aplicaciones en química clínica, los baños sin circulación son, en general, inaceptables porque el control de la temperatura es inadecuado (+1o C), por lo tanto son necesarios los baños con circulación los cuales tienen un estricto control de temperatura. Tales baños están equipados con una bomba interna o externa de circulación que mantiene un adecuado equilibrio térmico. En algunos casos, la bomba puede ser acoplada a una unidad de refrigeración para proveer un control de temperatura por debajo de la temperatura ambiente. El agua usada en el baño debe ser de tipo II (o tipo I) a la cual se le adiciona un agente bactericida tal como el thimerosal (Merthiolate) a una dilución de1:1000. El agente bactericida controla el crecimiento bacteriano, reduciendo la frecuencia con la cual debe ser cambiada el agua del baño. El uso de agua de alta calidad es necesario para controlar el depósito de sales en las resistencias, ya que estos depósitos interfieren con el mantenimiento y el adecuado control de la temperatura. Las placas térmicas de metal son menos eficientes manteniendo una temperatura constante y generalmente operan dentro de + 0.5o C. Las placas que están incorporadas al compartimiento de la celda en un espectrofotómetro operarán con más exactitud, generalmente + 0.2o C o mejor. La temperatura de los baños de agua y placas térmicas deben ser medidas diariamente con un termómetro calibrado contra un termómetro NIST o con un termómetro certificado por el NIST. Todas las mediciones y acciones correctivas deben registrarse. El laboratorio puede usar los hornos para secar sustancias químicas, extractos, medios de soporte electroforético, placas de cromatografía en capa fina, y material de vidrio. Para la mayoría de los propósitos, un control de temperatura de + 1o C es adecuado. Los termómetros usados para monitorear la temperatura de los hornos deben verificarse al menos cada año. La temperatura del horno debe medirse diariamente para detectar mal funcionamiento en los elementos de calefacción o en los controles del termostato. También se debe revisar la integridad de todos los empaques. Se deben reemplazar los empaques gastados para asegurar un adecuado control de temperatura. Todas las mediciones y acciones correctivas deben registrarse.

Centrífugas Tipos de centrífugas Existen tres tipos de centrífugas: de cubo giratorio o cabezal horizontal, de ángulo fijo o cabezal angular, y ultracentrífugas. Hay modelos para mesa o para piso, permitiendo al laboratorio comprar la que mejor cubra sus necesidades. Las centrífugas se usan en el laboratorio clínico para separar sustancias de masas o densidades significativamente diferentes. Las dos sustancias a ser separadas pueden ser sólido (partículas) y un líquido o dos líquidos de diferentes densidades. Las centrífugas se usan especialmente para separar sangre coagulada o células del suero y plasma o fluidos corporales. 66

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Aunque la elección específica de una fuerza centrifuga relativa (“Relative Centrifugal Force” “RCF” en inglés) para llevar a cabo estas separaciones no es crítica, se recomienda una fuerza de 1000 a 1200 x g por 10 + 5 min.ref(26) En algunos casos, puede ser necesario más tiempo (ver Capítulo 3). Los instrumentos de cubo giratorio o cabezal horizontal, tienen los rotores que mantienen los tubos en posición vertical cuando la centrífuga está en descanso; los tubos se mantienen en una posición horizontal cuando el rotor está en movimiento. Durante la centrifugación, las partículas se mueven constantemente a lo largo del tubo mientras éste está en posición horizontal, distribuyendo el sedimento uniformemente contra el fondo del tubo. Después de que la centrifugación se termina y el rotor deja de dar vueltas, la superficie del sedimento presenta con una columna de líquido sobre él. Los rotores de ángulo fijo mantienen los tubos a un ángulo específico, de entre 25 a 52 grados del eje vertical de rotación. Durante la centrifugación, las partículas se mueven a los lados del tubo para formar un sedimento que se acumula contra los lados y el fondo del tubo. La superficie del sedimento en este caso es paralela al eje de la centrífuga. Como el rotor va disminuyendo su velocidad y luego se detiene, la fuerza de gravedad puede causar que el sedimento se deslice hacia la parte inferior del tubo formando una escasa placa de sedimento. Los rotores de ángulo fijo son usados cuando se requiere una sedimentación rápida de partículas pequeñas. El diseño de estos rotores es más aerodinámico, permitiendo su operación a velocidades más altas que aquellas que se pueden alcanzar con un rotor de cubo giratorio. Esta característica permite a las centrífugas para microhematocrito operar entre 11,000 y 15,000 revoluciones por minuto (rpm) con una RCF de hasta 14,000 x G. Las ultracentrífugas son centrífugas de alta-velocidad que usan un rotor de ángulo fijo o rotor de cubo giratorio. Frecuentemente cuentan con sistema de refrigeración para contrarrestar el calor generado como resultado de la fricción. Existe también una ultracentrífuga pequeña manejada por aire, la Airfuge (Beckman Instruments, Spinco Division, Palo Alto, CA 94304) con una turbina de aire en miniatura con un pequeño rotor operando de 90,000 a 100,000 rpm, generando una RCF máxima de 178,000 x g. Este tipo de centrífuga ha sido usado para separar quilomicrones de suero, permitiendo llevar a cabo un análisis exacto en un infranadante claro. También, ha sido usada para fraccionar lipoproteínas, realizar análisis de fijación de drogas, y preparar tejido para análisis de receptores hormonales. Las ultracentrífugas analíticas se usan para determinar los coeficientes de sedimentación de las proteínas, permitiendo la determinación de pesos moleculares.

Componentes de una centrífuga Todas las centrífugas tiene un motor, un eje, y una cabeza o rotor, que pueden estar en la forma de una cámara con una cubierta. Los componentes que permiten el control de la centrífuga son un interruptor de corriente, marcador de tiempo, tacómetro, y freno. Cuando se necesita, se incluyen unidades de refrigeración. Algunas centrífugas están equipadas con una alarma que suena cuando existe algún problema en su funcionamiento, como en el caso de tubos no balanceados. Algunas centrífugas se apagan automáticamente, evitando la ruptura del tubo y la exposición a agentes potencialmente infecciosos. Todas las centrífugas tienen una cerradura de seguridad que evita que el operador abra el instrumento antes de que el rotor 67

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se haya detenido. Los rotores de cubo usan pares de transportadores o soportes que rotan libremente. Los soportes están diseñados para aceptar una variedad de cubiertas protectoras, permitiendo la centrifugación de tubos pequeños o grandes. Se requiere de diferentes rotores de ángulo fijo para diferentes tamaños de recipientes. El motor de una centrífuga grande es generalmente de: corriente directa (DC), de uso intensivo, de alta fuerza de rotación, o de motor eléctrico. En centrífugas más pequeñas, la corriente es alterna (AC). La energía es transmitida al rotor por el conmutador y las escobillas. El eje del rotor es manejado por un sistema de giro y los soportes están sellados, minimizando así, la vibración y la necesidad de lubricación. La velocidad de la centrífugas es controlada por un potenciómetro que modula el voltaje suministrado por el motor. La velocidad también se determina por la cantidad de carga en el rotor. El tacómetro mide la velocidad del rotor en revoluciones por minuto (rpm). El freno desacelera el rotor retrocediendo la polaridad de la corriente al motor. El medidor de tiempo permite al rotor alcanzar una velocidad programada; entonces el rotor se desacelera sin frenar después de que ha transcurrido el tiempo señalado. Las centrífugas refrigeradas se usan cuando el calor generado durante la centrifugación pudiera causar evaporación o desnaturalización de la proteína o fuga de componentes celulares en la muestra. La temperatura puede ser controlada entre -15o C y 25o C, permitiendo centrifugaciones a más altas velocidades y por períodos más prolongados. La selección de los tubos y botellas para la centrífuga es importante. Los tubos de plástico (poliestireno, polipropileno) tienen una tolerancia más alta a la velocidad y pueden resistir una RCF de hasta 5,000 x G. Los tubos con fondo cónico permiten la formación de un sedimento más compacto y son útiles en la preparación de la orina para análisis microscópico y para algunos procedimientos de radioinmunoanálisis. Los tubos deben descansar bien ajustados en los soportes; los tubos pequeños en un soporte muy grande producirán un sedimento poco compacto. La parte superior del tubo no debe sobresalir del soporte ya que puede llegar a impedir su movimiento. El balance de los tubos dentro de los soportes es crítico. Las centrífugas modernas automáticamente se desaceleran y luego se apagan cuando los soportes no están balanceados. La Fig.1-10 muestra un balance apropiado. Un balance incorrecto puede causar que la centrífuga vibre destruyendo la placa del sedimento. Cuando sea posible, los tubos que contienen materiales biológicos peligrosos deben ser centrifugados con las tapas puestas para minimizar los aerosoles.

Mantenimiento y aseguramiento de la calidad Es crítica la limpieza diaria de las superficies internas de la centrífuga con una solución de cloro al 10% o un desinfectante equivalente. Cuando ocurre ruptura de tubos, las partes de la centrífuga que tienen contacto con la sangre o cualquier otro agente infeccioso deben descontaminares inmediatamente. La tina de la centrífuga debe limpiarse con un agente desinfectante y las cabezas del rotor y su contenido deben someterse al autoclave. Todos los vidrios o plásticos rotos deben ser retirados y eliminados apropiadamente. Las velocidades de las centrífugas que son usadas en forma rutinaria deben ser verificadas periódicamente usando un tacómetro confiable, generalmente cada tres meses de 68

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acuerdo con las reglas de inspección del CAP.ref(27) La variación en velocidad no debe ser mayor del 5% bajo condiciones específicas. La exactitud del medidor del tiempo en la centrífuga también debe revisarse y verificarse cada tres meses. Las temperaturas de las centrífugas refrigeradas deben ser revisadas al menos cada mes (es preferible diariamente) bajo condiciones normales. La concordancia entre las temperaturas medidas y las esperadas (o programadas) debe estar dentro de 2o C. Deben seguirse las recomendaciones de los fabricantes para el mantenimiento, lubricación, y reemplazo de escobillas. La omisión en el reemplazo de escobillas gastadas puede conducir al deterioro del motor y requerir su reposición. Todas las revisiones deben ser registradas y las medidas correctivas documentadas.

Principios de centrifugación La velocidad de una centrífuga se expresa en revoluciones por minuto (rpm), mientras que la fuerza centrífuga relativa (RCF) generada se expresa como un número de veces la fuerza gravitaciónal, G. La relación entre rpm y RCF es expresada por la siguiente ecuación: RCF = 1.12 x 10-5 x r x (rpm)2 donde r es el radio de la camisa de la centrífuga expresado en centímetros y es igual a la distancia horizontal de el centro de la centrífuga al eje del rotor; 1.12 x 10-5 es un factor empírico. La Fig. 1-11 muestran un monograma para la determinación de las RCFs cuando el radio y las rpm son conocidos. La RCF aplicada a un tubo en un rotor giratorio puede ser considerablemente más grande que el aplicado al mismo tubo en un rotor de ángulo fijo, porque el tubo nunca alcanza una posición horizontal. Por esta razón, es preferible procesar tubos con separador de sueros en rotores horizontales que operan a RCFs más altas. De vez en cuando es necesario duplicar las condiciones de centrifugación en dos diferentes instrumentos. Esto puede ser hecho aplicando la siguiente ecuación : Cálculos del ajuste de la velocidadref(28): RCF (rotor original ) rpm (rotor nuevo) = ––––––––––––––––– 1.12 x r (cm, rotor original )

Cálculos del ajuste del tiemporef(29): Tiempo (rotor viejo) x RCF (rotor original) Tiempo (rotor nuevo) = –––––––––––––––––––––––––––––––––– RCF (rotor nuevo)

Estos cálculos no toman en cuenta las diferencias entre los instrumentos en el tiempo necesario para alcanzar la velocidad completa o para desacelerar. Por lo tanto son necesarios algunos ajustes adicionales. 69

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Seguridad en el laboratorio La Administración de Salud y la Seguridad Ocupacional ("Occupational Safety and Health Administration" o "OSHA", en inglés) ha establecido dos programas para garantizar la seguridad del personal en el laboratorio. El primero, trata la exposición ocupacional a sustancias químicas peligrosas,ref(30) pasó a ser ley en enero de 1991, y el segundo, que trata la exposición ocupacional a microorganismos patogenos,ref(31) pasó a ser ley en marzo de 1992. Además de estos programas obligatorios, el laboratorio es responsable por la práctica de procedimientos generales de seguridad. Cada laboratorio clínico es responsable por la designación de un oficial de seguridad. Este individuo también puede funcionar como oficial del programa de higiene química y coordinador del programa de microorganismos patógenos. Las responsabilidades de estos empleados incluyen la preparación y actualización de los manuales que describen procedimientos y políticas de seguridad, conservación de los registros de entrenamiento y educación continua, y el mantenimiento de los registros de exposición a materiales de riesgo. El oficial de seguridad puede también ser responsable de asegurar el abastecimiento del equipo protector, así como de que sean usados apropiada y consistentemente y que el laboratorio esté funcionando en un ambiente de seguridad para el trabajo. En una institución grande, estas funciones son compartidas por varios empleados, sin embargo, el oficial de seguridad todavía juega un papel clave para asegurar el cumplimiento de todas las regulaciones.

Seguridad general Seguridad contra incendios es de enorme importancia en el laboratorio clínico. Todo el equipo usado para protección contra el fuego debe cumplir con los estándares de la Asociación Nacional para Protección contra Incendios ("National Fire Protection Association", o "NFPA", en inglés). El equipo, debe ser accesible a los trabajadores del laboratorio e incluye extinguidores de fuego, sábanas contra el fuego, gabinetes para almacenar solventes y sustancias químicas inflamables, alarmas de fuego, detectores de humo, y sistemas de irrigación. Es importante la selección del tipo apropiado de extinguidores así como una inspección frecuente de los mismos para asegurar que estén en buenas condiciones. Las Tablas 1-14 y 1-15 clasifican los tipos de fuegos y comparan los tipos de extinguidores. Los extinguidores de Halom son generalmente usados para áreas que en las que están las computadoras. Deben pegarse anuncios de peligro es esas áreas y proveerse equipo de protección para respirar. En un laboratorio grande serán necesarios muchos extinguidores y que sean de diferentes tipos. Todos los empleados deben familiarizarse con su uso, y es obligatorio recibir un reentrenamiento anual. La seguridad eléctrica es también crítica ya que existe el riesgo de un corto circuito que resulte en el inicio de un incendio. Todo el equipo debe tener inscrito "aprobado por el laboratorio". Esto incluye extensiones de cables, los cuales pueden usarse solo como solución temporal. Todos los contactos eléctricos y equipos deben estar haciendo tierra y los cables 70

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deben ser revisados por algún desgaste. La inspección regular evitará la posibilidad de accidente eléctricos. Deben documentarse esas inspecciones. Cualquier equipo usado donde estén presentes solventes orgánicos debe ser dotado con entradas contra explosión tales como contactos o tomas de corriente . El equipo de seguridad general incluye regaderas de seguridad y estación de lavado de ojos en cada área grande de trabajo. El programa de seguridad también debe incluir medidas rutinarias para verificar que el equipo sea operacional y se guarden registros de su mantenimiento. Se requieren de guantes de asbesto (resistentes al calor) para el manejo de equipo caliente como el material de vidrio y para el hielo seco. Otro equipo para protección del personal es abordado en las secciones que tratan los riesgos químicos y biológicos.

El plan de higiene de sustancias químicas La OSHA ha establecido que a partir del 31 de enero de 1991, los laboratorios desarrollen un plan de higiene de sustancias químicas para la protección y educación de los empleados.ref(32)

Este Plan Contiene los Siguientes Elementos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Una descripción de los Procedimientos Estándar de Operación (SOP) Hojas de datos del material de seguridad (MSDS) Lista del inventario de sustancias químicas Información del almacenamiento apropiado de sustancias químicas. Requisitos de etiquetado. Una descripción de los controles de ingeniería requeridos. Una lista del equipo de protección que requiere el personal. Información sobre la eliminación de desechos Información sobre el control ambiental, cuando sea apropiado. Requisitos de limpieza. Requisitos exámenes físicos y consultas médicas para los empleados. Requisitos de entrenamiento. Requisitos en el mantenimiento de archivos. Designación de un Oficial y un Comité de Higiene Química . Otra información considerada necesaria para garantizar la seguridad.

Procedimientos estándares de operación (“Standard Operation Procedures” o “SOP”, en inglés) Estos procedimientos incluyen los protocolos para el manejo de accidentes y derrames 71

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de sustancias químicas. En general, si las sustancias químicas han estado en contacto con los ojos o la piel, lavar con cantidades abundantes de agua seguido por atención médica si es necesario. Los procedimientos de lavados de ojos requieren una duración de 15 minutos por lo tanto son inaceptables las estaciones portátiles de lavados de ojos. Los procedimientos de limpieza para cada sustancia química, así como la ropa protectora necesaria, deben ser definidos individualmente. También deben definirse las reglas para evitar la exposición innecesaria a sustancias químicas. Fumar, comer, beber, o aplicar cosméticos está prohibido en las áreas de trabajo. El cabello largo y la ropa suelta deben estar bien sujetados; se prohíben zapatos abiertos o de lona. No usar lentes de contacto en el laboratorio ya que interfieren con un apropiado lavado de los ojos cuando ocurre un accidente. Además, los lentes de plástico pueden ser dañados por los vapores orgánicos, conduciendo a infecciones oculares crónicas. Se debe enfatizar el lavado de manos después del manejo de sustancias químicas y antes de salir del laboratorio con el propósito de comer o tomar algo. El material de vidrio agrietado o astillado debe ser desechado inmediatamente ya que puede romperse durante su uso. Todo el material de vidrio que ha estado en contacto con sustancias tóxicas o corrosivas debe ser bien enjuagado con agua o alcohol antes de ser colocado con el resto del material sucio. Se requiere que el laboratorio mantenga un archivo actualizado en orden alfabético con las Hojas de Datos sobre la Seguridad de Materiales (“Material Safety Data Sheet” o “MSDS”, en inglés) para cumplir con las leyes locales, estatales y federales del Derecho a Saber. Las MSDS son requeridas para todas las sustancias químicas, reactivos,y equipos usados en el laboratorio pero no para los agentes farmacéuticos como la aspirina.ref(33) Las MSDS contienen información acerca de los riesgos tanto físicos como para la salud que presentan cada producto. El archivo debe ser accesible a los empleados y a los contratistas externos trabajando para el laboratorio.

Inventario El inventario de las sustancias químicas se lleva a cabo anualmente, enlistando todos los agentes peligrosos usados y almacenados en el laboratorio. La peligrosidad de una sustancia química puede ser clasificada por el Departamento de Transporte ("Department of Transportation", o "DOT", en inglés), la Agencia para la Protección Ambiental (the "Environmental Protection Agency", o "EPA" en inglés), o por la NFPA (ver etiquetado). El inventario debe estar en orden alfabético e incluir la siguiente información para cada sustancia química: Nombre y dirección del fabricante, estado físico, cantidad almacenada, número en El Servicio resúmenes de Sustancias Químicas ("Chemical Abstract Service" o "CAS", en inglés), sí se conoce, localización de almacenamiento, y cualquier otra clasificación de riesgo para la salud, fuego, reactividad, o corrosividad. Debe mantenerse una lista por separado de los compuestos carcinógenos o de los que se sospecha que pueden ser carcinógenos.

Almacenamiento de sustancias químicas Las cantidades de sustancias químicas almacenadas en el laboratorio deben ser tanto pequeñas como prácticas. Todos los refrigeradores usados para almacenamiento de sustancias 72

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químicas deben estar claramente marcados. Bajo ninguna circunstancia se debe guardar comida o bebidas, ni siquiera temporalmente. Para el almacenamiento de solventes volátiles serán necesario refrigeradores a prueba de explosión, claramente marcados. Las sustancias químicas tóxicas, incluyendo a los carcinógenos, deben estar almacenados en envases secundarios irrompibles, químicamente resistentes, y en áreas bien ventiladas. Los envases deben estar etiquetados para indicar que es un AGENTE SOSPECHOSO DE CAUSAR CÁNCER o que causa ALTA TOXICIDAD CRONICA . Los solventes volátiles en grandes cantidades deben ser almacenados en gabinetes especiales aprobados por la NFPA. Siempre que sea posible, se deben mantener estos gabinetes con ventilación exterior. El almacenamiento de los solventes volátiles en las mesas de trabajo está limitado por la clasificación de la OSHA. Esta clasificación es determinada por el "punto de inflamación" y el punto de ebullición; los solventes más los combustibles son clase IA y IB. La ubicación de esos solventes en las mesas de trabajo debe limitarse a volúmenes muy escasos, sin embargo, algunas regulaciones locales son más estrictas. Las cantidades grandes deben ser transferidas a latas de seguridad dotadas con un conducto surtidor. Todos los gabinetes donde se guarden solventes deben ser apropiadamente etiquetados. Los cilindros de gas comprimido se usan frecuentemente en el laboratorio. Los gases más comúnmente usados son oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, helio, dióxido de carbono, y en menor grado, acetileno y propano. Generalmente los cilindros son codificados por colores y su contenido etiquetado de acuerdo al sistema de diamantes de la NFPA. Las regulaciones de la OSHA para cilindros de gas están basadas en publicaciones de la Asociación de Gas Comprimido.24 Los cilindros deben estar almacenados lejos del laboratorio en una posición vertical y segura, de preferencia en un espacio ventilado y bajo llave, resistente al fuego y con los cilindros vacíos bien separados de los que están llenos. Los cilindros siempre deben asegurarse en un carro manual para su transporte. La tapa protectora debe permanecer en su lugar hasta que el cilindro sea conectado. Aún cuando los cilindros de gas estén vacíos deben estar sujetados a la pared o al piso ya que una caída puede romper la válvula, causando la expulsión del cilindro como un torpedo. Hay que marcar cada cilindro con una etiqueta que contenga la fecha en que fue puesto en uso. Cuando un cilindro está a punto de vaciarse debe reemplazarse antes de que quede completamente vacío para evitar la contaminación con materiales externos y se debe marcar con un letrero de VACÍO. En general, los cilindros vacíos son reciclados por los proveedores. Sin embargo los cilindros chicos que contienen propano no son reciclados. Estos pueden ser desechados de acuerdo al código local para incendios. Las válvulas de reducción de los diferentes gases no son intercambiables. Nunca se debe sustituir un regulador, con o sin adaptador, por otro. El personal del laboratorio nunca debe intentar forzar, liberar o congelar válvulas reguladoras. Todas las conexiones deben ser probadas con agua jabonosa para detectar la presencia de fugas. Las fugas pequeñas de oxígeno o nitrógeno tienen escasas consecuencias, pero las fugas de hidrógeno, acetileno u otros gases inflamables son inaceptables. Cuando se cierra un cilindro con gas inflamable, se la debe cerrar la válvula de entrada principal y permitir que el gas se queme. Entonces se cierran las válvulas de reducción. No se debe abrir la válvula de un cilindro a menos que la válvula de reducción este cerrada. Es importante recordar que el propano es más pesado que el aire y por lo tanto la fuga de una pequeña cantidad de gas puede flotar sobre las mesas de trabajo e iniciar una flama en cualquier lugar. Por esta razón, son más seguros los cilindros 73

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pequeños para ser usados una sola vez.

Requisitos de etiquetado y manejo La regulación de OSHA, 29 CFR 1910.1450ref(34), define los requisitos específicos de etiquetado. Las etiquetas originales de las sustancias químicas no deben despegarse o voltearse. Las sustancias químicas que no están en su envase original, deben ser etiquetadas con la siguiente información: (1) identidad de la substancia peligrosa, (2) ruta de entrada al cuerpo (ojos, nariz, boca, piel), (3) riesgo para la salud, (4) riesgo físico, y (5) órgano blanco afectado. Los requisitos de etiquetado se aplican a todas las sustancias químicas con una clasificación de 2 de acuerdo al sistema de clasificación del riesgo de la NFPA. Este sistema consiste en 4 pequeños símbolos en forma de diamantes agrupados dentro de un diamante más grande (Fig. 1-12). El diamante de la izquierda es azul y representa el riesgo de salud, el superior es rojo e identifica el riesgo de inflamabilidad, el diamante de la derecha es blanco e indica el riesgo de estabilidad o reactividad (usado para sustancias que son capaces explotar o de presentar un cambio químico violento, y el diamante amarillo de la parte inferior se usa para proveer información de riesgo especial como la reactividad al agua. El grado de riesgo es medido usando una escala del 0 al 4, donde 4 indica el riesgo más alto. Los materiales como alcohol isopropílico o cloro diluido en envases para despachar requerirán estas etiquetas reguladoras. Además, es deseable el uso adicional de etiquetas de alerta como las usadas por el Departamento de Transporte mostradas en la Fig.1-13. El manejo de sustancias químicas peligrosas requiere de gran cuidado. En el capítulo 9 se presenta una discusión del manejo y eliminación de sustancias químicas radioactivas. Todos los líquidos inflamables y tóxicos deben usarse en una área con buena ventilación, de preferencia en una campana de extracción. Una campana de extracción que opera apropiadamente debe tener un flujo mínimo de aire de 150 ft3/min. Las soluciones corrosivas como los ácidos, álcalis, y sales de mercurio deben también manejarse en las campanas de extracción. Los envases con ácidos concentrados deben ser transportados con una cubierta especiales para tal propósito, evitando así el riesgo de romperlos. Debe insistirse en el uso del equipo de protección personal. Cuando se preparan reactivos con ácidos concentrados, el ácido debe ser adicionado lentamente al agua. Las precauciones para el manejo de carcinógenos en polvo incluyen el uso de equipo desechable y un respirador, además de otras medidas estándar de seguridad. Después de manejar el compuesto, debe limpiarse cuidadosamente el área y enjuagarse el material de vidrio con un ácido orgánico fuerte o con un solvente orgánico, antes del lavado regular. Los controles de ingeniería son una parte importante de la operación diaria del laboratorio. Además de las disposiciones, inspección, y documentación del funcionamiento de los extinguidores de fuego, los lavadores de ojos, y las regaderas de seguridad, deben también monitorearse y validarse otros aspectos del ambiente del laboratorio. La calidad y cantidad de la ventilación de los cuartos (de 4 a 12 cambios de aire por hora) debe documentarse cada tres meses, así también, debe monitorearse el flujo de aire a través del laboratorio. Todas las áreas donde se hayan manejado o almacenado sustancias peligrosas tales como almacenes, cajas de guantes, y cámaras frías, deben tener una adecuada ventilación, al igual que ductos de extracción. Todas las campanas de extracción deben ser inspeccionadas después de su instalación y cada año posteriormente, por una compañía de reputación. La inspección debe 74

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incluir una evaluación del perfil de los patrones de flujo y de la velocidad de flujo. Cualquier campana que no pase la inspección debe ser retirada del servicio inmediatamente. Debe mantenerse una lista de revisión de seguridad semanal incluyendo lo siguiente: flujo de aire adecuado, artículos innecesarios en la campana, uso correcto de la pantalla, y protección del marco de la ventana en operación. Antes de usar la campana, el operador debe confirmar su correcto funcionamiento. Ésto puede cumplirse usando un medidor permanente de flujo u observando la desaparición de humo o vapores producidos después de haber expuesto cuidadosamente dos aplicadores juntos humedecidos en amoniaco o ácido clorhídrico, respectivamente (las puntas de los aplicadores se mojan al chorro de agua antes de ser desechados). Alternativamente, se puede sostener firmemente una toalla “Kimwipe” bajo el marco de la ventana en posición baja para evaluar la fuerza de extracción. Cuidado! no se debe permitir que se introduzca el papel dentro del sistema de extracción. La OSHA ha definido el equipo de protección personal requerido para las operaciones del laboratorio que involucran sustancias químicas de riesgo. Mucho de este equipo es idéntico al requerido para la protección contra microorganismos patógenos y será descrito en la siguiente sección. El manejo de sustancias químicas de riesgo requiere del uso de guantes (el tipo a usar dependerá de la naturaleza del riesgo de la sustancia que se maneja). Las batas protegen la ropa; es probable que alguna sustancia química de riesgo salpique imprevistamente; como prevención los delantales que cubren completamente el cuerpo ofrecen una protección adicional. Las máscaras, anteojos de seguridad con protección lateral o micas para protección facial son necesarias cuando hay un peligro potencial de contaminación para ojos, nariz, o boca. Deben proveerse respiradores y usarlos de acuerdo con los requerimiento enlistados en el 29 CFR 1910.134. Todo el equipo de protección personal debe ser retirado antes de dejar el área de trabajo.

Control de compuestos químicos y desechos Los procedimientos para la eliminación de los desperdicios químicos y desechos de compuestos químicos de riesgo deben cumplir con todas las regulaciones locales y estatales. La EPA considera a la mayoría de los laboratorios como generadores de cantidades mínimas y se requiere que tengan un número de generación, obtenido de la oficina regional correspondiente. Ciertos compuestos químicos pueden ser desechados en el sistema de drenaje sanitario. La información específica al respecto debe obtenerse de fuentes locales, pero solo aquellos compuestos químicos que son razonablemente solubles (al menos 3%) en agua pueden ser vaciados al drenaje y éste debe ser enjuagado al menos con 100 volúmenes de exceso de agua. Los compuestos que nunca deben ser vaciados al drenaje son: solventes orgánicos con un punto de ebullición menor de 50o C, hidrocarburos, hidrocarburos halogenados, compuestos nitrogenados, mercaptanos, la mayoría de los compuestos oxigenados, compuestos que contengan más de cinco átomos de carbono (por ejemplo, freón), compuestos orgánicos tales como azidas y peróxidos, ácidos y bases concentrados, y compuestos altamente tóxicos, de mal olor, o lacrimógenos (que provocan lagrimeo). Es responsabilidad del laboratorio determinar la eliminación de desechos químicos que salen del local. Las MSDS y otras fuentes pueden proveer información sobre la eliminación específica de desechos.refs(35) La incineración es una manera comúnmente aceptada desde el punto de vista ambiental para líquidos combustibles. La colocación de sustancias químicas 75

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volátiles en una campana con el propósito de evaporarlas es inaceptable. El laboratorio debe estar familiarizado con las regulaciones que gobiernan el almacenamiento y eliminación de sustancias químicas tóxicas tales como solventes y formaldehído. Deben llevarse registros de la eliminacion de desechos. La Azida de sodio, es otra sustancia química problemática que todavía se usa como agente bacteriostático. Las azidas forman sales explosivas con un gran número de metales como el hierro y el cobre, los cuales fácilmente estallan cuando hay un shock mecánico. Aunque la cantidad de azida de sodio usada como preservativo es relativamente pequeña, su uso continuo puede producir una acumulación de las sales metálicas en las tuberías del drenaje. Estas sales son extremadamente explosivas; incluso el uso de una llave en la linea del drenaje puede resultar en una violenta explosión. Es difícil remover azidas de las tuberías. Un método involucra el cierre de la parte baja de una sección del tubo y dejarlo en contacto con una solución de hidróxido de sodio al 10%, por un mínimo de 16 horas. Se debe enjuagar entonces el tubo con abundantes cantidades de agua durante 15 minutos. El uso de azidas de sodio debe evitarse o minimizarse ya que además de ser potencialmente explosivas también son carcinógenas. Algunos métodos colorimétricos (por ejemplo, la determinación de cloro) que usan sales de mercurio todavía están en uso, sin embargo los procedimientos que no usan mercurio han reemplazado a la mayoría de ellos. La eliminación de grandes cantidades del reactivo gastado por los analizadores automáticos que usan esos métodos pueden representar un problema ya que los desechos no deben ser vaciados al sistema de drenaje. Estos líquidos de desecho debe ser colectados en recipientes grandes de plástico y acidificados ligeramente con ácido acético y si es necesario, agregar tioacetamida (aprox. 10g/L). Se deben almacenar los recipientes en un lugar bien ventilado (puede ser que se liberen pequeñas cantidades de sulfito de hidrógeno) y con el paso del tiempo se puede precipitar el mercurio como sulfuro de mercurio. Entonces, se puede decantar el sobrenadante y vaciarse en el drenaje. La eliminación del sulfuro de mercurio debe hacerse por medio del enterramiento. El monitoreo ambiental puede ser necesario si el laboratorio usa tres o más veces por semana alguna de las sustancias químicas definidas en la publicación OSHA 29 CFR 1910 Subdivisión Z. El formaldehído está incluido en está lista. El monitoreo consiste en la evaluación semestral del aire de una habitación durante ocho horas, así como la evaluación de la tarjeta de identificación de uno o más empleados expuestos a la sustancia química. En el caso de que se excedan los límites de exposición permisibles, se requerirá de un monitoreo más frecuente (trimestral) hasta que se alcancen los límites de exposición aceptables. Aunque el xileno no está incluido oficialmente en la lista, se debe proceder de igual forma cuando éste sea usado. La limpieza del piso y del laboratorio en general, debe hacerse en forma regular de acuerdo con un esquema definido; el personal de limpieza debe estar informado de los riesgos asociados con su trabajo en el laboratorio. Queda entendido que el ambiente del laboratorio debe mantenerse ordenado. Los pasillos y las escaleras deben estar libres de obstáculos, los desechos deben ser manejados en forma apropiada, los suministros del laboratorio almacenados en forma correcta, y deben limpiarse todos los derrames en la forma establecida por el reglamento. Deben estar disponibles para su uso los estuches de limpieza de derrames. Los productos con propósitos múltiples como sosa natural son útiles y también lo son los productos comerciales vendidos por compañías químicas y proveedores de productos de 76

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seguridad (por ejemplo, J.T. Baker, Mallinckrodt Chemical Co., y Lab Safety Supply). El laboratorio puede preparar un equipo conteniendo los artículos equivalentes (guantes de hule, toallas, pala, varias sustancias químicas para neutralizar y absorber solventes orgánicos y sustancias químicas corrosivas). Los equipos deben estar etiquetados y completamente accesibles. Los derrames deben ser limpiados inmediatamente, usando el equipo de protección personal apropiado. Existen equipo especiales de limpieza para manejar derrames de mercurio y formaldehído. Los equipos neutralizan el derrame y permiten su desecho en los recipientes regulares en la mayoría de las condiciones. El mercurio derramado tiende a dividirse en gotas muy pequeñas, lo que dificulta recogerlo. Aún después de su colecta, la eliminación tiende a causar problemas, ya que el mercurio metálico no debe incinerarse o quemarse. Varios equipos para mercurio, están disponibles, por ejemplo, Mercury Absorption Disposal Kit (Aldrich Chemical Co., Milwaukee), el cual contiene material que absorbe las gotas de mercurio, produciendo una sustancia menos tóxica que puede eliminarse por enterramiento. Algunos equipos también incluyen eliminación de desechos a través del fabricante de los equipos (Merc*Clean de H-B Instrument Co.). Las mesas de trabajo y los pisos en los laboratorios viejos a menudo contienen grietas finas en las cuales el mercurio puede acumularse. Estas gotas son muy difícil de retirar, pero la grieta debe ser limpiada si es posible, ya que el mercurio es volátil a temperatura ambiente. Frotando sulfuro en polvo o polisulfuro de sodio en las ranuras puede ayudar a que el mercurio cambie a sal de sulfuro que es menos volátil. Las regulaciones de la OSHA disponen que el personal que rutinariamente está expuesto a sustancias químicas peligrosas reciba consulta y exámenes médicos en forma regular (por ejemplo cada año). La extensión del examen físico depende de la cantidad y tipo de exposición. Además de una revisión regular, el personal debe ser evaluado cada que haya un derrame grande, cuando el monitoreo ambiental indica exposición por arriba de los niveles o cuando se desarrollen signos y síntomas de toxicidad. Los empleados deben ser entonces ser monitoreados y asesorados hasta que sean dados de alta. Los expedientes médicos deben mantenerse por 30 años después de que el empleado deja el lugar de trabajo. La capacitación es una parte necesaria e importante del Plan de Higiene de Sustancias Químicas. Las sesiones de actualización se deben llevar a cabo cuando menos cada año, dejando registro documentado de los asistentes. El entrenamiento debe asegurar que el empleado conozca la magnitud de la exposición química, que entienda el sistema de etiquetado, que conozca el significado y la localización en el laboratorio de los libros con las MSDS, que este familiarizado con el equipo de protección personal requerido, y que sepa como reaccionar y manejar las sustancias en caso de derrames. Pueden usarse muchos métodos de entrenamiento, tales como métodos audiovisuales, folletos, y demostraciones. El mantenimiento de expedientes es un componente crítico en el programa de seguridad del laboratorio. Los registros que deben mantenerse son: (1) reportes de incidentes y accidentes, (2) inventario y uso de sustancias de alto riesgo, (3) monitoreo ambiental donde sea apropiado, (4) consultas médicas, (5) registro de asistencia a las sesiones de capacitación, (6) procedimientos de limpieza, e (7) inspecciones de seguridad.

Protección contra los desechos de contaminantes biológicos Precauciones universales. 77

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La OSHA promulgó un conjunto final de reglas el 6 diciembre, de 1991, que contemplan la exposición ocupacional a la sangre y otros materiales potencialmente infecciosos. El programa para protección contra desechos biológicos fue completamente instituido el 6 de julio, de 1992.ref(36) Muchos de los requerimientos son similares a aquellos contenidos en el Plan de Higiene de Sustancias Químicas, incluyendo el desarrollo de un documento describiendo lo siguiente: (1) la magnitud de la exposición para todos los empleados, (2) controles de ingeniería y trabajo práctico (3) equipo de protección personal, (4) evaluación de tareas, (5) procedimientos de limpieza, (6) procedimientos para derrames, (7) requerimientos de lavandería, (8) requerimientos de etiquetado, (9) eliminación de desechos, (10) administración de vacunas, (11) consultas médicas, (12) entrenamiento, y (13) mantenimiento de registros. Algunas exposiciones ocupacionales a microorganismos patógenos son inherentes a cada tarea en el laboratorio químico. Por lo tanto todo el personal está en riesgo. Aunque éste sea el caso, es necesario definir la magnitud de la exposición. Las Precauciones universales, como las define El Centro de Control y Prevención de Enfermedades ("Centers for Disease Control and Prevention", o "CDC" en inglés) y adoptados por la OSHA, son utilizadas para prevenir el contacto con la sangre y otros materiales potencialmente infecciosos.ref(37) Las recomendaciones generales incluyen: 1. Todo el personal debe usar rutinariamente barreras de protección para evitar la exposición a la piel y membranas mucosas cuando se esté en contacto con sangre o fluidos corporales de cualquier paciente. Usar guantes cuando se lleven a cabo extracciones de sangre y cuando se manejen sangre, fluidos corporales, o artículos impregnados con ellos. Debe usarse protección para los ojos o pantallas protectoras de la cara durante los procedimientos en que las membranas mucosas de la boca, nariz, y ojos pueden estar expuestas al esparcimiento de gotas de sangre o fluidos corporales. Las batas (y delantales) deben ser usados durante procedimientos que generen derrames o esparcimientos. 2. Si ocurre contaminación de las manos o piel con sangre u otro fluido corporal, estas deben ser lavadas inmediatamente en forma cuidadosa. 3. Los trabajadores de la salud deben evitar lesiones por agujas, bisturíes o cualquier otro artículo con punta. Las agujas después de su uso no deben ser tapadas, dobladas, quebradas, o ser retiradas de los recipientes para la eliminación de jeringas desechables. Después de haber usado jeringas desechables, agujas, navajas de bisturí, y otros artículos con punta, estos deben ser puestos en un recipiente resistente a objetos con puntas filosas. 4. Aquellos trabajadores de la salud que tengan lesiones exudativas de la piel o dermatitis ulcerativas deben evitar el contacto directo con los pacientes, con la sangre y otros materiales potencialmente infecciosos hasta que la condición sea resuelta. 5. En particular, las mujeres embarazadas deben seguir estas reglas. Otras prácticas de control en el trabajo incluyen las siguientes: 1. La sangre y otros materiales potencialmente infecciosos deben ser transportados en recipientes a prueba de derrames. Debe tenerse cuidado de no contaminar el recipiente ni la solicitud que lo acompaña. 78

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2. Deben usarse gabinetes de seguridad para los procedimientos de mezclado u otros procedimientos vigorosos que puedan generar aerosoles. 3. El pipeteo con la boca está prohibido. Hay utensilios mecánicos que se usan para pipetear TODOS los líquidos. 4. Comer, beber, aplicar cosméticos o crema para los labios,y usar lentes de contacto, está prohibido en las áreas de trabajo con riesgo biológico, así mismo están prohibidos en la áreas donde se manejan sustancias químicas. 5. Solo se permite en el laboratorio al personal autorizado. No se recomiendan las visitas casuales. Cualquier personal relacionado con el servicio de instrumentación debe ser provisto con el equipo de protección personal necesario. 6. Los instrumentos que requieren servicio deben ser descontaminados antes de ser reparados. 7. Los analizadores químicos que generan aerosoles con las muestras deben ser equipados con micas protectoras si es posible. 8. Todos los empleados deben lavarse las manos, quitarse la bata y cualquier otro equipo de protección antes de abandonar el área de trabajo. Equipo de protección personal. El equipo de seguridad debe ser otorgado al trabajador en su talla apropiada y sin costo alguno para este. Las batas deben ser impermeables a fluidos, ofreciendo una óptima protección contra agentes de riesgo biológico. Los delantales pueden ser usados para proveer protección adicional. Los anteojos, máscaras, o micas son usadas para proteger ojos, nariz, y boca. Evaluación de las tareas. Las normas de seguridad deben ser establecidas para cada tarea llevada a cabo en el laboratorio. Estas políticas deben incluir controles de ingeniería para la práctica del trabajo y requerimientos de equipo de protección personal. Para la mayor parte del trabajo llevado a cabo en el laboratorio químico, es necesario el uso de batas, gafas de protección y guantes. Para algunas tareas se requiere de equipo de protección adicional. Procedimientos de aseo. Siguiendo un esquema por escrito, se debe descontaminar todo el equipo y superficies de trabajo con un germicida como por ejemplo cloro diluido al 10%: (1) Después de finalizar los procedimientos especificados, (2) cuando las superficies están ostensiblemente contaminadas, (3) inmediatamente después del derrame de cualquier material potencialmente infeccioso, y (4) al final de cada turno de trabajo. Deben instituirse los procedimientos de limpieza rutinarios para el manejo de recipientes de basura y otros envases. La cristalería rota que puede estar contaminada se maneja usando medios mecánicos para desecharlos en forma apropiada. Los derrames de material biológico se descontaminan tan pronto como sea posible con material absorbente como toallas de papel o gasas, inundando el área contaminada con cloro o frotándola con una toalla humedecida en cloro y limpiando entonces con gasas o toallas limpias. Todos los artículos contaminados son colocados en bolsas para materiales de riesgo biológico y desechados de acuerdo a los lineamientos del laboratorio. La limpieza de 79

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derrames requiere del uso de equipo de protección personal. La ropa contaminada debe ser empaquetadas en bolsas rojas en el lugar donde se usan o marcadas con el signo de riesgo biológico si se usa otro tipo de bolsa. Todo el lavado y reparación de batas de laboratorio es proporcionado por la empresa. Bajo ninguna circunstancia pueden los empleados lavar sus propias batas. Cuando se maneje ropa sucia deben usarse guantes. El almacenado de batas limpias y sucias debe hacerse por separado. Las Etiquetas de alerta (Fig. 1-14) deben usarse para identificar (1) la entrada a las áreas de trabajo, (2) refrigeradores y congeladores que contienen sangre y otros agentes potencialmente infecciosos, (3) todos los envases usados para almacenar, transportar o enviar materiales potencialmente infecciosos, y (4) botes para desechos regulados (diferentes de las bolsas rojas). Las áreas donde se almacena comida deben ser marcadas como de no riesgo biológico (limpias). Disposición de desechos. Los desechos médicos regulados (desechos infecciosos) deben ser eliminados de acuerdo con las regulaciones locales y estatales.ref(38) Los materiales contaminados deben ser clasificados al momento de uso en categorías tales como objetos con agujas y otros objetos filosos. Los recipientes deben ser a prueba de fugas y cerrados cuando el contenido llegue a 3/4 de su capacidad. Cualquier desecho de riesgo biológico que se desinfecta por medio del autoclave está exento de estas regulaciones, y puede ser eliminado por los procesos estándar. Hay ahora varios sistemas disponibles para el tratamiento de desechos que los reduce a un producto irreconocible; estos incluyen procesos de pulverización o alto calentamiento. La legalidad de los mismos es determinada por cada estado. Vacunación. Deben ofrecerse vacunas contra hepatitis B (HBV) a todos los empleados sin costo alguno. Cualquier empleado que se niegue a ser vacunado debe firmar una hoja indicando que entiende el riesgo continuo a la exposición de microorganismos patógenos. Estos empleados son libres de cambiar de opinión en cualquier momento y recibir la vacuna. La administración de esta vacuna es en una serie de tres dosis durante un período de seis meses. Los niveles protectores de anticuerpos son inducidos en el 90% a 99% de los adultos, sin embargo, estudios de seguimiento durante 3-5 años después de la vacunación han demostrado en varios individuos, que ya no hay títulos cuantificables. Estos individuos deben recibir una sola dosis de refuerzo. No se ha sugerido un seguimiento más prolongado. Las Consultas médicas y evaluaciones deben ser provistas si un empleado es expuesto a agentes de riesgo biológico a través de una aguja o una herida, exposición de membranas mucosas (ojos, nariz, o boca) o una exposición que involucre contacto de la piel con grandes cantidades de sangre. Se investiga el origen del paciente y se le pide autorización para hacerle análisis de HBV y HIV, si es necesario legalmente. Cuando no se requiere el consentimiento se lleva a cabo el análisis y se informa al empleado de los resultados. La sangre del empleado se colecta y se analiza tan pronto como sea posible. Si el empleado no acepta el análisis para HIV, la muestra se guarda al menos por 90 días por si éste cambia de opinión. Cuando ocurren exposiciones de alto riesgo con pacientes que se sabe son HIV positivo o pacientes con alto riesgo de ser HIV positivos se procede como emergencia. Los medicamentos como la azidotimidina, AZT, deben administrarse, preferiblemente dentro de las 80

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4 horas posteriores a la exposición. Debe realizarse el seguimiento del empleado expuesto, incluyendo la determinación del antígeno y el anticuerpo, orientación, y profilaxis posterior a la exposición. El empleado es analizado de nuevo a las 6, 12, y 26 semanas después de la exposición si el paciente es HIV positivo o sujeto de alto riesgo. Capacitación. Todos los empleados requieren sesiones específicas de capacitación para asegurar que ellos entienden la epidemiología de las enfermedades hematológicas y sus modos de transmisión. Es esencial una explicación acerca de los tipos y el uso apropiado del equipo de protección personal, así como de procedimientos de emergencia a seguir en casos de exposición. Todos los empleados deben estar familiarizados con las políticas de protección contra la transmisión de microorganismos patógenos. La adherencia a las políticas debe ser monitoreada regularmente y cuando se encuentren fallas evidentes proveer asesoría o reentrenamiento. Los expedientes de los empleados vacunados contra HBV son obligatorios. Además, los resultados de los exámenes físicos y consultas debe ser guardados . Todos estos registros deben mantenerse por la duración del empleo más 30 años. La documentación de las sesiones de capacitación se mantiene por tres años y se incluye la fecha de todos los programas un resumen del contenido de cada uno de éstos, nombres y calificaciones de todos los instructores, y una lista de asistencia incluyendo nombres y puestos de trabajo. El control de calidad de todos los procedimientos de seguridad está definido por la OSHA y es un aspecto importante en el desempeño del trabajo en los laboratorios de hoy. Todos los registros que cubren higiene química y protección de riesgo biológico deben ser fácilmente accesible y cuidadosamente mantenido para cumplir con las regulaciones gubernamentales.

Parte II: Cálculos en química clínicaref(39) ELIZABETH ANN BYRNE

Diluciones En varias áreas del laboratorio, resulta necesario diluir sangre o fluidos corporales para preparar una concentración cuantificable. La preparación exacta de estas diluciones es obligatoria para el reporte de las concentraciones reales de los constituyentes en los fluidos corporales. El diagnóstico, pronóstico y la terapia dependen de estos resultados. La dilución puede definirse como expresiones de concentraciones. Las diluciones expresan la cantidad, ya sea del volumen o peso, de una sustancia en un volumen final total especificado. Una dilución 1:5 contiene 1 volumen (peso) en un total de 5 volúmenes (pesos), esto es, 1 volumen más 4 volúmenes. La expresión de una dilución 1:5 puede también ser indicado como la fracción común 81

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l/5. Esta fracción permite calcular la concentración real de una solución diluida.

Ejemplo. Una solución estándar de nitrógeno de 100 mg/mL es diluida 1:10. La concentración de la solución resultante es 100 x 1/10 = 10 mg/mL. La ecuación más comúnmente usada para la preparación de esta dilución es: V1 x C1=V2 x C2

Ec.1-1

V1 es el volumen, C1 es la concentración de la solución 1, y V2 y C2 son el volumen y concentración de la solución diluida. Estos pueden ser expresados como concentraciones % (peso/volumen, w/v), molaridad o normalidad. V2 y C2 están relacionadas en forma similar. Esta ecuación básica puede ser expresada como: V1 C1 ––––– = ––––– V2 C2 El error más común en el planteamiento de una ecuación de este tipo, es no colocar los volúmenes o concentraciones relacionados en el lugar correcto y también el cancelar las unidades que debieran permanecer. Una práctica útil para la solución exitosa de los cálculos en el laboratorio es escribir todos los números de una ecuación con sus unidades de medida respectiva. Esto puede ser un poco más tardado pero ahorrará tiempo en la revisión de los cálculos cuando el resultado final parece ilógico o incorrecto. En un problema, cuando no se cancelan las unidades correctas éste no puede resolverse. Una segunda práctica útil es la reducción de fracciones a su mínimo común denominador antes de calcular los resultados. Ejemplo. Prepare 500 ml de NaCl, 0.5 M (peso molecular del NaCl=58.5 g/mol). Litro 0.5 mol 58.5 0.5 x 58.5 g 29.25 g 500 mL x ––––––– x ––––––– x –––––– = ––––––––– = –––––– = 14.6 g 1000 mL Litro mol 2 2

14.6g de NaCl diluidos en 500 mL = 0.5 M de NaCl Ejemplo. Prepare 250 mL de HCl 0.1 M a partir de una solución concentrada de HCl 1M. Usando C1 x V1 = C2 x V2 Donde V1 es el desconocido C1 = 1.0 mol/ L

V2 = 250 mL. C2 = 0.1 mol/L

1.0 mol/L x V1 = 250 mL x 0.1 mol/L V1 = 25 mL

Medir 25 mL de HCl 1 M; diluirlo a 250 mL con agua destilada. Esta solución diluida tiene una concentración de 0.1 M de HCl (el razonamiento matemático indica que una dilución 1:10 de la solución concentrada HCl 1M resulta en una concentración de 0.1 M, y por lo tanto, 25 82

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mL diluidos a 250 mL equivale a una dilución 1:10)

Otras aplicaciones de las diluciones Para que la concentración de creatinina en orina de 24 horas pueda ser analizada, la muestra debe ser diluida 1:5 antes de ser medida. Calcule la excreción de 24 horas si el volumen urinario de 24 horas es de 1,800 mL y la concentración de creatinina medida es de 260mg/L: Excreción total = Volumen total de orina x Concentración x Dilución. mL mg 1L Excreción total = 1800 x ––––– x 260 –––– x 5 x –––––– 24 Hr L 1000mL Excreción total = 2340 mg/24 hrs o 2.34g/24 hrs

Ejercicios Calcule las concentraciones (las respuestas están en el apéndice al final de este capítulo). 1. NaOH 10 M, cual está diluida 1: 20 = __ M? 2. HCl 2 M, que está diluida 1 :5 = __ M? 3. Glucosa 1000 mg/L, diluida 1: 10 y después 1: 2 = __ mg/L? Diluciones seriadas son aquellas en las cuales todas las diluciones después de la primera son las mismas. Excepciones a esta descripción general de preparación de diluciones en serie están incluidas en ciertas técnicas en serología, tales como la titulación de antiestreptolisinas. Ejemplo de dilución seriada. Para determinar el título de antiRHO (D), el suero se diluye 1 :5 por adición de 0.2 mL de suero a 0.8 mL de solución salina, en el tubo l. Los tubos del 2 al 8 contienen 0.5 mL de salina como diluyente. La dilución se lleva a cabo transfiriendo 0.5 mL del tubo 1 al tubo 2, e mezcla, y entonces se transfieren 0.5 mL del tubo 2 al tubo 3, continuando así hasta el tubo 8 y mezclando después de cada transferencia. La concentración de suero en los tubos disminuye por un factor de 2 por cada dilución: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1 :80, 1: 160, l :320, y l :640. 4. Para un título ABO, el tubo l contiene 0.9 mL de diluyente, los tubos del 2 al 8 contienen 0.5 mL de diluyente, 0.1 mL de suero se añade al tubo 1, y se continúa con las diluciones en serie transfiriendo 0.5 mL en el resto de los tubos. Si el último tubo que presenta aglutinación con células A es el tubo 6, ¿cuál es el título de antiA en el suero? (¿Esta es igual a la dilución en el tubo 6 = 1:?) 5. Todos los tubos para una dilución seriada contienen 0.5 mL de solución salina, 0.5 mL de suero se añaden al tubo 1, y 0.5 mL se transfieren a todos los tubos de la fila. Se añaden células de carnero a los tubos, y se demuestra la aglutinación hasta el tubo 7. ¿Cuál es el título de las aglutinaciones en las células de carnero?

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Pesos y concentraciones Definiciones y ejemplos Concentraciones porcentuales. Los porcientos de concentraciones son generalmente expresadas como partes de soluto por 100 partes de solución total; de aquí la expresión por ciento, o por cien. El uso de concentración en porcentajes se deriva históricamente de los primeros químicos farmacéuticos. A pesar de que estos términos son usados todavía en los Estados Unidos, las grandes organizaciones (AACC, CAP) están intentando usar las unidades unificadas en el SI. Las concentraciones en unidades SI son descritas en moles por litro cuando el peso molecular de la sustancia es conocida, o como peso (masa) por mililitro o peso por litro, cuando el peso molecular es desconocido. La unidades en el Sl son usadas a través del texto cuando es necesario. Las tres formas básicas de concentración son las siguientes: Peso por unidad de peso (w/w). Ambos soluto y solvente son pesados, el total equivale a100 g. Ejemplo. 5% w/w de NaCl contiene 50 g de NaCl + 950 g de diluyente. Volumen por unidad de volumen (vlv). El volumen del soluto líquido por el volumen total del soluto y solvente. Ejemplo. 1% de HCl (v/v) contiene 1 mL de HCl por 100 mL (ó 1 dL) de solución. Peso por unidad de volumen (w/v). Las expresiones más frecuentemente usadas, concentraciones de w/v son reportadas como gramos por ciento (g %) o g/dL, también como g/dL y mg/dL. Cuando la concentración por ciento es expresada sin especificar la forma, se asume que es peso por unidad de volumen. El uso de peso por ciento para describir concentración está siendo descontinuado por profesionales, y no es usado en este libro, con algunas excepciones. Con unidades del SI esto sería en términos de peso por microlitros (mL), mililitros ( L), o litros (L). Ejemplo. Para preparar 100 mL de 100 g/L de NaCl; pesar 10 g de NaCl y diluir hasta un volumen de 100ml en un matraz volumétrico. Molaridad. La molaridad expresa la concentración como el número de moles por litro de solución. Una mol es el peso molecular de la sustancia en gramos. Una milimol es 1/1000 de una mol. Una solución molar contiene el peso molecular en gramos de una sustancia por litro. 1 mol = 1000 mmol 1 mmol = 1000 mol 1 mol = 1000 nmol Ejemplos. Una solución de NaOH 1 M (peso molecular, o PM= 40.0 g/mol) contiene un peso molecular equivalente gramo por litro, ó 40 g diluidos a 1000 mL con agua destilada. Una solución milimolar (1 mM), ó 0.001 molar (0.001 M), contiene 1 mmol/L. 1 milimol de NaOH es 1/1000 de 40 g, que es, 0.040 g (40 mg). Cuando es diluido a 1000 mL, la 84

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concentración de la solución será 0.001 M. Normalidad. La normalidad expresa la concentración en términos de peso equivalente de la sustancia. El peso equivalente está determinado por la valencia, la cual refleja el número de unidades combinables o reemplazables. Una solución 1 normal (1 N) contiene 1 peso equivalente por litro. El peso equivalente de un elemento o compuesto es igual al peso molecular dividido entre la valencia. La relaciones de normalidad y molaridad pueden ser calculadas si sus definiciones son entendidas. Ejemplos HCI 1 M = HCl 1 N, ya que 1 mol de H+ o Cl- reacciona por cada mol de HCl. H2SO4 1 M = H2SO4 2 N, ya que 2 moles de H+ (esto es, equivalentes), reaccionan por cada mol de H2SO4. H3PO4 1 M = H3PO4 3 N, ya que 3 moles de H+ reaccionan por cada mol de H3PO4. CaCl2 1 M = CaCl2 2N, ya que 2 moles de Cl- pueden reaccionar por cada mol de CaCl2. CaSO4 1 M = CaSO4 2 N, ya que el volumen de 2 moles de electrones está disponible para reaccionar con Ca++ o S04=. Los pesos equivalentes son conocidos como el número de gramos de un elemento (o compuesto) que reaccionarán con otro elemento (o compuesto). Esta ley denominada ley de combinación de pesos, opera para todos los compuestos químicos. Para simplificar los procedimientos químicos y reportes, pueden usarse factores para expresar la cantidad de un compuesto como una cantidad equivalente de otro compuesto. Este proceso puede ser nombrado equivalencia. Ejemplo. Calcular la cantidad de urea si el nivel de nitrógeno de urea de un paciente es 800 mg/L. La formula de la urea es NH2-CO-NH2, y su peso molecular es 60 g/mol. El peso molecular equivalente para el nitrógeno en moles es 14 g/mol x 2 moléculas = 28. El factor urea/nitrógeno es determinado por la siguiente ecuación: PM de urea (60) x g de urea ––––––––––––––––––– = –––––––––––––––––– 2 x PM de nitrógeno (28) 1 g de nitrógeno ureico 28 x = 60 x = 2.14 (factor)

Este factor establece que 2.14 g de urea serían equivalentes a un 1g de nitrógeno de urea. Así que, 800 mg/L urea nitrógeno x 2.14 es igual a 1712 mg/L de urea. Actualmente, los resultados de urea en el laboratorio son reportados como nitrógeno de urea, ya que los métodos históricos para esta prueba en particular están basados en mediciones de nitrógeno de 85

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urea. El personal competente del laboratorio debe ser capaz de convertir mg/dL a mEq/L. Los equivalentes de electrolitos pueden ser calculados de la ecuación: mg/dL x 10 = 10 mg/L

Ya que el peso mg/mEq es el peso milimolar en miligramos dividido entre la valencia mg/L –––––– = mEq/L mg/mEq

o mg/dL dL –––––– x –––––– = mEq/L mg/mEq L

Ejemplo. ¿Cuál es la concentración en mEq/L de cloro en suero, reportado como 250 mg/dL? Ya que el peso milimolecular del cloro es 35.5 (esto es, 1 mmol = 35.5 mg), el peso miliequivalente del cloro es:

PM 35.5 g/mol –––––––– = ––––––––– Valencia 1

250 mg dL ––––––––––– x 10 –––– 35.5 mg/mEq L

Gravedad específica. La gravedad específica puede ser usada para determinar la masa (peso) de las soluciones. Esto relaciona el peso de 1 mL de la solución y el peso de un volumen igual de agua pura a 4o C (1 g). Un uso práctico de la gravedad específica es en la preparación de diluciones a partir de ácidos concentrados comerciales, la ecuación es la siguiente: Gravedad específica x Porcentaje del análisis = Gramos del compuesto por mililitro

Ejemplo. El HCI concentrado tiene una gravedad específica de 1.25 g/mL y es usado como; HCl 38%. ¿Cuál es la cantidad de HCl por mililitro? 1.25 g/mL x 0.38 = 0.475 g de HCI por mL

Un error común es evitar el cambio del porcentaje determinado a su decimal apropiado; en el ejemplo anterior, 38% = 0.38 86

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Ejercicio 6. Usando el ejemplo anterior, cuantos mililitros de HCL concentrado se necesitan para preparar 1 L de una solución 0.1 N HCl, sí el peso molecular del HCl = 36.5? Agua de hidratación. Algunas sales están disponibles en ambas formas anhidra (sin agua) e hidratadas (con moléculas de agua). La forma disponible de la sal, incluyendo el agua de hidratación, está incluida en la etiqueta del fabricante. Para preparar concentraciones exactas de estas sales, los cálculos deben incluir las moléculas de agua presentes en el compuesto. Esto es hecho más fácil calculando el porcentaje del compuesto que está en forma anhidra. Con este porcentaje el peso de la forma hidratada puede ser corregido obteniendo el de la forma anhidra. La ventaja de usar concentraciones molares es que el agua de hidratación no tiene que tomarse en cuenta para los cálculos. Por ejemplo, 1 mol de CuS04 = 160 g y 1 mol de CuS04 · 5 H2O = 250 g. Un peso molecular equivalente gramo de cada compuesto contendrá 1 mol de CuS04; que es: 250 g CuS04 · 5 H2O = 1 mol de CuS04 = 160 g de CuS04

Ejemplo. ¿Cuántos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2 · 3 H2O? Mg 24 Cl2 71 ––– 95 PM

Mg Cl2 3H2O

24 71 54 ––– 149 PM 95 x ––– = ––– 14 1 149x = 95 x = 63.8%

Un gramo de MgCl2·3 H2O contiene 0.637 g de MgCl2. Fracción molar. La fracción molar se refiere a la relación entre la cantidad de un componente y la mezcla de los componentes. La fracción molar es una unidad derivada, que es expresada ya sea como porcentaje o como decimal. Ejemplo. ¿Qué porcentaje de magnesio está contenido en MgCl2 · 3H2O? Mg = 24 Cl = 35.5 MgC12 · 3 H2O = 149

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24 ––– = 16.1% 149 =

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Mg es 16.1% de la molécula MgCl2 · 3 H2O. Ejemplo. Determine el porcentaje molar del calcio en el carbonato de calcio (PM= 100), 1 mol de CaCO3 contiene 100 g, entendiendo que 40 (Ca) + 12 (Ca) + 48 (3 x O), de los cuales 40 es calcio. La fracción molar de calcio en 1 L de 1 mol de carbonato de calcio es igual a 40%. Ejemplo. ¿Cuánto SO4 · 5 H2O debe pesarse para preparar 1 L de un solución conteniendo 80 mg de CuSO4? PM Total de CuS04 · 5 H2O = 250 PM de CuSO4 = 160

La proporción de CuSO4 · 5H2O que es CuSO4 es 160/ 250 = 0.64. Por lo tanto, 1 g de CUS04 · 5H2O contiene 1 g x 0.64 = 0.64 g de CuSO4. El resto, 0.36 g, es agua. Entonces: 80 ––– = 125 mg de CuSO4 · 5 H2O 0.64

Ejemplos de cálculos a. Cual es la normalidad del HC1 concentrado que tiene una gravedad específica de 1.19 g/mL y un ensayo del 38%? Gravedad específica x Porcentaje = Gramos/mililitro 1.19 x 0.38 = 0.452 g/mL = 452 g/L 36.5 g de HCl/L = I N 452 g/L ––––––– = 12.4 N 36.5 g/Eq

b. Si 24.5 g de H2SO4 (PM = 98 g/mol) están disueltos en un 1 L de solución (1) ¿Cuál es la molaridad? (2) ¿Cuál es su normalidad? (Respuesta 1) 1 mol de H2SO4 = 98 g; Por lo tanto 24.5 g es igual a: 1mol x –––– = ––––– 98 g 24.5 g x = 0.25 mol 0.25 mol en 1 L = 0.25 mol/L = 0.25 M

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(Respuesta 2) La valencia de H2SO4 es igual a 2; por lo tanto el peso equivalente de H2SO4 se expresa como sigue: Peso molecular Peso equivalente = ––––––––––––– Valencia Peso equivalente = 49 g

Para resolver que número de equivalentes que hay en 24.5 g 1 equivalente x –––––––––– = –––––– 49 g 24.5 g x = 0.5 equivalentes 0.5 equivalentes en 1 L = 0.5 Eq/L = 0.5 N

c. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol y el peso atómico del calcio o es 40 g/mol; ¿cuántos gramos o miligramos se necesitan para preparar: (1) I L de CaCO3 0.1 M? (2) 10 mL de 100 mg/dL de Ca++ usando CaCO3? (3) 50 mg/L de CaCO3? (4) 0.2 mEq/L de Ca++ usando CaCO3? (Respuesta 1) 1 mol de CaCO3 = 100 g; por lo tanto 0.1 mol = 10 g, ya que 0.1 molar = 0.1 mol/L = 10 g/L (Respuesta 2) El porcentaje de peso del Ca++ en CaCO3 es:

Peso atómico del Ca++ 40 –––––––––––––––––––– = –––––– = 40% Peso molecular de CaCO3 100

En 10 mL, se necesitan 10 mg de Ca++ o: 10 mg 10 mg 10 mg ––––––––––– = –––––– = –––––– = 25 mg de CaCO3

% de CaCO3

40%

0.25

Por lo tanto, 25 mg de CaCO3 = 10 mg de Ca++ (Respuesta 3) Se necesitan 50 mg de CaCO3 para 1 L. (Respuesta 4) 1 peso equivalente de CaCO3 es igual a: 89

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Peso molecular del CaCO3

100 g/mol

–––––––––––––––––––– = –––––––––––––– = 50 g /equivalente Valencia 2 equivalentes/mol

Para convertir a miliequivalentes 1 Eq 1 mEq = ––––– 1000 50 g 1 Eq ––––– x ––––––– = 50 mg/mEq 1 Eq 1000 mEq

Calcular la cantidad para preparar 1 L de 0.2 mEq 1 mEq en peso 0.2 mEq en peso ––––––––––– = –––––––––––– = 50 mg x x = 10 mg de CaCO3

Ejercicios 7. 3 M CaCl2 (PM 111.1) = ___ N CaCl2 8. 2N H3PO4 (PM 98) = ___ M H3PO4 9. 2 M H2SO4 (PM 98) = ___ N H2SO4 10. 250 mL de 5% NaCl contienen___ g de NaCl 11. ¿Cuánto CuSO4 · 5 H2O debe pesarse para preparar 100 mL de CuSO4 al 5%? (PM CuSO4 = 159.61; PM H2O = 18) 12. ¿Qué porcentaje de CuSO4 · 5 H2O es de agua?___ %

Cálculos basados en mediciones fotométricas (Ley de Beer) Referirse al Capítulo 4 para una descripción de la relación entre porcentaje de transmitancia, absorbancia y concentración.

Colorimetría Colorimetría es la medición de la clase y cantidad de luz absorbida o transmitida por una solución. Estas mediciones de absorbancia o transmitancia están relacionadas logarítmicamente. La ley de Beer (ver abajo) refleja la relación entre la absorbancia y la concentración de una solución estándar conocida con las de las soluciones de concentraciones desconocidas; las muestras de los pacientes. La ley de Beer establece que la absorbancia de 90

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una solución está directamente relacionada con su concentración. Si la ley de Beer es verdadera, entonces: Au Cu = –––– x Cs As

Ec. 1-3

Cu y Au representan la concentración y absorbancia de las muestras desconocidas, mientras que Cs y As reflejan las de la solución estándar. En la preparación de un método colorimétrico para análisis en química clínica, se debe asegurar que la ley de Beer se cumpla o de otra manera esta fórmula no se puede usar. En otras palabras, esta fórmula puede ser usada sólo sí la absorbancia y la concentración son directamente proporcionales, esto es, si la absorbancia se duplica, la concentración se duplica. Una curva estándar puede usarse para determinar gráficamente los valores de concentración. La preparación de una curva estándar se describe abajo.

Absorbancia y transmitancia La absorbancia mide la cantidad de luz que es bloqueada o absorbida por una solución. La absorbancia es también conocida como "densidad óptica" (Optical density” o “OD”, en inglés), un término encontrado en la literatura antigua y no se usa comúnmente en la actualidad. La Transmitancia mide la cantidad de luz que pasa a través de una solución. La transmitancia es generalmente expresada como porcentaje, ó %T. La escala de %T es lineal, como aparece en la escala de lectura del colorímetro. Como es discutido en el Capítulo 4, la absorbancia y el porcentaje de transmitancia están relacionados en forma logarítmica, ya que la absorbancia es una función logarítmica. La interconversión de la absorbancia y el por ciento de transmitancia es comúnmente expresada por la siguiente fórmula: %T A = -log –––– x Cs 100

Ec. 1-4

Está ecuación puede ser convertida algebráicamente como sigue: A = - (log %T - log 100) A = -(log %T - 2) A = -log %T + 2 A = 2 - log %T Ec. 1-5

El valor de la absorbancia puede se obtenido con una calculadora usando esta fórmula al presionar las teclas de los números para el % de transmitancia y convirtiéndolos a la forma logarítmica, poniendo un signo de menos y sumando 2.

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Ejemplos. Determinación de las concentraciones usando lecturas de absorbancia (A, u OD). a. Si la absorbancia de una muestra desconocida es 0.25 y la concentración del estándar es 4 mg/L con una absorbancia de 0.40, la concentración desconocida puede ser calculada usando: Au Cu = –––– x Cs As 0.25 Cu = –––– x Cs 0.40 Cu = 2.5 mg/L

b. Calcular la concentración de glucosa sí la siguiente información es conocida: Cs = 2000 mg/L, As = 0 40, Au = 0.25 Usando la fórmula anterior 0.25 Cu = –––– x 2000 mg/L 0.40 Cu = 1250 mg/L

c. Calcular la concentración de glucosa de una muestra desconocida (Cu) si el %T es dado. Si el estándar 1000 mg/L de glucosa (Cs) da una lectura de 49% T y la de la muestra desconocida da 55% T, el %T debe ser convertido a absorbancia, ya que solo la absorbancia es directamente proporcional a la concentración: As = 2 - log %T Au = 2 - log %T As = 2 - 1.690 Au = 2 - 1.740 As = 0.31 Au = 0.26 49%T = 0.31A = As 55%T = 0.26A = Au Cs = 1000 mg/L, Au = 0.26, As = 0.31

Usando la fórmula como en (a) y (b) de arriba: 0.26 Cu = –––– x 1000 mg/L = 839 mg/L 0.31

Coeficiente de extinción molar 92

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Los coeficientes de extinción molar se usan en el laboratorio clínico para calcular concentraciones y actividades enzimáticas en unidades internacionales (U) y para determinar la pureza de las sustancias disueltas. Sus aplicaciones específicas son la verificación de soluciones estándar, tales como hemoglobina o bilirrubina. El coeficiente de extinción molar, o coeficiente de absorbancia molar, , es definido como la absorbancia de una solución 1M a una longitud de honda dada, en una celda de 1 cm a 25o C. Está relacionada con la absorbancia por la siguiente fórmula: A = cl

Ec. 1-6

donde A = absorbancia a una longitud de onda específica, c = concentración de la sustancia que está siendo cuantificada, en moles/L, y l es la longitud del paso de luz en cm. Un estándar apropiado de bilirrubina, como una solución 1 M en cloroformo, tendría una absorbancia teórica de 60,700 (media) + 800 litros . moles-1.cm-1 a 453 nm, medida en una celda de 1 cm a 25o C. El razonamiento lógico sugiere que si este estándar fue diluido 1: 60,700 dará una absorbancia de 1. Ejemplo. Un estándar de bilirrubina 1 M es diluido 1: 60,700 y luego 1: 2, siendo la dilución final de 1: 121,400. La lectura de absorbancia de esta dilución es de 0.495 en una celda de 1 cm. ¿Cual es el coeficiente de extinción del estándar de bilirrubina?

0.495 (121, 400) = –––––––––––– 1 mol/L (1 cm) = 60,093 litros . mol-1 . cm-1

Una aplicación importante de , es en la medición de la concentración de sustancias. Si la de una sustancia es conocida y es usada una celda de 1 cm, la fórmula de la ley de Beer se simplifica como sigue: A c = ––––

Ejemplo. La de NADH a 340 nm es 6.22 x 103 litros . mol-1.cm-1. ¿ Si la absorbancia de NADH a 340 nm es de 0.350, cuál es la concentración? 0.350 c = –––––––––––– 6.22 x 103 L. mol-1

c = 5 x 10-5 mol/L Ejercicios 93

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13. El NADH tiene una absorción molar de 3.3 x 103 a una longitud de onda de 366 nm. Calcular la concentración de una solución que tiene una A (absorbancia) de 0.175 a 366 nm. 14. Un químico está verificando un estándar de bilirrubina. ¿ Cuál será la absorción molar de una solución 1 M diluida l :60,700 y tiene una lectura de 0.70 en una celda de 7 mm? 15. El químico tiene una solución de NADH con una concentración de 0.05 x 10-3 mol/L. Calcular la absorción molar sí da una lectura de 0.300 a 334 nm.

Amortiguadores Los amortiguadores resisten cambios de acidez mediante la formación de un ácido o base débil ionizado con los iones H+ o OH- añadidos . Por ejemplo, cuando se añade HC1 a una solución de Na+Ac- (acetato de sodio) más H+Ac- (ácido acético), el H+ del HCl reaccionará con Ac- formando más HAc-, el cual está levemente ionizado. El ácido acético-acetato amortigua efectivamente, removiendo H+ de la solución. La ecuación de Henderson-Hasselbalch se usa para expresar relaciones ácido-base. Existen varias formas de esta ecuación que no serán delineadas aquí, pero que pueden ser usadas para calcular problemas ácido-base. La ecuación más simple es la siguiente: Concentración de la base conjugada pH = pK + log ––––––––––––––––––––––––––––– Concentración del ácido débil

Ec. 1-7

El valor de pK depende de un grupo específico de condiciones; éstas son grado de disociación, temperatura, y pH. El pK para el sistema amortiguador del bicarbonato en suero o plasma es 6.10 a 37 C. Los libros de referencia química, tales como el Manual de Física y Química, de Lide [Lide Dr, editor: Handbook of Chemistry and Physics, Cleveland, Ohio, CRC Press, yearly updated editions] contienen valores de pK. Como químicos competentes debemos comprender los cálculos básicos de las ecuaciones Henderson-Hasselbalch, aún cuando los instrumentos del laboratorio provean lecturas directas de los valores para las pruebas ácido-base de los pacientes.

Ejemplos a. Calcular el pH de un amortiguador de acetato compuesto de acetato de sodio 0.20 M y ácido acético 0.05 M. (El pK del ácido acético es 4.76.)

[Sal] pH = pK + log ––––– [ácido] 0.20 = 4.76 + log –––––

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0.005 = 4.76 = log 4 = 5.3621 pH = 5.36

b. Ahora para un ejemplo complicado. Preparar un litro de amortiguador de acetato cuya concentración de acetato es 0.2 M y tiene un pH de 5.0. (El pK del ácido acético es 4.76; el peso molecular del ácido acético es 60, y 82 para el acetato de sodio.) [Sal] pH = pK + log ––––– [ácido] [Sal] log ––––– = 5.0 - 4.76 [ácido]= [Sal]/[Ácido] = antilog 0.24 [Sal]/[Ácido] = 1.7

El número 1.7 es la relación entre las moles por litro de la sal y los moles por litro del ácido. Cualquier concentración molar de sal y ácido que dan una razón de 1.7 resultará en un amortiguador de acetato con pH de 5.0. Nota. El problema especifica una concentración de la solución, 0.2 M, o HAc + Ac- = 0.2 M. Si Ac-/HAc = 1.7

entonces Ac- = 1.7 HAc

o HAc + 1.7 HAc = 0.2 M

y 2.7 HAc = 0.2 HAc = 0.074 mol/L de ácido PM x M = g/L 60 x 0.074 = 4.44 g/L de ácido necesario

Para calcular el peso de sal necesario, para 1L use: Moles de Sal = Moles totales - Moles de ácido = 0.2- 0.074 = 0.126 moles de Sal

Como fue hecho para el ácido: PM de sal x M = Gramos de sal/litro

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82g/mol x 0.126 mol/L = 10.33 g de sal/L

Cuando están disueltos 4.44 g de ácido y 10.33 de sal en un volumen total de 1L, la concentración resultante del amortiguador es 0.2 M a un pH de 5.0.

Cálculos enzimáticos La expresión de actividad enzimática en unidades internacionales ha sido generalmente aceptada desde su recomendación por la Unión Internacional de Bioquímica ("International Union of Biochemistry" o “UIB”, en inglés), a principios de los 1960s. Una unidad internacional, U, de enzima es definida como la cantidad que catalizará la transformación de 1 mol de sustrato por minuto bajo condiciones estándar. La actividad es expresada en términos de unidades de enzima por litro de suero, o miliunidades por mililitros de suero,en la siguiente relación: 1 U/L = mmol/minuto/litro de suero

La explicación de la ecuación básica para la conversión de absorbancia a unidades internacionales, no se intentará en esta parte de cálculos en el laboratorio. Es suficiente decir que deben tomarse en cuenta cualquier cambio como temperatura o volumen para la siguiente ecuación básica (ver Capítulo 54): A/min x Vt x 106 (µmol/mol) U/L = –––––––––––––––––––––––––– x Vs x l

Ec. 1-8

A/min = Cambio de absorbancia por minuto Vt = Volumen total de la reacción incluyendo muestra, reactivo, y diluyente Vs = Volumen del suero l = Longitud de la trayectoria de la celda = Coeficiente de extinción

El factor 106 mmol/mol se añade para convertir la respuesta a mmol/min/L (U/L). Ejemplo. ¿Cuál es la actividad de la lactato deshidrogenasa (LD) de 0.1 ml de suero + 3 mL de sustrato, sí el NADH formado mostró 0.002 A/min a 340 nm? para NADH = 6.22 x 103 L . mol-1 . cm1-. Usando la fórmula de arriba: 0.002 (106 mol/mol) (3.1 mL) U/L = ––––––––––––––––––––––––––––––––– 1 min (6.22 x 103 L /mol · cm)(0.1 mL)(1 cm) U/L = 9.9

Ejemplo. El cálculo de las unidades internacionales por litro de la actividad de fosfatasa alcalina usando un estándar de p-nitrofenol requiere atención de todos los factores de la 96

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formula: A/min x Vt x 106 (µmol/mol) U/L = –––––––––––––––––––––––––– x Vs x l

Si A de la muestra = 0.070, el min; Vt = 5.5 mL; Vs = 0.005 mL.

para p-nitrofenol es 50,000 L/mol . cm; tiempo = 15

(106 mol/mol) (5.5 mL U/L = ––––––––––––––––––––––––––––––––– 15 min. (50,000 mol . cm) (0.005 mL) (1 cm) 0.070 x 5.5 x 1000 UL = –––––––––––––––– 50 x 0.075 103 U/L = Actividad de la fosfatasa alcalina

Curvas estándar La preparación de curvas estándar en gráficas de papel es un camino esencial para examinar la validez de los datos. Frecuentemente las calculadoras o computadoras no revelan anormalidades en el sistema pero calculan resultados sacando un promedio. Por lo tanto la construcción de la gráfica de los datos es un camino importante para validar un ensayo. Previamente, en este capítulo, se definió la ley de Beer como la relación directa de absorbancia y concentración en una solución. Esto significa que sí una solución al 2% da una lectura de 0.1 A, entonces a 4% de concentración dará una lectura de 0.2 A, y una solución de 8% dará una lectura de 0.4 A. Repitiendo, la mayoría de las soluciones obedecen la ley de Beer; que es, concentración y absorbancia son directamente proporcionales sólo sobre un intervalo específico de concentración.

Gráficas Fig. 1-15.

Las absorbancias de las concentraciones del estándar de glucosa trazadas en papel milimétrico resultan en una línea recta, confirmando que la ley de Beer se cumple hasta la concentración de 3000 mg/L. Fig. 1-16. El trazo de los valores de %T de las mismas concentraciones de glucosa usada en la Fig.1-15 en papel lineal produce una línea semicurva; los valores de %T no son lineales contra las concentraciones. (Recordar la relación logarítmica de absorbancia y %T.) Fig 1-17. El trazo de los valores de %T en papel semilogarítmico resulta una línea recta, la cual puede ser usada para interpolar las concentraciones de glucosa usando los valores de %T .

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Ejercicios (Figs. 1-15 and 1-17 ) Encontrar las concentraciones de glucosa para las siguientes lecturas usando las Figs.1-15 y 1-17. 16. 17. 18. 19.

0.3 A = ____ mg/L 0.39 A = ____ mg/L 49% T = ____ mg/L 52% T = ____ mg/L

Ejercicios usando un estándar de valor conocido para determinar concentraciones desconocidas ¿Cuáles son las concentraciones de glucosa de las siguientes muestras de pacientes si el estándar de 2000 mg/L da una lectura de 0.32 A? Podemos emplear ya sea: Au Cu = –––– x Cs As

o Cu Au –––– = –––– Cs As

20. 0.22 A = ___ mg/L 21. 0.14 A = ___ mg/L 22. 0.46 A = ___ mg/L

Cálculos para la prueba de depuración renal Las pruebas de depuración renal son usadas para evaluar la función de los riñones. La Depuración renal es una medida del índice que expresa el volumen de sangre depurada de la sustancia que está siendo estudiada (típicamente, creatinina o urea) por unidad de tiempo. Por lo tanto la unidad para la prueba de depuración renal son mililitros por minuto. Para calcular la depuración de creatinina, se requiere de la siguiente información: Concentración sérica suero [S] Concentración urinaria [U] (Precaución: las concentraciones de suero y orina deben estar en las mismas unidades, e.g., mg/L o mg/dL.) Volumen de orina excretado por minuto (V) (Volumen de orina colectado dividido entre el período de tiempo en minutos.) UxV

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Depuración = –––––––– S

Los cálculos anteriores no toman en cuenta el área de superficie corporal del paciente. Si el médico requiere el valor corregido, la ecuación debe ser multiplicada por 1.73/A, donde 1.73 es igual al promedio del área de superficie corporal en metros cuadrados y A es igual al área de superficie corporal del paciente. UxV 1.73 Depuración = –––––– x –––– (corregida) S A

El área de superficie corporal del paciente está computada en un nomograma, usando su estatura y peso, o se puede calcular usando la siguiente fórmula: log A = (0.425 x log P) + (0.725 x log H ) - 2.144

donde A es el área de superficie corporal en metros cuadrados; P es el peso del paciente en kilogramos; y H es la estatura del paciente en centímetros. Ejemplos a. Determine la depuración de creatinina no corregida para un paciente con una creatinina en suero de 25 mg/L. La creatinina en orina fue 500 mg/L y el volumen de orina volumen fue 312 mL/4 hr. 312 mL/240 min = 1.3 mL/ min U 500 C = ––– x V = ––– x 1.3 = 26 mL/min S 2.5

b. Calcule la depuración de creatinina corregida para un niño que pesó 22.7 kg, tuvo 95 cm de estatura y se le colectó un volumen de 500 mL de orina durante un período de 24 horas. Los valores de creatinina en suero y orina fueron 0.14 mmol/ L y 4.75 mmol/L respectivamente. log A = (0.425 x log 22.7) + (0.725 x log 95) - 2.144 log A = 0.576 + 1.434 - 2.144 = 0.134 A = 0.734 500 mL/1440 min = 0.35 mL/min U

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1.73

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C = ––– x V x ––– X A 4.75 1.73 = ––– x V x 0.35 x ––– 0.14 0.734 = 2.80 mL/min

Pruebas urinarias usando el factor tiempo Los resultados de la pruebas de orina pueden ser reportados en muchas maneras. Los valores pueden ser reportados como unidades de concentración, cantidad por volumen total, y cantidad por unidad de tiempo. La utilidad clínica de las pruebas de orina es incrementada cuando los resultados cuantitativos están expresados como cantidad por volumen total o cantidad excretada en un período de tiempo dado. Las buenas prácticas de laboratorio dictan que el volumen total de orina y el tiempo de inicio y terminación del período de colecta deben ser anotados. Cuando los resultados de la prueba de orina se reportan como cantidad por volumen total, la concentración es medida y los resultados son corregidos como sigue: Cantidad –––––––––––– = Concentración medida x Volumen total Volumen total

Estos cálculos requieren que ambos; el volumen de orina y la concentración dada por el instrumento de medición sean reportados usando las mismas unidades.

Ejemplos a. Calcule la cantidad de proteína en 2400 mL de orina con una concentración de 30 mg/dL. Cantidad 30 mg –––––––––––– = –––––– x 2400 mL = 720 mg Volumen total 100 mL

b.

Determine la cantidad de sodio en 1800 mL de orina con una concentración de sodio de 35 mEq/L. Cantidad 35 mEq –––––––––––– = –––––– x 1800 mL = 63 mEq Volumen total 1000 mL

Cuando los resultados son reportados como cantidad por período de tiempo de colecta, los cálculos de la cantidad de sustancia por volumen total deben ser realizados primero y el resultado, reportado por duración de tiempo, en lugar de volumen total. 100

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Ejercicios adicionales 23. La solución estándar de hemoglobina contiene 200 g/L. ? Que cantidades se usarían para preparar 6 mL de las siguientes concentraciones? 200 g/L 24.

150 g/L

100 g/L

a. ¿Qué fracción de la urea es nitrógeno? CO(NH2)2.

50 g/L

La formula condensada de la urea es

Pesos atómicos: C = 12 O = 16 N = 14 H=I b. ¿Que porcentaje de urea es nitrógeno? 25. Hay en existencia HCl concentrado, teniendo un 38% de análisis y una gravedad específica de 1.170. a. Cual es el peso del HCl presente en 1 mL? b. Para la preparación de 100 mL de HC1 10% peso/vol, __ Ml de HCl serán diluidos al volumen total de mL. 26. Una solución salina normal tiene una concentración de 0.85%. ? Cual es su molaridad? (El peso molecular del NaCl es 58.5) 27. Si el estándar de proteína da una lectura de 0.48 A, y la muestra de un paciente da una lectura 0.36 A, cual es la concentración de las proteínas del paciente? Seleccione una de las siguientes respuestas: a. Dos veces la concentración del estándar b. Igual a la concentración del estándar c. Tres cuartos de la concentración del estándar. d. No son suficientes los datos para hacer los cálculos 28. Un paciente en coma diabético tiene niveles altos de glucosa, así que su suero es diluido 1: 2 y otra vez 1:2 para poder leerlo en la gráfica de glucosa como 1900 mg/L. ? Cual es la concentración real en (a) mg/L; (b) mg/dL, y (c) g/L? 29. ? Cuántos mEq/L hay en una solución conteniendo 27.7 mg/dL de potasio? (Peso atómico del K = 39.) 30. ? Cuántos mL de NaOH 0.4 N pueden hacerse de 20 mL de una solución 2 N ? 31. ? Cuál es la normalidad de una solución conteniendo 40 mEq de NaOH en 50 mL? 32. Cual es la dilución de suero en un tubo conteniendo 200 mL de suero, 500 mL de salina, y 300 mL de reactivo? 33. Calcule la actividad de la fosfatasa alcalina en U/L para lo siguiente:

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del estándar (p-nitrofenol ) = 5 x 104 L mol-1 x cm-1 Amuestra = 150 Vmuestra = 0.2 mL Vtotal = 2.2 mL Tiempo = 15 minutos 34. Cual es el coeficiente de extinción de lo siguiente: Concentración de la solución = 1.2 molar Dilución de la solución = 1/121,400 Una lectura en la celda de 1cm = 0.6 35. Se necesita preparar una solución 0.01 M de Na2HPO4: (PM de Na2HPO4 = 141.98). Solo está disponible la sal hidratada, Na2PO4 7 H2O (PM = 267.98). ? Cuántos gramos serán necesarios para preparar 250 mL? 36. Si una solución de 50 mg/mL de Na2HPO4 necesita ser preparada, ? cuántos gramos de la sal hidratada mencionada arriba se necesitan pesar para hacer l L de solución ? 37. Un químico desea preparar 50 mL de una solución de 10 mg/mL de NADH (PM= 663.44). Para hacer esto exactamente, el químico preparará primero una solución concentrada conteniendo aproximadamente 50 mg/mL. La absorbancia de la dilución 1: 1000 de la solución concentrada se medirá a 340 nm y de la absorbancia molar conocida de NADH a esta longitud de onda (6.22 x 103), será calculada la concentración real. Entonces se hará una dilución conveniente para obtener 500 mL de la solución deseada de10 mg/mL. Asumiendo que estas instrucciones fueron seguidas, la dilución de la solución concentrada preparada, tendrá una absorbancia de 0.562. Calcule concentración de NADH en esta solución concentrada en mmol/L y mg/L. ? Qué dilución debe hacerse para preparar la solución de 10 mg/ mL de NADH ? 38. El nivel de calcio en el suero de un paciente es 3.5 mEq/L. El valor normal esperado es de 90 a 110 mg/L. ? El nivel de calcio del paciente es más bajo, dentro o más alto que el valor normal esperado? 39. Una concentración de sodio es reportada como 3500 mg/L. Cual es la concentración en mEq/L? (peso atómico del sodio = peso equivalente = 23 g/mol o 23 mg/mmol) 40. Si el estándar de cianometahemoglobina, con una concentración de 200 g/L, da una lectura de 0.426 A, y una muestra de sangre del paciente da una lectura de 0.297 A, ? cual es la concentración de hemoglobina en la muestra? 41. Un estándar de nitrógeno de urea de 200 mg/L da una lectura de 0.30 A y la muestra de un paciente da una lectura de 0.40 A. La concentración del estándar comparada con el nivel del paciente es: a. Más alto b. Dos veces más c. 3/4 más d. 4/3 más 42. Un estándar de glucosa de 2000 mg/L da una lectura de 0.4 A y la muestra del paciente 102

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da una lectura de 1.0 A. El químico debe: a. Reportar el resultado como 500 mg/dL. b. Repetir la prueba antes de reportar. c. Repetir la prueba en una muestra diluida. d. Preparar un nuevo estándar de glucosa.

Apéndice: Repuestas a los Problemas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

24. 25. 26. 27. 28.

103

0.5 M 0.4 M 50 mg/L 1:320 1:128 7.68 mL 6 0.667 4 12.5 7.82 36.05 c = 53 x l0-6 mol/L = 60,700 L mol-l cm-l 6.0 x 103 L mol-l cm-l 1900 mg/L 2400 mg/L 1920 mg/L 1740 mg/L 1375 mg/L 875 mg/L 2870 mg/L 200 g/L = 6 mL + 0 mL de diluyente 150 g/L = 4.5 mL + 1.5 mL de diluyente 100 g/L = 3.0 mL + 3 mL de diluyente 50 g/L = 1.5 mL + 4.5 mL de diluyente a. 28/60 = 7/15 b. 46.6 % a. 0.445 g b. 22.5 mL será diluido a 100 mL 0.145 mol/L c a. 7600 mg/L b. 760 mg/dL c. 7.6 g/L

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29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37.

38. 39. 40. 41. 42.

7.1 mEq/L 100 mL 0.8 N 1:5 2.2 U/L 6.07 x 104 0.67 g 94.4 g La concentración de NADH en la solución concentrada es 90.4 mmol/L o 60 mg/mL. Tomar 8.3 mL de la solución concentrada y diluir a 50 mL para preparar la solución de10 mg/mL. 70 mg/L: más bajo que el intervalo esperado 152 mEq/L 139 g/L c. 3/4 como máximo c

Referencias 1. 2.

Preparation and Testing of Reagent Water in the Clinical Laboratory, ed 2, NCCLS Approved Guideline C3-A2 Villanova, PA, 1991, National Committee for Clinical Laboratory Standards. Gabler, R, Hegde, R, and Hughes, D: Degradation of high purity water on storage, J Liquid Chromatog 6:2565-2570, 1983. Winstead, M: Reagent grade water: How, when and why? American Society of Medical Technologists, Austin, Texas, 1967. Steck Co. Jorgenson, JH, Smith, RF: Rapid detection of contaminated intravenous fluids using the Limulus in vitro endotoxin assay, Appl Microbiol 26:521-524, 1973. Sullivan, JD Jr, Valoes, FW, Watson, SW: Endotoxins: the Limulus amebocyte lysate system. In Mechanisms in bacterial toxicology, AW Bernheimer (ed) New York, 1976, John Wiley & Sons, Inc, p. 217. Bristol, DW: Detection of trace organic impurities in binary solvent systems. A solvent purity test, J Chromatog 188:193, 1980. Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals - Second Edition. NCCLS Approved Standard GP2-A2 Villanova, PA 1992. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Statement from Quadrennial Symposium on Measurable Properties (Quantities) and Units in Clinical Chemistry, Gaithersburg, MD. August 5 and 6, 1976. Am J Clin Pathol 71:465-468, 1979. Clinical Chemistry: Theory, analysis, and correlation. ed 2, Kaplan, LA and Pesce, AJ, St. Louis, MO, 1989, Mosby. Determining Performance of Volumetric Equipment, NCCLS Proposed Standard I8-P, Villanova, PA, 1984, National Committee for Clinical Labortory Standards. Lide DR: Handbook of Chemistry and Physics, ed 76, Boca Raton, Fla., 1995, CRC Press. Lashor TW, Macurdy, LB: Precision laboratory standards of mass and laboratory weights. National Bureau of Standards Circular 547, Washington, DC, 1954. United States Department of Commerce. McCoubrey, AO: Guide for the use of the international system of units: the modernized metric system. National Institute of Standards and Technology Spec Publ 811, Washington, DC, 1991, United States Department of Commerce.

3. 4. 5.

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

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14. The National Committee for Clinical Laboratory Standards Position Paper (PPC-11): quantities and units (SI), Clin Chem 25:657-658, 1979. 15. Committee on Hospital Care, American Academy of Pediatrics: Metrication and SI units. Pediatrics 65:659-664, 1980. 16. Laboratory Instrument Maintenance Manual, Skokie, IL, 1989, p 99, College of American Pathologists. 17. Temperature calibration of water baths, instruments, and temperature sensors, ed 2, NCCLS Approved Standard I2 - A2, Villanova, PA, 1990. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 18. Procedures for the handling and processing of blood specimens, NCCLS Approved Guideline H18-A, Villanova, PA, 1990, National Committee for Clinical Laboratory Standards. 19. Laboratory instrument evaluation and verification manual, College of American Patholigists, Skokie, Ill., 1989, p111. 20. A centrifuge primer, Palo Alto CA, 1980, Spinco Div. Beckman Instruments, Inc. 21. Occupational Safety and Health Administration (Department of Labor): Occupational exposures to hazardous chemicals in laboratories: final rule, Federal Register, 29 CFR Part 1910.1450, 55(21): 300-3335, Jan 31, 1990. 22. Occupational Safety and Health Administration (Department of Labor) Occupational exposure to bloodeborne pathogens: final rule, Federal Register, 29 CFR Part 1910.1030, (235):64003-64182, Dec 6, 1991. 23. Sigma-Aldrich Library of Chemical Safety Data, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO (available in written or CD-ROM formats). 24. Compressed Gas Association, Inc: Handbook of compressed gases, ed 2, New York, 1981, Reinhold Publishing Corp. 25. Lan G, Sansone EB: Destruction of hazardous chemicals in the laboratory, New York, 1990, John Wiley & Sons. 26. United States Department of Health and Human Services: Recommendations for prevention of HIV transmission in health care setting, Morbidity, Mortality Weekly Report 56(25), Aug 21, 1987. 27. Rutale WA, Weber DJ: Infectious waste-mismatch between science and policy: soundboard, N Engl J Med 325:578-581, 1991.

Tablas Tabla 1-1. Comparación de los procesos de purificación del agua.ref(40) Proceso de purificación: Destilación Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: E/Gref(41) Gases ionizados disueltos: P Orgánicos disueltosref(42): G Partículas: E Bacteriasref(43): E Pirógenos/endotoxinas:

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E Proceso de purificación: Desionización Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: E Gases ionizados disueltos: E Orgánicos disueltosref(44): P Partículas: P Bacteriasref(45): P Pirógenos/endotoxinas: P Proceso de purificación: Osmosis inversa Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: Gref(46) Gases ionizados disueltos: P Orgánicos disueltosref(47): G Partículas: E Bacteriasref(48): E Pirógenos/endotoxinas: E Proceso de purificación: Adsorción por carbón Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: P Gases ionizados disueltos: ref(49) P Orgánicos disueltosref(50): ref(51) E/G Partículas: P Bacteriasref(52): P Pirógenos/endotoxinas: P Proceso de purificación: Filtración Clases mayores de contaminantes:

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Sólidos ionizado disueltos: P Gases ionizados disueltos: P Orgánicos disueltosref(53): P Partículas: E Bacteriasref(54): E Pirógenos/endotoxinas: P Proceso de purificación: Ultrafiltración Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: P Gases ionizados disueltos: P Orgánicos disueltosref(55): Gref(56) Partículas: E Bacteriasref(57): E Pirógenos/endotoxinas: E Proceso de purificación: U.V. Oxidación Clases mayores de contaminantes: Sólidos ionizado disueltos: P Gases ionizados disueltos: P Orgánicos disueltosref(58): ref(59) E/G Partículas: P Bacteriasref(60): ref(61) G Pirógenos/endotoxinas: P E; Excelente (capaz de eliminación total o cercana a la totalidad) G; Buena (capaz de eliminar grandes porcentajes) P; Pobre (poca o ninguna eliminación)

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Tabla 1-2. Especificaciones para el agua como reactivo. Tipo I Tipo II Tipo III Contenido bacteriano máximo, 10ref(62) 1000 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)

N.S.

pH

5.0-8.0

N.S.

N.S.

Resistividad mínima, megohm10(en línea) centímetro (megohm-cm 25o C)

1.0

0.1

Máximo silicato mg/L SiO2

0.05

0.1

1.0

Material particuladoref(63)

0.22 m filtroref(64)

N.S.

Contaminantes orgánicosref(65)

Carbón activado N.S.

N.S.

N.S.

N.S., No especificado.

Tabla 1-3. Usos sugeridos del agua como reactivo.Note(66) Especialref(67) HPLC

Tipo I

Ensayo de elementos trazas y metales pesadosref(68)

Tipo II Preparación de medios bacteriológicode

Lavado cristalería y enjuague preliminar

Cultivo celular/ tejido (libre de pirógenos

Ensayo enzimático Tinciones y colorantes

Ensayos de ligando Reactivos sin preservativos

(histología/parasitología)

Análisis cromosomal

Ensayos inmunofluorescentes cuantitativos

Reactivos que serán esterilizados

IVF/GIFTref(69)

Preparación de Reactivos con soluciones estándar preservativos

Prueba HLA (con ultrafiltro)

Procedimientos electroforéticos

Tabla 1-4. Algunos agentes desecantes comunes. 108

Tipo III

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Desecante CaCl2 anhidro

Propiedades

Usos

Alta capacidad, acción lenta,En la mayoría de las trabaja bien a menos de 30o C condiciones, muy económico

MgSO4 anhidro Neutro, acción rápida condiciones, es

En la mayoría de las económico

Na2SO4 anhidro Neutro, alta capacidad, trabaja a menos de 32o C, acción lenta

Puede eliminar grandes volúmenes de agua

CaSO4 anhidro

Extremadamente rápido en acción, químicamente inerte, capacidad límite para absorber agua (6% al 10% de peso en agua)

Mas caro que Na2SO4 y MgSO4; vendido comercialmente como Drierite; puede regenerarse fácilmente por calentamiento a 230-240o C por 3 hrs.

Al2O3 (Al activado)

Puede absorber dél 15% Puede ser repetidamente al 20% de su peso en agua reacactivado por calentamiento a 175o C por 7 horas

Table 1-5. Tipos de cristalería comúnmente usada y sus propiedades. Vidrio

Propiedades

Kimax/Pírex

Vidrio borosilicato relativamente inerte alta resistencia a los cambios bruscos de frío o calor

Todos propósitos

Vycor

Buena resistencia a condiciones drásticas ignición de calentamiento, shock, tratamiento químico, y alta temperatura; resistencia ácida y alcalina

Cenizas, técnicas de

Corex Vidrio de silicato de Usado bajo condiciones aluminio, seis veces de tensión

109

Propósito

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más fuerte que el vidrio de borosilicato; resistente a rajaduras y a trans ferencias alcalinas

110

Alto % de Silicato

> 96% silicato;Para trabajo de alta comparable al cuarzo precisión analítica, fundido; tolerancia eléctrica, reflectores óptico química y al calor. Excelentes y espejos propiedades ópticas

Libre en Boro

Álcali-resistente; Soluciones altapobre resistencia; mente alcalinas al calor; suave, < 0.2% boro

Bajo en actino

El color ámbar o rojo Para uso con reduce la exposición materiales sensibles del contenido a la luz. a la luz en el intervalo x de 300 a 500 nm (e.g. bilirrubina, vitamina A, caroteno)

Flint artículos

Vidrio Soda-lime

Usado para

conteniendo óxidos de sodio, silicona, y calcio; pobre resistencia a altas temperaturas o cambios de temperatura, poca resistencia química; puede también dejar colar contaminantes orgánicos

desechables de vidrio, (e.g., pipetas)

Cubierto

Delgado, óxido metálico ligado con fuego a la superficie del vidrio

Conduce electricidad, actúa como barrera electrostática; protege contra rayos infrarrojos

Óptico

Hecho de soda-lime, plomo y borosilicato

Prismas, lentes, y espejos ópticos

Pyroceram

Alta resistencia térmica, químicamente estable, resistente a la corrosión

Placas térmicas, intercambiadores de calor

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Tabla 1-6. Resumen de la resistencia química (a 20o C) y propiedades físicas de varios plásticos.* Resistencia química Clases de sustancias: Ácidos, diluidos o débiles Tipos de resinas*: LDPE: E HDPE: E PP, PA: E PMP: E FEP, TFE, ETFE: E PC: E PSF: E Botellas de PVC**: E PS: E Nylon: F Clases de sustancias: Ácidos,ref(70) fuertes y concentrados Tipos de resinas*: LDPE: E HDPE: E PP, PA: E PMP: E FEP, TFE, ETFE: E PC: N PSF: G Botellas de PVC**: E PS: F Nylon: N Clases de sustancias: Alcoholes, alifá ticos Tipos de resinas*: LDPE: E HDPE: E PP, PA: E PMP: E FEP, TFE, ETFE: E PC: G PSF: G Botellas de PVC**: E PS: E Nylon: G Clases de sustancias: Aldehídos Tipos de resinas*: LDPE: G HDPE: G PP, PA: G PMP: G FEP, TFE, ETFE: E PC: F

111

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PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

F N N F

Clases de sustancias: Bases Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA: PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

E E E E E N E E E F

Clases de sustancias: Esteres Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA: PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

G G G G E N N N N E

Clases de sustancias: Hidrocarburos, alifáticos Tipos de resinas*: LDPE: F HDPE: G PP, PA: G PMP: F FEP, TFE, ETFE: E PC: F PSF: G Botellas de PVC**: E PS: N Nylon: E Clases de sustancias: Hidrocarburos, aromáticos Tipos de resinas*: LDPE: F HDPE: G PP, PA: F PMP: F FEP, TFE, ETFE: E PC: N PSF: N

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Botellas de PVC**: PS: Nylon:

N N E

Clases de sustancias: Hidrocarburos, halogenados Tipos de resinas*: LDPE: N HDPE: F PP, PA: F PMP: N FEP, TFE, ETFE: E PC: N PSF: N Botellas de PVC**: N PS: N Nylon: G Clases de sustancias: Cetonas Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA: PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

G G G F E N N N N E

Clases de sustancias: Agentes oxidantes fuertes Tipos de resinas*: LDPE: F HDPE: F PP, PA: F PMP: F FEP, TFE, ETFE: E PC: N PSF: G Botellas de PVC**: G PS: N Nylon: N Propiedades Físicas Clases de sustancias: Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA:

Temperatura máxima utilizable (o C)

PMP: FEP, TFE, ETFE:

113

80 120 135 (PP) 130 (PA) 175 205(FEP)

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PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon: Clases de sustancias: Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA:

150(ETFE) 135 165 70ref(71) ---

Temperatura de fragilidad (o C)

PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

-100 -100 0 (PP) -40(PA) 20 270(FEP) 100(ETFE) -135 -100 -30 ---

Clases de sustancias: Esterilizaciónref(72) Clases de sustancias: Autoclave Tipos de resinas*: LDPE: No HDPE: No PP, PA: Si PMP: Si FEP, TFE, ETFE: Si PC: Siref(73) PSF: Si Botellas de PVC**: Noref(74) PS: -Nylon: --

114

Clases de sustancias: Gas Tipos de resinas*: LDPE: HDPE: PP, PA: PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

Si Si Si Si Si Si Si Si ---

Clases de sustancias: Tipos de resinas*: LDPE: HDPE:

No No

Calor seco

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PP, PA: PMP: FEP, TFE, ETFE: PC: PSF: Botellas de PVC**: PS: Nylon:

No Siref(75) Si No Si No ---

Clases de sustancias: Químico Tipos de resinas*: LDPE: Si HDPE: Si PP, PA: Si PMP: Si FEP, TFE, ETFE: Si PC: Si PSF: Si Botellas de PVC**: Si PS: -Nylon: -Modificado de 1983-1984 Nalgene Labware Catalog, Nalge Co., Division of Sybron Corp., Rochester, N.Y. * Códigos de resinas: ETFE, Tefzel ETFE (Etileno-tetrafluoretileno); FEP, Teflon FEP (Etileno propileno-florado); HDPE, Polietileno de alta densidad; LDPE, Polietileno de baja densidad; PA, polialomero; PC, policarbonato; PMP, polimetilpenteno("TPX"); PP, polipropileno; PS, poliestireno; PSF, polisulfona; PVC, cloruro polivinilico; TFE, Teflon TFE (tetrafluoretileno). Clasificación de resistencia química: E, 30 días de constante exposición no causa daño. El plástico puede aún tolerarlo por años. G, Poco o ningún daño después de 30 días de constante exposición al reactivo. F, Algún efecto después de 7 días de constante exposición al reactivo. Dependiendo dél plástico, el efecto puede ser cuarteamiento, agrietamiento, perdida de fuerza, o decoloración. Los solventes pueden causar ablandamiento, hinchazón, y perdida de permeabilidad con LDPE, HDPE, PP, PA, y PMP. El efecto dél solvente en estas cinco resinas normalmente es reversible; la parte regresara a su condición normal después de la evaporación. N, No se recomienda para uso continuo. Puede ocurrir daño inmediato. Dependiendo del plástico, los efectos tendrán un mayor cuarteamiento, agrietamiento, perdida de fuerza, decoloración, deformación, disolución, o perdida de permeabilidad. ** Para mangueras de cloruro polivinílico, ver el Catalogo vigente de Nalgene Interpretación de la resistencia química. Este resumen es solo una guía general. Porque son muchos los factores que afectan la resistencia química de un producto dado, usted debe probar bajo sus propias condiciones. Si existe alguna duda sobre las aplicaciones específicas de los productos Nalgene, por favor contacte Technical Service, Nalgene Labware Department, Nalge Company, 75 Panorama Creek Drive, Rochester, NY 14602 o llame (716) 586-3985. Fax (716) 264-3707.

115

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Efectos de las sustancias químicas en plásticos. Las sustancias químicas pueden afectar la fuerza, flexibilidad, apariencia de la superficie, color, dimensiones o peso dél material de plástico. Los modos básicos de interacción que causan estos cambios son (1) ataque químico en la cadena del polímero, resultando en la reducción de sus propiedades físicas, incluyendo oxidación; reacción de grupos funcionales en o sobre la cadena; y despolimerización; (2) Cambio físico, incluyendo absorción de solventes, haciendo el material de plástico más suave e hinchado; resultando en penetración del solvente a través del plástico; disolución en un solvente; y (3) agrietamiento por la interacción del agente de estiramiento con que fue moldeado el material. La combinación de reactivos con compuestos de dos o más clases puede causar un efecto químico sinérgico e indeseable. Otros factores que afectan la resistencia incluyen la temperatura, presión, y tensión interno o externo (por ejemplo, centrifugación), el tiempo de exposición, y concentración de la sustancia química. A medida que la temperatura se incrementa, la resistencia al ataque decrece. PRECAUCIÓN. No almacenar agentes oxidantes fuertes en materiales de plástico excepto los que estén hechos de Telson FEO. Exposición prolongada causa fragilidad y averías. Aunque el almacenado prolongado no se intente al tiempo del llenado, un recipiente olvidado puede pasarse de tiempo y derramar su contenido. No colocar material de plástico en placas calientes o en la flama.

Tablas 1-7. Exactitud de los matraces volumétricos. Capacidad (mL)

Límite de error

25 50 100 250 500 1000

Porcentaje de error

0.03 0.05 0.08 0.11 0.15 0.30

0.1 0.1 0.08 0.04 0.03 0.03

Tabla 1-8. Exactitud de las pipetas manuales.

116

Tipo de pipeta

1.0 mL 5.0 mL

10.0 mL

25.0 mL

NBS estándar -Clase A volumétrica Mohr Mohr punta larga Serológica Serológica abertura amplia

0.01 0.006 0.01 0.02 0.01 0.05

0.025 0.02 0.03 0.06 0.03 0.10

0.03 0.10 -0.10 0.20

0.02 0.01 0.02 0.04 0.02 0.10

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Serológica punta larga

0.02

0.04

0.06

--

Tabla 1-9. Cantidades básicas y unidades del SI (Système International d'Unités). Cantidad

Unidad básica

Símbolo

Longitud Masa Tiempo Corriente eléctrica Temperatura Intensidad luminosa Cantidad de sustancia

Metro Kilogramo Segundo Ampere

m kg s A

Kelvin Candela

K cd

Mol

mol

Tabla 1-10. Unidades derivadas de SI usadas en medicina. Cantidad derivada

Unidad derivada

Símbolo

Área Volumen Velocidad Concentración de sustancia Presión Energía de trabajo o cantidad de calor Temperatura en Celsius Actividad (de un radionucleido) Potencia Carga eléctrica o cantidad Potencial eléctrico Resistencia Conductancia

Metro cuadrado Metro cúbico Metro por segundo Mol por metro cúbico Pascal Joule

m2 m3 m/s o m . s-1 mol/m3 o mol . m-3 Pa J

Grados Celsius Becquerel Watt Coulomb Volt

°C Bq W C V ê S

Siemens

Tabla1-11. Prefijos SI.

117

Prefijo* Símbolo

Factor

Símbolo

atto da

10-18

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Prefijo*

Factor

deka

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femto h pico k nano M micro G mili T centi P deci E-

10-15

f

hecto

102

10-12

p

kilo

103

10-9

n

mega

106

10-6

F

giga

109

10-3

m

tera

1012

10-2

c

peta

1015

10-1

d

exa

1018

*Se recomienda usar solo un prefijo.

Tabla 1-12. Caracterización de los tipos de balanzas y su relación con sus intervalos de operación.

Tipo de balanza Reproducibilidad Precisión balanzas Electrónico 32,000 16,000 6000 2000 1200 110 Mecánica

20,000 10,000 5,000 2,200 160

Balanzas analíticas Electrónicas 210 205 50 20 Mecánicas

160 160

Microbalanzas

118

Capacidad peso, g

Escala de lectura g

0.1g 0.1g 0.01g 0.01g 0.001g 0.001g

+0.1g +0.05g +0.01g +0.005g +0.0001g +0.0005g

2 1 0.1 0.01 0.001

+1g +0.5g +0.05g +0.01g +0.001g

0.1 mg 0.01 mg 0.1mg 2 g

+0.1 mg +0.03 mg +0.1mg +3 g

0.1 mg 0.01 mg

+0.05 mg +0.01 mg

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Electrónicas Mecánicas

5.1 2.1 20

1.0 g 0.1 g 0.001 mg

+0.9 g +0.25 g +0.001 mg

Tabla 1-13. Tolerancias NIST individuales para pesas de clase S. Tolerancia individual (mg)

Tolerancia mantenida (mg)

Masa nominal

1, 2, 3, 4, 10, 20, 30, 50 mg 100, 200, 300, 500 mg 1, 2, 3, 5, g 10, 20, 30 g 50 g 100 g

+0.014 +0.025 +0.054 +0.074 +0.12 +0.25

+0.014 +0.05 +0.11 +0.148 +0.22 +0.5

Tabla 1- 14. Clases o tipos de fuegos. Clase

Riesgo

A

Ropa, madera, papel, combustibles ordinarios

B

Líquidos inflamables (grasas, solventes) Gases inflamables (natural o manufacturado)

C

Equipo de operación eléctrica (Si la electricidad se apaga, el fuego es reclasificado como A o B)

Tabla 1-15. Comparación de tipos de extinguidores de fuego. Tipo

Ventajas

Desventajas

Halon (Clase Rápido control Requiere rápida A,B, C, dél fuego. descarga. o B,C) Puede alcanzar Más caro fuegos ocultos De riesgo No daña el personal (Halom equipo. 1211) Buen margen de No es útil para descarga. fuegos Menor Absorbe el intensos calor. Riesgo ambiental. Recargable

119

Notas* Sistema más común para fuegos por electricidad Máxima eficacia requiere rápida detección impacto ambiental si se recarga en sistema cerrado

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Polvo Bueno en grasa y Limitado riesgo Compatible con químico aceite. para el personal. otros agentes (Clases A, Buen control Posible daño al Sujeto a interB, C) Bajo costo equipo. ferencia en el Recargable Requiere limpieza equipo No indicado para fuegos ocultos Dióxido de Buena supresión Puede ser tóxico Segunda carbono del fuego y para el personal. opción después (Clase B,C) capacidad de Puede causar del Halon para enfriamiento. daño termostá fuegos tipo B Alcanzará fuegos tico yC escondidos Acumulación de No daña el equipo. vapores pesados No causa olores. limitando el rango de Recargable la descarga total Polvo No produce calor No es recomendable químico Fácil de limpiar para fuegos ocultos regular Buen control Leve riesgo (Clase B,C) Inodoro respiratorio No conductivo Recargable

Segunda opción después del Halom cuando fuegos clase B yC

*Del proveedor de materiales de seguridad para el laboratorio

Figuras

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Figura 1-1 Ejemplos de utensilios comúnmente usados en el laboratorio. A, Matraz Erlenmeyer. B, Embudo de separación C, Matraz de fondo redondo. D, Vaso de precipitados. E, Probeta. F, Matraz volumétrico. G, Embudo de tallo largo (para filtrar). H, Embudo de polvos. I, Bureta. J, Desecadores.

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Figura 1-2 Ejemplo de especificaciones NIST que se encuentran grabadas en matraces volumétricos clase A.

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Figura 1-3 Ejemplos de pipetas para transferir (PT). A, Mohr. B, Mohr punta larga. C, Serológicas. D, Serológicas con abertura ancha. E, Serológicas de punta larga.

123

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Figura 1-4 Ejemplos de pipetas para transferir (PT). A, Ostwald-Folin. B, Volumétricas clase A.

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Figura 1-5 Pasos para la utilización de micropipetas tipo Eppendorf. A, Anexando el tamaño apropiado de punta para el intervalo de volumen de la pipeta rotar la punta al mismo tiempo que se empuja en la pipeta para lograr un sellado continuo sin filtración de aire. B, Posición de la pipeta antes de su uso. C, Instrucciones detalladas para llenar y vaciar la punta de la pipeta. Seguir las instrucciones completas del fabricante para el cuidado y uso de micropipetas.

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Figura 1-6 Ejemplo de dispensador manual o repipetor.

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Figura 1-7 Ejemplo un diluidor-dispensador del tipo de doble jeringa.

Figura 1-8 A, Técnica apropiada de pipeteo como se describe en el texto. B, Ejemplo de bulbo de hule para pipeteo usado para aspirar muestra dentro de la pipeta.

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Figura 1-9 Cambiando el principio de una fuerza electrónica compensadora en una balanza. (Cortesía de The Mettler Instrument Corp., Highstown, N.J.)

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Figura. 1-10 Ejemplos de cargas balanceadas y no balanceadas. A, Suponiendo que todos los tubos han sido llenados con una cantidad igual de líquidos, podemos decir que la carga de ese rotor está balanceada. Los soportes opuestos A-C y B-D están cargados con un número igual de tubos que están balanceados con respecto al centro de rotación. Cada soporte es también balanceado con respecto a su eje central o eje pivotal. B, Aun sí todos los tubos están llenos con una cantidad igual, este rotor esta cargado o balanceado inapropiadamente, ninguno de los soportes cargados esta balanceado con respecto a su eje pivotal o punto central. A velocidades de operación los soportes A y C no alcanzan la posición horizontal. Soportes B y D sobrepasan la posición horizontal. También nótese que el arreglo de los tubos en los soportes opuestos B y D no están simétricamente con respecto al centro de rotación. (Reprinted from A Centrifuge Primer, Spinco Division of Beekman Instruments, {Palo Alto, CA, 1980, para permiso de Beekman Instruments, Inc.)

Figura 1-11 Nomograma para relacionar la fuerza centrífuga relativa, RCF con las revoluciones por minuto, rpm. 129

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Figura 1-12 Sistema de identificación de la Asociación Nacional para Protección contra el Fuego ("National Fire Protection Association"). (From Bauer JD: Clinical laboratory methods, ed 9, St Louis, 1982, Mosby.)

Figura 1-13 Etiquetas DOT. ( Departamento de Transportes, "Department of Transportation" en inglés).

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Figura 1-14 Etiquetas de riesgo biológico.

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Figura 1-17 Curva estándar para el análisis de glucosa. Se representa gráficamente el porcentaje de transmitancia (%T) vs. la concentración en escala log-lineal.

CAPÍTULO 2

2. Administración del Laboratorio Lawrence J. Crolla Paul W. Stiffler Robert W. Lang Delores Wishart

Regulaciones CLIA '88

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Estructura administrativa del hospital Organización del hospital Organización del laboratorio químico clínico Papel de la administración Comunicación de la administración Comunicación dentro de la organización total Comunicación dentro del laboratorio Administración del personal Personal Descripciones de trabajo o posiciones Horarios de trabajo Educación continua y competencia de los empleados Escalafón de carreras Administración de los recursos Administración financiera Presupuesto Justificación del Capital Compras Contabilidad de Costos Revisión general sobre aspectos de reembolso Manejo de la información Desempeño financiero Productividad Utilización de las pruebas Tiempo de entrega de resultados Mejoramiento continuo de la calidad Monitores de aseguramiento de la calidad

Términos clave patógenos sanguíneos Los microorganismos patógenos que están presentes en la sangre humana pueden causar enfermedades en los humanos. Estos patógenos incluyen, pero no están limitados a, Virus de la Hepatitis B (HBV) y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). CAP El Colegio de Patólogos Americanos (“College of American Pathologists”). CLIA '88 Modificaciones para las Mejoras del Laboratorio Clínico, 1988. (“Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988”). consideración de juez Equivalencia entre requerimientos de acreditación/requerimientos estatales y estándares de la CLIA. 135

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control de calidad (“Quality Control” o “CC”) Procedimientos para monitorear y evaluar la calidad del proceso analítico de cada método a fin de asegurar la exactitud y confiabilidad de los resultados de las pruebas y reportes de los pacientes. demandas del nivel de servicio Requisitos del laboratorio para la colecta de muestras y el tiempo de entrega de resultados. demográficos Datos personales acerca de una población específica. equivalente de tiempo completo (“Full Time Equivalent” o “FTE”) Empleado programado para trabajar 8 horas diarias, 260 días; ó 10 horas por día, 208 días; ó 2080 horas por año. HCFA Administración Financiera del Cuidado de la Salud (“Health Care Financing Administration”). HHS Departamento de Salud y Recursos Humanos (“Department of Health and Human Services”). JCAHO Comisión Conjunta para la Acreditación de Organizaciones del Cuidado de la Salud (“Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations”). Medicaid Un programa patrocinado por el gobierno federal, estatal, y local en Estados Unidos, para proveer beneficios a los que necesitan atención médica sin importar la edad que tienen. Medicare Un programa de atención médica y servicios hospitalarios patrocinado por el gobierno federal Estadounidense para personas mayores de 65 años. mezcla de pacientes El porcentaje de pacientes en una población hospitalaria con Medicare, Medicaid, pago privado y servicios caritativos. modelo de complejidad Los siete criterios usados para categorizar los sistemas de ensayos y exámenes de pruebas, basados en las calificaciones asignadas como 1, 2, ó 3 dentro de cada categoría. OSHA La Administración de la Salud y Seguridad Ocupacional de Estados Unidos (“Occupational Safety and Health Administration”). productividad Eficiencia en la producción expresada como unidades de trabajo dividida entre horas o puestos definidos. programa de aseguramiento de la calidad (“Quality Assurance” o “QA”, en inglés) Programa designado para: 1) monitorear y evaluar la calidad del proceso de las pruebas, la calidad total del proceso, la efectividad de sus normas, y procedimientos; 2) identificar y corregir problemas, asegurar la exactitud, confiabilidad, y el reporte rápido de los resultados de las pruebas; y 3) asegurar un personal adecuado y competente. prueba de alta complejidad Aquella prueba con una calificación de 13 o más alta por el sistema de categorización en el modelo de complejidad. prueba de complejidad moderada Prueba con una calificación de 12 o menos por el sistema de categorización en el modelo de complejidad. pruebas dispensadas Sistemas de pruebas de exámenes de laboratorio con procedimientos simples los cuales son aceptados por la FDA para ser usados en casa; éstas emplean metodologías que son tan simples y exactas como para dar la probabilidad de obtener resultados erróneos insignificantes sin tener riesgo de afectar la salud del paciente si la prueba es realizada incorrectamente. reforzamiento Cuando los directores crean un ambiente propicio en el cual su personal puede aprender, crecer, mejorar, y funcionar eficazmente. 136

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Registro Federal Provee un sistema uniforme para ofrecer al público regulaciones y noticias legales instituidas por agencias federales de Estados Unidos. sistema de información del hospital Minimarcos, macromarcos, o marco principal de computadoras. A través de la realización de análisis en varios especímenes biológicos, el personal del laboratorio de química clínica provee a los médicos de información que puede ser útil en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. El laboratorio no solo debe cumplir con las regulaciones legales de operación, sino que también debe llevar a cabo las pruebas de tal forma que resulten costeables. El balance de estos requerimientos es responsabilidad del personal que administra el laboratorio. La producción de resultados de pacientes requiere de una infraestructura compleja compuesta del sistema de pruebas (analizadores, reactivos, procedimientos de las pruebas, etc.), personal que realice los análisis, personal administrativo y sistemas para la integración de los resultados del laboratorio con un hospital u otro sistema de información. La forma en que el laboratorio debe operar está delineado en gran detalle por regulaciones federales. Las más importantes de éstas se encuentran en las Modificaciones para las Mejoras del Laboratorio Clínico (“Clinical Laboratory Improvement Amendments, 1988” o "CLIA '88", en inglés). Las metas de estas regulaciones son asegurar la calidad de los resultados de laboratorio sin tener en cuenta donde fueron realizadas las pruebas. Estas regulaciones cubren la mayoría de los aspectos de las pruebas de laboratorio, incluyendo pruebas de control externo de la calidad, aprobación de los programas externos de control, administración de las pruebas a los pacientes, control de calidad, personal, aseguramiento de la calidad, inspecciones, y asesorías. Otras regulaciones federales y estatales regulan la eliminación de desechos químicos, uso de sustancias radiactivas, y la seguridad de los empleados, incluyendo el delineamiento de las precauciones universales para el manejo de especímenes biológicos. Debido a la gran influencia de la CLIA '88 en la administración del laboratorio, gran parte de este capítulo se referirá a las secciones de estas regulaciones. Por lo tanto vamos a empezar por revisar los aspectos regulatorios de los laboratorios.

Regulacions En la actualidad una gran parte de la administración del laboratorio está dedicada a asegurar que éste cumpla con las regulaciones federales, estatales, y locales que ahora existen. El laboratorio de un hospital necesita estar certificado por la Administración Financiera del Cuidado de la Salud (“Health Care Financing Administration” o “HCFA”, en inglés), por una agencia privada de certificación, o por una agencia estatal que haya recibido la "categoría de juez." Estas agencias certificadoras inspeccionan los laboratorios para determinar si éstos cumplen con las regulaciones federales, incluyendo la CLIA '88. El Colegio de Patólogos Americanos (“The College of American Pathologists” o “CAP”, en inglés) y la Comisión Conjunta para la Acreditación de Organizaciones del Cuidado de la Salud (“Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations” o “JCAHO” en inglés) son dos de las agencias certificadoras a las que les han otorgado la consideración de jueces para actuar en nombre del 137

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gobierno federal. Los bancos de sangre requieren inspecciones de otras agencias certificadoras. Las regulaciones de la CLIA '88 se aplican en casi todos los laboratorios en los Estados Unidos que estén realizando pruebas para valorar la salud de seres humanos. Las regulaciones están divididas en varias suddivisiones; las subcategorías más importantes son el control externo de la calidad, control de la calidad, administración de las pruebas a los pacientes, y aseguramiento de la calidad.

"Modificaciones Para Mejorar Los Laboratorios Clínicos" O CLIA '88 La sección de control externo de la calidad ("proficiency testing" o "PT", en inglés) enumera las pruebas que serán evaluadas bajo los programas de control externo con regulación federal. También da una lista de las calificaciones necesarias para pasar tales pruebas y la documentación necesaria cuando un laboratorio presenta deficiencias en la prueba de control externo de la calidad. La sección de administración de las pruebas a los pacientes tiene que ver con la requisición de la prueba y el reporte de sus resultados. Esta sección también especifica por cuánto tiempo deben guardarse los registros y define la documentación necesaria para cualquier problema que ocurra en el proceso de reporte. La sección de control de calidad ("CC"), especifica como debe hacerse el control de calidad y con que frecuencia. También cubre todo lo relacionado a los manuales de procedimientos (ver el cuadro abajo) y la documentación necesaria para introducir una nueva prueba al laboratorio. Lab sección de personal define las responsabilidades, educación, entrenamiento, y experiencia requerida para cada posición que el personal ocupe, así como el lugar donde serán llevados a cabo los exámenes de moderada o alta complejidad. La sección de Control de Calidad maneja los diversos monitores que deben ser evaluados para asegurar que el laboratorio esté produciendo un trabajo de calidad. Si todos los monitores son evaluados en un programa consistente, de acuerdo con los lineamientos presentados en esta sección, los laboratorios estarán cumpliendo con la mayoría de las regulaciones y no deben temer a las inspecciones sorpresivas. El proceso de inspección por el organismo llamado Salud y Servicios Humanos (“Health and Human Services” o “HHS”, en inglés) o uno designado por éste se describe en detalle. El fracaso en una inspección o la obstrucción de la misma tendrá severas consecuencias . Otra regulación federal muy importante para los laboratorios es el Acta de Seguridad de la Salud Ocupacional (“Occupational Safety and Health Act”, en inglés) de 1970. Bajo esta acta, la Administración de la Salud y la Seguridad Ocupacional ("Occupational Safety and Health Administration" u "OSHA", en inglés) está autorizada para implementar regulaciones que garanticen la operación de un laboratorio seguro. La OSHA cubre todas las formas de seguridad, desde el ambiente físico hasta el trabajo con sustancias químicas y patógenos sanguíneos. El capítulo 1 discute varios de los aspectos de las regulaciones de la OSHA. Muchas organizaciones han emitido lineamientos concernientes en cuanto al tiempo que deben conservarse los registros de laboratorio (Tabla 2-1). Ya que las agencias que 138

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emiten estos lineamientos también acreditan hospitales y laboratorios; estos lineamientos tienen la fuerza de la ley. El laboratorio debe dedicar tiempo al cumplimiento de estos aspectos, ya que puede ser multado por la violación de cualquiera de las regulaciones federales de la OSHA o la CLIA '88. También se requiere de la certificación de la CLIA '88 para el reembolso del Medicare (un sistema de atención a la salud en los Estados Unidos), que resulta ser otra fuerte motivación para realizar su cumplimiento. Una de las acciones más importantes que el laboratorio puede tomar para asegurar el cumplimiento de las regulaciones es obtener copias de las mismas y ponerlas a la disposición del personal. Otra buena medida es formar un comité regulatorio con representantes de cada sección del laboratorio. El comité puede ayudar a formular las normas y procedimientos necesarios para que el laboratorio realice educación interdepartamental e inspecciones para mantener al día sus responsabilidades. El cumplimiento con las regulaciones sólo se puede alcanzar involucrando a todo el personal. Lo que Debe Incluir Cada Manual de Procedimientos El manual de procedimientos debe incluir lo siguiente, cuando sea aplicable para el procedimiento de la prueba: 1. Requerimientos para la colecta y procesamiento de la muestra así como los criterios de rechazo de la misma. 2. Procedimientos para exámenes microscópicos, incluyendo la detección de laminillas preparadas incorrectamente. 3. Desempeño del procedimiento paso a paso, incluyendo cálculos de las pruebas e interpretación de resultados. 4. Preparación de laminillas, soluciones, calibradores, controles, reactivos, colorantes y otros materiales usados en las pruebas. 5. Procedimientos de calibración y verificación de la calibración. 6. El intervalo de reporte para resultados de pruebas de pacientes establecido y verificado por la CLIA, Sección 493.1213. 7. Procedimientos de control. 8. Acciones correctivas a seguir cuando los resultados de calibración o controles no cumplen los criterios de aceptabilidad del laboratorio. 9. Limitaciones en metodologías, incluyendo sustancias interferentes. 10. Intervalos de referencia (valores normales). 11. Resultados que indican que la vida del paciente está en peligro o valores críticos. 12. Literatura de referencias pertinentes. 13. El criterio apropiado de almacenamiento y preservación que aseguren la integridad de la muestra hasta que las pruebas sean realizadas completamente. 14. Los sistemas de laboratorio para reporte de resultados incluyendo, cuando sea apropiado, el protocolo para el reporte de valores críticos. 15. Descripción del plan de acciones a tomar en el evento de que el sistema repentinamente esté fuera de servicio. 16. Criterios para referir especímenes incluyendo procedimientos para

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su sometimiento y manejo como lo describe la CLIA, sección 493.1103.

Estructura de la Administración Hospitalaria Organización de un hospital El tamaño, la base de pacientes (tipo de paciente con respecto al aspecto socioeconómico), el mercado y las afiliaciones de un hospital afectan la estructura de su organización. La Fig.2-1 ilustra una estructura de organización común para un hospital de 200 a 300 camas. Los hospitales más grandes tendrán una estructura similar. Es importante notar que cada vicepresidente tiene varios departamentos a su cargo. Ya que ellos no pueden ser expertos en todas las áreas, deben trabajar muy de cerca con los directores de cada departamento a su cargo. Cada departamento tiene su propia estructura interna, dependiendo de sus funciones específicas. En general, hay un flujo de responsabilidad desde el administrador de menor categoría hasta el administrador de mayor categoría, llegando hasta el director general. La importancia de los aspectos fiscales es tan grande que la mayoría de los departamentos tienen una línea de responsabilidad directa con el departamento financiero (ya sea que aparezca o no oficialmente en el diagrama de flujo de responsabilidades) para emitir cheques, fondos de investigación y compras. Generalmente existe un pequeño fondo fijo para el mantenimiento de computadoras tanto del hospital como del laboratorio. Las computadoras del hospital procesan información demográfica y financiera de los pacientes, mientras que las computadoras del laboratorio procesan los datos de las pruebas realizadas en el laboratorio (ver Capítulo 18). Organización de un laboratorio de química clínica Los departamentos de patología deben tener un diagrama de flujo general que muestre la relación jerárquica entre las diferentes posiciones del personal en cada laboratorio o sección. Esto ayuda a cada persona a entender la cadena de autoridad. Este diagrama de flujo muestra las líneas de "cortesía" para reportarse, así como el reporte directo y cualquier otro factor ajeno que afecte fuertemente la organización ya estructurada. El esquema típico de un Departamento de Patología se ilustra en la Fig.2-2. Dentro de cada laboratorio clínico, debe haber un diagrama de organización bien detallado que muestre la estructuración de cada sección del laboratorio. En la Fig. 2-3 se muestra el esquema de un laboratorio de química clínica "típico". La subdivisión de un laboratorio clínico en departamentos, secciones o unidades y luego en turnos, debe ser hecha de manera que permita al laboratorio en particular usar el espacio, instrumentos, reactivos y personal eficientemente y de manera flexible para cubrir las demandas del servicio esperado por el laboratorio. Por lo tanto, puede ser que el laboratorio no pueda hacer divisiones en departamentos correspondientes a las especialidades y subespecialidades descritas en las regulaciones finales de la CLIA '88 publicadas en Febrero 28, 1992, en el Registro Federal (“Federal Register” en inglés). Todas las pruebas de laboratorio deben ser realizadas y supervisadas por personal calificado y apropiadamente capacitado (ver abajo y pág. 50). Bajo la CLIA '88, están explícitos los requerimientos de educación, certificación, y experiencia para el director de un laboratorio que realiza pruebas de moderada y alta 140

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complejidad (secciones 493.1405, 493.1406, y 493.1443). Estos requerimientos están resumidos en las Figuras 2-4 y 2-5. También, un profesional con licencia estatal de Doctor en Medicina M.D., Doctor en Osteología D.O., Doctor en Medicina Física D.P.M. o Doctor en Bioquímica puede servir como el consultor clínico del laboratorio; quien se dedica a la interpretación de los datos de pruebas de laboratorio de moderada y alta complejidad para el personal del laboratorio. Si el laboratorio solo realiza pruebas de moderada complejidad, debe contar con un especialista técnico y el personal que realice las pruebas. Si el laboratorio realiza pruebas de alta complejidad, éste debe designar a un supervisor general y a un supervisor técnico. La CLIA '88 define un supervisor técnico como alguien que actúa como supervisor principal del laboratorio (Jefe de Laboratorio), mientras que un supervisor general (Jefe de Sección) actúa como un supervisor inmediato a lo realizado en las mesas de trabajo, revisando el trabajo diario y el control de calidad. Los requisitos de personal de laboratorio bajo la CLIA ‘88 están siendo modificados constantemente. Por favor consulte las regulaciones antes de hacer cualquier decisión.

Habilidades para administrar y características personales Las habilidades para administrar y las características personales de un director de laboratorio determinan el ambiente de trabajo diario en el laboratorio clínico. Un equipo profesional motivado no sólo es capaz de proveer el nivel de servicio esperado por el personal médico, pacientes hospitalizados y pacientes de consulta externa, sino que también es capaz de establecer y alcanzar sus metas estratégicas. En la Tabla 2-2 se enumeran muchas habilidades de administración positivas y características personales. El director del laboratorio debe enfocarse en las habilidades y características que encajan en su propia personalidad y en la personalidad de sus empleados. Además de trabajar con sus fortalezas, los buenos directores de laboratorio deben identificar las debilidades que a través de la educación y el entrenamiento formal pueden convertirse en habilidades o encontrar los recursos (planes, gente) que haya disponibles para compensar esa deficiencia. Aunque el personal técnico del laboratorio recibe entrenamiento para las tareas específicas que desempeña, los directores de laboratorio raramente reciben un entrenamiento en administración. Es importante proveer al director del laboratorio ambos entrenamientos: técnico y administrativo. El estilo personal del director del laboratorio, el cual es el resultado de las habilidades para administrar y las características personales, determinará fuertemente que tan fácil y que tan bien el laboratorio alcance sus metas. La mezcla de las habilidades para administrar y las características personales serán diferentes para cada director exitoso del laboratorio por tres razones básicas. La primera es que cada equipo que dirige la administración de un hospital y cada personal del laboratorio tienen sus propias y únicas personalidades. La segunda es que cada hospital tiene un plan estratégico diferente con metas específicas para ser alcanzadas por el laboratorio, además del mantenimiento de su nivel de servicio. La tercera razón es que la cantidad y tipo de recursos designados al laboratorio para mantener sus operaciones diarias, variarán de institución a institución.

Administración de la Communicación 141

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Comunicación dentro de la organización total El director del laboratorio debe comunicarse efectiva y frecuentemente con los administradores apropiados del departamento y del hospital, departamentos del hospital, comités del hospital, así como con el personal médico, para mantenerlos informados sobre los progresos del laboratorio dirigidos a cumplir las metas del hospital. Esta es también una buena oportunidad para el director del laboratorio de mantenerse informado de cualquier cambio en el plan estratégico o metas, o en la prioridad de éstas. Todas las comunicaciones interdepartamentales deben ser formalmente documentadas. Cuando existan problemas, todos los hechos deben recopilarse y determinarse el impacto que el problema tuvo sobre los pacientes o el nivel de servicio. Se consideran posibles soluciones y se desarrolla un plan de medidas correctivas. El problema, el plan de acción, y su resultado deben ser documentados. Después de un tiempo apropiado, tanto el problema original como la solución deben ser revisados y reevaluados por cada uno de los involucrados. Además de resolver problemas que se presenten en el momento, el director del laboratorio debe usar frecuentemente modos formales de comunicación, para mantener una relación profesional y cooperativa con el personal médico. Los modos de comunicación pueden incluir participación en las rondas médicas diarias, participación en la enseñanza de casos clínicos por departamentos y del hospital en general, y publicación de folletos informativos. Estos recursos permiten que el laboratorio mantenga al personal médico oportunamente informado sobre los cambios en el campo de las ciencias del laboratorio y en el propio laboratorio (por ejemplo, nuevos métodos, disponibilidad de pruebas, o nuevas pruebas) y otorga al personal médico la oportunidad de estar enterado de los futuros cambios. Un cambio en las normas del laboratorio sin la revisión y la conexión con el personal médico apropiado pone tal cambio en riesgo de fracasar. El director del laboratorio también debe ser apto para usar sus habilidades políticas a fin de representar los intereses y preocupaciones del personal del laboratorio ante el hospital entero, especialmente cuando los recursos son limitados, y son necesarios material adicional, espacio y personal. Las habilidades políticas también son requeridas para negociar acuerdos, promover entendimientos y cooperación dentro de la organización total. Nunca será suficientemente enfatizado que se espera que el director del laboratorio además de ser un defensor del laboratorio, sea también un leal miembro del personal administrativo. Comunicación dentro del laboratorio Dos herramientas efectivas que pueden ayudar a los directores de laboratorios a tener éxito son dirección participativa y reforzamiento. Para que estas herramientas sean usadas en forma efectiva, se debe mantener bien informado al personal con información exacta y oportuna. Para una dirección participativa, el personal del laboratorio debe tener un claro entendimiento del nivel de servicio que se necesita proveer (carga de trabajo), las metas a largo plazo que deben ser alcanzadas (plan estratégico) y los recursos que han sido asignados para cumplir con estas tareas. Con esta información, el personal del laboratorio puede participar activamente en la planeación. Después de comunicar claramente las metas del laboratorio, el director puede permitirle al personal que participe en la preparación de los objetivos, la planeación y la solución de problemas. La perspectiva de los químicos y 142

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supervisores es claramente diferente de la del director del laboratorio y cada uno puede contribuir a la planeación general. Ésta es una manera efectiva que tiene el director para establecer visibilidad, accesibilidad, credibilidad con el personal, y ganar confianza y respeto. También dando y recibiendo retroalimentación positiva o negativa, ayuda a motivar al personal para alcanzar sus metas. Ningún director debe asumir que el personal del laboratorio tiene capacidad ilimitada o que no tiene umbral de agotamiento. Con el uso de retroalimentación positiva en forma regular, el personal muy dedicado puede alcanzar metas hercúleas bajo condiciones poco frecuentes. Sin embargo, un buen director reconoce que hay limitaciones para la operación del laboratorio en esta forma. La operación de un laboratorio debe contar con un número apropiado de personal que lleve a cabo las pruebas, con los reactivos y equipos necesarios para procesar la carga de trabajo rutinaria y para lograr las metas del plan estratégico. El director necesita estar en contacto constante con el personal técnico, ya sea directamente o a través del personal supervisor, para monitorear el progreso de las tareas asignadas. Esto puede hacerse en forma de juntas informales en el laboratorio o juntas formales con uno más miembros del personal. Las juntas formales deben siempre tener una agenda. El director puede comunicarse con el personal por memoranda, boletines, correo electrónico, teléfono, o transmisión de facsímiles. Deben hacerse minutas de cada junta con el personal ya sea individual o en grupos. Las minutas deben establecer claramente el resultado de la junta, incluyendo metas que han sido establecidas o acciones que deben ser tomadas. Las minutas de las juntas deben ser distribuidas entre cada uno de los asistentes o entre los que generalmente asisten a una junta. La comunicación frecuente acorta el período de tiempo en el que, el director o el personal, pudieran estar desviados del cumplimiento de las metas y permite una constante revaloración del plan de acción.

Administración del Personal Personal La CLIA '88 ha creado categorías de trabajo para todos los químicos en el laboratorio clínico. También ha establecido requerimientos uniformes que incluyen la educación mínima y experiencia que una persona debe tener para dirigir, consultar, supervisar, o realizar cada prueba específica en especímenes humanos. Estas categorías de trabajo son descritas en las regulaciones finales de la CLIA '88, publicadas en el Registro Federal del 28 de febrero de 1992, y en la corrección de las modificaciones publicadas en el Registro Federal el 19 de enero de 1993, 22 de julio de 1993, 24 de abril de 1995, y el 15 de mayo de 1995. De acuerdo con la CLIA '88, los requerimientos de educación y experiencia para cada categoría de trabajo dependen del grado de complejidad de las pruebas que se realizan en el laboratorio. El modelo de complejidad de pruebas asigna todas las pruebas a una categoría, de cuatro que existen: dispensadas, microscopía realizada por médicos, de moderada complejidad o alta complejidad. La HCFA clasifica cada prueba de acuerdo al método, instrumento, reactivo, y complejidad. Estas clasificaciones de pruebas son publicadas periódicamente en el Registro Federal y hasta que una prueba es clasificada, es considerada 143

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altamente compleja. No existen requerimientos de educación o experiencia para el personal que realiza el reporte de resultados de pruebas dispensadas. Actualmente las pruebas dispensadas incluyen algunos procedimientos usados para pruebas en casa. Si las pruebas realizadas en el laboratorio son clasificadas como de moderada complejidad (es decir que no se realizan pruebas de alta complejidad), el laboratorio debe tener un director, un especialista técnico, un especialista clínico, y personal que lleve a cabo las pruebas. Los requerimientos de educación y experiencia o entrenamiento para cada una de estas posiciones son menos estrictos que aquellos requeridos para los puestos en que se realizan pruebas de alta complejidad. Cuando se realizan pruebas de alta complejidad (ya sea que se realicen o no pruebas de moderada complejidad), el laboratorio debe tener un director, supervisor técnico, especialista clínico, supervisor general, y personal que realicen las pruebas. Este personal debe tener al menos un nivel educativo de técnico o un certificado de preparatoria o su equivalente, y haber estado haciendo pruebas de alta complejidad. Según el documento del 19 de enero de 1993; el trabajo del personal con la última categoría mencionada debe ser revisado dentro de 24 horas por un supervisor. A partir de 1997, los individuos que no tienen un nivel de técnicos en ciencias del laboratorio o que no cumplan con los requisitos del registro federal, sección 493.1489 escritos el 24 de abril de 1995, no serán aceptados para realizar pruebas de alta complejidad. Toda persona elegible para hacer pruebas de alta complejidad también puede realizar pruebas de moderada complejidad. Los directores de laboratorio deben mantenerse actualizados en las adiciones, cambios, y eliminaciones de estas calificaciones del personal a medida que vayan siendo emitidas por la HCFA. El director del laboratorio debe identificar la categoría de cada prueba ya sea de tipo liberado, de moderada complejidad, o de alta complejidad, para que el personal adecuadamente entrenado y supervisado las realice. La mezcla de pruebas, el volumen de ellas, el nivel de servicio incluyendo la frecuencia de la prueba y el tiempo de entrega de resultados, determinarán entonces el número y tipo de supervisores y posiciones del personal que realice las pruebas, que sean necesarias para cumplir con la CLIA '88 y proveer un servicio adecuado.

Descripción de las posiciones de trabajo Cada posición del personal técnico y operativo debe tener por escrito una descripción de trabajo dividida en tres partes. Una parte debe establecer como mínimo el grado de educación y experiencia o entrenamiento requeridos por la CLIA '88 para esa posición. Cada requerimiento adicional formulado por el laboratorio debe ser incluido. La segunda parte debe documentar las pruebas específicas que se deben realizar o supervisar e indicar la clasificación de cada prueba: liberada, moderada, o de alta complejidad. La descripción del trabajo debe indicar si el individuo que desempeña esa posición realizará o supervisará cada análisis. Es esencial verificar los documentos educativos de cada miembro del personal para asegurarse de que cuentan con los requerimientos de la CLIA '88 para realizar, dirigir, o supervisar pruebas específicas. La tercera parte de la descripción del trabajo, contiene como mínimo las responsabilidades generales de una posición específica, los requerimientos de la CLIA '88 que debe cumplir y los estándares para un desempeño aceptable. De acuerdo a los requerimientos en el documento 493.1425 de la CLIA '88, el personal 144

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que realice las pruebas de moderada complejidad será responsables de procesar la muestra, realizar la prueba, y reportar los resultados. a. “Cada individuo sólo realizará aquellas pruebas de moderada complejidad que son autorizadas por el director del laboratorio y que requieren el grado o la habilidad proporcional a la educación, entrenamiento o experiencia y destreza técnica que posee. b. Cada individuo que realice pruebas de moderada complejidad debe: (1) Seguir los procedimientos del laboratorio para el manejo y procesado de la muestra, análisis de la prueba, reporte y mantenimiento de registros de los resultados de las pruebas de pacientes; (2) Mantener los registros que demuestren que se están corriendo muestras de control externo de calidad de la misma forma que se corren las muestras de pacientes; (3) Apegarse a las prácticas de control de calidad del laboratorio, documentar todas las actividades de control de calidad, calibraciones de instrumentos y procedimientos, y mantenimiento llevados a cabo; (4) Seguir las normas y procedimientos del laboratorio establecidos para acciones correctivas cada vez que los sistemas de prueba no estén dentro de los niveles aceptables de desempeño; (5) Ser capaz de identificar problemas que pueden afectar adversamente la realización de las pruebas o el reporte de los resultados y corregir los problemas o notificar inmediatamente al consultor técnico, consultor clínico o director; y (6) Documentar todas las acciones correctivas tomadas cuando el sistema se desvíe de las especificaciones establecidas por el laboratorio”. De acuerdo con el documento 493.1495 de las regulaciones finales de la CLIA '88, para pruebas de alta complejidad, el personal que realice las pruebas es responsable del proceso de la muestra, realización de la prueba, y reporte de los resultados: a. Cada individuo realiza sólo las pruebas de alta complejidad, autorizadas por el director del laboratorio y que requieren el grado o la habilidad proporcional a la educación, entrenamiento, o experiencia y destreza técnica que posee. b. Cada individuo que realiza pruebas de alta complejidad debe seguir las 6 instrucciones de la lista anterior para hacer pruebas de moderada complejidad. Además, aplicar una séptima instrucción y excepción: (7) "Si está calificado bajo la disposición 493.1489(b)(4), debe llevar a cabo pruebas de alta complejidad sólo con supervisión directa de un supervisor general calificado de acuerdo a la disposición 493.1461." c. Excepción: "Para individuos calificados bajo la disposición 493.1489(b)(4), que estuvieron realizando pruebas de alta complejidad el 19 de enero de 1993 o antes, los requerimientos del párrafo (b)(7) de esta sección no son efectivos, siempre que toda prueba de alta complejidad realizada por un individuo en la ausencia de un supervisor general sea revisada dentro de las 24 horas subsecuentes por un supervisor general calificado bajo 493.1461". Una descripción paralela debería ser preparada para cada persona que realiza pruebas, enumerando el nivel de educación de la persona, el grado de complejidad de las pruebas que 145

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puede realizar bajo las reglas de la CLIA y si requiere o no supervisión directa o revisión supervisada. La Tabla 2-3 enumera la información que debe mantenerse en el expediente personal de cada analista.

Horario de trabajo Puede ser que el horario real para el personal de un laboratorio en particular no sea conforme a los tres turnos estándar de 8 horas por día, con miembros del personal trabajando 5-8 horas al día por semana. Existen formatos alternativos de horarios que incluyen el uso de turnos de 10 horas, tiempo flexible, y turnos escalonados. Muchos laboratorios usarán una combinación de todos estos formatos para alcanzar una cobertura completa. Esto permite una sobreposición entre los turnos y aumenta la comunicación entre ellos y una continuidad en el flujo de trabajo. Los directores de laboratorio deben tomar en cuenta las fuerzas y debilidades individuales de los químicos cuando planean un horario de trabajo, incluyendo el equilibrio de los químicos con mayores habilidades, con los de menos habilidades para cada turno. Haciendo una cuidadosa revisión de las estadísticas de la carga de trabajo, el director puede determinar si la carga de trabajo está distribuida en forma equitativa dentro del turno y entre los turnos y programar la distribución de horarios del personal de acuerdo a ella. Algunas áreas de trabajo, tales como el laboratorio de terapia intensiva, son posiciones que siempre requieren la presencia de un químico o analista y deben estar siempre ocupadas por el personal. La distribución del personal en el laboratorio debe tomar en cuenta el número de días que el personal se ausenta por enfermedad, días festivos y vacaciones. Por lo tanto, por cada posición de trabajo cubierta, deben ser contratados entre 1.5 y 2.0 individuos por cada turno para proveer una cobertura de siete días a la semana. Debido a que el costo más grande para el laboratorio es el de mano de obra, la mayoría de los laboratorios intentan incrementar la productividad (precio de la prueba/equivalentes o empleados de tiempo completo) por medio de la automatización o combinando estaciones de trabajo para incrementar la eficiencia (ver Capítulo 16). En la pág. 57 se discuten otros aspectos de productividad (manejo de recursos).

Educación continua y competencia de los empleados Educación continua. Las regulaciones finales de la CLIA '88 establecen que el director del laboratorio o especialista técnico en pruebas de moderada complejidad y el director del laboratorio o supervisor técnico en pruebas de alta complejidad, deben identificar las necesidades de entrenamiento o de educación continua para mejorar las habilidades en el personal. Ellos también deben identificar las necesidades de entrenamiento en cada estación de trabajo y asegurar que cada individuo que esté realizando pruebas reciba entrenamiento interno regularmente, así como la educación apropiada para el tipo y complejidad de los servicios desempeñados por el laboratorio. Por lo tanto, el laboratorio debe mantener una lista actualizada de los programas de educación continua disponibles en la institución o a través de organizaciones profesionales que cubran las necesidades del personal del laboratorio. 146

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El laboratorio puede ofrecer programas sobre temas generales, tales como administración del laboratorio, sistemas de información para laboratorios, regulaciones gubernamentales para el laboratorio, OSHA, seguridad, tecnología del futuro, programas en temas técnicos específicos tales como patofisiología, pruebas en uso actual, e instrumentación. La asistencia a congresos regionales, estatales y nacionales debe ser estimulada cuando los temas y exhibiciones sean pertinentes. La asistencia a todos los programas de educación continua debe ser documentada y mantenida en el expediente personal del empleado. Aptitud de los empleados. El director del laboratorio tiene la responsabilidad definitiva de asegurar la aptitud o competencia y la educación continua del personal que realiza las pruebas según las regulaciones finales de la CLIA '88. Los detalles están especificados en las secciones 493.1413(b)(8,9) y 493.1451(b)(8,9), que establecen que el especialista técnico en pruebas de moderada intensidad y el supervisor técnico en pruebas de alta complejidad, respectivamente, son responsables por: (8) La evaluación de la competencia de todo el personal que realiza las pruebas y por el aseguramiento de que el personal mantenga su competencia para obtener y reportar resultados de una forma rápida, exacta y eficientemente. Los procedimientos para la evaluación de la competencia del personal deben incluir, pero no están limitados a: (i) La observación directa de la realización de las pruebas de rutina del paciente, incluyendo preparación del paciente, si es aplicable, manejo, procesamiento, y análisis de la muestra; (ii) El monitoreo del registro y reporte de resultados; (iii) La revisión de los resultados intermedios o de las hojas de trabajo, registros de control de calidad, resultados del control externo de la calidad y registro del mantenimiento preventivo; (iv) La observación directa del desempeño en el mantenimiento de los instrumentos y revisiones de su función; (v) La valoración de la realización de las pruebas a través de muestras analizadas previamente, tales como la realización de muestras ficticias o pruebas en muestras de control externo de la calidad; (vi) La valoración de las habilidades para resolver problemas; y (9) La evaluación y documentación del desempeño de los individuos responsables de las pruebas de moderada complejidad (especialista técnico) y pruebas de alta complejidad (supervisor técnico), al menos dos veces al año durante el primer año que el individuo trabaja con muestras de pacientes. De ahí en adelante, la evaluación se debe llevar a cabo cada año, a menos que haya cambios de metodología o instrumentos, en tal caso antes de reportar los resultados del paciente, el desempeño del individuo debe ser reevaluado para incluir el uso de la nueva metodología o la instrumentación de prueba." La frecuencia de las evaluaciones puede ser mayor, de acuerdo a las regulaciones locales. Además de evaluar la competencia del empleado bajo los requerimientos de la CLIA '88, se valorará rutinariamente la productividad del personal que hace las pruebas y se discutirá 147

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el logro de la meta general con cada individuo. El personal debería saber porque ellos han tenido un desempeño menor, igual, o mejor de lo esperado y a cada quien se le debe dar los medios adecuados para alcanzar un mejor desempeño. Se debe dar al empleado la oportunidad de hacer comentarios en la revisión. Es importante documentar el proceso entero de valoración, dar copias al empleado y guardar copias en el expediente personal. La documentación de valoraciones razonables y frecuentes es importante para el desarrollo del empleado (ver abajo) y también para proveer el marco de trabajo para las acciones disciplinarias necesarias.

Escalafón de carreras El proceso de entrenamiento continuo y motivación del personal es una parte significativa del trabajo de un director de laboratorio. El trabajo técnico rutinario acoplado con limitadas oportunidades de avance conduce a un alto número de renuncias del personal. El uso de un sistema de escalafón de carrera puede eliminar estos obstáculos y retener al personal. En este sistema, las credenciales y experiencia requeridas para avanzar a la siguiente posición (el siguiente peldaño de la escalera) están claramente delineados. Para establecer un sistema de escalafón de carreras en el laboratorio clínico, se debe formar un grupo de empleados que diseñe y prepare un modelo de programa basándose en las necesidades de los trabajadores y del laboratorio, sometiéndolo después a la dirección para su revisión y aprobación. Una vez aprobado, las etapas de implementación deben ser formalmente establecidas por la dirección y el personal. Este enfoque ayuda a realzar la aceptación del empleado y a concentrar el programa en las necesidades específicas identificadas en el trabajador. El escalafón básico de carreras da la oportunidad de avance a todos los empleados calificados. Para hacer esto posible, es necesario definir las etapas en el escalafón de carreras, junto con las responsabilidades y privilegios de cada una de ellas. Deben ser creadas las nuevas posiciones con responsabilidades intermedias entre las de los químicos y las de los supervisores. Además, cuando sea posible, el director del laboratorio debería de ascender. Este tipo de norma tiende a desarrollar empleados dedicados y leales los cuales pueden moverse vertical y horizontalmente dentro de la organización. Una vez que un plan de escalafón de carreras es aceptado, la dirección se reúne con cada empleado individualmente con el propósito de establecer metas específicas para ese empleado, incluyendo la implementación de lineamientos, tiempo del que se dispone para terminar esa tarea, y los reconocimientos por su éxito. El director del laboratorio debe monitorear regularmente el progreso de cada empleado, dar retroalimentación y estimulación a los empleados para mantenerlos concentrados en el logro de sus metas. Las regulaciones finales de la CLIA '88 establecen que cualquier persona por lo menos con un certificado de preparatoria o el equivalente, puede ser capacitada para realizar pruebas de moderada complejidad (493.1423). Es importante que el entrenamiento impartido así como el desempeño queden documentados antes de que se le permita al empleado analizar muestras de pacientes. Esto hace posible que el personal como flebotomistas y auxiliares estén capacitados para realizar pruebas. Debe establecerse el criterio para la promoción del personal que realiza pruebas, a puestos de supervisión dentro del laboratorio. Asimismo, se deben identificar con el sistema de información del laboratorio las posiciones administrativas o 148

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posiciones auxiliares, programas de largo alcance, y puestos que no son del laboratorio. Los requerimientos de capacitación, educación, y las responsabilidades de trabajo de todas las posiciones deben estar por escrito. Los beneficios de promoción para los empleados es la mayor satisfacción del trabajo, educación adicional, reconocimiento de los logros a través de la retroalimentación, una base para una evaluación más objetiva del desempeño, y compensación monetaria. La capacitación cruzada que permite la rotación de los miembros del personal dentro de muchos departamentos, es otra opción para el escalafón de carreras. La capacitación cruzada sirve para liberar de la monotonía que vive un analista especializado al realizar la misma función de trabajo día tras día. La capacitación cruzada puede ampliar y agudizar las habilidades de los trabajadores, permitiendo a los miembros del personal trabajar con diferentes personas y desarrollar un mejor entendimiento de la operación global del laboratorio. En algunos laboratorios, el entrenamiento cruzado puede ser una necesidad, proveyendo una mayor flexibilidad en el personal, de tal modo que el laboratorio pueda cumplir con las demandas del servicio. El especialista de una determinada área puede promover entrenamiento continuo y competente a los nuevos miembros del personal. Sin embargo, la especialización puede causar problemas de personal debido a la disminución en la flexibilidad.

Administracón De Los Recursos El director del laboratorio es el responsable de administrar los recursos del laboratorio, incluyendo al personal, reactivos, abastecimientos, y capital para equipos. Usando estos recursos, el laboratorio debe proveer los servicios que se esperan del mismo, como lo define el plan estratégico del hospital. El papel del laboratorio se desarrolla durante las discusiones con los usuarios que expresan sus necesidades y lo que esperan de este servicio. Así como el servicio que debe ser provisto, por quién, con qué frecuencia, a qué costo, y a partir de cuando entra en efecto el acuerdo. Es una función del director aceptar el plan estratégico en nombre del laboratorio y usar todos los recursos del mismo para cubrir completamente las metas del plan. Un director competente motiva y refuerza al personal del laboratorio para planear e implementar las tareas necesarias para alcanzar las metas del plan estratégico. Por lo tanto, el director debe promover una atmósfera de libertad y creatividad donde el empleado involucrado sea valorado. Además de introducir nuevas pruebas de diagnóstico para mantener el nivel del servicio en los más altos estándares posibles, cuando sea apropiado, el director buscará nuevos negocios para el laboratorio. Si los consigue, el director debe motivar al personal para que éste comprenda el interés profesional de estas oportunidades. Desde el punto de vista práctico, la administración de recursos es usada para llevar a cabo la operación diaria del laboratorio. Para manejar estas responsabilidades exitosamente, el director prepara una agenda con un plan para ser ejecutado a corto plazo (operación diaria del laboratorio) y otra agenda para el plan a largo plazo (plan estratégico), el cual establece metas para los próximos 5 años. Los recursos deben ser distribuidos con base a los datos actuales, los datos históricos y 149

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las predicciones a cerca de los efectos de las tendencias actuales relacionadas con la operación del laboratorio. En el plazo corto, los incrementos repentinos en la carga de trabajo pueden ser solucionados si el laboratorio tiene el equipo con la capacidad para manejar mayor volumen o equipo de apoyo y personal con entrenamiento cruzado. El uso de tiempo extra, la redistribución del trabajo a otra estación, o el envío de poco volumen de pruebas a un laboratorio de referencia, también puede ayudar. Otra opción es trasladar trabajo a otro turno que tenga la capacidad de realizar la carga extra. Si la tendencia de incremento en la carga de trabajo se refleja en la carga rutinaria, se deben tomar las medidas apropiadas para aumentar personal, reactivos, abastecimientos, y equipo si es necesario. Si la carga de trabajo decrece repentinamente, pueden cerrarse estaciones de trabajo o consolidar las estaciones que tengan capacidad de manejar trabajo adicional. Además, se puede alentar a los miembros del personal del laboratorio que haga uso de sus vacaciones, que tome sus días libres designados, o que trabaje menos horas. El plan a largo plazo está relacionado con la operación del laboratorio en un año o más en el futuro. El director debe seguir muy de cerca la operación diaria del laboratorio, predecir los efectos de las tendencias actuales sobre la operación del laboratorio en el futuro. Específicamente, el efecto de los cambios proyectados en el volumen de muestras, la mezcla de las pruebas en el personal, reactivos, abastecimientos, y equipo, deben ser evaluados para que las demandas del futuro servicio puedan ser cubiertas en forma adecuada. Al planear para el futuro, se deben considerar los siguientes factores significativos: La posibilidad de nuevas regulaciones gubernamentales, la oportunidad de reembolso, la necesidad de control del costo, la existencia de mercado para los servicios del laboratorio, satisfacción del cliente, satisfacción del empleado, y la competencia existente. Por otra parte, el director del laboratorio debe estar enterado de los avances tecnológicos que pueden incrementar la productividad del laboratorio. Es crucial que el director comunique regularmente al personal acerca de los cambios que influencian fuertemente la operación diaria del laboratorio y acerca de los cambios que pueden afectar el laboratorio en el futuro. Es importante que todos los miembros del personal participen en el proceso de planeación provisional o final para acomodar esos cambios.

Administración Financieria Presupuesto El director del laboratorio tiene la responsabilidad de preparar el presupuesto del laboratorio para asegurar la operación de éste dentro de lo presupuestado. Los supervisores y jefes de sección deberían participar en la preparación del presupuesto al hacerse responsables del presupuesto de su respectiva sección. El presupuesto es preparado usando cifras reales de los gastos operativos corrientes, ganancias, utilización de datos, y demografía de pacientes. Cualquier factor que pueda tener un efecto material en la operación financiera del laboratorio durante el presupuesto actual y el de los siguientes años, se toma en cuenta cuando se planea el presupuesto. Entre más grande sea el nivel de servicio demandado, mayores serán los gastos básicos de operación, porque será necesarios más personal, reactivos, y equipo. Deben considerarse incrementos en los 150

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gastos básicos cuando se analicen las ganancias por el incremento de pruebas. Una vez que el presupuesto ha sido aprobado por la administración, éste es verificado por el director del laboratorio para asegurar que todas las provisiones sean exactas. La verificación real del presupuesto puede ser hecha por aquellos que están más familiarizados con cada componente de la operación en el laboratorio. Los documentos de apoyo que fueron usados para preparar el presupuesto también se usan para este proceso. La presentación del presupuesto debe ser fácil de leer y entender, de tal modo que pueda ser monitoreado para identificar e investigar rápidamente variaciones más allá de los límites establecidos. Los gastos, ganancias, y la utilización de líneas de artículos por cada unidad de laboratorio debe ser definida individualmente para facilitar su monitoreo y asegurar que se está respetando lo presupuestado. La línea de artículos para cada unidad financiera y operacional del laboratorio, puede incluir mano de obra y prestaciones, surtido de artículos para las pruebas, artículos que no se usan en las pruebas, reactivos, contratos de renta o préstamo de equipos, contratos de servicios, reparaciones y mantenimiento, pago de pruebas enviadas a otros laboratorios, utilización individual de cada prueba, otros cargos a pacientes externos/internos, ganancias (colectados ya sea liquidadas totalmente o parcialmente), y el balance negativo. Los registros utilizados para preparar el presupuesto en vigencia deben ser retenidos con el propósito de poder investigar rápidamente las variaciones que se presenten en cada línea. Es importante hacer reportes mensuales para comparar el desempeño actual de cada unidad con el que se proyectó en el presupuesto. El laboratorio debe establecer criterios para investigar las variaciones del presupuesto. Las explicaciones de la variación inaceptable en los gastos de una línea de artículos, deben describir la variación como una tendencia, una fluctuación al azar, o un cambio real causado por cambios en la periodicidad de las órdenes o en los patrones de pago, cambios en carga de trabajo, problemas relacionados con el personal, o cambios operacionales. La explicación debe incluir cualquier acción correctiva que se siga. Las notas guardadas durante la investigación de las acciones correctivas serán de gran ayuda para la preparación del próximo presupuesto. Pueden usarse comparaciones entre el desempeño del presupuesto de un año a la fecha, con ambos, el presupuesto que se predijo y el presupuesto del año pasado, para mostrar tendencias en una línea específica de artículos. Estas tendencias a veces pueden ser vistas sólo con el presupuesto en un artículo particularmente y no en el presupuesto entero del laboratorio. El estudio de las comparaciones mensuales y las de un año a la fecha permiten al director del laboratorio revisar la variación específica de cada unidad y seguir una acción correctiva para ajustar el presupuesto de una unidad o del laboratorio total. El entendimiento de estas variaciones del presupuesto permitirá al director preparar futuros presupuestos que reflejen aspectos de las ganancias y gastos con más exactitud.

Justificación del capital La mayoría de los laboratorios requieren justificar el capital de las compras por una sola vez con costo por arriba de una cierta cantidad, por ejemplo $ 500. El grado de los detalles requeridos para justificar una compra, puede variar según el costo de la misma. Si el equipo es comprado para pruebas de laboratorio, entonces la justificación debe detallar claramente el costo del artículo, la instalación, abastecimientos, reactivos, controles, 151

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estándares, y contrato de servicio. El director calcula el costo por resultado reportable, tomado en cuenta el tamaño y frecuencia de las corridas, frecuencia de calibraciones, ya sea que el equipo será usado para pruebas de urgencias o pruebas de rutina o ambas, si las muestras se analizarán una vez o por duplicado, se incluye también el número analizado de controles, estándares, y muestras repetidas en una corrida. El costo de la mano de obra por prueba, debe ser calculado exactamente. Finalmente, una comparación financiera y operacional del método propuesto con el método existente debe mostrar menor costo y una justificación sustancial del capital. Cuando se adquiere una pieza o instrumento capital, es deseable una máxima flexibilidad para obtener un instrumento de “tecnología moderna”, mediante la disminución del período del tiempo que el laboratorio es obligado a utilizar un instrumento específico. Por lo tanto, el director del laboratorio debe evaluar cuidadosamente el costo de compra, arrendamiento, renta o el costo de las rentas de reactivos de un instrumento. Cuando un instrumento es adquirido a través del plan de renta de reactivos, al laboratorio le cobran los reactivos (el vendedor incluye el precio del equipo en el costo de los reactivos) a un precio previamente acordado. El laboratorio hace el contrato para la compra de una cantidad mínima de material para las pruebas, basado en las necesidades actuales y futuras. La Tabla 2-4 compara los costos de renta de reactivos con los costos de compras directas. El tipo de decisiones de compra descrito en la Tabla 2-4 está basado en el flujo de efectivo. Si no hay capital disponible, se puede adquirir el equipo por renta de reactivos. Sin embargo, la compra de equipo usando el programa de renta de reactivos resulta más costosa que la compra directa. Esto es porque el hospital normalmente obtiene el reembolso por el Medicare y otros pagos con base al capital gastado. Si se usa la renta de reactivos, no hay reembolso de capital. Si se usa el flujo de efectivo, entonces se puede usar un arrendamiento. Por este medio, el costo mensual es cargado junto con el costo de reactivos. Este costo capital generalmente se puede someter para reembolso. A veces los fabricantes ofrecen incentivos adicionales cuando más de una unidad es obtenida. Como se dijo antes, es necesario realizar un análisis de costos para cada prueba que está siendo considerada y preparar una declaración en una proforma financiera del equipo que se pretende adquirir. También debe tomarse en cuenta el costo de la evaluación, y el establecimiento del método de adquisición escogido debe tomarse en cuenta. En todos los casos, el análisis de costos y la proforma financiera deben estar claramente escritos y documentados con todos los datos que lo apoyen, anexos al reporte escrito. También se incluye una copia del contrato con el fabricante.

Compras Los abastecimientos, reactivos, y equipo son comprados con fondos asignados al presupuesto del departamento. Para estar dentro del presupuesto, el director del laboratorio, el personal y el departamento de compras deben trabajar en equipo para asegurar los precios más bajos por parte de los vendedores, contratistas nacionales y varios grupos compradores. Antes de tomar la decisión de ordenar una compra se debe evaluar el precio, localización de los centros de distribución, disponibilidad de los productos, y servicios de atención al cliente por parte de las empresas comerciales. Puede ser necesaria la compra de un reactivo específico o material más caro en lugar del artículo genérico de menor precio, con el propósito 152

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de tener la certeza en la exactitud de los resultados y en la función adecuada de los sistemas de prueba. El departamento de compras tiene que ayudar en la negociación de descuentos por mayoreo y en la obtención de los mismos números de lote por un largo tiempo para alargar más la consistencia en los resultados. El CLIA '88 estipula (493.1218) la obligación de verificar los nuevos lotes de reactivo o aún nuevos envíos del mismo lote, para su utilidad. Uno de los mayores problemas que enfrentan los hospitales es el flujo de efectivo, es decir, la suficiente colección de fondos para pagar a tiempo sus gastos. Por esta razón, las opciones alternativas de compras se han vuelto comunes en el marco del laboratorio. Sin embargo, al hacer estas transacciones es importante tomar en consideración el costo del préstamo.

Contabilidad de costos La contabilidad de costos es un método por medio del cual todos los costos asociados con la producción y adquisición de un artículo particular son identificados. En el laboratorio clínico, esto se aplica primordialmente al cálculo del costo por resultado de prueba reportable. Entre más detallado y completo sea el análisis, más exacta y útil será la determinación del costo. La Tabla 2-5 propone una lista de costos para ser incluidos en el análisis. El uso de un análisis completo, puede descubrir factores de costo que estaban bloqueados y que tienen un impacto significativo en el cálculo del costo real por resultado reportable. Resulta ventajosa la comprensión de cuáles factores tienen el mayor efecto en los costos de las pruebas y cuáles son los factores que son afectados por el equipo o la metodología, dentro del propio laboratorio. Este tipo de análisis también ofrece ventajas al comparar un nuevo método o procedimiento de prueba contra uno existente, para calcular con mayor exactitud el costo real por resultado reportable. La meta final de la contabilidad de costos es la determinación del costo real de la prueba. Esto le permite al director del laboratorio ofrecer mejores precios en un lugar con mercado competitivo. La manera más simple para realizar la contabilidad de costos es usar un paquete (software), como el SUMITTM el cual ha sido designado específicamente para la contabilidad de costos del laboratorio.

Revisión general de los aspectos de reembolsos Los reembolsos en un ambiente hospitalario se refieren al proceso por el cual se reciben los pagos por parte de instituciones como Medicare y Medicaid, compañías aseguradoras privadas, Organizaciones Médicas de Salud (“Health Medical Organizations” o “HMO” en inglés), y pacientes. Los cobros a los pacientes privados o particulares es la entrada más pequeña en la mayor parte de las instituciones y estos pacientes son el único grupo que paga la cantidad completa de su cuenta. La mayoría de los otros clientes negocian tarifas de descuentos con el hospital o con el laboratorio. El Medicare paga una tarifa básica por diagnóstico. Esta tarifa básica está basada en el sistema llamado DGR (Diagnosis Related Group). Este pago básico es fijo para cada enfermedad diagnosticada y cubre todos los servicios a pacientes hospitalizados, incluyendo pruebas de laboratorio realizadas durante la estancia del paciente en el hospital. El reembolso por Medicare está dividido en dos categorías: Parte A y Parte B. Es decir que, la Parte A hace los pagos por servicios de pacientes hospitalizados, mientras que la 153

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Parte B hace los pagos por los servicios médicos y pruebas de laboratorio en pacientes externos. Si las pruebas de laboratorio de un paciente son realizadas dentro de las 72 horas de su admisión, entonces los hospitales deben solicitar su inclusión para cobertura bajo el pago por DRG en lugar de cobrarlos por separado. El reembolso de todas las pruebas de pacientes externos se hacen de acuerdo a un número de código. Estos números, llamados Terminología Común de Procedimientos ("Common Procedure Terminology" o “CPT”, en inglés), son constantemente actualizados y modificados. El laboratorio debe tener una copia actualizada de los códigos de cobro. El Medicare generalmente reembolsa a los hospitales algunos gastos capitales usando una fórmula basada en los gastos. El Medicare, sin embargo, tiene un plan progresivo que hará un pago fijo por capital gastado de cada paciente tratado que tenga Medicare. Este nuevo plan de reembolso produce en el laboratorio el efecto de forzarlo a trabajar más como un negocio. El reembolso se basará en un pago con capital de aproximadamente $400 por paciente dado de alta. Menos pacientes significa que hay menos dinero disponible para gastos de capital. También, si un hospital no hace una compra con capital, de todas formas recibe el mismo dinero. Esta póliza puede conducir a los laboratorios a retener el equipo por períodos de tiempo más largos. Entonces el reembolso puede ser contabilizado como ganancia. Este plan, sin embargo, puede retrasar a una institución en la adquisición de nuevo equipo de alta eficiencia, que resulta necesario para mantener la competitividad.

Manejo de la Información El Capítulo 18, Sistemas de Información del Laboratorio, SIL (“Laboratory Information Services o "LIS", en inglés), revisa el uso de un SIL para manejar la información e incrementar la productividad del laboratorio. Para manejar la información se usan algunas herramientas tales como los reportes financieros y de utilización generados por el SIL. La Tabla 2-6 enumera varios de los reportes de utilización que deben ser revisados en forma rutinaria por el director del laboratorio. Las listas de reportes de producción del trabajo pueden ser encontradas en la pág. 332 capítulo 18. Al preparar un sistema de administración para evaluar el desempeño del laboratorio, es importante que el sistema incluya monitoreos en los cuatro aspectos de operación. Estos incluyen: Desempeño Financiero Productividad Utilización Tiempo de Entrega de Resultados La siguiente sección resume brevemente muchos indicadores claves para cada aspecto de las operaciones. El sistema de monitoreo debe evaluar cada sección individualmente (por ejemplo, química, hematología, y microbiología) y al laboratorio como un todo.

Desempeño financiero Los reportes financieros del SIL deben proveer información exacta, detallada, y 154

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actualizada de los gastos reales del laboratorio comparados con aquellos planeados en el presupuesto. Sin embargo, estos reportes financieros no le informan al director que tan bien se está desempeñando el laboratorio, comparado con otros en hospitales de similar tamaño, agudeza, localización, y nivel de servicio. La subscripción a un sistema de base de datos como el LABTRENDS* permite hacer tal comparación. Las comparaciones pueden hacerse en áreas específicas del laboratorio y se pueden evaluar diferencias significativas para tomar medidas correctivas que mejoren la productividad, gastos o ganancias. El costo promedio por prueba realizada es una medida excepcionalmente importante del desempeño de la operación. Ya que la mano de obra y los abastecimientos constituyen alrededor del 70% al 75% del presupuesto de la mayoría de los laboratorios (incluyendo prestaciones de los empleados, gastos de depreciación, y compensación a patólogos), es importante monitorear estos elementos de costos del laboratorio. Las reparaciones, mantenimiento preventivo, y pruebas de referencia a otros laboratorios generalmente representan del 3% al 10% del presupuesto de la mayoría de los laboratorios. Los monitores de estos costos se muestran en el cuadro abajo.

Monitores de Desempeño Financiero Costo/Por prueba realizada en el laboratorio Gastos de Compensación y Prestaciones/ Prueba Realizada Gastos de Compensación y Prestaciones/ Hora Gastos de Abastecimientos/ Prueba Realizada Costo/ Prueba Referida Gastos de Reparaciones y Mantenimiento Preventivo/ Prueba Realizada Compensación a Patólogos como Porcentaje del Gasto Total del Laboratorio

Productividad La medición de la productividad general del laboratorio y de cada una de las secciones, debe ser parte del desempeño de cualquier sistema operacional desarrollado. La revisión de la productividad debe incluir los siguientes monitores: Número de pruebas realizadas/Personal de tiempo completo (FTE) para la realización de las pruebas (incluyendo el tiempo del supervisor) (asignado a una estación específica de trabajo) Número de pruebas realizadas/ total del personal de tiempo completo Número de pruebas realizadas/ hora trabajada Horas trabajadas como porcentaje de horas pagadas En el pasado, los laboratorios usaban las unidades de carga de trabajo del CAP como un indicador de productividad. Estas unidades asignaban un cierto número de unidades de trabajo para cada procedimiento de laboratorio basado en el tiempo requerido para realizar el procedimiento. Los laboratorios podían entonces comparar sus valores de productividad actual con un número calculado, basado en los procedimientos que ellos realizaron. Sin 155

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embargo, estos números fueron resultando irreales y en 1992 el CAP descontinuó su plan de carga de trabajo. Éste ha sido reemplazado por un sistema que usa algunos de los parámetros enumerados arriba. El uso de los parámetros de arriba y la comparación del laboratorio con una base de datos como LABTRENDSTM o el programa del CAP; el LMIPTM, permite al director del laboratorio ver que tan eficiente es su laboratorio comparado con otros laboratorios similares. Esta comparación puede entonces ser usada para ayudar a justificar personal adicional sí el laboratorio está operando con personal insuficiente (productividad más alta que la promedio), comparado con la media de la base de datos de comparación.

Utilización de las pruebas Es ampliamente aceptado que la utilización que el personal médico hace que las pruebas de laboratorio, varíen significativamente de hospital a hospital y no está manejado exclusivamente por la agudeza (medida indicadora de la gravedad del paciente) o demandas de los pacientes. La utilización de las pruebas de laboratorio en los hospitales con pacientes internados con similares agudezas o programas (por ejemplo, transplante de órganos o SIDA, etc.), tiene diferencias sustanciales en el índice de utilización del laboratorio. Los sistemas que son usados para el monitoreo del desempeño operacional incluyen la utilización de indicadores clave mostrados abajo. Número de pruebas realizadas en pacientes hospitalizados/paciente por día. Número de pruebas realizadas en pacientes hospitalizados/pacientes dados de alta. Algunos hospitales pueden realizar una revisión de la utilización de pruebas para ciertas áreas o médicos individuales, como un intento de controlar la sobreutilización de los recursos del laboratorio.

Tiempo de entrega de resultados Una revisión estadística de los tiempos de entrega de resultados ("Turnaround Time" o "TAT", en inglés) puede ayudar al director del laboratorio a entender y evaluar mejor el desempeño operacional. Ya que las demandas del servicio pueden afectar grandemente los patrones del personal, instrumentación determinada, y costos de mano de obra, es importante medir los TATs reales para determinar si se están cumpliendo los TATs que el personal médico del hospital espera. El sistema de monitoreo de los TATs debe incluir entre 20 y 30 pruebas de las más comúnmente realizadas en el laboratorio, también como aquellas pruebas que requirieren un TAT especialmente corto (por ejemplo, pruebas de urgencia y pruebas de embarazo). Hay varias formas de monitorear los TATs por nombre de prueba. Una metodología común identifica y sigue la distribución de los TATs basados en el tiempo transcurrido desde que la prueba fue ordenada hasta que se entregó el resultado. Es también importante evaluar tres diferentes etapas de los TATs: la fase preanalítica, analítica, y postanalítica. Para monitorear los TATs de esta manera, el software del SIL necesita identificar la hora de 156

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colección de la muestra, la hora a la que el laboratorio tuvo acceso a la muestra, y la hora a la que el médico recibió el resultado.

Mejoramiento Continuo de la Calidad El Mejoramiento Continuo de la Calidad ("Continuous Quality Improvement" o "CQI", en inglés) es un proceso que usa el laboratorio para asegurar que el resultado correcto es reportado para el paciente correspondiente en un tiempo oportuno. Estos procesos han sido requeridos por la JCAHO por algún tiempo. Recientemente ha sido ordenado por la HCFA en la legislación de la CLIA '88. Este proceso involucra los indicadores de la evaluación del aseguramiento de la calidad ("AC") que monitorean el nivel de desempeño en el laboratorio. Una meta de desempeño se realiza, si después del monitoreo, algún indicador sugiere que el desempeño no cumple con lo establecido. Entonces debe tomarse una acción correctiva para superar la deficiencia. Para saber si el problema ha sido corregido, es necesario monitorear nuevamente el mismo indicador. Si no, se pondrá en función un nuevo plan hasta que el desempeño del indicador sea satisfactorio. El ejemplo de una forma de monitoreo del desempeño está mostrado en la Fig. 2-6. En la preparación de un programa del aseguramiento de la calidad se debe establecer una meta. Un ejemplo, como se describe en la Fig. 2-6, sería "monitorear, evaluar y mejorar, si es necesario, el TAT de urgencias de los análisis de HCG." Después de haber decidido una meta junto con el director del laboratorio, se debe establecer un comité representativo del AC (Aseguramiento de la Calidad). Este comité estará compuesto por un representante de cada sección del laboratorio. El director del laboratorio debe estar involucrado en el proceso del mejoramiento continuo de la calidad para que éste sea efectivo. El comité debe establecer los parámetros que serán monitoreados así como los valores indicados para un indicador determinado. Los monitoreos pueden variar debido a las características individuales de cada operación en los diferentes laboratorios, pero la CLIA '88 demanda que sean evaluados, como mínimo, los índices mostrados en la sección “Aseguramiento de la Calidad de los Monitores.” Se recomienda al lector obtener copias del Registro Federal del 2/28/92 y 1/19/93 para una descripción completa del proceso de AC de la CLIA '88, subdivisión P 493.1701-493.1721.

Monitores de aseguramiento de la calidad 1. Administración de las pruebas de pacientes Basado en los resultados de sus evaluaciones, el laboratorio debe monitorear, evaluar, y revisar, si es necesario, lo siguiente: a. El criterio establecido para la preparación del paciente, colección, etiquetado, conservación, y transportación de las muestras; b. La información solicitada y obtenida en las solicitudes de pruebas de laboratorio para determinar si está completa, su relación con la información y la necesidad de realizar las pruebas en la muestra del paciente; c. El uso apropiado del criterio establecido para el rechazo de muestras; d. El llenado, utilidad y exactitud de la información reportada de la prueba que es 157

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necesaria para la utilización e interpretación de los resultados; e. El tiempo del reporte de los resultados basado en la prioridad de las pruebas (urgencias, rutina, etc.); y f. La exactitud y confiabilidad de los sistemas de reporte, apropiado almacenamiento de los registros y recuperación de resultados de las pruebas. Evaluación del CC El laboratorio debe tener un mecanismo continuo para evaluar las acciones correctivas tomadas bajo "Acciones de Remedio": 493.1219. Los procedimientos y políticas no efectivos, deben ser revisadas con base al resultado de la evaluación. El mecanismo debe evaluar y revisar la efectividad de las acciones correctivas tomada para: a. Problemas identificados durante la evaluación de la calibración y control de datos de cada método de prueba; b. Problemas identificados durante la evaluación de los valores de las pruebas de los pacientes con el propósito de verificar los intervalos de referencia del método de una prueba; y c. Errores detectados en resultados reportados. Valoración del control externo de la calidad En la subdivisión H de esta división, del Control Externo de la Calidad, se debe evaluar la efectividad de las medidas correctivas que se tomaron para remediar los resultados insatisfactorios, inaceptables o no exitosos. Comparación de resultados de pruebas a. Si el laboratorio realiza la misma prueba usando diferentes metodologías o instrumentos, o realiza la misma prueba en diferentes sitios, éste debe contar con un sistema semestral que evalúe y defina la relación entre los resultados de pruebas provenientes de diferentes metodologías, instrumentos, o sitios de prueba. b. Si el laboratorio realiza pruebas que no están incluidas en la subdivisión I de esta división, de los Programas de Control Externo de la Calidad, éste bebe contar con un sistema de verificación de la exactitud de sus resultados al menos dos veces por año. Relación entre la información del paciente y sus resultados Para el Aseguramiento de la Calidad interno (“Quality Assurance” o “QA”, en inglés), el laboratorio debe tener un mecanismo para identificar y evaluar los resultados de las pruebas de los pacientes que parecen ser inconsistentes con el criterio clínico del paciente, tales como: a. Edad del Paciente; b. Sexo; c. Diagnóstico o datos clínicos pertinentes, cuando sean provistos; d. Distribución de los resultados de pacientes, cuando estén disponibles; y e. Relación con otros parámetros de prueba, cuando estén disponibles dentro del laboratorio. Evaluación del personal El laboratorio debe tener un mecanismo continuo para evaluar la efectividad de sus políticas y procedimientos para asegurar la competencia de sus empleados y, si es aplicable, la competencia de sus especialistas. Comunicaciones El laboratorio debe contar con un sistema para la documentación de problemas que

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ocurren como resultado de falta de comunicación entre el laboratorio y el individuo autorizado, que ordena o recibe los resultados de los procedimientos de las pruebas o exámenes. Cuando sea necesario deben tomarse medidas correctivas para resolver y minimizar los problemas de falta de comunicación. 8. Investigación de quejas El laboratorio debe tener un sistema que asegure que todas las quejas o problemas reportados al mismo sean documentadas. La investigación de las quejas deben hacerse cuando se hayan instituido las acciones correctivas apropiadas. 9. Revisión del aseguramiento de la calidad ("AC") con el personal El laboratorio debe tener un mecanismo de documentación y valoración de los problemas identificados durante las revisiones del aseguramiento de la calidad y debe discutirlos con el personal. Es importante que el laboratorio tome las medidas correctivas necesarias para evitar recurrencias. 10. Estándares; registro del aseguramiento de la calidad (AC) El laboratorio debe mantener la documentación de todas las actividades del AC incluyendo problemas identificados y medidas correctivas tomadas. Todos los registros del AC deben estar disponibles para el HHS y ser mantenidos por un período de 2 años. Después de establecer los monitoreos, el comité debe decidir con que frecuencia serán examinados. Algunos, como los TATs pueden ser evaluados mensualmente hasta que el tiempo esperado se cumpla repetidamente. Otros, seguirán diferentes programaciones. Por ejemplo, la documentación del control externo de la calidad se puede monitorear cada cuatro meses cuando el laboratorio realice dichas pruebas. El proceso de mejoramiento continuo de la calidad ("CQI") es esencial, pero consume mucho tiempo, por lo que el comité debe balancear la necesidad de monitorear el CQI contra el hecho de que el laboratorio debe cumplir con una carga diaria de trabajo. Después de evaluar los monitores, el comité debe formular un plan para mejorar aquellos monitores que no cumplen con lo esperado. Después de poner en marcha un nuevo proceso se inicia otra vez un monitoreo. Es importante revisar los resultados de AC con el personal para asegurar su introducción.

Referencias Managing Director, World Wide Health Care Consulting, Surprise, AZ, Director of Chemistry Columbus Hospital Chicago, IL Clinical Laboratory Consultant, World Wide Health Care Consulting, Surprise, AZ, Microbiology Consultant, LaGrange Memorial Hospital LaGrange, IL. Manager of Laboratory Services, LaGrange Memorial Hospital, LaGrange, IL. Laboratory Administrative Director, Alexian Brothers Medical Center, Elkgrove Village, IL.

General Davidson, J.P.: Are you entrepreneurial material? Clin Lab Manage Rev 4(3):192- 195, 1990. Fritz, R.: I'm your new boss . . . why are you laughing? Clin Lab Manage Rev 6(2): 162-163, 1992.

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Regulaciones Federal Register, 56(235): 64175-64182, December 6, 1991. Federal Register, 57(40): 7001-7186, February 28, 1992. Federal Register, 58(11): 5211-5237, January 19, 1993. Federal Register, 58(139): 39154-39156, July 22, 1993.

Administración de la estructura hospitalaria y administración de la comunicación Haynes, M.E.: How to conduct quality meetings, CLMR, 4(1):29-36, 1990. Hunt, L.B.: Here's how you can harness the positive energy of conflict, CLMR, 6(5):456-459, 1992. Ketchum, S.M.: Overcoming the four toughest management challenges, CLMR, 5(4):246-263, 1991. Lussier, R.N.: Assigning tasks effectively using a model, CLMR, 6(2):150-153, 1992. Miner, F.C.: If two heads are better than one, why do I have bruises on my forehead?, CLMR, 5(5):386-393, 1991. Pfeiffer, I.L., and Dunlap, J.B.: Empowered employees--a good personnel investment, CLMR, 6(2):154-161, 1992. Rinke, W.J.: Establishing a shared vision in your organization, CLMR, 3(2):95-99, 1989. Veninga, R.L.: Crisis management: strategies for building morale in uncertain times, CLMR, 6(5):449-455, 1992. Young, S.: Developing your political skills, CLMR, 3(2):100-102, 1989. Baytos, L.M.: Launching successful diversity initiatives, HR Magazine, 37(3):91-97, 1992.

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Administración de recursos Hinterhuber, H.H., and Popp, W.: Are you a strategist or just a manager? Harvard Business Review, 70(1):105-113, 1992. Reeves, P.N.: Strategic planning for every manager, CLMR, 4(4):272-275, 1990.

Administración financiera Brase, S.J., and Matysik, M.K.: Laboratory manager's financial handbook, CLMR, 6(2):164-169, 1992. Carpenter, R.B.: Laboratory cost analysis: a practical approach, CLMR, 4(3):168-177, 1990. Getzen, T.E.: Laboratory manager's financial handbook: What is value?, CLMR, 6(3):237-240, 1992. Kisner, H.J.: Laboratory manager's financial handbook: expense management-supplies, CLMR, 6(4):341-348, 1992. Melbin, J.E.: One for all, MT Today, December 7, 1992, 8-9. Patterson, P.P.: Cost accounting in hospitals and clinical laboratories: Part II, CLMR, 3(1):26-33. Portugal, B.: Factors influencing relative financial performance of hospital laboratories, CLMR, 3(2):81-87, 1989.

Administración de la información mejoramiento continuo de la calidad 160

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Bull, G., Maffetone, M.A., and Miller, S.K.: As we see it: Implementing TQM, CLMR, 6(3):256-261, May/June, 1992. Clark, G.B.: Quality assurance, an administrative means to a managerial end, CLMR, 6(5): Part I 4(1):7-17, 1990; Part II, 4(4):224-252, 1990; Part III, 5(6):463-475, 1991; Part IV, 6(5):426-440, 1992. Westgard, J.O., Barry, P.L., and Tomar, R.H.: Implementing total quality management (TQM) in health-care laboratories, CLMR, 5(5):353-370. 1991.

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Tablas Tabla 2-1

Lineamientos para guardar los registros de laboratorio

Tipo de registro

Tiempo de retención del registro (años)

Observación

General§ Solicitudes de pruebas

2*

Registros de pruebas

2†

Reportes de pruebas

2†

Control de calidad

2†

Manual de laboratorio para procedimientos de prueba

2*

Registros de pruebas de competencia y de acciones de remediación

2*

Mantenimiento del instrumento

Vida del instrumento†

Personal

30†

Laboratorio clínico

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Registro de ingreso y pruebas del paciente

2†

Muestras

24 horas†

Desde la fecha del reporte, de manera preliminar o final Dos años después que la prueba es descontinuada

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Sustancias controladas

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Radioucleótidos

3†

Sustancias peligrosas/ enfermedades infecciosas Capacitación de empleados

3‡

Historia médica y de exposición de empleados

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Exposición a formaldehído y a benceno

30‡

Registros de capacitación

3

Treinta años después del empleo

Desde la fecha de capacitación

De: Passay R: Med Lab Observer, Feb, 1993. *Regulaciones de la CLIA '88. †Colegio de Patólogos Americanos. ‡Administración de Seguridad y Salud Occupacional (OSHA). §La CLIA establece que los registros deben conservarse por tres años si el tiempo de retención ne es mencionado específicamente en las regulaciones.

Tabla 2- 2. Habilidades de administración y características personales deseables en los directores de laboratorio. Analítico Comunicativo

Competente Articulado

Justo Comprensivo Objetivo Exacto

Informado Político Puntual Proveedor de liderazgo Con recursos

Visionario

Compasivo Proveedor de retroalimentación Considerado Oyente Responsable Racional Creíble

Honrado Astucia financiera Entendido en SIL Organizado Respetuoso Habilidad para delegar Establecedor de metas

Tabla 2-3. Información útil para ser mantenida en el expediente de cada empleado. cumplimiento de estándares Solicitud de empleo incluyendo experiencia en el área Educación y certificación pertinente Nivel de Complejidad de Pruebas (CLIA"88) que el empleado puede realizar Si el empleado requiere supervisión directa Areas donde el empleado es competente Evaluaciones periódicas para la competancia

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Registro de Educación Interna Registro de Entrenamiento en Medidas de Salud y Seguridad Asistencia a Cursos de Entrenamiento Registro de Vacunas tales como la de Hepatitis B, o una declaración por escrito del rechazo a recibirla CLIA, Clinical Laboratories Improvements Amendments

Tabla 2-4. Comparación entre compras directas* y renta de reactivos. Compras directas

Renta de reactivos

Precio del Instrumento Costo del reactivo/prueba **,+, × Pérdida del interés del Volumen de pruebas/año × 5 años dinero por 5 años Costo total por 5 años Contrato de servicio por 4 años Costo del instrumento por 5 años Costo del instrumento por 5 años Costo del reactivo**/prueba × Volumen de pruebas/año × 5 años Costo Total por 5 años * añadir lineas individuales para sumar costos. ** Incluir volumen de calibradores y controles. + Asumir que el servicio está incluido por 5 años.

Tabla 2-5. Costos directos sobre costos indirectos. Costo directos

Costos Indirectos

Reactivos Mano de obra Costos de equipo Costos de servicios Colección de suministros Suministros para las pruebas Material de control de calidad Depreciación

Depreciación acumulada Hospital general Laboratorio general Gastos Contables Gastos regulatorios Administración laboral Gastos de SIL

Tabla 2-6. Ejemplos de reportes de administración de laboratorio provistos por un SIL.

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Tipo de Reporte

Función

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número total de personal del laboratorio. Monitoreo de tendencias de cargas de trabajo. Carga de trabajo por turno

Monitoreo adecuado del número de personal en cada turno.

Trimestral

Carga de trabajo por empleado

Monitoreo de la carga de trabajo por un analista; comparando productividad con otros en el mismo turno y entre otros turnos.

Trimestral

Control de calidad de rutina

Monitoreo de exactitud y precisión a corto tiempo.

Bimensual

Tiempo de entrega de resultados

Monitoreo de servicio adecuado

Mensual

Figuras

Fig. 2-1 Organigrama de la estructura de un hospital.

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Figura 2-2 Organigrama de un departamento de patología.

Figura 2-3 Organigrama de un laboratorio de química.

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Figura 2-4 Carta resumida de las calificaciones del personal requeridas por la CLIA '88 para un director de un laboratorio de complejidad moderada.

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Figura 2-5 Carta resumida de las calificaciones del personal requeridas por la CLIA '88 para un director de un laboratorio de alta complejidad.

Reporte de Monitoreo del Aseguramiento de la Calidad. Nombre de la Institución: Hospital Sunland Nombre del Laboratorio o Sección: Químicas Reporte del monitor de Aseguramiento de la Calidad, AC Nombre de la prueba: Urgencias, pruebas de embarazo, suero Monitor: Tiempo de Entrega de Resultados (Turnaround Time, TAT) Criterio de evaluación y/o umbral: 95% de las pruebas séricas de embarazo de urgencias que se realizan dentro: a: 30 minutos a partir de su recepción en el laboratorio b: 90 minutos a partir de la hora de colecta Período del monitoreo: Mensual, Anual : Julio, 1995 o Trimestral: 1o 2o 3o 4o Resultado del monitor: Cumple NO Cumple (subraye) Datos del monitor: a. 96.3% de todas las solicitudes son realizadas dentro de 30 minutos a partir 167

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de su recepción en el laboratorio b. 95.9% de todas las solicitudes son realizadas dentro de 90 minutos a partir de su colecta Revisión de acción: Hubo uno fuera de tiempo que fue realizado después de 2 horas de su colección. Muestra pérdida en áreas de recepción de muestras, se informó a la recepcionista Futuras acciones o comentarios: Tres muestras fuera del TATA (Tiempo de Entrega de Resultados) del laboratorio. Muestras recibidas en el laboratorio durante el período de la comida. Se comentará con el supervisor acerca de mantener la cobertura durante ese tiempos. Comparación con monitores previos: Dar % dentro de límites Anterior: Dos anteriores: : Fecha:________ %:_____ Fecha:________ %:______ Director del Laboratorio: _____________ Supervisor Técnico:__________ Figura 2-6.. Forma para el monitoreo del aseguramiento de la calidad

CAPÍTULO 3

3. Fuentes y Control de la Variación Preanalítica David R. Dufour

Causas de variación previas a la colecta Variables de ciclos biológicos Variables físicas relacionadas con el paciente Procedimientos para minimizar las variables del paciente Causas de variación en la colecta de sangre Técnicas de colecta de sangre Tipos de muestras de sangre Errores relacionados con los preservativos y anticoagulantes Errores relacionados con los tubos separadores de suero Errores relacionados con las técnicas de colecta inadecuada Errores relacionados con la identificación del paciente y la muestra correspondiente Cadena de custodia Procedimientos para minimizar la variación relacionada con la flebotomía Causas de variación posterior a la colecta Transporte de la muestra

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Procesamiento de la muestra Almacenamiento de la muestra Otros aspectos preanalíticos de la colecta Colecta de muestras de orina: fuentes de variación Colecta de muestras en infantes Ayuda del sistema de base de computación para la detección de errores. Criterio de rechazo de muestras.

OBJETIVOS Describir las tres categorías mayores de variación preanalítica; bosquejar para cada categoría, los pasos que pueden ser tomados por los laboratorios para minimizar la variación. Describir las diferencias entre sangre capilar, venosa y arterial, al igual que las pruebas comunes de laboratorio que son afectadas en forma significativa por estas diferencias. Discutir el uso apropiado de los anticoagulantes y preservativos, y sus efectos en las pruebas comunes de laboratorio. Reconocer el patrón de contaminación del EDTA y sus causas. Categorizar los tipos de pruebas afectadas por la hemoconcentración, las causas de la hemoconcentración, y las técnicas de control para limitar su ocurrencia. Discutir la secuencia de los cambios ocurridos en especímenes después de su colecta, y las técnicas de control para limitar las alteraciones resultantes en la concentración del compuesto analizado. Definir que son las revisiones delta, y resumir su utilidad en la detección de errores analíticos.

Términos Clave aditivo Sustancia química que al añadirse a una muestra causa uno o más cambios en sus propiedades físicas o químicas. adsorber Acoplamiento de una sustancia química a una superficie sólida. aerosol Una fina niebla producida por la atomización de un líquido. alícuota Una pequeña parte de una determinada muestra, la cual tiene la misma composición química. compuesto analizado Una sustancia que puede ser medida por una técnica analítica. anastamósis Conexión de dos vasos sanguíneos. anticoagulante Una sustancia que puede suprimir, retrasar, o evitar la coagulación de la sangre impidiendo la formación de fibrina. antiséptico Una sustancia química la cual reduce el número de bacterias. artefacto Cambio del estado de un material como resultado de un proceso o condición artificial más que de uno natural. arterial Relacionado con o derivado de las arterias, los vasos que conducen sangre del corazón a los tejidos del cuerpo. capilar Relacionado con un vaso sanguíneo muy delgado en los tejidos donde los nutrientes son depositados y los productos de desecho son removidos por la sangre. catéter Un tubo de hule o plástico que conecta una cavidad del cuerpo con la superficie del cuerpo. código de barras Un sistema que usa barras de anchos variables como una forma de proveer 169

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información de identificación. coágulo Agregación de células sanguíneas unidas por fibrina, una proteína polimerizada. cronobiología La ciencia que estudia la variación cíclica de los organismos vivos. EDTA Ácido etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic acid), es un agente quelante de calcio, de uso común. Actúa como anticoagulante y preservativo, uniendo calcio y otros cationes. Por sus propiedades quelantes, es capaz de inactivar varias enzimas necesarias para la formación del coágulo y para la degradación de proteínas y lípidos en sangre. estasis Una disminución en el flujo de sangre en una parte del cuerpo. evaporación Transformación de agua en vapor extracelular Fuera de las células. flebotomía Punción de una vena con una aguja con el propósito de obtener una muestra de sangre. glucolítico Relacionado con el proceso del metabolismo de la glucosa. hemoconcentración El proceso de incremento en la concentración de las células, proteínas, y ocasionalmente otros compuestos analizados en sangre a través de la pérdida de agua, ya sea in vitro o in vivo. hemólisis Ruptura de glóbulos rojos, liberando al suero o plasma los contenidos en ellos. heparina Un anticoagulante el cual inhibe directamente la formación de fibrina. in vitro Literalmente, en vidrio; ocurre en una situación artificial, como en un tubo de ensaye. in vivo Ocurre en un organismo vivo. infradiano Cambios en la concentración de compuestos analizados que ocurren con menos frecuencia que una vez al día. intraindividual Dentro de una sola persona. intravenoso Dentro de una vena; generalmente se refiere a los fluidos intravenosos, en donde el agua contiene medicamentos, glucosa, o electrólitos que son administrados a un paciente a través de un catéter insertado en una vena. no laminar Que no está ordenado en forma de capas , con cambios graduales de una capa a otra. En los líquidos, el flujo no laminar produce de fuerzas de ruptura, al ponerse en contacto diferentes capas o laminas. plasma La parte líquida de la sangre en el torrente sanguíneo; es una muestra obtenida de sangre mediante la colecta con un anticoagulante, con una centrifugación posterior de la muestra. postprandial Después de comer. preservativos Sustancias químicas que impiden cambios en la concentración de compuestos analizados en una muestra de sangre, orina, u otro fluido corporal. proteólisis El proceso de degradación de las proteínas, el cual puede ocurrir por reacciones químicas o procesos enzimáticos. quelación El proceso de unión de una molécula orgánica (quelante) con múltiples iones metálicos. revisión delta Comparación de la concentración de un compuesto analizado en la muestra de un individuo, con la misma concentración existente en la muestra anterior, de la misma persona. separador de suero Un componente mecánico que separa físicamente el suero y las células 170

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(los separadores de plasma separan plasma de las células), previniendo los cambios en la concentración de los compuestos analizados séricos debido al metabolismo celular. suero La parte líquida de la sangre que queda después de que se ha formado un coágulo. TBEP Tri(2-butoxietil)fosfato, una sustancia química encontrado en el hule, el cual puede pasar a través del tapón y unirse a proteínas, desplazando sustancias químicas y alterando sus concentraciones en suero (o plasma). torniquete Un dispositivo mecánico (como una banda ancha de hule) usada en la superficie de una extremidad la cual comprime las venas, haciéndolas aparecer más grandes mediante la prevención del retorno de sangre al corazón y pulmones. ultradiano Cambios en la concentración de los compuestos analizados los cuales ocurren en un período de tiempo mucho menor que un día. variación cíclica Cambios en concentración de compuestos analizados los cuales ocurren repetitivamente, en una forma predecible, durante un período dado de tiempo. variación circadiana Cambios en la concentración de compuestos analizados la cual ocurre durante el transcurso de un día. variación preanalítica Factores que alteran los resultados de una prueba de laboratorio, y que ocurren antes de realizar la prueba. venoso Relacionado con las venas, los vasos que retornan la sangre de los tejidos al corazón y pulmones.

Las pruebas de laboratorio, que miden un compuesto analizado en un especimen de sangre u otro fluido corporal, son ordenadas por los médicos para evaluar el estado del paciente. Se asume que el resultado analítico obtenido es representativo de la concentración real del compuesto analizado en el paciente. Desafortunadamente, hay numerosos factores que pueden invalidar esta suposición. Los errores pueden ocurrir debido a tendencias analíticas; el control de calidad tradicional está dirigido hacia la minimización de errores. Sin embargo, un número de errores no analíticos pueden también cambiar la concentración de uno o más compuestos analizados en un especimen de tal forma que los resultados no reflejan la condición fisiológica del paciente. Éstos son llamados colectivamente fuentes de error preanalítico. De la misma forma que el control de temperatura, longitud de onda, y tiempo de incubación limitarán el error analítico, el error preanalítico también puede ser controlado. El propósito de este capítulo es detallar las fuentes comunes de error preanalítico y los métodos que pueden ser usados para controlarlos. Es responsabilidad de los laboratorios tomar medidas que minimicen las fuentes de error, desarrollando procedimientos estándares que establezcan la preparación del paciente, colecta de la muestra, métodos de transporte, y preservación de muestras. Las agencias que acreditan los laboratorios, incluidos el Colegio de Patólogos Americanos ("College of American Pathologists," o "CAP", en inglés) y la Comisión Unida para la Acreditación de Organizaciones del Cuidado de la Salud ("Joint Commission on Accreditation of Health Care Organizations" o “JCAHCO” en inglés), requieren que cada laboratorio provea un manual detallado que documente el método apropiado para la colecta de especímenes. Es recomendable incluir en este documento los procedimientos usados para minimizar errores en cada punto donde puede desarrollarse una variación. 171

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Causas de Variación Previas a la Colecta Variables del ciclo biológico Variación cíclica se refiere a los cambios en concentración de los compuestos analizados, que ocurre en una forma predecible a ciertas horas del día, semana, o mes. El estudio de tales cambios cíclicos es llamado "cronobiología".ref(76) La variación rítmica es típica de muchas funciones biológicas; la variación diurna en el metabolismo de drogas y la incidencia de infarto al miocardio son dos ejemplos de la importancia de este campo.ref(77) La variación cíclica más reproducible es la variación circadiana, la cual ocurre durante el transcurso de un solo día. Se sabe que la melatonina, un compuesto producido por la glándula pineal en respuesta a la oscuridad, afecta la función de muchas partes del eje hipotalámico-pituitario.ref(78) Como resultado, la concentración de la mayoría de las hormonas pituitarias se incrementa en las noches y disminuye durante el día. Aquellas hormonas cuyas concentraciones son afectadas por la estimulación de la pituitaria muestran una variación diurna similar. Los cambios diurnos parecen estar influenciados por los períodos de sueño y vigilia más que por la hora en el reloj. La gente que trabaja turnos irregulares o que ha llegado recientemente a una zona con un horario diferente, típicamente tiene algún retraso en el ajuste de su ciclo diurno; sin embargo, finalmente la concentración de las hormonas pituitarias será más alta durante el período de sueño, disminuyendo gradualmente después de despertar.ref(79) Al reportar la hora de colecta de una muestra para pruebas hormonales, por lo tanto, es necesario indicar la hora en que despertó el paciente. Muchas otras sustancias medidas comúnmente, tales como el hierroref(80) y la fosfatasa ácida,ref(81) también muestran una prominente variación circadiana.ref(82) La excreción urinaria de la mayoría de los electrólitos, tales como sodio, potasio, y fósforo muestran considerable variación circadiana. El índice de excreción de estos compuestos analizados en especímenes obtenidos a diferentes horas del día pueden diferir hasta un 50%. Algunas hormonas no son liberadas a la circulación en forma constante, sino que son secretadas en episodios repentinos. Esta variación ultradiana es típica de la mayoría de las hormonas pituitarias, como se muestra en la Fig. 3-1. La concentración durante tal secreción repentina puede llegar a ser varias veces el nivel basal. Por lo tanto, una sola muestra, no puede ser representativa de la producción total de la hormona. La variación cíclica durante un período de tiempo mayor de un día (infradiana) también puede afectar los resultados en las pruebas de laboratorio. En mujeres, el ciclo menstrual se asocia con cambios significantes en las concentraciones de hormonas ováricas. También están relacionadas con lo anterior, las fluctuaciones mensuales en las concentraciones de otros compuestos analizados tales como calcio, magnesio, colesterol, hormona paratiroidea, renina, aldosterona, y hormona antidiurética.ref(83) La variación circanual, la cual ha sido reportada en algunas sustancias, está relacionada con cambios en la dieta debido a la estación, o con la variación del clima. Por ejemplo, la concentración en suero de 1,25-dihidroxivitamina D es más alta en el verano que en el invierno,ref(84) y el oxalato urinario es más alto en verano que en otras estaciones (el oxalato está presente en altas concentraciones en las fresas).ref(85) Para otros compuestos analizados, tales como la elevada respuesta de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) a la hormona liberadora tiroidea ocurre en verano,ref(86) la causa de esta variación no es clara. 172

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Además de tales variaciones predecibles, las fluctuaciones al azar pueden causar cambios marcados en la concentración de un día a otro. Aunque muchos compuestos analizados como los electrólitos, proteínas, y fosfatasa alcalina muestran menos del 5% de variación intraindividual, la variación de un día a otro puede ser arriba del 20% para sustancias como la bilirrubina, creatina cinasa, triglicéridos, y la mayoría de hormonas esteroideas. La excreción urinaria de creatinina varía aproximadamente un 10% en un determinado individuo, pero muchas otras sustancias excretadas en la orina muestran fluctuaciones del 25 al 50% durante períodos relativamente cortos.ref(87) La Tabla 3-1 enumera la variabilidad biológica a largo plazo para un número de compuestos analizados comunes.

Pruebas Sujetas a Variación Diurna Fosfatasa ácida * ACTH Catecolaminas Cortisol (y otros esteroides adrenales) Gastrina* Hormona del Crecimiento* Tolerancia a la Glucosa Hierro Osteocalcina* Hoemana Paratiroidea* Prolactina* Renina/aldosterona TSH* *Más alta en PM; todas las otras más altas en AM

Pruebas Afectadas por la Ingestión de Alimentos Cloro* Gastrina Glucagon Glucosa Hormona del Crecimiento Insulina Calcio Ionizado Fosfato * Potasio * Triglicéridos pH en Orina *Más bajo después de los alimentos; todos los demás, más altos

Variables físicas relacionadas con el paciente 173

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El ejercicio es una causa común controlable de variación en los resultados de las pruebas de laboratorio. Dentro de las pruebas químicas de rutina; el potasio, fósforo, creatinina, y proteínas séricas son significativamente alteradas por un período breve de ejercicio.ref(88) Con el ejercicio regular, hay un aumento en las enzimas relacionadas con la actividad muscular y un aumento en la concentración de ácido úrico en sangre (Fig. 3-2). El ejercicio intenso, como correr en un maratón, produce una rápida elevación en la concentración de potasio, ácido úrico, bilirrubina, y enzimas musculares, mientras que la concentración de glucosa y fósforo disminuyen significativamente.ref(89) En personas que están en entrenamiento para competencias de distancias largas, las concentraciones de gonadotropina y esteroides sexuales están marcadamente disminuidas, mientras que la concentración de prolactina está aumentada.ref(90) Los cambios en los resultados de las pruebas de laboratorio relacionados con la dieta abarcan muchos compuestos analizados; la mayoría son transitorios y fácilmente controlables. Después de la ingestión de una comida, hay un incremento en la concentración de las sustancias que se absorben de los alimentos, como glucosa y triglicéridos. Además, las concentraciones de sodio, ácido úrico, hierro, y deshidrogenasa láctica están significativamente alteradas después de una comidaref(91) mostrando un aumento postprandial. Las hormonas que son secretadas en respuesta a la ingestión de alimentos, como gastrina e insulina, también mostrarán un incremento postprandial. La concentración plasmática de sustancias, como el potasio y el fósforo, que entran a las células bajo la influencia de la insulina, disminuirán después de las comidas. Las sustancias presentes en la comida pueden interferir químicamente con los resultados de las pruebas, tales como la vainillina, la cual interfiere con el análisis químico del ácido vanilmandélico y la serotonina dietética puede aumentar la concentración urinaria de ácido 5-hidroxi-indolacetico. Las pruebas de sangre oculta en heces, las cuales identifican el grupo hemo son afectadas por la ingestión de carne y, en algunos casos por ingestión de hierro y rábano.ref(92) La variación en la dieta puede también inducir cambios de mayor duración en las pruebas de laboratorio; las alteraciones en la ingestión de proteínas están asociadas con cambios reversibles en la excreción urinaria de creatinina y en la depuración de creatinina.ref(93) El estrés, ya sea físico o mental, puede alterar en forma reversible los resultados de varias pruebas de laboratorio. Es bien sabido que el estrés induce la producción ACTH, cortisol, y catecolaminas. Aún un ligero estrés, como el causado por el piquete de una aguja, la preparación para un examen, o la admisión voluntaria en un hospital, puede ser suficiente para causar cambios. Aunque el colesterol total puede aumentar con un ligero estrés,ref(94) el colesterol HDL sufre una disminución de alrededor del 15%.ref(95) La preparación de la región cubital anterior para venipuntura puede causar un marcado aumento de las catecolaminas plasmáticas. El estrés más severo causa cambios más profundos. Después de un infarto agudo al miocardio, el colesterol comienza a disminuir alrededor de las 24 horas y puede alcanzar una disminución máxima del 60% valor basal, regresando a los valores típicos del paciente después de tres meses.ref(96) Los pacientes en las unidades de cuidado intensivo tienen una supresión en la producción de varias hormonas pituitariasrefs(97) y aldosterona.ref(98) Debido a estos cambios, la evaluación voluntaria de la función endocrina y el estado de los lípidos no deben combinarse con la admisión hospitalaria por otras causas. La postura es una causa de variación preanalítica fácilmente controlable. En la posición de pie, un incremento en la presión hidrostática causa pérdida de agua y electrólitos 174

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procedentes del compartimento del líquido intravascular, resultando en un aumento en la concentración de proteínas. Si la flebotomía se lleva a cabo antes de que el paciente tenga cuando menos 15 minutos de estar sentado después de un tiempo de haber estado de pie, se producirá una hemoconcentración del 5 al 8%.ref(99) Este aumento puede producir diferencias importantes clínicamente en las concentraciones de calcio, colesterol y lipoproteínas. En posición supina, el agua y los electrólitos regresan al espacio vascular, resultando en una disminución proporcional en la concentración de proteínas. La diferencia en la medición de la concentración de hemoglobina entre la hora de admisión en el hospital (cuando al paciente pudo haber tenido una flebotomía después de haber estado de pie por un tiempo) y la mañana siguiente (cuando al paciente se le pudo haber extraído sangre mientras descansaba en la cama) puede conducir al médico a sospechar que el paciente ha desarrollado una hemorragia interna o hemólisis.

Procedimientos para minimizar las variables en el paciente Las etapas importantes para controlar las variables en el paciente incluyen el obtener una buena historia clínica del paciente, y dar instrucciones claras al flebotomista y al paciente, así como verificar que se sigan los protocolos establecidos. Variables biológicas cíclicas. El laboratorio debe determinar cuales de las pruebas realizadas tienen cambios significativos de concentración, ya sean cíclicos o relacionados con la ingesta de alimentos; las Tablas 3-2 y 3-3 enumeran las pruebas más importantes que son afectadas de esta manera. En condiciones óptimas, los especímenes para estas pruebas deben ser colectados tan pronto como el paciente despierte y que todavía esté en ayunas. Si hay un patrón de variación ultradiana, como lo hay para la mayoría de las hormonas pituitarias, se deben colectar varios especímenes a intervalos mayores del ciclo usual para proveer una noción exacta sobre la producción de hormonas.ref(100) Por ejemplo, para las gonadotropinas, es recomendable colectar tres o cuatro especímenes con una diferencia mínima de media hora entre cada toma, y mezclar el suero de todas ellas antes de realizar el análisis. Un método más sofisticado consiste en colocar un catéter intravenoso en el paciente y a través de él obtener las muestras cada hora durante un día. Cada especimen es analizado en forma separada, y la concentración se gráfica contra la hora del día en que fue obtenido. Se reporta el área bajo la curva como una medida integrada de producción de la hormona . Variables físicas. Si se están colectando muestras, para medir compuestos analizados que son afectados por el ejercicio, es necesario interrogar al paciente para saber si ha llevado a cabo ejercicios vigorosos durante las ultimas 24 a 48 horas. Cualquier historia de ejercicio vigoroso debe ser anotada en la forma de requisición y debe incluirse en el reporte final. Otra alternativa es pedir al paciente que regrese después para la toma de esa muestra. El estado de estrés antes de la toma de muestra es difícil de controlar; sin embargo, los médicos deben estar informados sobre aquellas pruebas que son afectadas, así como de la magnitud del cambio inducido por el estrés ya sea físico o mental. Hay casos en que resulta recomendable que el laboratorio solicite asesoría especial antes de llevar a cabo pruebas que son severamente afectadas por el 175

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estrés del paciente, tales como las pruebas de función adrenal o pituitaria, metabolitos de catecolaminas, análisis de lípidos, y prueba de tolerancia a la glucosa. Los efectos debido a la postura pueden minimizarse pidiendo a los pacientes ambulatorios que permanezcan sentados por lo menos 15 minutos antes de la extracción de la sangre. Para los análisis que sufren alteraciones por la dieta, incluyendo las mediciones de tolerancia a la glucosa, hidroxiprolina, 5-HIAA, y los metabolitos de las catecolaminas urinarias, es recomendable proveer al paciente con las indicaciones por escrito antes de ser programado para la colecta de la muestra. Si pruebas tales como la medición de renina y aldosterona, tolerancia a la glucosa, orina de 24 horas, grasa en heces de 72 horas, requieren preparación especial del paciente, resulta buena práctica citar al paciente antes para entregarle una explicación detallada en una hoja impresa.

Cauas de Variación en la Colecta de Sangre Técnicas para la colecta de sangre El uso incorrecto de los procedimientos para obtener especímenes puede introducir significante error en los resultados finales de las pruebas de laboratorio; los errores relacionados con la colecta de muestras en el laboratorio son las causas más comunes de resultados erróneos. Muchas publicacionesrefs(101) detallan en forma apropiada los procedimientos en la ejecución de flebotomías para obtener muestras de sangre, y los programas de certificación en flebotomía han establecido los estándares para capacitar y educar a los flebotomistas. En hospitales de enseñanza, la flebotomía es llevada a cabo por una variedad de individuos (enfermeras, asistentes de médicos, y estudiantes) quienes tienen un entrenamiento formal limitado, o incluso carecen de él, en técnicas de flebotomía. En la mayoría de los laboratorios, los especímenes son colectados usando tubos al vacío y agujas especialmente diseñadas, que permiten simultáneamente la punción de la vena y del tapón del tubo. Los tubos para colecta son típicamente hechos de vidrio, aunque los tubos de plástico están siendo usados más frecuentemente; ambos son apropiados para la mayoría de las pruebas.ref(102) Muchos tubos están cubiertos con silicón, el cual reduce la adhesión del coágulo, permitiendo mejor separación del suero y de las células. Los tapones están típicamente hechos de hule. En viejas formulaciones se usó el tri(butoxietil)fosfato (TBEP) como plastificante; este compuesto es capaz de disociar varios medicamentos de sus proteínas de transporte. Los medicamentos entonces se difunden dentro de los eritrocitos, reduciendo la concentración de la droga en el suero. El TBEP ha sido retirado de la mayoría de los tapones de uso común. Algunos tubos tienen tapas protectoras especiales sobre los tapones que no están en contacto directo con la sangre, disminuyendo el riesgo de transmisión de agentes infecciosos. En algunos casos, la sangre es extraída con una jeringa y entonces se transfiere al tubo para trasladarla al laboratorio. Este procedimiento, presenta el riesgo de contaminación para el flebotomista durante la transferencia de la muestra. El método más seguro para preparar alícuotas de muestras es seleccionar los tubos necesarios que contienen anticoagulantes o preservativos y retirar los tapones de los tubos antes de colectar la muestra. Después de colectar la muestra, se desprende la aguja de la jeringa, y la sangre es vaciada en los tubos; entonces se colocan nuevamente los tapones. La inyección de la sangre en los tubos vacíos 176

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incrementa el riesgo de punción en la piel por la aguja y también incrementa el riesgo de producir hemólisis en la muestra (ver pág. 110). En niños y adultos con difícil acceso venoso, puede hacerse una punción capilar para la obtención de la muestra. Ciertos microtubos especiales, que contienen anticoagulantes, pueden llenarse por capilaridad. Si las muestras van a ser transportadas al laboratorio, estos tubos capilares deberán contener una pequeña pieza metálica que debe moverse a través de la muestra por medio de un imán para mezclar la sangre inmediatamente después de colectarla y antes de someterla a centrifugación o análisis (Figura 3- 3). Si la prueba se va a realizar cerca del lugar de la toma, como es típico para muchos de los instrumentos portátiles usados cerca del paciente, estos aditamentos para mezclar la sangre no son necesarios, ya que la tardanza entre la colecta y el análisis es mínima. La contaminación de la muestra con fluidos de tejido es una causa potencial de preocupación en todos los procedimientos de colección capilar de sangre, ya que el fluido tisular virtualmente no contiene proteínas y, por lo tanto, no tiene compuestos analizados unidos a proteínas. Este tipo de contaminación puede ser minimizado usando solo la sangre que fluye libremente del sitio de punción. Es por lo tanto inaceptable obtener sangre aplicando presión al tejido cerca del sitio de punción.

Tipos de muestras de sangre Las diferencias que existen entre sangre arterial, venosa y capilar, son causas ocasionales de resultados erróneos. La sangre arterial es la fuente de nutrientes para todos los tejidos del cuerpo, y es la mejor muestra para el análisis de la distribución de sustancias necesarias para los tejidos corporales como el oxígeno. La sangre venosa difiere de la sangre arterial en que tiene menores concentraciones de sustancias usadas en el metabolismo, tales como oxígeno y glucosa, y más altas concentraciones de productos de desecho tales como ácidos orgánicos, amoniaco, y dióxido de carbono. La magnitud de la diferencia en la concentración de estos compuestos analizados entre la sangre arterial y venosa es dependiente de la perfusión tisular; con poca perfusión, la diferencia se incrementa. Se ha sugerido la medición de la diferencia en gases sanguíneos entre sangre arterial y sangre venosa central, como una medida generalizada de la perfusión tisular para monitorear pacientes en shock.ref(103) La sangre capilar en general, es más cercana en su composición a la arterial, que la venosa. Si se mantienen tibios sitios específicos, como el lóbulo de la oreja o el pie, se pueden obtener muestras de sangre capilar que son muy parecidas a las de sangre arterial. En estados de poca perfusión tisular y en los neonatos, sin embargo, hay una diferencia significativa entre la presión parcial de oxígeno (PO2) de la sangre capilar y la arterial. La glucosa medida en una muestra por punción de un dedo puede ser 50% más baja que la glucosa medida en plasma venoso de pacientes en shock;ref(104) al menos algunas de las diferencias son causadas por la PO2 baja en la sangre capilar de los pacientes en shock, lo cual afecta los métodos para glucosa oxidasa en sangre total. Para algunas sustancias, la diferencia entre las concentraciones de sangre capilar y venosa depende de factores hormonales que afectan la extracción del tejido. Por ejemplo, en ayuno, la concentración de glucosa en sangre capilar es similar a la de sangre venosa. En especímenes postprandiales, cuando la concentración de insulina está incrementada, la diferencia entre la concentración de glucosa en sangre capilar y venosa puede aumentar hasta un 15%.ref(105) 177

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Errores relacionados con preservativos y anticoagulantes Los preservativos y anticoagulantes son ampliamente usados para colectar muestras de sangre, orina, y otros fluidos corporales. Cuando se extrae sangre del cuerpo y se deja coagular, ésta se separa en una fase líquida llamada suero y en un coágulo sólido conteniendo células sanguíneas y fibrina. Si se añade un anticoagulante como la heparina, la fase líquida es llamada plasma. El suero y el plasma son similares en muchos aspectos. El suero difiere del plasma en que carece de fibrina, disminuyendo el total de proteína en un promedio de 3 g/L. En la coagulación, las plaquetas liberan potasio al suero; el potasio en el plasma es normalmente alrededor de 0.2-0.3 mmol/L más bajo que el potasio en suero. Por razones desconocidas, la concentración de fósforo es más baja en plasma por un promedio de 2 g/L.ref(106) En pacientes con algunos trastornos hematológicos estas diferencias son exageradas. Con estas pocas excepciones, el suero y el plasma heparinizado son usados indistintamente para pruebas de laboratorio. La selección del tipo de muestra depende de la instrumentación, métodos de ensayos, y de la necesidad de rapidez en los resultados. El plasma heparinizado puede ser separado de las células inmediatamente después de la colecta, por lo tanto dichas muestras de plasma son apropiadas para un análisis rápido en situaciones de emergencia. Aunque la heparina es un anticoagulante efectivo, en varios casos ocurre formación de fibrina después de la separación, la cual puede causar obstrucción en las mangueras y las agujas aspiradoras de muestras en los instrumentos. La heparina puede interferir en algunos sistemas analíticos, tales como el ensayo de lipasa en laminilla seca. El catión usado en sales de heparina (como litio o amonio) puede causar contaminación en las muestras para la medición de estos compuestos analizados. Por estas razones, algunos laboratorios prefieren no usar sangre heparinizada. Además de la heparina, se usan otros anticoagulantes y preservativos para diversas muestras. La Tabla 3-4 enumera algunas de las sustancias más comúnmente usadas y algunas indicaciones típicas para el uso de estos aditivos. Mientras estos compuestos son esenciales para ciertas pruebas, pueden ser totalmente inapropiados para otras. El EDTA, usado para muestras en hematología, es usado también para algunos ensayos químicos porque la quelación de los cationes divalentes inactiva muchas enzimas y conduce a cambios in vitro de hormonas peptídicas y lípidos. La quelación de cationes tales como el hierro, magnesio, y calcio, sin embargo, causa una disminución artificial de los resultados en la mayoría de los ensayos colorimétricos y reduce la actividad de enzimas que requieren cationes activadores (fosfatasa alcalina, y creatina cinasa). La contaminación de muestras con anticoagulantes, especialmente EDTA, es un problema común en muchos laboratorios. En nuestro laboratorio, se reciben aproximadamente de 2 a 3 muestras contaminadas con EDTA cada mes. El patrón de anormalidades que se ven debido a contaminación con EDTA se muestra en la Tabla 3-5. Para evitar esta contaminación, deben llenarse primero los tubos sin anticoagulantes o preservativos, seguidos por los tubos que contienen anticoagulantes o preservativos. Debido al potencial del EDTA para interferir en muchos ensayos, los tubos conteniendo EDTA deben llenarse al último. Si se está usando anticoagulante líquido, es importante asegurarse que la proporción de sangre y anticoagulante usada sea constante. En muestras con un inadecuado volumen de sangre ("escasa extracción"), puede haber una dilución significativa de la sangre debido a la solución del anticoagulante. Ya que la mayoría de los anticoagulantes no entran a las células, las 178

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alteraciones en el hematocrito afectarán la proporción anticoagulante-plasma. Por ejemplo, los pacientes con hematocrito alto tendrán un exceso relativo de anticoagulante resultando en una dilución del plasma, mientras que en individuos anémicos el anticoagulante puede ser insuficiente.

Efectos de la Contaminación con EDTA Incremento de Potasio Reducción de Calcio, Magnesio (ensayos colorimétricos) Reducción de Fosfatasa Alcalina, Creatina Cinasa

Errores relacionados con los tubos separadores de suero Los tubos separadores de suero y plasma son usados por muchos laboratorios para simplificar el proceso de separación del suero (o plasma) de los elementos celulares. Si la separación no ocurre, el metabolismo continúa en la fase celular, produciendo una variedad de cambios los cuales se discuten más tarde en este capítulo. Los tubos separadores de suero y plasma, contienen un gel relativamente inerte e impenetrable, el cual tiene una densidad intermedia entre los elementos celulares y el plasma o suero. Durante la centrifugación, el gel se levanta desde el fondo del tubo y forma una barrera mecánica que evita que los cambios metabólicos afecten las concentraciones plasmáticas (Figura 3-4). Los tubos que contienen estos geles pueden ser centrifugados y almacenados sin ser destapados, reduciendo así el riesgo de producir aerosoles infecciosos y evitando en forma simultánea la evaporación. Algunos agentes terapéuticos se adsorben en el gel, disminuyendo falsamente las concentraciones de antidepresivos tricíclicos y ciertas drogas antiarrítmicas como flecainide. Con estas excepciones, la mayoría de sustancias en plasma no son afectadas por el uso de geles separadores.

Errores relacionados con las técnicas de colecta inadecuada Torniquetes. El uso de los torniquetes es una importante causa, controlable, de variación en los resultados de pruebas de laboratorio. Los torniquetes son ampliamente usados en flebotomías para bloquear el retorno venoso, causando dilatación de las venas y haciendo más fácil la identificación de un sitio de venopunción. Los torniquetes a menudo se dejan colocados durante el proceso de venopunción asumiendo que la continua dilatación venosa permitirá una colecta más rápida de la muestra y evitará el "colapso" de la vena. Aunque los torniquetes hacen el proceso de flebotomía más fácil, la disminución en el flujo de sangre que éstos inducen causa cambios en los resultados de las pruebas de laboratorio que pueden predecirse. Un minuto después de aplicar el torniquete, el incremento de presión causa pérdida de agua y electrólitos del plasma hacia el espacio del fluido extracelular, produciendo una elevación en la concentración de proteínas, células, y sustancias unidas a células y proteínas. Después de tres 179

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minutos, generalmente hay un incremento del 5 a 8% en la concentración de proteínas. Si un torniquete se deja por 15 minutos, la elevación en la concentración puede alcanzar hasta 15%. La magnitud de estos efectos puede diferir entre el primero y el último tubo colectados, mostrando una hemoconcentración mayor en las últimas muestras. Una preocupación adicional con el uso del torniquete es la disminución relativa del flujo de sangre. Las concentraciones de subproductos metabólicos tales como el lactato y el ion hidrógeno aumentan en el tejido, y el restablecimiento del flujo sanguíneo después de retirar el torniquete causa una elevación en la concentración de lactato venoso. Cuando la sangre es colectada usando un torniquete, se le pide al paciente que apriete y relaje su puño en forma alternada para incrementar la velocidad de colecta de los especímenes. No solo hay poca evidencia en la eficacia de este procedimiento, sino que éste también puede ser la causa de hiperkalemia artificial (Figura 3-5).ref(107) Hemólisis. La hemólisis ocurre cada vez que hay un trauma de los relativamente frágiles eritrocitos, ya sea durante la colecta, o con menor frecuencia después de la flebotomía. Una causa poco común de hemólisis, es cuando se lleva a cabo la flebotomía antes de que se seque el alcohol o cualquier otro desinfectante usado. Frecuentemente la hemólisis es causada por un flujo turbulento no laminar, durante el proceso de colecta. Dentro de los tamaños de agujas que comúnmente se utilizan, la hemólisis no es causada por el uso de agujas muy grandes o muy pequeñas. El flujo no laminar ocurre comúnmente cuando la sangre se mueve muy lentamente o demasiado rápido a través de la aguja. Si la sangre se extrae con una jeringa, al sacar el embolo con fuerza o al inyectar la sangre en los tubos usando presión en el embolo, generalmente se produce hemólisis. Similarmente, el flujo de sangre lento de una vena colapsada depositado a un tubo con vacío a menudo produce una muestra hemolisada. La turbulencia en un tubo conteniendo sangre también puede causar hemólisis después de haber terminado la colecta; los transportadores mecánicos y centrífugas en mal estado son causas raras de hemólisis, como se discute en el siguiente capítulo. La hemólisis altera los resultados de las pruebas de laboratorio en dos formas. La más importante de todas, que el contenido de los glóbulos rojos es liberado, incrementando la concentración de sustancias intracelulares tales como lactato deshidrogenasa (LD), potasio, y magnesio, mientras que disminuye la concentración de solutos extracelulares como el sodio. Ya que la actividad dentro de los eritrocitos para la LD es aproximadamente 150 veces más alta y la concentración de potasio es 30 veces más alta, la hemólisis eleva falsamente los niveles en plasma y suero de estos compuestos analizados. Debido a que la hemoglobina absorbe la luz sobre la mayor parte del espectro visible y en el ultravioleta, la hemólisis puede interferir con los resultados de muchos ensayos espectrofotométricos. El cuadro abajo muestra las pruebas más comúnmente afectadas por la hemólisis y la naturaleza de la interferencia en cada ensayo.

Efectos de la Hemólisis en Pruebas Químicas Aumentos debidos a la liberación de sustancias provenientes de los eritrocitos

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Potasio, magnesio, LDH, ASAT, proteínas totales, hierro, fosfato, amonio Aumentos causado por interferencias en el ensayo Colesterol, triglicéridos, CC, CC-MB (inmunoinhibición) Disminución causada por interferencias en el ensayo Bilirrubina (espectrofotometría directa), caroteno, insulina, albúmina

Contaminación con fluidos intravenosos. La contaminación con fluidos intravenosos puede ser una importante causa de variación en los resultados de las pruebas. A muchos de los pacientes hospitalizados, se les administra fluidos intravenosos, los cuales típicamente tienen una concentración más alta de glucosa, drogas y algunos electrólitos, que los que están presentes en la sangre. La contaminación con fluidos intravenosos ocurre cuando la sangre es extraída de una vena conectada a la vena que tiene el catéter. Aunque pudiera parecer que una vena en el antebrazo es suficientemente distante del catéter, hay una gran cantidad de conexiones anastomóticas. Cualquier extracción de sangre de una vena en el mismo lado donde está instalado un catéter corre el riesgo de experimentar contaminarción por fluidos. En muchos casos, la sangre es extraída mediante la conexión de un catéter. Ha sido demostrado que, para la mayoría de los compuestos analizados, el remover y descartar un volumen de sangre igual al volumen del catéter resulta adecuado para evitar la contaminación. En el caso de los medicamentos administrados a través de un catéter (incluyendo heparina y potasio), el volumen que se descarta puede ser más de 5 veces el volumen del catéter para evitar resultados incorrectos. En pacientes que reciben fluidos intravenosos, por un tiempo largo, comúnmente se usa un catéter “multilumen” a fin de proveer un acceso para la colecta de sangre. Aún, si la sangre es extraída de este acceso por separado, puede todavía ocurrir contaminación si los fluidos intravenosos están siendo administrados a través de un lumen diferente. El patrón más común de interferencia por fluido intravenoso es un marcado incremento de concentración en la sangre de las sustancias contenidas en el fluido. La concentración de potasio en un fluido intravenoso puede ser diez veces más alto que el de la sangre, y la concentración de glucosa en un fluido intravenoso es de 50,000 mg/L. Las concentraciones de drogas son típicamente 100 veces más altas que las existentes en la sangre cuando el fluido es administrado lentamente. Puede ocurrir con menor frecuencia, que haya suficiente líquido presente para diluir realmente las concentración de los constituyentes normales de la sangre, incluyendo los solutos tales como urea y creatinina; en la mayoría de los casos de contaminación por fluidos, estos son alterados mínimamente.

Errores relacionados con la identificación del paciente y la muestra correspondiente Debido a que no hay forma de probar que una muestra sin etiqueta pertenece a un paciente dado, resulta esencial la identificación apropiada de las muestras. Mientras que el etiquetado puede parecer la parte más simple de la colecta de muestras, en la mayoría de los laboratorios es la causa más común de resultados erróneos. En nuestro hospital, 181

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aproximadamente el 1% de las muestras que no se extrae por el personal del laboratorio, es recibido con una identificación inadecuada. Aproximadamente el 0.05% son recibidas con una incorrecta identificación del paciente. Aunque los errores pueden ser cometidos cuando se etiquetan muestras de pacientes con nombres similares, la causa más común de identificación inadecuada de las muestras es la negligencia por parte del flebotomista al etiquetar las muestras antes de abandonar el lugar de extracción donde está hospitalizado el paciente. En nuestro laboratorio, alrededor del 99% de las muestras mal etiquetadas ocurren de esta forma.

Cadena de custodia En ciertas situaciones, como en las pruebas forenses, se requiere de la identificación positiva de muestras en cada etapa del proceso de colecta, transporte, y análisis. Para estos especímenes debe usarse un formato apropiado de cadena de custodia (Fig. 3-6). De acuerdo con los lineamientos publicados por el Instituto Nacional de Abuso de Drogas ("National Institute of Drug Abuse", o "NIDA", en inglés),ref(108) la identificación positiva comienza colocando un sello inviolable en el recipiente que contiene la muestra antes de que ésta sea retirada de la vista del donador; la etiqueta típicamente es marcada por el propio donador con sus iniciales y a veces, por testigos. Después de que el donador certifica en la forma para la cadena de custodia que la muestra fue obtenida de él o ella, cada persona que toma posesión de la muestra firma en la forma y anota la fecha y hora que la muestra fue transferida a la siguiente persona para la continuación del proceso del análisis. Normalmente, cada persona certifica que la muestra fue mantenida en condiciones seguras durante el tiempo que estuvo bajo su custodia. Esto asegura que el resultado será legalmente aceptable en el tribunal de justicia, ya que este resultado puede ser identificado directamente con la persona de quien se obtuvo el especimen.

Procedimientos para minimizar variaciones relacionadas con la flebotomía Los procedimientos para minimizar la variación relacionada con la colecta de muestras, generalmente están bajo el control del laboratorio. Por lo tanto, el laboratorio debe tener una guía clara por escrito que ayude a minimizar los errores, al igual que debe trabajar muy de cerca con el equipo de flebotomistas, administración de enfermería, y médicos. Las guías para la flebotomía de cada prueba que el laboratorio realiza deben incluirse en el manual del laboratorio. Los lineamientos deben especificar el tipo de muestra a colectar, el volumen de muestra necesaria, y si se requiere sangre arterial, venosa o capilar. Se deben monitorear la frecuencia de errores en las flebotomías, como lo sugieren las regulaciones de la CLIA '88 (ver Capítulo 2). Identificación del paciente. La etapa inicial en la prevención de errores en la colecta es la identificación exacta del paciente antes de colectar la muestra. Cuando se trabaja con pacientes de consulta externa, se debe preguntar el nombre, incluyendo la correcta escritura del apellido, y cualquier número de identificación necesario (registro del paciente o número de seguro médico). En pacientes hospitalizados se debe preguntar el nombre, y confirmar la identificación comparando los 182

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datos que proporciona el paciente con los que están anotados en la banda hospitalaria de su brazo. El número de identificación hospitalaria del paciente debe compararse con el numero registrado en la solicitud del laboratorio, para asegurar que son idénticos. Si el paciente tiene más de una banda de identificación, hay que revisar todas las bandas para asegurar que tengan la misma información; hay una frecuencia relativamente alta de errores en el etiquetado de muestras de pacientes con más de una banda. Con niños o adultos con enfermedades neurológicas o mentales, es necesaria una forma de identificación más cuidadosa, como por ejemplo una identificación con fotografía. Las etiquetas de las muestras escritas a mano, deben ser claras y legibles antes de alejarse de la cama del paciente; la etiqueta debe incluir el nombre y número de identificación del paciente y la hora y fecha de colecta. Para ayudar a hacer una identificación apropiada, los sistemas de computación para el laboratorio generalmente proveen de etiquetas preimpresas junto con una lista de colecta (ver Capítulo 18). Muchos laboratorios han empezado a usar el sistema de código de barras para incrementar la exactitud en la identificación positiva del paciente. ref(109) La complejidad de las etiquetas de código de barras varía. Algunas simplemente tienen el nombre y número del paciente, mientras que otras contienen una lista de todas las pruebas que deben ser realizadas en la muestra, la hora en que la muestra fue obtenida, y el nombre de la persona que efectuó la flebotomía. Para verificar la identificación del especimen se pueden llevar a la cama del paciente unos lectores portátiles de códigos de barras para comparar el código en la etiqueta de la muestra con la información en la banda de su muñeca. Los códigos de barras también eliminan errores tipográficos o de escritura a mano, al identificar las muestras que serán introducidas en los instrumentos para análisis. También pueden ser usados para automatizar las requisiciones de las pruebas en los instrumentos de acceso al azar; además, el código de barras facilita el muestreo al hacer uso del mismo tubo de colecta en varios instrumentos, y de esa manera reduce futuros errores en la identificación de muestras (ver capítulo 18). En un estudio en el cual se usó el código de barras no ocurrió ningún error en la identificación de muestras durante el análisis de 300,000 especímenes. Debido a que existen muchos tipos de códigos de barras disponibles, los laboratorios deben revisar cuidadosamente las especificaciones del fabricante antes de empezar a usar el sistema del código de barras. En los Capítulos 16 y 18 se discute con más detalle el uso de código de barras. Preservativos y anticoagulantes. Se debe especificar cualquier preservativo o anticoagulante requerido, y deben especificarse algunas alternativas permitidas. Ya que mucho laboratorios prefieren usar tubos separadores de plasma o suero para la mayoría de las pruebas químicas, aquellas pruebas en las cuales no se pueda usar este tipo de tubos, debe enumerarse claramente; en el cuadro se presenta una pequeña lista de éstos. El uso de un orden específico en la colecta de especímenes evitará la contaminación de la muestras; los tubos sin anticoagulantes son siempre colectados primero, seguidos por los que contienen heparina u otro tipo de anticoagulantes, y al final los que tienen EDTA.

Pruebas en los Cuales los Geles Separadores son Inapropiados

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El compuestos analizado se adsorbe al gel Flecainida, antidepresivos tricíclicos, haloperidol Pruebas donde se requiere sangre completa Enzimas de los eritrocitos, hemoglobina A1c, plomo, ciclosporina A Posibles contaminantes en el gel Elementos traza Pruebas donde son requieren preservativos La mayoría de hormonas peptidicas, renina, catecolaminas

Colecta de la muestra. En el manual de flebotomía deben incluirse las guías para los procedimientos de flebotomía en pacientes que tienen instalados catéteres. Si el paciente tiene una línea intravenosa, la sangre no debe ser extraída del lado donde está dicha línea, preferentemente del otro brazo. Antes de tomar la muestra se deben proveer instrucciones que especifican la cantidad de sangre que se necesita extraer de la línea intravenosa o intraarterial. Ya que la extracción de un volumen de sangre igual al volumen del catéter es adecuada para la mayoría de los compuestos analizados, el manual debe proveer información del volumen que tienen los catéteres más comúnmente usados Se debe tener la precaución de no extraer la muestra de un catéter en aquellas pruebas que son afectadas más severamente por la contaminación con fluidos, como el monitoreo de drogas terapéuticas. Aunque pueden ser usadas muchas venas para una punción, el sitio más ampliamente usado es la fosa antecubital del brazo. Debido a que los torniquetes se usan en la mayoría de las punciones venosas, es necesario que se den instrucciones apropiadas sobre el uso del torniquete. El flebotomista puede identificar el sitio de la flebotomía y limpiar la piel antes de aplicar el torniquete; alternativamente, el torniquete debería soltarse después de la identificación de una vena adecuada. El torniquete debe ser mantenido por un período tan corto como sea posible, preferentemente menos de un minuto, antes de que la flebotomía sea realmente llevada a cabo. Cualquier antiséptico usado debe dejarse secar antes de colectar la muestra para minimizar la posibilidad de hemólisis. Los especímenes deben colectarse sólo si la sangre está fluyendo libremente; de otra manera las muestras de sangre venosa pueden hemolizarse, y los especímenes de sangre capilar pueden ser diluidos con fluido tisular. Debido a que las pruebas de química sanguínea son generalmente más afectadas por la hemoconcentración, deben extraerse primero las muestras para estas pruebas. No se debe pedir al paciente que apriete y suelte el puño durante la colecta ya que esta acción estimulará la liberación de metabolitos musculares dentro de la vena.

Causas de Variación Posteriores a la Colecta La causas de variación posteriores a la colecta son más fácilmente controladas por el laboratorio que las variaciones relacionadas con la flebotomía, ya que es posible desarrollar criterios para las condiciones aceptables de almacenamiento y manejo de muestras después de 184

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la colecta, durante el tiempo que las muestras están en posesión del laboratorio. Dentro de las variables en el manejo de muestras que afectan los resultados de las pruebas están; transporte, separación del suero de los elementos celulares, y las condiciones de almacenamiento.

Transporte de las muestras Errores relacionados con el transporte de muestras. Generalmente las muestras son transportadas por los flebotomistas o por los mensajeros. Una tardanza razonable en la transportación es por lo general bien tolerada para la mayoría de los compuestos analizados, ya que los cambios metabólicos ocurren relativamente despacio a temperatura ambiente. En general, la tardanza hasta de una hora no cambia la concentración de la mayoría de los compuestos analizados. La glucosa, a menudo considerada una de las sustancias más lábiles en la sangre disminuye alrededor de 2 a 3% por hora, a temperatura ambiente, en tubos sin inhibidores glucolíticos como el fluoruro.ref(110) Una muestra de gases sanguíneos arteriales es probablemente el especimen más sujeto a errores de manejo. La Tabla 3-3 enumera las causas comunes de cambios en los resultados de gases en sangre arterial, la dirección y la magnitud relativa de los cambios inducidos. Los productos del metabolismo (como lactato, amonio y el ion hidrógeno) se acumulan en el plasma después de la toma de la muestra, a menos que las reacciones enzimáticas sean retardadas. Otros procesos metabólicos, como la proteólisis, también ocurren a temperatura ambiente. Los péptidos que son susceptibles a degradación por proteasas plasmáticas, generalmente disminuyeran en concentración; sin embargo, el precursor de la renina (pro-renina) será convertido a renina enzimáticamente activa si se deja enfriar el plasma lentamente.ref (111) Procedimiento para minimizar errores de transportación Preservación de muestras durante la transportación. Para minimizar la variación posterior a la colecta, los especímenes deben ser entregados y almacenados rápidamente después de la toma de muestras. Los compuestos analizados que están sujetos a cambios de concentración in vitro a temperatura ambiente, deben ser transportados en hielo inmediatamente al laboratorio. Las instrucciones de manejo deben ser claras; en muchos casos, las muestras son colocadas incorrectamente sobre hielo, o son transportadas sobresaliendo de un recipiente con hielo o sumergidas en hielo sin agua. Debido a que un sólido conduce calor más lentamente que un líquido, las muestras manejadas de esta manera no se enfriarán tan rápido y pueden mostrar cambios en la concentración del compuesto analizado. Aunque el enfriamiento de las muestras durante su transporte minimiza muchos cambios artificiales en la concentración de compuestos analizados, el enfriamiento también incrementa la liberación de potasio de las células. Para una sustancia que sufre cambios en la concentración debidos al metabolismo in vitro, debe indicarse un tiempo específico tolerable de retraso. Las dos técnicas más comunes para evitar el metabolismo de glucosa son; el uso de inhibidores glucolíticos, como el fluoruro o el yodoacetato, y el enfriamiento del especimen en agua con hielo. Si se usan tubos sin anticoagulantes o con separador de suero, debe pasar por lo menos media hora antes de la centrifugación de la muestra para permitir la formación completa del coágulo. Los tubos que tienen aceleradores del coágulo o anticoagulantes pueden ser centrifugados inmediatamente. 185

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Después de la centrifugación, los tubos para colecta de muestras sin barrera de gel, deben ser separados del plasma o suero de las células tan pronto como sea posible para evitar artefactos. Uso de transportadores mecánicos. La transportación de las muestras al laboratorio generalmente causa retraso en el procesamiento. Un estudio del Colegio de Patólogos Americano sobre pruebas del laboratorio de urgencias, mostró que el transporte de especímenes por mensajeros aumenta en promedio del 60 al 100% del tiempo total para la entrega de resultados en las pruebas de urgencias.ref(112) Los transportes de sistemas mecánicos, generalmente usan tubos neumáticos, y son empleados por varios laboratorios para una entrega acelerada de muestras. Los sistemas cuidadosamente diseñados pueden reducir marcadamente el tiempo necesario para que las muestras lleguen al laboratorio. En contraste con el tiempo promedio de 30 minutos por el transporte manual, el tiempo promedio con el sistema neumático de tubos en un hospital fue de 2 minutos. Por lo tanto el sistema de tubos neumáticos tiene el potencial de reducir la necesidad de recurrir a laboratorios satélite y a los equipos de prueba destinados a usarse cerca del paciente. Sin embargo, el sistema de tubos neumáticos puede producir trauma a los eritrocitos. El riesgo de hemólisis se incrementa con el uso de tubos que no son llenados completamente con la muestra, por una repentina desaceleración, y por movimientos bruscos en el sistema de tubos. Un empaquetado incorrecto puede incrementar el número de tubos rotos durante el tránsito. El sistema de tubos neumáticos debe ser monitoreado periódicamente para asegurar que la velocidad de los tubos no se incremente más allá de los límites aceptables. Para estos propósitos, puede ser útil el monitoreo para determinar la prevalecía de muestras hemolisadas.

Transporte a sitios remotos. Cuando las muestras son transportadas a sitios remotos de análisis, como los laboratorios de referencia, pueden ocurrir cambios en la concentración de muchas sustancias. En general, a menos que el ensayo requiera realizarse específicamente en sangre total, es mejor la separación física del plasma o suero de las células antes de preparar la muestra para su envío. Para evitar rompimientos durante el tránsito, es preferible el uso de tubos de plástico firmemente cerrados. Deben tomarse precauciones para evitar el descongelamiento de muestras congeladas. Aunque la mayoría de los laboratorios de referencia sugieren el uso de recipientes aislantes con hielo seco, los servicios de entrega de 24 horas se han vuelto suficientemente confiables, para que la mayoría de muestras puedan ser preservadas adecuadamente mediante el uso de bolsas reusables de hielo “ice packs”. Las muestras deben ser empaquetadas en forma segura para evitar derrames y deben ser marcadas como potencialmente infecciosas.

Procesamiento de muestras Errores originados debido al procesamiento incorrecto de las muestras. La centrifugación es el método más comúnmente usado para la separación inicial del suero y las células. Los principios de centrifugación están cubiertos en el Especimen 1. En general, la centrifugación de muestras por 5 a 10 minutos a 1000-2000 G es adecuada para la completa separación del suero y eritrocitos, incluyendo las muestras que contienen geles 186

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separadores de suero o plasma. Las muestras para obtener suero deben ser centrifugadas únicamente hasta que la formación del coágulo sea completa (al menos 20 a 30 minutos después de su colecta). Cuando se usan geles separadores, las centrífugas con rotor horizontal producen mejor separación mecánica. En nuestro laboratorio, almacenamos muestras con geles separadores hasta por 72 horas sin obtener cambios significativos en la concentración de la mayoría de los compuestos analizados, siempre y cuando no haya puntos visibles de contacto entre las células y el suero. Con centrífugas de cabezal de ángulo fijo, ocasionalmente pueden haber espacios que permiten el contacto del suero con las células. Se debe tener la precaución de revisar que realmente el coágulo se haya formado, ya que puede haber razones fisiológicas para que ocurran tiempos prolongados de formación del coágulo. Por ejemplo, las muestras de pacientes de diálisis pueden continuar coagulándose por horas después de la colecta debido a la heparina empleada en la preparación de los pacientes para diálisis. En tales casos, pueden usarse; la recentrifugación, filtros de suero, y aplicadores de madera para remover la fibrina restante. Con tubos que no contienen geles separadores, es necesaria una etapa adicional para completar la separación. Antes de la centrifugación, los artículos tales como perlas de vidrio, tapones, o cualquier otro objeto mecánico puede ser adicionado a los tubos para realizar la misma función que el gel. Después de la centrifugación, pueden insertarse cilindros huecos, conteniendo filtros o válvulas de un sentido en una de las terminales, en un tubo de colecta para proveer una barrera física, y a la vez se pueden usar pipetas para remover manualmente el suero. El rendimiento del suero obtenido cuando se usan métodos alternativos de separación es menor que el obtenido con geles. El uso de estos procedimientos alternativos en lugar de los geles separadores incrementa el riesgo de derrames y consecuentemente de infección, por lo que a menudo incrementan los costos del laboratorio. Como se discutió antes, el suero debe ser separado de las células, de otra manera las células sanguíneas continuaran llevando a cabo sus funciones metabólicas y alterarán la composición del especimen. Aunque esto ocurre más rápida y dramáticamente en mediciones de gases sanguíneos, cambios más sutiles ocurren con el retardo en la separación de otras muestras. A temperatura ambiente, la glucólisis continúa lentamente, con una disminución en la concentración de glucosa a una velocidad un promedio del 3% por hora. Después de aproximadamente 24 horas, la falta de glucosa causa pérdida de potasio y de pequeñas proteínas, tales como enzimas de las células; y el rompimiento de compuestos de fosfato orgánico causa una elevación en el fosfato inorgánico. Después de varios días, se observa una visible hemólisis. Si las muestras son refrigeradas sin separación, la glucólisis es inhibida, pero ocurre la pérdida de potasio y de enzimas. En muestras de personas con cuentas altas de leucocitos o plaquetas, pueden ocurrir cambios drásticos después de la flebotomía. Las plaquetas liberan potasio de su citoplasma durante la formación del coágulo; esto causa que la concentración de potasio en suero sea más alta que en el plasma. Aunque los individuos normales tienen una diferencia de 0.2-0.3 mmol/L entre el potasio sérico y el plasmático, estas diferencias aumentan en un promedio de 0.15 mmol/L por cada incremento de 100,000/mm en la cuenta de plaquetas.refs(113) Debido a que los leucocitos son más activos metabólicamente que los eritrocitos, los cambios resultantes de una separación retardada son totalmente exagerados en pacientes con leucemia. La concentración de glucosa puede disminuir y la concentración de potasio puede empezar a elevarse en un tiempo tan corto como 30 minutos,ref(114) y el pH puede disminuir cerca de 0.6 187

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unidades en 10 minutos si la muestra no se pone rápidamente en un recipiente con hielo. En pacientes con leucemia linfocítica, la heparina parece inducir la degeneración de linfocitos in vitro, conduciendo a una rápida elevación de la concentración de potasio ref(115) en plasma (pero no en suero) como se muestra en la Fig. 3-7. Procedimiento para minimizar errores en el procesamiento de muestras. La manera más efectiva para minimizar errores en el procesamiento de la muestra, es la centrifugación de las muestras que requieren separación tan pronto como sea posible. Si se usan tubos sin ningún tipo de aditivo o anticoagulante, la centrifugación debe ser realizada por lo menos hasta que haya transcurrido media hora después de la extracción de sangre para permitir la formación completa del coágulo. Los tubos con aceleradores del coágulo o anticoagulantes pueden ser separados inmediatamente para prevenir cambios en la muestra. Después de la centrifugación, en muestras sin gel, el plasma o suero debe ser separado de las células tan pronto como sea posible para evitar cambios en la muestra.

Almacenamiento de muestras Errores originados debidos al almacenamiento inadecuado de muestras. Una vez que el suero o plasma ha sido separado de las células, la mayoría de las sustancias muestran pequeños cambios en la concentración en un período de 2-3 días cuando se mantienen a 4o C. Para compuestos analizados lábiles, incluyendo, enzimas como la creatina cinasa y lactato deshidrogenasa, la mayoría de las hormonas polipeptídicas, y algunas otras sustancias, las muestras deben ser congeladas para prevenir cambios relacionados con el almacenamiento. Los compuestos analizados que pueden ser intrínsecamente estables en almacenamiento pueden cambiar en presencia de otros compuestos. Por ejemplo, la concentración de triglicéridos disminuye en el suero obtenido de pacientes que toman heparina, aparentemente por la activación de la lipoproteina lipasa.ref(116) Antibióticos aminoglucósidos, tales como la tobramicina y gentamicina, son estables cuando se almacenan a temperaturas de refrigeración a menos que el suero también contenga ciertas penicilinas sintéticas, principalmente piperacilina; las concentraciones de aminoglucósidos pueden disminuir a menos del 50% su valor basal a las 72 horas, cuando ambos medicamentos están presentes.ref(117) La Evaporación puede incrementar la concentración de la muestra. Cuando una muestra no está cubierta, la velocidad de evaporación es afectada por la temperatura, humedad, movimiento del aire, y el área superficial de la muestra.ref(118) Si la humedad es baja (una situación frecuentemente encontrada en laboratorios con aire acondicionado), hay una relación lineal entre la temperatura y la velocidad de evaporación; sin embargo, con alta humedad, los cambios de temperatura tienen un efecto mínimo en la velocidad de evaporación. Uno de los factores más importantes que afectan la evaporación es la velocidad del movimiento del aire sobre la superficie de un líquido. Para cualquier velocidad dada de flujo de aire, el incremento en la altura de la columna de aire sobre la muestra o la reducción área de apertura del recipiente que contiene la muestra, disminuirá la velocidad de evaporación y decrecerá el movimiento de aire sobre la muestra. En las copas de muestra pequeñas completamente llenas, puede ocurrir hasta un 50% de pérdida de agua en pocas horas. Como en cualquier otra forma de hemoconcentración, esto conducirá a un incremento en la 188

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concentración de proteínas y sustancias unidas a proteínas; aunque también la evaporación incrementa la concentración de otros solutos. Procedimientos para minimizar errores por almacenamiento. Los errores por almacenamiento pueden ser evitados seleccionando adecuadamente la hora, temperatura, y condiciones de almacenamiento. La mayoría de los compuestos analizados son estables cuando se almacenan refrigerados hasta por 72 horas. Si un compuesto analizado no es estable, las muestras deben ser congeladas, hasta su análisis. La mayoría de especímenes pueden almacenarse a -70o C sin que sean afectadas las concentraciones de los compuestos analizados, más cuando sean congelados por varios años.ref(119) La actividad de fosfatasa alcalina puede incrementarse con la congelación, aparentemente como resultado de la destrucción de un inhibidor. A las temperaturas estándares de congelación de -10o a -20o C, la mayoría de las sustancias serán estables por períodos más cortos. Debe evitarse la descongelación y recongelación repetidas de muestras; esto es especialmente problemático con los congeladores modernos "libres de escarcha", los cuales periódicamente incrementan la temperatura de congelación para permitir la fusión de la escarcha. Los compuestos analizados que son susceptibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, como el complemento, deben ser almacenados en otro tipo de congeladores. Las muestras congeladas deben ser descongeladas lentamente a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37o C, y entonces ser mezcladas meticulosamente antes de su análisis. Para evitar la evaporación, las muestras deben ser almacenadas con tapa y mantenidas, si es posible, lejos de las áreas de flujo rápido de aire. Cuando sea posible, hay que usar recipientes con pequeña área de superficie y una columna de aire grande sobre la muestra para minimizar la evaporación. La identificación de cada muestra debe ser confirmada en cada una de las etapas de operación para minimizar la posibilidad de confundir los especímenes. Sin embargo, el muestreo directo a partir el tubo de colecta es el mejor camino para minimizar tales errores, especialmente si se cuenta con etiquetas que tienen código de barras y los lectores correspondientes.

Otros Aspectos Preanalíticos de la Colecta de Muestras Colecta de orina: fuentes de variación Variables biológicas. La variación preanalítica en la orina es algo difícil de controlar. Mientras que los cambios en concentración del suero están relacionados con el grado de hemoconcentración, la variación en orina puede ser causada por varios factores. La variable más importante en la determinación de la concentración urinaria de una sustancia es la cantidad relativa de agua excretada. El cuerpo es capaz de alterar marcadamente la concentración urinaria para satisfacer las necesidades de excreción y conservación de agua. Ya que la mayoría de solutos en orina están compuestos por productos de desecho como la urea y creatinina, la osmolalidad de la orina es una medida de la excreción relativa de agua. Los individuos sanos pueden tener una osmolalidad urinaria dentro de un rango de 75 a 1200 mOsm/kg; la concentración relativa de otros solutos, por consiguiente puede variar alrededor de 15 veces. Como se discutió antes en la variación al azar, la variación intraindividual en concentración de orina es, en 189

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promedio, varias veces más alta que la variación intraindividual para los mismos compuestos analizados en suero.ref(120) Controlando el grado de hidratación de los pacientes durante el proceso de colecta de orina se puede minimizar la fuente de variabilidad. Otras causas de variación preanalítica también afectan las mediciones de orina. Existe una variación diurna independiente de la concentración relativa de varias sustancias de la orina, principalmente proteínas, sodio y potasio, fosfatos, y hormonas. Parte de la variación diurna en la excreción de proteínas está relacionada con la postura ya que la concentración relativa de proteínas comparada con la de la creatinina, aumenta cuando se está de pie.ref(121) El estrés incrementa la excreción de proteínas; el ejercicio y la fiebre han demostrado ser causa de un incremento transitorio en proteínas.ref(122) Los cambios dietéticos en la ingesta de una sustancia, a menudo alterarán la excreción urinaria. La hidroxiprolina, un componente de la colágena, se usa frecuentemente para medir el recambio metabólico del hueso; la gelatina, un componente de muchos alimentos procesados, contiene colágena y puede ser la principal fuente de excreción urinaria de hidroxiprolina.ref(123) La excreción de creatinina es a menudo usada para evaluar la adecuada colecta de orina para un determinado tiempo. Sin embargo, la fluctuación por cortos períodos en la ingestión de proteínas en la dieta altera la excreción de creatinina en orina.ref(124) Tiempo de colecta. La variación en las mediciones de orina puede ser el resultado de la colecta inadecuada de una orina de 24 horas. Tales muestras se encuentran dentro de las más difíciles de colectar correctamente. Como ya se mencionó, la creatinina en orina a menudo es usada para medir la colecta completa de la orina, y las muestras con mucha o muy poca creatinina son consideradas como provenientes de una incorrecta colecta. Debido a que la excreción de creatinina es relativamente reproducible en un individuo con una dieta estable (con un promedio de variación diaria del 10%, con una pequeña variación diurna), la relación existente entre la concentración de la sustancia de interés y la de creatinina han sido considerada como un medio de proveer una estimación exacta de la excreción urinaria total.refs(125) Esto es especialmente importante para muestras pediátricas, ya que es difícil obtener la cooperación de los niños en las colecciones de orina por tiempo. Estabilidad de la muestra. Muchos compuestos que son estables en suero son inestables en orina. Tanto la contaminación bacteriana como el pH bajo pueden producir cambios in vitro en la concentración de muchos compuestos analizados. La colecta de orina en recipientes con varios preservativos ácidos o bases, se requiere comúnmente para evitar tal variación; una discusión más completa sobre preservativos para orina es dada en el Capítulo 57. En general, las sustancias estables como los electrólitos, proteínas, y creatinina pueden ser medidas en muestras de orina sin el uso de preservativos. La adición de ácidos o bases concentradas generalmente no afecta las mediciones de electrólitos y creatinina; sin embargo, un especimen conteniendo un preservativo apropiado para medir un compuesto analizado, puede ser inadecuado para realizar en la medición de otra sustancia. El almacenamiento de las muestras de orina durante la colecta también puede alterar la concentración de compuestos analizados. Por ejemplo, las porfirinas son inestables cuando son expuestas a la luz, mientras que el calcio puede precipitarse a bajas temperaturas. La mayoría de los elementos formados en la orina, 190

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como los depósitos de material celular, son inestables cuando se almacenan. La refrigeración de muestras de orinas es a menudo usada para evitar crecimiento bacteriano. Sin embargo, la refrigeración, promueve la formación de cristales que se encuentran a temperatura corporal y disminuye la concentración de aquellas sustancias que se han precipitado. Variación preanalítica en otros fluidos corporales. La variación preanalítica en otros fluidos corporales no ha sido estudiada en forma extensa. Muchos factores que afectan otras muestras tales como la hemoconcentración, uso del torniquete y estrés no afectan la composición de los fluidos cefalorraquídeo, peritoneal, y sinovial. El retraso en el transporte de los especímenes al laboratorio, generalmente causa pequeños cambios en la composición de fluidos normales, ya que esos especímenes están prácticamente libres de células. Si se requieren las mediciones de compuestos analizados inestables, como lactato glucosa o pH, las muestras deben ser transportadas al laboratorio en agua con hielo para evitar cambios artificiales en la concentración. Para otros fluidos aparte del líquido cefalorraquídeo, es recomendable el uso de un anticoagulante para evitar la formación de coágulos de fibrina, los cuales pueden disminuir artificialmente las cuentas celulares.

Colecta de muestras en infantes Muestreo capilar. La venipuntura en infantes y niños pequeños generalmente no es un método aceptable para la obtención de sangre, en ambos casos debido a la dificultad para encontrar una vena y la importancia de preservar venas disponibles para ser usadas en la administración de fluidos intravenosos. La sangre capilar es el especimen que usualmente está disponible para las pruebas de estos niños. En neonatos, las partes externas de la planta del pie son los sitios preferidos para punción en piel, mientras que los lóbulos de las orejas y los dedos son aceptables en infantes mayores y niños pequeños. La superficie de la piel es entibiada para producir sangre capilar "arterializada"; como se menciono antes, sin embargo, la concordancia con gases sanguíneos arteriales es poca en neonatos, particularmente en infantes prematuros. Es esencial dejar que se seque el antiséptico tópico que se haya usado antes de hacer la punción de la piel, ya que la sangre colectada se mezclará libremente con cualquier líquido remanente en la superficie. La contaminación con antisépticos puede diluir falsamente especímenes y causar hemólisis. Pueden ser de utilidad aplicar una suave presión después de que la piel ha sido puncionada, pero el oprimir el sitio de punción contamina la muestra con fluido tisular. Debido al pequeño volumen de muestra obtenido y, el alto hematocrito en neonatos, la cantidad de suero o plasma disponible para la prueba es relativamente escasa. Para facilitar la colecta adecuada de especímenes, existen tubos capilares que contienen anticoagulantes o preservativos. El uso de tubos pediátricos con separadores de suero o plasma heparinizado producirá una cantidad mayor de muestra por volumen de sangre obtenida. Sin embargo, la escasa cantidad de muestra a menudo resulta en una área de superficie relativamente grande, haciendo de la evaporación una consideración aún más importante. El control de los factores que causan la evaporación es especialmente importante en muestras pediátricas. Los cambios 191

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relacionados con hemoconcentración, postura, y dietas son relativamente menos importantes en neonatos que en niños mayores o adultos. La magnitud de las variaciones cíclicas en infantes y niños aún se desconocen en una medida. Colecta de sangre para enfermedades metabólicas. Cuando los infantes son estudiados para errores innatos del metabolismo, las muestras son colectadas en papel filtro y se transportan a un laboratorio especializado en manchas de sangre seca. Existe poca información sobre los factores preanalíticos específicos relacionados con manchas de sangre; sin embargo, se sabe que algunos factores afectan los resultados de tales pruebas.ref(126) Debido a que tales especímenes son colectados como sangre capilar, se debe tener cuidado de evitar la contaminación con antisépticos que pueden interferir en los ensayos. El papel debe estar completamente saturado en el área de colecta para proveer una cantidad adecuada de muestra. Para muchos errores metabólicos, el estudio no debe hacerse hasta que el infante tenga por lo menos 24 horas después que se le comenzó a alimentar, ya que los productos metabólicos que se acumulan son derivados de los alimentos ingeridos. La obtención especímenes antes de este tiempo, puede producir resultados falsos negativos. Para pruebas que requieren mediciones de actividad enzimática, debe tenerse cuidado en evitar la exposición de los especímenes al calor excesivo durante el proceso de transporte; si los especímenes son enviados por correo, las temperaturas de los buzones pueden ser suficientemente altas para producir resultados artificialmente bajos. Todas las precauciones generales discutidas previamente, tales como prevención de la evaporación y el mal etiquetado, se deben observar cuidadosamente.

Uso de sistemas computarizados para la detección de errores Los sistemas de computación que ayudan a la detección de errores pueden reducir el número de resultados erróneos que son reportados.ref(127) En muchos sistemas de computación de laboratorio y hospitales, es posible comparar los resultados de un especimen actual con los de muestras previas del mismo paciente (ver Capítulo 18). Tales comparaciones de resultados son llamadas verificaciones delta.ref(128) Una revisión delta pueden examinar la variación de los resultados por cantidad o en porcentaje; en algunos sistemas es posible usar un tipo de verificación para los valores a un cierto nivel y otro para niveles de concentración más altos o más bajos. Las pruebas que son particularmente apropiadas para monitorear las verificaciones delta son aquellas que normalmente cambian poco de un día a otro. Algunas de ellas aparecen en la Tabla 3-4. Se puede usar la medición de la velocidad de cambio de un compuesto analizado para mejorar la sensibilidad de detección de errores.ref(129) Las verificaciones delta no deben ser usadas para sustancias que están sujetas a variaciones intraindividuales pronunciadas (ver Tabla 3-4). En la Tabla 3-5 se da una lista de los valores de verificaciones delta usadas en nuestro laboratorio. Aunque las fluctuaciones en los resultados de una prueba pueden ser vistas cuando mucho en un 1% de todos lo especímenes, los resultados de pruebas múltiples que no pasan la revisión delta, son por lo general el resultado ya sea de un cambio significante en la condición del paciente o de un especimen no representativo. Se puede mejorar la utilidad de las revisiones delta mediante selección de las pruebas que cambian típicamente en paralelo, como ALAT y ASAT o urea y creatinina, (Tabla 3-4).ref(130) Algunos casos comunes de falla en la revisión delta, incluyen la extracción de especímenes de líneas intravenosas, especímenes 192

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contaminados, y especímenes mal identificados. La revisión de tales resultados antes de su reporte puede conducir a una significante reducción en el reporte de resultados erróneos. En la Fig. 3-8 se presenta un método que puede ser usado para la evaluación de especímenes que no pasan la revisión delta.

Criterio para el rechazo de especímenes Para evitar el reporte de resultados falsos, cada laboratorio debe establecer el criterio para el rechazo de especímenes. Un especimen debe ser rechazado cuando los resultados obtenidos en su análisis no representan el estado del paciente. La causa más común de rechazo de un especimen es una identificación inadecuada. Los especímenes deben tener el nombre del paciente y número de identificación tanto en la muestra como en la requisición. Los especímenes que no son extraídos por el personal del laboratorio deben ser cuidadosamente revisados antes de ser aceptados en el laboratorio. En especímenes que requieren manejo especial, las causas más comunes de rechazo son la colecta y/o transporte inadecuado. La mayoría de los laboratorios que procesan gases sanguíneos, tienen un promedio de un 5% de muestras mal colectadas, y que deben ser rechazadas.ref(131) Con frecuencia los especímenes son colectados en el tubo incorrecto para el ensayo requerido. Cada laboratorio debe tener una lista de muestras alternativas aceptables para cada prueba; por ejemplo, el manual del laboratorio puede sugerir la colecta de suero para una prueba en particular, pero una muestra de plasma heparinizado puede ser una alternativa aceptable. Si las muestras contienen otros anticoagulantes o preservativos, deben ser rechazadas (aunque sea útil para otros análisis). Para tubos que contienen anticoagulantes o preservativos debe haber una proporción entre la muestra y el preservativo. Esto es más crítico con preservativos en soluciones líquidas, pero puede ocurrir también con anticoagulantes en polvo. Los tubos que no tengan la proporción apropiada no deben ser aceptados para análisis. Para pruebas que requieren preparación especial del paciente y ésta no se llevó a cabo, las muestras deber ser rechazadas. Si una prueba es afectada por hemólisis, los especímenes hemolisados deben rechazarse. Si el resultado de una prueba es afectado por lipemia (y la muestra no puede ser clarificada por ultracentrifugación antes del análisis), los resultados de la prueba no deben ser reportados. Finalmente, cualquier resultado que no pase la revisión delta o que sea considerado irreal (potasio mayor de 10 mmol/L, calcio menor de 40 mg/L, etc.), debe ser reportado al director del laboratorio para su verificación antes de ser reportado. Aunque muchos médicos se quejan cuando el laboratorio no les reporta el resultado de las pruebas que ordenaron para sus pacientes, si hay alguna duda a cerca de la validez de un resultado este no debe ser reportado. Los resultados erróneos pueden conducir al tratamiento inadecuado del paciente.

Referencias 1.

Arendt, J, Minors, DS, and Waterhouse, JM (eds): Biological rhythms in clinical practice. Boston, Wright, 1989. 2. Liskowsky, DR: Biological rhythms and shift work. JAMA 268:3047, 1992.

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Tablas Tabla 3-1. Variación intraindividual en pruebas comunes de laboratorio.refs(132)

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Suero de prueba

Medio%

Intervalo%

Alanina aminotransferasa Albumina Fosfatasa alcalina Amilasa Aspartato aminotransferasae Bilirrubina, total Calcio, total Cloro Colesterol, HDL Creatinina Ferritina Glucosa, en ayunas Hierro Lactato dehidrogenasa Magnesio Osmolalidad Fosfato Potasio

20 2.5 7 9 8 19 2 1.2 6 5 10 10 15 10 4 1 8 3

5-30 1.5-4 5-10 5-12 5-12 13-30 1-3 1.1-1.3 3-9 3-8 5-18 5-13 10-25 8-13 3-5 1-2 5-10 1-5

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Proteínas, totales Sodio Tirotropina (TSH) Tiroxina Triglicéridos Urea (BUN) Ácido úrico

2 0.6 18 5 20 10 7

2-3.5 0.5-1 15-20 4-7 15-30 5-17 5-10

Tabla 3-2. Indicaciones para los anticoagulantes y preservativos mas comúnmente usados.

Muestras Aplicación Sangre total Hematología Plomo Plasma Coagulación

Tipo de anticoagulante o preservativo

Base química del anticoagulante o preservativo

EDTA*

Unión al calcio

Heparina de sodio

libre de plomo

Citrato de sodio

Unión al calcio

Heparina**

Inhibe la trombina

Oxalatos

Unión al calcio

Ninguno

Ninguno

Ninguno

Libre de

Bioquímica Coagulación Suero Bioquímica Elementos contaminantes traza Separador de suero

Barrera de gel

Trombina

Aumenta la velocidad

Bioquímica Bioquímica de de coagulación emergencia Agentes Suero Glucosa, ácido

Antiglucoliíticos Yodoacetato

Inhibe el gliceraldehido 3- fosfato

láctico Plasma parcial Glucosa

Fluoruro/oxalato

*se obtiene como Na+ o sales de K+ ** se obtiene como Na+, LI+ o sales NH4+

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deshidrogenasa Inhibe la enolasa

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Tabla 3-3. Efecto de las variables en el manejo de especímenes la medición de gases sanguíneos. Factor no controlado pH El espécimen no fue sumergido en agua con hielo Burbujas de aire que no se retiraron Exceso de heparina líquida adicionada

PO2 Disminuye hasta 0.01 en 10 minutos Aumente la muestra si se agita Disminuye con algunas formas; en general no hay efecto

PCO2 Disminuye hasta 5% en 10 minutos

Cambio mínimo

Aumenta ligeramente, disminuye en pacientes con PO2 inicial alto Aumenta ligeramente. disminuye en pacientes con inicial PO2 alto

Disminuye

Tabla 3-4. Revisiones delta para análisis. Apropiado

Inapropiado

Electrólitos; Na, K, Cl Glucosa Proteína Total Fosfato Albumina Lactato Deshidrogenasa Urea Creatina cinasa Creatinina Aspartato Aminotransferasa Fosfatasa Alcalina Alanina Aminotransferasa Hemoglobina y hematocrito; MCV y amplitud de la distribución de las células rojas

Tabla 3-5. Valores de revisión delta. Prueba Albumina Brecha aniónica Calcio Cloro Colesterol

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Valor de revisión delta 10 g/L 10 mmol/L 10 mg/L 5 mmol/L ±30%

Disminuye

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Contenido de CO2 Creatinina Bilirrubina directa Glucosa (solo en ayunas) Magnesio Volumen medio corpuscular Volumen medio de plaquetas Osmolalidad Potasio Proteínas Amplitud de la distribución de células rojas Sodio Bilirrubina total Nitrógeno úrico Ácido urico

5 mmol/L ±50% ±50% ±30% 0.25 mmol/L 4 m3 1.5 m3 15 mosm/kg 1 mmol/L 10 g/L 2 % (cambio absoluto) 5 mmol/L ±50% ±50% 15 mg/L

Figuras

Figura 3-1 Patrones diurno y ultradiano de liberación de hormonas. La mayoría de hormonas pituitarias muestran una pronunciada variación diurna, con niveles generalmente más altos durante la noche que durante el día. Algunas hormonas, tales como la del crecimiento (ilustrada aquí), son liberadas en episodios bruscos durante el día. Un solo resultado al azar es difícil de interpretar, porque puede representar un pico, una depresión, o un punto intermedio.

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Figura 3-2. El efecto del ejercicio en los resultados de las pruebas de laboratorio. Datos de 750 estudiantes de medicina, muestra que el ejercicio esta asociado con un cambio o desviación en la distribución de resultados hacia valores más altos (distribuidos en el eje de las x; y el eje de las y representa el número de estudiantes).

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Figura 3-3. Representación esquemática de tubos capilares heparinizados. El imán se usa para mover el metal que esta dentro del tubo sellado a fin de mezclar la muestra con heparina y, posteriormente, volver a mezclar la muestra antes de someterla al análisis.

Figura 3-4. Tubos de flebotomía vacutainer que contienen gel de barrera (tapones rojo/gris). 1, Tubo llenado con sangre y centrifugado; 2, Tubo sin llenar; y 3, Tubo llenado con sangre y sin centrifugar. Advierta las posiciones del gel antes (3) y después de la centrifugación (1). B, Sangre coagulada; St, tapones rojo/gris; G, gel de barrera; S, suero

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Figura 3-5. Efectos que ocurren en la concentración plasmática de sodio al aplicar un torniquete y apretar el puño (panel superior) efecto al usar solamente el torniquete (panel inferior). Los círculos negros representan el paciente y los círculos blancos los sujetos de control. La aplicación sola del torniquete no tiene ningún efecto en los niveles de potasio, mientras que al cerrar el puño resulta en un fuerte incremento en los niveles tanto del paciente como los sujetos de control (De: Don BR, Sebastian A, Cheitlin M, et al: N Engl J Med 322:1291, 1990.)

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Figura 3-6. Ejemplo de una forma para la cadena de custodia. (De: Pesce AJ, Kaplan LA: In Methods in Clinical Chemistry, St Louis, 1987, Mosby)

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Figura 3-7. Efecto de heparina en el potasio en leucemia linfocítica. La gráfica representa la concentración de potasio en "suero" obtenida durante la cirugía para retirar el bazo en un paciente con leucemia linfocítica crónica con una cuenta de leucocitos de 350,000/mm3. El punto A representa potasio preoperatorio en suero. Los siguientes tres puntos representan los especímenes obtenidos a través de un catéter arterial conteniendo heparina después de 1, 2, y 3.5 horas de iniciada la cirugía. El punto B representa el potasio en suero obtenido del brazo opuesto al catéter arterial 15 minutos después del espécimen previo con un potasio en "suero"de 11.2 mmol/L.

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Figura 3-8. Diagrama de flujo de las alertas delta.

CAPÍTULO 4

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4. Técnicas Espectrales Amadeo J. Pesce Christopher S. Frings Jack Gauldie

Luz y materia Propiedades de la luz y la energía radiante Interacciones de la luz con la materia. Espectroscopía de absorción Absorción de energía radiante Ley de Lambert y Beer Instrumentación Rendimiento del instrumento Selección de las condiciones óptimas y sus limitaciones Pruebas para el control de calidad de los espectrofotómetros Espectrofotometría de reflectancia Registrando la espectrofotometría espectral. Absorción atómica Fundamento Instrumentación Fuentes de error Fotometría de llama Fundamento Fluorometría Fundamento Instrumentación Limitaciones Fluorescencia de resolución tardía Quimioluminiscencia Fluorescencia de polarización. Nefelometría y turbidimetría Fundamentos Instrumentación Limitaciones: turbidimetría frente a la nefelometría. Refractometría Fundamento Aplicaciones Interferencias Instrumentación.

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OBJETIVOS Describir las relaciones entre longitud de onda, frecuencia, energía y el color del espectro visible y ultravioleta. Describir las relaciones entre porcentaje de transmitancia (%T) y absorbancia (A). Como afecta esta relación el color de una solución. Describir la Ley de Lambert-Beer y sus limitaciones. Mostrar la construcción y funcionamiento de monocromadores fotométricos y detectores; explicar las ventajas y desventajas asociadas con el uso de cada uno de los instrumentos espectrales. Además describir los principios de aislamiento espectral y ancho de banda. Trazar un diagrama de los componentes esenciales del espectrofotómetro de absorción atómica y del fluorómetro. Mencionar el principio de funcionamiento, clarificar las similitudes y diferencias. Explicar las interferencias asociadas con cada uno. Describir como la instrumentación y los fundamentos básicos de fotometría son modificados con las aplicaciones en: turbidimetría, nefelometría o fluorometría e identificar cada una de las interferencias o fuentes de error asociadas con cada una. Describir una de las reacciones químicas que se produce en quimioluminiscencia. Comparar y diferenciar los principios espectroscópicos de absorción y emisión.

Términos clave absorbancia Definida como 2 - log %T, es directamente proporcional a la concentración de las sustancias absorbentes si se sigue la ley de Beer. absorción atómica sin llama Técnica de absorción atómica en la cual el elemento es transformado a la fase gaseosa sin el uso de llama. absorción molar (e) Absorbancia de luz a una longitud de onda específica dividida entre el producto de la concentración en moles por litro y la longitud del camino óptico de la muestra en centímetros. La absorción molar se expresa como L/mol.cm. absortividad Absorbancia dividida entre el producto de la concentración de una sustancia y la longitud del paso de luz de una muestra. ancho de banda Intervalo de longitudes de onda que alcanza la abertura de salida de un monocromador; usualmente se define como el intervalo de longitudes de onda a un punto igual a la mitad del máximo (pico) de la intensidad transmitida. ángulo de detección Ángulo en el cual la luz dispersada es medida en nefelometría. arreglo de diodos Matriz bidimensional de semiconductores sensibles a la luz, cuya respuesta permite trazar el espectro de absorción completo en milisegundos. (Diode array, en inglés) bioluminescencia Catálisis enzimática de una reacción usando moléculas orgánicas complejas y adenosín trifosfato (ATP) para emitir luz. blanco Solución que contiene todos los componentes incluyendo solutos y solventes, excepto el compuesto a ser medido. Esta solución se utiliza para fijar Io, la intensidad de luz original. cubeta Receptáculo en el cual se coloca la muestra en un fotómetro. También se le denomina celda. dispersión de la luz Interacción de la luz con partículas que provocan la desviación de su 207

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camino original (principio de turbidez). dispersión de Rayleigh Reflexión de la luz a diferentes ángulos por partículas suspendidas en una solución. Esta dispersión ocurre cuando la longitud de onda de la luz es mayor que el tamaño de las partículas. espectro de absorción Intervalo de energía electromagnética utilizado en el análisis espectral, incluyendo la luz visible y la radiación ultravioleta; también se le denomina a la gráfica o trazo de un espectro de un compuesto específico. espectro de línea Espectro discontinuo de emisión de elementos en los cuales las bandas de luz emitidas cubren un intervalo estrecho de energías (0.1 nm). espectrofotometría de absorción atómica Medida espectroscópica cuantitativa en la cual la luz emitida de una fuente compuesta por un elemento es absorbida por el mismo elemento en fase gaseosa. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración del elemento en la muestra. espectrofotometría de reflectancia Técnica espectrométrica cuantitativa en la cual, la luz reflejada desde una superficie de una reacción colorimétrica es usada para medir la cantidad del producto de la reacción. espectrofotómetro Instrumento que mide la intensidad de la luz. Compuesto por una fuente de energía radiante, abertura de entrada, monocromador, abertura de salida, soporte de la cubeta, detector y mecanismo de medición. Las mediciones en este instrumento pueden realizarse sobre un intervalo continuo del espectro disponible. estándar interno Elemento o compuesto añadido en una cantidad conocida para producir una señal frente a la cual podrá calibrarse un instrumento o el compuesto analizado por determinarse. filtro Dispositivo óptico (generalmente de vidrio) que permite sólo el paso de una porción de la luz policromática incidente. La cantidad de luz trasmitida está relacionada con el ancho de banda del filtro. fluorescencia de resolución tardía Técnica en la cual se mide la fluorescencia lentamente emitida por componentes tales como los metales quelados. Se determinan usualmente entre los 400 y 1000 mseg. fluorescencia polarizada Orientación de la luz fluorescente emitida, la cual puede ser calculada por la fórmula de polarización. fluorescencia Luz emitida por un átomo o molécula después de la absorción de un fotón. Esta luz tiene una longitud de onda mayor (menor energía) que la luz absorbida y es usualmente emitida en menos de 10-8 segundos. Sin embargo, algunos componentes emiten el fotón a una velocidad más lenta. fosforescencia Similar a la fluorescencia, luz emitida por un átomo o molécula después de la absorción de un fotón. La luz es usualmente emitida a un tiempo mayor de 10-3 segundos después de la absorción de un fotón. fotodetector Aparato que responde a la luz (fotones) usualmente de manera proporcional al número de fotones que chocan sobre su superficie fotosensible. Generalmente se genera una corriente eléctrica proporcional a la intensidad de la luz incidente. fotómetro Instrumento que mide la intensidad de la luz, formado por una fuente de energía radiante, un filtro para la selección de longitudes de onda, un soporte para cubeta, un detector, y un mecanismo de medición. 208

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fotón Consiste en una partícula con una carga discreta de energía radiante. índice de refracción Razón de la velocidad de la luz en dos medios diferentes; generalmente el medio de referencia es el aire. lámpara de cátodo hueco Lámpara consiste en un cátodo de metal y un gas inerte. Cuando una corriente eléctrica pasa a través del cátodo, el metal es expulsado libremente y luego de chocar con el gas de la lámpara emite un espectro lineal de longitudes de onda específicas relacionadas con el metal del cátodo. ley de Lambert-Beer (comúnmente conocida como ley de Beer) La concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida. longitud de onda de emisión Longitud de onda radiante ( em) utilizada para determinar el decaimiento de las moléculas excitadas en la fluorescencia; se refiere usualmente a la longitud de onda de los fotones de salida medidos en un fluorómetro. longitud de onda de excitación Longitud de onda de energía radiante ( ex) que es absorbida por una molécula, que produce su promoción a un estado energético mayor; usualmente se refiere a la longitud de onda de la energía incidente en el fluorómetro. longitud de onda Distancia lineal atravesada por un ciclo completo de onda de energía electromagnética. luminiscencia Luz emitida a bajas temperaturas, a menudo como resultado de una reacción química. luz errática Energía radiante que alcanza el detector y consiste en longitudes de onda distintas a las definidas por el filtro o monocromador. luz visible Energía radiante en el espectro electromagnético que es visible al ojo humano (aproximadamente de 390 a 780 nm). monocromador Aparato usado para aislar una cierta longitud de onda o rango de longitudes de onda. Generalmente se refiere a prismas o redes de difracción. monocromático Luz de un solo color (longitud de onda). En la práctica se refiere a la energía radiante compuesta por un intervalo muy estrecho de longitudes de onda. nefelometría Técnica que mide la cantidad de luz dispersada por las partículas suspendidas en una solución. policromático Luz de muchos colores (longitud de onda), usualmente referido a la luz blanca, o que comprende una región definida del espectro. quimioluminiscencia Reacción química que implica oxidación usualmente, en el cual uno de los productos es luz. radiación infrarroja Región del espectro electromagnético que se extiende desde 780 a 300,000 nm. radiación ultravioleta Región del espectro electromagnético entre los 180 a 390 nm. red de difracción Elemento óptico que consiste en una superficie reflejante de líneas paralelas igualmente espaciadas que dispersa luz policromática en un espectro continuo y uniforme. La dispersión de la luz se atribuye a fenómenos de interferencia en la superficie. refracción Proceso por el cual el camino de la luz incidente es desviado después que la esta pasa oblicuamente de un medio a otro de diferente densidad. refractómetro Instrumento para medir el índice de refracción (refractividad) de varias sustancias, especialmente de soluciones. transición electrónica Cambio de la posición orbital del electrón de un átomo o molécula. En 209

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el caso de la absorción de un fotón de luz, el electrón usualmente va de un nivel de energía más bajo o basal a uno más elevado con un estado de energía mayor (energía aumentada) de la molécula. Es la base del fenómeno de fluorescencia.

Luz y Materiarefs(133) Propiedades de la luz y la energía radiante La energía radiante electromagnética es una forma de energía que puede describirse en términos de sus propiedades ondulatorias. Las ondas electromagnéticas viajan a grandes velocidades y no se requiere la existencia de un medio de soporte para su propagación. La longitud de onda, , de un rayo de energía radiante electromagnética es la distancia lineal atravesada por un ciclo completo de onda y usualmente se expresa en nanómetros (nm, 10-9 metros). La frecuencia, v, es el número de ciclos que ocurren por segundo y se obtiene por la relación c v = –––

La velocidad, c, varía con el medio a través del cual atraviesa la energía radiante (c = 3 x 1010 cm/seg cuando se mide en el vacío). Puede demostrarse que la energía radiante se comporta como si estuviera compuesta de cargas discretas de energía llamada fotones. La energía de un fotón es variable y depende de la longitud de onda o frecuencia de la energía radiante. La relación entre la energía, E, de un fotón y la frecuencia está dada por la fórmula E = hv h es la constante de Planck y tiene un valor numérico de 6.62 x 10-27 erg.seg. La expresión equivalente que introduce a la longitud de onda es hc E = –––

Esta ecuación demuestra que las longitudes de onda corta tienen mucha más energía que las longitudes de onda larga. El espectro electromagnético abarca un intervalo muy grande de longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 4-1. Las áreas del espectro electromagnético utilizadas generalmente en el laboratorio clínico son: el ultravioleta (UV) y las regiones visibles. La región visible está definida como la región entre 390 y 780 nm, mientras que el espectro ultravioleta definido para el laboratorio de química clínica cae entre 180 y 390 nm. La luz solar o la luz emitida por un filamento de tungsteno es una mezcla de energía radiante de diferentes longitudes de onda que el ojo reconoce como “blanco”. La desintegración de la 210

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región visible en color absorbido y color reflejado se ilustra en la Tabla 4-2. Si una solución absorbe energía radiante (luz) entre 400 y 480 nm (azul), transmitirá todos los demás colores y aparecerá amarilla al ojo. Por lo tanto el amarillo es el color complementario del color azul. Si se enfoca la luz blanca sobre una solución que absorbe energía entre 505 y 555 nm (verde), la luz transmitida y por consiguiente la solución aparecerá color púrpura (azul y rojo). Si se dirige una luz roja sobre una solución de color rojo, la luz roja será transmitida porque esta solución no puede absorber la luz roja. Por otra parte, si la luz verde se hace incidir sobre una solución de color rojo, no hay luz transmitida, puesto que la solución absorbe toda la luz excepto la roja. El ojo humano responde a la energía radiante entre 390 y 700 nm, pero los instrumentos del laboratorio permiten mediciones del espectro tanto de longitudes de onda corta como la UV y longitudes de onda larga, como el infrarrojo.

Interacciones de la luz con la materia Proceso de absorción. Cuando un átomo, ion o molécula absorbe un fotón, la energía agregada produce una alteración del estado, y se dice que las especies están excitadas. La excitación puede involucrar alguno de los siguientes procesos: 1. Transición de un electrón a un nivel mayor de energía. 2. Un cambio en el modo de vibración de las moléculas con enlaces covalentes. 3. Alteración de su modo de rotación alrededor de los enlaces covalentes. Cada una de estas transiciones requiere una cantidad definida de energía; la probabilidad de que ocurra una determinada transición es mucho mayor cuando el fotón absorbido proporciona dicha cantidad definida de energía. Los requerimientos de energía para estas transiciones varían ampliamente. Usualmente la promoción de electrones a niveles superiores de energía requiere la absorción de gran cantidad de energía que la requerida para provocar cambios vibracionales. Usualmente las alteraciones en la rotación tienen menores requerimientos energéticos. Por consiguiente, la absorción de energía en la región de microondas e infrarrojo lejano produce transferencias en los niveles de energía de rotación, puesto que la energía de la radiación es insuficiente para ocasionar otros tipos de transiciones. Los cambios en los niveles vibracionales son ocasionados por la absorción en el infrarrojo cercano y las regiones del visible. La promoción de un electrón a un nivel superior de energía ocurre después de la absorción de energía en las regiones del espectro visible, ultravioleta y de rayos X. La energía almacenada por los electrones en los enlaces covalentes varía según la naturaleza de los enlaces. La energía de un fotón de luz necesaria para excitar un electrón variará por lo tanto, con el enlace y cada tipo de enlace tendrá su propio patrón característico de longitudes de onda óptimas de luz que pueden ser absorbidas por ese enlace. La Tabla 4-3 proporciona bandas de absorción de muchos grupos orgánicos.ref(134) El patrón de absorción de moléculas orgánicas complejas que contienen decenas de miles de enlaces, por lo tanto debe describir la suma acumulativa de la absorción de todos los enlaces covalentes. La absorción de la energía radiante por una solución puede describirse por medio de una gráfica de absorbancia en función de la longitud de onda. Esta gráfica se denomina espectro de absorción (Fig. 4-1). El espectro de absorción refleja la suma de las transiciones 211

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características de energía de una molécula en cada longitud de onda. El espectro de absorción frecuentemente se utiliza para propósitos de identificación cualitativa. Esto es particularmente cierto para energías de baja absorción, como las que se encuentran en la región infrarroja. Independiente de la cantidad de energía absorbida, una especie excitada tiende a regresar espontáneamente a su estado basal o no excitado; en el proceso se libera energía cinética (movimiento), vibracional, o energía luminosa (ver el texto de fluorescencia). Procesos de emisión. Algunos elementos y compuestos pueden ser excitados de manera que, cuando el electrón regresa de un estado excitado a uno basal la energía se disipa como energía radiante. La energía radiante consiste en uno o más niveles de energía y por lo tanto en diferentes longitudes de onda. Este principio se aplica en fotometría de llama y métodos fluorométricos, y será discutido más adelante.

Espectroscoía De Absorciónrefs(135)

Absorción de energía radiante Considérese un haz de energía radiante con una intensidad inicial, Io, que incide sobre una celda cuadrada y pasa a través de ella (cuyos lados son perpendiculares al haz). La celda contiene una solución de un compuesto que absorbe energía radiante de una cierta longitud de onda (Fig. 4-2). La intensidad de la energía radiante transmitida, Is, será menor que Io. Parte de la energía radiante será reflejada por la superficie de la celda o absorbida por la pared de la celda o el solvente. Por lo tanto estos factores deben ser eliminados si se desea considerar sólo la absorción del compuesto de interés. Esto se hace usando un blanco o solución de referencia que contiene todo menos el compuesto a ser determinado. La cantidad de luz que pasa a través de la solución blanco se establece como la nueva Io (relativa a la celda de referencia y la solución). La transmitancia de un compuesto en solución se define como la proporción de luz incidente que es transmitida: Transmitancia = T = Is /Io Usualmente esta razón se describe como un porcentaje Porcentaje de T = %T = Is/Io x 100 El concepto de transmitancia es importante porque sólo puede medirse la luz transmitida. Cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta, más luz es absorbida por la solución y menos es transmitida. El porcentaje de T varia inversamente y logarítmicamente con la concentración. Sin embargo, es más conveniente usar la absorbancia, A, la cual es directamente proporcional a la concentración. Por lo tanto 1 A = – log Is/Io = – log T = log ––– 212

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T Para convertir T en %T, el denominador y el numerador son multiplicados por 100: 1 100% 100% A = log ––– x –––––– = log ––––– T 100% T Esto puede rearreglarse

A = log 100% – log %T o A = 2 – log %T Es importante recordar que la absorbancia no es una cantidad directamente cuantificable, sino que puede ser obtenida por cálculo matemático de los datos de transmitancia. La relación entre absorbancia y %T se ilustra en la Fig. 4-3, en la cual la escala lineal de %T va de 0 a 100%, mientras que la escala logarítmica de la absorbancia ve de infinito a 0.

Ley de Lambert-Beer La ley de Lambert-Beer (comúnmente conocida como ley de Beer) establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida. Si la concentración de una solución es constante y la longitud del paso de luz que atraviesa una solución se duplica, el efecto sobre la absorbancia es igual duplicar la concentración, ya que habrá dos veces más moléculas absorbentes presentes en el paso de energía radiante. De este modo la absorbancia también es directamente proporcional a la longitud de la trayectoria que atraviesa la energía radiante a través de la celda. La relación matemática entre la absorción de energía radiante, la concentración de la solución, y la longitud del paso óptico se demuestra por la ley de Beer: A = abc A es la absorbancia; a, absortividad; b, paso de luz de la solución en centímetros; y c, concentración de la sustancia de interés. Esta ecuación forma las bases del análisis cuantitativo por fotometría de absorción o espectroscopía de absorción. Los valores de absorbancia no tienen unidades. La absortividad es una constante de proporcionalidad relacionada con la naturaleza química del soluto y tiene unidades que son recíprocas con las de b y c. Cuando c se expresa en moles por litro y b en centímetros, el símbolo , llamado absortividad molar, se usa en lugar de a y es una constante para un compuesto dado a una determinada longitud de onda, bajo condiciones específicas de solvente, pH, temperatura, etc. Tiene unidades de L/mol.cm. Mientras mayor es la absortividad molar, mayor es la 213

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absorbancia para la misma concentración en términos de masa de dos compuestos. Por lo tanto, en la selección de un cromógeno para métodos espectrofotométricos, se debe usar un cromógeno con alta absortividad molar, el cual impartirá mayor sensibilidad a la medición. Una vez probado que el cromógeno sigue la ley de Beer a una longitud de onda específica (es decir, una gráfica lineal de A contra c con intercepto en cero; Fig. 4-4, A), la concentración de una solución desconocida puede ser determinada midiendo su absorbancia e interpolando su concentración en la gráfica de calibración. Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la concentración (en un papel milimetrado), se obtiene una relación curva (Fig. 4-4, B). A causa de la relación lineal entre la absorbancia y la concentración, es posible relacionar concentraciones desconocidas con un calibrador único por una ecuación simple de proporciones. Así Au Cs –––– = –––– As Cu

y Au Cu = –––– x Cs As

donde Cu y Cs son las concentraciones de la muestra y el calibrador respectivamente y Au y As son sus respectivas absorbancias. La ecuación arriba descrita es válida sólo si el cromógeno obedece la ley de Beer y tanto el calibrador como la muestra son determinados en la misma celda. El intervalo de concentración sobre el cual el cromógeno obedece la ley de Beer debe determinarse para cada conjunto de condiciones analíticas. La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene varias limitaciones. Las desviaciones de la ley de Beer, son variaciones en la linealidad de la absorbancia contra la concentración (Fig. 4-5), y ocurren cuando: (1) se miden concentraciones muy elevadas, (2) la energía de la radiación incidente no es monocromática, (3) la absorción del solvente es significativa comparada con la absorbancia del soluto, (4) la energía radiante es transmitida por otros mecanismos (luz errática), y (5) los lados de la celda no son paralelos. Si dos o más compuestos absorben a la longitud de onda de la energía radiante incidente, cada uno con diferente absortividad, no se cumplirá la ley de Beer. La radiación errática (luz errática) es energía radiante que alcanza el detector a longitudes de onda distintas a las establecidas por el monocromador. Toda la energía radiante que incide sobre el detector será registrada, ya sea que haya pasado o no a través de la muestra. La Fig. 4-5 muestra los efectos de la luz errática sobre la ley de Beer. A medida que la cantidad de luz errática aumenta (o la monocromaticidad disminuye), aumenta la desviación de la ley de Beer (decrece la linealidad).

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Espectrofotómetro de haz simple. La mayoría de los componentes de un espectrofotómetro de haz simple se muestra en la Fig. 4-6. El equipo necesario puede ser dividido en siete componentes básicos: (1) una fuente estable de energía radiante; (2) una hendidura de entrada para el enfoque de la luz; (3) un selector de longitud de onda; (4) una hendidura de salida para el enfoque de la luz; (5) un dispositivo para mantener el recipiente transparente (cubeta) que contiene la solución a ser medida; (6) un detector de energía radiante; y (7) un dispositivo para leer la señal eléctrica generada por el detector. Si se utiliza un filtro como selector de longitud de onda, se dispone solo de luz monocromática a longitudes de onda discretas y el instrumento es llamado fotómetro. Si se usa un monocromador (esto es, un prisma o una red de difracción, ver abajo) como selector de longitud de onda, el equipo puede proporcionar luz monocromática sobre un intervalo continuo de longitudes de onda y es llamado espectrómetro o espectrofotómetro. Los espectrofotómetros pueden ser instrumentos de doble haz con dos portacubetas, una para la muestra y otra para el blanco o muestra de referencia. Las ventajas de un instrumento de doble haz incluyen la capacidad de hacer correcciones simultáneas para los cambios en la intensidad de la luz, en la eficiencia de la red de difracción, en las variaciones en el ancho de la hendidura, etc., esto es particularmente útil para obtener curvas espectrales. Fuentes de energía radiante. Una lámpara con filamento de tungsteno es útil como fuente de un espectro continuo de energía radiante de 360 a 950 nm (Fig. 4-7). La lámpara de yoduro de tungsteno se utiliza frecuentemente como fuente de energía radiante visible y ultravioleta cercana. Los filamentos de haluros de tungsteno son de mayor duración, producen más luz a longitudes de onda corta, y emiten energía radiante de mayor intensidad que los filamentos de tungsteno. Las lámparas de descarga de hidrógeno y deuterio emiten un espectro continuo, siendo utilizadas en la región del espectro ultravioleta (de 220 a 360 nm) (Fig. 4-8). La lámpara de deuterio tiene más intensidad que la de hidrógeno. Las lámparas de vapores de mercurio producen un espectro discontinuo o de líneas (313, 365, 405, 436 y 546 nm) (Fig. 4-8). Estas son útiles para propósitos de calibración de longitudes de onda pero no son utilizadas en muchos espectrofotómetros. La lámpara de mercurio es usada en fotómetros y en espectrofotómetros, empleándose para cromatografía líquida de alta resolución. Recientemente, están siendo empleados diodos emisores de luz como fuente luminosa. Es importante entender que una cantidad de luz emitida de una fuente de luz no es constante en un intervalo continuo de longitudes de onda, por consiguiente una lámpara normal tiene un espectro complejo de transmitancia máxima y mínima (Fig. 4-7 y (Fig. 4-8). Las lámparas de diversos tipos pueden variar y también las de los diferentes fabricantes. Por lo tanto uno debe tener cuidado en la elección de una lámpara para un análisis determinado, ya que la cantidad de luz emitida a una longitud de onda deseada debe ser muy pequeña o muy grande. Por ejemplo, las lámparas de hidrógeno o deuterio usadas para el análisis ultravioleta, tienen una salida máxima de radiación en el rango de 250 a 300 nm. La salida de energía radiante de longitudes de onda larga (mayores de 340 nm) es considerablemente menor y puede ser muy débil para muchos análisis. Selectores de longitud de onda. El aislamiento de la longitud de onda o del intervalo de longitudes de onda puede 215

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realizarse con el uso de filtros o monocromadores. Los filtros son dispositivos sencillos, que consisten en un solo material, que transmite selectivamente la longitud de onda deseada y absorbe el resto de las longitudes de onda. En un monocromador, la energía radiante de una fuente de luz se dispersa por una red de difracción o un prisma en un espectro, en el cual la longitud de onda deseada se aísla mediante hendiduras mecánicas. Filtros. Hay dos tipos de filtros: (1) los que tienen características de transmisión selectivas, que incluyen los filtros de vidrio y Wratten, y (2) los que se basan en los principios de interferencia (filtros de interferencia). El filtro Wratten consiste de una capa de gelatina coloreada entre láminas de vidrio claro; los filtros de vidrio están compuestos de una o más capas de vidrio coloreado. Ambos tipos de filtros transmiten más energía radiante en algunas partes del espectro que en otras. Los filtros de interferencia funcionan sobre un principio diferente. El fundamento es el mismo que aquel en que se basa el juego de colores de una película de jabón, y se denomina interferencia. Cuando la energía radiante choca contra una película delgada, parte se refleja en la superficie frontal, pero el resto de la energía radiante que penetra la película se refleja por la superficie del otro lado. Los últimos rayos de energía radiante han viajado más que el primero por una distancia igual al doble del espesor de la película. Si los dos rayos reflejados están en fase, la intensidad resultante se duplica, pero si no están en fase se eliminan uno al otro. Por lo tanto cuando la luz blanca choca contra la película, algunas longitudes de onda reflejadas serán aumentadas y otras destruidas, resultando en colores. Monocromadores. Los monocromadores pueden dar un rango más estrecho de longitudes de onda que los filtros y son fácilmente ajustables sobre un amplio intervalo del espectro. El elemento dispersante puede ser un prisma o una red de difracción. La dispersión por un prisma es no lineal, haciéndose menos lineal a longitudes de onda largas (sobre 550 nm). Por lo tanto, para validar la calibración de longitudes de onda, uno debe verificar tres longitudes de onda. Los prismas dan sólo una medida del espectro emergente y de esta manera proporcionan mayor eficiencia óptica, dado que la energía incidente es distribuida sobre un solo espectro. Una red de difracción consiste en un gran número de líneas guías paralelas, igualmente espaciadas sobre una superficie. La dispersión por una red de difracción es lineal, por lo tanto sólo dos longitudes de onda diferentes deben verificarse para validar la exactitud de las longitudes de onda. Ancho de banda. Con excepción de los dispositivos ópticos láser, la luz obtenida por un selector de longitud de onda no es verdaderamente monocromática (esto es, una longitud de onda individual) sino que consiste en un intervalo de longitudes de onda. El grado de monocromaticidad está definido por los siguientes términos. Ancho de banda es el intervalo de longitudes de onda que pasan a través de una hendidura de salida en un dispositivo selector de longitudes de onda. La longitud de onda nominal de este haz de luz es la longitud de onda en la cual ocurre el pico de la intensidad luminosa. Para un selector de longitud de onda como un filtro monocromador en el que la hendidura de entrada y salida son del mismo ancho, la longitud de onda nominal es la longitud de onda media del espectro emergente. El intervalo de longitudes de onda obtenido por un filtro que produce un espectro simétrico es habitualmente conocido por su ancho de banda medio. Éste describe las 216

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longitudes de onda obtenidas entre los dos lados del espectro a un valor de transmitancia igual a la mitad del pico de transmitancia (Fig. 4-9). Para los monocromadores, el grado de monocromaticidad se describe por el ancho de banda nominal, el cual corresponde a estas longitudes de onda que son centradas sobre el pico de longitudes de onda y transmiten el 75% del total de la energía radiante presente en el haz de luz emergente. Para los monocromadores con hendiduras de salida variables, el ancho de banda también variará. Hendiduras. Existen dos tipos de hendiduras presentes en los monocromadores. La primera, a la entrada, enfoca la luz sobre la red de difracción o prisma, donde será dispersada con un mínimo de luz errática. La segunda hendidura, a la salida, determina el ancho de banda que seleccionamos del espectro de dispersión. Con el aumento del ancho de la hendidura de salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace más amplio, produciendo un aumento en la intensidad de la energía pero disminuye la pureza espectral. En los monocromadores de red de difracción, la hendidura de salida puede ser de un ancho fijo, derivando en un ancho de banda constante. Por el contrario, los monocromadores prismáticos tienen hendiduras de salida variables. El propósito de ambas clases de hendiduras en los fotómetros con filtro es hacer la luz paralela y reducir la luz errática. Cubetas. El receptáculo en el cual se coloca la muestra para determinaciones espectrométricas se denomina cubeta o celda. Las cubetas de vidrio son apropiadas para usarse en el intervalo de 320 a 950 nm. Para mediciones por debajo de 320 nm es necesario el uso de celdas de cuarzo (sílica). Estas celdas pueden utilizarse también en longitudes de ondas altas. La Fig. 4-10 ilustra el patrón de transmisión de varios tipos de cubetas. Existen cubetas de sección cuadradas y circulares (tubos de ensayo). Se alcanza una gran exactitud con cubetas cuadradas con lados paralelos hechos con vidrio óptico. Aunque las cubetas tienen usualmente dimensiones internas de 1 cm (longitud del paso de luz), se pueden encontrar cubetas con otras dimensiones. Detectores Celdas con capa de barrera ( fotovoltaicas o fotocélulas). Estos detectores consisten en una lámina de cobre o hierro sobre el cual se ha colocado una lámina semiconductora de óxido cuproso o selenio. Esta capa está cubierta por una lámina de metal transparente que sirve como electrodo colector. A medida que el destello pasa a través de este electrodo hacia la placa semiconductora, se induce un flujo de electrones en la placa y puede medirse en el amperímetro. Estos detectores son resistentes, relativamente económicos y sensibles desde la región ultravioleta hasta los 1000 nm. No se necesita fuente de poder externa, la fotocorriente producida es directamente proporcional a la intensidad de la energía radiante. Las fotocélulas exhiben un efecto de fatiga el cual significa que con el destello, la corriente sube por encima del valor de equilibrio aparente y luego decrece gradualmente. Tubos fotomultiplicadores. Es un tubo electrónico capaz de amplificar significativamente la corriente. El cátodo está fabricado de un metal sensible a la luz, que puede absorber energía radiante y liberar electrones en forma proporcional a la energía radiante que choca contra la superficie del metal sensible a la luz. Estas superficies varían en su respuesta a la luz de diferentes energías (longitudes de onda) y así también en la sensibilidad del tubo fotomultiplicador (Fig.4-11). Los electrones producidos por el primer estado de energía van a una segunda superficie, donde cada electrón produce entre cuatro a seis 217

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electrones adicionales. Los electrones del segundo estado energético se dirigen a otro estado, donde nuevamente producen entre cuatro a seis electrones. En los tubos fotomultiplicadores actuales están presentes hasta 15 estados (o dínodos) (Fig. 4-12). Los tubos fotomultiplicadores tienen un tiempo de respuesta rápido, son muy sensibles y no muestran efectos de fatiga como otros detectores. Fotodiodos. Son semiconductores que cuando son impactados por la luz cambian su voltaje de carga (usualmente 5 V). Los cambios de voltaje son transformados en corriente y de esa manera son cuantificados. Un fotodiodo está compuesto por una matriz bidimensional de cientos de finos semiconductores colocados muy cercanos entre sí. La luz del instrumento se dispersa por la red de difracción o prisma dentro del fotodiodo. Cualquier posición o diodo en esta configuración está calibrado para corresponder con una longitud de onda específica. Cada diodo se examina y el cambio electrónico resultante es calculado para ser proporcional a la absorción. El espectro completo es registrado en milisegundos.

Rendimiento del instrumento La sensibilidad de respuesta de un espectrofotómetro es una combinación de la emisión de la lámpara, eficiencia del filtro o monocromador en la transmisión de la luz, y la respuesta del fotomultiplicador. Como todos estos factores son funciones de la longitud de onda, está claro que el instrumento debe ser reajustado cuando uno cambia las longitudes de onda. La mayoría de las veces, este nuevo establecimiento de condiciones consiste en el ajuste de la solución blanco para que la lectura sea 100% T (cero de absorbancia) cambiando la ganancia del fotomultiplicador. Existen una serie de recomendaciones sobre especificaciones propuestas que abarcan muchos aspectos de los instrumentos usados para análisis fotométricos.ref(136) Estas especificaciones están señaladas en la Tabla 4-4.

Selección de las condiciones óptimas y limitaciones Cuando se establece un nuevo procedimiento espectrofotométrico, es importante registrar el espectro de absorción del material que va a ser medido. Este espectro de absorción debe ser registrado con relación a ambos, agua o blanco de reactivo, según el método de análisis elegido. Algunos ejemplo de estos espectros se presentan en la sección de métodos de este texto. Este espectro ayudará para determinar la mejor longitud de onda que se utilizará en los análisis espectrofotométricos. La longitud de onda óptima para un análisis específico dependerá de varios factores, incluyendo la absorción máxima del cromógeno, la pendiente del pico de absorción, y el espectro de absorción de posibles cromógenos interferentes. Un ejemplo del espectro de absorción se ilustra en la Fig. 4-13. De acuerdo con la ley de Beer, cuanto mayor sea el coeficiente de absorción molar, mayor será la absorción a una concentración y longitud de onda determinada, y mayor será la sensibilidad del método. En este e spectro hay tres picos de absorción (coeficiente de absorción más alto): 1, 2 y 3 nm. La absortividad de 2 es muy baja y su uso puede ser descartado inmediatamente. 218

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Si un pico de absorción es muy estrecho, como el de 1, cualquier pequeño error en el ajuste del espectrofotómetro a esta longitud de onda producirá un cambio grande en la absorbancia. Con espectrofotómetros de ajuste manual de longitudes de onda, esto puede causar grandes imprecisiones y errores analíticos entre cada análisis. Con los fotómetros de filtro se requiere un filtro exacto de alta calidad, para asegurar la exactitud cuando se está trabajando con un pico de absorción estrecho. Estos problemas pueden resolverse usando un pico de absorción más ancho ( 3). Con este pico de absorción, pequeños cambios en los ajustes de la longitud de onda producirán cambios insignificantes en la capacidad de absorción y se obtendrá mayor precisión y exactitud. La sensibilidad de muchos métodos puede aumentarse por el uso de bandas de absorción a longitudes de onda corta (tal como la ultravioleta), dado que estas son muy intensas frecuentemente. Sin embargo existe una absorción inespecífica a longitudes de onda corta de los amortiguadores u otras especies químicas en las soluciones. Por lo tanto, deben usarse blancos apropiados para obtener medidas exactas. En algunas técnicas el compuesto analizado es purificado antes del análisis y su detección es factible a longitudes de onda corta (ultravioleta), proporcionando una sensibilidad óptima. El conocimiento de las longitudes de onda en las cuales los cromógenos interferentes absorben luz más comúnmente, ayuda a determinar la selección adecuada de la longitud de onda. Una regla general para seleccionar la longitud de onda óptima en la cual se va a medir una reacción espectrofotométrica incluye tres criterios: (1) Seleccionar un pico de absorción con el mayor coeficiente de absorción molar. (2) Elegir el pico relativamente más amplio. (3) Escoger el pico que esté lo más lejos posible de los picos de absorción de los cromógenos interferentes.

Pruebas para el control de calidad de los espectrofotómetrosref(137) Existen varias pruebas de control de calidad que deben realizarse para validar que los espectrofotómetros estén funcionando dentro de sus especificaciones. Estas pruebas son exactitud de longitud de onda, respuesta lineal del detector, radiación errática (luz errática) y exactitud fotométrica. Los detalles de las pruebas de rendimiento del espectrofotómetro pueden encontrarse en las referencias 5ref(138) y 13ref(139). Exactitud de la longitud de onda. Si cambia la calibración de longitud de onda de un instrumento, la medición de la absorbancia también cambia. La magnitud del error de absorbancia atribuible a la calibración de la longitud de onda, depende de la localización relativa del punto en el espectro de absorción del cromóforo a ser medido. Es decir, el error de la absorbancia con respecto al error de la longitud de onda, es mayor cuando la medición de la absorbancia se realiza en la pendiente de la banda de absorbancia que cuando se realiza cerca del pico de la banda de absorbancia. El mantenimiento de la calibración de la longitud de onda es particularmente importante para los análisis espectrofotométricos, como las determinaciones enzimáticas. El método más adecuado para controlar la exactitud de las longitudes de onda es el reemplazo de la lámpara por una fuente de energía radiante que emita fuertes líneas de 219

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longitudes de onda bien definidas. Entre las fuentes de energía radiante útiles tenemos: (1) la lámpara de vapor de mercurio, la cual tiene fuertes líneas de emisión a 313, 365, 405, 436 y 546 nm, y (2) lámpara de deuterio o hidrógeno, las cuales tienen líneas de emisión entre 486 y 656 nm (Fig. 4-8). Los espectrofotómetros equipados con lámparas de deuterio o hidrógeno tienen fuentes internas fabricadas para controlar la exactitud de la longitud de onda. Un segundo método para verificar la calibración de la longitud de onda involucra el uso de filtros de compuestos de tierras raras, como el óxido de holmio y didimio. El óxido de holmio tiene fuertes líneas de absorción a 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm. El didimio tiene bandas de absorción más anchas a 573, 586, 685, 741, 803 nm. Como existe la posibilidad del deterioro de los filtros, se debe verificar periódicamente la exactitud de la longitud de onda. Un tercer método para evaluar la calibración de la longitud de onda implica el uso de soluciones. Se puede emplear una solución de un cromógeno estable como estándar secundario en la calibración de la longitud de onda, para determinar si la exactitud de la misma en un instrumento ha variado después que ha sido validada la exactitud de la longitud de onda por un estándar primario de calibración, como la lámpara de mercurio o deuterio. Las desventajas de usar soluciones químicas para la calibración de longitudes de onda son: que los picos de absorción generalmente son anchos y los cambios espectrales pueden resultar de la contaminación, envejecimiento, o errores de preparación. Independientemente del método, para los instrumentos con red de difracción es necesaria la calibración a dos longitudes de onda, mientras que los instrumentos con prisma deben calibrarse a tres longitudes de onda. Linealidad en la respuesta del detector. Un espectrofotómetro que funcione adecuadamente debe mostrar una relación lineal entre la energía radiante absorbida y la lectura final del instrumento. La linealidad del instrumento es un prerrequisito para la exactitud espectrofotométrica y analítica. Los filtros de vidrio sólido pueden utilizarse para validar la linealidad del instrumento. El método más común para certificar la linealidad de la respuesta del detector, consiste en el uso de soluciones de concentraciones variables con un componente conocido que sigue la ley de Beer. Algunos compuestos utilizados para este propósito son la oxihemoglobina a 415 nm, p-nitrofenol a 405 nm, sulfato de amonio y cobalto a 512 nm, sulfato cúprico a 650 nm y colorante verde vegetal a 257, 410 y 630 nm. Las absorbancias de soluciones que contienen concentraciones crecientes de algunos de estos compuestos son graficados contra una concentración conocida. Las gráficas no lineales de absorbancia frente a concentración indican un error en la dilución o un problema de instrumentación. Además, un detector defectuoso, la radiación errática o una hendidura muy abierta puede ocasionar también una respuesta no lineal. Luz errática. Se observa frecuentemente un aumento de la luz errática en los extremos terminales del intervalo espectral, donde la respuesta del detector o fuente de energía es muy baja. La luz errática produce usualmente una desviación negativa de la ley de Beer, los métodos para detectarla emplean filtros o soluciones que tienen una alta transmisión sobre una porción del 220

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espectro, pero son opacos por debajo de la longitud de onda límite. Se han usado varias soluciones para verificar la luz errática, incluyendo Li2CO3 debajo de los 250 nm, NaBr (0.1 mol/l) por debajo de los 240 nm y acetona debajo de los 320 nm. La longitud de onda exacta en la cual ocurre el límite es una función de la concentración, longitud del paso de luz de la celda y temperatura; por lo que las longitudes de onda reportadas pueden variar ligeramente. Muchos filtros pueden detectar luz errática. Si se emplean filtros o soluciones que no transmiten energía radiante a la longitud de onda de la medición, la transmitancia medida será la cantidad de luz errática presente. La multiplicación de esta transmitancia por 100 nos dará el porcentaje de radiación errática. Es indicativo que un instrumento funciona mal cuando la cantidad de luz errática excede el 1%. Las acciones a tomar para eliminar la radiación errática comprenden el cambio de la fuente de luz, verificación de la calibración de las longitudes de onda, sellar las rendijas de luz, realinear los componentes del instrumento y limpiar las superficies ópticas. Exactitud fotométrica. Cuando se realizan análisis que no utilizan estándares químicos, la exactitud de la absorbancia es crucial. Un calibrador de absorbancia debe tener una absorbancia contante y estable a una longitud de onda adecuada, es decir, que no presenta sensibilidad al ancho de banda espectral de un instrumento y a las variaciones en la configuración del haz de luz. Estos estándares deben ser fáciles de usar y disponibles. El Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (“National Institute of Standards and Technology” o “NIST”, en inglés”) provee un grupo de tres filtros de vidrio con densidad neutra (SBM 930), que tiene absorbancias conocidas en cuatro longitudes de onda para cada filtro. Estos filtros no son completamente estables y deben recalibrarse periódicamente por el NIST. Las soluciones de dicromato de potasio, sulfato de cobalto y amonio, y nitrato de potasio se están usando como estándares para validar la exactitud fotométrica. Las soluciones estándares están sujetas a cambios de absorbancia por la temperatura, tiempo y pH, que los hacen poco convenientes como estándares de calibración a largo plazo.

Espectrofotometría de reflectancia En la espectrofotometría de “reflectancia”, un haz de luz es dirigido a una superficie plana y la luz reflejada se cuantifica. La luz reflejada de la superficie se enfoca en un tubo fotomultiplicador. El equipo puede ser similar a un espectómetro de filtro de haz simple (Fig. 4-14). La lámpara genera una luz que pasa a través del filtro y de una serie de hendiduras, y luego es enfocada sobre la superficie de prueba. Parte de la luz que incide en la muestra se absorbe por los cromóforos de la superficie y la luz remanente es reflejada. (Esto es análogo al paso de luz a través de una solución, pero además en este caso, parte de la luz es absorbida y el resto pasa a lo largo). Luego la luz reflejada pasa a través de una serie de hendiduras, lentes y al fotodetector. La señal luego se convierte en una lectura apropiada. El término densidad de reflección es utilizado para describir la absorción de la luz por los cromóforos en la superficie. La densidad de reflección está relacionada con la intensidad de luz reflejada por una muestra.ref(140) La densidad de reflección, DR, de una muestra está dada por la razón de la 221

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luz reflejada por un material reflector estándar (usualmente una superficie N revestida de sulfato de bario), RO, entre la luz reflejada por la muestra, Rtest, como se muestra en la ecuación DR = log (RO/R test) Esta ecuación es semejante a la ecuación que relaciona %T (y por lo tanto, absorbancia) con la luz incidente transmitida (ver ecuación, pág. 87). En general, las propiedades ópticas de las diferentes superficies varían considerablemente. Las propiedades ópticas del papel para reactivo o cintas de plástico difieren de las de una película seca. Por lo tanto, para calibrar un instrumento a fin de medir la densidad de reflección, se debe usar un estándar con la superficie específica empleada en el sistema de prueba. El valor DR en la ecuación de arriba puede corregirse por la reflectancia errática. Debe utilizarse un estándar negro con las mismas características superficiales de la muestra de prueba para obtener el valor máximo de absorbancia. Cada lectura de reflección del instrumento bajo de estas condiciones será la reflectancia errática. Este valor se puede restar del valor de la prueba para corregir esta variable. El uso de la reflectancia permite medidas cuantitativas de reacciones sobre superficies tales como tiras reactivas o películas secas (reacciones de química seca). Las desventajas de este método son los problemas de estandarización. La cantidad de luz reflejada y su respectiva medición, están sujetas al tipo de instrumento. Las variables son: el ángulo en el cual se mide la reflección, el área de superficie, etc. También, las variaciones de la superficie de prueba (ocasionados durante los procesos manuales o de fabricación) pueden alterar las propiedades de la superficie reflectante. Registrando la espectrofotometría espectral El registro del espectro completo de absorción se utiliza ya sea para la identificación de los compuestos o para convertir matemáticamente el espectro en su primera o segunda derivada. El registro del espectro puede realizarse con los espectrofotómetros descritos arriba o por sistemas detectores de arreglos de diodo, donde hay una relación espacial entre las líneas espectrales esparcidas por un prisma o red de difracción y el detector de luz del diodo. La primera y segunda derivadas espectroscópicas son la conversión matemática de la curva de absorción en la función derivada. Estas derivadas sirven para eliminar las interferencias de las líneas de absorción espectrales observadas y permite análisis más exactos.

Absorción Atómicarefs(141)

La espectrofotometría de absorción atómica se usa en el laboratorio clínico para la determinación de calcio, magnesio, litio, plomo, zinc, y otros metales. Fundamento Los átomos vaporizados en estado basal absorben luz en intervalos de longitud de onda definidos muy estrechos. Estas bandas de absorción están en el orden de 0.001 a 0.01 nm de ancho, y por consiguiente el espectro completo de átomos se denomina espectro de línea. 222

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Si estos átomos en el estado de vapor son excitados, ellos regresan al estado basal emitiendo una luz de la misma longitud de onda discreta que el espectro de línea. En la espectrofotometría de absorción atómica la forma iónica de los elementos no se excita en la llama pero sí se disocia de sus uniones químicas, y mediante la atracción de electrones libres producidos por el proceso de combustión, regresa al estado atómico basal. En esta forma es capaz de absorber luz a la longitud de onda específica de su espectro de línea. En la absorción atómica un haz de energía radiante que contiene el espectro de línea del elemento por medirse, pasa a través de la llama que contiene el metal vaporizado a determinarse. La fuente de energía radiante se denomina lámpara de cátodo hueco. La longitud de onda de la energía radiante absorbida es la misma que sería emitida si el elemento fuera excitado. Con la ayuda de un monocromador, se mide la atenuación de una de las longitudes de onda de la luz incidente. Lo que ocasiona esta atenuación, es la interacción de los fotones con los átomos en el estado basal en la llama. La ley de Beer es válida para relacionar la concentración de los átomos en la llama y la transmisión o absorción de luz. Solo un pequeño porcentaje de átomos en la llama están excitados y la mayoría de los átomos se encuentran en una forma capaz de absorber la energía radiante emitida por la lámpara de cátodo hueco.

Instrumentación En la Fig. 4-15 se muestra la mayoría de los componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica. Lámpara de cátodo hueco. La lámpara de cátodo hueco es la forma más práctica para generar un espectro de línea de la pureza espectral requerida. Las lámparas tienen un cátodo hueco o en forma de copa, que está recubierta con el metal puro del elemento a determinarse o con una aleación apropiada. Se utiliza una lámpara diferente para cada elemento, excepto por algunas ocasiones en que el cátodo puede estar fabricado de tal manera que una sola lámpara sirve para dos o tres elementos (tal como el calcio y el magnesio). La lámpara se llena con un gas inerte monoatómico, usualmente argón o neón a baja presión. El gas inerte seleccionado para la lámpara puede variar con el compuesto que se va a medir. Por ejemplo, el plomo y el hierro se pueden analizar con lámparas de neón, mientras que los análisis de litio se realizan mejor con lámparas de argón. Para medir otros elementos, la elección del gas inerte no es tan crítica. Se pueden utilizar como ventana el cuarzo o un vidrio especial que permitan la transmisión a una longitud de onda apropiada. Se suministra una corriente a un cátodo y los iones del metal son liberados continuamente (expulsados) de la superficie interna del cátodo, llenando la lámpara con un vapor atómico. Los átomos en este vapor experimentan una excitación electrónica por colisiones con el gas inerte y los átomos excitados resultantes emiten su energía radiante característica cuando regresa el electrón a su estado basal. Esto genera un haz de energía radiante con la longitud de onda correspondiente para la absorción por los átomos en estado basal en la llama. Quemador. En la espectrofotometría de absorción atómica, la muestra deberá pasar al estado gaseoso. 223

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Esta técnica convierte la muestra en un fino aerosol mientras se introduce en la llama. Este proceso se denomina nebulización. El nebulizador se considera generalmente parte del quemador. En el interior de la llama, el solvente se evapora del aerosol liberando partículas microscópicas que se desintegran bajo la influencia del calor para producir átomos. Este fenómeno se denomina atomización. El acetileno es el combustible más usado en el quemador. En la absorción atómica se alcanzan usualmente temperaturas de 2300o C. Dos tipos de quemadores se usan en muchas aplicaciones clínicas. Uno es el quemador de consumo total. Con este quemador, los gases y la muestra se mezclan dentro de la llama. La llama en estos tipos de quemadores puede producir mucho calor, ocasionando disociaciones moleculares, las cuales pueden ser deseables para algunos sistemas químicos. El segundo tipo es el quemador de premezcla (quemador de flujo laminar), en el cual las gotitas grandes de la atomización van al desecho y no hacia el interior de la llama. La longitud del paso óptico a través del quemador de premezcla es mayor que la del quemador de consumo total, proporcionando una mayor sensibilidad. La temperatura de la llama no es tan alta como en el quemador de consumo total. Absorción atómica sin llama. El propósito de la llama es transformar la muestra en vapor atómico. La llama puede reemplazarse por otros procesos de atomización. Un proceso aplicable al análisis de mercurio usa reacciones químicas para transformar el mercurio en vapor atómico. Se descompone la muestra por la digestión con ácidos, luego un agente reductor se agrega para transformar el mercurio al estado elemental, finalmente un flujo de gas impulsa el vapor de mercurio a través del aparato a una celda sellada con ventanas de cuarzo en el paso del haz óptico. La absorbancia se mide a 253.7 nm. En otra técnica de atomización frecuentemente empleada, la muestra se deseca en un tubo o plataforma de carbón. La mezcla se vaporiza en una atmósfera inerte cuando una corriente eléctrica pasa a través del soporte para crear instantáneamente una temperatura suficientemente elevada para vaporizar el compuesto analizado. Estos atomizadores están en el espacio ocupado normalmente por la llama en los instrumentos de absorción atómica de llama (AA). Las temperaturas alcanzadas por la absorción atómica sin llama (sobre los 2700o C) son necesarias para vaporizar metales pesados. Los instrumentos de absorción atómica sin llama tienen una mayor sensibilidad que los instrumentos de absorción atómica de llama. Monocromadores y detectores. Los monocromadores (redes de difracción o prismas) y los tubos fotomultiplicadores pueden aislar señales de energía radiante pura y medir la intensidad de esa señal, respectivamente. El monocromador no permite que la energía radiante extraña, ya sea de otras longitudes de onda del espectro de línea o de la luz generada por la llama, alcance el tubo fotomultiplicador. El tubo fotomultiplicador transforma la energía radiante que no fue absorbida en la llama en una señal y la amplifica conduciéndola a un medidor o contador. Fuentes de error En las mediciones de absorción atómica se pueden presentar interferencias químicas, de ionización, por la matriz y del quemador. Otros factores como la temperatura, 224

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composición del solvente, contenido de sales, viscosidad y la tensión superficial pueden ser la causa de variaciones de muestra a muestra o entre muestras desconocidas y estándares. Interferencia química. La presencia de ciertos aniones de algunos elementos en la muestra ocasiona la formación de compuestos que no son completamente disociados en la llama. El resultado es la disminución en el número de átomos en estado basal presentes en la llama. El ejemplo más común de interferencia química es la formación de uniones estrechas de los complejos de calcio con los aniones, especialmente los iones fosfato. El efecto de estos aniones se minimiza o elimina agregando lantano a la muestra para desplazar el calcio del complejo. El lantano forma un complejo más estable con el fosfato que con el calcio. En la absorción atómica sin llama, la interferencia química puede provenir de los compuestos que se vaporizan junto con el elemento a medirse. La adición de “modificadores de la matriz” a la muestra permite que la vaporización del elemento se produzca a altas temperaturas, permitiendo que los compuestos interferentes sean quemados a temperaturas más bajas. Interferencia por ionización. Cuando los átomos en la llama son ionizados (A+) en lugar de permanecer en el estado basal (A0), ellos no absorberán la luz incidente. Esto se denomina interferencia por ionización, y este efecto produce una disminución aparente de la concentración del compuesto analizado. Se puede corregir la interferencia al agregar un exceso de una sustancia que es más fácilmente ionizable, aportando de esta manera electrones libres. El exceso de electrones libres, por lo tanto desplaza la reacción: A+ + e- A0 para la formación de átomos en estado basal. La interferencia por ionización se minimiza por el manejo de la llama a las temperaturas bajas de la combustión de aire-acetileno. Interferencia de la matriz. Las diferencias en las matrices entre la muestra y los estándares pueden ocasionar errores. A veces se agregan proteínas en los estándares cuando el factor de dilución sérico es pequeño. Los efectos de la matriz se minimizan cuando las diferencias en la composición entre la muestra y el estándar no son significativas. Los estándares de calcio deben contener concentraciones fisiológicas de sodio, ya que el sodio ocasionará una interferencia negativa. La técnica de “adición de estándares” a sido empleada para minimizar las diferencias de la matriz en las mediciones del aluminio u otros elementos por absorción atómica sin llama. En esta técnica, diferentes concentraciones del estándar son agregados a las muestras diluidas, y todo será medido por AA sin llama. El intercepto negativo de la línea de regresión de la señal contra la cantidad de aluminio agregado es igual a la cantidad de aluminio en la muestra. Problemas del quemador. El componente más crítico en la espectrofotometría de absorción atómica es la llama y su nebulizador. Es esencial una llama estable y un fluido controlado de gas tanto para el 225

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combustible como para el oxidante. Es importante que la cabeza del quemador esté limpia para un análisis exacto y preciso. Igualmente, en la absorción atómica sin llama, la plataforma de carbón debe cambiarse después de un número de descargas para proporcionar resultados reproducibles. Interferencia de emisión. Muchos átomos de compuestos analizados cuando se introducen en la llama son excitados y emiten un fotón al regresar al estado basal. La luz emitida es, por supuesto, de la misma longitud de onda que la luz incidente que se está midiendo. La luz emitida aumenta la señal que recibe el fotodetector, y dicha señal es traducida en forma de una absorción disminuida, y por lo tanto detecta una concentración erróneamente baja del compuesto analizado. Esta interferencia puede ser eliminada usando un “rebanador” o "chopper", en inglés (ver Fig. 4-15), para crear un haz de luz incidente en forma de pulsos proveniente de la lámpara de cátodo hueco. Sin embargo, la luz ocasionada por la interferencia de emisión es un haz de luz producido constantemente. Esta emisión estable puede ser diferenciada electrónicamente del haz en forma de pulso de luz transmitida y de esta manera ser eliminada como una fuente de interferencia.

Fotometría de Llamarefs(142) La fotometría de llama fue ampliamente utilizada en el laboratorio clínico para determinar las concentraciones de sodio, potasio y litio en los líquidos biológicos. Hoy en día esta técnica es poco utilizada. Fundamento Los átomos de algunos metales, cuando reciben suficiente energía térmica suministrada por una llama, serán excitados y reemitirán esta energía a longitudes de onda particulares para el elemento previamente descrito. Las reacciones experimentadas por los iones en la llama son las siguientes A+ + e- A0 A0 + Calor A* * 0 A A + hv A* representa el átomo excitado en la llama, A0 es un átomo con la energía electrónica en estado basal, y hv es un fotón. Los metales alcalinos son relativamente fáciles de excitar en la llama. El litio produce una emisión roja en la llama; el sodio, una amarilla; y el potasio, un color rojo-violeta. Estos colores son característicos de los átomos de los metales que están presentes como cationes en solución. La intensidad de la longitud de onda característica de la energía radiante producida por los átomos en la llama es directamente proporcional al número de átomos excitados, los cuales son directamente proporcionales a la concentración de la sustancia de interés en la muestra. El número efectivo de átomos presentes en un estado excitado es una pequeña fracción del total 226

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de átomos presentes en la llama. Una revisión de la técnica de fotometría de llama se encuentra en la referencia.ref(143)

Fluorometríarefs(144) Fundamento La fluorescencia puede considerarse uno de los productos de las interacciones de la luz con la materia. Cuando la luz choca con la materia, puede simplemente pasar a través de ella como en una solución transparente, puede ser dispersada por la interacción, o puede ser absorbida. Cuando la luz es transmitida, no hay pérdida de energía; cuando es dispersada, no hay cambio de energía; la luz tiene la misma longitud de onda antes y después de interactuar con la materia. Pero cuando la luz es absorbida, hay una conversión de la luz de la energía luminosa en diversas formas, incluyendo transiciones sin radiación (conversión de energía en calor) y otras, como fluorescencia y fosforescencia donde se emiten fotones (Fig. 4-16). La absorción de la luz puede utilizarse, por supuesto, para determinar la concentración de los componentes como se hace en espectroscopía de absorción. Si la luz absorbida es reemitida, los fotones liberados pueden usarse para cuantificar el compuesto emisor (flúor). La cuantificación también es posible con el uso de la luz dispersada, ya que la cantidad de luz dispersada está relacionada con el número y tamaño de las partículas en solución. Los métodos que usan luz dispersada son llamados nefelometría y turbidimetría (ver pág. 100). La luz fluorescente es el resultado de la absorción de un fotón de energía radiante por una molécula. Cuando esta molécula absorbe el fotón, aumenta su nivel de energía. Ya que la energía molecular es mayor que la de su entorno, tratará de liberar el exceso de energía por medio de la expulsión de otro fotón, dando como resultado la emisión de fluorescencia o fosforescencia. Para que ocurra la fluorescencia, debe existir una buena probabilidad de que la energía del estado excitado pueda ser convertida al estado basal por la expulsión de un fotón. En general no todos los componentes fluorescen; de hecho muy pocos tienen esta propiedad. Entre los que fluorescen, ningún fotón absorbido será transformado en luz fluorescente. Algunos componentes excitados perderán energía mediante transiciones sin radiación, debido a la transferencia de la energía al solvente. Para una misma cantidad de luz absorbida, las moléculas con una mayor eficiencia de fluorescencia, serán más brillantes o con una fluorescencia mayor. En las soluciones, cuando una molécula regresa a su estado basal por la emisión de un fotón, hay una menor energía en el fotón emitido que la que estaba absorbida inicialmente. En otras palabras, la luz fluorescente emitida es de una longitud de onda mayor que la radiación excitada o absorbida (Fig. 4-17).

Instrumentación Los componentes básicos de un fluorómetro son similares a los de un espectrofotómetro de absorción. La diferencia mayor es la introducción de un grupo de filtros o monocromadores antes y después de la celda para aislar la luz emitida. En la Fig. 4-18 se presenta un diagrama del fluorómetro. Los principales componentes son: luz de excitación, filtros o monocromadores para 227

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separar la luz excitada de la emitida, y un detector sensible. Lo más frecuente es que la medición de la luz fluorescente se realice en un ángulo de 90 grados con respecto a la luz de excitación. Esto se realiza para maximizar la sensibilidad del instrumento, minimizando la cantidad de luz de excitación que pueda alcanzar el fotodetector. El detector es un fotodetector o un dispositivo similar que puede cuantificar la mínima señal de luz fluorescente y de esta manera alcanzar el nivel deseado de sensibilidad. Porque el espectro de absorción varía de un componente a otro, el instrumento debe estar optimizado para cualquier compuesto que se va a determinar. Esto se hace mediante el ajuste de la longitud de onda de excitación para lograr el máximo de absorción de los fotones, lo cual usualmente significa colocar el instrumento en las condiciones en que se obtiene la absorción máxima del compuesto. Además debe determinarse la longitud de onda de emisión máxima de los fotones fluorescentes, siendo esta la longitud de onda en la cual la señal fluorescente es comúnmente registrada. Limitaciones La señal fluorescente de un compuesto se ve afectada por muchas variables que incluyen: 1) solvente, 2) pH, 3) temperatura, 4) absorbancia de la solución, y 5) presencia de sustancias interferentes o específicamente aquellas que atrapan la luz. La estandarización no se hace usualmente por un procedimiento único como en la espectroscopía de absorción, ya que la fluorescencia varía dependiendo de: 1) la intensidad de la luz incidente sobre la muestra, 2) la cantidad de luz interceptada por el detector que es regulada por las hendiduras, 3) el ancho de banda de la luz analizada 4) la eficiencia del detector. El rendimiento cuántico o eficiencia de emisión de luz de un fotón es constante si el solvente, pH, temperatura, y otros parámetros se mantienen constantes. Pero en general el instrumento no se mantendrá constante diariamente. Por lo tanto, para la mayoría de las mediciones se emplea el rendimiento de fluorescencia relativa. Para un blanco de reactivos en un ensayo fluorométrico, solo pueden ajustarse el cero o la fluorescencia nula. No hay equivalencia a la escala de transmisión del 100%. Por lo tanto la señal electrónica variará de un instrumento a otro para la misma concentración del compuesto analizado. Para hacer una curva lineal con respecto a la concentración con una serie de estándares fluorescentes, la absorbancia de las soluciones no debe exceder de 0.1. Por arriba de esta concentración, todas las partes de la solución no son iluminadas uniformemente; es decir la capa de la solución inicialmente iluminada absorberá más luz que la capa final, de esta manera la capa inicial fluorescerá más que final. Con soluciones diluidas, como las que tienen absorbancias menores de 0.1, esto no ocurre. Sin embargo, ciertos análisis emplean la relación cuantitativa inversa entre la intensidad de la fluorescencia y la cantidad de luz absorbida por una solución cuya absorbancia es mayor que 0.1. Tales pruebas son denominadas análisis de atenuación de la fluorescencia. En estos sistemas se coloca una cantidad constante de colorante fluorescente para cada solución control y de prueba. En la muestra, el compuesto analizado causa una reacción en la cual se produce un compuesto que absorbe luz. A mayor cantidad del producto de reacción colorido formado por el compuesto analizado, menor será la cantidad de luz absorbida por el colorante fluorescente. Por consiguiente la disminución del paso de luz a través de la solución resulta en una reducción proporcional en intensidad de fluorescencia, la cual está relacionada con la concentración del compuesto analizado en la 228

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muestra. Fluorescencia de resolución tardíaref(145) Una aproximación que puede usarse para mejorar la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia es la fluorescencia de resolución tardía. El tiempo de emisión de la fluorescencia en muchas moléculas fluorescentes, como la fluoresceína, está en el rango de los nanosegundos (nseg); es decir la señal de la fluorescencia decrece en un intervalo de 100 nseg. Algunos compuestos como el quelato metálico dicetona-europio tienen una vida media de fluorescencia muy larga; de 10 a 1000 microsegundos ( seg). Cuando se mide la fluorescencia después de 400 seg, durante un período adicional de otros 400 seg, se puede obtener la intensidad de fluorescencia de estos compuestos sin interferencia de la luz dispersada o por cualquier otra molécula que emita fluorescencia. Aparte del aumento en la especificidad del análisis, esta técnica proporciona un incremento considerable en la sensibilidad. Los instrumentos especializados que usan esta técnica iluminan la muestra por un período de tiempo, luego detienen la iluminación, y después miden la fluorescencia emitida en un tiempo especificado de 400 a 800 seg después de la iluminación (Fig. 4-19). Una limitación de esta técnica es la necesidad de pasos de separación debido a que los compuestos quelados no pueden medirse directamente en los líquidos biológicos (para más detalles ver el capítulo 13).

Quimioluminiscenciarefs(146) La quimioluminiscencia es cualquier reacción química en la cual uno de los productos es la luz. La enzima peroxidasa puede reaccionar con moléculas como el luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) para producir luz como uno de los productos de la reacción. La reacción del luminol produce emisión de fotones en el intervalo de 400 a 450 nm. La baja producción de fotones en esta reacción limita su sensibilidad y su aplicación. En todo caso, con la adición de moléculas reforzadoras (luciferín, 6- hidroxibenzotiazol) la reacción continuará por más tiempo (30 min o más) aumentando varios miles de veces la producción de fotones. Los productos de estas reacciones no son conocidos. Una reacción parcial puede ser escrita como sigue: Peroxidasa

2 H2O2 + Luminol y el reforzador ––––––––

2 H2O + hv + luminol oxidado

La peroxidasa frecuentemente es parte de la técnica de inmunoensayo enzimático, en el cual es la enzima marcada. Esta reacción se puede medir con una serie de diferentes tubos fotomultiplicadores sensibles. La ventaja de esta técnica es que es muy sensible. Una molécula de peroxidasa puede convertir varios millones de moléculas de sustrato por minuto. De esta manera la detección puede ser más sensible que la realizada con radioisótopos. La desventaja de esta técnica es que la reacción se realiza en un sistema heterogéneo en el cual la peroxidasa se fija a una fase sólida. El H2O2 y el luminol deben estar en un sistema libre de matrices biológicas, como suero, y por lo tanto es necesario un paso de separación. 229

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Otro sistema de coloración que produce una reacción quimioluminiscente cuantitativa utiliza los ésteres de acridina y los dioxetanos. Los ésteres de acridina son frecuentemente oxidados por el peróxido de hidrógeno para producir luz, mientras los dioxetanos están hechos de derivados ésteres de fosfato estable, que al hidrolizarse se degradan espontáneamente, produciendo luz como uno de sus productos. La bioluminiscencia es un fenómeno que ocurre de manera natural, se ha estudiado extensivamente e involucra una reacción muy conocida de las moléculas luciferina, adenosín trifosfato (ATP) y luciferasa en presencia de oxígeno. Luciferasa

Luciferina + ATP + O2 ––––––––

Oxiluciferina + Luz

La reacción es cuantitativa por que se libera un fotón de luz por cada molécula de ATP consumido. La sensibilidad de la reacción se ve limitada sólo por la capacidad del fotodetector de contar fotones. Fluorescencia de polarizaciónrefs(147) La luz se considera compuesta por un vector electrónico y uno magnético. Si la luz se polariza, todos los vectores electrónicos tendrán la misma orientación. Cuando una molécula fluorescente absorbe luz, excita a un cromóforo que tiene una orientación específica, produciendo la transición de un electrón a un nivel de energía superior. La molécula excitada emite luz a medida que el electrón (oscilador fluorescente) regresa al nivel de energía inferior. Las mediciones de la fluorescencia polarizada requieren un colorante con una orientación electrónica, donde la luz emitida retiene la misma orientación inicial de la luz incidente. Como ejemplo de este tipo de moléculas tenemos: la fluoresceína. Si se utiliza luz polarizada para excitar las moléculas de fluoresceína, la fluorescencia reemitida también estará polarizada. Sin embargo, las moléculas giran en solución, perdiendo además su orientación y la polarización de fluorescencia. En la polarización de fluorescencia, el colorante debe seleccionarse de modo que su rotación molecular sea tan alta entre los tiempos de absorción y emisión de luz, que la molécula viene a ser orientada aleatoriamente durante este período y la fluorescencia se polariza de forma mínima. La cantidad que se mide es la intensidad de la luz orientada o la diferencia entre la luz orientada y la no orientada. Para medir la luz polarizada están disponibles varias opciones. Un enfoque es, excitar la solución de prueba con luz polarizada en una dimensión y registrar la cantidad de fluorescencia emitida. Se coloca el polarizador inmediatamente después del primer monocromador, como se muestra en el diagrama de un fluorómetro en la Fig. 4-18. Luego, la solución es excitada por luz que está polarizada a 90 grados con relación a la luz utilizada en la primera excitación, y la fluorescencia emitida se registra. La polarización (P) se determina a través de la siguiente ecuación: Ivv – Ihv P = –––––––– Ivv + Ihv

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donde Ivv es igual a la señal registrada cuando se utiliza luz polarizada verticalmente para excitar la muestra, mientras que Ihv es la respuesta producida cuando la luz polarizada horizontalmente se usa para excitar la muestra. La luz emitida se determina del polarizador vertical con una orientación de 90 grados de la luz incidente, usando un segundo polarizador colocado antes del segundo monocromador. Numerosos procesos afectan la polarización final. Para muchos colorantes fluorescentes, incluyendo el más conocido, la fluoresceína, la orientación de la luz se retiene si la molécula se mantiene rígida. Cuando una molécula gira aleatoriamente por el proceso de movimiento browniano, la polarización se pierde. La capacidad de una molécula en solución para girar parcialmente depende de la viscosidad de la solución y el volumen molecular. Cuando la viscosidad de una solución o el volumen molecular aumenta, las moléculas fluorescentes giran lentamente y la polarización aumenta. En el caso de los inmunoensayos de fluorescencia polarizada, cuando el derivado de fluoresceína-medicamento se une por el anticuerpo, el volumen molecular aumenta y por ende la fluorescencia polarizada aumenta. Cuando el derivado no se une, tanto el volumen molecular como la fluorescencia polarizada son bajos (ver capítulo 13). Las medidas de la fluorescencia polarizada pueden realizarse con mucha exactitud y se afectan muy poco por las variaciones en la intensidad de la fluorescencia, a diferencia de la fluorescencia estándar (ver ecuación previa). De este modo, se alcanza fácilmente una precisión de la medición en el orden del 1% o más, que se traduce en un análisis más exacto. Otra ventaja de la fluorescencia polarizada es que la técnica se puede usar como un análisis homogéneo. Entre las desventajas están, el hecho de que la técnica está limitada al uso de colorantes fluorescentes, se requiere frecuentemente de una instrumentación muy especializada para medir sólo la intensidad o polarización de la fluorescencia, y además el sistema es menos flexible que la espectroscopía de absorción. En general, es determinante controlar la temperatura y la viscosidad cuando uno desarrolla fluorescencia polarizada,.

Nefelometría y Turbidimetríarefs(148) Fundamentos Interacción de la luz con las partículas. Para comprender el fundamento de los análisis de nefelometría y turbidimetría se debe primero examinar el concepto de la dispersión de la luz. Cuando un haz de luz colimado (es decir paralelo, no divergente) choca con partículas en suspensión, parte de este rayo es reflejado, algo es dispersado, algo es absorbido, y algo es transmitido. La nefelometría es la medición de la luz dispersada por partículas en solución. La turbidimetría mide la luz dispersada como una disminución de la luz transmitida a través de la solución. Para comprender la nefelometría debe examinarse la pregunta de cómo la luz es dispersada por una suspensión de partículas homogéneas. Pueden ocurrir tres tipos de dispersión. Si la longitud de onda, , es mucho mayor que el tamaño de la partícula (d < 0.1 ), la luz se dispersará simétricamente alrededor de la partícula, ocurriendo un mínimo en la intensidad de la dispersión a 90 grados respecto al rayo incidente, como lo descrito por Rayleigh (Fig. 4-20, A). 231

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Si la longitud de onda de la luz incidente es mucho menor que el tamaño de la partícula (d > 10 ), la mayor parte de la luz aparecerá dispersada hacia adelante por causa de una retrodispersión destructiva fuera de fase; como se describe en la teoría de Mie (Fig. 4-20, B). Si en cambio, la longitud de la luz es aproximadamente igual al tamaño de las partículas, aparece más luz dispersada hacia adelante que hacia atrás (Fig. 4-20, C), según lo describe Rayleigh-Debye.ref(149) Una de las aplicaciones más comunes de los análisis de dispersión de la luz, es la medición de las reacciones antígeno-anticuerpo. Ya que la mayoría de los complejos antígeno-anticuerpo son sistemas heterogéneos con partículas de un diámetro de 250 a 1500 nm y las longitudes de onda usadas en la mayoría de los analizadores de dispersión son de 320 a 650 nm, la dispersión es esencialmente Rayleigh-Debye, con un blanco de dispersión descrito en la dispersión de Rayleigh. De esta manera, la capacidad de detectar la dispersión de la luz hacia delante ( = 15 a 90 grados) proporcionará una mayor sensibilidad a las determinaciones nefelométricas. Como en el caso de los nefelómetros de velocidad y láser. Detección de la luz dispersa Turbidimetría. La turbidimetría es la medida de la reducción en la transmisión de la luz ocasionada por la formación de partículas, y cuantifica la luz residual transmitida (Fig. 4-21). La instrumentación requerida para las determinaciones turbidimétricas va desde un simple espectrofotómetro manual, disponible en la mayoría de los laboratorios, hasta sofisticados analizadores discretos. Ya que esta técnica mide la disminución de una amplia señal de luz transmitida, la sensibilidad de la turbidimetría está limitada principalmente por la exactitud fotométrica y la sensibilidad del instrumento. Los equipos usados para turbidimetría pueden ser utilizados para otras pruebas, como los ensayos enzimáticos y aquellos ensayos basados en métodos colorimétricos. Nefelometría. La nefelometría, detecta la porción de la luz que es dispersada en una variedad de ángulos (Fig. 4-22). La sensibilidad de este método depende principalmente de la ausencia de un blanco o fondo de dispersión debido a que el instrumento detecta un pequeño aumento de la señal a un ángulo de dispersión, , sobre un fondo negro o nulo. Idealmente la luz no se detecta en ausencia de muestras dispersantes, por lo que la dispersión subsecuente en la muestra se mide contra un fondo negro. La señal se amplifica por un fotomultiplicador y de esta manera se aumenta el intervalo de detección. Sin embargo, estas determinaciones requieren la utilización de un nefelómetro, el cual tiene una aplicación limitada para otras pruebas.

Instrumentación Diagrama esquemático del instrumento. Un diagrama esquemático de los componentes básicos de un nefelómetro está representado en la Fig. 4-23. Un sistema típico consiste en una fuente de luz, un sistema de colimación, un selector de longitud de onda como un filtro (estos dos últimos no son necesarios con fuentes de luz láser); una cubeta para la muestra, una trampa para la luz errática, y un fotodetector. Fuente de luz. 232

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Los fluoronefelómetros utilizan una lámpara de arco de mercurio de presión media como fuente de luz, la cual sirve para nefelometría y fluorometría. La intensidad relativamente alta de luz y la emisión de bandas de longitud de onda corta hacen de ésta una buena fuente. Otras fuentes de luz van desde simples lámparas de filamento de tungsteno de bajo voltaje y diodos de emisión de luz hasta sofisticados dispositivos láser de bajo poder. Los equipos láser producen rayos intensos de luz estable y altamente colimados (típicamente 1 miliradian de divergencia) que no requieren colimadores ópticos adicionales como las otras fuentes de luz. En los sistemas ópticos que usan luz láser es más fácil reducir la luz errática que contribuye a la dispersión de fondo y enmascara el haz transmitido, permitiendo de esta manera la medición de la dispersión hacia adelante. Este aumento en la intensidad de la luz realizado con el láser también permite mejorar la relación señal-ruido, pero está algo limitada por la saturación del detector. Entre las desventajas de las fuentes láser tenemos: el costo, problemas de seguridad, y el hecho de su disponibilidad restringida o limitada a longitudes de onda fijas. Dado que el tamaño de las partículas puede cambiar continuamente durante la reacción analítica, como la formación de inmunoprecipitados, la luz dispersa de longitud de onda simple puede cambiar mientras que el promedio de luz dispersa sobre muchas longitudes de onda permanece relativamente constante. El sistema “array” de la compañía “Beekman” emplea un filtro de banda ancha para la selección de regiones de longitud de onda de una lámpara de tungsteno normal para superar este problema, el cual es evidentemente más agudo en los métodos que miden la velocidad de formación cuando el tamaño de la partícula cambia rápidamente. En todos los casos, el sistema fotodetector debe cotejarse a la longitud o longitudes de onda de luz dispersa, el cual por nefelometría y turbidimetría, corresponde a la longitud o longitudes de onda de la luz incidente. Angulo de detección.ref(150) Debido a que partículas del tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo parece que dispersan más luz en dirección frontal, hay un incremento en la relación señal-ruido cuando el detector está situado más cerca del paso de luz transmitido (0 grados). La señal blanco, mejor descrita como dispersión de Rayleigh (Fig. 4-20, A), no se afecta por un ángulo alterado de detección. Aunque en la mayoría de los primeros nefelómetros detectaban la dispersión de luz a 90 grados por razones de fácil fabricación, lo cual limitaba la capacidad de medir ángulos pequeños, la detección de la luz dispersada hacia delante deberá proporcionar teóricamente mayor sensibilidad. Los instrumentos más recientes tienden a operar con ángulos de detección más pequeños, en la mayoría de los casos optimizados para dar una mayor relación señal-ruido para las ópticas particulares de los instrumentos. Obviamente, la detección a 0 grados no es posible debido a la alta intensidad del haz transmitido, pero algunos analizadores rápidos equipados con láser que usan una máscara para bloquear el rayo transmitido pueden operar con ángulos muy pequeños. Los instrumentos que emplean detectores de ángulo-pequeño tienden a tener mayor sensibilidad que el tipo instrumentos de 90 grados.

Limitaciones: turbidimetría frente a la nefelometría Aunque el fundamento de la nefelometría -detección de una pequeña señal 233

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(amplificable) sobre un fondo negro- debe proporcionar a este método una mayor sensibilidad, las especificaciones y lo sofisticado de los instrumentos disponibles no alcanzan este objetivo. La turbidimetría -detección de una pequeña disminución en una señal grande- debe estar limitada en sensibilidad; sin embargo, los instrumentos actuales tienen una discriminación excelente y pueden cuantificar pequeños cambios en la señal, permitiendo de este modo determinaciones turbidimétricas que alcanzan una alta sensibilidad. La turbidimetría y nefelometría poseen similitudes con la espectrofotometría de absorción, y muchas fuentes de interferencias y errores son comunes en estos sistemas. Varias de las técnicas analizadas en el capítulo 23, que pueden ser utilizadas para minimizar interferencias en la absorción son aplicables también en la turbidimetría y nefelometría. Sin embargo la turbidez de la muestra puede ser una interferencia en ambas técnicas. Debido a la particularidad de las determinaciones nefelométricas, especialmente en el caso de las reacciones antígeno-anticuerpo, algunas aplicaciones específicas serán discutidas más adelante en este capítulo. Color endógeno y selección de la longitud de onda. La teoría básica de la dispersión de la luz predice que la intensidad de la luz dispersada aumenta a medida que se utilizan longitudes de onda menores de luz incidente. La mayoría de los ensayos inmunológicos que emplean proteínas séricas requieren la selección de una longitud de onda, en la cual ninguna de las proteínas o los componentes cromogénicos del suero absorben significativamente. Dado que las proteínas absorben fuertemente por debajo de los 300 nm y el suero tiene un pico de absorción de 400 a 425 nm debido a las porfirinas, los instrumentos tienden a funcionar en los intervalos de 320 a 380 ó de 500 a 650 nm. La reducción de la concentración de proteínas mediante diluciones puede disminuir la absorción de fondo. La mayoría de las reacciones inmunoquímicas determinadas por nefelometría utilizan anticuerpos de alta afinidad para permitir grandes diluciones de las proteínas con el consecuente mejoramiento de la sensibilidad. Comparación de la sensibilidad. La sensibilidad en los nefelómetros está controlada en gran parte por la cantidad de dispersión de fondo de las muestras y reactivos. Dado que la dispersión de fondo puede ser alta con relación a la dispersión específica, los instrumentos no alcanzan su mayor potencial de sensibilidad. Esta limitación, unida a las altas longitudes de onda generadas en los instrumentos láser, explica el hecho de que los instrumentos láser no presentan un mayor incremento en la sensibilidad sobre los nefelómetros convencionales. La sensibilidad en las determinaciones turbidimétricas depende de la capacidad del detector para resolver pequeños cambios en la intensidad de la luz. Usando bajas longitudes de onda y espectrofotómetros de alta calidad con sistemas de detección de alta precisión, generalmente la sensibilidad de la turbidimetría es adecuada para muchas determinaciones y en muchos de los casos es comparable con la nefelometría. Teóricamente, con los perfeccionamientos adicionales, la nefelometría debe proveer finalmente una mayor sensibilidad que la turbidimetría. Análisis de punto final contra análisis cinético. El examen de la luz dispersada como una función del tiempo, después de la mezcla antígeno-anticuerpo, muestra que luego del retardo inicial, existe un aumento casi lineal en la dispersión seguido por el lento establecimiento de una dispersión constante. La reacción 234

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secundaria se produce más lentamente que la primera debido a que se forman partículas más grandes que comienzan a flocular, distorsionando la intensidad de dispersión observada a ángulos frontales. Las determinaciones de turbidimetría y nefelometría se comportan de esta manera. Existen dos maneras básicas para la medir de la luz dispersa causada por esta reacción; análisis cinético y de punto final. El análisis de punto final requiere la determinación de un blanco (reactivo) y debe transcurrir una cantidad de tiempo razonable antes de la medición final. La Fig. 4-24 muestra la dispersión de luz hacia adelante (directa) desarrollada a un ángulo de 70 grados en un analizador nefelométrico de velocidad.ref(151) Comparando las dos gráficas se pueden observar las diferencias entre el análisis de punto final (valor del blanco contra la lectura a t = x) y un análisis de velocidad o cinético (aumento en la intensidad de la dispersión sobre un intervalo de tiempo). El enfoque cinético, que resta electrónicamente cualquier señal del blanco, no requiere que se corra un blanco de reactivo separado en el ensayo. Ambos análisis cinético y de punto final se utilizan igualmente en nefelometría y turbidimetría.

Refractometría Fundamento Cuando un haz de luz incide sobre una superficie puede ser reflejado, absorbido, o si el material es transparente, puede atravesar el límite y emerger del otro lado. Cuando la luz pasa de un medio a otro, la trayectoria del haz de luz cambiará de dirección en la superficie de la interfase si su velocidad en el segundo medio es diferente de la del primero (Fig. 4-25). Esta desviación del rayo de luz se denomina refracción.ref(152) Dado que el grado de difracción del rayo de luz depende de la diferencia de velocidad de la luz entre dos medios diferentes, la relación de las dos velocidades ha sido expresada como índice de refracción, o índice refractivo. La capacidad relativa de una sustancia para desviar la luz se denomina refractividad. La expresión del índice de refracción, n, es siempre relativa al aire con la convención que n del aire = 1. La medida del índice de refracción es la medida de los ángulos, dado que la luz se desvía en un ángulo proporcional a la relación de n en el medio a través del cual pasa la luz: n

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La refractividad de un líquido depende de 1) la longitud de onda de la luz incidente, 2) temperatura, 3) la naturaleza del solvente, y 4) la masa total de soluto disuelto en el solvente. Si los primeros tres factores permanecen constantes, el índice de refracción de una solución, es una medida directa de la masa total de los sólidos disueltos. Aplicaciones La refractometría ha sido aplicada en la determinación de la concentración de proteínas totales del suero.32 Este análisis se basa en la suposición de que la matriz del suero (es decir, 235

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la concentración de electrolitos y pequeñas moléculas orgánicas) permanece esencialmente constante de paciente a paciente. Debido a que la masa de proteínas es normalmente mayor que la masa de otros constituyentes del suero, pequeñas variaciones en las demás sustancias no tienen un efecto significativo en el índice de refracción del suero. Los refractómetros son calibrados contra un suero "normal" y la concentración total de proteínas es leída directamente en una escala. La refractometría también se utiliza para estimar la gravedad específica en muestras de orina. El índice de refracción está relacionado linealmente con la masa total de solutos disueltos y por ende con la gravedad específica. Esto es útil para el intervalo encontrado normalmente en la orina (es decir, hasta 1.035 g/ml). Interferencia Cuando la concentración de compuestos de bajo peso molecular o materia particulada aumenta considerablemente, aparecen interferencias positivas. Esta interferencia se produce en presencia de hiperglicemia, hiperbilirrubinemia, azotemia (aumento de la urea sérica), muestras liofilizadas, e hiperlipidemia. La hemólisis produce valores falsos positivos para proteínas totales.

Instrumentación Muchos refractómetros clínicos están basados en el refractómetro de Abbé (Fig. 4-26), fabricado por American Optical Corporation. Este refractómetro consiste en dos prismas y una serie de lentes. La luz pasa a través del primer prisma donde el rayo de luz es dispersado. La luz dispersada pasa en y a través de una fina capa de la muestra donde se refracta. El rayo de luz pasa a través de un segundo prisma, donde es dispersado nuevamente y cuando sale de nuevo es refractado. La interfase en el borde del haz de luz refractado está alineada perpendicularmente con la escala de lectura de la concentración de proteínas séricas o puede leerse la gravedad específica. La escala para la lectura de las proteínas del suero (gr/dL o gr/L) se establece mediante la calibración del instrumento contra una solución de suero “normal”. Este tipo de refractómetro es extraordinariamente simple ya que no tiene partes móviles o eléctricas. Por lo tanto, la determinación de proteínas es fácilmente reproducible con una precisión de +1% y una exactitud de +1 g/l. El tamaño de la muestra es alrededor de 50 l. Refractómetros más complejos se utilizan para monitorear la elución de análisis de cromatografía líquida de alta resolución (ver capítulo 6).

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9. 10. 11. 12. 13.

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Chem 225:868-876, 1957.

Tablas Tabla 4-1. Espectro electromagnético.

Rayos

Rayos Ultravioleta

Visible

Infrarrojo

390

780

Microondas gama

X

(UV)

1

180

(IR) Longitud de onda 0.1 400 x 103 (nm)*

*Este es el intervalo de longitud de onda donde se produce el tipo más bajo de energía radiante respectivo.

Tabla 4-2. Colores y colores complementarios del espectro visible. Color complementario o de Longitud de onda* (nm) solución transmitido

Color absorbido†

350-430

violeta

430-475

azul

amarillo naranja 475-495 rojo-naranja 495-505 naranja-rojo 505-555 rojo 555-575 violeta-rojo 575-600 violeta 600-650 azul 670-700 verde

azul verdoso azul verdoso verde amarillo verdoso amarillo naranja rojo

De Brown TL, Lemay HE: Chemistry: the central science, Englewood

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Cliffs, N.J., 1977, Prentice-Hall. *Debido a la naturaleza subjetiva, los intervalos de longitudes de onda son solo aproximaciones. † Si una solución absorbe luz del color de la lista en la segunda columna, el color que se observa de la solución, es decir, la luz complementaria transmitida, está dado en la tercera columna.

Tabla 4-3. Bandas de absorción electrónica para cromóforos representativos. Cromóforo max Éter Tioéter Amina Tiol Disulfuro Sulfona Etileno Cetona Ésteres Aldehído Carboxilo Nitro Azo Nitrato

Sistema max max

–O– –S– –NH2 –SH –S–S– –SO2– –C=C– >C=O –COOR –CHO –COOH –NO2 –N=N– –ONO2 –(C=C)2– (acíclico) –(C=C)3– –(C=C)5– C=C–C=C

Benzeno 255 170 Antraceno Quinolina 314 2750 Isoquinolina 317 3500

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max

max

185 194 195 195 194 180 190 195 205 210 200-210 210 285-400 270 (hombro) 210-230

1000 4600 2800 1400 5500 — 8000 1000 50 fuerte 50-70 fuerte 3-25 12

260 330 219 184

35.000 118.000 6500 46.700 202

6900

252 227

199.000 375 37.000 270

7900 3600

218

80.000 266

4000

215

1600

255

400

270-285

18-30

280-300

11-18

21.000

De: Willard HH, Merritt LL, Dean JA: Instrumental methods of analysis, ed 4, Princeton, N.J., 1965, Van Nostrand.

Tabla 4-4. Lineamientos para instrumentos de análisis fotométrico enzimático. 239

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Intervalo o eror Parámetro confiabilidad, ±2 SD)

(95%

Arrastre De muestra muestra a muestra Exactitud de la temperatura Tiempo de equilibrio Manejo de la muestra Exactitud Precisión Tamaño menos Manejo de los reactivos Tiempo de mezcla seg Rendimiento fotométrico (a una velocidad de 0.1 A/min) Absorbancia inicial 0-1 A Absorbancia inicial 1-2 A Exactitud de la longitud de onda Ancho de banda Intervalo de longitud de onda Variable Intervalo de absorbancia Linealidad Paso de la celda/colocación 20 ng/mL siempre asociados a cáncer de próstata. Por consiguiente, en la medida en que la concentración de PSA aumenta, la probabilidad de enfermedad y la especificidad del ensayo también aumentan. El uso clínico deseado de una prueba será, también, un factor en la selección del mejor valor del punto de corte. En un grupo clínico dado, las consecuencias de un resultado falso negativo pueden ser más graves que las de un falso positivo. Los resultados falsos negativos son completamente inaceptables cuando se trata de pruebas para detectar infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en donadores de sangre y de transplante de órganos. Alternativamente, se puede causar menos daño al clasificar un paciente con un infarto agudo de miocardio IAM por una prueba de CC MB, cuando realmente lo tenía (falso positivo) que clasificarlo como negativo ( falso negativo). Dar de alta de un departamento de emergencia a un paciente con un infarto de miocardio (IM) puede ser catastrófico para el paciente. Por otra parte, tampoco es deseable someter innecesariamente a un paciente a procedimientos diagnósticos o intervenciones riesgosas por haber reportado pruebas falsamente positivas. Además sería exageradamente costoso recibir muchos pacientes quienes no padecen IM en una unidad de cuidado intensivo. Galen y Gambinoref(360) sugieren que el mejor valor del punto de corte empleado para clasificar un paciente como un caso de IM es el valor que produce la más alta eficiencia diagnóstica. No hay una manera sencilla para seleccionar las combinaciones óptimas de sensibilidad y especificidad. Como se discutió anteriormente, la elección depende de la naturaleza de la enfermedad, de la población clínica, y del costo relativo de un resultado falso positivo o falso negativo. Los ensayos secuenciales, suplementarios o confirmatorios adicionales pueden compensar una prueba con una relación alta de resultados falsos positivos y minimizar las consecuencias indeseables asociadas. Curva característica Receptor-Operador. La capacidad de una prueba que utiliza una concentración específica de compuesto analizado para discriminar enfermedad de no enfermedad puede ser representada gráficamente por medio del uso de las curvas de análisis características receptor operador (CRO). Construyendo varias curvas CRO dentro de la misma gráfica, el personal del laboratorio puede comparar los beneficios de dos pruebas diferentes o el desempeño de una prueba en condiciones diferentes, como diferentes valores de puntos de corte o diferentes poblaciones de pacientes. En la Fig. 20-5 se observa un ejemplo de estas curvas (Zweig y asociados)ref(361) mostrando la discriminación entre sujetos con y sin enfermedad arterial coronaria, en diferentes niveles de decisión, para apolipoproteina B, colesterol de baja densidad (LDL), relación apolipoproteina A1 a apolipoproteina B, y la relación de colesterol de alta densidad (HDL) y colesterol total. Para una buena discusión del uso de 786

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las curvas CRO se deben referir al artículo de Zweig y asociadosref(362) y a la revisión de Zweig y Campbell.ref(363) Una curva CRO se elabora graficando la sensibilidad de la prueba (relación de verdaderos positivos) versus 1 menos la especificidad (relación de falsos positivos). Los múltiples puntos en la curva representan la relación de verdaderos positivos y la relación de los falsos negativos empleando diferentes valores de puntos de corte para el diagnóstico o diferenciación de enfermedad versus no enfermedad. El punto de la curva que se encuentra más cercano a la esquina superior izquierda de la gráfica, representa el valor del punto de corte o límite de decisión que proporciona la mayor exactitud diagnóstica, esto es, la eficiencia de la prueba. El área bajo la curva representa la exactitud general de la prueba. Hay otras maneras útiles de representar y examinar el valor diagnóstico relativo de diferentes valores de puntos de corte. Un ejemplo, es la gráfica de Gerhardt modificadaref(364) como se utiliza en un estudio de la utilidad relativa de amilasa total, lipasa total, isoenzimas de la amilasa pancreática, y una isoforma de la lipasa, en el diagnóstico de pancreatitis aguda.ref(365) Esas cuatro pruebas fueron usadas en la misma población de 81 pacientes con sospecha de pancreatitis aguda. En dicha población, 41 pacientes presentaron pancreatitis y 40 no. En la Fig. 20-6, las barras vacías sobre la línea de valor cero representan pacientes con pancreatitis y las barras rayadas debajo de la línea representan pacientes sin pancreatitis. Empleando esa gráfica, los investigadores pudieron juzgar la mejor discriminación o punto de corte para maximizar la sensibilidad o especificidad de cada prueba. Ellos también concluyeron que, por lo menos en este grupo de pacientes estudiados, la amilasa total fue una prueba deficiente para evaluar pacientes con “abdomen agudo” y la mejor prueba de elección fue la lipasa total. Otras representaciones de valores de puntos de corte también útiles, son las que se muestran en las Figs. 20-4 y 20-7, para un ensayo inmunoquímico hipotético de CC-MB empleado en el diagnóstico de lesión del miocardio.ref(366) Cuando el objetivo es la eficiencia diagnóstica, es útil elaborar una gráfica sencilla del porcentaje de eficiencia versus los valores del punto de corte diagnóstico. Lo más apropiado es obtener la mayor eficiencia en el punto de corte más bajo, ya que el incremento de los valores del punto de corte producirá más resultados falsos negativos. La Fig. 20-4, es interesante porque muestra la eficiencia diagnóstica graficada como una función de la combinación de dos valores de punto de corte, el CC MB en ng/mL y el índice del porcentaje relativo de CC MB sobre CC total. La máxima eficiencia diagnóstica en la población de pacientes definida para estos ensayos de CC y CC MB parece ser de 90% con un punto de corte para CC MB de 5 ng/mL y un índice relativo de 3%. Los análisis de decisión que comprenden pruebas múltiples o pruebas combinadas pueden ser similares a los conceptos presentados aquí para la medición de un solo indicador variante, estos son discutidos en el texto de Galen y Gambino.ref(367) Puede ser también muy complejo con respecto a las evaluaciones secuenciales o simultáneas de múltiples valores variantes de acuerdo al teorema de Bayes, como ha sido discutido por Statland y colaboradores.ref(368) Agradecimientos Agradecemos los esfuerzos de los miembros de la NCCLS Subcomité de Intervalos de Referencia, quienes prepararon las Guías C28-P: Edward Sasse (Presidente), Kaiser J 787

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Aziz, Eugene K Harris, Sandy Krishnamurthy, Henry T Lee, Jr., Andy Ruland y Bette Seamonds. El C28-P fue modificado a C28-A, 1995.

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Tablas Tabla 20-1 Ejemplos de posibles criterios de exclusión. Consumo de alcohol Presión sanguínea anormal Donación frecuente de sangre Abuso de drogas Medicamentos con prescripción Medicamentos sin prescripción Medio ambiente Estado de ayuno o no ayuno Factores genéticos Hospitalización actual o reciente

Enfermedad reciente Lactancia Obesidad Ocupación Contraceptivos orales Embarazo Cirugía reciente Consumo de tabaco Transfusiones recientes Abuso de vitaminas

De: National Committee for Clinical Laboratory Standards: How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: approved guideline, NCCLS Document C28-A, Villanova, Penn., 1995, NCCLS.

Tabla 20-2 Ejemplos de posibles factores de partición Edad Grupo sanguíneo Variación circadiana Dieta Componente étnico Ejercicio Estado de ayuno o no ayuno Localización geográfica

Postura al tomar la muestra Raza Sexo Fase del ciclo menstrual Estado del embarazo Hora del día cuando se toma la muestra Uso de tabaco

De: National Committee for Clinical Laboratory Standards: How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: approved guideline, NCCLS Document C28-A, Villanova, Penn., 1995, NCCLS.

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medicina, clasificados por sexo.

Compuesto Analizado 88 89 91 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 106 Total

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1 2 5 12 12 19 14 27 28 39 24 21 10 12 14 9 1 1 240

Fuente: National Committee for Clinical Laboratory Standards: How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: approved guideline, NCCLS Document C28-A, Villanova, Penn., 1995, NCCLS.

indica el 2.5avo percentil. Indica el 97.5avo percentil.

Tabla 20-5 Intervalos de confianza del 90% para límites de referencia bajos y del 95% para límites de referencia altos. Compuesto analizado Calcio mg/L mujeres (n=120) hombres(n=120) combinada(n=240)

Límite de referencia bajo

88 - 91 91 - 93 88 - 91

Límite de referencia alto

101 - 103 103 - 106 103 - 106

De: National Committee for Clinical Laboratory Standards: How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: approved guideline, NCCLS Document C28-A, Villanova, Penn., 1995, NCCLS.

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Tabla 20-6 Propósito para el cual se ordenan análisis de laboratorio y el grado de importancia de los intervalos de referencia en la interpretación de sus resultados Propósito

Intervalos de Referencia

Diagnóstico de la enfermedad Tamizaje de la enfermedad Determinación de la severidad de la enfermedad Monitoreo y progreso de una enfermedad Respuesta al monitoreo de la terapia Monitoreo de la terapia Monitoreo de la toxicidad a fármacos Predicción de la respuesta a un tratamiento Predicción del pronóstico Tranquilidad del paciente

++ +++ + + + +++ ++ + + ++

De: Young D.S. Arch Pathol Lab Med 116:704-709,1.992 +, menor importancia; ++, moderada importancia; +++, mucha importancia.

Tabla 20-7. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos * Número de sujetos con un resultado Positivo Número de sujetos con enfermedad Número de sujetos sin enfermedad Total

VP FP VP+FP

Número de sujetos con un resultado Negativo FN VN FN+VN

Total VP+FN FP+VN VP+FP+FN+VN

VP, Verdaderos positivos, o número de pacientes enfermos correctamente clasificados por la prueba FP, Falsos positivos, o número de pacientes sanos incorrectamente clasificados por la prueba. FN, Falsos negativos, o número de pacientes enfermos clasificados incorrectamente por la prueba. VP, Verdaderos negativos, o número de pacientes sanos correctamente clasificados por la prueba.

Sensibilidad diagnóstica: Especificidad diagnóstica: Valor predictivo positivo de una prueba, Valor predictivo negativo de una prueba,: Eficiencia de una prueba (fracción de Pacientes correctamente clasificados), Prevalencia,

VP / VP+FN VN / FP+VN VP+ = VP / VP + FP VP - = VN / VN + FN VP + VN / VP+FP+VN+FN VP + FN / VP+FP+VN+FN

*De Statland BE, Winkel P. Burke DM. Galen RS. Quantitative approaches used in evaluating measurements and other clinical data ,in Henry JB. editor. Clinical diagnostics and management by

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laboratory methods. Philadelphia, 1979, Saunders.

Figuras

Figura 20-1 Distribución de ensayos perfectamente separados de poblaciones de individuos sanos y enfermos. Esta clara separación rara vez ocurre en la realidad.

Figura 20-2 Distribuciones de resultados de pruebas obtenidas usualmente de poblaciones sanas y enfermas, entre las cuales ocurre determinada superposición.

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Figura 20-3 El grado de superposición de resultados de pruebas no permite la diferenciación entre las poblaciones enfermas y las sanas.

Figura 20-4 Porcentaje de eficiencia diagnóstica contra los niveles de punto de corte combinados de CC-MB en nanogramos por mililitro (conjunto inferior de valores en el eje x) e índice relativo porcentual, expresado como (CC-MB/CC total) x 100. La combinación de estas dos pruebas a diferentes niveles de punto de corte respectivos produjo la eficiencia diagnóstica más alta, 90%, en un punto corte de 5 ng/mL para CC-MB y 3% para el índice relativo. (Cortesía de D. Obzansky, Du Pont Cp., Wilmington, Del.)

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Figura 20-5 Curvas características receptor-operador (CRO) que muestran la discriminación entre sujetos con y sin ninguna enfermedad arterial coronaria, determinada por cateterización cardíaca para dos diferentes indicadores bioquímicos. (De Zweig MH, Broste sK, Reinhart RA: Clin Chem 38:1425-1428, 1992.)

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Figura 20-6 Gráficas de Gerhardt modificadas para amilasa sérica, lipasa, y para el diagnóstico de pancreatitis aguda. ( De: Gerhardt W: The Bayes approach: sistematic graphic evaluation of diagnostic tests. In Keller H Trendelenburg CH, editors: Data presentation, interpretation, New York, 1989, Walter de Gruyter.)

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Figura 20-7 Porcentaje de eficiencia diagnóstica graficada contra diferentes niveles de punto de corte corte diagnóstico en nanogramos por mililitro para un ensayo inmunoquímico hipotético de CC-MB sérica. El nivel de decisión óptimo es la eficiencia diagnóstica más alta, 90%, al nivel de corte más bajo, 5 ng/mL de CC-MB. (Cortesía de D. Obzansky, Du Pont Cp., Wilmington, Del.)

CAPÍTULO 21

21. Control de la Calidad en el Laboratorio Clínico Richard B. Passey Especiales agradecimientos a Bradley E. Copeland, M.D., por la autoría de este capítulo en la edición anterior, del cual se mantiene la mayor parte. Objetivos de un programa de control de la calidad. Establecimiento de objetivos. Error total permisible. Desempeño requerido en los ensayos de aptitud. Limites de decisión clínicos. Definición de los criterios de utilidad clínica, mediante el cálculo del límite de cambio significativo.

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Control de la calidad, (control del proceso) y detección del error. Niveles de responsabilidad en el proceso de control. Análisis de los especímenes de control de la calidad –Toma de decisiones diarias. Procedimiento para el control de la calidad. Consideraciones preliminares, en la definición de límites para las mezclas de control de calidad. Un método simple para establecer valores objetivo promedio, provisionales para las mezclas de control de calidad. Cálculo de la desviación estándar usual. Establecimiento de los límites de acción y control para cada nivel de las mezclas de control calidad. Definición de los límites de control de la calidad mediante curvas de poder. Detección y solución de problemas de calidad. La decisión “fuera de control”. Detección de problemas de calidad. Utilización de los datos de los pacientes en la toma de decisiones. Acciones para volver a tener un sistema analítico bajo control. Medidas a tomar cuando un método está fuera de control. Procedimientos a seguir cuando un sistema analítico falla. Calibración y control de la calidad. Uso de calibradores. Un sistema práctico para la verificación de un nuevo calibrador. Control de la calidad durante el cambio de reactivos y el mantenimiento de equipos. Programas de control de la calidad externo y otras herramientas para el control de exactitud. Control de exactitud requerido por la CLIA´88 Métodos definitivos y de referencia. Materiales de referencia. Selección de un laboratorio de referencia como apoyo en el control de la exactitud. Responsabilidad de los fabricantes en el control de los sistemas analíticos.

OBJETIVOS Proporcionar un enfoque práctico sobre el control de la calidad. Establecer un sistema de evaluación de las especificaciones de desempeño, durante el proceso de control de la calidad. Proveer métodos prácticos para llevar a cabo el control de la calidad. Desarrollar criterios objetivos en la definición de las condiciones de “fuera de control”. Suministrar una guía conveniente en la solución de situaciones “ fuera de control”.

Términos Claves CLIA o CLIA´88 La Reforma para el Mejoramiento de los Laboratorios Clínicos 798

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(CLIA´88 por sus siglas en inglés), reglamenta el funcionamiento de los laboratorios clínicos en los Estados Unidos. Esta ley se interpreta mediante regulaciones administrativas desarrolladas por organizaciones certificadoras. control de la calidad externo Programa en el cual una institución externa provee muestras desconocidas para su análisis. (Vea: Survey o proficiency testing specimen. Encuesta o especímenes para ensayos de aptitud). Los resultados son remitidos a los laboratorios participantes con una evaluación de rendimiento: “aceptable o no aceptable”. En el CLIA´88 este proceso se conoce con el nombre de ensayos de aptitud. control de calidad la interno Programa analítico que verifica la aceptabilidad y estabilidad de los resultados del laboratorio, mediante la utilización de muestras controles. corrida “Una corrida es un intervalo menor de 24 horas, dentro del cual se espera, que la exactitud y precisión de un sistema de análisis permanezcan estables. “(CLIA ‘88 §493.1218[b]). curvas de poder Gráfica de la magnitud del error detectado por un sistema de control, versus la probabilidad de detectar el mismo error con reglas de control diferentes. desviación estándar usual (DEU) Es el promedio de los valores de las desviaciones estándar de 3 a 6 meses, basados en datos consecutivos de control de calidad. Es un estimado de la precisión, que un sistema analítico es capaz de alcanzar. desviación estándar (DE): Es un indicador descriptivo de la extensión de la dispersión de una población de resultados de ensayos o de un conjunto de datos. desviación estándar mensual Desviación estándar calculada con los valores de control de la calidad diarios durante un mes. diferencia significativa Aquella que se demuestra estadísticamente que está más allá del límite de variabilidad esperado; clínicamente es una diferencia suficientemente grande para influir en una decisión médica; operacionalmente es una diferencia estadísticamente significativa que el personal que realiza el ensayo y los supervisores consideran suficientemente grande para requerir una investigación. ensayos de aptitud ('proficiency testing' en inglés) Estos ensayos son equivalentes a los que se ejecutan en un programa de control externo de la calidad, pero con fines legales para el funcionamiento del laboratorio. error presupuestado Error total aceptable de un sistema analítico, que está determinado por cada laboratorio sobre la base de los requerimientos médicos o los sistemas reguladores. Este error tolerable producido, debe comprende todas las fuentes del mismo, incluyendo la imprecisión, el sesgo, las interferencias y otros. especificaciones de desempeño Límites numéricos establecidos por cada laboratorio, para definir el funcionamiento aceptable de cada compuesto analizado y sistema de análisis. Las especificaciones de desempeño,incluyen recomendaciones sobre: exactitud, precisión, sensibilidad, (cantidad mínima reportable), especificidad analítica (sustancias interferentes) 799

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si es aplicable, los límites reportables de los resultados de los pacientes, y el intervalo de referencia o valores normales. especimen de las encuestas o ensayos de aptitud Muestra que es preparada por una agencia independiente y remitida a los laboratorios participantes de un programa de control externo. estándar primario Substancias químicas de la más alta pureza conocida, que pueden ser usadas para producir calibradores para sistemas analíticos. fuera de control Condición en la cual un sistema de análisis es rechazado para ser utilizado en la atención de los pacientes, debido a los resultados de control de la calidad o a otros indicadores. Esta circunstancia debe ser declarada formalmente por el director del laboratorio o por el supervisor técnico, porque la decisión implica la necesidad de tomar acciones específicas de acuerdo con regulaciones del CLIA´88 (Ver §493 1219 Remedial Actions y §493 Quality Assurance Of Quality Controls). Los resultados rutinarios de control de la calidad que excedan los límites definidos, deben ser documentados. (ver límites de acción). grupo semejante Cuando se utiliza en programas de control externo, indica el grupo de laboratorios que utilizan métodos iguales o similares. límites de acción Rangos de valores establecidos para las mezclas de control de calidad. Si los resultados están por fuera de estos límites puede existir un deterioro en la calidad de los sistemas analíticos, que debe ser investigado por el técnico. límites de control Límites numéricos, (expresados en las unidades de los ensayos), dentro de los cuales deben hallarse los valores de una muestra de control, para que el ensayo pueda ser considerado válido o dentro de control. materiales de referencia certificados (MRC). Un material de referencia, que tiene uno o más de sus valores garantizados por un procedimiento válido. Está acompañado o respaldado por un documento expedido por un organismo certificador.ref(369) El material tiene una alta pureza del componente especificado. Los materiales de referencia certificados son usados en la preparación de calibradores o especímenes de concentración conocida. método El principio metodológico usado en la elaboración de un ensayo: el fundamento químico o físico del mismo. método de referencia Un método investigado profundamente, en el cual se da una descripción precisa y clara de los procedimientos y condiciones necesarias para la determinación exacta de uno o más valores. La exactitud y precisión documentadas para al método se corresponden con la utilización del método para evaluar la exactitud de otros métodos, para medir valores de la misma propiedad, o para asignar valores a materiales de referencia. método definitivo El método analítico que ha sido sometido a la investigación y evaluación de todas las fuentes de inexactitud incluyendo la inespecificidad. La magnitud de la imprecisión final del método y el sesgo, expresados en la declaración de incertidumbre, son compatibles con el propósito e implementación final del mismo. El valor final de un método definitivo es 800

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tomado como “valor verdadero”. mezclas para control de la calidad Cantidad de material estable, (tal como suero, plasma u orina), que es utilizado en un programa de control de la calidad interno para evaluar la aceptabilidad y estabilidad de un sistema de análisis. procedimiento Grupo de instrucciones para utilizar un método, que genera un resultado analítico. programa regional de control de la calidad Grupo de laboratorios que adquieren en forma conjunta una gran cantidad de material de control de calidad, con el fin de establecer valores asignados comparables. promedio mensual Valor promedio para un período de un mes, de los datos de control de la calidad diarios. promedio mensual Valor promedio para un período de un mes, de los datos de control de calidad diarios. rechazo falso Rechazo de una serie porque los resultados de control de la calidad indican un problema analítico que no está realmente presente. rechazo verdadero Rechazo de una corrida analítica porque los especímenes de control indican que existe un problema real. salto Un salto es un cambio abrupto y sustancial (en una dirección) de los datos de calidad. Un salto generalmente indica un problema en el sistema analítico o en el material de control. sesgo sistemático El sesgo sistemático puede ser constante o proporcional. El sesgo sistemático constante muestra una diferencia constante entre el valor verdadero y el valor observado, con independencia del nivel de concentración. El sesgo sistemático proporcional denota una diferencia entre el valor verdadero y el valor observado, el cual varía proporcionalmente a medida que cambia el nivel de concentración. sistema analítico La combinación de un método analítico, un procedimiento para usar el método, reactivos, calibradores, accesorios y un instrumento. tendencia Cambio gradual en los resultados de las muestras de control de la calidad, que sugiere un problema con el sistema analítico o con el material de control. valor asignado Es el valor medio, establecido para un compuesto analizado en una mezcla de control de calidad. variabilidad inherente Los valores de las mediciones repetidas de un mismo material varían alrededor de una media. La desviación estándar mide la magnitud de esta variabilidad.

Esta discusión sobre control de calidad, tal como se realiza en el laboratorio clínico, pretende suministrar una guía útil, para el establecimiento y mantenimiento de la calidad en el trabajo del laboratorio. Breitenberg 4 identificó 10 puntos de las normas para el aseguramiento de la calidad, de la Organización Internacional para la Estandarización, series ISO 9000, que son comunes a todos los sistemas de control. Estos puntos incluyen la garantía y disponibilidad de: (1) Un sistema de calidad efectivo; (2) Mediciones válidas; (3) Equipos calibrados y probados; (4) Técnicas estadísticas apropiadas; (5) Sistemas de identificación y 801

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trazabilidad del producto; (6) Un buen mantenimiento de los procesos de archivo y registro; (7) Sistemas adecuados de control de los registros; (8) Un sistema de inspección y ensayo; (9) Procedimientos para el manejo de las no conformidades; (10) Personal debidamente entrenado y con la experiencia necesaria. El objetivo de los programas de control de calidad debe ser cumplir con cada uno de estos 10 estándares. Un análisis cuidadoso de las normas definidas por la “Reforma para el Mejoramiento de los Laboratorios Clínicos de1988” (CLIA 1988), muestra que todos los puntos mencionados anteriormente deben incluirse en un sistema de control de la calidad de laboratorio. Los principales objetivos analíticos de un programa de control de calidad para un laboratorio clínico deben ser: 1. Establecer y mantener métodos exactos. 2. Definir y mantener los valores de precisión necesarios para el laboratorio. 3. Garantizar que los sistemas analíticos sean estables y que funcionan de acuerdo con las especificaciones de manejo. Esto incrementa la confiabilidad de las decisiones médicas a corto y largo plazo. Para alcanzar estas metas, se debe cumplir con los 10 objetivos de aseguramiento de la calidad enumerados anteriormente, establecer políticas para la preparación y atención del paciente, reducir los errores pre-analíticos (ver capítulo 3), y maximizar el uso efectivo del personal y las instalaciones del laboratorio. Un programa de control de la calidad, está diseñado para evaluar qué tan bien se cumplen estos objetivos.

Objetivos de un Programa de Control de Calidad Establecimiento de objetivos El primer paso cuando se está implementando un programa de control de calidad para el laboratorio, es definir los criterios de desempeño aceptables. ¿Qué exactitud y precisión serían recomendables? ¿Qué tan exacto y preciso debe ser? Estas consideraciones incluyen la definición del error analítico permisible, basados en la utilización de los resultados de las pruebas.refs(370) Un control más allá del requerido para fines clínicos puede ser una pérdida de tiempo y de materiales, por lo que resulta importante evaluar si la reducción del error mejora el diagnóstico, tratamiento o pronóstico del médico. Los criterios de desempeño pueden ser formulados de acuerdo con diferentes bases. La primera está constituida por los estándares reguladores. Por ejemplo, la precisión y exactitud requeridas por CLIA ’88. La segunda es la precisión y exactitud alcanzables en su funcionamiento por la mayoría de los laboratorios. Esta información puede obtenerse mediante comunicación con profesionales de otros laboratorios, o por los resultados de los programas de control externo como el del Colegio de Patólogos Americanos (CAP). Tercero y probablemente lo más importante, es esencial definir la precisión y exactitud requeridos por el personal médico, quienes son los usuarios de los resultados producidos por el laboratorio. El error de los sistemas analíticos, debe ser mucho menor que el valor aceptable por las normas reguladoras, porque si no es así, el laboratorio no podrá cumplir con estas reglamentaciones y quizás tampoco con los requerimientos médicos. La siguiente sección 802

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revisará los criterios clínicos que son utilizados para establecer y evaluar el desempeño del laboratorio. Error total permisible El error total permisible de un sistema de análisis, está compuesto de varios elementos y cada uno de ellos, puede ser una fuente de imprecisión o de sesgo. Si el error total puede ser comparable con el error presupuestado, la suma de los componentes individuales del error aceptable, constituye el error total producido de ese presupuesto. Cuando éste se excede, es porque se ha superado el error que puede ser tolerado en un ensayo de laboratorio. Cuanto mejor se puedan identificar los componentes del error, mejor se podrán ajustar los elementos del ensayo para reducirlo. Los requerimientos médicos y del CLIA ’88, no dependen de que el error se introduzca por imprecisión o por sesgo del resultado; es la combinación de ambos que determina el error total. Sin embargo, el personal del laboratorio debe conocer qué partes representan la imprecisión y el sesgo existentes en el error total producido, porque el procesos de solución de estos problemas son frecuentemente diferentes. El error totalref(371) está definido por la imprecisión y el sesgo mediante la fórmula: Error total = Suma de los errores de sesgo + 1.96 x DE (Desviación estándar)

Ec. 21.1

Se debe tener en cuenta que 1.96 es el límite de confianza (frecuentemente redondeado a 2 por conveniencia) para un grupo de resultados con una distribución normal. Ejemplo: Si los requerimientos médicos para glucosa, definen que el error total debe ser menor que 60 mg/L a una concentración de 1200 mg/L, y usted sabe que su imprecisión es de 20 mg/L, el máximo sesgo que su método puede tener, se calcula de la siguiente manera: 60 mg/L = x mg/L + 1.96 . 20 mg/L Máximo sesgo = X = 60 – (1,96.20) = 20,8 mg/L

Un sesgo en el ensayo demasiado grande, se puede reducir con frecuencia, empleando procedimientos de calibración y materiales más exactos. La imprecisión se incrementa por componentes electrónicos y mecánicos de baja calidad. El estado de mantenimiento de los instrumentos, puede afectar el sesgo y la imprecisión. Un sistema de control de calidad exacto, puede proveer información de ambos, exactitud y precisión. La Tabla 21-2 contiene datos analíticos del Centro Médico de Oklahoma, en donde se muestra el error total para una serie de pruebas. El error total es grande, porque incluye el sesgo aportado por varios instrumentos utilizados al procesar y reportar las pruebas. El error de exactitud presupuestado, debe incluir el sesgo introducido por la utilización de diferentes sistemas analíticos, ya que el problema de la desviación entre ellos es de tal magnitud, que puede afectar la utilización médica de las pruebas, y generalmente éstas se realizan utilizando más de un sistema. Desempeño requerido en los programas de control externo. El gobierno federal ha presentado los criterios de error permitidos para 154 pruebas en 13 áreas del laboratorio además de citología. (Reglas para los ensayos de aptitud del CLIA’88, Federal Register Febrero 28, 1990, páginas 7152-7162). Los criterios de CLIA para Química 803

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Clínica están enumerados en la Tabla 21-2. Estos criterios de error permisibles, definen la cantidad de error total que el resultado de una prueba de un ensayo de aptitud puede tener. El valor diana, también denominado valor objetivo o valor blanco, utilizado para determinar el sesgo es definido por el servicio que brinda el ensayo de aptitud usando la media general, o la media del grupo par, o el valor establecido mediante un método definitivo o de referencia. Las ventanas de error de CLIA ’88 (presupuestas) son demasiado grandes para los límites del control de la calidad rutinario ya que los errores de imprecisión de esta magnitud causarán fallos en los ensayos de aptitud.ref(372) Compare los errores totales presentados en la Tabla 21–1 con el los errores clínicos permisibles y las máximas ventanas de error especificadas por CLIA ’88. Observe que varias pruebas en la Tabla 21-2 presentan problemas potenciales con los ensayos de aptitud, debido a un error total alto e inaceptable, cuando se procesan las pruebas por más sistemas de análisis. Este sería el caso si los ensayos de aptitud imitaran realmente el trabajo del laboratorio. Sin embargo, en la práctica actual, estos ensayos de aptitud únicamente comparan los resultados con los grupos objetivos o similares por instrumentos. Limites de decisión clínicos. Para tener un verdadero control de calidad es necesario evaluar, desde la perspectiva de los clientes, el desempeño requerido en cada paso de la operación del laboratorio.refs(373) Un buen programa de control de la calidad incluye entre sus fundamentos, el establecimiento de criterios de desempeño analítico de exactitud y precisión, basados en los requerimientos de utilidad clínica.refs(374) En la Tabla 21–1 se compara el error analítico total para diferentes instrumentos con el error permisible sugerido por los requerimientos médicos y el exigido como aceptable por el CLIA´88. Un ejemplo de criterios clínicamente definidos para precisión y exactitud son las guías formuladas por El Instituto Nacional de Salud ("National Institute of Health" o "NIH", por sus siglas en inglés) para el análisis de colesterol. refs(375) Para minimizar el error en el diagnóstico de las hiperlipidemias, el NIH estableció un valor de 3% como límite de imprecisión y 3% como un grado aceptable de sesgo (inexactitud). Cada laboratorio debe consultar a los usuarios apropiados o a los médicos para obtener su estimado de error permisible basado en la práctica clínica.refs (376) Si sus requerimientos son razonables y no ponen en conflicto el laboratorio con los requerimientos oficiales se podría tratar de tomar estos límites de error. Si no hay información disponible acerca de las necesidades de precisión y exactitud para las decisiones médicas, el laboratorio podrá estimar su error teórico basado en el grado de variación inter e intraindividual para cada compuesto analizado.refs(377) En la pág. 405 se presentan las ecuaciones relativas al error total permisible de acuerdo con estas variaciones biológicas. La Tabla 3-1 relaciona algunos ejemplos de variabilidad intraindividual para ciertos compuestos analizados. Una vez se haya decidido el criterio de error total permisible de acuerdo con los requerimientos médicos, los métodos y sistemas analíticos deben estar en capacidad de producir valores que satisfagan estos requerimientos. Adicionalmente, el control de la calidad debe estar diseñado para garantizar que los sistemas analíticos mantienen estos límites. Los intervalos de referencia de las pruebas describen los valores esperados para grupos de individuos seleccionados cuidadosamente, determinados mediante sistemas analíticos que se asume tienen un desempeño apropiado. (Ver capítulo 20). Un incremento en el sesgo ocasionará un cambio en los valores de los ensayos que invalidará 804

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la utilidad clínica de los rangos de referencia establecidos.

Definición de los criterios de utilización médica mediante el cálculo del límite de cambio significativo La utilidad clínica de los ensayos de laboratorio, depende de la capacidad de mantener día a día la precisión y exactitud de los sistemas analíticos. Los médicos toman muchas decisiones, sobre la base de las diferencias de los valores de los resultados que diariamente tienen los pacientes, asumiendo que se ha mantenido el mismo nivel de precisión y exactitud, de día a día, mes a mes o año en año. Así, la precisión y exactitud actuales de los procedimientos de medición, influencian directamente la interpretación clínica de los cambios diarios de los resultados de laboratorio. Un elemento clave en la evaluación de la utilidad médica de un resultado de un ensayo, es el estimado de la magnitud de cambio analítico significativo en la concentración. Este estimado es llamado el límite de cambio significativo (LCS). El límite de cambio significativo, es una herramienta de decisión que ayuda a los médicos a saber, si los cambios que se producen día a día en los resultados de laboratorio, son debidos a la variabilidad inherente a los procesos analíticos, o a los cambios causados por modificaciones en la fisiología y patología del paciente. El límite de cambio significativo asume que la desviación estándar usual, representa la variabilidad analítica del método. La desviación estándar teórica de la diferencia (DEdif) entre dos análisis del mismo material en diferentes días, está relacionada con la desviación estándar usual (DEU) del procedimiento por la siguiente fórmula: SD dif = 2(USD) 2 = 1.4 USD

Ec. 21-2

El LCS representa entonces, el 95% de los límites de confianza (ó ± 2 DEdif) y definen la magnitud de la variabilidad inherente al método: LCS = Valor promedio ± 2 DEdif = Valor promedio ±2.8 DEU

Ec. 21-3

Como una aproximación, el límite de cambio significativo es tres veces la desviación estándar usual (Tabla 21-3). Valores mayores que el cambio del límite significativo podrían representar una alteración real en el estado del paciente. Por ejemplo, si la desviación estándar usual para colesterol es de 50 mg/L, el cambio del límite significativo es 2.8 veces 50, o sea 140 mg/L. Una variación de 2000 o 2200 mg/L, excedería el LCS y representaría un cambio real en el estado del paciente. Un cambio de 2000 a 1900 mg/L, no excedería el LCS y podría ser el resultado de la imprecisión del método. Para facilitar que la toma de decisiones por parte del médico sea acertada, es necesario mantener unos niveles consistentes de precisión de mes a mes y de año en año.

Control de Calidad (Proceso de Control) y DetecciÓn de Errores 805

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Una vez que han establecido los criterios de desempeño, se debe implementar un sistema de control de los procesos, que permita vigilar constantemente el ensayo (incluyendo las fases preanalíticas y postanalíticas), para asegurar que se cumplan los objetivos de funcionamiento, o tomar las medidas necesarias para alcanzarlos. Es importante reconocer el papel del personal del laboratorio, como el corazón del proceso de control de calidad. Niveles de responsabilidad en el proceso de control. El proceso de control, que nosotros llamamos control de calidad (CC) está diseñado para detectar el error en los sistemas analíticos. Existen al menos tres niveles en este proceso, cada uno es responsabilidad de diferentes personas. Para que el proceso de control sea más efectivo, es esencial tener una activa comunicación entre los individuos de los diferentes niveles. El primer nivel, es responsabilidad del equipo de técnicos y de los supervisores. El proceso de control en este nivel, incluye los análisis diarios de los especímenes de control discutido en esta sección y la revisión de los resultados y de los reportes de los pacientes. El técnico es responsable de efectuar análisis de especímenes de control en intervalos apropiados, y determinar que no existen errores sistemáticos aparentes en ninguna de las series realizadas. Ambos, el técnico y el supervisor son responsables de revisar los datos de los pacientes para garantizar que no existe un error aleatorio. El segundo nivel de control de la calidad asegura que durante un período relativamente corto de semanas a meses, únicamente se produzca un sesgo mínimo en el sistema. La responsabilidad del control aquí está usualmente compartida por el supervisor y el director de laboratorio, aunque los técnicos con frecuencia contribuyen grandemente. El proceso de control en este nivel, requiere la revisión de los datos de control de calidad y de los ensayos de aptitud que se han acumulado durante ese período de tiempo. El tercer nivel de los procesos de control asegura que los sistemas analíticos son tan precisos y exactos como sea posible. Esta responsabilidad recae sobre el director de laboratorio o el asesor técnico. El control de este proceso requiere: la revisión de los resultados de los ensayos de aptitud, el conocimiento de los niveles de precisión y exactitud alcanzables por otros laboratorios, y cuando sea aplicable la utilización de estándares para exactitud para verificar o corregir de errores. La revisión de control de calidad en este nivel debe hacerse durante un período largo de tiempo, de meses a años. La discusión de los ensayos de aptitud se encuentra en una sección posterior. El control de calidad del sistema analítico total, desde la toma de muestras hasta la impresión del reporte del paciente, requiere mediciones de control adicionales, que evalúan en muchos casos, el cumplimiento de la reglamentación oficial sobre cada uno de los pasos del proceso, los cuales se revisan en el Capítulo 2. Un factor importante que pocas veces es formalmente reconocido, son las quejas de los médicos sobre los problemas percibidos, que son ocasionados con frecuencia por deficiencias reales de una parte del sistema analítico. Estos errores pueden no ser conocidos por el laboratorio, hasta que son revelados mediante la investigación de una queja por el personal del laboratorio. Dar seguimiento y solucionar las quejas de los médicos, es entonces un factor muy importante, que ayuda al control de calidad sobre todo el sistema analítico. Análisis de los especímenes de control de calidad: Toma de decisiones diaria. 806

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La preparación y análisis diarios de las “mezclas” de control de calidad es una responsabilidad rutinaria del técnico, quien las procesa como controles “conocidos”, simultáneamente con las muestras de los pacientes. Los valores son “conocidos” porque se han realizado ensayos para determinar los niveles reales de cada constituyente. El laboratorio puede estimar estos valores diana de las muestras de control mediante: análisis repetidos, a través de la utilización los rangos de valores asignados por los fabricantes, o de forma ideal, determinarlos por métodos definitivos o de referencia (ver más adelante, pág. 399). La frecuencia de los análisis de los materiales para control de la calidad se establece para cada método por cada laboratorio. La CLIA’88 recomienda analizar, por lo menos, 2 controles de diferentes valores para cada serie (definida ésta sólo hasta 24 horas de operación estable). La mayoría de los laboratorios utiliza dos tipos de “mezclas”, uno normal y otra anormal. La primera contiene sustancias a analizar en concentraciones dentro del intervalo de referencia no patológico, mientras que una “mezcla” anormal contiene los compuestos analizados en concentraciones por fuera del mismo. Algunos laboratorios utilizan hasta tres “mezclas” - anormal bajo, normal y anormal alto-especialmente cuando se toman decisiones clínicas en cada nivel. La CLIA le permite a cada laboratorio fijar sus propios protocolos para el control de las pruebas de química, siempre y cuando se procesen al menos dos muestras de control de diferentes concentraciones cada 24 horas. Algunos estados exigen tres “mezclas” para algunas pruebas. Para el análisis de gases arteriales, la CLIA requiere como regla especial mínima, procesar una muestra de CC cada 8 horas de trabajo y el uso de una combinación de muestras de CC y calibradores, la cual incluya todos los días especímenes de concentraciones bajas y altas. CLIA´88 también exige el uso de un calibrador o un control cada vez que se procese la muestra de un paciente, a menos que el instrumento de gases sea calibrado cada 30 minutos (§493.1243). Normalmente el fabricante de un sistema analítico recomienda la frecuencia de análisis que debería ser usada como base en la reglamentación del sistema de control de calidad del laboratorio. El personal que realiza las pruebas tiene que revisar cada uno de los valores de control de calidad, para poder tomar una decisión sobre la validez de los resultados del paciente. Generalmente, si las muestras de control de calidad están dentro del rango aceptable, se asumirá que los datos de los pacientes obtenidos en la misma serie son válidos y se pueden “aceptar”. Al contrario, si los resultados para esta “mezcla” de control de calidad son inaceptables, la serie se rechazará (ver pág. 391). La decisión de aceptar o rechazar la serie analítica debe ser documentada con la anotación “aceptada o “rechazada”, el nombre del analista (o número de código) y la fecha, en el registro de trabajo diario, en un cuaderno separado, en un registro de datos, o bien en el sistema de información del laboratorio, SIL (ver capítulo 18). Usualmente, el técnico es responsable del proceso de verificación y aceptación de datos en el SIL. Los ensayos diarios del sistema básico de control de calidad, tienen mayor utilidad para detectar errores sistemáticos o un incremento de la imprecisión. También se pueden utilizar para detectar un incremento de la imprecisión. Sin embargo, los errores al azar, que ocurren de forma impredecible, generalmente no son detectados por el sistema de control de la calidad. Estos son detectados únicamente, mediante la revisión de los problemas reportados y de los resultados de los pacientes (ver págs. 394 – 396). Procedimiento para el control de calidad. 807

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Cómo elegir una “mezcla” de control de calidad. El material para control de calidad debe tener una matriz que sea casi igual a la de las muestras que se van a procesar. Esto significa, que si la serie incluye líquido cefalorraquídeo, suero y orina, los controles deben estar constituidos por estos elementos. Debido a que el material para control de la calidad, se analizan simultáneamente con cada serie de muestras de pacientes, cada año se necesitan grandes volúmenes de material. Actualmente, el laboratorio puede obtenerlo en suficiente cantidad de varias fuentes: (1) mezcla comercial liofilizada; (2) “mezclas” líquidas comerciales estabilizadas; (3) mezclas de muestras de pacientes congeladas. El suero del paciente es usado con mayor frecuencia que el plasma, por que es más fácil de conseguir y probablemente incluye menos material precipitado. Los líquidos o “mezclas” congeladas y clarificadas (con materiales que reducen la turbidez), muestran desviaciones estándar más pequeñas que las liofilizadas, en parte porque no involucran los errores inherentes a los procesos de liofilización. Sin embargo, estas “mezclas” líquidas experimentan mayores errores de inestabilidad, asociados con el transporte de los lotes a los clientes. La Tabla 21-4 presenta algunas características de las tres fuentes de material de control de calidad. Es importante seleccionar una “mezcla” que tenga una matriz que interfiera lo menos posible con los métodos utilizados en el laboratorio, debido a que algunas características como la turbiedad o ciertos constituyentes químicos, pueden inutilizarlo. Es importante hacer notar, que el material de control preparado en el laboratorio con muestras de los pacientes (suero, plasma, orina, y LCR), puede estar contaminado con microorganismos peligrosos y por lo tanto es esencial analizar los especímenes de cada lote y la “mezcla” final, para descartar su presencia. Las siguientes recomendaciones se aplican para todas las muestras utilizadas en la preparación de “mezclas” para control de calidad. Primero, todo el material humano debe ser analizado para descartar la presencia del virus de inmunodeficiencia humano y del virus de Hepatitis B. Ninguna “mezcla” debe ser usada, si existe evidencia de la presencia de cualquiera de ellos. Segundo, todos los materiales de control necesitan espacio en refrigeración o en el congelación para el almacenamiento del material para el consumo de 1 a 2 años. Alternativamente, los distribuidores comerciales pueden suministrar cantidades de un mismo lote en forma mensual o trimestral, durante 1 o 2 años. Esto le permite al laboratorio obtener una estabilidad a largo plazo en los procesos de control de la calidad, aunque de todos modos debe considerarse, la posibilidad de variación de un envío a otro, dentro del mismo lote. Algunos grupos de profesionales y fabricantes ofrecen participación en programas regionales de control de la calidad, en los cuales los laboratorios utilizan el mismo lote de suero control. Esto ofrece ventajas tanto en costos como científicas. La comparación entre laboratorios puede ayudar a pronosticar cómo va a funcionar el sistema analítico en los ensayos de aptitud. Esta comparación es más valiosa cuando la exactitud de la “mezcla” de control de calidad está establecida por métodos de referencia o métodos definitivos.refs(378)

Consideraciones preliminares en la definición de los límites para las “mezclas” de control de calidad. A menos que el valor verdadero de una “mezcla” esté establecido por métodos 808

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definitivos o de referencia, los valores asignados son sólo promedios de mediciones repetidas. El promedio transitorio o el promedio final de los valores diana de la mezcla para control de la calidad son las concentraciones estimadas para cada compuesto analizado dentro de la mezcla. Cada laboratorio usualmente establece sus propios valores diana promedio, para cada análisis, ejecutando los procedimientos de laboratorio en cada material de control. CLIA’88, permite que los fabricantes de las “mezclas” establezcan los valores diana, si el laboratorio confirma que éstos son aplicables a sus sistemas de análisis. Los laboratorios deben resolver un dilema, al considerar los límites diana que resultan de las nuevas reglas de la CLIA. Por un lado, existe la necesidad de optimizar la calibración del sistema analítico de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero por el otro, se presenta la necesidad de cumplir con los requerimientos de los ensayos de aptitud. La Administración Financiera para el Cuidado de la Salud permite a cada proveedor de pruebas de control externo, determinar cómo establece los valores diana que serán utilizados para juzgar si es aceptable el desempeño del laboratorio. Si el valor diana es calculado a partir de las medias de los grupos semejantes para cada sistema analítico, es mejor establecer los valores diana del sistema de CC del laboratorio, utilizando las recomendaciones del fabricante para calibración y para CC. Sin embargo, si los valores diana para los ensayos de aptitud son establecidos mediante el cálculo del promedio de todos los participantes o por la determinación del valor verdadero por métodos definitivos, podrían aparecer problemas cuando se optimizan los ensayos de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes y se presenta un sesgo como resultado de ellas. Parte del problema con el establecimiento de un programa de control de la calidad, utilizando las recomendaciones de los fabricantes, es el efecto que la liofilización produce (por cambios de matriz) en varios constituyentes, causando interferencias específicas del método o sesgos (por ejemplo como resultado de la turbiedad de esos especímenes). El dilema, por lo tanto, es que si el laboratorio cumple los requerimientos de CLIA’88 de seguir las instrucciones del fabricante, pueden tener fallas en los ensayos de aptitud. Sin embargo, un laboratorio puede modificar las instrucciones del fabricante, mediante las reglas de CLIA’88, si el laboratorio tiene datos que validen cualquier cambio. Cuando se establecen nuevos valores diana para un nuevo lote de material de control de calidad, es importante asegurarse de que durante el período de recolección de datos, los sistemas analíticos se están comportando de acuerdo con las especificaciones normales. El nuevo lote de material de control, debe ser probado paralelamente con el lote en uso. Si los datos analíticos del material de control de calidad en uso, indican una ejecución satisfactoria de los métodos, se puede asumir, que los datos para el nuevo lote son válidos. Cuando se establece un sistema de CC por primera vez, la presente metodología se acepta como válida si el método cumple sus especificaciones de desempeño. La selección del método analítico (o sistema analítico) por parte del laboratorio está basada en la experiencia con la utilidad médica, los límite de cambio significativos, el control externo de la calidad y las comparaciones de exactitud, y el desempeño del control de la calidad. Existen básicamente tres vías que pueden ser usadas para establecer los límites de los valores que son aceptables para una mezcla de control. La primera es la utilización del error clínicamente aceptable, la segunda, más usual, es calcular el valor diana y la desviación estándar para el método (DE) y utilizar un número definido de desviaciones estándares para establecer el rango. La tercera técnica es emplear el método de las curvas de poder que es el procedimiento más exacto 809

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estadísticamente. En las siguientes páginas se describirán estas tres alternativas.

Un método simple para establecer los valores diana promedio temporales de las “mezclas” de control de la calidad. 1. Adquirir material de CC para un 1 año de consumo como 2. Es preferible planear con 6 semanas de anticipación antes de cambiar los “mezclas” de control, para permitir a) El análisis comparativo entre los lotes de material de control viejo y nuevo (3 semanas), b) la reducción de datos, cálculos y evaluación de los límites de control (1 semana), y c) 2 semanas de seguridad ya que no toda planeación es perfecta. También es aconsejable conservar 20 o 30 frascos de cada “mezcla” vencida, para ser utilizados en la evaluación de los problemas resultantes de los cambios en el sistema. Identificar claramente la “mezcla” que se vence para asegurar que no es utilizada después de su fecha de vencimiento o que no es confundida con el lote actual de materiales de control. La CLIA prohíbe a los laboratorios el uso de reactivos, soluciones, controles, calibradores o medios de cultivo que se encuentren fuera de la fecha de vencimiento (§493.120[e] [1]). Cualquier excepción tiene que ser concedida específicamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA en inglés). 3. Reconstituir cuidadosamente el material liofilizado, siguiendo las indicaciones de la etiqueta. Si se mezcla muy rápido o muy fuerte se puede tener problemas con la solubilización del material liofilizado o desnaturalizar las proteínas constituyentes reduciendo la actividad de las enzimas. En cada frasco de material de control debe registrarse, después de su reconstitución, datos como la fecha, la hora y las iniciales del tecnológo que efectuó la operación. Si utiliza una “mezcla” líquida congelada, mezcle el especimen seis veces por inversión después de descongelar, debido a que las proteínas y otros componentes se concentran en el fondo del frasco durante la congelación. 4. Analizar diariamente y por duplicado dos frascos diferentes (20 frascos, 40 mediciones) durante 10 días. Un procedimiento alternativo es reconstituir un frasco por día y ejecutar las prueba por duplicado durante 20 días consecutivos (20 frascos, 40 mediciones). Ver la Tabla 21-3 para un ejemplo de este cálculo. 5. Determinar los valores diana temporales para cada constituyente calculando el promedio de esos 40 valores analíticos (n = 40). Este valor diana temporal es reemplazado después de dos meses con un valor diana final promedio (ver el siguiente texto). 6. Calcular la desviación estándar de los 40 valores. Note que esta desviación estándar calculada, es un híbrido entre la imprecisión entre series y la imprecisión total, porque las pruebas están realizadas en series individuales y durante diferentes días. Fijar el rango de los valores de control permitidos alrededor de la diana temporal promedio, utilizando la desviación estándar calculada recientemente, multiplicada por el límite de control del laboratorio, expresado como número de desviaciones estándar (como 2.5 o 3.0 2,5 ó 3,0). El número de desviaciones estándar para el rango de control puede ser establecido también de acuerdo con la medida de la DEU y el error permisible para cada prueba (ver el siguiente texto y la Tabla 21-3). Si el error permisible para glucosa a un nivel de 1200 mg/L es de ±60 mg/L, el rango de control debe ajustarse dentro de estos límites. En otras palabras, el rango completo de control del sistema analítico (para ±3 desviaciones estándar) debe ajustarse 810

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dentro de los ±60 mg/L permitidos. Pra este ejemplo, una desviación estándar puede ser tan grande como 20 mg/L. Alternativamente, si la desviación estándar usual es 15 mg/L, entonces ±4 desviaciones estándar pueden ajustarse dentro del rango permitido. La diana promedio temporal y los rangos de valores de control permisibles se pueden utilizar ahora para rutinas de control de calidad en el laboratorio durante los dos meses siguientes. 7. Después del segundo mes, se tienen tres valores para calcular el valor diana promedio final: el valor diana temporal y dos promedios mensuales (Tabla 21-3). Si el material de control es ligeramente inestable con el tiempo (por ejemplo, la actividad de la fosfatasa alcalina cambia a menudo durante el tiempo), el proceso utilizado para cambiar el valor objetivo, debe incluir evidencias de que el valor del material de control cambió mientras el sistema analítico permaneció constante. Tal evidencia puede ser probada adicionando materiales estables con valores conocidos (tales como un control diferente, excedentes de material de los ensayos de aptitud, o materiales de calibración adicionales). El proceso de decisión para cambiar el valor diana tiene que estar bien documentado. Es preferible evitar el empleo de material de control inestable. Cálculo de la desviación estándar usual. Cada método tiene una característica de variabilidad inherente llamada la desviación estándar usual. La DEU se calcula, a partir de una serie de tres a seis desviaciones estándar mensuales consecutivas, obtenidas cuando el sistema de análisis está supuestamente estabilizado. La DEU es un estimado válido de la variabilidad entre días de las mediciones individuales. La DEU puede ser utilizada eventualmente en lugar de la DE temporal, para establecer los límites de control diarios, alrededor del valor diana final promedio. La Tabla 21-3 muestra cómo puede ser utilizada la DEU para calcular el número permitido de desviaciones estándar de los controles, manteniendo la utilidad clínica del sistema analítico. El error clínicamente permisible se divide por la DEU para calcular el número de desviaciones estándares usuales existentes dicho error. Este cálculo asume que los sesgos no son significativos. Si los hubiera, se debe sustraer primero el valor de los sesgos del error total clínicamente aceptable y después dividir el resultado por la DEU. Este número calculado de desviaciones estándar deber ser igual o mayor que el número de las desviaciones estándares utilizadas para el rango de control del laboratorio. De otra modo la prueba estará persistentemente fuera de control, o su utilidad médica estará comprometida. La DEU también puede ser utilizada para establecer la significación estadística de la diferencia entre dos valores del mismo paciente. A esto último se le llama frecuentemente como límite de cambio significativo (ver pág. 387). Establecimiento de los límites de acción y control para cada nivel de la “mezcla” de control de calidad Los límites de resultados aceptables son utilizados para determinar los límites de acción del rango de control. Históricamente, un resultado de CC que excedía los límites establecidos era conocido como un valor fuera de control. Sin embargo, las regulaciones de la CLIA, ahora definen específicamente el término fuera de control, como una situación en la cual un sistema analítico no puede ser utilizado para reportar resultados de pacientes. De este modo, el término excediendo los límites de acción, es utilizado ahora, para designar la condición menos 811

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seria en la que el resultado de una rutina de análisis de CC excede los límites fijados. La respuesta documentada de un tecnólogo médico a un resultado de CC que excede los límites de acción (ver texto siguiente), no incluye dejar de utilizar el procedimiento. Esto sólo ocurre cuando el director del laboratorio declara formalmente que el sistema analítico está fuera de control y el laboratorio empieza un proceso formal correctivo para solucionar esta seria situación (ver texto siguiente). Un laboratorio estará mejor preparado, si señala las condiciones que definirán estas dos situaciones en su manual de laboratorio. Históricamente, los márgenes eran ±2 desviaciones estándar y cubrían el 95% de los valores de control esperados. Sin embargo, esto significa que se espera que el 5% de los resultados del material de control excedan los límites de acción, aún cuando el método está funcionando perfectamente. Un falso rechazo de una serie resultará en una repetición excesiva de muestras y necesitará elaborar la documentación requerida en esos casos por las regulaciones de la CLIA. Por eso, existen muchas sugerencias para usar otros límites diferentes a ±2 DE como límites de control. Muchos laboratorios utilizan normalmente 2,5 ó 3,0 desviaciones estándar para los límites aceptables en un intento de reducir el número de series falsamente rechazadas y la pérdida de tiempo en repeticiones innecesarias. Sin embargo, el uso de 2,5 ó 3,0 desviaciones estándar como límite de error, puede no detectar el error que es aceptable por los requerimientos médicos y por la CLIA.refs(379) De este modo, una segunda propuesta es establecer diariamente los márgenes de control de calidad, basados en las consideraciones anteriormente discutidas. El rango diana tiene que ser igual o menor que el error total permisible (ver pág. 384), el cual a su vez es igual a, o menor que el error clínicamente y legalmente aceptable por la CLIA. Los límites diana de control serán por lo tanto algunos múltiplos de la DEU o de las DE temporales que cumplan con estos requerimientos. El número de múltiples elegido se basará en la necesidad de detectar casos verdaderos de mediciones inexactas y minimizar falsos rechazos de series aceptables (ver el siguiente texto). Otra propuesta es la de establecer el rango permisible basado solamente en los criterios de utilidad clínicos. El rango se expresa como más o menos la ventana del error clínicamente permisible alrededor del valor diana. Este proceso no requiere que el laboratorio utilice ±2 ó más desviaciones estándar. La ventana de control es tan ancha como lo permite el uso médico. Una situación de “límite de acción” se presenta cuando el valor del ensayo del material de control excede los límites de error. Se debe determinar que esta propuesta no coloque al laboratorio en riesgo de falla en los ensayos de aptitud. Para todas estas propuestas, el rango de control final no tiene que ser tan grande como para que el sistema analítico deje de detectar verdaderos casos de falla del método.

Definición de los límites de control de la calidad mediante curvas de poder Entre las principales preguntas en control de la calidad están: “¿Qué tantas pruebas de control de la calidad son suficientes?” “¿Estoy seguro de detectar apropiadamente los pequeños errores?” y “¿Es mi detección de errores lo suficientemente sensible para señalar si el sistema analítico es apropiado para las necesidades clínicas?” Si un laboratorio ha establecido adecuadamente los límites de error permisibles para las necesidades médicas, la segunda pregunta es solamente de interés académico, ya que la búsqueda de los errores más pequeños es costosa y requiere de mucho tiempo. 812

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Una propuesta más científica para responder estas preguntas, utiliza curvas de poder para determinar cuántos controles deben ser ejecutados y qué reglas de control deben ser utilizadas. Las curvas de poder son gráficos del tamaño del error detectado por un sistema de control versus la probabilidad de detectar ese error por varias reglas de control. Las reglas de la curva de poder pueden calcular la probabilidad de rechazar falsamente una prueba válida, la probabilidad de rechazo verdadero (la detección de un error significativo en la serie), la probabilidad de detección del error, y el número promedio de observaciones de control requeridas para identificar un error dado.refs(380) refs(381) El diseño de reglas de control específicas para un laboratorio requiere de un proceso de cinco pasosref(382) que incluyen la determinación de: (1) la definición del error analítico total permisible, (2) la estimación de la desviación estándar actual de los métodos y los sesgos las concentraciones de decisiones clínicas, (3) la determinación del error sistemático y aleatorio que debe ser detectado por el sistema de control, (4) determinación del nivel de probabilidad usado para la detección del error (esto es ¿ se desea detectar un 90%, 95% o un 99% de errores?), y (5) trazado e inspección de las curvas de poder para determinar el número de especímenes de control que deben ser analizados por serie. La parte más difícil de estas evaluaciones es determinar qué cantidad de error es permisible. Westgard utilizó estas curvas de poder, para desarrollar una serie de guías de control específicas, popularmente llamadas las “reglas de Westgard”. Estas reglas son utilizadas para determinar si una ejecución analítica está fuera de control y se escriben de forma resumida así: (1) 12s, 12.5s, y 13s que significa que un valor de control excede dos, dos y medio o tres desviaciones estándar, (2) 22s significa que dos valores de control exceden dos desviaciones estándar y (3) R4s significa que el rango de dos especímenes de control excede cuatro desviaciones estándar. Para muchas situaciones analíticas la aplicación secuencial de 13S/22S/R4S permite que dos especímenes de control proporcionen suficiente información para detectar el error de una serie sencilla.ref(383) Estas reglas significan que la serie es rechazada (se exceden límites de acción), si ocurre algo como: (1) 13S si un valor de control difiere por más de tres desviaciones estándar del valor medio, (2) 22S si dos valores de control difieren en más de dos desviaciones estándar del valor medio, y (3) R4s si el margen entre dos controles en la misma ejecución excede una combinación de cuatro desviaciones estándar (esto es, un control >1.5 DE del promedio y el otro >-2.5 DE de promedio). Las dos primeras reglas van a detectar si hay demasiado sesgo, mientras que la última rechaza la ejecución debido a una imprecisión excesiva. Con el uso de estas reglas, los datos de la Fig. 21-1 muestran valores para un control que exceden los límites de acción en los días 10 (13S) y 20(13S). Note, que para el rechazo, el valor del control debe exceder el límite de control, y no sólo ser igual al mismo. Para muchas pruebas químicas, las curvas de poder permiten la detección costo-efectivo de errores totales significativos (basados en la utilidad clínica), cuando se utilizan dos controles y los límites se establecen en algún lugar entre 2.5 y 3.5 desviaciones estándar.ref(384) Por esta razón, se utiliza bastante el límite de 3 DEU como un límite de control generalizado.

Detección y Resolución de Problemas de la Calidad La decisión “fuera -de –control” 813

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Un sistema analítico está “fuera de control” cuando no se considera apropiada la validez de los resultados. Los sistemas analíticos groseramente “fuera de control” son normalmente impropios para propósitos médicos. Esta decisión es tomada por el director o por el supervisor técnico. Las condiciones y criterios para una decisión de “fuera de control” deben ser establecidos por cada laboratorio e incluyen los siguientes elementos mínimos: 1. Los valores de control exceden los límites de “fuera de control” predeterminados dentro de un período especificado. Los técnicos deben ser adiestrados a documentar sus respuestas a todo valor de control que exceda los límites establecidos. 2. Se determina que un método tienen un intervalo de referencia inapropiado: si este rango no se puede corregir inmediatamente, el método queda “fuera de control”. 3. Un método demuestra una imprecisión inaceptable, no linealidad o interferencias. Las interferencias se limitan generalmente a tipos de muestras o sustancias específicas. 4. Se observa un patrón de resultados de pacientes inapropiado con numerosas anormalidades. 5. El director del laboratorio, el director de sección o los supervisores técnicos declaran el método “fuera de control” por otras razones. Las técnicas para detectar y resolver situaciones de “fuera de control” se discuten a continuación. Detección de problemas de calidad Apoyo del ordenador. Los valores diana y límites para resultados aceptables que están establecidos para cada “mezcla” de control, son usados en la práctica diaria para detectar problemas analíticos. Un tecnólogo puede revisar un resultado de control para evaluar su aceptabilidad de diferentes formas. Puede comparar simplemente el resultado con el rango establecido. Esto limita la habilidad del técnico para emplear las reglas Westgard o para evaluar la tendencia de resultados previos. Están disponibles ahora reglas de selección más complejas como parte de algunos programas de computación en los instrumentos, o como parte de los sistemas de información de laboratorio (SIL) (ver capítulo 18). La ayuda del computador permite revisar en tiempo real el control de los resultados, detectar rápidamente los problemas de CC y documentar mejor los procesos de control de calidad. Gráficas de Levey-Jennings.refs(385) Los datos obtenidos de los análisis diarios de las “mezclas” de control de calidad, pueden ser graficados para darles una presentación visual. El análisis más común es la gráfica de Levey-Jennings. Se dibujan en el eje de las y las concentraciones esperadas de los compuestos analizados, el valor diana establecido y el número de desviaciones estándar deseadas y en el eje de las x los días del mes (normalmente 31) (Fig. 21-1). Se puede utilizar una pieza grande de papel especial para gráficas, para mostrar los datos de diferentes meses. De este modo, la información acumulada de los resultados de control de la calidad puede ser observada al mismo tiempo. Las gráficas de Levey-Jennings están disponibles normalmente en 814

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el SIL (ver capítulo 18). La Figura. 21-1 muestra un ejemplo de una gráfica de Levey-Jennings. La variación repentina en los valores de control (días 1-4 versus 5-7) de un valor promedio a otro nuevo promedio se denomina “desvío o cambio”. El incremento de la desviación del valor diana observado desde el día 8 hasta el día 10 se llama “tendencia”. Se observan cambios en la precisión del sistema analítico entre los días 21al 26, que es una mayor dispersión en los valores que lo observado en los días 13 y 19. Se consideró que el proceso era inaceptable por las razones documentadas al final de la Fig. 21-1. El día 32, el director del laboratorio volvió a evaluar el valor diana y concluyó que estaba muy alto. Se definió un valor más bajo y los resultados de CC para el mes siguiente fueron vigilados de cerca para evaluar este cambio. Las gráficas de Levey-Jennings deben ser analizadas rutinariamente por los técnicos y el personal de supervisión. Tanto las tendencias negativas o positivas, o los desvíos del valor diana representan sesgos que deben ser evaluados. Los gráficos de Levey-Jennings deben ser evaluados rutinariamente por los tecnólogos y el personal supervisor buscando tendencias o desvíos del valor diana que puedan indicar problemas en el sistema analítico. Normalmente una tendencia o un desvío se detecta entre los 6 y 10 días después de iniciada. Una tendencia o un desvío que se mantiene por este tiempo, indica con frecuencia un cambio permanente, no aleatorio. Utilización de los datos de los pacientes en la toma de decisiones Patrón de resultados de los pacientes. Los resultados de los análisis de las muestras de los pacientes caen dentro de intervalos de referencia establecidos para cada compuesto analizado.ref(386) De este modo, para una serie analítica de muestras de pacientes los resultados mantienen un patrón familiar: esto es, la mayoría de resultados están dentro del intervalo de referencia del paciente no enfermo y unos pocos resultados son anormales. La distribución de resultados patológicos, o sea, el porcentaje de resultados altos y bajos, variarán de una prueba en prueba y de un hospital a otro. Las desviaciones de este patrón de resultados deben alertar al personal que realiza las pruebas, sobre la posibilidad que un cambio en el desempeño del sistema pueda estar ocurriendo, que invalide resultados de los pacientes. Por ejemplo, una serie de resultados de pacientes para potasio, mayor de 5 debe indicar al técnico sobre un posible problema de sesgo (Tabla 21-5). El ejemplo en la Tabla 21-5 muestra un grupo típico de valores de potasio (paciente A) y una serie claramente anormal (paciente B). El técnico debe, por supuesto, evaluar circunstancias especiales. Por ejemplo una carga de trabajo que incluye un número más extenso que lo normal de muestras de pacientes de diálisis renal o sometidos a quimioterapias de cáncer, desviará anormalmente los patrones (que de otra manera serían típicos) de los resultados de las pruebas. La prueba delta. Otra prueba importante de control de calidad, es el patrón de resultados consecutivos para un paciente individual. Para la mayoría de los análisis, es improbable que una serie de dos a tres resultados consecutivos de un paciente muestren grandes diferencias, a menos que ocurra un cambio clínico suficientemente grande. Estas variaciones más allá de lo esperado entre dos muestras de un mismo individuo, se denominan cambios delta y son establecidos por el laboratorio para detectar problemas de confusión de especímenes u otro tipo de errores 815

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(ver pág. 80). Cuando se producen, se tiene que determinar, si la variación es un cambio real del estado del paciente o si existen problemas en el laboratorio que no son identificados por el control de calidad. Acciones para volver a tener un sistema analítico bajo control. Cuando se encuentran problemas analíticos, lo mejor es tener un plan de acción que se ejecute en secuencias hasta que se resuelva el problema. CLIA’88 exige la documentación del problema, de su investigación, la resolución y cualquier dato que indique que está resuelto. Normalmente, esta documentación se mantiene aparte, en un cuaderno para documentación de “límites de acción” o “fuera de control” que incluya una lista de recomendaciones que deben ser seguidas en secuencia para identificar un problema. Después de que se ha seguido cada paso del plan de acción, se deben analizar las “mezclas” de rutina para CC; si los resultados están ahora entre los límites, se supone que el problema ha sido resuelto y se pueden liberar los resultados de los pacientes. Si los resultados de CC aún no son satisfactorios, se deben seguir las siguientes recomendaciones: 1. Repetir los ensayos de los controles, utilizando alícuotas frescas. 2. Repetir los ensayos de las muestras de control utilizando mezclas provenientes de un grupo de controles diferente o recién reconstituido, ya que si algún control está mal manipulado, puede haber un cambio en las concentraciones analizadas debido al deterioro de las enzimas o a evaporación. 3. Buscar problemas obvios: coágulos, nivel de los reactivos, fallas mecánicas. 4. Calibrar nuevamente los instrumentos para el compuesto analizado que está “fuera de control” y después ensayar otra vez todos los controles. 5. Colocar un nuevo frasco o un número de lote diferente para uno o todos los reactivos. 6. Calibrar nuevamente y ensayar todos los controles. Ejecutar el mantenimiento periódico, calibrar otra vez y volver a ensayar todos los controles. Si el seguimiento de estas recomendaciones produce datos de CC aceptables, se pueden liberar los resultados de los pacientes, si y sólo si, por lo menos tres (o la serie completa si es menor) muestras de pacientes tomadas de la última corrida, son ensayadas nuevamente y las diferencias entre los resultados previos y los nuevos están dentro de las especificaciones de desempeño para la precisión (ver pág. 391). Este requerimiento está establecido por la CLIA, que declara (§ 493.1219[b]) que: “todos los resultados de las pruebas de los pacientes obtenidos en la serie de pruebas no aceptable, o desde la última serie aceptada, tienen que ser evaluados para determinar si los resultados de los pacientes han sido adversamente afectados y el laboratorio tiene que tomar las acciones correctivas necesarias para asegurar un reporte exacto y confiable de los mismos.” Los tecnólogos deben estar estimulados para ejecutar por si mismos todos las recomendaciones mencionadas antes de solicitar ayuda de un supervisor. Sin embargo, en las áreas críticas del laboratorio deben fijarse límites de tiempo de interrupción para los instrumentos. En una sección de urgencias por ejemplo, sólo deben demorar resolviendo el problema alrededor de 15 a 20 minutos antes de notificar al supervisor. Ejemplo: Al principio del día el método para potasio produjo resultados para el control elevados: por encima de 5 desviaciones estándar. El problema coincidió con el 816

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cambio de reactivos, por lo tanto éstos se cambiaron. Se volvieron a calibrar los equipos y los controles se repitieron, encontrándose nuevamente bajo control. Tres muestras de pacientes de la última serie se probaron otra vez para averiguar si el problema había afectado los valores reportados. Los resultados de potasio obtenidos en la primera serie fueron 3,9, 4,6, y 5,3 mmol/L y cuando se repitieron 4,1, 4,5 y 5,3 mmol/L. El requerimiento de desempeño de precisión para el método de potasio es 1 DE=0,11 mmol/L. Los resultados de potasio de los pacientes cambiaron 0.5%), pueden también interferir con el análisis. Además, pueden obtenerse concentraciones de hemoglobina A1 falsamente aumentadas en pacientes con uremiaref(1150) y en pacientes con 1313

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alcoholismo.ref(1151) La separación electroforética de hemoglobina combinada A1, se basa en la habilidad del amino N-terminal de la hemoglobina no glicada para interactuar con los grupos negativamente cargados presentes en el medio de soporte. Una vez separadas por electroforesis, las bandas de hemoglobina puede ser coloreadas y cuantificadas por medio de un densitómetro. La presencia de variantes de hemoglobina puede interferir con los resultados de la prueba. Además, las hemoglobinas carbamiladas y acetiladas son medidas como la fracción de hemoglobina A1c.ref(1152) Los métodos que pueden usarse para medir hemoglobina A1c, incluyen variaciones de los procedimientos de cromatografía por intercambio iónico y por electroforesis y los métodos inmunológicos.ref(1153) Los métodos electroforéticos desarrollados para la separación de la hemoglobina A1c, incluyen el enfoque isoeléctrico en gel de poliacrilamida y la electroforesis en gel de agar a pH 6.5. El electroenfoque proporciona una separación distinta de la hemoglobina A1c de la hemoglobina A0 pero el método requiere para la cuantificación, de un técnico habilidoso y de un densitómetro de alta calidad. La separación electroforética en gel de agar produce un separación más amplia de la hemoglobina A1c de las otras especies de hemoglobina, y la cuantificación es mucho más fácil.ref(1154) La aplicación de la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (Tabla 32-6, método 3) para la separación de hemoglobina glicada también utiliza resina de intercambio catiónico como la fase estacionaria. Las varias fracciones de hemoglobina se separan a medida que los amortiguadores de fuerza iónica creciente pasan a través de la columna. Las concentraciones de las fracciones de hemoglobina separadas son medidas espectrofotométricamente a 415 nm a medida que dejan la columna. Los métodos por HPLC reconocen las variantes de hemoglobina tales como las hemoglobinas S, C, D y G. Como resultado, deben llevarse a cabo correcciones matemáticas antes de la interpretación para explicar estas variantes de hemoglobina.ref(1155) Los métodos inmunológicos (Tabla 32-6, método 4) para medida de la hemoglobina A1c, incluyen los procedimientos de radioinmunoensayo,ref(1156) el inmunoensayo enzimáticoref(1157) y los procedimientos de inmunoaglutinación latex. ref(1158) Se han desarrollado ambos anticuerpos monoclonales que reconocen la movilidad del azúcar y cualquier número de aminoácidos en el amino N-terminal de la cadena beta100. La medida de la hemoglobina glicada total puede lograrse por el uso de cromatografía de afinidad con ácido fenilborónico ligado a una resina inerte. El ácido borónico forma una unión covalente débil con los grupos hidroxilos de los azúcares. Las hemoglobinas glicadas fallan en ligarse a la resina y eluyen primero. La hemoglobina glicada ligada es luego eluida por la aplicación de un amortiguadores que contiene un azúcar competitivo, como el sorbitol, el cual compite con la hemoglobina glicada ligada por los sitios de unión del ácido borónico. Las hemoglobinas glicadas que se unen a la resina incluyen no solamente la hemoglobina A1c sino también otras formas de hemoglobina glicada A0. El método es simple de llevar a cabo y es específico para la hemoglobina glicada. Los métodos colorimétricos (Tabla 32-6, método 6) para la hemoglobina A1c están basados en el hallazgo de que cuando la hemoglobina A1c está sujeta a hidrólisis ácida 1314

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moderada, se libera 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) y puede combinarse con el ácido tiobarbitúrico para formar un producto coloreado.ref(1159) Este método es específico para los azúcares ligados a cetamina; de esta manera la hemoglobina F y las variantes de hemoglobina no interfieren. Los inconvenientes del procedimiento incluyen valores falsamente aumentados de la formación de 5-HMF como resultado de la condensación de glucosa (en alta concentraciones) con la hemoglobina.ref(1160) Ejemplar. Se prefieren los ejemplares anticoagulados con EDTA. La mayor parte de los métodos requieren hemolisado preparado usando un agente lisante de célula. Los ejemplares de sangre total pueden ser almacenados hasta 5 días a 2o C y 6o C. Intervalos de referencia. Los rangos de referencia para la hemoglobina glicada son dependientes de la especie de hemoglobina que es medida y del tipo de procedimiento que es usado. La Tabla 32-8 proporciona rangos de referencia representativa para varios tipos de métodos diferentes. Insulina y péptido C Steven C. Kazmierczak

Principios de análisis y uso corriente. El inmunoensayo de unión competitiva empleando 125I marcado (radioinmunoensayo, RIA) es todavía la técnica más ampliamente usada para medir insulina (Tabla 32-8, método 1). La determinación de insulina en los diabéticos tratados con insulina presenta problemas especiales debido a las interferencias por insulina exógena y anticuerpos para insulina circulante.ref(1161) La insulina, por unión no proteica o libre, es considerada la forma biológicamente activa de la molécula. Así, para el ensayo de insulina total la insulina ligada debe ser disociada de los anticuerpos antes del análisis. La disociación de la insulina de los anticuerpos de insulina exógena puede ser llevada a cabo usando precipitación ácida. La separación de la insulina ligada y la libre marcada puede ser realizada por una variedad de técnicas incluyendo la precipitación usando un segundo anticuerpo, carbón envuelto en dextrano, y polietilenglicol.ref(1162) Se han desarrollado inmunoensayos no isotópicos, de unión competitiva para la insulina, algunos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos inmunoensayos competitivos emplean marcadores de enzimas con medidas fluorométricas o luminométricas de la actividad enzimática así como marcadores fluorescentes para el uso de los inmunoensayos fluorescentes.refs(1163) Los reactivos usados en los inmunoensayos no isotópicos son típicamente estables durante períodos de tiempo más largos cuando se comparan con las técnicas RIA.ref(1164) Un ensayo de dos tipos, inmuenzimométrico de fase sólida desarrollado por TOSOH Medics Corp., Foster City, California (Tabla 32-8, método 2), emplea anticuerpo monoclonal de ratón que ha sido inmovilizado en un molde magnético en fase sólida. El segundo, un anticuerpo monoclonal de ratón marcado enzimáticamente crea un sandwich anticuerpo/insulina/anticuerpo marcado. La velocidad de la fluorescencia producida por la hidrólisis del sustrato es directamente proporcional a la concentración de insulina dentro de la 1315

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muestra. La tecnología de inmunoanálisis enzimático de micropartícula (IAEM) de los Laboratorios Abbot (Tabla 32-8, método 3) emplea anticuerpos monoclonales anti-insulina cubiertos de micropartículas. Una alícuota de la mezcla de reacción que contiene insulina ligada a las micropartículas cubiertas de anti-insulina es transferida a la matriz de fibra de vidrio. La matriz es lavada para remover los materiales sin unir, y el segundo anticuerpo anti-insulina conjugado con la fosfatasa alcalina se suspende en la matriz de fibra de vidrio donde se fija al complejo antígeno-anticuerpo. Después de un paso de lavado, el sustrato, el 4-metil-umbiferil fosfato, se agrega a la matriz, y la fluorescencia producida está directamente relacionada con las concentraciones de insulina dentro del ejemplar. La determinación del péptido fijador (péptido C) de proinsulina proporciona una forma de reserva de insulina exógena secretoria en pacientes con diabetes mellitus. La insulina y el péptido C son secretados por el páncreas a través del hígado. Mientras que el hígado extrae una cantidad considerable y variable de insulina de la sangre,ref(1165) casi todo el péptido C emerge del hígado para entrar a la circulación sistémica. Como resultado, el péptico-C no mide la insulina exógena y no está sujeto a interferencia significativa de los anticuerpos insulina vistos en pacientes que reciben terapia por insulina.ref(1166) RIA es la técnica de inmunoensayo más común en uso para la determinación del péptido C. Todavía se plantean preguntas sobre la estandarización de los ensayos de péptido ref(1167) C. Además, una reactividad cruzada menor del antisuero de péptido C con la proinsulina humana puede inclusive interferir significativamente en los inmunoensayos del péptido C si la secreción de proinsulina persiste en un paciente diabético que tiene anticuerpos para insulina circulantes inducidos por terapia con insulina.refs(1168) Especimen El suero es un ejemplar aceptable para todos los ensayos. El plasma (EDTA y heparina) puede ser usado con algunos procedimientos de inmunoensayo. La presencia de una enzima que degrada insulina en los eritrocitos puede resultar en valores de insulina falsamente disminuidos en los ejemplares hemolisados. ref(1169) Los resultados falsamente aumentados causados por anticuerpos de heterofilia o por factores reumatoideos han sido observados en los inmunoensayos que utilizan una técnica sandwich.ref(1170) El suero para las determinaciones de insulina deben ser separados de los glóbulos rojos dentro de las 5 horas después de ser recogidos.ref(1171) Una vez separado, la insulina es estable hasta 12 horas a temperatura ambiente, por 1 semana a 4o C y por 1 mes a –10o C. Intervalos de referencia. Los rangos de referencia para la insulina del suero son dependientes de factores como el tipo de ensayo usado para su medida y por el estado clínico del paciente en relación a la concentración de glucosa en sangre. Las concentraciones de insulina en pacientes en ayuno son típicamente menores que 25 U/mL (1042 pg/mL, 0.17 pmol/mL). Agradecimientos Los editores desean agradecer a los anteriores contribuidores de los métodos: Nancy Gau, ácido acetoacético y ácido beta-hidroxibutírico; Mary Ellen King, hemoglobina glicada; y Michael D.D. McNeeley, insulina y péptido C. 1316

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Tablas Tabla 32-1. Clasificación del NIH de la diabetes y de otras categorías de la intolerancia a la glucosa. 1321

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Descripción

Diabetes mellitus Tipo I (diabetes mellitus insulino dependiente[DMID])

Deficiencia de insulina (insulinopenia) Dependencia de insulina inyectada Generalmente ocurre antes de los 40 años Propenso a cetoacidosis Propenso a complicaciones diabéticas: Cataratas (6 veces mayor que en un no diabético) Neuropatía (todos muestran algunos síntomas; 10% serios) Nefropatía (40%-50% desarrollan falla renal) Angiopatía (alto riesgo para ataque y paro cardíaco)

Diabetes mellitus Tipo II (diabetes mellitus no insulino dependiente DMNID])

Niveles variables de insulina No dependiente de insulina exógena para control de hiperglucemia; a menudo individuos obesos Generalmente ocurre después de los 40 años No propensos a cetoacidosis No propensos a complicaciones diabéticas

Diabetes mellitus secundaria

Diabetes causada por varias condiciones secundarias tales como enfermedad pancreática, acromegalia, síndrome de Cushing, feocromocitoma, glucagonoma, somatostatinoma, aldosteronismo primario, enfermedad severa del hígado, y ciertas drogas, productos químicos y hormonas.

Tolerancia disminuida de la glucosa

Personas con niveles de glucosa plasmática intermedios entre el límite superior de los niveles normales y definitivamente diabéticos (1100-1400 mg/L) y personas con una prueba de tolerancia anormal de la glucosa pero sin evidente hiperglucemia

Diabetes mellitus general

Gestacional diabetes que tiene lugar durante el embarazo

Clases estadísticas de riesgos; anormalidad previa de tolerancia a la glucosa

Hiperglucemia transitoria previa que ocurre ya sea espontáneamente o en respuesta a estímulos específicos pero con una prueba que se de presentan normales

Anormalidad potencial de tolerancia a la glucosa

Personas que no exhiben indicaciones de diabetes pero que se encuentran en

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riesgo sustancialmente potencial para contraer diabetes en el futuro; incluye gemelos monozigóticos de un diabético DMNID; persona que tiene padres, hermanos o descendiente que son diabéticos DMNID; individuos obesos; miembros de ciertos gupos raciales o étnicos con alta prevalencia de diabetes

Tabla 32-2. Comparación de cuatro criterios para evaluación de la prueba de tolerancia oral de glucosa.

Tiempo de extracción sanguínea

Niveles de glucosa plasmática (mg/L) Sistema de punteo Sistema de Wilkerson Fajans-Conn OMS UGDP

Ayuno 1 1½ 2

>1290 (1)* >1940(1/2)* – >1390 (1/2)*

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>1290 (1/2)*

– >1840 >1640 >1390 >2000 (diabetes) –

>1390 Suma – Suma – 1400-200 (UGT) Suma –

Suma

UGDP, Programa Universitario del Grupo de Diabetes; OMS, Organización Mundial de la Salud. * Puntos dados en el sistema de Punto Wilkerson.

Tabla 32-3. Componentes de la hemoglobina glucosilada en diabéticos y en no-diabéticos. Fracción de hemoglobina glucosilada A1a1 (lábil + estable) A1a2 (lábil ( estable) A1b (lábil + estable) A1c (por cromatografía líquida de alta eficacia) Lábil + estable Lábil Estable

1323

Porcentaje de hemoglobina total No-diabéticos Diabéticos 0.19 + 0.02 0.19 + 0.4 0.48 + 0.15

0.20 + 0.03 0.22 + 0.04 0.67 + 0.3

3.3 + 0.3 3.2 96.8

7.5 + 2.0 6.9 93.1

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Tabla 32-4. Métodos para el análisis de cetonas. Método: Compuesto : Tipo de análisis: Principio: Uso: Comentarios:

Método: Compuesto : Tipo de análisis: Principio:

1.

Colorimétrico Acetoacetato,acetona Semicuantitativo Na2Fe(CN)5NO + Acetona/acetoacetato ––– color púrpura Más común; Sensibilidad para el acetoacetato 5 veces mayor que para la acetona 2.

Enzimático AcBc, -HB Cuantitativo NADH + H+ + AcAc PH 7.0

–––––––––––––––– -hidroxibutirato deshidrogenasa

–––––––––––––––– pH 8.5-9.5

Uso: Comentarios:

Método: Compuesto : Tipo de análisis: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Compuesto : Tipo de análisis: Principio: Uso: Comentarios:

-HB + NAD+ Raro; procedimiento no útil para análisis rápido Precisión excelente; fácil de automatización; rápido, preciso, Volumen pequeño de la muestra 3. Cromatografía gaseosa Acetona (AcAc, -HB por cálculo) Cuantitativo La acetona se detecta por detector de ionización de llama; AcAc es convertido a acetona por calor Raro; no útil como análisis rápido Acetoacetato cuantificado por sustracción de la acetona no calentada a partir de la acetona calentada. 4. Electroforesis capilar -HB Cuantitativo Separación electroforética de -HB Raro Equipo especializado

AcAc, Acetoacetato; -HB, Acido beta-hidroxibutirato

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Tabla 32-5. Métodos para análisis de glucosa. Método: Principio de análisis:

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Método: Principio de análisis:

Uso: Comentarios: Método: Principio de análisis:

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Método: Principio de análisis:

Uso: Comentarios:

Método: Principio de análisis:

Uso: Comentarios:

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1. Benedict (reducción de cobre) Basado en la habilidad de la glucosa para reducir el ion cúprico (Cu++) a ion cuproso (Cu+): Cu++ + Glucosa ––– Cu2O (rojo) + CuOH (amarillo) Frecuentemente usado como prueba semicuantitativa para azúcares reductores totales en la orina Usado con procedimiento más específico para glucosa a fin de diferenciar glucosuria a partir de otros azúcares en la orina. 2. Glucosa oxidasa (consumo de oxígeno) Glucosa + O2 ––– Ácido glucónico + H2O2 El H2O2 es consumido en reacciones colaterales El consumo de O2 se mide polarográficamente Utilizado frecuentemente Automatizado exacto y preciso 3. Glucosa oxidasa acoplada a reacción enzimática ("Trinder") Glucosa + O2 ––– Acido glucónico + H2O2 H2O2 + colorante reducido––– colorante oxidado (coloreado) + H2O Automatizado frecuentemente usado en suero y orina Reacción indicadora sujeta a interferencia; de otro modo buena exactitud y precisión 4. Hexocinasa acoplada a reacción enzimática Glucosa + ATP ––– Glucosa-6-fosfato + ADP Glucosa-6-P + NADP+ ––– 6-fosfogluconato + NADPH + H+ Aumento en la absorbancia a 340nm directamente relacionado con la concentración de glucosa Método en uso más común; muy buena exactitud y precisión 5. Glucosa deshidrogenasa Glucosa + NAD+ ––– D-Gluconolactona + NADH + H+ El aumento en la absorbancia a 340 nm está directamente relacionado con las concentraciones de glucosa Raramente usado Puede ser automatizado Buena exactitud y precisión

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Tabla 32-6. Métodos de análisis de hemoglobina glicada (GHb).

Método 1.Minicolumna (microcolumna)

Base para la separación de Hb

Bases de análisis

Tipo de Hb glicada medida

Cromatografía de intercambio iónico

Absorbancia espectral de componentes de Hb separados

A1* o A1c

2. Electroforesis Diferencia de carga

Absorbancia espectral de componentes de Hb separados

A1* o A1c; S1, C1, S1, C1c pueden ser también medidos

3. HPLC

Absorbancia espectral de componentes de Hb separados

Cromatografía de intercambio iónico

A1c*

4. Inmunoensayo Afinidad por anticuerpo

EIE, IEIT, IAL A1c**; GHb lábil no se unirá

5. Minicolumna

Absorbancia espectral de componentes de Hb separados

A1c + no-A1 GHb; GHb lábil no se unirá

Formación de productos coloreados a partir de 5-HMF y TBA

A1c glicada A0

Cromatografía por afinidad

6. Colorimétrico Hidrólisis ácida

EIE, Ensayo inmunoenzimático; 5-HMF, 5-hidroximetil furfural; HPLC, cromatografía líquida de alta eficacia; IIAL, inhibición por inmunoaglutinación látex; TBA, ácido tiobarbitúrico; IEIT, inmunoensayo por inhibición turbidimétrica. * Métodos 1, 2 y 3 actualmente incluyen rutinariamente un agente en el reactivo de hemólisis para remover la GHb lábil. **El reconocimiento de las variantes de Hb, tales como S1c, es específico para anticuerpo

Tabla 32-7. Rangos de referencia para los diferentes métodos sobre hemoglobina glicada. 1326

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Hemoglobina glicada total Hemoglobina A1 Hemoglobina A1c Hemoglobina A1c

Tabla 32-8. Métodos para medición de insulina. Método: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Principio:

Uso: Comentarios:

1. Radioinmunoensayo (RIA) Ioduro radiactivo marcado (125I) compite con la insulina en especimen por un número limitado de sitios de unión en los anticuerpos anti-insulina Procedimiento más frecuentemente utilizado Posible interferencia a partir de anticuerpos anti-insulina endógenos 2. Ensayo inmunoenzimométrico (EIEM)) La insulina ligada al anticuerpo inmovilizado al suporte magnético de fase sólida. El agregado de un segundo anticuerpo marcado con FAL adicionado para formar sandwich. El sustrato fluorogénico adicionado después del paso de lavado para remover el anticuerpo marcado no ligado. Frecuentemente utilizado Posible interferencia a partir de los anticuerpos anti-insulina endógenos y de los anticuerpos anti-ratón humanos. 3. Inmunoensayo enzimático de micropartícula (IEEM) Similar al método 2, excepto que la insulina está ligada a las micropartículas cubiertas de antiinsulina transferidas a la matriz fibra de vidrio donde se agrega el conjugado anti-insulina:FAL para formar el complejo "sandwich". El fosfato de 4-metilumbeliferil es agregado como sustrato para la FAL. Frecuentemente utilizado Lo mismo que para el método 2

FAL, Fosfatasa alcalina

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Figuras

Figura 32-1 Los cinco pasos principales del metabolismo de la glucosa: glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, vía de la hexosa monofosfato, y vía del ácido urónico.

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Figura 32-2 Dos fases de la glucólisis. La primera fase procede a partir de la glucosa para la formación del 1,3 difosfoglicerato y consume 2 moles de ATP. La segunda fase procede a partir del 1,3 difosfoglicerato hasta piruvato y produce 4 moles de ATP. La glucólisis, por lo tanto, resulta en una ganancia neta de 2 moles de ATP por mol de glucosa. La síntesis del 2,3-DPG por el ciclo de Rapoport-Luebring es importante para la regulación del transporte de oxígeno.

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Figura 32-3 El ciclo de los ácidos tricarboxílicos produce CO2 y agua a partir de piruvato, ácidos grasos y aminoácidos, los cuales entran al ciclo a nivel de los puntos indicados. Los iones hidruros (H: –) son generados y utilizados en el proceso de fosforilación oxidativa para producir ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico.

Figura 32-4 El glicógeno es un polisacárido de 1 a 4 millones de daltones compuesto de unidades de glucosa con uniones glucosídicas 1,4 y 1,6. Las uniones 1,6 producen ramificaciones a intervalos de aproximadamente 10 unidades de glucosa. 1330

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Figura 32-5 El glucógeno, la molécula de almacenamiento para la glucosa, es sintetizada a partir de glucosa-1-fosfato por un proceso llamado glucogénesis (lado izquierdo). La glucogenólisis libera unidades de glucosa a partir de glucógeno. La desramificación es el primer paso en la glucogenólisis (lado derecho)

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Figura 32-6 Vía involucrada en la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos, ácidos grasos, glicerol, y lactato. Esta vía comparte muchas de las enzimas de la vía glucolítica y del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La gluconeogénesis proporciona glucosa en todo momento que haya escasez de glucosa y cuando se acumule lactato. ALAT , Alanina transaminasa; LD, lactato deshidrogenasa; PC, piruvato carboxilasa.

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Figura 32-7 Secuencia de aminoácidos de la insulina. La secuencia de aminoácidos para esta figura, un conjunto de secuencias para la proinsulina bovina y preproinsulina de rata, probablemente no difiera mucho de la secuencia de aminoácidos de la preproinsulina humana. En el texto se describen esta serie de rupturas enzimáticas de la preproinsulina (sitio 1) a la proinsulina y de la proinsulina (sitio 2 y 3) a la insulina.

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Figura 32-8 Prueba de tolerancia a la glucosa oral (PTGO, ver p. 627). La respuesta del diabético a la PTGO se compara a la respuesta normal. En la diabetes, la curva de glucosa es elevada y retardada. En la respuesta normal, el pico se alcanza después de 30 minutos y retorna al valor base después de las dos horas. La diabetes de tipo I produce una curva para la insulina prácticamente chata después de la administración de glucosa. Si hay un pico, tiene lugar tardíamente (después de una hora). En la diabetes tipo II, la respuesta a la insulina se encuentra a menudo exagerada, el pico es tardío, y el retorno al valor base es posterior a las 3 horas.

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Figura 32-9 Vías involucradas en el metabolismo de los cetoácidos. La acumulación de cetoácidos, acetoacetato, y beta-hidroxibutirato es un rasgo principal de la cetoacidosis diabética. La vía metabólica que conduce al acetoacetato e hidroxibutirato a partir de la acetil CoA se encuentra acelerada en la diabetes debido a la movilización de los ácidos grasos libres.

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Figura 32-10 Formación de la base de Schiff para producir un producto estable.

CAPÍTULO 33

33. Enfermedades Coronario Arteriales y Desórdenes del Metabolismo Lipídico Hebert K. Naito

PARTE I: LÍPIDOS Fisiología normal de los lípidos Composición de los lípidos de los alimentos Digestión grasa, absorción y metabolismo de los lípidos Rol del hígado en el metabolismo de los lípidos Metabolismo del colesterol Funciones biológicas Fisiología del metabolismo del colesterol Síntesis Catabolismo Valores normales esperados del colesterol Metabolismo de los triglicéridos Funciones biológicas

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Fisiología Síntesis Catabolismo Valores normales esperados de triglicéridos PARTE II: LIPOPROTEÍNAS Clasificación de lipoproteínas Quilomicrones Lipoproteínas de muy baja densidad Lipoproteínas de densidad intermedia Lipoproteínas de baja densidad Lipoproteínas de alta densidad Otras lipoproteínas Metabolismo de las lipoproteínas Quilomicrones Lipoproteínas de muy baja densidad Lipoproteínas de densidad intermedia Lipoproteínas de baja densidad Lipoproteínas de alta densidad Hiperlipidemia Hiperlipoproteinemia Clasificación de las hiperlipoproteinemias Hiperquilomicronemia Hiperbetalipoproteinemia Hiperlipoproteinemia combinada Disbetahiperlipoproteinemia Hiperprebetalipoproteinemia Hiperlipoproteinemia combinada Transformación de hiperlipidemia a hiperlipoproteinemia Limitación de la clasificación en tipos de hiperlipoproteinemias De lípidos a lipoproteinemias: consideraciones del laboratorio Hiperlipoproteinemias secundarias Otras formas de dislipoproteinemias Implicaciones clínicas de las hiperlipidemias Enfermedades coronarias arteriales Formación de placas ateroscleróticas Etiología de las lesiones ateroescleróticas

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El Programa Nacional de Educación del Colesterol Métodos de análisis Colesterol Colesterol asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) Electroforesis de lipoproteínas Triglicéridos

OBJETIVOS Describir la digestión, absorción y metabolismo del colesterol y triglicéridos, incluyendo el rol del hígado y el tejido adiposo. Listado de las lipoproteínas y su contenido en apolipoproteínas, funciones principales de cada lipoproteína. Descripción de síntesis y catabolismo de HDL, LDL, VLDL, y quilomicrones. Discusión sobre cada uno de los seis tipos de lipoproteínas respecto a sus niveles de lípidos y lipoproteínas, consideraciones sobre la muestra y etiología genética Discusión sobre la iniciación y desarrollo de la ateroesclerosis. Discusión sobre los factores de riesgo de ateroesclerosis coronaria. Consideraciones sobre el significado clínico de la hiperlipidemia.

Términos Clave amfipático De amfi "a ambos lados" y patic " sentido" perteneciendo a una molécula que tiene dos sitios con propiedades características diferentes, que tiene un extremo polar (hidrófilo) y un extremo no polar (hidrófobo) pero con una longitud suficiente para que cada extremo demuestre su propia solubilidad. apolipoproteína Proteína componente del complejo lipoproteico. HDL Lipoproteínas de alta densidad. Estos complejos lipo-proteicos se llaman también alfa-lipoproteínas y son las más densas de las lipoproteínas. Su acrónimo más usado es HDL por "High-Density Lipoprotein." IDL Lipoproteínas de densidad intermedia. Este complejo lipoproteico tiene una densidad entre VLDL y LDL, es de una vida media relativamente corta, y en la sangre de una persona sana están en muy bajas concentraciones. En personas con disbetalipoproteinemia su concentración en sangre es elevada. Su acrónimo más usado es IDL por "Intermediate-Density Lipoprotein." LDL Lipoproteínas de baja densidad. Este complejo lipoproteico es también llamado beta-lipoproteína y es el producto final del catabolismo de la VLDL. Es el mayor transportador del colesterol. Su acrónimo más usado es LDL por "Low-Density Lipoprotein." lipoproteínas Complejo lípido (apoproteína)-proteína correspondiente a unas familias de macromoléculas con conocidas propiedades físicas químicas y fisiológicas conocidas. quilomicrones Grandes complejos lipoproteicos formados en el intestino y que tienen una importante función en el transporte de grasas (mayormente 1338

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triglicéridos dietarios). VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad también llamadas pre-beta lipoproteína. Estos son relativamente grandes complejos lípido-proteicos relativamente grandes que transportan triglicéridos de síntesis endógena. Su acrónimo más usado es VLDL por Very Low-Density Lipoprotein."

Parte I: Lípidos Fisiología Normal de los Lípidos Composición lipídica de los alimentos La grasa encontradas en los alimentos está compuesta mayormente de triglicéridos alrededor de 98% a 99%, de los cuales 92% a 95% es ácidos grasos y el resto es glicerol. El restante 1% a 2% de los lípidos incluyen colesterol, fosfolípidos, diglicéridos, monoglicéridos, grasas solubles, vitaminas esteroides, terpenos, y otras grasas. La mayoría de las grasas son mezclas de triglicéridos conteniendo cuatro o cinco ácidos grasos mayores y muchos más menores o trazas de constituyentes. Las moléculas de glicéridos individuales en la mayoría de los alimentos grasos contienen ambos ácidos grasos saturados e insaturados. Varios ácidos poliinsaturados (ácidos linoléico, linolénico, y araquidónico) no pueden ser sintetizados en el organismo y deben ser provistos por la dieta. Estos han sido llamados ácidos grasos esenciales (EFAs, por sus siglas en inglés)(ver Capítulo 37). La pequeña cantidad de sustancia no hidrolizable de la grasa alimentaria consiste en esteroides, alcoholes grasos, hidrocarburos, pigmentos, ésteres de glicerol, y varios otros componentes. El colesterol está en todas las grasas animales. La mayoría de los esteroles son colesterol pero dependiendo de la dieta, otros esteroles tales como fitoesteroles pueden constituir un apreciable porcentaje del total de esteroles particularmente en poblaciones con dieta vegetariana. Los fitoesteroles son importantes ya que compiten con el colesterol en la toma de las células de la mucosa. Por eso el mayor consumo de fitoesteroles, disminuye el colesterol dietario absorbido por las células de la mucosa intestinal. Digestión grasa, absorción y metabolismo de los lípidos La absorción ocurre en tres fases: la intraluminal, o fase digestiva durante la cual las grasas dietarias son modificadas física y químicamente antes de la absorción; la celular o fase absortiva en la cual el material digerido que entra en las células de la mucosa intestinal es reunido en su forma preabsortiva; y la fase de transporte durante la cual los lípidos son transportados desde las células de la mucosa a otros tejidos a través de los linfáticos y la sangre.refs(1172) Fase intraluminal La mayor parte de la digestión de las grasas alimentarias se realiza en el intestino a través de la acción de las enzimas intestinales y pancreáticas (lipasas) y ácidos biliares (ver Capítulos 29 y 30 respectivamente). Debido a su actividad surfactante activa, las sales biliares emulsionan los triglicéridos dietarios en partículas muy pequeñas de un diámetro aproximado de 1um. El proceso de emulsificación forma de esta manera partículas que pueden fácilmente 1339

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ser atacadas por las enzimas digestivas. En la cavidad intestinal la acción de la lipasa pancreática origina una progresiva digestión de los triglicéridos a 1,2-diglicéridos y luego a 2-monoglicéridos y ácidos grasos. Solo un pequeño porcentaje de las grasas se hidrolizan completamente a ácidos grasos libres (FFAs, por sus siglas en inglés) y glicerol. Los ésteres del colesterol se hidrolizan a colesterol libre y ácidos grasos libres; la reacción es catalizada por la enzima colesterol esterasa. Fase de absorción Luego que los monoglicéridos y ácidos grasos ingresan en el retículo endoplasmático de las células de la mucosa, presuntamente por difusión, los monoglicéridos y ácidos grasos son reesterificados a triglicéridos por cualquiera de los dos caminos. La vía de los monoglicéridos característica de la mucosa intestinal y que involucra la acilación directa de los monoglicéridos absorbidos del conducto con los FFA activados. La vía del alfa-glicerofosfato presente en la mayoría de los tejidos comprende la formación de coenzima A (acyl CoA) derivada de ácidos grasos. Esta reacción la cual requiere adenosina trifosfato (ATP), es catalizada por la enzima ácido grasa:CoA ligasa (AMP). Esta enzima tiene una pronunciada especificidad por ácidos grasos de cadena larga. Así los ácidos grasos de cadena larga aparecen en el ducto toráxicolinfático transportados como triglicéridos formando parte de los quilomicrones, mientras los ácidos grasos de cadena corta y media son transportados unidos a la albúmina en la circulación portal. El porcentaje de colesterol que es absorbido de la dieta se autorregula. Niveles incrementados de triglicérido en la dieta y un depósito de ácidos biliares elevado promueven la absorción de colesterol. Cuando la ingesta continua de colesterol es menor de 300 mg./día, la mayoría es absorbido (cerca de un 40% a 60%). Si la ingesta es incrementada a 2 o 3 g/día, se absorbe una pequeña cantidad como de un 10%. En una dieta típica americana se consumen cerca de 600 mg de esteroides son consumidos por día, y el coeficiente de absorción del colesterol dietario es generalmente de 25%a 40%. Debe notarse que la absorción de colesterol tiene una gran variación individualidad. Esto puede justificar parcialmente la influencia de la dieta en la hipercolesterolemia inducida debido a la diferencia en la sensibilidad individual o falta de la misma. Fase de transporte Una vez que los triglicéridos han sido resintetizados en la célula de la mucosa intestinal, son ensamblados en las células de la mucosa el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi dentro de macromoléculas hidrosolubles denominadas quilomicrones. Las lipoproteínas intestinales dejan las células de la mucosa presuntamente por pinocitosis reversa. Aparecen primero en los vasos linfáticos de la región abdominal y luego en la circulación sistémica. La liberación intestinal de los quilomicrones persiste por varias horas después de la ingestión de las comidas grasas. Dado que los quilomicrones tienen un tamaño suficiente para la dispersión de la luz (hasta 0.5 micras de diámetro), el plasma se vuelve lactescente (turbio) y produce lo que comúnmente se llama respuesta alimentaria lipémica. Este gran complejo lípido-proteico es una mezcla de triglicéridos (82%), algunas proteínas (2% como apoprotroteínas) pequeñas cantidades de colesterol (9% mayormente como ésteres) y fosfolípidos (7%). Aunque la cantidad de proteínas es pequeña, hay bastante evidencias que su presencia es necesaria para la liberación de los quilomicrones. Por ejemplo, en la 1340

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abetalipoproteinemia (una enfermedad genéticamente determinada en la cual la apoproteína B no se genera en el cuerpo) los triglicéridos no son liberados de las células intestinales La sangre transporta los quilomicrones a todos los tejidos del cuerpo, incluyendo el tejido adiposo, el cual es el principal sitio de captación. Los grandes quilomicrones, pesadamente cargados de triglicéridos (Fig. 33-1) son más bien rápidamente removidos (en minutos). Los quilomicrones están normalmente presentes en trazas, en muestras de sangres tomadas después de un ayuno nocturno. Bajo condiciones normales, el catabolismo de los quilomicrones procede en dos fases conocidas. Al principio, los triglicéridos son hidrolizados en los tejidos extrahepáticos bajo la influencia de triglicérido (o lipoprotein) lipasa. Este proceso conduce a la formación de una partícula remanente, relativamente pobre en triglicérido, y rica en colesterol. En la segunda fase metabólica la partícula remanente es removida por el hígado. La hidrólisis por la lipoprotein lipasa de las lipoproteínas del plasma rica en triglicéridos se produce en la superficie luminal (del lado de la corriente sanguínea) en los capilares endoteliales. La enzima está unida al endotelio de las células capilares en los músculos y tejido adiposo y puede ser liberada por administración intravenosa de heparina (actividad lipolítica postheparinica, PHLA). Como resultado de esta primera fase del metabolismo de los quilomicrones se liberan en la circulación sanguínea ácidos grasos no esterificados en la circulación sanguínea, y los diglicéridos y monoglicéridos son tomados por las vacuolas y transportados a través de las paredes capilares para su hidrólisis. Dentro de las células tisulares, los ácidos grasos derivados de los triglicéridos (de quilomicrones o las lipoproteínas de muy baja densidad, VLDL) pueden ser almacenados o utilizados como energía cuando se les necesite, especialmente por el corazón. Los FFAs son también usados para la síntesis celular de fosfolípidos, incluyendo la síntesis de prostaglandinas y determinadas hormonas producidas localmente. Las partículas remanentes de quilomicrones son clarificadas por el hígado. El catabolismo adicional de las VLDL remanente ocurre en un sitio extracelular y conduce a la formación de lipoproteínas de baja densidad (LDL), una partícula rica en colesterol. Función del hígado en el metabolismo de los lípidos Además del intestino y otros órganos, el hígado puede sintetizar partículas de lipoproteínas a partir de los constituyentes dietarios recientemente absorbidos. De hecho el hígado es el principal órgano que puede sintetizar colesterol; de hecho alrededor del 70% de la producción diaria de colesterol proviene del hígado. La síntesis reciente de triglicéridos hepáticos se cumple por la unión con fosfolípidos colesterol y proteínas para formar las VLDL. Estas macromoléculas son entonces liberadas a la circulación y transportadas al tejido adiposo. La síntesis de triglicéridos hepáticos es acelerada cuando la dieta es rica en exceso de calorías. Esto resulta en una sobreproducción de VLDL, lo que puede explicar las hipertrigliceridemias observadas en dietas particularmente ricas en azúcares simples. Durante el ayuno, las vías metabólicas en el hígado son revertidas. La concentración de la glucosa sanguínea cae, y los niveles de insulina disminuyen. La síntesis hepática de triglicéridos de las VLDL disminuye en el ayuno normal. Los derivados de los FFAs del tejido adiposo son tomados por el hígado, y su oxidación a cuerpos cetónicos provee energía para la gluconeogénesis. Los FFAs originados en el tejido adiposo pueden ser esterificados a 1341

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triglicéridos, incorporados en las VLDL hepáticas, y finalmente liberadas a la circulación. Durante los períodos de estrés y en determinadas condiciones metabólicas, tales como la diabetes descompensada; las FFAs son el principal precursor de las VLDL hepáticas.

Metabolismo del Colesterol Funciones biológicas El colesterol es un miembro de una clase grande de compuestos biológicos llamados esteroides que tienen una estructura similar de cuatro anillos, el anillo ciclopentanoperhidrofenantreno (Fig. 33-2). Debido a la bien establecida asociación positiva entre el colesterol plasmático y la enfermedad coronaria (ECC), podemos pensar en el colesterol como una sustancia nociva. Contrariamente a esta opinión el colesterol es esencial para el normal funcionamiento del organismo porque es: 1. Un componente estructural esencial de las membranas de todas las células y partículas subcelulares de todos los animales. 2. Un precursor esencial de los ácidos biliares. 3. Un precursor de todas las hormonas esteroides. Incluyendo las hormonas sexuales y adrenales. Fisiología del metabolismo del colesterol El colesterol de los tejidos está en constante intercambio con el colesterol del plasma; la velocidad de intercambio y la cantidad de colesterol de los tejidos que se intercambia con el colesterol plasmático va a variar de un tejido a otro. Dado que la pérdida y remplazo, del colesterol del organismo es alrededor del 2%, este es renovado cada día. El mayor canal de salida desde el pool, es el tracto gastrointestinal; la velocidad absoluta de recambio (en gramos por día) puede ser estimada por medida de la excreción fecal diaria que es, para el colesterol de 1 a 2 g/día, con excreción de ácidos biliares que es alrededor de la mitad del total del recambio. La Fig. 33-3 ilustra que la concentración de un pool de colesterol determinado de colesterol está bajo la influencia de las velocidades de aporte, salida y recambio de colesterol. Debería señalarse que a causa del continuo ciclo del colesterol hacia y fuera de la circulación sanguínea, su concentración plasmática, no es una simple función aditiva de la ingesta de colesterol dietario y la síntesis de colesterol endógena. Más bien refleja las velocidades de síntesis de lipoproteínas portadoras de colesterol y la eficiencia de mecanismos receptores que determinan su catabolismo. Una detallada discusión de la dinámica de la concentración de lipoproteínas puede ser hallada en la sección sobre el metabolismo de lipoproteínas. El colesterol está presente en todas las lipoproteínas plasmáticas, pero casi un 60% del total del colesterol en plasma en ayunas es transportado en las LDL.ref(1173) Casi dos tercios del total del colesterol plasmático es esterificado con ácidos grasos de cadena larga, con ácido linoleico siendo el ácido graso predominante en humanos. Los ésteres de colesterol en el plasma están en estado de constante recambio debido a su continua hidrólisis y resíntesis. La hidrólisis de los ésteres de colesterol tiene lugar en el hígado, pero la síntesis ocurre mayormente en el plasma por transferencia de residuos de ácidos grasos desde lecitina al colesterol libre (Fig. 33-4). Esta reacción está catalizada por una enzima plasmática conocida 1342

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como lecitina colesterol acil transferasa o LCAT. El sustrato preferido de lipoproteico preferido de la LCAT humana es la lipoproteína de alta densidad (HDL), y parece probable que el grueso de colesterol esterificado en plasma se forma sobre HDL.ref(1174) El éster de colesterol entonces es entonces transferido desde HDL a LDL VLDL, parcialmente por intercambio con los triglicéridos. Se cree que una de las funciones de HDL es transportar el colesterol, en forma esterificada desde los tejidos hacia el hígado.ref(1175) Uno puede entonces postular la siguiente secuencia de eventos. El colesterol libre desde los tejidos periféricos es transferido a la HDL; este es entonces esterificado por la LCAT, permitiendo al HDL captar más colesterol libre. El colesterol esterificado formado sobre la HDL es transferido hacia LDL y VLDL, donde es incorporado en el núcleo apolar de las moléculas de lipoproteínas. Las LDL, llevando su carga de ésteres de colesterol a los tejidos periféricos, alcanza el hígado, donde los ésteres de colesterol son hidrolizados, entrando el pool de colesterol libre en el hepatocito. El colesterol libre puede dejar el pool hepático por secreción en la bilis, directamente o luego de la conversión en ácidos biliares, o por reincorporación en la lipoproteína plasmática (VLDL). La excreción hepática por medio del pool biliar es uno de los principales mecanismos para remover colesterol desde la circulación. Síntesis Casi todos los tejidos animales sintetizan colesterol desde acetil CoA. En adultos el hígado y la pared intestinal proveen más del 90% del colesterol plasmático de origen endógeno. La génesis hepática de colesterol, diferente de la síntesis intestinal, es inhibida por el colesterol dietario. La velocidad de producción de colesterol (colesterol absorbido más sintetizado endógenamente), es de aproximadamente de 1g/día. En muchos tejidos la velocidad de síntesis de colesterol es determinada por la capacidad de la -hidroxi- -metil glutaril CoA (HMG-CoA) reductasa, la cual cataliza un paso limitante de la velocidad en la secuencia biosintética desde acetil CoA hasta colesterol. Aunque esto parezca ser la principal reacción limitante de la velocidad, podrían haber otros sitios de supresión en el camino de la biosíntesis del colesterol. La HMG-CoA reductasa hepática está sujeta a la inducción y represión por diversas hormonas, factores dietarios, y drogas. El control de la retroalimentación de la génesis del colesterol hepático está también mediada por el colesterol en sí mismo y directa o indirectamente por ácidos biliares. Un breve esquema del control de la génesis hepática del colesterol se muestra en la Fig. 33-5. Catabolismo En humanos, la absorción incrementada de colesterol es seguida desde el pool intercambiable por una excreción aumentada del mismo. La conversión aumentada del colesterol en ácidos biliares puede ser causada por la interrupción de la circulación enterohepática de las sales biliares. Las sales biliares que vuelven al hígado desde el intestino reprimen la síntesis de una enzima que cataliza el paso limitante de la velocidad de reacción de la conversión de colesterol en ácidos biliares. Cuando las sales biliares están impedidas de volver al hígado, la actividad de esta enzima aumenta y se estimula la degradación de colesterol en ácidos biliares. Este efecto puede ser explotado terapéuticamente en el tratamiento de la hipercolesterolemia por el uso de resinas no absorbibles, las cuales captan ácidos biliares en el lumen del intestino e impiden su retorno al hígado. 1343

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Los mecanismos recién expuestos para la excreción de colesterol por medio de ácidos biliares o colesterol en bilis dependen de una actividad mediada por receptores en el hepatocito. El hepatocito tiene sitios receptores que son específicos para apoproteínas (Apo) B y E. La función principal del hígado en el aclaramiento de lipoproteínas es remover desde el plasma las lipoproteínas que contienen Apo E (como quilomicrones remanentes y VLDL remanentes) y Apo B (como LDL) remanentes). Sin embargo, las lipoproteínas que contienen Apo-E son aclaradas con mayor eficiencia que las lipoproteínas que contienen Apo-B. Por esta razón los quilomicrones remanentes y las VLDL remanentes (lipoproteína de densidad intermedia IDL) no son normalmente cuantificables en individuos saludables (ver Fig. 33-1). La captación de LDL por los tejidos periféricos es también mediada por receptores (ver Fig. 33-4). La unión de las LDL al receptor seguida por la internalización e hidrólisis de las LDL sirve para entregar colesterol libre a la célula. El colesterol libre intracelular entonces funciona como: (1) un regulador de la velocidad de síntesis de receptores, (2) un regulador para la síntesis de colesterol por el mecanismo de retroalimentación negativa, o (3) como regulador de la actividad de la ACAT (acil-CoA : colesterol aciltransferasa), la cual determina cuanto colesterol es almacenado en la célula como oleato de colesterol, a éster de colesterol. Se cree que uno de los factores que ocasiona el eflujo de colesterol desde la célula a la sangre es la disponibilidad de HDL.ref(1176) Por este proceso, el oleato de colesterol en la célula es hidrolizado a colesterol libre y ácido graso. El hígado, el tracto gastrointestinal y otros órganos, como las glándulas adrenales y los tejidos gonadales, toman HDL y lo catabolizan en sus constituyentes proteínas y lípidos (incluyendo colesterol). Valores normales esperados de colesterol A diferencia de muchos de los compuestos sanguíneos que medimos en el laboratorio, los lípidos y lipoproteínas requieren un enfoque diferente dado que los valores normales esperados están siendo definidos.ref(1177) El problema que surge es definir que niveles de lípidos plasmáticos separan a la población “normal “de las personas con valores elevados sanguíneos y que tienen o podrán desarrollar ECC. Antes de que se pueda determinar que es lo adecuado dieta o terapia con drogas para el control de las concentraciones de lipoproteínas y lípidos en suero, se necesitaría primero considerar el nivel al cual los lípidos sanguíneos deberían descender. En otras palabras, ¿a que nivel deberían los clínicos considerar una muestra como “hiperlipidémica”?. Muchos laboratorios clínicos y médicos usaron los intervalos de referencia derivados desde el 95% de los valores centrales cuando clasificaban una muestra normal o anormal. Desafortunadamente, debido a la forma que hemos definido “normal” en el pasado, muchos resultados de pruebas de lípidos y lipoproteínas no se correlacionan muy bien con las condiciones de riesgo de enfermedad en un individuo base. De este modo valores de colesterol en el rango normal para una población dada pueden no representar un nivel de colesterol saludable. Por ejemplo, un valor de colesterol entre 2500 y 2800 mg/L puede estar dentro del 95% de la distribución de una población masculina saludable entre 51 y 59 años de edad en los Estados Unidos, pero cerca del 40% a 50% de estas personas eventualmente desarrollaran ECC. Se han establecido los valores críticos para lipoproteínas y lípidos del suero que son altamente predictivos de enfermedad o riesgo de enfermedad, sin considerar la distribución “normal”, (ver la discusión del Programa Nacional de educación sobre colesterol pág. 669). Debido a la correlación positiva entre concentraciones sanguíneas de colesterol y el 1344

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riesgo aumentado de ECC, muchos investigadores creen que el promedio de concentraciones de colesterol para toda la población debe ser lo mas bajo posible. De acuerdo a datos clínicos,ref(1178) los individuos con valores de colesterol plasmático inferior a 1800 mg/L tenían una mortalidad por ECC mínima (alrededor de 3.3/1000). Sin embargo, el riesgo relativo aumentaba al 25% para aquellos con valores entre 1800 y 2000 mg/L. Entre 2000 y 2390 mg/L el riesgo relativo aumentaba alrededor del 80%; para valores superiores a 2400 mg/L, el riesgo relativo aumentaba casi dos y medias veces, o 230%. Para individuos con concentraciones plasmáticas de colesterol cercanas a 2600 mg/L, el riesgo relativo aumentaba al 400%. En términos simples, concentraciones por debajo de 2000 mg/L pueden considerarse más ideales que concentraciones por encimas de 2000 mg/L para una población adulta. Usando esto como definición, parece que cerca del 58% de la población adulta tiene niveles de concentración de colesterol indeseables. La concentración plasmática en hombres Estadounidenses jóvenes está esencialmente dentro del rango ideal. Si no aumentara con la edad, el riesgo de ECC en la población americana quizás sería mucho más inferior de lo que es ahora. Informes recientes indican que el valor promedio de colesterol en la población de Estados Unidos bajo desde 2200 a menos de 2150 mg/L, la morbilidad y mortalidad por ECC a disminuido. Otra vez, debe ser recordado que la relación entre concentraciones sanguíneas de colesterol y ECC no muestra umbral para la enfermedad. Es bien conocido que a medida que se envejece se vuelve más susceptible al proceso arterosclerótico. Ha sido calculado que, para un individuo con un nivel de colesterol de 2000 mg/L y ningún otro factor de riesgo, un grado crítico de aterosclerosis (mayor que un 60% de estenosis) se alcanza en muchas personas al llegar a la edad de 70 años. Si el mismo individuo tiene un valor de colesterol entre 2500 y 3000 mg/L, este grado de enfermedad de las arterias coronarias (EAC) puede probablemente ser alcanzado a los 60 o 50 años de edad respectivamente. Esta guía es acelerada cuando uno considera la interacción de otros factores de riesgo para las ECC. Con la adición de un factor de riesgo de ECC, como fumar, la edad crítica es alcanzada alrededor de los 60 años de edad, y por el agregado adicional de otro factor de riesgo de ECC, hipertensión, esta edad cae a los 50 años. Una concentración plasmática de colesterol de 2500 mg/L puede mover la edad crítica por debajo de los 50 años con un factor de riesgo y a los 40 años con dos factores de riesgo. Es de resaltar el suero de una persona o la concentración plasmática de colesterol esta bajo la influencia de muchos otros factores, algunos de los cuales son controlables y algunos incontrolables.ref(1179) Genética. La genética probablemente tiene la influencia más importante en la concentración de colesterol de una persona. Se estima que cerca de la mitad de la variabilidad en concentraciones sanguíneas de colesterol tiene una base genética. Edad. La concentración de colesterol en el suero comienza alrededor de 650 mg/L al nacer y aumenta constantemente con la edad (cerca de 15 mg/L por año). Sexo. La concentración sanguínea de colesterol en hombres es generalmente siempre más alta que en mujeres premenopáusicas. Después de la menopausia, sin embargo, la 1345

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concentración de colesterol es mayor en mujeres que en hombres. Los niveles de colesterol en los hombres parece mantenerse constante entre los 50 y 60 años de edad. Dieta. La grasa saturada en la dieta aumenta los niveles de colesterol del suero, mientras que la grasa poliinsaturada disminuye la concentración de colesterol; las grasas monoinsaturadas tienen un menor efecto. El colesterol de la dieta eleva los niveles de colesterol del suero. Los esteroles de las plantas y ciertos tipos de fibras disminuyen la concentración del colesterol del plasma. Los aceites de pescado parecen disminuir los triglicéridos más que el colesterol. Obesidad. Aunque la obesidad es comúnmente mirada como un contribuyente importante para el desarrollo de hipertrigliceridemia, esta establecido que a medida que el porcentaje de individuos con obesidad aumenta con la edad, así también aumentan las concentraciones sanguíneas de colesterol. Actividad física. La actividad física tiende a disminuir el colesterol total del suero. Muchos de estos efectos dependen del tipo, intensidad, duración, y frecuencia de la actividad física. El ejercicio también disminuye la concentración de LDL colesterol y aumenta la del HDL colesterol. Hormonas. La hormona del crecimiento, tiroxina, y glucagón disminuyen los niveles de colesterol del suero, mientras que esteroides anabólicos y progestágenos aumentan los niveles de colesterol. La pérdida de estrógenos en las mujeres postmenopáusicas esta asociada con elevadas concentraciones sanguíneas de colesterol elevadas. Enfermedades primarias. Diabetes mellitus, disfunción de la tiroides, enfermedad obstructiva del hígado, porfiria aguda, disgamaglobulinemias, y síndrome nefrótico, tienen un efecto en las concentraciones sanguíneas de colesterol.

Metabolismo de los Triglicéridos Funciones biológicas Los triglicéridos son la principal forma en que se encuentran las grasas en la naturaleza, y su función prioritaria es proveer de energía a las células. Un gramo de ácidos grasos liberan alrededor de 9 kcal. El cuerpo humano almacena grandes cantidades de ácidos grasos unidos a ésteres como glicerol en el tejido adiposo. Esta forma de almacenar energía es altamente eficiente por la magnitud de energía que se libera cuando se produce el catabolismo de los ácidos grasos. Fisiología Los triglicéridos son por lejos la subclase más abundante de glicéridos de la naturaleza. Los tejidos de los mamíferos también contienen algunos diglicéridos y monoglicéridos, pero esto ocurre a niveles de trazas cuando se les compara con los triglicéridos. Muchas moléculas de 1346

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triglicéridos de los tejidos de mamíferos están mezcladas con glicéridos. Debido a su insolubilidad en agua, los triglicéridos son transportados en el plasma combinados con otros lípidos más polares (fosfolípidos) y proteínas, como también con colesterol y ésteres de colesterol en complejos lipoprotéicos macromoleculares. Se demuestra que los triglicéridos esencialmente no polares (y ésteres de colesterol) se encuentran principalmente en el centro de la lipoproteína, con la proteína más polar y los componentes fosfolípidicos en la superficie, con sus grupos polares dirigidos hacia afuera para estabilizar la estructura total en el medio plasmático acuoso. Síntesis La concentración de triglicéridos en el plasma en un determinado tiempo es un balance entre la velocidad de entrada en el plasma y su tasa de remoción. Un cambio de concentración puede por lo tanto ser el resultado de un cambio en cada uno o ambos de estos factores. Además, un cambio primario en uno puede originar un cambio secundario en el otro. Esto, por lo tanto es el mayor problema a ser considerado en cualquier situación donde la concentración de triglicéridos es anormalmente alta, ya sea atribuible a una elevación en la velocidad de entrada, o a una caída en la velocidad de remoción de los triglicéridos plasmáticos. Los triglicéridos del plasma derivan de dos fuentes, intestinal e hígado. Los triglicéridos intestinales son sintetizados a partir de la grasa de la dieta. La entrada hacia la sangre desde el hígado de los ácidos grasos presentes en el triglicérido depende mucho del estado, nutricional. Así en ayunas los ácidos grasos derivados de los triglicéridos de la célula adiposa son tomados por el hígado y una porción es reexcretada como VLDL. Siguiendo a una comida, los carbohidratos de la dieta son tomados por el hígado y convertidos a triglicéridos, los que son secretados como lipoproteínas. Es importante hacer notar que, excepto durante la absorción de la grasa de la dieta, el hígado es el principal contribuyente de triglicéridos al plasma. El tamaño, contenido de triglicéridos y densidad de partícula de los complejos de lipoproteínas formados por el intestino y el hígado varía de acuerdo a la cantidad de triglicéridos que está siendo liberada. Así altas velocidades de liberación resultan en grandes complejos con una alta carga de triglicéridos y una correspondiente baja densidad. De hecho, los complejos de lipoproteínas liberados desde el hígado bajo tales condiciones pueden alcanzar un tamaño no muy inferior al de los quilomicrones intestinales aunque estos normalmente tiene un contenido de triglicéridos algo menor y por lo tanto una mayor densidad. Catabolismo La acción del factor aclarante de la lipasa en la superficie endotelial de células endoteliales no solo facilita la remoción de los ácidos grasos de los triglicéridos desde la sangre sino que también determina donde son utilizados, y esto tiene consecuencias importantes. Por ejemplo en un estado de exceso calórico la proporción de ácidos grasos de los triglicéridos en la circulación sanguínea en exceso respecto de la inmediata necesidad calórica es tomada por el tejido adiposo. Muchos de los ácidos grasos son reconvertidos a triglicérido intracelular y almacenados. En cambio en un estado de déficit calórico (como en el ayuno) los tejidos obtienen su energía principalmente desde la oxidación de ácidos grasos no esterificados, los que son movilizados desde el tejido adiposo y llevados a los tejidos del cuerpo por la sangre. 1347

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Quedan todavía en estas condiciones triglicéridos en la sangre en forma de VLDL, pero en vez de ser tomados por el tejido adiposo para almacenarse se dirigen lejos de este tejido hacia el músculo para complementar el abastecimiento de energía desde los ácidos grasos movilizados. Esta modificación en la toma de ácidos grasos de los triglicéridos es lograda mediante cambios en la actividad de la lipasa intracelular en los tejidos correspondientes. Así el ayuno resulta en una disminución en la actividad de la enzima en el tejido adiposo y un aumento de su actividad en el músculo. La enzima triglicérido adiposa intracelular es diferente de la enzima de plasma y es llamada lipasa sensible a hormona porque es convertida de su forma inactiva a la activa por epinefrina, norepinefrina, adrenocorticotropina, hormona estimulante de la tiroides, y glucagón. Además, su actividad es estimulada por la hormona del crecimiento. Por otro lado la insulina inhibe la actividad de esta lipasa. A diferencia de la lipoprotein lipasa del tejido adiposo, la lipasa sensible a hormona de otros tejidos muestra un incremento en la actividad durante el ayuno, debido posiblemente a una disminución de los niveles de insulina. Es admitido que la lipasa hormona sensitiva juega un rol importante en la movilización de grasa desde el tejido adiposo. Valores normales de triglicéridos esperados Más que basarse en los tradicionales rangos tradicionales de 95 percentiles como intervalos de referencia para triglicéridos, una conferencia de consenso de la NIH recomendaba que el valor más usual para recordar es 10000 mg L o mayor, el que representa un riesgo aumentado para pancreatitis aguda.ref(1180) Él limite superior adulto del normal se definió como 2000mg/ l para ambos sexos, sin considerar la edad. La dificultad en la interpretación de los valores de triglicéridos es la "zona gris"; es decir trata uno como hipertrigliceridemia media si los valores están entre 2000 y 4000 mg/l?. Clínicamente tiene sentido tratar como hipertrigliceridemia media solo si la concentración de HDL colesterol del paciente está disminuida. La carencia de evidencias convincentes que los triglicéridos son un factor de riesgo primario para ECC no garantiza una intervención agresiva con tratamiento para el paciente con hipertrigliceridemia media. Sin embargo en muchos casos la disminución de triglicéridos normalizará los niveles bajos de HDL colesterol debido a la existencia de una relación inversa entre concentraciones de triglicéridos y HDL colesterol. Por otra parte, si las concentraciones de HDL colesterol están normales o sobre los límites normales(que son, 600mg/L), no hay indicación de tratamiento para el paciente con hipertrigliceridemia media.

Parte 2. Lipoproteínas Como se discutió antes, los lípidos son insolubles en medio acuoso, incluyendo el del plasma.refs(1181) Es solamente cuando los lípidos hidrofóbicos están unidos a “lipoproteínas” que se vuelven solubles en la circulación sanguínea. Debido a que las lipoproteínas son generalmente vistas como una clase de macromoléculas asociadas al transporte de lípidos, se hicieron en 1967 se hicieron recomendaciones para transferir el énfasis en el diagnóstico de hiperlipidemia a hiperlipoproteinemia.refs(1182) 1348

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Una lipoproteína puede ser visualizada más simplemente como una estructura globular con una cubierta soluble exterior de proteína y fosfolípido y un interior hidrofóbica, núcleo neutro de triglicérido y colesterol (Fig. 33-6). La proteína y los fosfolípido imparten solubilidad a los lípidos insolubles. La unión entre el lípido interior y la cubierta de fosfolípido y proteína es no covalente, ocurriendo principalmente mediante puente de hidrógeno y fuerzas de van Der Waals. La proteína libre de lípidos, es llamada apolipoproteína. Se debe hacer notar que los lípidos, están débilmente unidos a la proteína y fosfolípido, para permitir el pronto intercambio de los mismos entre las lipoproteínas del suero, así como también entre las lipoproteínas del suero y de los tejidos, sin embargo lo suficientemente fuerte para aislarlos y clasificarlos como lipoproteínas, en los sistemas analíticos usados.

Clasificación de las Lipoproteínas Los cuatro sistemas mas frecuentemente usados para aislar, separar y caracterizar las lipoproteínas se basan en ultracentrifugación analítica, ultracentrifugación preparativa, electroforesis, y técnicas de precipitación.ref(1183) Los sistemas más frecuentemente usados son los basados en ultracentrifugación y electroforesis (Fig. 33-7). Con un papel o medio soporte de agarosa, los modelos electroforéticos muestran a los quilomicrones remanentes en el origen mientras que las pre-beta-lipoproteínas y las beta-lipoproteínas migran hacia las áreas beta1–beta2 globulina respectivamente y las alfa-lipoproteínas migran hacia el área alfa1-globulina. Usando la ultracentrifugación y tomando ventaja del hecho que las lipoproteínas son más livianas que las otras proteínas del suero, uno puede separar las lipoproteínas en quilomicrones (las lipoproteínas más livianas, con una densidad menor que la del plasma), VLDL con una densidad por debajo de 1.006 g/mL (después de la remoción de quilomicrones), LDL con una densidad entre 1.006 y 1.063 g/mL, y HDL con una densidad entre 1.019 y 1.210 g/mL.refs(1184) Estas clases de lipoproteínas se correlacionan con los modelos electroforéticos; por ejemplo, la pre-beta- lipoproteína es generalmente sinónimo con la VLDL, la beta-lipoproteína con la LDL, y la alfa-lipoproteína con el HDL. La Tabla 33-1 y la Fig. 33-7 resumen las características físicas, químicas y fisiológicas de las más importantes lipoproteínas del plasma. Quilomicrones Los quilomicrones contienen principalmente triglicéridos combinados con colesterol, pequeñas cantidades de fosfolípidos, apoproteínas específicas (Apo B-48, A-I, A-II, C-I, C-II, C-III, y pequeñas cantidades de Apo B y E-II, E-III, E-IV) (ver Tabla 33-3). La mayoría de los modelos de la estructura del quilomicrón han sido realizados bajo la suposición de que los lípidos neutros (triglicéridos y ésteres de colesterol) están parcialmente recubiertos por una capa exterior de fosfolípido, colesterol libre, y proteína. Bajo condiciones de ayuno (más de 10 o 12 horas), no se encuentran quilomicrones generalmente en la sangre de personas sanas. La presencia de quilomicrones le da al suero una apariencia de turbio o lechoso. Lipoproteínas de muy baja densidad Una preparación promedio de VLDL contiene 52% de triglicéridos, 18% de fosfolípidos, 22% 1349

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de colesterol, y cerca de un 8% de proteínas. El colesterol y los ésteres de colesterol se encuentran en una relación aproximada de 1:1 en peso. La esfingomielina y la fosfatidilcolina son los fosfolípidos más importantes. El mayor tamaño de una partícula de VLDL, está en relación con la mayor la proporción de triglicéridos y Apo C y la menor la proporción de fosfolípidos, Apo B, y otras apoproteínas. La Apo B parece estar presente en una cantidad absoluta constante en todas las fracciones de VLDL. La Apo B-100 da cuenta de aproximadamente un 30% a 35%, con Apo C-I, C-II, y C-III constituyendo más de un 50% del contenido de apoproteínas en la VLDL. Pueden también estar presentes Apo E-II, E-III, y E-IV y variadas cantidades de otras apoproteínas (A-I, A-II, B-48). La cantidad relativa de cada proteína varía con el individuo y con el grado de hiperlipidemia. Lipoproteína de baja densidad Las LDL contienen, en peso, 80% de lípidos y 20% de proteínas. Consecuente con este incremento del contenido de proteínas, la LDL es más pequeña (21 a 25 nm) y tiene una mayor densidad de hidratación (1.006 a 1.063 g/mL) que la VLDL y los quilomicrones. Aproximadamente un 50% de los lípidos de la LDL son colesterol. Las LDL constituyen entre un 40% y 50% de la masa de lipoproteínas del plasma en humanos. Su concentración promedio en un hombre adulto americano normal es cerca de 1400 mg/L, y en mujeres es de 1340 mg/ L. La LDL es el principal portador de colesterol y es considerada una lipoproteína aterogénica. Apo B-100 es la principal apoproteína de la LDL normal, y la LDL Apo B de la LDL representa entre un 90% y 95% del total de Apo B-100 del plasma. La evidencia experimental sugiere que la LDL Apo B en humanos sanos deriva casi enteramente de la apoB de la VLDL en plasma. Basado en la densidad de flotación, la LDL es frecuentemente separada en dos clases, LDL1 (o lipoproteína de densidad intermedia, IDL) y LDL2, basados en la densidad de flotación. La fracción de densidad inferior, IDL (1.006 a 1.019g /mL), es más rica en lípido que la LDL2 (1.019 a 1.063 g/mL) y probablemente representa a un intermediario en el catabolismo de la VLDL (ver Fig. 33-1). Así una comparación entre IDL y LDL2 demuestra la gradual desaparición de triglicéridos y de apoproteínas más características de la VLDL (Apo C y Apo E) y un enriquecimiento con Apo B-100 y éster de colesterol. Lipoproteína de alta densidad El complejo macromolecular HDL (ver Fig. 33-6) contiene aproximadamente 50% de proteína y 50% de lípido. La HDL es la menor de las lipoproteínas (9 a 12 nm) y flota a la mayor densidad (1.063 a 1.21 g/m L) que ninguna de las moléculas de lipoproteína. El lípido más importante cuantitativamente de la HDL es el fosfolípido, aunque HDL colesterol tiene un interés particular. La mayor especie de fosfolípido es fosfatidilcolina (también conocida como lecitina), la cual se encuentra en un 70% a 80% del total de fosfolípidos. Tiene un importante rol funcional como reactante en la esterificación del colesterol del plasma, la cual es catalizada por la enzima lecitin-colesterol-acil-transferrasa (LCAT). La HDL puede ser además subfraccionada por ultracentrifugación diferencial en HDL2 (con una densidad entre 1.063 y 1.110 g/m L) y HDL3 (1.110 y 1.21 g/m L. La primera está presente en mujeres premenopáusicas en alrededor de tres veces de su concentración en los hombres. Los individuos con niveles menores de HDL2 son aparentemente más susceptibles a ECC prematuras. 1350

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Otras lipoproteínas Beta-lipoproteína flotante o VLDL beta-migrante. La fracción de lipoproteína llamada beta-lipoproteína flotante es encontrada en personas con hiperlipoproteinemia tipo III, o “enfermedad de beta ancha” (proveniente de las regiones de mancha amplia de beta-a-pre-beta-lipoproteína frecuentemente presentes en la electroforesis del total de lipoproteínas del plasma en estos sujetos); es también llamada disbetalipoproteinemia.ref(1185) Esta fracción tiene una densidad de 1.006 g/mL, lo que es una característica de la VLDL, pero tiene un modelo de migración de beta-lipoproteína. La composición anormal de lípidos de la VLDL en personas con hiperlipoproteinemia tipo III es atribuible a una cantidad proporcionalmente mayor cantidad de colesterol en esa fracción. Esta es considerada ser una lipoproteína muy aterogénica; muchos individuos con este trastorno de lipoproteína normalmente mueren por ECC entre los 20 y 30 años de edad.ref(1186) Este es un desorden genético muy raro, afectando aproximadamente a 1:10000 individuos, o menos de un 0.1% de la población. Una típica presentación clínica de esta enfermedad es el xantoma palmar (también llamado xantoma estriatum palmar). Ocasionalmente, xantomas tuberosos o tuberoeruptivos aparecen en los brazos y, menos frecuentemente, en las nalgas. Además de ECC prematura, la disbetalipoproteinemia causa enfermedad cerebral y vascular periférica. Esta anormalidad bioquímica se refleja por un incremento en las IDL y quilomicrones remanentes, una relación entre VDL colesterol y VDL triglicérido mayor que 0.35, y un patrón de isoelectroenfoque demostrando la presencia de las isoformas E-II/E-II, las cuales son hoy en día la prueba de diagnóstico definitivo. Lp(a), o lipoproteína pre-beta sumergida. Las semejanzas entre la composición de lípidos, concentración y densidad (1.05 a 1.10 g/m L) entre Lp(a) y LDL impidieron la clara discriminación de estas dos lipoproteínas hasta que tests inmunológicos demostraron la relación entre sus residuos proteicos. Un sesenta y cinco % de la proteína Lp(a) es Apo B-100, pero otro 15% es albúmina, y el resto es una apoproteína única de la Lp (a), llamada Apo Lp(a). A pesar de su alta frecuencia en la población, el significado funcional de esta lipoproteína es incierto. Hay incrementada evidencia de que niveles altos de Lp(a) (que son, mayores que 300 mg/ L) están asociados con un riesgo elevado para ECC.ref(1187) Parece ser que una persona puede tener un LDL colesterol normal pero una concentración elevada de Lp(a) y tener un incremento en el riesgo para ECC. Personas con hipercolesterolemia familiar con niveles elevados de Lp(a) tienen un riesgo muy alto para ECC prematuras. Aunque cerca de un tercio del población americana tiene niveles normales o bajos de Lp(a) (menos de100 mg/ L), cerca de un 50% de la población tiene niveles elevados. La elevación de la Lp(a) ocurre tempranamente en la niñez y persiste a lo largo de la edad adulta. Los niveles de Lp(a) no son afectados por ninguna técnica de intervención en la dieta y no son sensibles a la mayoría de las drogas para disminuir lípidos, excepto para ácido nicotínico. Lipoproteína X. Aunque la lipoproteína X tiene una densidad de flotación similar a la de la LDL, la composición en lípido y proteína es totalmente diferente, esta lipoproteína anormal migra electroforéticamente en forma diferente que la LDL. La lipoproteína X está caracterizada por 1351

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una proporción inusualmente alta proporción de fosfolípido del plasma y colesterol no esterificado y por un bajo contenido de proteína consistiendo de Apo B, Apo C, y albúmina. Se encuentra más característicamente en el plasma de pacientes con obstrucción biliar. Lp-X no se encuentra en personas sanas pero a menudo se encuentra en pacientes con una deficiencia familiar de la enzima LCAT y en pacientes con enfermedad obstructiva del hígado. Lp-X, ha sido usada en Europa para diferenciar colestasis de la enfermedad hepática parenquimal. No es un marcador útil para diferenciar colestasis extrahepática de la intrahepática.

Metabolismo de las Lipoproteínas Quilomicrones Como se discutió anteriormente, los quilomicrones se forman exclusivamente en el intestino y cruzan el sistema linfático hacia el conducto torácico donde ellos entonces entran a la circulación sistémica. La principal función de los quilomicrones es transportar triglicérido de la dieta o exógenos. Se postula que los quilomicrones nuevamente sintetizados y secretados (de 80 a 500 nm) desde las células de la mucosa intestinal recogen Apo C-II desde las HDL. Las Apo C-II entonces catalizan la hidrólisis de triglicéridos de lipoproteínas por la lipoproteína lipasa. La hidrólisis resulta en la liberación de FFAs y monoglicéridos. Como se muestra en la Fig. 33-1 la hidrólisis catalizada por la lipoproteína lipasa de la célula endotelial resulta en una progresiva deprivación de triglicéridos de la molécula de quilomicrón resultando en una partícula de quilomicrón remanente. Esta transformación involucra el mantenimiento de la estructura de la lipoproteína por renovaciones simultáneas de fosfolípido, colesterol no esterificado, y péptidos Apo C desde la superficie de la lipoproteína al HDL del plasma. Una transferencia recíproca de ésteres de colesterol desde el HDL puede ocurrir, Apo D puede ayudar en este proceso de transferencia. La partícula de quilomicrón remanente circulante es entonces liberada desde la pared capilar y aclarada desde la circulación mediante el hígado, donde es metabolizada. Esta partícula, ahora menor (entre 30 y 80 nm), retiene su éster de colesterol y Apo B y Apo E, lo que juega un papel importante en la toma de estas partículas por un mecanismo de toma por receptor hepático de alta afinidad (ver Fig. 33-4). Cuando ocurre la unión, los remanentes son inmediatamente internalizados por endocitosis mediada por receptor y degradados en los lisosomas hepáticos. LipoproteínA de muy baja densidad Luego del aumento postprandial en triglicéridos de quilomicrones, una subida secundaria en la concentración de triglicéridos ocurre entre las 4 a 6 horas después de una comida. Esto representa predominantemente un triglicérido de VLDL hepático sintetizado desde glucosa y triglicérido de quilomicrones no hidrolizados en el tejido periférico. La contribución relativa de la glucosa y de la grasa de la dieta varía con la composición de la dieta. El consumo de una dieta alta en carbohidratos puede conducir a un fenómeno conocido como hipertrigliceridemia inducida por los carbohidratos. Con una dieta alta en carbohidratos, el flujo de glucosa al hepatocito está en exceso respecto a la demanda de energía y capacidad de almacenamiento de glucógeno. Esto resulta en la modificación de la acetil CoA en la síntesis de ácidos grasos y la dihidroxiacetona fosfato en glicerol activado. Este fenómeno puede no 1352

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persistir en personas sanas, pero otros pueden ser inusualmente susceptibles a la inducción de carbohidratos de la síntesis de VLDL. Esto es una base para la reducción de los carbohidratos dietarios (azúcares simples y alcohol) en el tratamiento de la hipertrigliceridemia, pero este enfoque no es exitoso si la hipertrigliceridemia tiene otras causas, como una sobreproducción o un defecto en la depuración. Normalmente, las VLDL representan cerca de un 10% a15% del total de la lipoproteínas circulantes en un individuo normal sano. Se cree que los triglicéridos de la VLDL tiene un destino similar al de los lípidos de los quilomicrones (ver sección del catabolismo de quilomicrones, p.652 y por encima). Durante el catabolismo de las VLDL, más de un 90% de Apo C es transferida al HDL, mientras que esencialmente todo el Apo B permanece con la partícula de lipoproteína original. Según esta vía catabólica postulada, la ruptura de la VLDL conduce a la formación de partículas LDL ricas en colesterol. LDL. La HDL juega un rol importante al servir de aceptor de ApoC, colestero libre y fosfolípido como exceso de superficies remanentes desde una VLDL saturada. La Apo C puede recircular desde HDL a los quilomicrones nuevamente sintetizados o a las VLDL. La vida media de la VLDL es entre 1 y 3 horas. Lipoproteína de densidad intermedia La IDL es una partícula transitoria (22 a 28 nm) usualmente presente in concentraciones muy bajas en el plasma de personas en ayuno. La IDL, como se discutió previamente, es un lipoproteína derivada del catabolismo de la VLDL. Las partículas de HDL interactúan con la enzima plasmática LCAT, la cual esterifica el exceso colesterol libre de HDL con ácidos grasos derivados de la posición 2-carbono de la lecitina, el principal fosfolípido del plasma. El éster de colesterol nuevamente sintetizado se retransfiere a las partículas de IDL desde las HDL, aparentemente mediante la acción de una proteína intercambiadora de éster es de colesterol del plasma (posiblemente Apo D). El resultado neto del acople de las lipólisis y las reacciones de intercambio, es el reemplazo de la mayoría del núcleo original de triglicérido de la VLDL con éster de colesterol. Después de la lipólisis, las partículas de IDL son liberadas desde la pared capilar a la circulación. Ellas luego sufren una conversión adicional en la cual la mayoría de los triglicéridos remanentes son removidos y todas las apoproteínas excepto Apo B se pierden. La partícula resultante, que contiene éster de colesterol casi puro en el núcleo y Apo B en la superficie, es la LDL. Lipoproteína de baja densidad Como se discutió previamente, la formación de la LDL se produce inicialmente a partir del catabolismo de la VLDL. En una persona normal sana, el colesterol-LDL constituye cerca de dos tercios del total de colesterol plasmático; la concentración de LDL colesterol en las mujeres es ligeramente menor que en los hombres (excepto después de la menopausia). La LDL libera el colesterol al tejido extrahepático (y al hígado), donde es utilizado, depositado, o excretado. La entrada de las partículas de LDL al tejido periférico es realizada cuando la LDL se une a los receptores de alta afinidad localizados en regiones de la membrana plasmática llamados los ”hoyos” revestidos. Estos fosos se invaginan en la célula y se aprietan para formar una vesícula que transporta el LDL a las lisosomas (Fig. 33-4). La fusión de la membrana de la vesícula con la membrana lisosomal expone a la LDL a una serie de enzimas 1353

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hidrolíticas, las que degradan la Apo B en aminoácidos. Los ésteres de colesterol son hidrolizados por una lipasa ácida, y el colesterol libre liberado deja los lisosomas para uso en reacciones celulares. Como resultado de este mecanismo de captación, las células extrahepáticas tienen velocidades menores de síntesis de colesterol, dependiendo en cambio del colesterol derivado de LDL. El colesterol así liberado es usado para la síntesis de membrana y sirve para regular, como es, deprimir la síntesis de colesterol por la HMG-CoA reductasa. La internalización del LDL también regula la síntesis del receptor de LDL por sí mismo. El exceso de colesterol activa la enzima acil-CoA-colesterol aciltransferasa (ACAT), conduciendo al almacenamiento intracelular de éster de colesterol. Así el resultado neto de la unión y internalización del LDL es la inhibición recíproca y activación de las enzimas de síntesis y almacenaje celular de colesterol y una reducción en el número de receptores disponibles para unir LDL. La significación de este proceso para regular los niveles de colesterol plasmático en humanos esta ilustrada en pacientes con la forma homocigota de la hipercolesterolemia familiar. Estos paciente son deficientes en los receptores de LDL y tienen excesiva producción de LDL y un catabolismo deficiente de LDL debido a una incapacidad de los tejidos de unir, internalizar, degradar, y así regular la síntesis de colesterol. Excepto por la manifiesta deficiencia del receptor en la hipercolesterolemia familiar, es sin embargo incierto, el rol del receptor de la LDL incierto en el control final de los niveles plasmáticos de colesterol y es probablemente solo un complemento de otros procesos regulatorios. Se ha reconocido que la especificidad del receptor de LDL también se extiende a lipoproteínas que contienen Apo E y Apo B. Parece que aunque los receptores extrahepáticos toman LDL fácilmente, los receptores hepáticos toman los quilomicrones remanentes con mayor eficiencia (cerca de 20 veces más) y las LDL con mucho menor eficiencia. Esta diferencia es probablemente atribuible al contenido de Apo E en los quilomicrones remanentes y IDL, la cual tiene una mayor afinidad por el receptor que la de Apo B. Sumándose al mecanismo normal de degradación, la vía de receptores de LDL de alta afinidad, el LDL del plasma puede ser degradado por mecanismos menos eficientes que, requieren niveles plasmáticos altos para lograr velocidades significativas de remoción. Uno de estos mecanismos ocurre en las células depuradoras (macrófagos) del sistema retículoendotelial. Cuando el nivel plasmático de LDL aumenta, estas células depuradoras degradan cantidades crecientes de LDL. Cuando se sobrecargan con ésteres de colesterol, son convertidas en células espumosas, que son componentes de las placas ateroscleróticas. En humanos, los rangos estimados de la proporción de LDL plasmático degradado por el sistema receptor de LDL está entre 33% y 66%. Lo restante es degradado por el sistema de células depuradoras y quizás por otros mecanismos aún no aclarados. Lipoproteína de alta densidad Las moléculas de HDL nacientes son sintetizadas en las células de la mucosa intestinal y en hepatocitos por un proceso análogo a la síntesis de VLDL y quilomicrones. Esto involucra la síntesis de lípido microsomal y proteína seguido por secreción. Durante el proceso sintético, los fosfolípidos y colesterol libre son combinados con apoproteínas específicas para formar estructuras diferentes que experimentan modificaciones en la composición y estructura después de la secreción. La más importante de estas modificaciones es la esterificación de 1354

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colesterol libre para formar éster de colesterol por una reacción catalizada por la enzima LCAT. En humanos esta es la principal fuente de éster de colesterol plasmático. Las personas con deficiencia en LCAT tienen una acumulación de estas partículas deficientes en éster de colesterol en el plasma. Este hallazgo posiblemente indica que el éster de colesterol formado en la reacción de LCAT permite la expansión de las estructuras discoidales para formar las esferas características del HDL del plasma normal. El éster de colesterol así formado puede ser transferido a la VLDL durante el catabolismo. El perfil de apoproteína del HDL naciente es modificado concomitantemente con cambios en el contenido de lípido. Apo E es el principal componente nuevamente secretado (naciente) HDL, a diferencia del HDL plasmático, el cual es caracterizado por una predominancia de Apo A con menor contribución de Apo C y Apo E. El significado funcional de esta modificación no está completamente entendido, pero la Apo A-I es un activador de la LCAT, y esta adquisición debe facilitar todas las reacciones de la LCAT. Además, la HDL participa en la regulación del catabolismo de triglicéridos y formación de éster de colesterol por proveer los respectivos cofactores, Apo C-II para la activación y Apo C-III para la inhibición de la actividad de la lipoproteínlipasa. También la HDL normal puede equilibrar el transporte de LDL por mediación de la remoción de colesterol desde sitios periféricos a sitios degradativos y excretores. Este rol la HDL en el transporte reverso de colesterol puede ser la base para la protección proporcionada por la HDL contra las enfermedades cardiovasculares. La vida media plasmática del HDL en sujetos normales oscila entre 3.3 y 5.8 días. El catabolismo de la Apo A-I y Apo A-II dentro de la HDL son similares. El catabolismo del HDL está realzado en pacientes nefróticos pero disminuido en sujetos hipertrigliceridémicos, especialmente aquellos con hipercolesterolemia. Está también incrementado en sujetos con dietas altas en carbohidratos y está muy realzado en pacientes con deficiencia de HDL familiar (enfermedad de Tangier). Pareciera que el cambio en el catabolismo de HDL puede jugar un rol principal en la regulación de los niveles plasmáticos de HDL.

Hiperlipidemia Por definición, la hiperlipidemia es una concentración elevada de lípidos en la sangre. Los lípidos plasmáticos de mayor interés son el colesterol total (colesterol libre + colesterol esterificado) y los triglicéridos. Cuando una o más de estas clases mayores de lípidos plasmáticos están elevadas, existe una condición referida a hiperlipidemia. Las concentraciones de colesterol y triglicérido pueden ser usadas para detectar hiperlipoproteinemia. Como se definió previamente sobre el 90% de las personas con hiperlipidemia, como se definió previamente, tienen hiperlipoproteinemia. Las principales excepciones son individuos con excesiva cantidad de LDL cuyo colesterol plasmático es mantenido dentro de los límites por una concomitante disminución en HDL. La NIH sugiere que el tratamiento en los Estados Unidos debería iniciarse cuando un adulto tiene un nivel de colesterol en suero por encima de 2000 mg/ L.refs(1188) El límite superior de los niveles de triglicérido en suero es algo menos claro. La concentración de triglicéridos de un paciente por encima de 4000 mg/L puede ser considerada alta, y niveles por encima de 10000 mg/L pueden ser considerados indeseables debido al aumento de riesgo de pancreatitis aguda.refs(1189) La terapia dietaria debe ser iniciada cuando los límites superiores 1355

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son excedidos a favor de prevenir o minimizar el desarrollo de ECC dado que la aterosclerosis raramente se produce con concentraciones de colesterol total menores que 1500 mg/L durante la vida de una persona, a menos que otros factores de riesgo estén presentes como genéticos, presión elevada, fumar y obesidad .

Hiperlipoproteinemia La hiperlipoproteinemia es una elevación de las concentraciones de lipoproteína del suero. La clasificación de la hiperlipoproteinemia comienza con la determinación del tipo de perfil de lipoproteína anormal.refs (1190)refs Sin embargo, son siempre necesarios otra diferenciación y análisis, por ejemplo: 1. Separación de hiperlipoproteinemia en formas primarias y secundarias (Tabla 33-2). La forma secundaria es causada por otra enfermedad conocida que puede resultar en una manifestación de hiperlipoproteinemia secundaria que se puede presentar en cualquiera de los cinco tipos principales de perfiles de lipoproteína. 2. Diferenciación de hiperlipoproteinemia hereditaria y no hereditaria. 3. Determinación de la concentración relativa de las fracciones de lipoproteínas, que son, VLDL colesterol, LDL colesterol, y HDL colesterol. Hay numerosos tipos de hiperlipoproteinemias, pero la mayoría de los pacientes con hiperlipidemia hereditaria tienen uno de los seis patrones comunes de lipoproteína anormal. Estos modelos están resumidos en la Fig. 33-8, donde uno puede observar que tres de las cuatro familias de lipoproteína sirven como determinantes. Estas tres familias son (1) quilomicrones, (2) VLDL, y (3) LDL (incluyendo IDL.) La clasificación fenotípica original de Fredricksonref(1191) no consideró la importancia de las HDL y otras lipoproteínas discutidas en este capítulo. Debido al hallazgo epidemiológico mundialmente reciente de que hay estadísticamente una importante relación inversa entre concentración de HDL colesterol y riesgo de ECC, los laboratorios ahora determinan LDL colesterol y HDL colesterol como parte del total del perfil lípido–lipoproteína.

Clasificación de las Hiperlipoproteinemias Aunque la clasificación de las hiperlipoproteinemias se basa en la identificación de concentraciones elevadas de lípidos sanguíneos y modelos de lipoproteína anormal (Fig. 33-8), debe enfatizarse nuevamente que cada forma de dislipoproteinemia no es una entidad homogénea desde un punto de vista genético, clínico, o patológico. Las hiperlipoproteinemias se describen ahora en detalle algo mayor, haciendo énfasis en los aspectos de diferenciación clínica, diagnóstica, genética, bioquímico-patofisiológica, y terapéutica.refs (1192)refs Hiperquilomicronemia Este desorden de lipoproteico se caracteriza por concentraciones de triglicéridos plasmáticos muy elevados, generalmente mayores que 10000 mg/ L, como el resultado de la 1356

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quilomicronemia. La elevación ocasional en colesterol es secundaria a la pronunciada elevación en los niveles de quilomicrones, ya que estas partículas también contienen colesterol. Las LDL y HDL están frecuentemente bajas, mientras que las VLDL pueden estar ligeramente elevadas. La remoción de colesterol está reducida, y los sujetos tienen deficiencia en la actividad de la lipasa, como en la actividad lipolítica posheparina (PHLA) (específicamente la extrahepática, lipoproteínlipasa, protamina-inactivada). La hiperquilomicronemia primaria usualmente se manifiesta en sí misma tempranamente en la niñez. Aunque este desorden es generalmente primario y familiar, este patrón de lipoproteína puede ser producido por muchas otras enfermedades o estados metabólicos. Así formas secundarias de esta dislipoproteinemia deben ser excluidas (ver Tabla 33-2). Una vez que las causas secundarias obvias son excluidas, el desorden primario puede ser confirmado por (1) la presencia de xantomas eruptivos, hepatoesplenomegalia, lipemia retinalis, dolor abdominal, y pancreatitis temprana en la vida, (2) ingesta de drogas que pueden ser causa hipertrigliceridemia secundaria, (3) presencia de niveles plasmáticos reducidos de triglicérido lipasas, (4) reducción en los niveles de triglicéridos y desaparición de quilomicronemia en una dieta libre de grasa, y (5) confirmación por tamizaje familiar de herencia como una característica autosómica recesiva. Las drogas corrientes que disminuyen lípidos no son efectivas para disminuir los triglicéridos del suero, por lo tanto solamente una dieta baja en grasas es efectiva para tratar este desorden. Como los quilomicrones son producidos como respuesta a la ingestión de grasa en la dieta, el enfoque terapéutico es reducir la cantidad de grasa dietaria a 10% del total de calorías. Esta intervención técnica puede resultar en una disminución de los triglicéridos del suero dentro de las 24 horas. La meta primaria es disminuir los triglicéridos del suero a menos de las 10000 mg/L para reducir el riesgo del paciente para la pancreatitis aguda. La meta secundaria es además reducir los niveles de triglicéridos para normalizar los niveles de HDL colesterol. Las recomendaciones de NECPrefs(1193) como niveles saludables de triglicérido los menores de 2000 mg/L (Tabla 33-3). Hiperbetalipoproteinemia La alteración de lipoproteína hiperbetalipoproteinemia es caracterizada por concentraciones elevadas de colesterol plasmático con niveles normales frecuentemente de triglicéridos y el plasma claro. La hipercolesterolemia primaria puede ser causada por (1) sobreproducción de VLDL, (2) aumentada velocidad de conversión de VLDL en LDL, (3) LDL enriquecida con colesterol esterificado, (4) estructura defectuosa de LDL, y (5) disminución del número de receptores de LDL o en la actividad de cada célula. Se estima que cerca de un 50% de la variación de la concentración de colesterol sanguíneo en la población general tiene una base genética. El modelo de lipoproteína esta caracterizado por una elevación de las LDL con VLDL normal. Este desorden de lipoproteína es reconocido como hipercolesterolemia familiar, la que exhibe los siguientes aspectos: (1) un número deficiente de receptores funcionales de LDL en los cultivos de fibroblastos (es una característica patognómica), (2) una expresión de patrón tipo II en la infancia, (3) xantomatosis en miembros severamente afectados, y (4) prematuras ECC prematuras vistas en la tercer y cuarta década. Los desordenes hiperbetalipoproteinémicos secundarios, como hipotiroidismo, síndrome de porfiria aguda intermitente, disgamaglobulinemias, enfermedad obstructiva del hígado, y dietas en grasas altamente saturadas y en colesterol deben ser descartados. 1357

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Una vez que la hiperlipoproteinemia secundaria ha sido descartada, el desorden primario puede confirmarse por: (1) tamizaje familiar incluyendo niños; (2) persistencia de hipercolesterolemia aún después de 8 semanas de dieta baja en colesterol (menor que 300 mg/día), altas grasa poliinsaturadas (relación de grasa poliinsaturada a saturada [P/S] encima de 1:1.2); (3) presencia de xantomas tendinosos, xantelasma, y arcos corneales; y (4) determinación de la deficiencia o defecto de receptores de LDL u otros defectos moleculares genéticamente determinados. Un tratamiento especial se requiere frecuentemente para los niveles de colesterol muy elevados de los individuos con hipercolesterolemia familiar (HF) (5000 a 15000 mg/ L). Además de las dietas acostumbradas y tratamiento con drogas (ver debajo), la mayoría de los pacientes con HF requieren plasmaféresis cada 3 o 4 semanas para la remoción de LDL. En casos extremos, se requiere el transplante de hígado. Para hipercolesterolémicos no-HF, el primer paso de tratamiento es una dieta rigurosa baja en grasa. Si la dieta no logra reducir suficientemente el colesterol del suero, se emplea drogas para disminuir los lípidos. La meta de una terapia con dieta es reducir el colesterol-LDL del suero mientras se mantiene una dieta nutricionalmente adecuada. El enfoque dietario recomendado se puede encontrar en los reportes del panel de tratamiento adulto (ATP) del NECP.refs(1194) Las recomendaciones de ATP son para que la intervención por dietas ,deben ser en dos pasos, paso I y paso II. Estas dietas reducen progresivamente la ingesta de grasa total y saturada y colesterol y promueven la pérdida de peso en pacientes con sobrepeso. Estas dietas en etapas reducen otros riesgos para ECC por disminución de la presión sanguínea, aumentando los niveles de HDL colesterol, y disminuyendo los riesgos para diabetes. Los niveles de LDL y HDL colesterol deben ser monitoreados después de 4 a 6 semanas y luego de 3 meses de comenzada la terapia con dieta paso I. Si las meta de colesterol no son alcanzadas, el paciente puede progresar a la dieta paso II. Si la intervención con el paso II todavía no hace lograr las metas de colesterol, se puede considerar una terapia con drogas. Los agentes que disminuyen los niveles de colesterol incluyen los secuestrantes de ácidos biliares (colestiramina o colestipol), inhibidores de la HMG-CoA reductasa (como lovastatin (Mevacor), provastatin (Pravacol), simvastatin (Zocor), fluvastatin (Lescol), ácido nicotínico, y probucol. El efecto de la terapia con drogas debe ser monitoreado a las 4 o 6 semanas y luego nuevamente a los 3 meses. Hiperlipoproteinemia combinada Otra forma de hiperlipidemia familiar es la hiperlipidemia familiar combinada. Sus características importantes incluyen: (1) no-anormalidad en el número de receptores de LDL funcionales en los cultivos de fibroblastos, (2) ausencia del modelo hiperbetalipoproteinímico en niños, (3) temprana expresión de hipertrigliceridemia, (4) patrones lipoprotéicos múltiples en parientes afectados, en generaciones sucesivas, y (5) hipercolesterolemia en el común de los patrones hiperbetalipoproteinicos. Esta es la más común de las hiperlipoproteinemias primarias. El rasgo característico de este desorden es la variedad de los fenotipos de lipoproteínas dentro de una familia. Más comúnmente, los pacientes pueden tener una elevación en ambos LDL y VLDL; sin embargo, dentro de una familia, se pueden también encontrar hiperbetalipoproteinemia e hiperprebetalipoproteinemia afectando a personas diferentes. A diferencia de la hiperbetalipoproteinemia, los sujetos con hiperlipoproteinemia familiar combinada 1358

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generalmente no manifiestan su enfermedad hasta la edad adulta. Clínicamente, estos pacientes tienen una incidencia aumentada de enfermedad de las arterias coronarias (EAC). Ellos también son frecuentemente diabéticos, tienen una tendencia a la hiperuricemia, y muestran una baja incidencia a la tendinitis y xantomas tuberosos. Estos rasgos están más ligados clínicamente a la hiperprebetalipoproteinemia que a la hiperbetalipoproteinemia familiar. El modo de herencia de la hiperlipoproteinemia familiar combinada está aún en duda; sin embargo, es claramente un desorden familiar que es visto más comúnmente con este patrón lipoproteico. Es de mencionar que sujetos con hiperbetalipoproteinemia o hiperprebetalipoproteinemia pueden también pertenecer a un grupo familiar que tiene hiperlipoproteinemia familiar combinada. Esta enfermedad lipoproteica está caracterizada por un elevado colesterol total, LDL, triglicérido, VLDL y con la ausencia de la flotante beta-lipoproteína. Cualquier hipercolesterolemia y hipertrigliceridemia secundaria deben descartarse antes de confirmar el desorden de lipoproteína primario. El tamizaje familiar es de rigor para el reconocimiento de esta anormalidad de lípidos. Un diagnóstico preciso del perfil de lipoproteínas requiere una apreciación de los factores que determinan los niveles de triglicéridos. Los estudios en poblaciones en los Estados Unidos han documentado aumentos en los niveles de triglicéridos con la edad y han indicado que alrededor de un cuarto de los hombres de mediana edad tuvieron niveles de triglicéridos que exceden los valores de corte previamente publicados. Así, aunque estadísticamente válidos, los límites críticos para concentraciones de triglicéridos pueden no representar los límites fisiológicos. Por lo tanto uno puede esperar una mayor frecuencia de hiperlipoproteinemia en grupos de mayor edad. No deberían descuidarse los efectos posibles de los carbohidratos dietarios cuando uno evalúa este desorden de lipoproteínas. Se ha demostrado que la hipertrigliceridemia de ayuno en pacientes con este perfil metabólico de lipoproteínas puede ser atribuible con un aumenta agudo en los carbohidratos dietéticos. Parece ser que valores de triglicérido mayores que 4000 mg/L son raros en pacientes con este modelo lipoproteico. Los pocos casos reportados en la literatura médica sucedieron en mujeres postmenopáusicas. La electroforesis de lipoproteínas no es frecuentemente necesaria para el diagnóstico de este patrón. Si el perfil de hiperbetalipoproteína está presente con niveles de colesterol elevado y triglicéridos normales queda poco por aclarar con la electroforesis de lipoproteínas. Si el patrón hiperlipémico familiar combinado está presente, el procedimiento de diagnóstico decisivo es la diferenciación de éste modelo de cualquiera de los modelos beta ancha o patrón hiperprebetalipoproteinémico. Esta tarea no se aclara fácilmente con la electroforesis de lipoproteínas. También es de hacer notar que el colesterol total del plasma puede ser normal a pesar de un valor elevado de colesterol-LDL. Esta relación también sucede en la hipercolesterolemia familiar. El modelo de beta-ancha descrito más abajo no es más considerado único y ha sido notado en casos homocigotas para la hipercolesterolemia familiar. La presencia de una discreta banda atribuible a concentraciones altas de Lp(a), o pre-beta-lipoproteína sumergida puede causar una confusión en el diagnóstico con el perfil de hiperlipidemia familiar combinada. Cuando el valor de triglicérido es normal, el aspecto del patrón beta-ancha en la electroforesis es sugestivo de la presencia de Lp(a). Así el modelo electroforético es insensible y no es una herramienta altamente específica para la diferenciación de modelos. 1359

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El tratamiento para la hiperlipoproteinemia debe ser focalizado en disminuir ambas concentraciones de colestrol-LDL y triglicéridos. Esta estrategia para disminuir LDL colesterol es discutida en la sección de hiperbetalipoproteinemia (pág. 657). La disminución de los triglicéridos y VLDL colesterol es algo diferente. Desde un punto de vista dietético, está focalizado sobre los carbohidratos y calorías (si el paciente tiene sobrepeso), requiriendo restricción alcohólica, y aumento de actividad física y logrando un peso ideal. La terapia con drogas está generalmente indicada en pacientes con concentraciones muy altas de triglicéridos (ver Tabla 33-3).refs(1195) Ambos, clofibrato y gemfibrosil son efectivos en disminuir triglicéridos (de esta forma VLDL o VLDL colesterol). La droga de elección para la hiperlipoproteinemia combinada es el ácido nicotínico, puesto que es muy efectivo en disminuir ambos, colesterol (LDL colesterol) y triglicéridos (VLDL colesterol) mientras aumenta el HDL colesterol. Disbetalipoproteinemia La disbetalipoproteinemia (también llamada hiperlipoproteinemia beta amplia) está caracterizada por una elevación de las concentraciones plasmáticas de colesterol y triglicérido y una LDL anormal (mas específicamente IDL), la cual flota en la fracción de una densidad menor que 1.006 g/mL. Esta LDL anormal frecuentemente se combina con la banda pre-beta en la electroforesis para producir una banda beta-ancha (ver fig. 33-8). Para un diagnóstico preciso de disbetalipoproteinemia es necesario documentar la presencia de la beta-lipoproteína flotante por un estudio de ultracentrifugación con medida de colesterol y triglicéridos en las fracciones con una densidad por debajo de 1.006 g/mL. Las medidas de la composición de lípido de la lipoproteínas con una densidad menor que 1.006 parece ofrecer un medio más confiables para identificar esta dislipoproteinemia que la por detección de la presencia de beta-lipoproteínas flotantes mediante la electroforesis sola. La relación clínicamente usada es el contenido en colesterol del VLDL dividido por la concentración plasmática de triglicéridos. Esta relación parece ser más útil para documentar esta hiperlipoproteinemia cuando el nivel de triglicérido es por lo menos 1500 mg/ L, pero puede estar sujeta a error cuando los triglicéridos exceden de 10000 mg/ L. Se ha sugerido que si la relación VLDL colesterol–triglicérido es de 0.30 o más, el sujeto puede tener disbetalipoproteinemia. Sin embargo, cuando la relación está entre 0.25 y 0.29, se puede considerar un diagnóstico de hiperlipoproteinemia de beta-ancha. La confirmación de este desorden se puede hacer por hallazgo de una isoforma de apoE con un patrón E2/ E2. Las características clínicas de sujetos con este desorden lipoproteico varían ampliamente en función de la edad, sexo, grado de adiposidad, y presencia de un desorden asociado como hipotiroidismo y alcoholismo. El xantoma más característico en sujetos con beta-ancha lipoproteinemia es llamado xantoma striatum palmare (en la literatura ambos “xantoma striatum palmare” y “xantoma striata palmaris” están en Latín impropio). En su forma más sutil estas lesiones producen una decoloración naranja o amarilla de los pliegues palmares (xantocromía striata palmaris), un fenómeno más fácilmente detectado en sujetos de complexión adecuada. Cuanto más avanzan, estas lesiones pueden producir elevaciones planas y la virtual obliteración de los pliegues palmar y digital. Las lesiones levantadas pueden ocasionalmente afectar las superficies palmares remanentes y en la forma severa producir xantomas tuberosos incapacitantes. 1360

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Se han notificado varias formas de ECC en asociación con hiperlipoproteinemia beta-ancha. La hiperlipoproteinemia es fácilmente tratada con dieta y drogas. La forma de enfermedad cardiovascular asociada con esta forma de dislipoproteinemia difiere significativamente, de la asociada con la hiperbetalipoproteinemia familiar, en la que enfermedades periféricas y aún cerebrovasculares parecen ser tan comunes como ECC. La hiperlipoproteinemia beta amplia puede estar asociada con hipotiroidismo, gota, y diabetes mellitus y se encuentra en pacientes con falla renal aguda en tratamiento de hemodiálisis. Hiperbetalipoproteinemia La forma pre-beta de la hiperbetalipoproteinemia ha sido llamada hiperlipidemia endógena o hiperlipidemia inducida por carbohidratos. El último término no es más aceptado por la mayoría de los investigadores dado que se observa también una hipertrigliceridemia inducida por carbohidratos en individuos normolipémicos. La hiperlipidemia endógena excluye la poco frecuente hiperquilomicronemia pero incluye una poco común hiperlipidemia mixta exógena y endógena. (Ver más adelante). Por definición la hiperprebetalipoproteinemia es una elevación de niveles de VLDL (y triglicéridos) por encima del arbitrario punto de corte en ausencia tanto de quilomicrones o VLDL anormal de la disbetalipoproteinemia. Los niveles de LDL son normales y la medida de Colesterol-LDL es normal. Una tentativa de diagnóstico de este desorden lipoproteico se puede hacer si, la concentración de triglicéridos está aumentada, el colesterol total es normal o moderadamente elevado, y el estacionamiento del plasma (a 40o C por 10 a 12 horas) no revela quilomicrones. El diagnóstico bioquímico es confirmado si la electroforesis revela una banda pre-beta lipoproteína diferente y el colesterol-LDL está en los límites normales. Hay que recordar que la presencia de pre-beta con niveles normales de triglicéridos plasmáticos se produce con pre-beta–lipoproteína “sumergida” una lipoproteína aparentemente normal pobre en triglicéridos, variante observada en por encima del 35% de individuos sanos. Una vez que el patrón bioquímico de hiperprebetalipoproteinemia ha sido confirmado (esto es basado en más de una muestra en condiciones estándar), debería ser clasificado de acuerdo a la causa, como primaria-ya sea tanto familiar como esporádica-o como secundaria a otro desorden. (ver Tabla 33-2) El diagnóstico de enfermedad primaria depende de los siguientes criterios: (1) patrón electroforético de hiperprebetalipoproteinemia, (2) un aumento de colesterol-LDL, (3) una o más parientes en primer grado con, este desorden y (4) ausencia de parientes cercanos con otras enfermedades lipoproteicas primarias. Otras características comunes son: niveles de colesterol normal si los niveles de triglicéridos son menores de 4000 mg/l, los niveles de triglicérido debajo de 15000 mg/l y una historia familiar de diabetes. Dado el alto consumo de alcohol en parte de la población, se hará un breve comentario. Aunque no se la considera la causa mayor de hiperlipidemia, el etanol es considerado como una causa aguda de una hipertrigliceridemia transitoria con una elevación primaria de las VLDL, causando principalmente prebetahiperlipidemia (algunas veces hiperlipoproteinemia) . La hipertrigliceridemia producida por etanol se manifiesta con las siguientes características: 1361

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1. La hipertrigliceridemia es usualmente moderada y de duración limitada. Los niveles de triglicéridos raramente exceden los 10000mg/L, y la lipemia tiene su pico a las 12 a 14 horas y desaparece luego de las 25 a 40 horas. Este efecto aparentemente transitorio parece ser cierto, especialmente en las personas normolipémicas. 2. Esta hipertrigliceridemia es, para la mayoría el resultado de un aumento de las VLDL y probablemente de los quilomicrones. 3. El hígado graso asociado con la ingesta de alcohol tiene un rol vital en la formación y extensión de la hiperlipoproteinemia inducida, y los cambios resultantes pueden relacionarse con la etapa del daño hepático. 4. La concentración de triglicéridos en la hiperlipidemia alcohólica está íntimamente relacionada con la calidad y cantidad de los ácidos grasos ingeridos. Es bien conocido que la ingesta simultanea de etanol y grasas (como en una comida compleja o de solo un aceite de maíz) produce una prolongación y aumento en la concentración de triglicéridos. Sin embargo es obvio que la hiperlipidemia puede ser producida por una excesiva producción y liberación de lípidos (de aquí en adelante lipoproteínas) dentro de la circulación, por una remoción defectuosa o “depuración” de lípidos de la sangre, o por una combinación de estos procesos fisiológicos, el mecanismo preciso de la hiperlipidemia inducida por etanol es aún desconocido. El protocolo de tratamiento se describe en la sección de hiperlipoproteinemia combinada (p.658). Hiperlipoproteinemia mixta Otra forma de hiperquilomicronemia es una hiperlipoproteinemia mixta. Se distingue por la presencia tanto de VLDL como de quilomicrones elevados en el plasma de personas en ayuno con dieta regular. Este desorden puede producirse como un defecto genético primario y puede representar una segunda forma de hiperquilomicronemia familiar. Se observan niveles de triglicéridos similares a los que se ven en la hiperquilomicronemia. Como en estos desórdenes la existencia de síndromes abdominales incluyendo pancreatitis, y los hallazgos físicos de xantomas eruptivos lipemia retinal, y hepatoesplenomegalia, están relacionados al nivel de triglicéridos en plasma. Aunque las características fisiopatológicas de las manifestaciones de esta forma de hiperlipoproteinemia no difiere probablemente de las observadas en la hiperquilomicronemia, una variedad de otras diferencias existen en las observaciones clínicas, genéticas, metabólicas y bioquímicas. En un marcado contraste con la hiperquilomicronemia, muchas de las instancias en este orden ocurren en la edad adulta. La plena aparición de esta anormalidad puede no manifestarse hasta la quinta o sexta década de la vida, presentádose más tarde en las mujeres que en los hombres. Se han descrito varios niños con esta hiperlipoproteinemia familiar. Triglicéridos extremadamente altos e hiperquilomicronemia no son atribuidos usualmente a desórdenes metabólicos primarios pero se los ha encontrado en varios desórdenes que conducen a enfermedades metabólicas secundarias. Estas enfermedades son propensas a producir estas formas de dislipoproteinemias en pacientes con hiperprebetalipoproteinemia primaria. Por ejemplo, la pancreatitis puede estar asociada con 1362

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una pronunciada hiperquilomicronemia, pero posteriormente una discreta hipertrigliceridemia puede encontrarse al reevaluar al paciente en condiciones estables. También es bien conocido que puede presentarse una hiperprebetalipoproteinemia en pacientes diabéticos insulino-dependientes insuficientemente controlados, y en alcohólicos. Aunque esta forma de hiperlipoproteinemia está asociada con elevados triglicéridos (como VLDL y quilomicrones), el colesterol plasmático puede estar discretamente o moderadamente aumentado, LDL y HDL-colesterol están usualmente normales o bajos. El plasma es usualmente opalescente y puede observarse una capa cremosa flotando encima de un plasma turbio. Cuando los triglicéridos están por encima de 10000 mg/L, la apreciación visual de un discreto sobrenadante “cremoso” sobre un plasma turbio es dificultoso. El uso de la ultracentrífuga (para remover los quilomicrones) o la prueba de refrigeración (separación de los quilomicrones después de reposarlos una noche a 40C) ultracentrífuga puede ser usada si es necesario para separar lo quilomicrones de puede ayudar a diferenciar esta forma de hiperlipoproteinemia. La las VLDL para cuantificarlas individualmente. Una valoración cuantitativa por electroforesis es a veces es suficiente para documentar elevadas VLDL y quilomicrones. Dado que en la práctica puede haber una sobreposición de niveles de VLDL en estos dos patrones lipoprotéicos puede caracterizarse finalmente por una medida de lipoprotein lipasa postheparínica. Esta enzima suele estar presente en este desorden lipoproteico. En ausencia de un ensayo específico para esta enzima una guía razonable y confiable de su presencia puede ser buscada por observación del cambio en los patrones electroforéticos obtenidos de una muestra de plasma de 10 minutos después de una inyección de heparina (10 U/kg por kilo de peso). La relación en plasma de colesterol a triglicéridos en plasma es en esta forma de dislipoproteinema (0.23 + -0.02) es usualmente más baja que en la hiperprebetalipoproteinemia (0.86 + -0.03) porque los quilomicrones incorporan menos colesterol que la VLDL. Las principales dificultades cualitativas pueden ser mayores para la distinción de este desorden lipoproteico de hiperprebetalipoproteinemia (hipertrigliceridemia endógena) porque estos patrones son frecuentemente transitorios, ya que muchos sujetos pierden su banda de quilomicrones con una moderada reducción de triglicéridos. Esta forma de hiperlipoproteinemia es frecuentemente secundaria a una amplia variedad de enfermedades, drogas, y hábitos dietarios (ver Tabla 33-2). Dado que hay muchos caminos para adquirir esta forma de hiperlipoproteinemia, es necesario una distinción cuidadosa entre causas primarias y secundarias. Una historia de rutina sobre ingesta de etanol y administración de estrógenos o esteroides, un uroanálisis y la medida de ayuno o de una glucosa postprandial de 2 horas, pruebas funcionales de: hígado tiroides y riñón serían útiles para su diferenciación. Acentuado por una diabetes mellitus mal controlada, exceso alcohólico, o estrógenos o contraceptivos orales conteniendo estrógenos en individuos con hiperprebetalipoproteinemia preexistentes, se producen frecuentemente patrones mixtos. Puede presentarse en casos familiares particularmente con triglicéridos por encima de 15000mg/l, lipemia retinal, hepatoesplenomegalia, y xantomas eruptivos. El defecto bioquímico de esta forma de hiperlipoproteinemia no es aún claro. La presencia de quilomicrones en el plasma de ayuno de un sujeto cuya dieta contiene un contenido bajo de grasas indica claramente que el mecanismo de “depuración” no es el adecuado. El defecto primario está en la remoción de triglicérido plasmáticos que pueden así explicar las elevadas VLDL. Se establece que este defecto no es una simple variante de la 1363

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hiperquilomicronemia se establece detectando y cuantificando la heparina liberada del plasma PHLA de estos sujetos. Así diferentes tipos de problemas pueden llevar a esta falla en la remoción de lipoproteínas. Una posibilidad es que la síntesis de triglicéridos endógenos y la secreción resultante de VLDL desde el hígado pueda hacerse a una velocidad anormalmente alta, suficiente para saturar las vías de remoción que son compartidas por los quilomicrones, lo que lleva a la elevación de ambas lipoproteínas. Estudios utilizando lipoproteínas marcadas con radioisótopos han indicado que muchos pacientes con hipertrigliceridemia tienen una elevada síntesis de triglicéridos de VLDL. La hiperquilomicronemia familiar puede dividirse en hiperquilomicronemia y una forma mixta de hiperlipoproteinemia. Ambos desordenes se manifiestan por niveles muy elevados de triglicéridos, presentando frecuentemente xantomas eruptivos lipemia retinal, hepatoesplenomegalia, y dolores abdominales. La hiperquilomicronemia es causada por una pronunciada deficiencia de lipoprotein-lipasa. La elevación de triglicéridos aparece con la ingestión de grasas dietarias y se manifiestan en niños muy jóvenes. La forma mixta puede ser detectada en raras ocasiones en la niñez, pero es de usual presentación en el adulto. También difiere de la hiperquilomicronemia en que la lipoprotein lipasa es mensurable y son hallazgos frecuentes la intolerancia a la glucosa e hiperuricemia. El único tratamiento efectivo es una dieta baja en grasas. La forma mixta de hiperlipoproteinemia es tratada más efectivamente por una dieta que induce a una pérdida de peso y que frecuentemente responde a alguna de estas drogas: ácido nicotínico, noretindrona, oxandrolona, benzafibrato, gemfibrozil, o clofibrato.

Transformación de Hiperlipidemia en Hiperlipoproteinemia Limitación de la clasificación en tipos de hiperlipoproteinemia Son bien conocidas las limitaciones que ofrece la clasificación de los tipos de lipoproteínas de Frederickson, Levy y Lees.refs(1196) Sin embargo se ha remarcado que los patrones lipoprotéicos del plasma no son un sustituto de una clasificación etiológica de hiperlipoproteinemia. La aproximación de Frederickson, Levy y Lees ha sido vista como provisoria hasta un entendimiento más fundamentado de las causas de hiperlipidemia. Usando solo una medida cuantitativa de colesterol y triglicéridos se pueden clasificar los pacientes en tres grupos mayores: aquellos con solo hipercolesterolemia, los con hipertrigliceridemia sola, y aquellos con una combinación de las dos. Sujetos con hipercolesterolemia pura usualmente tienen un patrón hiperbetalipoproteinémico y aquellos con una hipertrigliceridemia pura sin quilomicrones, un patrón de hiperprebetalipoproteinemia. Sujetos con niveles de colesterol y triglicéridos altos pueden tener perfiles o patrones de disbetalipoproteinemia o hiperprebetalipoproteinemia. Aunque actualmente el tipo de lipoproteínas no es considerado más como necesarias o importantes puede haber cuatro áreas donde el sistema de tipificación mantiene una validez para investigaciones clínica. 1. Los patrones lipoprotéicos son útiles para localizar las diversas anormalidades metabólicas y subrayar las hiperlipidemia. 2. Los tipos de hiperlipoproteinemias así identificados no son estados de enfermedad, pero son el resultado de desórdenes que afectan similarmente las concentraciones en particular de algunas lipoproteínas. 3. Cada tipo de lipoproteína está frecuentemente asociado con algunas 1364

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características clínicas distintivas. 4. Cada tipo de lipoproteína, independiente de la causa, se maneja mejor por una dieta específica y la terapéutica propuesta.

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El sistema de tipificación tiene cuatro limitaciones mayores: Para la diferenciación de disbetalipoproteinemia, su diagnóstico requiere apoyarse en la determinación de la relación de colesterol en VLDL dividido sobre los triglicéridos plasmáticos como también de la confirmación por electroforesis de la VLDL beta-migrante. Además, en sujetos con una elevación mixta de colesterol y triglicéridos es importante la cuantificación de colesterol-LDL para una correcta diferenciación. La segunda área mayor donde el sistema de tipificación tiene limitaciones es la genética. No se consideran genéticamente, determinados tipos de hiperlipoproteinemia; las determinaciones de lípidos y lipoproteínas no pueden proveer el diagnóstico de un desorden genético específico en un solo paciente, hay evidencias crecientes de una fuerte heterogeneidad en los patrones lipoprotéicos en parientes en primer grado de familias con hiperlipidemia familiar monogénica. La tercera área que este sistema de tipificación no cubre, es la evaluación en la clasificación de la alfa-lipoproteína. Es conocido que la baja concentración de colesterol-HDL es un factor de riesgo independiente para enfermedades coronario cardíacas, y anormalidades genéticas como las hipoalfalipoproteinemia, aunque raras existen. Finalmente el presente sistema electroforético está limitado en su posibilidad para resolver otras fracciones lipoproteicas inusuales tales como variantes lipoproteicas, VLDL beta migrante, e IDL.

De lípidos a lipoproteínas: consideraciones de laboratorio En la transformación de hiperlipidemia a hiperlipoproteinemia, los análisis de lípidos y la prueba de refrigeración nocturna pueden ser usados para determinar el perfil de lipoproteínas con un justo grado de exactitud. Si el plasma es claro, los triglicéridos probablemente son normales o casi normales (menos de 2000 mg/L). Cuando los triglicéridos aumentan alrededor de 3000 mg/L o más, la apariencia del plasma es usualmente de opalescente a turbio y no es lo suficientemente translúcido como para permitir la lectura clara de un impreso a través del tubo. Cuando los triglicéridos plasmáticos están por encima de 10.000mg/L, el plasma es usualmente opaco o lechoso (lipémico, lactescente). Si los quilomicrones están presentes luego de una incubación nocturna a 40o C se puede observar una capa homogénea cremosa flotando sobre la superficie del plasma. Como está resumido en la Fig. 33-8, un plasma uniformemente opaco usualmente corresponde a hiperprebetalipoproteinemia. Una muestra de plasma opaco con una capa superior cremosa usualmente corresponde a una forma mixta de hiperlipoproteinemia. Una capa fina cremosa de quilomicrones con un plasma infranadante generalmente claro es usualmente consistente con un perfil de hiperquilomicronemia. En pacientes con hipercolesterolemia sin hipertrigliceridemia, frecuentemente con niveles aumentados de LDL, el plasma es claro pero puede tener un tinte amarillo anaranjado 1365

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dado que los carotenos se transportan con las LDL. Luego de una observación visual “simple” se puede efectuar el diagnóstico de anormalidad lipídica en el 90% de los sujetos por cuantificación del colesterol y triglicéridos solamente. La NECP ATP recomendó protocolos para los análisis de laboratorios para realizar un asesoramiento más eficaz del riesgo de ECV y detectar anormalidades lipoproteicas comunes, incluyendo medidas de colesterol total ,triglicéridos colesterol LDL y HDL. refs(1197) Estas medidas se pueden realizar en la mayoría de los laboratorios (ver abajo).Técnicas analíticas con mayores demandas técnicas, tales como ultracentrifugación analítica o apolipoproteínas y medidas de subfracciones de lipoproteínas pueden ser necesarias para diferenciar lipoproteínas anormales atípicas: estas son usualmente asequibles en laboratorios altamente especializados. Muy comúnmente, niveles de LDL colesterol son convencionalmente medidos por el uso de ultracentrifugación preparativa pero puede ser estimado en forma más barata y conveniente estimándolo por la fórmula de Friedwald: Triglicéridos LDL colesterol = Colesterol total - ––––––––– + HDL colesterol 5

Esta estimación requiere la medida de colesterol HDL por técnicas de precipitación y es exacta en pacientes con triglicéridos menores de 400mg/L con concentraciones por encima de 400ng/L lleva a inconsistencia de los triglicéridos VLDL, es decir, que la relación colesterol /triglicéridos no permite la división por un número fijo, y la fórmula no puede ser usada con mucha exactitud. Además la hipertrigliceridemia es la mayor causa de las medidas inexactas de colesterol HDL. La razón es que la Apo B contenida en las lipoproteínas ricas en triglicéridos son incompletamente precipitadas, resultando un colesterol HDL con resultados falsamente elevados. Métodos nuevos para colesterol HDL (ver Tabla 33-9) son más robustos y pueden tolerar concentraciones de triglicéridos que excedan 15000 mg/L17 o aún 43000 mg/L (Naito, resultados no publicados) antes de que ocurran interferencias. Usar la electroforesis sola, sin una determinación previa de colesterol y triglicéridos no es lógico por las razones siguientes: 1. Excepto en condiciones muy controladas, los patrones electroforéticos son difíciles de cuantificar consistentemente y así proveer concentraciones relativas o absolutas de las clases de lipoproteínas. Muchas de estas dificultades se relacionan a diferentes intensidades de colorante, problemas de aplicación, y otras variables que son difíciles de controlar en electroforesis. 2. La lipoproteínas Lp (a) frecuentemente aparece como una banda pre-beta en electroforesis pero no asociada con ninguna elevación de triglicéridos.

Hiperlipoproteinemia secundaria En general, la cuantificación de lipoproteínas y su tipificación por si sola no pueden distinguir una forma primaria de una secundaria (ver Tabla 33-2). Aún en el diagnóstico de enfermedades concurrentes como parece ser la causa de las hiperlipoproteinemia secundarias no se ha establecido precisamente si esta es la causa de la hiperlipoproteinemia del paciente. 1366

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Inversamente acompañando el tratamiento de la causa sospechosa del desorden de la anormalidad lipídica, es preciso determinar la naturaleza secundaria de la hiperlipoproteinemia. De ocurrir fallas en esta reversión significaría que la hiperlipoproteinemia puede ser primaria indicando la necesidad de un estudio familiar. Algunas enfermedades fueron obviamente asociadas con hiperlipoproteinemia desde la historia y examen físico del paciente. Otras requieren estudios de sangre y orina para el diagnóstico. Si en este tamizaje no se revelan anormalidades, es razonable asumir que el paciente tiene una hiperlipoproteinemia primaria. La hiperlipoproteinemia se establecerá como familiar en su origen dependiendo de los resultados del estudio familiar. Otras formas de dislipoproteinemias En las enfermedades lipoproteicas familiares discutidas en este capítulo, una o más de estas cuatro fracciones (quilomicrones, VLDL, VLDL beta-migrante, y LDL) están presentes en concentración elevada. Sin embargo hay además otras anormalidades lipoproteicas ha ser vistas. Hay tres desórdenes genéticamente determinados en los cuales una o más familias de lipoproteínas están ausentes del plasma o se encuentran en concentraciones extremadamente bajas.ref(1198) El primero que ha sido encontrado es la abetalipoproteína en la cual quilomicrones, VLDL y LDL, se pierden. El probable defecto hereditario es el que comprendería la síntesis de la mitad proteica de la LDL, Apo B. Otra enfermedad es la hipobetalipoproteinemia (deficiencia familiar LDL), en la cual no se pierde lipoproteínas pero la concentración de LDL está muy por debajo de la normal. En el tercer desorden, la hipoalfalipoproteinemia familiar la HDL circula pero contiene cantidades anormales de las dos apolipoproteínas de las HDL. El probable locus afectado por esta rara mutación produce un defecto en la síntesis de Apo-A1. Con esta lipoproteína de alta densidad anormal, pacientes con la enfermedad de Tangier tienen baja concentración de HDL, almacenan ésteres de colesterol en muchas partes de organismo y tienen neuropatías por razones no aclaradas. Hay grandes amígdalas anaranjadas que forman parte de este síndrome. Todas estas enfermedades son usualmente detectables inicialmente por una manifestación común de hipocolesterolemia. Por último aunque no clasificada como dislipoproteinemia, la hiperalfalipoproteinemia es una condición en la cual la HDL se encuentra elevada en sangre por encima de las dos desviaciones estándar para una determinada edad y sexo. Esta condición está bajo influencias genéticas, y estas personas parecen tener una vida más larga que aquellas con concentraciones "normales" de HDL. No hay otros síntomas asociados con características de estas lipoproteínas. Se hará más abajo una discusión más detallada sobre estas anormalidades lipoproteínas. Abetalipoproteinemia. Este raro desorden abetalipoproteinemia tiene cinco características básicas: concentración en plasma no detectable de LDL, mala absorción de grasas, acatocitosis pigmentosa retinal, y enfermedad atáxica neuropática. Esto no es específico de esta condición lipoproteica. La acantocitosis puede presentarse en otras enfermedades en las cuales las lipoproteínas no son deficientes. En la abetalipoproteinemia la LDL está ausente, no meramente deficiente. El colesterol plasmático no excede los 800 mg/L y en general no por encima de 300 mg/l. Esto se acompaña por concentraciones de triglicéridos menores que en 1367

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cualquier otra enfermedad, usualmente por debajo de 200 mg/L. La concentración total de fosfolípidos es también baja, es menor de 1000 mg/l. Tanto la distribución de fosfolípidos como la composición de ácidos grasos de los lípidos plasmáticos es anormal y se reflejan frecuentemente con anormalidades similares en los eritrocitos y tejido adiposo. Los problemas gastrointestinales de estos pacientes con abetalipoproteinemia son típicos. La mala absorción de grasa está presente desde el nacimiento, y el periodo neonatal se caracteriza por poco apetito vómitos, pérdida voluminosa de materia fecal, y poco aumento de peso. Las manifestaciones neuromusculares de la abetalipoproteinemia son devastadoras. Las causas de las anormalidades neuromusculares de la abetalipoproteinemia no son claras. La atención se ha dirigido a la cantidad anormal de un pigmento ceroide (Lipofucsina) en este desorden en el cerebelo y otros tejidos. En la abetalipoproteinemia hay un disturbio funcional del transporte graso. Los quilomicrones no entran en el plasma y el transporte neto de glicéridos endógenos en las VLDL parece estar ya sea ausente o llevado a un incambiable mínimo nivel. Una alimentación pesada con carbohidratos durante días produce un aumento brusco de los niveles plasmáticos de glicéridos y en las VLDL en los pacientes con la enfermedad de Tangier y en casi todos los otros sujetos, faltando esto en los pacientes abetalipoproteinemia. El defecto de la abetalipoproteinemia no es conocido. Lo más probable es una falla en la síntesis de Apo B. El punto de unión intracelular de la lipoproteína conteniendo Apo B es otro posible sitio de disfunción, o puede posiblemente estar ligado al proceso de secreción. Cualesquiera de estos pueden ser primarios, ninguno de estos defectos permiten explicar las muchas manifestaciones secundarias de la enfermedad. El diagnóstico de la abetalipoproteinemia puede efectuarse en pacientes con una de las anormalidades listadas al comienzo de la sección. Se puede pensar en una disglobulinemia producida por anticuerpos anti LDL. La prueba de laboratorio aislada más importante para el diagnóstico es la determinación del colesterol plasmático. El hallazgo de un valor subnormal, particularmente toda concentración por debajo de 1000 mg/l, debe ser seguida por una determinación de triglicéridos y una electroforesis de lipoproteínas. El diagnóstico definitivo depende de la demostración inmunoquímica de ausencia de LDL y ApoB en el plasma. En todos los pacientes diagnosticados es también importante verificar, y en todos los heterocigotos obligados la concentración de LDL por análisis inmunoquímicos o por ultracentrifugación. En la hipobetalipoproteinemia familiar, los heterocigotas presentan concentraciones de LDL y Apo B más bajas de la normal. Hipobetalipoproteinemia. Existe otro trastorno genético aparentemente no relacionado a la abetalipoproteinemia, la hipobetalipoproteinemia, en la cual la concentración de LDL en plasma es aproximadamente una décima parte de la normal. Esta anormalidad lipoproteica se hereda como rasgo autosómico dominante. La concentración plasmática total de colesterol puede ser tan baja como la observada en la abetalipoproteinemia. El porcentaje de colesterol esterificado puede estar en el rango normal. Los niveles de triglicéridos pueden encontrarse dentro del intervalo normal, pero a veces se hallan por debajo del límite inferior. Las concentraciones de fosfolípidos pueden variar entre 100 y 1800mg/l y usualmente se hallan en los límites normales inferiores en la mayoría de los pacientes. La concentración de vitamina A y E son normales o bajas; aunque están reducidas nunca alcanzan los niveles observados en la 1368

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abetalipoproteinemia. En la electroforesis es posible observar una tenue banda betalipoproteica. La concentración de HDL, determinada por precipitación, ultracentrifugación preparatoria o ultracentrifugación analítica, es normal; las VLDL habitualmente exhiben una pequeña reducción. Las LDL se encuentran presentes en el suero cuando se lleva a cabo la prueba de inmunoprecipitación. Estas determinaciones han sugerido la presencia de concentraciones de LDL de 8 a 16 menores que las normales. Hipoalfalipoproteinemia o analfalipoproteinemia. La enfermedad de Tangier (deficiencia familiar de HDL) se caracteriza por una severa deficiencia o ausencia de HDL normal en el plasma y por la acumulación de ésteres de colesterol en muchos tejidos del organismo, incluyendo hígado, bazo, nódulos linfáticos, timo, mucosa intestinal, piel y córnea. Existe una combinación de dos manifestaciones que es patognómica: una concentración reducida de colesterol en combinación con niveles normales o elevados de triglicéridos y la presencia de amígdalas y tejido adenoide de coloración anaranjada o amarillenta. Algunos pacientes pueden padecer una neuropatía periférica. La escasa cantidad de HDL difiere cualitativa y cuantitativamente de las HDL normales, en particular en el contenido de apolipoproteína (Apo A-1). Este trastorno parece ser atribuible a un gen autosómico recesivo que afecta la síntesis o catabolismo de las HDL. Los heterocigotos en familias conocidas de heterocigotos usualmente pueden ser identificados por una concentración reducida de HDL (50% por debajo de lo normal), y no exhiben neuropatía ni acumulación de ésteres de colesterol. Entre los estados de deficiencia lipoproteica, la combinación de una concentración muy reducida de colesterol y la elevación de los niveles de triglicéridos confiere a la enfermedad de Tangier una característica única. Algunos pacientes pueden mostrar niveles normales de triglicéridos en el estado de postabsorción y superficialmente pueden asemejarse a aquellos con una deficiencia de LDL. Los niveles plasmáticos de colesterol oscilan entre aproximadamente 400 y 1250 mg/L, dentro de los límites también detectados en la abetalipoproteinemia y la hipobetalipoproteinemia. Las variaciones individuales de los niveles plasmáticos de triglicéridos son considerables y dependen en gran medida de la dieta. La sustitución de hidratos de carbono por grasas a menudo disminuye la concentración plasmática de triglicéridos en este trastorno. El patrón de las lipoproteínas plasmáticas es distintivo: la banda de la alfa-lipoproteína está ausente independientemente del medio de soporte utilizado. La inmunoectroforesis puede generar ocasionalmente una banda débil de precipitación con movilidad de alfa globulina utilizando un suero anti-HDL. Un método sumamente útil para detectar la escasa cantidad de apoproteínas A consiste en la inmunodifusión del plasma con inmunosueros específicos contra la Apo AI y AII. La reactividad con la Apo AII es generalmente mayor que con la Apo AI. La estimación del contenido en colesterol de las lipoproteínas plasmáticas después de la ultracentrifugación preparatoria secuencial o después de la ultracentrifugación y precipitación selectiva con heparina-manganeso confirma la escasez de HDL. Además de la ausencia o deficiencia de HDL, Las siguientes enfermedades deben ser descartadas: 1. Deficiencia familiar de LCAT. En este caso la HDL está muy reducida, pero los niveles plasmáticos de colesterol son normales o elevados y la mayor parte de colesterol no está esterificado. 1369

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2. Enfermedad hepática obstructiva donde los niveles plasmáticos de HDL y de apoproteína A pueden encontrarse reducidos hasta valores similares a los detectados en la enfermedad de Tangier. En esta enfermedad el colesterol sanguíneo no está reducido sino elevado y la mayor parte de colesterol no está esterificado. Las apropiadas pruebas funcionales hepáticas permiten el diagnóstico correcto. 3. Malnutrición severa o enfermedad parenquimatosa hepática, en las que las lipoproteínas de elevada densidad están reducidas. La disminución del colesterol también se asocia con la disminución en los niveles de triglicéridos y LDL. 4. Deficiencia adquirida de HDL atribuible a una disglobulinemia, incluyendo un posible desarrollo de anticuerpos anti-HDL. 5. Otros trastornos del almacenamiento asociados con la presencia de células espumosas y hepatoesplenomegalia. En estas condiciones, los niveles de HDL, son más elevados que los detectados en la enfermedad de Tangier y las anormalidades tonsilares están ausentes.

Consecuencias Clínicas de la Hiperlipidemia ¿Cuál es la importancia clínica de la hiperlipidemia y de la hiperlipoproteinemia?. La hiperlipidemia suele ser un estado bioquímico que, si perdura durante un tiempo suficientemente prolongado puede estar asociado con el desarrollo de ateroesclerosis y sus complicaciones; incluyendo infarto de miocardio y enfermedades vasculares. En ocasiones la hiperlipidemia puede asociarse con síntomas francos específicos, directamente atribuibles a la presencia de hiperlipidemia. Por ejemplo, la aparición de dolor abdominal pancreatitis, y las manifestaciones cutáneas de la hiperlipidemia, tales como xantomas, arco corneal y xantelasmas. Enfermedad coronaria. arterial (ECA) La ECA es casi siempre el resultado de la ateroesclerosis con endurecimiento de las arterias. La ateroesclerosis es principalmente el resultado de la acumulación de depósitos grasos en las paredes de las arterias coronarias, lo que lleva a la formación de tejido fibroso en la pared del vaso. La ECA es el tipo más frecuente de enfermedad cardíaca y la principal causa de muerte en los Estados Unidos y en muchos otros países. En los Estados Unidos se estima que el 50% de las muertes anuales de adultos se producen por ECA.ref(1199) La ECA afecta a los hombres de mediana edad; casi el 45% de todos los ataques cardíacos ocurren en individuos menores de 65 años. La enfermedad coronaria cardíaca (ECC) se desarrolla en hombres de 60 años de edad o más jóvenes con una relación de aproximadamente el doble que las mujeres, mientras que las mujeres postmenopáusicas a la misma edad tienen una más alta incidencia de ECC que las premenopáusicas.ref(1200) Tanto para hombres como para mujeres, la incidencia de enfermedad coronaria vascular (ECV) y la tasa de mortalidad por ateroesclerosis aumenta con el avance de la edad. Alrededor del 75% de la mortalidad relacionadas a las coronarias son el resultado de la ateroesclerosis. Cada año alrededor de 1.25 millones de Americanos se afectan con infarto de miocardio (MI), y se realizan alrededor de 300,000 operaciones de bypass.ref(1201) Se estima que el costo anual de 1370

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ECC para la población americana es aproximadamente entre U$42 billones a U$ 88 billones.ref(1202) Factores de riesgo asociados con enfermedad arterial coronaria. Aunque la causa básica de la EAC es desconocida; los científicos han logrado identificar una serie de factores asociados con un claro incremento de las probabilidades de desarrollar un ataque cardíaco en etapas ulteriores de la vida.refs(1203) Estos factores, que se pueden correlacionar con la presencia de EAC, han sido denominados factores de riesgo. En el recuadro se enumera los riesgos primarios y secundarios asociados con enfermedad coronario arterial. Algunos factores de riesgos, son inevitables, como la susceptibilidad racial o genética, mayor prevalencia en hombres, y las probabilidades de sufrir un ataque cardíaco a medida que se envejece. Muchos de los factores de riesgo son, sin embargo susceptibles de modificación. Entre ellos son particularmente importantes la hipertensión, el tabaquismo y el colesterol elevado. Aproximadamente un 50% de los individuos que sufren un ataque cardíaco, son personas que tienen uno o más de estos tres factores. De acuerdo a los datos de Framingham, hay un claro gradiente de tasa de incidencia en relación con la concentración de HDL-colesterol sérico. Personas con niveles por debajo de 350 mg/L muestran una tasa de enfermedad coronaria equivalente a ocho veces que la correspondiente a personas con HDL-colesterol por encima ce 650 mg/L. Un importante factor de riesgo adicional incluye a la lipoproteína (a) (Lpa), oxidación de LDL, partículas lipoproteicas de tamaño pequeño (o LDL densas), fibrinógeno, homocisteina, isoformas de apolipoproteínas específicas (Apo) A-I, B, E, y triglicéridos y remanentes de lipoproteínas ricas en triglicéridos.refs(1204) El grado de riesgo aún no ha sido asignado a estos, factores. Otros posibles factores cuya importancia se está aun estableciendo incluyen hipertrigliceridemia, niveles de actividad física y tipos de personalidad.

Formación de Placas Ateroescleróticas La arquitectura de los vasos sanguíneos (arterias) sanos consiste en una íntima, recubierta interiormente por el endotelio, constituyendo la luz del vaso, la cual está unida por la lámina elástica interna a la media (Fig. 33-9). La capa más externa es la adventicia, que esta unida a la lámina externa elástica y al exterior del mismo vaso. La intima es el sitio en el que se forma la lesión aterosclerótica. El endotelio sirve como una barrera para los materiales que lleva la sangre y es el sitio donde al menos dos mitógenos se sintetizan y secretan (ver más adelante). La túnica media es la pared muscular de la arteria que consiste en células musculares lisas retenidas juntas por una membrana basal discontinua y por intercalado de fibras de colágeno y proteoglicanos.refs(1205) Las células del músculo liso que proliferan en la íntima arterial para formar las lesiones avanzadas de aterosclerosis se originan en la media. Esta proliferación de la célula del músculo liso representa el sine qua non de las lesiones de aterosclerosis avanzada. Las células del músculo liso, como el endotelio y los fibroblastos, contienen receptores para LDL y PDGF (ver bajo). Un aspecto característico de las células del músculo liso que se encuentran ,en las lesiones de aterosclerosis es la acumulación de lípidos que resulta en la formación de células altamente vacuolizadas o células espumosas. Hay tres etapas progresivas en la formación de la placa ateroscleróticas: (1) las estrías lipídicas, las que gradualmente desarrollan en lesiones sobresalidas, que son llamadas placas 1371

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grasas; (2) la placa fibrosa, que tiene una proliferación de células de músculo liso con un casquete fibroso rico en colágeno que cubre al núcleo lipídico que está limitado por las células espumosas y rodea una acumulación amorfa extracelular de ésteres de colesterol; y (3) la lesión complicada, que puede mostrar calcificación, hemorragia, ulceración (ruptura), y trombosis (Fig.33-10). Es la lesión complicada que frecuentemente subyace el evento clínico agudo de oclusión arterial que conduce al daño de miocardio (MI). La formación y acumulación de células espumosas en la íntima es el sello de calidad de la lesión ateroscleróticas temprana. Actualmente se cree que la mayoría de las células espumosas son derivadas desde los macrófagos enviados desde la sangre aunque algunas pueden venir desde las células del músculo liso. Un paso fundamental en el desarrollo de las células espumosas es la captación acelerada de LDL modificada (ver mas adelante bajo), seguido por proliferación de células de músculo liso (con y sin depósitos de lípidos en sus citoplasmas) (Fig. 33-11). La proliferación de la célula del músculo liso está acompañada por una síntesis aumentada de elastina celular, colágeno, y proteoglicanos, que estas células depositan extracelularmente en el desarrollo de la placa. El desarrollo de la lesión ateroscleróticas es promovido por la secreción de dos células sanguíneas claves, macrófagos y plaquetas. Los macrófagos pueden secretar agentes quimiotácticos (como interleiquina-1, anión superóxido, leucotrieno B 4) y factores de crecimiento (como factor de crecimiento derivado plaquetario (conocido más ampliamente por su acránimo en inglés, PDGF), interleuquina-1, factor de crecimiento fibroblasto, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante- ). Estos dos grupos de factores derivados de los macrófagos son probablemente responsables de la promoción de la proliferación de tejido conectivo en los vasos sanguíneos durante el proceso de enfermedad.ref(1206) Las plaquetas juegan un rol pequeño en algunas lesiones ateroscleróticas, sin embargo juegan un rol principal en la formación del trombo. Esto es usualmente un mural o trombo oclusivo que conduce a un MI. Las plaquetas puede también producir los mismos factores de crecimiento como macrófagos activados. Así, en los sitios de daño en los que ocurre la exposición de colágeno, estimulando y proliferando las respuestas numerosos vasoactivos, pueden tomar lugar y probablemente jueguen un rol en la iniciación de las lesiones ateroscleróticas. La etapa bioquímica inicial en la proliferación celular, es la infiltración de lipoproteínas (VLDL remanentes, LDL, y IDL) en el espacio subendotelial. Aquí algunas lipoproteínas son atrapadas en la sustancia conectiva intima, modificadas, e ingeridas por los macrófagos para formar células espumosas. La toma de LDL por los macrófagos puede ser incrementada si la LDL es modificada por oxidación o degradación de Apo B por radicales oxígeno reactivo (como radicales libres), o por modificación de la Apo B por glucosilación o por reacción con malonaldehído.ref(1207) (Fig. 33-12) Los macrófagos cargados de grasa, junto con un variado número de células del músculo liso cargadas de lípidos, son las que desarrollan las vetas grasas. La mayoría de los lípidos en las células espumosas son colesterol libre y ésteres de colesterol. Las estrías lipídicas son observadas tempranamente en la niñez, y sus transformaciones en las lesiones complicadas usualmente ocurren entre la cuarta y quinta década antes de la manifestación clínica de la enfermedad sean evidentes, incluyendo angina pectoris, MI o 1372

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muerte cardíaca súbita.ref(1208) En hombres, el primer evento MI usualmente ocurre alrededor de los 55 años, mientras que en mujeres hay 10 años de demora, ocurriendo alrededor de los 65 años. Este proceso aterosclerótico puede ser acelerado por tener (1) factores de riesgo adicional ECC (ver mas adelante), (2) daño endotelial, que remueve la barrera natural a la entrada de lipoproteínas en la pared arterial o causa trombosis, y (3) una predisposición genética para hipercolesterolemia primaria. Etiología de las lesiones ateroscleróticas Los conceptos actuales sobre las patogénesis de las lesiones ateroscleróticas incluyen: la respuesta al daño y la hipótesis monoclonal. La primer teoría se centra en la premisa que ocurre un daño inicial a la célula endotelial alineada a la pared arterial. El daño endotelial, causado por factores mecánicos, químicos, inmunológicos, tóxicos, o infecciosos, resulta en un aumento de la toma de LDL colesterol. Esto, a la vez, cambia las características de superficie de las células endoteliales y la circulación de leucocitos (monocitos y plaquetas), conduciendo a favorecer la adhesión de monocitos al endotelio.ref(1209) Los monocitos son entonces transformados en macrófagos, que ahora tienen la habilidad de tomar lípidos adicionales. De acuerdo con Steinberg et al.,ref(1210) la oxidación del LDL puede jugar un rol central en la aterogénesis en por lo menos cuatro caminos (Fig. 33-13): (1) actúa como un quimiotáctico para los monocitos circulantes en la sangre para entrar al espacio subendotelial; (2) causa la transformación de los monocitos en macrófagos; (3) atrapa los macrófagos en los espacios endoteliales por inhibición de su motilidad; y (4) es tóxico para las células endoteliales. El macrófago cargado de lípido forma la célula espumosa que contribuye al desarrollo de la estría lipídica. También, estos macrófagos activados pueden formar por lo menos cuatro factores de crecimiento diferentes, los que pueden ser responsables de la migración de las células del músculo liso y fibroblastos dentro de la íntima y para su subsiguiente proliferación. En esta hipótesis las plaquetas por agregación están involucradas en la ateroesclerosis formando trombos murales en particular en sitios anatómicos donde el flujo sanguíneo por efectos de rozamiento puede causar cierto injuria sobre el endotelio. Este mecanismo produce una liberación de factores de crecimiento (similares a los que se liberan por activación de macrófagos) lo que puede llevar a la proliferación de lesiones ateroscleróticas del músculo liso. También se debe mencionar que otros factores hemostáticos se han sido estudiados y han mostrado tener una razonable asociación con la enfermedad cardiaca isquémica (ECI).ref(1211) Estos factores incluyen fibrinógeno, factor VII, factores VIII, antitrombina III, plasminógeno activador inhibidor I, Lp(a), y anticuerpos antifosfolípidos. De estos diversos factores trombogénicos, el más convincente como factor de riesgo independiente para ECV ha sido el fibrinógeno plasmático. El estudio Northwick Park Heart ref(1212) señala que la incidencia de ECI está mas fuertemente relacionada a los niveles de fibrinógeno que al de la concentración de colesterol total. El estudio de Leighref(1213) también concluye que la asociación entre la concentración de fibrinógeno y ECI es mas alta que la de colesterol total, la presión sanguínea y el tabaquismo. Los posibles mecanismos del rol del fibrinógeno como factor de riesgo trombogénico incluye su función como precursor de la fibrina y la consecuente trombosis y su efecto sobre la viscosidad sanguínea, el cual afecta el flujo hemodinámico, característica que lleva a la trombosis. La segunda hipótesis asociada con la aterogénesis es la hipótesis monoclonal. Esta 1373

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premisa está basada en una sola célula muscular lisa que sirve como fuente de todas las células dentro de la lesión. El neoplasma benigno de la pared arterial se deriva de una célula la que ha sido transformada por virus, sustancias químicas, toxinas u otros mutágenos.

El Programa Nacional de Educación para el Colesterol Al final de la década de los 80, los profesionales de la salud descubrieron que era necesario un esfuerzo unificado para estandarizar las propuestas para la detección y clasificación de individuos con alto riesgo de CDH y para estandarizar los tratamientos y el monitoreo de dichos individuos. Este esfuerzo requería también una mayor fuerza educacional para informar a los médicos generales y a sus pacientes con factores de riesgo de CDH. Para alcanzar esta meta científica y educacional, el gobierno federal y un gran espectro de grupos de profesionales de la salud trabajaron juntos para establecer lineamientos y recomendaciones con la intención de reducir CDH en América. Esta campaña nacional fue denominada Programa Nacional de Educación para el Colesterol (NCEP). Como resultado de este esfuerzo, el NIH en 1985ref(1214) y en 1988 (El Panel de Tratamiento de Adultos de NIH [ATP] de la NCEP) recomendó nuevos niveles de decisión médica para el colesterol y colesterol LDL que debería tener un mayor efecto en la reducción de la morbilidad de ECC y la mortalidad en los Estados Unidos, donde el ECC es todavía una enfermedad principal. Para simplificar el sistema de clasificación y para hacer más conveniente de recordar los niveles de corte, el panel eliminó la estratificación por edad y sexo antes recomendado.ref(1215) Estos nuevos niveles de corte, mostrados en la Tabla 33-4, se aplican a todos los adultos de 20 años o mayores.refs(1216) El objetivo del programa de NCEP era establecer un criterio que definiese la persona con alto riesgo para intervención médica y para proporcionar claros lineamientos en la forma de cómo detectar, determinar objetivos, tratar, y monitorear estos pacientes en el tiempo. Algunos de los aspectos fundamentales de este reporteref(1217) guía sobre colesterol son los siguientes: Todos los adultos de 20 años o más deben ser monitoreados para hipercolesterolemia midiendo su nivel de colesterol sanguíneo. Luego que un incremento de colesterol total es confirmado a partir de medidas repetidas, el colesterol LDL y HDL deben ser determinados. Son definidos nuevos límites superiores más agresivos de colesterol total y LDL para una estrategia medicinal preventiva primaria (Tabla 33-4). El colesterol LDL y no el colesterol total servirá como el índice principal para clasificar el riesgo de ECC en una persona. Junto con las pruebas de lípidos y lipoproteínas, todos los adultos deberían también ser evaluados para la presencia de otros factores de riesgo para ECC (fumar, diabetes mellitus, obesidad severa, o una historia de ECC en el paciente, o un ECC prematuro en miembros familiares, o enfermedad cerebrovascular definitiva o vascular periférica oclusiva). El paciente es considerado que tiene un estado de alto riesgo si el o ella tiene (1) ECC definitivo (eso es, infarto de miocardio primario o isquemia miocárdica), o (2) la presencia de dos o más factores de riesgo de ECC, o (3) una anormalidad en 1374

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lípidos o lipoproteínas con la presencia de otro factor de riesgo de ECC. La selección de modalidades de intervención terapéutica (eso es, dieta con agentes para disminuir el colesterol), objetivos de tratamiento, y métodos de monitoreo han sido claramente señalados. Un reporte posteriorref(1218) fue publicado con modificaciones para los lineamientos recomendados. En pocas palabras se agregó lo siguiente: Incrementado énfasis del estado de riesgo de ECC como una guía para el tipo y la intensidad de una terapia de reducción de colesterol. Especial énfasis se le ha dado al paciente con ECC y otras enfermedades ateroescleoroticas, lo que se consideró el riesgo mas alto y se establecieron valores blanco de LDL más bajos. La edad (45 años o más para hombres y 55 años o más para mujeres) fue agregada a la lista principal de factores de riesgo de ECC (Tabla 33-5). Retardar el uso de agentes farmacológicos para la terapia de lípidos y lipoproteínas en la mayoría de hombres jóvenes adultos y mujeres premenopáusicas con elevados niveles de colesterol LDL. Acrecentar el reconocimiento de mujeres postmenopáusicas de alto riesgo y pacientes ancianos de alto riesgo que están en buen estado de salud y que son candidatos para la terapia de reducción de colesterol. Más atención al colesterol HDL como un factor de riesgo de ECC, que incluye su medición en las determinaciones de colesterol inicial. Un alto nivel de colesterol HDL (mas de 600 mg/L) ha sido designado como un factor negativo de riesgo de ECC, mientras que un bajo colesterol HDL (menos de 350 mg/L) ha sido designado como un factor positivo de riesgo de ECC (Tabla 33-6). Además, cuando estamos seleccionando una droga para la reducción de colesterol LDL, se debe considerar el efecto de la droga en el colesterol HDL del paciente. Se incrementa el énfasis en la actividad física y pérdida de peso como componentes de la terapia dietaria de alto colesterol sanguíneo. Debe ser enfatizado que la estrategia de NCEP ATP está basada en colesterol LDL y colesterol HDL siendo estos los criterios iniciales usados para la clasificación de pacientes con riesgo de ECC, dependiendo también de otros factores (Tabla 33-5) que pueden influenciar en la categorización final de riesgo. El panel NIH experto en niveles de colesterol sanguíneo en Niños y Adolescentesref(1219) recomendó lo siguiente (ver Tabla 33-7): “Tamizaje” selectivo de niños de alto riesgo y adolescentes que tienen una historia familiar de enfermedades cardiovasculares prematuras o por lo menos un padre con alto colesterol sanguíneo (mas de 2400 mg/L). La selección es también aplicada sí los padres o abuelos, a los 55 años de edad o menos atravesaron diagnósticos de arteriografía coronaria y se les detectó aterosclerosis. Esto incluye padres y abuelos que han sufrido angiaplastia o cirugía bypass de arterias coronarias. Esto también incluye padres o abuelos que sufrieron una MI documentado, una angina pectoris, una enfermedad vascular periférica, una enfermedad cerebro vascular o una muerte cardíaca súbita. 1375

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No fue defendida el tamizaje universal de niños y adolescentes para alto colesterol en sangre. Los objetivos mínimos para el tratamiento de pacientes con una valor límite de colesterol LDL es disminuir dicho nivel a menos de 1100 mg/L y para el paciente con alto colesterol LDL es disminuir el nivel a menos de 1300 mg/L. La terapia con drogas no debe ser usada en niños menores de 10 años de edad y para aquellos a los cuales no se les ha sometido a una adecuada dieta para bajar el colesterol de por lo menos 6 meses a 1 año. Los factores de riesgo positivos o negativos de ECC son usados como una guía para el tipo e intensidad de terapia que debe ser usado por el médico general para disminuir el colesterol (Tabla 33-5). Por ejemplo un hombre mayor de 45 años o una mujer mayor de 55 años está en mayor riesgo de ECC y debería ser tratado mas agresivamente. Por lo tanto los objetivos para disminuir los niveles séricos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y colesterol total son más intensivos. Debe remarcarse que una persona con dos o más factores positivos de riesgo señalados en la Tabla 33-5 adicionado al valor de colesterol LDL debería ser clasificado como un individuo de alto riesgo para ECC. Debe tenerse en cuenta que un valor alto de colesterol HDL (mayor de 600 mg/L) representa un factor de riesgo de carácter negativo. Las estrategias de tratamiento todavía se concentran en disminuir el alto nivel de colesterol LDL sanguíneo para proporcionar una prevención primaria de ECC. EL algoritmo de la modalidad de pruebas y tratamiento para la prevención primaria en adultos sin evidencia de ECC se muestra en las Figs. 33-14 y 33-15. Por ejemplo, para una persona con una cantidad de colesterol total deseable (< 2000 mg/L) el valor de colesterol HDL determina la estrategia a seguir. Si el colesterol HDL está en los 1600 mg/L) y aquellos con límite de alto riesgo que tienen dos o más factores de riesgo deben ser evaluados clínicamente y deben comenzar una terapia activa para disminuir el colesterol. Para una prevención secundaria de la enfermedad en adultos con evidencia de ECC o con otra enfermedad clínica aterosclerótica, se analizan las lipoproteínas, y se determina la concentración de colesterol LDL es el índice clave para la clasificación de terapia y riesgo de ECC. Para una prevención secundaria la concentración óptima de colesterol LDL es < 1000 mg/L, un objetivo más agresivo que el de la prevención primaria. Las personas en esta categoría con niveles de colesterol LDL > 1000 mg/L deben tener un seguimiento clínico apropiado y deben comenzar una terapia de disminución de colesterol. Para alcanzar estos objetivos de colesterol LDL descritos en las Tablas 33-4, 33-6 y 33-7, se remarca que la terapia debe siempre comenzar con una intervención dietaria. La pérdida de peso (si corresponde) y actividad física deben ser parte del proceso de intervención. Si persisten elevados los niveles de colesterol LDL luego de la dieta apropiada, se debe considerar la intervención con drogas. El reporte de NCEP es muy específico a cuando se debe aplicar la terapia con drogas (Tabla 33-8). Además, el reporte recomienda retardar el uso de drogas en la mayoría de hombres jóvenes adultos (menores de 35 años de edad) y en mujeres premenopáusicas con concentraciones de colesterol LDL por debajo de 2200 mg/L las cuales no están de otra manera en riesgo. Un error común en la clasificación del riesgo de ECC en un paciente es la no diferenciación de las dislipidemias primarias de las secundarias. Algunas de las más frecuentes dislipidemias secundarias se encuentran en la Tabla 33-2. Es imperativo que se trate primero la condición que lleva a la hiperlipidemia secundaria.

Métodos de Análisis Colesterol Hebert K. Naito

Principios de análisis y uso corriente Diversas críticas que describen la utilidad y limitaciones de diferentes métodos de colesterol se encuentran disponibles.refs(1220) En la rutina de laboratorio practicada hoy, sin embargo la determinación de colesterol por medio de ensayos enzimáticos son virtualmente los únicos métodos empleados. El método de análisis de colesterol más antiguo todavía en uso es el de Liebermann-Burchard (L-B)ref(1221) (Tabla 33-9, método 1). Un intenso color verde azulado es producido como resultado de la reacción entre anhídrido acético y ácido sulfúrico, con una solución de colesterol en cloroformo. Esta reacción se transformó en la base para subsecuentes métodos para la medición de colesterol. La reacción química responsable del cambio de color en los métodos colorimétricos es la oxidación progresiva del colesterol. Las modificaciones al procedimiento L-B permitieron la medición de colesterol libre, éster de colesterol, o ambos. La medición de estas diferentes fracciones puede ser realizada por medio 1377

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de una saponificación (hidrólisis de una unión éster) con el uso de un compuesto de saponina, tal como digitonina. La digitonina reacciona con el colesterol no esterificado y forma un precipitado. La medición del colesterol remanente en el sobrenadante proporciona una estimación del colesterol esterificado. Se calcula el colesterol libre sustrayendo el valor de colesterol esterificado del colesterol total, que es medido directamente, sin el uso de la digitonina. El método L-B tiene muchas desventajas que pueden afectar los resultados adversamente. Por ejemplo la intensidad de color producida por el colesterol esterificado es mucho mayor que el producido por el colesterol no esterificado, o colesterol libre. Por lo tanto es necesario el paso de saponificación para asegurar que las concentraciones de colesterol total no son sobrestimadas por la predisposición positiva causada por la presencia de ésteres de colesterol. Un aumento en la medida de colesterol puede ocurrir en presencia de: concentraciones de bilirrubina,ref(1222) y Vitamina A aumentadas (retinol), y digitonina sin reaccionar. Además, la precisión del método L-B es fuertemente dependiente de la estricto cumplimento de los tiempos y temperaturas de reacción, y la longitud de onda usada para medir el cambio de color final. Pequeñas variaciones en estos parámetros pueden producir resultados erróneos. El método de referencia para colesterol, utilizado por el centro para el control y la prevención de enfermedades, está basado en la modificación del procedimiento de Abell et allref(1223) (Tabla 33-9, método 2) que, en cambio, es una modificación de la reacción L-B. Este método de referencia involucra la hidrólisis inicial de ésteres de colesterol. El colesterol libre es luego extraído en éter de petróleo, y el desarrollo de color es realizado con el uso de un reactivo formado por ácido acético-anhídrido acético y ácido sulfúrico. Los métodos más comunes en uso para la determinación de colesterol en suero, plasma, o sangre total son los procedimientos enzimáticos (Tabla 33-9, método 3). El primer paso en la secuencia enzimática usa la enzima colesterol esterasa para hidrolizar ésteres de colesterol a colesterol libre. El colesterol libre producido, junto al colesterol libre que estaba presente en la muestra inicialmente, es luego oxidado a colest-4-en-3-ona y H2O2 en una reacción catalizada por colesterol oxidasa. El paso final de este ensayo hace uso de la habilidad del H2O2 para oxidar varios compuestos y producir un producto coloreado, siendo la magnitud del color producido proporcional a las concentraciones de colesterol en la muestra. Muchas reacciones indicadoras de peróxido de hidrógeno que han sido aplicadas, incluidas las de Trinder, están basadas en la formación de un quinonimina coloreada (máximo de absorción, 500nm; Tabla 33-9, método 3a). Una desventaja de esta reacción indicadora es la interferencia ejercida por la bilirrubina.ref(1224) Además, las muestras turbias pueden interferir con las lecturas de absorción y se debe evitar el uso de tubos Tygon pues la quinonimina es absorbida por dicho tubo. También se han desarrollado las reacciones indicadoras espectrofotométricas de ultravioleta, basadas en la formación de NADPH, (Tabla 33-9, método 3b). Otras técnicas que han sido aplicadas para el monitoreo de formación de H2O2 producido por la colesterol oxidasa incluye la oxidación de ácido homovainillilico por parte de H2O2 formando un compuesto fluorescente monitoreado a 470 nm; 40 y el uso de técnica polarográficas para el monitoreo directo de la producción de H2O2.ref(1225) El Panel de Estandarización de Laboratorio (LSP) recomendó los siguientes lineamientos para medidas confiables de colesterol:ref(1226) 1378

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Los objetivos de precisión intralaboratorio deben ser + CV del 3% (coeficiente de variación) o menores y la predisposición analítica (exactitud) debe ser 3% o menos de los valores del método de referencia. La exactitud de cada sistema analítico debe ser verificado por el uso de materiales de referencia certificados por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, Gaithersburg, Md.), El Centro para Control y Prevención de Enfermedad (CDC, Atlanta, Ga.), o el Colegio de Patólogos Americanos (CAP, Chicago, III.) u otro material de referencia que sea atribuible al del Comité Nacional para Sistemas de Referencia Nacionales de Estándares de Laboratorio Clínico para Colesterol (NCCLS, Villanova, Penna; NRS/ Chol). Todos los laboratorios deben participar en un programa de aptitud de pruebas (PT) que provee valores de referencia para colesterol que son atribuibles a los de NCCLS NRS/Chol. Los programas PT deben tener como objetivo un error total de 9.5% o menor (para medidas únicas) para evaluar la pericia de los participantes (precisión y exactitud) en medidas de colesterol. Las decisiones médicas deben estar basadas en por lo menos dos análisis separados, en dos ocasiones separadas, para las medidas de colesterol total y LDL. Los valores de colesterol total deben estar dentro de 300 mg/L antes que sean promediados para fijarlo como un nivel de colesterol usual individual. Se debe estandarizar la preparación del paciente y los procedimientos de recolección de sangre para minimizar los factores preanalíticos que pueden conducir a valores de colesterol inexactos. Especimen Suero, plasma o sangre total son especímenes apropiados para las determinaciones de colesterol. Si se usa plasma o sangre total, el anticoagulante preferido es EDTA (1mg/mL) o heparina. Anticoagulantes como fluoruro, citrato, y oxalato pueden producir errores de dilución como resultado de su efecto osmótico de salida de agua desde los eritrocitos al plasma. Los valores de colesterol plasmáticos son entre 3% y 5% menores que los valores en suero.ref(1227) Se debe recordar que los valores de riesgo de colesterol para enfermedad cardíaca coronaria NECP (ver Tabla 33-4) están basados en suero. Si se usa plasma para el análisis, los valores deben multiplicarse por 1.03 para dar los valores equivalentes de suero.ref(1228) Las muestras para la determinación de colesterol no necesitan ser tomadas de individuos en ayunas. Sin embargo, si las concentraciones de triglicéridos o HDL colesterol van a ser medidas en la misma muestra, la sangre debe colectarse solamente si el paciente tiene un ayuno mínimo de 12 horas. Una vez recolectado, el suero y el plasma deben separarse de los glóbulos rojos lo mas pronto posible. El intercambio de colesterol entre la membrana de glóbulos rojos y el suero o plasma puede alterar las concentraciones de colesterol. Si el análisis ha de ser demorado por varios días, las muestras pueden ser guardadas a 4º C. Para períodos más largos de almacenamiento, el congelado de las muestras a –60º C permite resultados reproducibles hasta un período de un año.ref(1229) Las muestras congeladas a –20º C pueden ser mantenidas por varios meses. Las muestras que han sido mantenidas a temperaturas de congelación deben mezclarse adecuadamente antes del análisis; para revertir 1379

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la separación de varias fracciones de lípidos de acuerdo a sus densidades dentro del espécimen, lo que puede ocurrir con el almacenamiento en un lapso de tiempo. Intervalos de Referencia. Los intervalos de referencia para las concentraciones de colesterol total se basan en un riesgo relativo de desarrollar ECC (ver Tabla 33-4 y 33-7). En la Tabla 33-5 se dan los factores de riesgo positivos y negativos que han sido asociados con el desarrollo de ECC y por lo tanto son parte del esquema de clasificación de riesgo. Las decisiones de diagnóstico y tratamiento (ver Figs. 33-14 y 33-15) están también basadas en la concentración de HDL (ver Tabla 33-6) y LDL (ver Tabla 33-4 y 33-7).

Lipoproteína de alta densidad (HDL) colesterol Hebert K. Naito

Principios de análisis y usos corrientes. Las concentraciones de lipoproteína de alta densidad (HDL) en suero son consideradas uno de los factores de riesgo primarios para enfermedades coronarias.ref(1230) Recientes lineamientos indican que este compuesto debe ser incluido junto con la medición del colesterol total como parte del proceso inicial de testeo de riesgo de enfermedades coronarias. Se debe realizar la medición de HDL como parte de una rutina luego de una intervención farmacológica de hipercolesterolemia. Los objetivos intralaboratorio para la precisión son de un porcentaje de coeficiente de variación (CV%) de < 4%, y los objetivos de exactitud es alcanzar un sesgo de un 10% desde los valores de referencia. Aunque ha sido usada una variedad de técnicas han sido usadas para medir concentraciones de HDL, podemos realizar las determinaciones de HDL en un laboratorio clínico de rutina, usando simple métodos de precipitación. Aunque estas técnicas de precipitación son rápidas y fáciles de realizar, pueden dar resultados altamente dispares cuando son realizadas en diferentes laboratorios. Las diferencias interlaboratorios para la determinación de HDL son altas, con coeficientes de variación que oscilan entre 7% y 25%. El método de referencia para las determinaciones de HDL emplea ultracentrifugación (Tabla 33-10, método 1). Con esta técnica, la muestra a ser analizada es ajustada a la densidad de 1.063 g/mL intercalando el espécimen con una solución de bromuro de potasio. La muestra es luego centrifugada a 105,000g por 24 horas a 16 º C. Como la densidad del HDL es mayor a 1.063 mientras que las lipoproteínas de baja (LDL) y muy baja densidad (VLDL) son menores a 1.063, las fracciones de LDL y VLDL irán a la fracción sobrenadante, mientras que el HDL y un pequeño porcentaje de lipoproteínas con densidades mayores a 1.063 irán a la solución infranadante. La presencia de estas pequeñas cantidades de lipoproteínas con densidades mayores a 1.063 encontradas en el infranadante es comúnmente ignorada. El sobrenadante conteniendo fracciones de LDL y VLDL es removida por medio de aspiración, y se mide el HDL colesterol en la solución inferior. Un enfoque alternativo es empleado por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades en Atlanta, Georgia, laboratorio de estandarización de lípidos. Este procedimiento vincula la remoción del VLDL por ultracentrifugación y entonces la fracción de LDL es precipitada por el uso de una solución de heparina-cloruro magnesio (ver bajo más adelante). La concentración de HDL es 1380

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determinada por medidas del contenido de colesterol remanente en la solución. Los métodos más comunes en uso para determinación de HDL colesterol involucran la precipitación selectiva de lipoproteínas conteniendo Apo-B con solución de polianiones (Tabla 33-10, método 2 y Fig. 33-16). Las soluciones de polianiones mas frecuentemente usadas para este propósito incluyen fosfotungsteno de sodio y cloruro de dextrano sulfato-magnesio. Estos agentes unen y precipitan todas las fracciones principales de lipoproteínas excepto el HDL. El uso de heparina-cloruro de magnesio como agente precipitante es infrecuentemente empleado, aunque es considerado un agente precipitante de opción. El uso rutinario de heparina cloruro de magnesio es limitado a dos factores principales. Primero la presencia de altas concentraciones de magnesio en la muestra vuelve al espécimen inapropiado para el análisis de colesterol usando los métodos comunes de colesterol enzimático. Otra desventaja en el uso de este agente es que puede haber un alto grado de heterogeneidad en la preparación comercial de heparina, debido a la variación de su peso molecular. Esto en cambio puede llevar a incrementar la variabilidad lote a lote en el análisis de HDL. Los procedimientos de sulfato de dextrano tienden a sobre estimar la verdadera concentración de HDL. El uso de sulfatos de dextrano de mayor peso molecular (50,000 daltones) puede producir valores de HDL que son uniformes con los métodos de heparina-cloruro de magnesio. Además, han sido desarrollados los métodos de cloruro-sulfato de dextrano-magnesio que son compatibles con las determinaciones enzimáticas de colesterol.ref(1231) El fosfotungstato de sodio puede también producir una subestimación de concentraciones de HDL. Otra desventaja asociada con el uso de este agente en particular es que las fluctuaciones de temperatura y las diferencias de concentraciones de reactivo pueden ser las principales fuentes de error. Sin embargo, las modificaciones a este método de precipitación han resultado en una mejor precisión y exactitud para las determinaciones de HDL.ref(1232) Un problema común a todos los métodos de precipitación ocurre con muestras que contienen concentraciones de triglicéridos aumentadas (> 4000 mg/L). La presencia de hipertrigliceridemia puede provocar precipitaciones incompletas de lipoproteínas no HDL, resultando que cantidades sustanciales de LDL y VLDL permanecen en solución con el HDL colesterol. La medición de colesterol en estas muestras con precipitaciones incompletas resultará en un falso incremento de valores de HDL. Las muestras con concentraciones de triglicéridos aumentadas pueden ser utilizadas para las determinaciones de HDL si ciertos pasos son tomados para asegurar la precipitación completa de todas las fracciones de lipoproteínas no HDL. En práctica de rutina, la precipitación de todos los LDL y VLDL en muestras con hipertrigliceridemia pueden ser obtenidas por la dilución de las muestras con solución salina al 0.9% y reprecipitación o uso de doble cantidad de agente precipitante en una muestra sin diluir. Recientemente ha sido introducida la técnica de precipitación para le determinación de HDL basado en el uso de sulfato de dextrano en una unión covalente con hierro. El principio de este método es similar a aquel ensayo tradicional de precipitación excepto que luego que el complejo dextrano de sulfato-hierro se adhiere a las fracciones de lipoproteína de LDL y VLDL el fondo del tubo es colocado cerca de una fuerza magnética que “tira” las fracciones de LDL y VLDL fuera de la solución. Así, esta técnica elimina la necesidad de centrifugación. Además, este método es más robusto y no parece ser rápidamente afectado por una 1381

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precipitación incompleta de lipoproteínas conteniendo ApoB debida a la presencia de hipertrigliceridemia comparada con los otros métodos de precipitación.ref(1233) Otros métodos de determinación de colesterol HDL incluyen cromatografía de intercambio de iones y electroforesis en gel de agarosa (ver el siguiente texto). Ninguno de estos métodos es utilizado en el laboratorio clínico de rutina para las determinaciones de HDL. Muestras. El suero y el plasma son aceptables para el análisis de concentraciones de HDL. Si se usa plasma, el anticoagulante de opción es EDTA. Aunque el ayuno no influye en las concentraciones de HDL sanguíneo, la hipertrigliceridemia que puede también presentarse en especímenes sin ayuno e interferir con algunos de los métodos de determinación de HDL. Aunque el uso del espécimen de ayuno es el preferido. Una vez recogida la muestra debe ser removida del coágulo en menos de dos horas y almacenada a 4º C hasta el análisis. Intervalo de referencia. Los intervalos de referencia para el colesterol HDL establecidos para hombres y mujeres blancas han sido dados en la Tabla 33-11. Además la Tabla 33-6 da los valores de corte de NCEP HDL que pueden ser usados para la clasificación de individuos respecto al riesgo de desarrollo de enfermedades coronarias. Las estrategias de diagnóstico y tratamiento están resumidas en Figs. 33-14 y 33-15. Electroforesis de Lipoproteínas Hebert K. Naito

Principios de análisis y uso corriente La separación por electroforesis de las principales fracciones de lipoproteínas para la evaluación del perfil de una lipoproteína específica no es frecuentemente utilizada hoy en día en el laboratorio clínico, pues la mayoría de las dislipoproteinemias pueden ser clasificadas por determinaciones simples y baratas de concentraciones de colesterol total y triglicéridos, y una examen visual de una muestra de suero o plasma. El examen visual para indicar la presencia de quilomicrones flotantes o muestra túrbida es realizada luego de que la muestra se deja reposar a 4º C a 8º C por un período de tiempo (usualmente toda la noche). Estos tests simples, acompañados por la determinación de HDL y LDL, han suplantado extensamente la electroforesis de lipoproteínas en el laboratorio clínico. Sin embargo, en ciertas situaciones la electroforesis de lipoproteínas puede ser de gran utilidad para identificar individuos con la rara hiperlipoproteinemia de Fredrickson tipo III (también llamada disbetalipoproteinemia) (ver Fig. 33-8). Esta disbetalipoproteinemia es caracterizada electroforéticamente por una gran mancha característica entre las bandas beta y prebeta. Este hallazgo puede ser de gran utilidad diagnóstica par identificar esta disbetalipoproteinemia. La separación de lipoproteínas por electroforesis es similar en teoría y técnica a la separación electroforética de proteínas (ver capítulo 10) y por lo tanto no es discutido en detalle aquí. Críticas de la teoría y técnica electroforética se pueden encontrar en otros lugares.ref(1234) El medio de soporte que es empleado en la separación electroforética de lipoproteínas es uno de los factores más críticos que conciernen a esta técnica. Los medios de soporte que 1382

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han sido usados incluyen papel, almidón, agarosa, poliacrilamida, agar, y acetato de celulosa. El uso de papel como medio de soporte para la electroforesis de lipoproteínas ha sido reemplazado por agarosa. Sin embargo, el uso de papel como medio de soporte es considerado un método clásico para la electroforesis de lipoproteínas, y la clasificación de Fredrickson de hiperlipoproteinemia está basada en el sistema de papel electroforético.refs(1235) El gel de almidón no ha sido usado nunca en gran extensión para la electroforesis de lipoproteínas. Se pueden preparar estos geles usando almidón de papa parcialmente hidrolizado, y estos geles separaran las lipoproteínas en base a la carga eléctrica y el tamaño molecular.ref(1236) Luego de separados mediante la electroforesis de gel de almidón, las lipoproteínas del suero migran para incrementar su movilidad como alfa-lipoproteínas, beta-lipoproteínas, lipoproteínas de baja densidad, y quilomicrones. En realidad, el tamaño molecular de la fracción de quilomicrón impide su entrada al gel de almidón. Hoy en día el uso de la electroforesis de gel de almidón esta limitado a la preparación de fracciones de lipoproteínas para investigaciones adicionales. La agarosa es el medio de soporte más usado para la separación electroforética de lipoproteínas (Fig. 33-17). El gel de agarosa permite una mejor separación de las fracciones prebeta lipoproteína y beta lipoproteína cuando se compara con otros medios de soporte disponibles. La separación de fracciones de lipoproteínas con agarosa puede ser realizada en una hora, mientras que la electroforesis con papel o gel de almidón pueden llevar varios días. También, la clara matriz del gel de agarosa permite la cuantificación de las fracciones de lipoproteínas con el uso de un densitómetro para explorar. Finalmente, las fracciones de lipoproteínas obtenidas en un medio soporte de agarosa se aproximan más a los resultados de cuando las lipoproteínas son separadas con ultracentrifugación, método de referencia para el análisis de lipoproteínas. La poliacrilamida, como el gel de almidón, separa las fracciones de lipoproteínas sobre la base de la carga eléctrica y tamaño molecular. La acción molecular de tamizado del gel de poliacrilamida (gel de almidón) provoca la migración mas lenta de la banda prebeta haciéndola migrar más lentamente que la banda beta (Fig. 33-18). El efecto de tamizado molecular del gel de poliacrilamida también provoca la separación de fracciones de lipoproteínas con un mayor grado de resolución cuando se compara con otros medios soportes. En realidad, el poder resolutivo del gel de poliacrilamida es tan bueno que algunos especímenes pueden presentar excesos de bandas, haciendo su interpretación difícil. El uso de poliacrilamida es más conveniente para muestras que producen patrones de lipoproteínas cuestionables o complicados con otros medios de soporte, como la agarosa. También, el tiempo que consume producir el gel de poliacrilamida limita el uso de esta técnica en la rutina de laboratorio clínico. Otros medios de soporte que han sido usados incluyen acetato de celulosa y agar gel. Aunque el acetato de celulosa es todavía usado para la electroforesis de proteínas del suero, tiene desventajas que incluyen la tendencia de este medio para dar un falso incremento en la fracción beta lipoproteína, cuando se compara con otros métodos electroforéticos establecidos, y la necesidad de clarificar el gel posteriormente a la interpretación debido a un fondo manchado. El gel de agar no es usado generalmente para la rutina de separación electroforética de lipoproteínas. Sin embargo, el uso de este medio tiene como utilidad la identificación de una lipoproteína sérica anormal definida como lipoproteína-X (Lp-X). Esta variante de lipoproteína está caracterizada por una gran cantidad de colesterol y fosfolípidos y una baja 1383

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cantidad de proteínas. La presencia de Lp-X esta asociada con la enfermedad de hígado colestático. Aunque la Lp-X migra en la misma posición como la beta lipoproteína en otro medio de soporte, en el gel de agar esta especie migra catódicamente a las beta lipoproteínas.ref(1237) Por lo tanto, la presencia de Lp-X puede ser confirmada por medio de electroforesis usando el gel de agar como medio de soporte. La visualización de lipoproteínas separadas puede ser obtenida por medio de manchas específicas de lípidos. “Oil red O” y “Fat red 7B”, son los colorantes más comúnmente usados. Especímenes Pueden ser utilizados suero o plasma para determinaciones de lipoproteínas por medio de electroforesis. Si se usa el plasma, el anticoagulante preferido es EDTA. Además del uso anticoagulante, EDTA también ayuda a preservar la integridad de especímenes inhibiendo la autooxidación de ácidos grasos no saturados y colesterol inducida por metales de ácidos grasos no saturados y colesterol. Las muestras deben ser obtenidas de individuos con un ayuno de 12 horas. Como el metabolismo de lipoproteínas es afectado por una variedad de condiciones patofisiológicas, se debe asegurar que la muestra obtenida sea representativa de un día normal del individuo. Por lo tanto, las muestras no deben ser recogidas de individuos que recientemente hayan experimentados cambios sustanciales en el consumo calórico, consumo alcohólico, pérdida o ganancia de peso, y cambios en la medicación. Además, los factores tales como enfermedad o herida aguda (como infarto de miocardio), o reciente cirugía pueden alterar dramáticamente el metabolismo de lipoproteínas. La recolección de muestras para el análisis de lipoproteínas debe ser evitada en individuos en estas condiciones. Intervalos de referencia El porcentaje de distribución de lipoproteínas séricas en niños y adultos se muestra en la Tabla 33-12.

Triglicéridos Hebert K. Naito

Principios de análisis y uso corriente La determinación de las concentraciones de triglicéridos en suero o plasma es útil para la evaluación y diagnóstico diferencial de hiperlipidemias primarias o secundarias y de la evaluación de los factores de riesgo para pancreatitis aguda. Además, las determinaciones exactas de triglicéridos son importantes por su rol en la estimación de la concentración de LDL colesterol por medio del uso de la ecuación de Friedewald: Colesterol LDL = Colesterol total – (colesterol VLDL + colesterol HDL)

donde el colesterol VLDL es igual a los triglicéridos dividido entre 5. La meta de precisión recomendada para la medición de triglicéridos es un CV% de < 5%, y la meta de exactitud es de un ALAT desde un valor de referencia de no más de 5%. Metas similares para las mediciones de colesterol LDL son CV 4% y un 4% de sesgo. 1384

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Los métodos más antiguos de determinación de triglicéridos fueron procedimientos indirectos, basados en la sustracción de colesterol y fosfolípidos de la concentración de lípidos totales presentes en la muestra,ref(1238) donde el contenido de lípido remanente se atribuía a los triglicéridos. Los métodos corrientes para la determinación de triglicéridos usan procedimientos enzimáticos con la medición de concentración de glicérido glicerol. La cantidad de glicérido glicerol es proporcional a las concentraciones de triglicéridos en la muestra. Las concentraciones de glicérido glicerol pueden ser determinadas también por métodos químicos; sin embargo, este método es raramente realizado hoy en día en laboratorios clínicos (ver Métodos en Química Clínicaref(1239)). Los métodos enzimáticos para la cuantificación de triglicéridos requieren primeramente la hidrólisis de ácidos grasos desde glicerol, con el uso de lipasa. El uso de enzimas para este paso ha sido posible por el desarrollo de métodos rápidos y automatizados. Además de la lipasa, es usualmente empleada en el paso de hidrólisis una enzima proteasa. El rol de la enzima proteasa en la hidrólisis de ácidos grasos desde glicerol no es todavía conocido; sin embargo, su inclusión en el sistema reactivo ayuda a asegurar la hidrólisis completa de triglicéridos. La alfa- quimotripsina es una proteasa comúnmente usada para este propósito.ref(1240) Luego de la producción de glicerol libre por medio de la hidrólisis enzimática de triglicéridos, una variedad de técnicas se pueden emplear para la determinación del glicerol que ha sido liberado. Un método común emplea lipasa, glicerol cinasa, piruvato cinasa (PC), y lactodeshidrogenasa (LD) (Tabla 33-13, Método I). En este ensayo el glicerol es liberado de los triglicéridos por la acción de la lipasa, y luego el glicerol libre reacciona con el ATP en la presencia de glicerol cinasa produciendo glicerol-3-fosfato y ADP. El ADP formado en esta reacción es refosforilado por fosfoenolpiruvato, en una reacción catalizada por PC, para producir ATP y piruvato. En la reacción final de la secuencia, el piruvato es reducido enzimáticamente en la presencia de NADH por el LD, produciendo lactato y NAD. La disminución en absorción resultante del consumo de NADH es monitoreada a 340nm y es proporcional a las concentraciones de triglicéridos en la muestra. Otro método enzimático comúnmente usado (Tabla 33-13, Método II) emplea la enzima L-alfa-glicerol fosfato oxidasa (GPO), que reacciona con el glicerol-3-fosfato formado por la reacción en secuencia de lipasa y glicerol cinasa descrita anteriormente. En la presencia de GPO y O2, el glicerol-3-fosfato se oxida para producir dihidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno reacciona con un cromógeno en una reacción catalizada por peroxidasa de rábano, causando la oxidación del cromógeno y el cambio de color, que puede ser monitoreado.ref(1241) Otro procedimiento para la determinación de triglicéridos utiliza el glicerol-3-fosfato producido en la reacción catalizada por la glicerol cinasa para dar un formazan altamente coloreado (Tabla 33-13, Método III). El glicerol-3-fosfato es oxidado primeramente por el NAD en una reacción catalizada por el glicerol-3- fosfato deshidrogenasa formando NADH. El NADH formado reacciona con 2-p-iodofenil-3-nitrofenil-5-feniltetrasolium, en una reacción catalizada por diaforasa, produciendo un formazan coloreado. Los métodos de triglicéridos basados en las mediciones de absorción de NADH a 340nm deben utilizar un blanco de suero como parte del procedimiento de este ensayo. El blanco de suero se corrige por la presencia de componentes de suero que pueden absorber o esparcir luz a 340nm. Los métodos colorimétricos que están basados en la reducción de sales 1385

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de tetrazolium por medio de NADH y diaforasa y la medición de formazan coloreado resultante en el espectro visible no requiere una medición de muestra blanco. Sin embargo, estos métodos sufren la formación espontánea de formazan coloreado, que resulta en un aumento de la lectura de reactivo blanco. Otro factor que puede afectar adversamente la exactitud de las mediciones de triglicéridos es el uso de pasos de blanqueo para corregir el glicerol libre presente en el suero. Los pasos de blanqueo son típicamente realizados en un análisis de dos partes. En la primer parte del análisis, se realizan todos los pasos necesarios para la medición de concentraciones de glicerol, excepto que la hidrólisis de triglicéridos no se realiza, este paso mide el glicerol libre. En la segunda parte del análisis, la reacción completa mide las concentraciones de glicerol total. La concentración actual de triglicérido está basada y calculada desde el nivel correcto de glicerol, que es, glicerol total menos el glicerol libre. El glicerol libre presente en el suero es producido como un resultado de lipólisis de triglicéridos almacenados y usualmente ocurre con concentraciones en el rango de 80 a 200 mg/L.refs(1242) Sin embargo, situaciones tales como estrés o estados de enfermedad pueden resultar en incrementos sustanciales en el porcentaje de lipólisis de tejido adiposo con un incremento resultante en la cantidad de glicerol libre presente en el suero. Además, los productos de glicerol o similares al glicerol pueden estar presentes en ciertas infusiones intravenosas dadas a los pacientes, con incrementos resultantes de glicerol libre contenido en el suero.refs(1243) Por lo tanto, aunque muchas fórmulas han sido desarrolladas para la corrección del contenido de glicerol libre en suero, su uso es restringido a individuos no estresados y con buena salud. Se debe destacar sin embargo, que aún en esta población las concentraciones de glicerol libre mayores a 750 mg/L no son infrecuentes.ref(1244) Especímenes. Suero y plasma pueden ser usados para la determinación de concentraciones de triglicéridos. Se debe establecer, sin embargo, que los valores de plasma son de alrededor de 2% a 4% menores que en el suero debido al efecto de dilución causado por la salida de agua de los eritrocitos producido por el anticoagulante. Los anticoagulantes como fluoruro, citrato, y oxalato pueden causar grandes cambios de agua desde los eritrocitos hacia el plasma, lo cual debe ser evitado.ref(1245) La sangre debe ser recogida para determinaciones de triglicéridos solamente si el paciente ha ayunado por un período mínimo de 10 a 12 horas. Las concentraciones de triglicéridos crecen en un lapso de 2 horas luego de comer y alcanzan su máximo luego de 4 a 6 horas. Así, en un paciente sin ayuno al cual se le ha extraído sangre para análisis de triglicéridos, un incremento en la concentración de triglicéridos es imposible de interpretar adecuadamente. Además, la concentración aumentada de quilomicrones en especímenes sin ayuno puede interferir en las mediciones de absorción en algunas determinaciones colorimétricas de triglicéridos. Intervalos de referencia. Las recomendaciones de NCEP han eliminado el uso de intervalos de referencia para triglicéridos. En cambio, el Panel de Expertosrefs(1246) ha recomendado algunos valores de corte, como colesterol total, para simplificar el recuerdo de números de decisiones médicas importantes (ver Tabla 33-3). 1386

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43. 44. 45. 46. 47.

Clin Chem 41:147-152, 1995. Malinow MR: Plasma homocyst(e)ine and arterial occlusive diseases: a mini-review, Clin Chem 41:173-176, 1995. Srinivasan SR, Berenson GS: Serum apolipoproteins A-I and B as markers of coronary artery disease risk in early life: the Bogalusa Heart Study, Clin Chem 41:159-164, 1995. Wilson WF: Relation of high-density lipoprotein subfractions and apolipoprotein E isoforms to coronary disease, Clin Chem 41:165-169, 1995. Zilversmit DB: Atherogenic nature of triglycerides, postprandial lipidemia, and triglyceride-rich remnant, Clin Chem 41:153-158, 1995. Strong JP: Natural history and risk factors for early human atherogenesis, Clin Chem 41:143-138, 1995. Wissler RW: Theories and new horizons in the pathogenesis of atherosclerosis and the mechanisms of clinical effects, Arch Pathol Lab Med 116:1281-1291, 1992. Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, et al: Beyond cholesterol: modifications of low-density lipoproteins that increase its atherogenicity, N Engl J Med 320:915-923, 1989. Meade TW, Miller GJ, Rosenberg RD: Characteristics associated with the risk of arterial thrombosis and the prethrombotic state. In Fuster V, Verstraete M, editors: Thrombosis in cardiovascular disorders, Philadelphia, 1992, Saunders. NIH Consensus Development Conference: Lowering blood cholesterol to prevent heart disease, JAMA 253:2080-2086, 1985. Current status of blood cholesterol measurement in clinical laboratories in the United States: a report from the Laboratory Standardization Panel of the National Cholesterol Education Program, Clin Chem 34:193-201, 1988. Naito HK: Cholesterol: review of methods, Check Sample PTS 85-I, Chicago, 1985, American Society of Clinical Pathology, pp. 1-17. Naito HK: Cholesterol. In the CD-ROM by Kaplan LA, Pesce AJ, editors: Clinical chemistry: a scientific and management infobase, Cincinnati, Ohio, 1996, Pesce Kaplan Publishers. Kim E, Goldberg M: Serum cholesterol assay using a stable Liebermann-Burchard reagent, Clin Chem 15:1171-1179, 1969. Abell LL, Levy BB, Brodie BB, Kendall FE: Simplified methods for the estimation of the total cholesterol in serum and demonstration of its specificity, J Biol Chem 195:357-366, 1952. Pesce MA, Bodourian SH: Interference with the enzymic measurement of cholesterol in serum by use of five reagent kits, Clin Chem 23:757-760, 1977. Huang HS, Kuan JC, Guilbault GG: Fluorometric enzymatic determination of total cholesterol in serum, Clin Chem 21:1605-1608, 1975. Noma A, Nakayama K: Polarographic method for rapid micro-determination of cholesterol with cholesterol esterase and cholesterol oxidase, Clin Chem 22:336-340, 1976. Cooper GR: High density lipoprotein reference materials. In Lipel K, editor: Report of the high density lipoprotein methodology workshop, DHEW publ no NIH 79-1661, Washington, D.C., 1979, U.S. Government Printing Office, p 178. Kannel WB: Low high-density lipoprotein cholesterol and what to do about it, Am J Cardiol 70:810-814, 1992. Kerscher L, Schiefer S, Draeger B, et al: Precipitation methods for the determination of LDL-cholesterol, Clin Biochem 18:118-125, 1985. Van Handel E, Zilversmit BD: Micromethod for the direct determination of triglycerides, J Lab Clin Med 50:152-157, 1957. Bucolo G, David H: Quantitative determination of serum tri-glycerides by the use of enzymes, Clin Chem 19:476-482, 1973. Nagele U, Hagele EO, Sauer G, et al: Reagent for the enzymatic determinations of serum total triglycerides with improved lipolytic efficiency, J Clin Chem Clin Biochem 22:165-174, 1984.

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Tablas Tabla 33-1. Descripción física y química de las lipoproteínas plasmáticas en humanos.

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Características: Quilomicrones: VLDL: IDL: LDL: HDL:

Densidad (g/mL) 2400

Deseable < 1300 Línea límite alta 1300-1590 Alta > 1600

Del Reporte del Panel de Expertos en Detección, Evaluación y Tratamiento de Colesterol Sanguíneo Alto del Programa de Educación Nacional de Colesterol, Arch Intern Med 148;36-39, 1988, y del Segundo Panel de Expertos: Detección, Evaluación, y Tratamiento de Colesterol Sanguíneo Alto en Adultos (Adult Treatment Panel II), Circulación 89: 1329-1445, 1994. *Miligramos de colesterol por litro de sangre; para convertir mg/L de colesterol a mmol/L, dividiendo por 387 o multiplicando por 0.002586.

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Tabla 33-5. Factores de riesgo asociados con el desarrollo de enfermedad cardíaca coronaria. Factores de riesgo positivos Edad (años) Hombre > 45 Mujer > 55 o premenopáusicas prematuras sin terapia de reemplazo de estrógenos Historia familiar de prematura enfermedad cardíaca coronaria Fumador corriente Hipertensión Diabetes mellitus Bajo HDL colesterol, < 350 mg/L (0.9 mmol/L) Factores de riesgo negativos Alto HDL colesterol, > 600 mg/L (1.6 mmol/L)

Tabla 33-6. Valores de corte para riesgo de enfermedades cardíacas coronarias basados en los niveles de HDL colesterol.

Clasificación Riesgo de enfermedad cardíaca coronaria positivo Riesgo de enfermedad cardíaca coronaria negativo

Valor de corte de HDL colesterol < 350 mg/L > 600 mg/L

Del Segundo Panel de Expertos: Detección, Evaluación, y Tratamiento de Colesterol Sanguíneo Alto en Adultos (Adult Treatmet Panel II), Circulación 89:1329-1445, 1994.

Tabla 33-7. Recientes recomendaciones del NECP para niños y adolescentes. Colesterol total (mg/L) < 1700 1700-1990 > 2000

Clasificación de riesgo Aceptable Línea límite alta Alto

LDL colesterol (mg/L) < 1100 1100-1290 > 1300

NECP, Programa Nacional de Educación de Colesterol. Del Panel de Expertos: Reporte del Panel de Expertos en Niveles de Colesterol Sanguíneos

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en Niños y Adolescentes del Programa Nacional de Educación del Colesterol, U.S. Departamento de Salud y Servicios Humanos, NIH publ no 91-2732, Sept 1991, pp 1-119. También del Scanu AM; Clin Chem 41:170-173, 1995.

Tabla 33-8.

Decisiones de tratamiento basadas en las concentraciones de HDL colesterol.

ECC y estado de factores de riesgo Sin CDH y 2 factores de riesgo Con CDH

Nivel de decisión de LDL colesterol mg/L (mmol/L)

Modalidad de tratamiento

> 1600 (4.1) > 1900 (4.9) > 1300 (3.4) > 1600 (4.1) > 1000 (2.6) > 1300 (3.4)

Dieta Droga Dieta Droga Dieta Droga

Modificado del Segundo Panel de Expertos: Detección, Evaluación, y Tratamiento de Colesterol Sanguíneo Alto en Adultos (Adult Treatment Panel II), Circulación 89;1329-1445, 1994.

Tabla 33-9. Métodos para análisis de colesterol. Método: 1. Liebermann-Burchard (L-B) Clasificación del método: Colorimétrico Principio: El colesterol es extraído y reacciona con un ácido fuerte (ácido sulfúrico) y anhídrido acético para formar un producto coloreado con máxima absorbancia a 410nm Uso: Raramente usado Comentarios:El colesterol esterificado produce mayor cambio de color que el no esterificado Método: 2. Abell et al.ref(1247) Clasificación del método: Colorimétrico Principio: Los ésteres de colesterol son químicamente hidrolizados (saponificación), y el colesterol total es medido por la reacción de L-B Uso: Considerado método de referencia corriente Raramente usado Comentarios:Laborioso Método: 3. Enzimático de punto final

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Clasificación del método:Colorimétrico Principio:

Colesterol esterasa 1. Esteres de colesterol –––––––––––– Colesterol + Acidos grasos Colesterol oxidasa

2. Colesterol + O2 ––––––––––

Colest-4-en-3-ona + H2 O2

El H2O2 producido en la reacción 2 es utilizado en las reacciones A o B: Peroxidasa

A. 2H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona –––––– Quinoneimina color + 4 H2O Catalasa

B.

H2O2 + Etanol –––––

Acetaldehído +H2O

Aldehído

Acetato + NADPH + H+

Acetaldehído + NADP –––––––– deshidrogenasa

Uso: El método más común Comentarios:Seguro y fácilmente automatizable Posible método futuro de referencia

Tabla 33-10. Métodos para el análisis de HDL colesterol. Método

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Principio

Usos

Comentario

1.UltraEl espécimen se ajusta Uso en centrifugación a la densidad de 1.063 investigación g/mL con bromuro de potasio; se centrifuga a alta velocidad por 24 horas; las lipoproteínas son separadas por densidad, con la fracción de HDL entre 1.063 y 1.21 g/mL.

Método de laborioso y referencia; consume mucho tiempo

2.Precipitación El agente precipitante es usado para precipitar las mayores lipoproteínas conteniendo Apo-B; el colesterol remanente en el sobrenadantedante

Método corriente de elección

Es la técnica más frecuentemente usada

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es cuantificado como HDL colesterol a.Heparina-cloruro de magnesio

Uso infrecuente

b.Dextran sulfato

Comúnmente usado

c.Fosfotungsteno

Más comúnmente usado

d.Polietilenglicol

Frecuentemente usado

No compatible con todos los procedimientos de colesterol Uso de moléculas de dextrano de bajo PM puede producir resultados malos; Dextranos de alto PM dan resultados excelentes. Compatible con procedimientos enzimáticos Subestima el HDL, sensible a fluctuaciones de temperatura Pobre en exactitud y precisión, no recomendado

Tabla 33-11. Percentiles quinto y 95avo para concentraciones de HDL colesterol plasmático en hombres y mujeres blancas en mg/L (mmol/L)

Edad (años) 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59

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Percentil Hombres 95 380 (0.98) 370 (0.96) 300 (0.78) 300 (0.78) 310 (0.80) 280 (0.72) 290 (0.75) 270 (0.70) 300 (0.78) 280 (0.72) 280 (0.72)

740 (1.91) 740 (1.91) 630 (1.63) 630 (1.63) 630 (1.63) 630 (1.63) 620 (1.60) 670 (1.73) 640 (1.66) 630 (1.63) 710 (1.80)

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Mujeres 95 360 (0.93) 370 (0.96) 350 (0.91) 330 (0.85) 370 (0.96) 360 (0.93) 340 (0.88) 340 (0.88) 340 (0.88) 370 (0.96) 370 (0.96)

730(1.89) 700 (1.81) 740 (1.91) 790 (2.04) 830 (2.15) 770 (1.99) 820 (2.12) 880 (2.28) 870 (2.25) 920 (2.38) 910 (2.35)

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60-64 65-69 70 +

300 (0.78) 300 (0.78) 310 (0.80)

740 (1.91) 780 (2.02) 750 (1.94)

380 (0.98) 350 (0.91) 330 (0.85)

920 (2.38) 980 (2.53) 920 (2.38)

Tabla 33-12. Porcentaje de distribución de las fracciones de lipoproteínas en niños y adultos.

Edad (años)

Sexo

Niños(4-14) M,F Adultos (18-65) M Adultos (18-65) F

Lipoproteínas (%), X + SD Beta Prebeta Alfa 55 + 5 12 + 3 33 + 3 65 + 8 12 + 4 23 + 4 60 + 6 8 + 4 32 + 5

Tabla 33-13. Métodos para el análisis de triglicéridos. Método: Tipo de análisis: Principio:

1. Piruvato cinasa ultravioleta Enzimático 1. Triglicérido [lipasa proteasa] ––

Glicerol + ácidos grasos

2. Glicerol + ATP [glicerol cinasa] ––

Glicerol-3-fosfato +ADP

3. ADP + Fosfoenolpiruvato Piruvato [PC] –

ATP + Piruvato

4. Piruvato + NADH [Lactato deshidrogenasa] ––

Lactato + NAD

Disminución en la absorbancia a 340nm por desaparición de NADH proporcional a la concentración de triglicéridos Usos: Suero, plasma Comentarios:Buena sensibilidad, especificidad, y precisión; requiere blanco de suero, frecuentemente usado Método: Tipo de análisis: Principio:

2. Glicerol fosfato oxidasa (GPO) Enzimático colorimétrico Usa las reacciones 1 y 2 descriptas arriba, luego: GPO

3. Glicerol-3-fosfato + O2 ––

Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

4. H2O2 + 4-clorofenol + 4-aminofenazona + Peroxidasa

hexacianoferrato de K (II) ––––– 4-p-Benzoquinona monoiminofenazona + hexacianoferrato de K (III) + HCl + H2 O

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Formación de quinona monoimina coloreada proporcional a la concentración de triglicéridos Usos: Suero, plasma Comentarios:Buena sensibilidad, especificidad, y precisión; requiere blanco de suero, frecuentemene usada Método: Tipo de análisis: Principio:

3. Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) Enzimático Colorimétrico Utiliza las reacciones 1 y 2 descritas en método 1, luego: GPD

NAD+

3. Glicerol-3-fosfato + ––– Dihidroxiacetona fosfato 4. NADH + 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-tetrazolium (oxidado) [diaforasa] ––––– 2-p-yodofenil- 3-p-nitrofenil-tetrazolium (reducido) + NAD+ Producción de formazan coloreado proporcional a la concentración de triglicéridos Usos: Suero, plasma Comentarios:Buena sensibilidad, especificidad, y precisión; requiere blanco de suero, frecuentemene usada

Figuras

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Figura 33-1 Origen y camino catabólico de quilomicrón y lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). El producto final del quilomicrón es el quilomicrón remanente; el producto final del VLDL es LDL. Chol, colesterol; PL, fosfatidillecitina; TG, triglicérido.

Figura 33-2 Estructura química del anillo ciclopentanoperhidrofenantreno. Esta estructura común de cuatro anillos es la estructura básica de todos los esteroides.

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Figura 33-3 Esquema de la dinámica del metabolismo del colesterol.

Figura 33-4 Esquema de la incorporación y catabolismo de LDL por la célula. El mecanismo no solamente depura LDL desde la circulación sino también ayuda en la 1400

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regulación de síntesis y almacenamiento de colesterol. Las lipoproteínas de alta densidad, HDL, juegan una función integral en la remoción de colesterol celular, esterificación de colesterol libre en sangre y transporte de colesterol al hígado para su catabolismo. ACAT, Acil-CoA: colesterol aciltransferasa; ECC, éster de colesterol ; HMG-CoA reductasa, -hidroxi- -metilglutaril-coenzima A reductasa; LCAT, lecitin-colesterol aciltransferasa; PL, fosfolípido; RER, retículo endoplasmático rugoso; SER, retículo endoplasmático liso.

Figura 33-5 Camino metabólico de la síntesis de colesterol, acentuando el paso de inhibición por producto final de retroalimentación negativa en el paso de -hidroxi- -metilglutaril CoA con la enzima importante HMG-CoA reductasa.

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Figura 33-6 Esquema de un complejo de lipoproteína mostrando la superficie externa polar y el núcleo relleno con lípidos neutros. HDL, lipoproteína de alta densidad. (Modificado desde Grundy SM: Slide atlas of lipid disorders: colesterol , atheroscloerosis, and coronary heart disease, Nueva York, 1990, Editorial médica Gower.)

Figura 33-7 Caracterización general de los principales tipos de lipoproteínas, de donde se observan algunas propiedades químicas y físicas básicas. St, indice de flotación de Svedberg; quilo, quilomicrones; beta, beta-lipoproteína; prebeta, una lipoproteína de muy baja densidad; alfa, alfa-lipoproteína. 1402

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Figura 33-8 Resumen de los seis tipos de lipoproteínas. Abreviaturas igual que en la Figura 33-7.

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Figura 33-9 Diagrama de un vaso sanguíneo saludable (arteria) con integridad normal de la íntima, media y adventicia. (Modificado desde Grundy SM: Slide atlas of lipid disorders: colesterol , atheroscloerosis, and coronary heart disease, Nueva York, 1990, Editorial Médica Gower.)

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Figura 33-10 Los tres estados de aterogénesis: formación de la vena grasosa, placa fibrosa y lesión complicada. Notar el desarrollo y acumulación de las células espumosas en la vena grasosa, acumulación de células de músculo liso en la placa fibrosa, y formación de calcificación, ulceración, trombosis y hemorragia en la lesión avanzada o complicada. (Modificado desde Grundy SM: Slide atlas of lipid disorders: colesterol , atheroscloerosis, and coronary heart disease, Nueva York, 1990, Editorial Médica Gower.) 1405

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Figura 33-11 Formación de la célula espumosa: captación macrófaga (ingestión) de LDL modificado por el camino de receptor de LDL modificado, lo cual resulta en el desarrollo de grandes gotitas cargadas de grasa. Este proceso de formación de la célula espumosa es la marca característica del desarrollo de la vena grasa en la aterogénesis. (Modificado desde Grundy SM: Slide atlas of lipid disorders: colesterol , atheroscloerosis, and coronary heart disease, Nueva York, 1990, Editorial Médica Gower.)

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Figura 33-12 Modificación del LDL. LDL nativa secuestrada (en el espacio subendotelial) pueden experimentar dos tipos de modificación – derivación (enlace a manolaldehído o glicosidación de Apo B-100) u oxidación (degradación de Apo B-100 por superóxidos). (Modificado desde Grundy SM: Slide atlas lipid of disorders: colesterol , atheroscloerosis, and coronary heart disease, Nueva York, 1990, Editorial Médica Gower.)

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Figura 33-13 Hipótesis de las múltiples funciones de LDL oxidado en la aterogénesis. (Desde Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, et al: N Engl J Med 320:915-923, 1989.)

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Figura 33-14 Algoritmo de estimación de riesgo de enfermedades cardíacas coronarias, tratamiento y monitoreo usando los lineamientos del NCEP, Panel II sobre Tratamiento de Adultos para prevención primaria en adultos con y sin evidencia de CDH. Clasificación inicial basada en las concentraciones de TC (colesterol total) y HDL-C (colesterol de lipoproteína de alta densidad). PE, examen físico; RF, factor de riesgo.

Figura 33-15 Algoritmo estimación de riesgo de CDH, tratamiento, y monitoreo para prevención primaria y secundaria de CDH en adultos con y sin evidencia de CDH.ref(1248) La clasificación subsecuente del riesgo esta basada en la concentración de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). RF, factor de riesgo.

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Figura 33-16 Esquema del método de precipitación con polianión (heparina – MnCl2) para la determinación de HDL colesterol.

Figura 33-17 Esquema de un modelo electroforético de lipoproteína en agarosa como medio de soporte. HDL, lipoproteína de alta-densidad; LDL, lipoproteína de baja-densidad; VLDL, lipoproteína de muy-baja-densidad.

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Figura 33-18 Esquema de un modelo electroforético de lipoproteína sobre un medio soporte de gel de poliacrilamida.

CAPÍTULO 34

34. Alcoholismo Charles L. Mendenhall Robert E. Weesner

Diagnóstico de alcoholismo Intoxicación alcohólica Alcoholismo Alteraciones bioquímicas y metabólicas Metabolismo del etanol Alteraciones bioquímicas en lípidos, proteínas y carbohidratos Alteraciones nutricionales asociadas a alcoholismo y a enfermedad hepática provocada por alcohol Malnutrición proteico-calórica Anormalidades en vitaminas Anormalidades en minerales

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Patología: enfermedades sistémicas del alcohólico Mecanismos de daño en órganos Hígado Páncreas Síndrome fetal por alcohol Complicaciones sistémicas menos comunes Patología: trauma y abuso de alcohol Cambio del compuesto analizado en la enfermedad Enzimas Bilirrubina Proteínas Lípidos Carbohidratos Pruebas de función hepática Excreción de verde de Indocianina Métodos de análisis Alcohol

OBJETIVOS Describir el metabolismo del etanol y las alteraciones de la bioquímica de lípidos, proteínas y carbohidratos que resultan del consumo excesivo de alcohol. Citar y describir las alteraciones nutricionales asociadas al alcoholismo y a la enfermedad hepática alcohólica. Describir las enfermedades sistémicas asociadas con el alcoholismo. Enunciar los cambios esperados en los niveles séricos de los siguientes parámetros de laboratorio en la enfermedad hepática provocada por alcohol: aspartato aminotransferasa, alanino aminotransferasa, gama-glutamiltransferasa, lactato deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, 5'nucleotidasa, bilirrubina, albúmina, globulinas, colesterol, triglicéridos, ácidos biliares y glucosa.

Términos Clave cetoacidosis alcohólica Disminución del pH sanguíneo (acidosis) que a veces se observa en alcohólicos, y que está asociada a un aumento de los cuerpos cetónicos en suero (acetona, ácido beta-hidroxibutírico y ácido acetoacético). 1412

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cirrosis alcohólica Proceso patológico que resulta del consumo crónico y excesivo de alcohol. Ocurre en hígado, donde la lesión progresiva produce bandas fibróticas o tejido cicatricial que atrapa células hepáticas y desemboca en la pérdida de la arquitectura lobular microscópica (regeneración nodular), normal. cuerpos de Mallory (hialina alcohólica) Inclusión eosinofílica citoplasmática que se acumula en las células hepáticas. Es típica de la lesión hepática aguda provocada por alcohol hepatitis alcohólica), aunque no siempre está asociada a la misma. fibrosis hepática Depósito de colágeno y tejido fibroso en hígado, antes del desarrollo de la regeneración nodular y la cirrosis. hemocromatosis Alteración en el metabolismo del hierro caracterizado por un excesivo depósito de hierro en tejido, particularmente en hígado, páncreas y corazón, que provoca lesiones en el órgano y que puede manifestarse como cirrosis, diabetes mellitus e insuficiencia cardíaca, respectivamente. hepatítis alcohólica Daño en hígado, agudo y tóxico, asociado con el consumo excesivo de alcohol, y caracterizado por necrosis, inflamación polimorfonuclear y en muchas casos, cuerpos de Mallory. hígado graso Excesiva acumulación de grasas, fundamentalmente lípidos neutros, triglicéridos y colesterol, en las células del parénquima hepático. El hígado graso se desarrolla en forma predecible tras de la exposición a una variedad de hepatotoxinas, de las cuales el etanol o alcohol etílico es la más común. síndrome fetal por alcohol: grupo de anormalidades fetales que resultan del consumo de alcohol por parte de la madre durante la gestación. kwashiorkor Enfermedad nutricional resultante de la carencia de proteínas, caracterizada por deprivación de proteínas y disfunción inmunológica. El consumo de calorías totales puede ser deficiente, adecuado o incluso excesivo. marasmo Enfermedad nutricional resultante de la disminución de calorías, caracterizada por pérdida de peso, pérdida de masa muscular y agotamiento de los depósitos grasos. síndrome de retirada por alcohol Conjunto de síntomas clínicos asociados con la interrupción del consumo de alcohol, que pueden llegar a incluir temblor, alucinaciones, disfunciones del sistema nervioso autónomo y convulsiones. síndrome de Wernicke-Korsakoff Enfermedad del sistema nervioso central que aparece en alcohólicos y es atribuida a una deficiencia de tiamina. La encefalopatía de Wernicke consiste en perturbaciones oculares, ataxia, y deterioro de las funciones mentales. Si no se trata terapéuticamente, puede convertirse en el síndrome de Korsakoff, que incluye disminución de memoria, fabulaciones y trastornos en la percepción del tiempo.

El alcoholismo representa uno de los más serios problemas mundiales no sólo a nivel de la salud, sino también desde el punto de vista socio económico. En los Estados Unidos, las enfermedades hepáticas relacionadas con el alcohol constituyen la sexta causa principal de 1413

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muerte.ref(1249) Se define al alcohólico como una persona que consume una determinada cantidad de etanol (alcohol etílico) capaz de provocar cambios patológicos.ref(1250) La cantidad de etanol necesaria para provocar la enfermedad depende de una variedad de factores, entre ellos, predisposición genética,ref(1251) malnutrición,ref(1252) e infección viral concomitante en hígado hepatitis viral).ref(1253) Para una persona predispuesta, la cantidad puede llegar a ser tan baja como 35 g/día,ref(1254) que es equivalente al consumo diario de tres bebidas hechas a base de whisky. Sin embargo, para la mayoría de las personas, la cantidad de alcohol necesaria para provocar enfermedad es más de 80 g/día durante por lo menos 10 a 15 años. Esta cantidad equivale al siguiente consumo diario de bebidas acohólicas: 8 cervezas de 12 onzas (6 % alcohol por volumen ), 1 litro de vino (12 % alcohol por volumen ) o aproximadamente 250 mL de whisky (casi 40 % alcohol por volumen ). Debe recalcarse que aquellas personas predispuestas pueden desarrollar la enfermedad con cantidades mucho menores de etanol. Sin embargo, cuando el nivel de etanol es inferior a 7 g/día, la condición patológica no aparece, ni siquiera en personas predispuestas.ref(1255) Ver el Capítulo 52 para profundizar sobre el problema de la adicción en general.

Diagnóstico de Alchoholismo Intoxicación alcohólica Un elevado nivel de alcohol en sangre demuestra ingestión reciente de alcohol e intoxicación. No puede utilizarse como diagnóstico de alcoholismo, a pesar de que el nivel sanguíneo se correlaciona con signos corrientes de deterioro mental y físico provocados por la intoxicación con etanol. Los signos generales de la intoxicación con etanol son en el cuadro siguiente.

Signos Generales de la Intoxicación con Etanol Historia de consumo de alcohol Aliento alcohólico en la respiración Nistagmo (rápido movimiento horizontal del ojo) Lenguaje entrecortado Respuesta disminuida al dolor Pobre coordinación motora Nivel de conciencia disminuido.

La relación entre los niveles de alcohol en sangre y los signos físicos de intoxicación en un bebedor esporádico ha sido bien establecida y figura en la Tabla 34-1. La función motora disminuida asociada a niveles sanguíneos elevados puede llevar al trauma a la persona intoxicada. A niveles sanguíneos de alcohol entre 400 y 600 mg/L, existe un significativo deterioro en las funciones de manejo de vehículos, incluyendo las habilidades motoras, cognoscitivas y de procesamiento de información.ref(1256) Los conductores con niveles sanguíneos entre 500 y 900 mg/L, tienen nueve veces más probabilidad de involucrarse en un accidente de coche que los individuos con valores no detectables de alcohol en sangre.ref(1257) 1414

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Para aquellos consumidores crónicos de alcohol, los mismos signos y síntomas pueden observarse a niveles sanguíneos aún mayores, inclusive a valores de alcohol tan elevados como 1000 mg/L o más. Antecedentes de una intoxicación alcohólica pueden llevar al médico a la sospecha de alcoholismo crónico. Alcoholismo Una característica de los alcohólicos es intentar ocultar o disimular su exceso en las bebidas, y por ello, su propia historia de consumo puede no ser veraz. Frecuentemente se requiere la confirmación por parte del cónyuge o de familiares directos para determinar con exactitud si existen antecedentes de consumo de bebidas alcohólicas. Sin embargo, los signos y síntomas de la intoxicación corriente enunciados anteriormente, sumados a los síntomas del retiro de la droga (para los alcohólicos, el delirium tremens), llevan a sospechar un abuso crónico de alcohol. Se han propuesto diferentes marcadores de laboratorio como herramientas de diagnóstico para confirmar el consumo excesivo de etanol.refs(1258) Una cantidad tan pequeña como dos bebidas diarias, puede provocar un aumento significativo del volumen corpuscular medio (VCM) de los glóbulos rojos.ref(1259) Sin embargo, en general no hay grandes cambios, y puede ser necesario utilizar los valores basales previos al consumo de bebida para reconocer el efecto del etanol. Se ha demostrado que la gama-glutamiltransferasa (GGT) sérica es fácilmente modificada por una variedad de compuestos, incluyendo el etanol. En ausencia de otros parámetros de laboratorio anormales para enfermedad hepática, niveles elevados de GGT pueden ser útiles para reconocer al bebedor crónico en el estadio previo a la enfermedad.

Alteraciones Bioquímicas y Metabólicas Metabolismo del etanol En los seres humanos, el etanol es primariamente un compuesto exógeno que se incorpora al organismo mediante el consumo de bebidas alcohólicas, y que es fácilmente absorbido al través de todo el tracto gastrointestinal. El etanol sanguíneo es metabolizado por el hígado a una velocidad constante, disminuyendo 150-200 mg/L por hora en un individuo normal, y alcanzando 300-400 mg/L por hora en un alcohólico crónico. Esto implica una velocidad de depuración de aproximadamente 3 onzas de etanol por hora para un adulto promedio. La mayor parte del etanol absorbido se degrada por procesos oxidativos que ocurren fundamentalmente en hígado, primero a acetaldehído y posteriormente a acetato. Solamente del 2% al 10% se excreta sin oxidar por orina y pulmones. Existen al menos tres sistemas enzimáticos capaces de producir la oxidación del etanol: (1) alcohol deshidrogenasa. (2) sistema microsomal oxidante de etanol (MEOS: microsomal ethanol oxidizing system, el acrónimo más usado), y (3) catalasa. El principal camino metabólico de oxidación del etanol involucra a la alcohol deshidrogenasa (ADH), lo cual es especialmente cierto en la intoxicación aguda:

Alcohol deshidrogenasa

Etanol ––––––––––––––– 1415

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NADH + H+

El paso inicial catalizado por la alcohol deshidrogenasa parece ser el limitante para la depuración del etanol de la sangre, pero no es específico para el mismo. Metanol, retinol (vitamina A), y otros alcoholes también son oxidados por esta enzima. Este hecho es importante desde el punto de vista clínico para el tratamiento de la intoxicación aguda con metanol.ref(1260) En este caso, se administra en forma terapéutica etanol para que compita con el metanol por los sitios de unión de la enzima ADH, postergando así la oxidación de metanol a su metabolito tóxico formaldehído. MEOS es el sistema enzimático secundario para la depuración de etanol:

Oxígeno

MEOS

Etanol ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– NADP +

H+

Acetaldehído

NADP + H2O

Esta enzima microsomal se encuentra en el retículo liso del endoplasma de los hepatocitos. En el alcohólico crónico existe un aumento de actividad de MEOS. ref(1261) La inducción de su actividad está asociada a la actividad aumentada de otros constituyentes del retículo liso involucrados en el metabolismo de drogas, como GGT, 5'Nucleotidasa, citocromo P-450 reductasa y citocromo p-450. Estos cambios son significativos desde el punto de vista clínico, pues transforman al alcohólico en un individuo más resistente a los efectos de los sedantes y barbitúricos más comunes, por lo que resulta necesario administrar dosis mayores que las habituales cuando se requiere lograr la sedación. Cuando se consumen simultáneamente etanol y barbituratos, la inhibición enzimática por competición provoca una depuración disminuidaref(1262) y se alcanzan niveles anormalmente elevados de barbituratos en sangre. Esta interacción puede inclusive llevar a la muerte. El papel de la catalasa en la oxidación biológica del etanol está en discusión. ref(1263) Se ha demostrado in vitro que en presencia de un sistema generador de peróxido (H2O2), la catalasa es capaz de oxidar al etanol según la siguiente reacción: catalasa

Etanol + H2O2 –––––––––––––––––––

2 H2O + Acetaldehído

Parece que la baja velocidad mediante la cual el peróxido puede ser generado a partir de NADPH oxidasa o xantino oxidasa, es la razón por la cual la catalasa contribuye con no más de 2% en la oxidación in vivo del etanol. Alteraciones bioquímicas en lípidos, proteínas y carbohidratos Lípidos. Los lípidos se acumulan en la mayoría de los tejidos en los cuales el etanol es metabolizado, provocando hígado graso, miocardio graso, túbulos renales grasos, y así sucesivamente.ref(1264) El mecanismo parece ser multifactorial, resultante de la acumulación aumentada de lípidos y de la oxidación disminuida de los mismos. ref(1265) Aunque la secreción de lipoproteínas séricas 1416

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es baja en comparación a la carga lipídica que se acumula en hígado, la cantidad total secretada está aumentada por encima de la normal, y esto puede desembocar en una hiperlipidemia alcohólica.ref(1266) Esta hiperlipidemia de tipo IV presenta niveles séricos elevados de triglicéridos y ésteres del colesterol, provocando un aumento en suero de lipoproteínas hepáticas de muy baja densidad y de partículas similares a quilomicrones. Las actividades enzimáticas relacionadas con la oxidación del etanol y con el metabolismo de drogas están frecuentemente alteradas. Estos cambios pueden ser producidos en forma directa, por inducción o por supresión enzimática, o en forma indirecta, por el cambio de equivalentes de reducción, o sea, por el aumento de la relación NADH/NAD+. Proteínas. Proteínas puede estar alterada su liberación por parte de las células hepáticas que las sintetizaron. Como consecuencia de ello, la acumulación de proteínas es uno de los cambios que más precozmente se observan en el hígado del alcohólico.ref(1267) Ocurre simultáneamente con la acumulación grasa, y contribuye a aumentar el tamaño del hígado (hepatomegalia), condición que se observa en más del 90 % de los alcohólicos con enfermedad hepática.ref(1268) Carbohidratos. Carbohidratos a través de diferentes mecanismos, el etanol actúa deteriorando la gluconeogénesis. Este es un proceso mediante el cual la glucosa se obtiene a partir de compuestos que no son carbohidratos, por ejemplo, glicerol, piruvato y algunos aminoácidos. Debido a que el etanol promueve la formación de lípidos que contienen glicerol, y además altera el transporte de aminoácidos, disminuye la disponibilidad de estos compuestos para la gluconeogénesis. La actividad de la ácido glutámico deshidrogenasa, que está disminuida debido a los niveles elevados de NADH, disminuye la disponibilidad del alfa-cetoglutarato necesario para la transaminación de los aminoácidos antes de su conversión a glucosa. Esto último también contribuye a alterar el proceso de gluconeogénesis. El aumento de NADH junto con el descenso concomitante de NAD+ asociado a la actividad de ADH puede también provocar cambios secuenciales en el metabolismo de carbohidratos con consecuencias clínicas. La disponibilidad aumentada de NADH provoca un aumento en la producción de lactato, que disminuye su disponibilidad para la gluconeogénesis y puede provocar hiperlacticoacidemia.ref(1269) Esta condición reduce la capacidad del riñón para excretar ácido úrico, originando una hiperuricemia secundaria,ref(1270) que en personas predispuestas puede agravarse o precipitar ataques de gota.ref(1271) El almacenamiento de glucógeno en hígado también está disminuido en alcohólicos, debido a una pobre ingesta en la dieta y a las enfermedades hepáticas frecuentemente asociadas al alcoholismo crónico (hígado graso, hepatitis alcohólica y cirrosis alcohólica). Las consecuencias clínicas que implican estos cambios en el glucógeno hepático y en el alterado proceso de gluconeogénesis se estudian más adelante, junto con la intervención de la insulina y otras hormonas en el desarrollo de la hipoglucemia alcohólica. En ausencia de enfermedad hepática, malnutrición u otras condiciones predisponentes, el etanol por sí mismo solo produce un ligero aumento de la glucosa sanguínea, pudiendo incluso no provocar ningún cambio. Si éste se produce, el pico de glucosa aparece 30 a 45 minutos después de la ingestión, y representa un aumento que generalmente no supera el 7% 10 %. 1417

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Alteraciones Nutricionales Asociadas con Alchoholismo y Enfermedad Hepática Alcohólica Malnutrición proteíno-calórica Las bebidas alcohólicas tienen un contenido alto en calorías. Cada gramo de etanol produce 7 kcal. El etanol puede ser el responsable de hasta el 10% de la ingesta energética total de un consumidor moderado y de hasta el 50% en un alcohólico. Sin embargo, las bebidas alcohólicas tienen escaso valor nutritivo,ref(1272) y el alcoholismo crónico siempre se ha asociado a malnutrición y enfermedad hepática. La malnutrición, en forma de una deficiencia proteíno-calórica, proviene de una variedad de causas: (1) pobre ingesta en la dieta; (2) mala absorción de los nutrientes consumidos como resultado de gastritis inducida por alcohol, pancreatitis o diarrea; y (3) alteraciones en procesos bioquímicos y fisiológicos. La malnutrición proteíno-calórica (MPC), ha sido clasificada como marasmo, si predomina una deficiencia calórica, y como enfermedad semejante al kwashiorkor, si predomina una deficiencia proteica.ref(1273) (ver capítulo 37) En un estudio realizado en 284 alcohólicos con hepatitis alcohólica, todos los pacientes tenían algún grado de M.P.C., y 80 % presentaba signos de marasmo y enfermedad semejante a kwashiorkor.ref(1274) La determinación de los niveles de prealbúmina en suero puede utilizarse para el diagnóstico y seguimiento de la MPC.ref(1275) Aunque la lesión hepática puede aparecer en ausencia de malnutrición, sus formas más severas están invariablemente asociadas a una severa malnutrición. El reconocimiento de las deficiencias nutricionales es importante para el paciente alcohólico con enfermedad hepática porque la corrección de esas anormalidades mediante una adecuada terapia nutricional puede acelerar la recuperación del daño hepático y aumentar el grado de supervivencia. Anormalidades en vitaminas El consumo excesivo de alcohol conduce normalmente a una deficiencia de vitaminas,ref(1276) resultante de la pobre nutrición general asociada al abuso de alcohol y al daño hepático. El hígado no solamente constituye un importante depósito de vitaminas, sino también es el lugar donde se produce su conversión a compuestos útiles desde el punto de vista metabólico (ver capìtulo 39). Por ello, la lesión hepática altera el metabolismo de las vitaminas. Estas pueden ser liberadas por las células hepáticas necrosadas que se pierden en el organismo y que no son apropiadamente reemplazadas.ref(1277) Además, las vitaminas liposolubles ( vitaminas A, D, K y E ) pueden no ser absorbidas en forma adecuada por el intestino de los alcohólicos.ref(1278) Debido a la mayor síntesis de ácidos nucleicos y a la regeneración hepática, el alcohol puede aumentar el requerimiento por parte del organismo de ácido fólico y de vitaminas B12 y B6.ref(1279) La reposición de vitaminas y proteínas es importante en el tratamiento del paciente alcohólico, dadas las interacciones entre hígado, alcohol y vitaminas. En la Tabla 34-2 se observa la incidencia de la disminución de los valores séricos de vitaminas en pacientes con cirrosis alcohólica. (Ver capítulo 39 para bioquímica y fisiología de vitaminas). Vitamina A. Vitamina A se absorbe como retinol, que para ser funcional, debe ser oxidado a retinal con la ayuda de la alcohol deshidrogenasa. El alcohol inhibe competitivamente la conversión 1418

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de retinol a retinal en el hígado.ref(1280) Vitamina B1 (tiamina). El deficiencia de tiamina aparece frecuentemente en alcohólicos.ref(1281) El requerimiento de tiamina es mayor cuando los carbohidratos constituyen la mayor fuente de energía, como ocurre a veces en los alcohólicos. En algunos pacientes, la deficiencia de tiamina puede producir un desorden neuropsiquiátrico, que puede ser genéticamente determinado,ref(1282) llamado síndrome de Wernicke-Korsakoff. Existen evidencias crecientes que hacen suponer que la deficiencia de tiamina también contribuye a otras formas de lesión cerebral en alcohólicos.ref(1283) Vitamina B2 (riboflavina). Rara vez es un problema en el alcohólico.ref(1284) Acido nicotínico. Su deficiencia severa provoca la pelagra que se observa en alcohólicos.ref(1285) Vitamina B6 (piridoxina). En la hepatitis alcohólica el nivel sérico de la aspartato aminotransferasa (ASAT o TGO) es mayor que el de la alanino aminotransferasa (ALAT o TGP) en el 90 % de los pacientes.ref(1286) Acido fólico. La deficiencia de acido fólico deficiencia vitamínica más común entre los alcohólicos.ref(1287) La deficiencia de folato contribuye a la anemia megaloblástica que se observa en ellos.ref(1288) El alcohol no inhibe la absorción intestinal del folato asociado a los alimentos.ref(1289) Se cree que las mayores causas que explican su deficiencia en alcohólicos son la pobre ingesta en la dieta y el aumento, tanto de los requerimientos como de la excreción.ref(1290) Además, el alcohol puede bloquear directamente el metabolismo de folato.ref(1291) Vitamina B12 (cianocobalamina). Su deficiencia raramente es un problema,ref(1292) aunque en algunos individuos el alcohol inhibe su absorción a nivel del ileum. ref(1293) Debido a que la vitamina B12 se almacena en hígado, la necrosis aguda de la célula hepática durante la hepatitis alcohólica puede provocar un significativo aumento en los niveles séricos de B12, que cursa en forma paralela a la severidad de la lesión hepática. Vitamina C (ácido ascórbico). El deficiencia de vitamina C no es común en alcohólicos; los niveles bajos presentes se atribuyen a una pobre ingesta en la dieta.ref(1294) Vitamina D. El deficiencia de vitamina D no es un grave problema entre los alcohólicos.ref(1295) 1419

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Vitamina E. Los alcohólicos crónicos son susceptibles a su deficiencia, debido a una pobre ingesta en la dieta y al estado de malnutrición general. Se sabe que la deficiencia pura de vitamina E produce lesión testicular, pero no está claro aún si esto contribuye a explicar el hipogonadismo alcohólico.ref(1296) Vitamina K. Dado que los depósitos de esta vitamina son pequeños, la obstrucción biliar o la enfermedad severa del parénquima hepático pueden provocar trastornos en la coagulación.ref(1297) Los alcohólicos frecuentemente presentan un tiempo de protrombina prolongado.ref(1298) Cuando a estos pacientes se les administra vitamina K por vía parenteral, algunos muestran una corrección en el tiempo de protrombina, lo que indica una deficiencia de vitamina K. Aquellos que no mejoran con vitamina K tienen una enfermedad hepática demasiado severa como para utilizar la vitamina.ref(1299) Anormalidades en minerales (ver Capítulos 35 y 37) Hierro. Todavía no está claramente desentrañado el mecanismo responsable de la ligera a moderada acumulación de hierro en el hígado de algunos pacientes con enfermedad alcohólica hepática. Algunas bebidas alcohólicas, especialmente los vinos tintos, contienen hierro. La preparación de cerveza en ollas de hierro ha sido la causa de la hemocromatosis en la población Bantú de Sudáfrica.ref(1300) El efecto del alcohol sobre el folato puede influenciar la absorción del hierro. La deficiencia de folato está asociada con una eritropoyesis (producción de glóbulos rojos) ineficaz y con una sobrecarga de hierro.ref(1301) Los alcohólicos con una significativa sobrecarga de hierro pueden, de hecho, poseer el gen para la hemocromatosis idiopática primaria.ref(1302) Algunos alcohólicos tienen niveles bajos de hierro debido a pobre ingesta en la dieta, pérdida crónica de sangre por el tracto intestinal (gastritis, úlcera péptica, várices esofágicas y gástricas) y trastornos en la coagulación.ref(1303) Zinc. Zinc, un elemento micronutriente esencial, es importante para la síntesis de RNA y DNA, y para una variedad de enzimas zinc-dependientes, incluyendo la alcohol deshidrogenasa.ref(1304) La deficiencia de zinc también altera el metabolismo de la vitamina A.ref(1305) Los alcohólicos pueden tener niveles disminuidos de zinc debido a una reducida ingesta oral y a un aumento de su excreción urinaria, y pueden presentar algunos síntomas característicos de los estados de deficiencia de zinc.ref(1306) Estudios futuros serán necesarios para definir el rol del zinc en el hipogonadismo asociado al alcohol y otros problemas relacionados.ref(1307) Plomo. Algunos vinos tienen un alto contenido de plomo.ref(1308) Además, la intoxicación por plomo puede ocurrir en la producción ilegal de whisky u otras bebidas alcohólicas, cuando se emplean alambiques caseros construidos con elementos que tengan plomo, como radiadores viejos o tuberías.ref(1309) Por ello, y debido a su alto riesgo, es necesario detectar en alcohólicos cualquier signo o síntoma de intoxicación por plomo (ver capítulo 38). 1420

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Calcio (ver capítulo 28). Los pacientes con enfermedad hepática alcohólica pueden tener niveles bajos de calcio. Se ha encontrado que el alcohol aumenta la excreción de calcio.ref(1310) Los pacientes con cirrosis tienen una absorción disminuida de calcio, que puede ser el resultado de una disminución en la hidroxilación de la vitamina D en hígado. ref(1311) Si el paciente presenta una mala absorción de grasas, éstas pueden formar con el calcio jabones insolubles en el lumen intestinal, impidiendo así su absorción. Magnesio. Los alcohólicos crónicos comúnmente tienen una deficiencia de magnesio, como resultado de una pobre ingesta en la dieta, cetosis por inanición, vómitos, y aumento de la excreción urinaria lo cual es un efecto directo del alcohol. También es bajo el nivel de magnesio durante el síndrome de remoción de alcohol, lo que puede contribuir a explicar los signos y síntomas de esta alteración.ref(1312) Fósforo. Aproximadamente el 50 % de los alcohólicos hospitalizados presentan hipofosfatemia.ref(1313) Después de una ingestión de carbohidratos, el fósforo sérico disminuye de 10 a 15 mg/L. Los alcohólicos alcanzan su nivel más bajo de fósforo entre el segundo y cuarto día de hospitalización.ref(1314) Los bajos niveles observados en alcohólicos pueden ser resultado del efecto del alcohol por sí mismo, y también de una pobre ingesta de alimentos, diarrea, vómitos, deficiencia de magnesio, o el uso de antiácidos conteniendo aluminio.

Patología: Enfermedades Sistémicas del Alcohólico Mecanismos de daño en órganos El etanol es una toxina sistémica directa que provoca daño en todos los tejidos, dependiendo de la dosis y de la duración de la exposición. El grado de lesión varía entre los distintos sistemas de órganos. El hígado, órgano predominantemente responsable del metabolismo del etanol, presenta la incidencia más alta en cuanto a la severidad del daño ocasionado. El acetaldehído es el producto de las tres vías de oxidación del etanol descritos anteriormente. Varios desórdenes orgánicos y alteraciones bioquímicas parecen ser inducidas por el etanol o por el acetaldehído, pero no necesariamente por ambos. Por ejemplo, el síndrome fetal por alcohol parece obedecer a un efecto del etanol independientemente del acetaldehído,ref(1315) mientras que la fibrosis hepática y la formación de colágeno estarían más asociadas con el acetaldehído que con el etanol. El acetaldehído fácilmente forma aductos con los componentes de la membrana celular, que pueden causar daño celular en forma directa o pueden crear nuevos estimulantes antigénicos. El daño tisular, especialmente en hígado, puede ser de naturaleza inmunológica.ref(1316) Hígado Aparecen tres tipos de condiciones patológicas en hígado que forman un espectro que va desde muy ligeros cambios reversibles hasta la enfermedad irreversible que puede provocar la muerte.21ª Las interrelaciones existentes entre estos cambios se observan en la Fig. 34-1. 1421

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Hígado graso. La forma más leve de lesión hepática se caracteriza por infiltración grasa (hígado graso alcohólico) y por un mínimo grado de inflamación y necrosis. En casos más severos de hígado graso, puede aparecer fibrosis, especialmente alrededor de los canales venosos centrales. Clínicamente, esto se manifiesta por agrandamiento del hígado (hepatomegalia), sensibilidad sobre el órgano y anorexia. Los cambios en los parámetros de laboratorio son mínimos, ligera elevación de los niveles de GOT, bilirrubina y fosfatasa alcalina. Si se dispone de ellos, los parámetros más fiables para detectar los estadios tempranos de la enfermedad son la determinación de ácidos biliares en suero, y la prueba de verde de indocianina. El hígado graso alcohólico se considera habitualmente como una enfermedad benigna y reversible. Sin embargo, se ha observado muerte súbita en un pequeño porcentaje de pacientes, presumiblemente por embolia grasa. Hepatitis alcohólica. Es la forma más severa de lesión hepatotóxica, también caracterizada por hígado graso y hepatomegalia. Además, la inflamación y la necrosis están más extendidas, y la fibrosis es un rasgo destacable. Durante las primeras 6 semanas tras el ingreso hospitalario, el índice de mortalidad para la hepatitis aguda alcohólica alcanza el 60%. La hepatitis alcohólica es frecuentemente un estadio crucial hacia la progresión de la enfermedad cirrótica. En un estudio18 realizado en pacientes con hepatitis alcohólica clínica, la enfermedad derivó en cirrosis en el 54.7% de 97 pacientes en los que se pudo obtener una muestra histológica. En un alto porcentaje (76.2%) de pacientes pudo observarse el contorno irregular de una red homogénea de material eosinófilo en el citoplasma de la célula hepática (cuerpos de Mallory o hialina alcohólica). Su presencia no es diagnóstica de hepatitis alcohólica porque también aparecen en otras patologías hepáticas. Sin embargo, en un alcohólico con enfermedad hepática, su presencia si la sugiere. Se cree que la hialina alcohólica proviene de la degeneración de microfilamentos que luego actúan como irritantes inmunológicos y estimulan la fibrosis. ref(1317) Las manifestaciones clínicas de la hepatitis alcohólica, y así mismo los parámetros de laboratorio involucrados, se observan en la Tabla 34-3. Ninguno de los síntomas o cambios son patognomónicos de esta condición patológica. A medida que la enfermedad progresa, todos los parámetros de laboratorio habituales para daño hepático se vuelven anormales en distinto grado. Especialmente notables son las variaciones en los valores de las enzimas séricas. Aunque el nivel de la GOT está elevado en más del 75%, aún de los casos más suaves, la magnitud de su aumento raramente sobrepasa diez veces el límite superior normal. El valor promedio observado es 84 + 6 mU/mL. De forma similar, el nivel de la GPT está solo ligeramente elevado; habitualmente es menor que 100 mU/mL e invariablemente casi siempre es menor que el de la GOT. Cuando los valores de GPT se aproximan a 200 mU/mL o son mayores que los de GOT, esto indica una hepatitis crónica persistente, o una hepatitis agresiva crónica, en lugar de una hepatitis alcohólica sin complicaciones. En estas circunstancias, solamente una biopsia puede diferenciar la causa de la enfermedad hepática. Aunque la confirmación histológica de la hepatitis es el mejor indicador pronóstico, la bilirrubina sérica y el tiempo de protrombina son los parámetros de laboratorio que permiten predecir de forma segura la severidad y el pronóstico de la enfermedad hepática. Sin 1422

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embargo, no son lo suficientemente sensibles para diagnosticar formas más suaves de la enfermedad, (inclusive en estos casos pueden ser normales), pero a medida que la enfermedad progresa, aumenta su utilidad clínica. Cuando el nivel de bilirrubina es mayor de 200 mg/L y cuando el tiempo de protrombina se prolonga más de cuatro segundos, el paciente está en una condición de alto riesgo. En este grupo, la mortalidad sobrepasa el 75%. Los resultados obtenidos para ambos parámetros permiten clasificar a la enfermedad como leve, moderada o severa.ref(1318) La primera se presenta cuando la bilirrubina es menor de 50 mg/L con un tiempo de protrombina normal o ligeramente aumentado. La enfermedad moderada se presenta cuando la bilirrubina es igual o mayor de 50 mg/L y el tiempo de protrombina es normal o moderadamente elevado (prolongación no superior a cuatro segundos). La enfermedad severa se presenta con niveles de bilirrubina que sobrepasan los 50 mg/L y tiempos de protrombina prolongados en más de cuatro segundos. A medida que la severidad aumenta, la incidencia de ascitis y encefalopatía también se incrementa, mientras que la supervivencia a un año disminuye progresivamente de 91% a 46% (ver Tabla 34-3). Cirrosis. El estadio final de la enfermedad hepática alcohólica crónica es el desarrollo de cirrosis con fibrosis hepática extendida, regeneración nodular, distorsión de la arquitectura del hígado, y finalmente, todas las complicaciones clínicas de la enfermedad hepática crónica, insuficiencia hepática, y muerte. En algunos casos, la cirrosis puede ser difícil de diagnosticar clínicamente, especialmente cuando también están presentes una hepatitis alcohólica activa con necrosis aguda e inflamación. Un diagnóstico exacto de cirrosis sólo se obtiene realizando una biopsia hepática. Páncreas La asociación entre alcohol y pancreatitis es, como mínimo, tan estrecha como la relación entre alcohol y enfermedad hepática. En examen post-mortem, 18% a 47% de los alcohólicos que murieron por causas distintas a pancreatitis, tenían alguna evidencia histológica de pancreatitis.ref(1319) El alcohol es responsable de al menos 30%, según algunos estudios 60% a 90%, de los casos de pancreatitis en Estados Unidos.ref(1320) Aunque existe un amplio rango de variación individual, la duración media de consumo de alcohol previo al diagnóstico inicial de pancreatitis es 18 años para hombres y 11 años para mujeres. Esta diferencia indica que las mujeres tienen mayor predisposición. El riesgo de desarrollar pancreatitis se duplica por cada 50 g de incremento en el consumo diario de alcohol.ref(1321) El alcohol estimula la secreción gástrica de ácido, que cuando entra en contacto con la mucosa duodenal, estimula a su vez la secreción de jugo pancreático.ref(1322) En el proceso inicial de la enfermedad, este jugo pancreático inducido por el alcohol tiene una alta concentración de proteínas, que precipitan y forman tapones dentro de los conductos pancreáticos, provocando subsecuentemente su obstrucción. Esto provoca dilatación y proliferación de los conductos, dilatación del tejido acinar y finalmente, esclerosis de los conductos. Con el tiempo, los tapones de proteínas pueden calcificarse, apareciendo así una imagen radiográfica de pancreatitis calcificada crónica. A medida que este proceso continúa, la concentración de proteínas o de enzimas en el jugo pancreático va disminuyendo hasta que el nivel de enzimas presentes es insuficiente para la digestión de los alimentos, y aparece la mala absorción.refs(1323) En este proceso crónico, y por causas aún no aclaradas, se superponen 1423

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ataques dolorosos de pancreatitis aguda caracterizados por elevación de amilasa y lipasa. La primera crisis de pancreatitis se produce tras un largo periodo de consumo constante de alcohol, por lo que en la mayoría de los pacientes se desarrolla entre los 30 y 40 años.ref(1324) Una vez que la pancreatitis se ha establecido, un alto porcentaje de aquellos que continúan bebiendo padecen dolor crónico.ref(1325) La insuficiencia pancreática aparece cuando 80% a 90% del órgano se ha destruido, requiriendo entonces una sustitución de enzimas por vía oral.ref(1326) Además de la destrucción de las células secretoras de enzimas, también pueden destruirse las células productoras de insulina y glucagón. Cuando esto ocurre, el alcohólico desarrolla una diabetes mellitus y precisa insulina. Debido a que el nivel de glucagón también está disminuido y es demasiado bajo como para estimular adecuadamente la síntesis de glucosa, estos pacientes son diabéticos frágiles y son propensos a ataques hipoglucémicos.ref(1327) Esto hace más difícil el tratamiento , especialmente si continúa el consumo de alcohol.ref(1328) Síndrome alcohólico fetal El alcohol atraviesa fácilmente la placenta y se distribuye por todo el tejido fetal. Está bien demostrado que el etanol es una toxina fetal con características teratogénicas. Por esta razón, el consumo de etanol durante el embarazo está asociado a una variedad de efectos adversos, incluyendo aborto espontáneo, parto prematuro, bajo peso al nacer, muerte en el parto y baja expectativa de vida del neonato, lo que implica retraso en el desarrollo mental y motor, y el síndrome alcohólico fetal. Este último se caracteriza por un perfil de defectos de nacimiento, que incluyen retraso en el crecimiento prenatal y postnatal, anormalidades en el rostro, disfunción renal, disfunción a nivel de Sistema Nervioso Central y retraso mental. Se ha estimado que el síndrome fetal por alcohol constituye la principal causa de retraso mental en el mundo occidental.ref(1329) Complicaciones sistémicas menos frecuentes Corazón. Entre los alcohólicos, la incidencia de enfermedad cardíaca clínicamente significativa es mucho menor que la que corresponde a enfermedad hepática o pancreática. Se estima que entre un 20% y un 30% de alcohólicos desarrollan enfermedad hepática. En dos estudios sobre un total de 278 autopsias de pacientes alcohólicos, 11% a 15% presentaban signos de cardiomiopatía alcohólica.ref(1330) La verdadera incidencia de la cardiomiopatía es desconocida. Cuando aparece, el etanol provoca un efecto depresor agudo sobre la función del miocardioref(1331) con dilatación cardíaca progresiva que terminan produciendo una insuficiencia cardiaca por bajo gasto. Si sobreviene la muerte, ésta ocurre como consecuencia de una importante cardiomegalia y de una insuficiencia cardíaca crónica intratable, complicadas con fenómenos de embolismo. Sistema nervioso central y periférico. Las manifestaciones más comunes de una función cerebral alterada en el alcohólico son los síntomas de embriaguez, seguidos en frecuencia por los síntomas del síndrome de abstinencia: temblor, confusión, alucinaciones, delirium tremens y convulsiones. Todos ellos son habitualmente cambios funcionales reversibles. Menos comunes, pero frecuentemente irreversibles son los desórdenes metabólicos asociados con el prolongado y continuo consumo 1424

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de bebida y, en muchos casos, las deficiencias nutricionales: síndrome de Wernicke-Korsakoff, neuropatía periférica, ambliopía (pérdida de visión), degeneración cerebelar, degeneración cerebral, mielinolisis central pontina y demencia progresiva con desmielinización del cuerpo calloso (enfermedad de Machiafava-Bignami). Estudios clínicos y estudios realizados en animales indican un deterioro inducido por etanol en la función mnemónica del cerebro.ref(1332) (Ver detalles de los síndromes nombrados en un texto de neurología). Cáncer. El cáncer primario de hígado, un tumor raro, se observa en 5% a 10% de los alcohólicos con cirrosis alcohólica.ref(1333) Se cree que está provocado por el mismo proceso cirrótico. Además de los hepatomas asociados a la cirrosis alcohólica, estudios epidemiológicos prospectivos y retrospectivos indican que el consumo crónico de alcohol es por sí mismo un factor de riesgo para el cáncer.ref(1334) Numerosos estudios clínicos realizados en alcohólicos llegaron a la misma conclusión. Los grandes bebedores tienen una mayor incidencia de cáncer de boca, laringe, faringe y esófago.ref(1335) El consumo de alcohol puede también estar relacionado con la incidencia de cáncer de páncreas, cardias y colon.ref(1336) Esta evidencia epidemiológica es más intensa para el caso de cáncer de boca y faringe. Así un bebedor crónico y fumador crónico tiene un riesgo quince veces mayor de desarrollar una patología maligna oral que el no bebedor y no fumador. Al parecer, el riesgo de cáncer asociado a etanol estaría relacionado con el tempo de consumo y la dosis.ref(1337) Efectos endocrinos. Varían dependiendo si el consumo de alcohol es agudo o crónico.ref(1338) Un consumo moderado de alcohol tiene escaso efecto en el cortisol a nivel de la glándula adrenal,ref(1339) aunque cuando el nivel sanguíneo de alcohol supera 1 g/L puede provocar un aumento en el nivel plasmático de cortisol. Los alcohólicos crónicos muestran ocasionalmente rasgos clínicos del síndrome de Cushing y niveles elevados de cortisol.ref(1340) La abstención provoca el retorno del cortisol a sus valores normales en 2 a 3 semanas.ref(1341) Algunos alcohólicos muestran evidencia de insuficiencia hipofisaria. Normalmente, bajos niveles sanguíneos de glucosa producen un aumento del cortisol. Esta respuesta está disminuida o ausente en el 25% de los alcohólicos crónicos porque la glándula hipofisaria no secreta suficiente cantidad de hormona adrenocorticotrópica (ACTH) para estimular la glándula adrenal.ref(1342) Otra evidencia de insuficiencia hipofisaria son los niveles bajos de hormona de crecimiento y prolactina después de la estimulación provocada por un bajo nivel de glucosa sanguínea.ref(1343) Se cree que los niveles bajos de testosterona que se observan en alcohólicos también están relacionados a una insuficiencia pituitaria.ref(1344) Efectos hematopoyéticos. Los efectos del alcohol sobre la sangre y la médula ósea son el resultado de su acción tóxica directa y de las deficiencias nutricionales asociadas.ref(1345) (ver Capítulos 37 y 39). Los alcohólicos no sólo presentan niveles bajos de folato, sino que el alcohol también inhibe la absorción de la vitamina B12. Cada uno de estos factores por sí mismo, o la combinación de ambos, llevan a la producción de glóbulos rojos anormalmente grandes y a la anemia megaloblástica.refs(1346) El metabolismo del hierro se ve afectado por el alcohol de diversas maneras. El 1425

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alcohol puede producir pérdida crónica de sangre (úlceras, gastritis, sangrado de várices) provocando una anemia por deficiencia de hierro.ref(1347) Un aumento del hierro sérico y tisular también puede ser observado con un consumo excesivo de alcohol y causar una utilización anormal de hierro en la médula ósea. Finalmente, el exceso de alcohol puede provocar una anemia hemolítica aguda. La inhibición de la médula ósea por el alcohol provoca una disminución en el número de glóbulos blancosref(1348) y plaquetasref(1349) circulantes. El alcohol también altera la función de los glóbulos blancosref(1350), y la cirrosis alcohólica altera la función plaquetaria,ref(1351) lo que respectivamente provoca un aumento en la susceptibilidad a las infecciones y sangrado. La deficiencia de vitamina K observada en alcohólicos origina un tiempo de protrombina prolongado debido a la falta de factores de coagulación vitamina K dependientes normalmente producidos en el hígado. Cuando la enfermedad hepática es severa, factores de coagulación inadecuados son producidos aún en presencia de vitamina K. Sistema inmune. Se sabe que el etanol afecta el sistema inmune. En la mayoría de los pacientes con enfermedad hepática alcohólica, se ha identificado un aumento de los anticuerpos células B circulantes.ref(1352) En pacientes con hepatitis alcohólica se han identificado anticuerpos específicos contra la hialina alcohólica,ref(1353) lo que explicaría la frecuente elevación de inmunoglobulina A.ref(1354) Los principales cambios han sido observados en el sistema inmune celular. El número total de células T está disminuidosref(1355); su capacidad para sintetizar DNA está deteriorada (transformación linfocítica)ref(1356); su respuesta a antígenos y mitógenos está suprimidaref(1357); y sus propiedades citóxicas están aumentadas.ref(1358) Todo esto se manifiesta clínicamente por un recuento bajo de linfocitos, anergia a los pruebas cutáneas,ref(1359) respuesta alterada a las vacunas,refs(1360) y susceptibilidad aumentada a las infecciones. Estas alteraciones inmunológicas pueden ser en parte responsables de algunas de las lesiones de las células hepáticas y de la progresión de la enfermedad observada en pacientes con hepatitis alcohólica.refs(1361)

Patología: Traumatismo y Abuso de Alcohol Diversos estudios han demostrado que aproximadamente 35% a 55% de los pacientes con traumatismo que ingresan en las salas de urgencias tienen niveles elevados de alcohol en sangre,ref(1362) y muchos de ellos también muestran evidencia de abuso de drogas. La causa más frecuente es el traumatismo por accidente de tráfico. La mitad de los accidentes vehiculares, responsables de 25.000 muertes y más de 500.000 heridos por año, están relacionados con un conductor involucrado con una prueba de alcohol en sangre positiva.ref(1363) Los hombres tienen dos veces más probabilidad que las mujeres de muerte por conducir en estado de embriaguez. En el grupo de 18 a 45 años, sin embargo, la relación es de 3 a 1.ref(1364) Estas cifras ciertamente describen un estado patológico que es endémico en la sociedad de los Estados Unidos. El gran número de pacientes con traumatismo que ingresan en las salas de urgencias implican un desafío para el laboratorio. Un paciente que se presenta con traumatismo y con alteración del nivel de conciencia requiere estudios de laboratorio para determinar en forma inmediata su causa. Deben descartarse como posibles causas de la alteración del nivel de conciencia: traumatismo, trastornos metabólicos, causas infecciosas y 1426

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abuso de drogas. El panel de cribado para drogas de abuso debe incluir la determinación de alcohol en sangre. El tratamiento del paciente depende en gran medida del resultado de estos estudios de laboratorio, que deben ser realizados en un tiempo razonablemente corto.

Cambio del Compuesto Analizado en la Enfermedad (Tabla 34-4) Enzimas El aumento en los niveles séricos de las enzimas observados en la enfermedad hepática pueden ser el resultado del paso de enzimas a sangre debido al daño producido en las membranas celulares (GOT, GPT y lactato deshidrogenasa), o al incremento de la producción de enzimas (fosfatasa alcalina y GGT). Aspartato aminotransferasa (GOT) y alanino aminotransferasa (GPT). Ambas enzimas séricas se encuentran en el hígado y fácilmente escapan de las células durante los procesos de necrosis y daño celular. Aunque la lesión hepática producida por el alcohol está caracterizada por necrosis de las células hepáticas e inflamación, el aumento de estas enzimas es mínimo a moderado, siendo siempre mayor el observado en la GOT. Las alteraciones de esta enzima son frecuentes y aparecen precozmente, pero la magnitud del cambio no siempre es paralelo a la gravedad clínica de la lesión hepática.ref(1365) La causa de esta mínima respuesta enzimática ante la lesión hepática no se conoce con certeza. En algunos pacientes el déficit de piridoxina puede ser uno de los factores que contribuyan a esta baja respuesta enzimática, dado que para las reacciones de transaminación se requiere el piridoxal fosfato. (ver pág. 518, Métodos) Fosfatasa alcalina. En la enfermedad hepática alcohólica el aumento de la actividad de esta enzima tiende a ser paralelo a los cambios observados en los niveles de bilirrubina. 5' Nucleotidasa. 5' nucleotidasa no es tan sensible a la lesión hepática como la fosfatasa alcalina. Sin embargo, se mide junto con ésta para determinar si el aumento de la fosfatasa alcalina es el resultado de enfermedad hepatobiliar o de enfermedad ósea. Gama-glutamiltransferasa. Se ha observado aumento de los niveles séricos de esta enzima en alcohólicos con enfermedad hepática mínima o ausente. Esto se ha atribuido a una inducción enzimática microsomal mas que a la lesión hepática. (Ver pág. 515) Bilirrubina Aunque el alcohol no altera en forma directa el metabolismo de la bilirrubina, la lesión hepática producida por el alcohol sí lo hace. La ictericia, el signo clínico del aumento de bilirrubina, aparece en 60% de los pacientes con hepatitis alcohólica.ref(1366) El aumento de bilirrubina, junto con un tiempo de protrombina prolongado que no responde a vitamina K, y la disminución de albúmina sérica, se correlacionan bien con la gravedad de la hepatitis alcohólica. En algunos casos, los niveles de bilirrubina aumentan conjuntamente con los de fosfatasa alcalina, lo cual podría indicar obstrucción de conductos biliares.ref(1367) Debido a que 1427

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los pacientes con hepatitis alcohólica no toleran bien la cirugía, previamente a la misma, deben realizarse procedimientos diagnósticos tales como la colangiografía endoscópica o percutánea para confirmar el diagnóstico de obstrucción extrahepática. Proteínas Prealbúmina y albúmina. La prealbúmina y la albúmina se sintetizan y secretan por el hígado, por lo que sus concentraciones en suero son útiles como parámetros de función hepática. Los niveles séricos de prealbúmina están disminuidos en la malnutrición proteico-calórica (M.P.C.) y en todas las formas de enfermedad hepática, incluyendo aquellas asociadas con alcoholismo. No es raro encontrar valores por debajo de 160 mg/L en la M.P.C. severa.ref(1368) Se considera que la prealbúmina es un parámetro más sensible y específico que la albúmina para el estudio de la M.P.C. Niveles disminuidos de albúmina sérica en alcohólicos pueden indicar M.P.C. o enfermedad hepática. En un estudioref(1369) realizado en 111 pacientes con hepatitis alcohólica grave (Veterans Administration Cooperative Study), 18% tenían valores por debajo de 20 g/L, mientras que solamente 1% tenían valores dentro del rango normal. Muchos pacientes con enfermedad hepática alcohólica tienen ascitis con aumento del espacio extravascular, por lo cual el bajo nivel de albúmina sérica observado en ellos puede representar un desplazamiento de la albúmina desde el compartimiento intravascular hacia ese espacio extravascular expandido. Globulinas. Los niveles de gama globulinas séricas cambian durante la enfermedad hepática en respuesta a la estimulación antigénica, reflejando los cambios inmunológicos asociados a la enfermedad hepática alcohólica. De los tres tipos de gama globulinas (IgA, IgG e IgM), la IgA es la que más frecuentemente aumenta en la enfermedad hepática alcohólica. Está elevada en el 90% de los casos, con un aumento medio de 118%.ref(1370) IgM es la que menos aumenta, presentando niveles elevados en el 25% de los casos. La IgG aumenta en el 64% de los casos con un aumento medio de 25%. Lípidos Triglicéridos y colesterol. Los niveles séricos de colesterol y triglicéridos están frecuentemente aumentados y son descritos en pág. 654. Acidos biliares. El hígado es responsable de casi todas las etapas del metabolismo de los ácidos biliares, por lo que éstos son indicadores muy sensibles de lesión hepática, aún cuando ésta sea mínima. En la enfermedad hepática alcohólica, los ácidos biliares séricos, especialmente los conjugados de ácido cólico, se correlacionan con los hallazgos de la biopsia.ref(1371) El hígado graso por sí solo no está asociado con niveles elevados, mientras que la hepatitis alcohólica y la cirrosis van acompañadas de aumentos significativos en los niveles séricos. En el estudioref(1372) realizado por Veterans Administration Cooperative en pacientes con hepatitis alcohólica, la colil glicina estaba alterada con más frecuencia que cualquier otro parámetro de 1428

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lesión hepática. Carbohidratos Hiperglucemia. El daño hepatocelular, independientemente de su etiología, es una importante causa de intolerancia a la glucosa y juega un papel importante en la hiperglucemia observada en algunos alcohólicos.ref(1373) Sin embargo, el alcohol raramente es responsable de producir una gran intolerancia a la glucosa o una diabetes franca.ref(1374) La elevación de los niveles de cortisol inducida por el alcohol, especialmente cuando es suficiente para provocar un síndrome de pseudo-Cushing, es otro factor que contribuye a la hiperglucemia alcohólica.ref(1375) Hipoglucemia. Aunque la hipoglucemia puede aparecer en la enfermedad hepática grave con insuficiencia hepática fulminante, también aparece asociada al uso de alcohol y a un hígado relativamente normal.ref(1376) La hipoglucemia puede ser la causa de muerte súbita entre los alcohólicos, con una mortalidad de 11% en adultos y 25% en niños.ref(1377) Esta forma de hipoglucemia (en ayunas e inducida por alcohol) aparece en alcohólicos crónicamente malnutridos o cuando se consumen de moderadas a grandes cantidades de alcohol después de un ayuno de 6 a 36 horas.ref(1378) Los pacientes están estuporosos o comatosos, tienen aliento alcohólico y frecuentemente están hipotérmicos. El diagnóstico se realiza mediante los hallazgos clínicos de hipoglucemia y elevado nivel de alcohol en sangre; la acidosis láctica no es rara.ref(1379) Los niveles de insulina plasmática son bajos, mientras que los de glucagón son altos.ref(1380) Aunque la hormona de crecimiento y el cortisol están aumentados, este aumento es aún menor del esperado para la gravedad de la hipoglucemia.ref(1381) El mecanismo de la hipoglucemia es probablemente multifactorial, en el que juega un papel principal la inhibición de la gluconeogénesis provocada por el alcohol.ref(1382) También contribuyen otros factores, como una leve deficiencia adrenocortical, y un defecto en la secreción de la hormona de crecimiento.ref(1383) Otra forma de hipoglucemia aparece cuando se consume el alcohol conjuntamente con carbohidratos (hipoglucemia reactiva inducida por alcohol).ref(1384) El alcohol tiene la capacidad de potenciar las propiedades insulino-estimulantes de la glucosa.ref(1385) Así, el alcohol consumido en las comidas puede potenciar la secreción de insulina y provocar hipoglucemia nocturna. Las grandes cantidades de café azucarado que habitualmente se utilizan para mitigar los efectos de la intoxicación alcohólica a un paciente, pueden provocar una rápida y grave hipoglucemia reactiva que puede contribuir a que se produzca un accidente de tráfico. Cetoacidosis alcohólica. La cetoacidosis es una complicación infrecuente que aparece en alcohólicos no diabéticos.ref(1386) Los pacientes tienen dolor abdominal, vómitos y antecedentes de no ingestión reciente de alimentos. Están acidóticos, pero conscientes, con niveles altos de cetonas en suero, agua y sales disminuidos, y niveles normales de glucosa.ref(1387) El mecanismo de la cetosis alcohólica no está claro.ref(1388) La concentración plasmática de insulina es baja, con niveles altos de cortisol y ligero aumento del nivel de hormona de crecimiento.

Pruebas de Función Hepática 1429

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Excreción de verde de indocianina El verde de indocianina no tiene efectos colaterales, y es rápidamente excretado por la bilis sin conjugarse en el hígado. Este colorante tiene la ventaja de poder ser monitoreado en forma exacta y continua con un densitómetro dicromático colocado en la oreja, eliminando la necesidad de la toma de muestra venosa.ref(1389) Se cree que la eliminación del colorante está relacionada con el flujo sanguíneo en el hígado. Esta prueba es la prueba de excreción de colorante de elección, aunque no sea utilizada en forma rutinaria.

Métodos de Análisis Alcohol K. Michael Parker

Principios del análisis y uso corriente. El alcohol es un importante depresor del sistema nervioso central. Si se ingiere en cantidad suficiente, puede provocar la muerte por depresión irreversible de la respiración. Debido a las serias consecuencias de la intoxicación por etanol, es importante disponer de un rápido análisis para iniciar la terapia apropiada. Además, debido a las implicancias médico legales de la intoxicación por alcohol, el análisis debe ser exacto.ref(1390) Además del etanol,otros alcoholes también pueden estar presentes, como metanol, isopropanol o etilenglicol, y se han desarrollado técnicas específicas su cuantificación. La medición del etanol puede realizarse en el laboratorio clínico por métodos químicos, enzimáticos y cromatográficos. Además de estas técnicas directas de cuantificación, también pueden utilizarse para la estimación del etanol técnicas indirectas semicuantitativas, como la osmometría por descenso del punto de congelación. Los primeros métodos químicos para la determinación de etanol estaban basados en la oxidación del etanol por dicromato de potasio u otros agentes oxidantes en un medio fuertemente ácido. (Tabla 34-5, método 1). La reducción del dicromato da como resultado un cambio de color que puede ser medido para monitorear la reacción. La mayoría de los métodos químicos se consideran obsoletos por su tediosidad, falta de adaptación a la automoatización y poca especificidad.ref(1391) Es importante recordar que estos métodos químicos no son específicos para etanol, pues también detectan agentes reductores volátiles. Una modificación de los ensayos químicos es el método de Widmark,ref(1392) que se basa en la simultánea destilación y oxidación del etanol por dicromato. Un método de microdifusión basado esencialmente en el mismo principio ha sido desarrollado recientemente para uso comercial.ref(1393) En este procedimiento, el ácido crómico, reactivo contenido en una lámina de fibra de vidrio, es reducido por acción del etanol a óxido crómico de color azul. Calentando la muestra a 80ºC-120ºC, el etanol es liberado hacia la lámina de fibra de vidrio que se coloca directamente sobre de la muestra. En la actualidad, los métodos enzimáticos son los más utilizados para la determinación de etanol. La alcohol deshidrogenasa (ADH), la enzima empleada en estos ensayos, es específica para etanol y no reacciona con metanol o acetona. Sin embargo, la enzima puede mostrar una ligera reacción cruzada con propanol (6% para 2-propanol y 1% para 1430

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1-propanol). Aunque la alta especificidad de ADH por etanol asegura la no interferencia con metanol y poca interferencia con isopropanol, los métodos enzimáticos pueden ser la causa de resultados engañosos en casos donde la intoxicación es provocada por la ingestión de isopropanol. La comparación de resultados de los ensayos enzimáticos con otros menos específicos, como los químicos u osmométricos, puede ayudar a identificar la presencia de éstos u otros alcoholes. El ensayo enzimático (Tabla 34-5, método 2a) está basado en la oxidación del alcohol a acetaldehído con la reducción concomitante de NAD+ a NADH. El NADH producido puede ser directamente leído a 340 nm, o puede acoplarse a otra reacción alternativa. Abbott desarrolló una variación denominada atenuación de energía radiante, que mide el grado de inhibición de la fluorescencia de la fluoresceína resultante de la producción de un producto coloreado (Tabla 34-5, método 2b).ref(1394) En este ensayo, la reacción inicial de ADH con etanol se acopla a una segunda reacción entre NADH y una sal de tetrazolio, yodonitrotetrazolio (INT). Esta reacción adicional, catalizada por la diaforasa, causa la reoxidación de NADH a NAD junto con la generación de un compuesto coloreado formazan-INT. Este producto tiene un pico de absorbancia a 492 nm, que se solapa al espectro de excitación y emisión de la fluoresceína incluida en la mezcla de reacción. La disminución en la intensidad de la fluorescencia es inversamente proporcional a la concentración de etanol presente en la muestra. Existe buena concordancia entre los métodos enzimáticos y cromatográficos.ref(1395) Sin embargo, algunos métodos enzimáticos pueden dar concentraciones de etanol falsamente elevadas en muestras de pacientes con altos niveles séricos de ácido láctico y lactato deshidrogenasa.ref(1396) Aunque los métodos enzimáticos no son absolutamente específicos para etanol, reúnen los requerimientos de exactitud, precisión y fiabilidad. La cromatografía de gases (Tabla 34-5, método 3) se considera el método de referencia.ref(1397) La cromatografía no es tan popular como los métodos enzimáticos debido a que requiere de personal experto para su realización, además del hecho de que la compra y mantenimiento de instrumental sofisticado dedicado solamente a una única clase de estudios no es efectivo desde el punto de vista del análisis de costos. Sin embargo, la cromatografía gaseosa ofrece la ventaja de permitir la detección simultánea de otros alcoholes y compuestos volátiles como metanol o isopropanol. Una consideración importante a tener en cuenta cuando se emplea la cromatografía de gases es el tipo de método de inyección utilizado, análisis directo o por "head-space." La inyección directa de sangre o suero habitualmente requiere que la muestra se diluya con una solución acuosa que contenga el standard interno. Se inyectan pequeños volúmenes (0.5 microlitros) y después de cada inyección debe lavarse cuidadosamente la jeringa. Empleando estas precauciones se aumenta de manera considerable la vida de la columna cromatográfica. Los procedimientos de head-space inyectan dentro del sistema de cromatografía gaseosa una muestra de aire desde un espacio que queda por encima de la sangre en un recipiente cerrado. Este tipo de análisis evita la contaminación de la columna e inyector. Puede obtenerse mayor sensibilidad agregando a la muestra una sal como el cloruro de sodio. La adición de sal provoca un aumento de la concentración de la sustancia volátil en la fase de vapor. La presencia de alcohol en suero produce un aumento en la osmolalidad del suero cuando ésta se mide mediante la técnica de descenso del punto de congelación (Tabla 34-5, método 4). Los osmómetros que usan la propiedad del descenso de la presión de vapor para 1431

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medir osmolalidad no pueden utilizarse para la estimación de la concentración de alcohol debido a que éste es volátil y contribuye significativamente a la presión de vapor por encima de la solución. Este fenómeno producirá una medición falsamente disminuida de la osmolalidad sérica. En la presencia de alcohol, se produce un aumento de la diferencia entre la osmolalidad medida (por descenso del punto de congelación) y la osmolalidad calculada (ver capítulo 14 acerca de la osmolalidad calculada). Esta diferencia osmolal se correlaciona razonablemente bien con las concentraciones de alcohol en sangre. Sin embargo, se ha descrito una sobreestimación de las concentraciones de alcohol de hasta 30%.ref(1398) Esta discrepancia se ha atribuido al comportamiento osmótico no ideal del etanol, que puede alterar el grado de disociación de solutos dentro de la muestra. Independientemente de estos inconvenientes, la medición de la diferencia osmolal puede ser útil en el diagnóstico de la intoxicación aguda en situaciones de urgencia. Además, la diferencia osmolal es no selectiva respecto del tipo de alcohol detectado, lo que implica que puede ayudar a revelar la presencia de otros alcoholes diferentes al etanol si se dispone de los resultados de las determinaciones enzimáticas de etanol. Muestra. Si la determinación se realiza por procedimientos enzimáticos, se puede utilizar suero, plasma u orina. Los anticoagulantes no interfieren con los métodos enzimáticos, ni con los métodos por cromatografía de gases. Cuando se utiliza ésta última, cualquier líquido biológico o tejido puede servir como muestra. Todas las muestras deben estar bien tapadas y preferiblemente refrigeradas, a fin de evitar la pérdida de etanol u otros alcoholes presentes. En muestras selladas de sangre completa no se observó pérdida de etanol durante 14 días cuando fueron almacenadas entre 0ºC-3ºC, o a temperatura ambiente (22ºC-29ºC).ref(1399) Intervalo de referencia. El etanol, al igual que otros compuestos volátiles como el metanol y el n-propanol, no están presentes en sangre o tejidos en condiciones normales. Una concentración sanguínea de etanol igual o mayor de 3000 µg/mL (65.1 mmol/L) puede provocar coma, mientras que niveles superiores a 4000 µg/mL (86.8 mmol/L) pueden llevar a la muerte. Sin embargo, dado que el metabolismo del alcohol varía en forma substancial de unos individuos a otros, los síntomas asociados con el consumo de etanol pueden presentarse en forma diferente en distintos pacientes.

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85. 86. 87.

88. 89. 90. 91. 92. 93.

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Tablas Tabla 34-1. Niveles de alcohol en sangre y síntomas.

1436

Alcohol en sangre (mg/L) de intoxicación

Signos físicos

< 500 Generalmente, ninguno 1000 Legalmente intoxicado

Estado relajado

2000 - 2500

Atención disminuida Intoxicación importante Letargia pronunciada Esfuerzo para mantener control emocional y motor

3000 - 3500

Estupor y coma

Grado

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> 5000

Probabilidad de muerte.

Tabla 34-2. Vitaminas en el alcohólico. Efecto del alcohol en la absorción Vitamina Clasificación intestinal A B1 (tiamina) B2 (riboflavina) Acido nicotínico B6 (piridoxina) Acido fólico B12 (cianocobalamina) C (ácido ascórbico) D E K

Liposoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Liposoluble Liposoluble Liposoluble

Incidencia ( % ) de bajos niveles séricos en cirrosis alcohólica

Disminuida Disminuida Sin efecto No evaluado Sin efecto Sin efecto Disminuida No evaluado No evaluado No evaluado No evaluado

12 58 6 33 60 78 25 25 ? 15 ?

Tabla 34-3. Rasgos clínicos iniciales y complicaciones de la hepatitis alcohólica.* Rasgo o complicación AnorexiaH Pérdida de pesoI Fiebre Hepatomegalia EsplenomegaliaH Infección Pancreatitis Sangrado gastrointestinal Ascitis Leve Moderada Severa CombinadasH Encefalopatía Grado 1

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Leve

Severidad de la enfermedad Moderada Severa

46.2 36.8 18.0 85.9 24.5 5.2 13.6 10.4

63.0 27.1 26.2 97.1 38.6 16.8 10.3 7.5

65.7 16.2 19.2 88.9 46.2 8.1 10.1 14.1

18.7 11.0 1.3 31.0

19.4 38.0 20.4 77.8

17.2 45.5 29.3| 92.0

17.3

29.6

25.3

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Grado 2 4.5 Grados 3 y 4 0.7 Combinadasb 2.5 Probabilidad de sobrevida 1 año' 0.91 + 0.027

24.1 3.7 57.4

41.4 0.0 66.7

0.75 + 0.045

0.46 + 0.055

De Mendenhall CL, Anderson S., Weesner RE, et al; Am J Med 73:221-222, 1984. *El diagnóstico de las diversas condiciones y rasgos que pueden complicar el cuadro no fue definido en el protocolo, pero fue determinado por el criterio clínico de cada investigador participante. Debido a que n varía en los distintos grupos clasificados de acuerdo a la severidad (leve, 156; moderada,108; severa,99), los valores se expresan como un porcentaje del total. El análisis de los datos consiste en un test de chi-cuadrado, el cual, cuando fue significativo para el nivel 0.05, fue seguido de un test de Bartholomew. El orden hipotético fue pleve < pmoderada < psevera excepto para la pérdida de peso, donde la presencia de ascitis revierte el orden hipotético. H p < 0.005 (test de Batholomew). I La incidencia disminuida de la pérdida de peso con el aumento de la severidad representa una mayor incidencia de ascitis. ' p < 0.006. Todas las comparaciones (leve, moderada, severa) determinadas por un test estadístico de distribución normal.

Tabla 34-4. Prevalencia de alteraciones de laboratorio en hepatitis alcohólica. Dirección en el cambio del Prueba

compuesto analizado

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Hemoglobina

Disminución

74 (0.70)

85 (0.66)

93 (0.60)

Hematocrito

Disminución

76 (0.80)

83 (0.76)

95 (0.70)

VCM

Aumento

73 (1.1)

83 (1.1)

90 (1.1)

Disminución

2

8

0

13

7 (1.1)

54 (1.24)

Disminución

11 (0.8)

9

8

ASAT (TGO)

Aumento

79 (2.1)

98 (3.1)

91 (2.5)

ALAT (SGPT)

Aumento

62 (1.9)

73 (1.9)

56 (1.9)

Bilirrubina total

Aumento

53 (1.6)

100 (13.5)

100 (18.7)

Fosfatasa alcalina Aumento

67 (1.4)

100 (2.3)

88 (1.9)

Tiempo de protrombina

Aumento

65

90

100

BUN

Aumento

3

17 (0.7)

36 (1.4)

Disminución

3 (0.5)

0

0

Glóbulos blancos Aumento

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Incidencia de resultados anormales, % (LNS x X media del grupo)*

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Creatinina

Aumento

2 (0.60)

17 (0.76)

29 (1.35)

Albúmina

Disminución

36 (0.74)

90 (0.54)

96 (0.48)

Colilglicina

Aumento

85 (8.2)

100 (25.2)

100 (15.1)

IgG

Aumento

49 (1.1)

72 (1.3)

83 (1.6)

Ig A

Aumento

84 (1.7)

98 (2.6)

93 (2.8)

Ig M

Disminución

17 (0.66)

26 (0.73)

43 (0.95)

Inmunoglobulinas

De: Leevy CM, Cardi L., Frank O. Et al: Am J Nutr 17:259-271,1965 * Los datos se expresan como cambio en los valores del parámetro de laboratorio, y la incidencia de resultados anormales se expresa como el porcentaje del total y la magnitud del cambio (número de veces el límite superior normal [LSN] para la media); n = 89 para el Grupo I, 58 para el II, y 37 para el III.

Tabla 34-5. Métodos para la determinación de alcohol.

Método

1. Destilación-oxidación

Tipo de análisis

Colorimétrico

Principio

El alcohol difunde en la fase gaseosa y reacciona con un agente oxidante, cambiando su color: 2K2Cr2O7 + 10H2SO4 +3C2H5OH (amarillo-naranja) 2Cr2(SO4)4 + 2K2SO4 + 3CH3COOH (azul- verdoso)

Uso

Se usa rara vez

Comentarios

No específico; da reacción con todos los volátiles; todos los fluidos corporales; tejido

Método

2. Enzimático

Tipo de análisis

a. Espectrofotométrico

Principio

NAD+ + Alcohol alcohol deshidrogenasa NADH + H+ + Acetaldehído

Uso

Rutinario; suero; frecuentemente usado

Comentarios

Específico para etanol; otros alcoholes no se pueden medir fácilmente b. Fluorométrico

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b. Fluorométrico

Figuras

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Principio

Reacción como en (2a) más NADH NAD+ + colorante de monotetrazolio reducido (fluorescencia de fluoresceína disminuida)

Uso

Rutinario

Comentarios

Específico para etanol; otros alcoholes no se pueden medir fácilmente

Método

3. Cromatografía de gases

Typo de análisis

Ionización de flama

Principio

El alcohol se separa en un columna cromatográfica

Uso

Rutinario; todos lo fluidos corporales; comúnmente usado

Comentarios

Específico para todos los alcoholes

Método

4. Osmometría

Tipo de análisis

Abatimiento del punto de congelación

Principio

El alcohol en alta concentración aumenta la osmolalidad; la diferencia entre el valor calculado y el medido es proporcional a los niveles de alcohol

Uso

Suero

Comentarios

No específico; detecta otras sustancias volátiles

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Figura 34-1 Enfermedad Hepática alcohólica.

CAPÍTULO 35

35. Metabolismo del Hierro, Porfirina y Bilirrubina William E. Schreiber

PARTE I: METABOLISMO DEL HIERRO Función Metabolismo Absorción Recambio celular de los eritrocitos Transporte e incorporación a la célula Almacenamiento Condiciones patológicas Deficiencia de hierro Exceso de hierro Cambio del compuesto analizado en la enfermedad Estudios hematológicos Hierro sérico Capacidad total de fijación del hierro y saturación de la transferrina

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Ferritina sérica Protoporfirina eritrocitaria libre PARTE II: SÍNTESIS DE HEMO Y LAS PORFIRIAS Estructura y función Bioquímica Vía sintética Puntos de interés Condiciones patológicas Porfirias neurológicas Porfirias cutáneas Trastornos secundarios del metabolismo de las porfirinas Cambio del compuesto analizado en la enfermedad Porfobilinógeno Acido delta aminolevulínico Porfirinas urinarias Porfirinas fecales Porfirinas eritrocitarias Ensayos enzimáticos Genética molecular PARTE III: BILIRRUBINA Formación y estructura Metabolismo Producción Transporte Incorporación hepática, conjugación y excreción Tránsito intestinal Condiciones patológicas: hiperbilirrubinemia Sobreproducción Incorporación disfuncional Conjugación defectuosa Excreción reducida Obstrucción Cambios del compuesto analizado en la enfermedad Bilirrubina Delta bilirrubina Urobilinógeno

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MÉTODOS DE ANÁLISIS Hierro y capacidad total de fijación de hierro Porfobilinógeno OBJETIVOS Enumerar las funciones fisiológicas del hierro y describir su absorción a partir del tubo digestivo y su transporte en el cuerpo. Describir las condiciones patológicas que conducen a la deficiencia y al exceso de hierro, y describir los cambios en los siguientes compuestos analizados en la anemia por deficiencia de hierro, anemia por enfermedad crónica, talasemia, hemocromatosis, e intoxicación por plomo: ferritina, hierro sérico, capacidad de fijación de hierro, y protoporfirina eritrocitaria libre. Definir la porfiria y distinguir entre las profirias primarias y secundarias. Enumerar los compuestos analizados de porfirinas que se encuentren elevados en las porfirias, tanto primarias como secundarias. Reseñar la formación y el catabolismo de la bilirrubina

Términos Clave ámpula de Vater La unión del ducto biliar común y el ducto pancreático proximal en su entrada al duodeno. anemia Una reducción en la cantidad de hemoglobina o del número de glóbulos rojos en la sangre. anemia hemolítica Anemia causada por una sobre vivencia corta de los glóbulos rojos maduros. anemia megaloblástica Anemia caracterizada por precursores agrandados de los glóbulos rojos en la médula ósea. anemia perniciosa Una anemia megaloblástica causada por una falla en la absorción de la vitamina B12. anemia sideroblástica Un grupo heterogéneo de anemias en el cual el almacenamiento de hierro en los tejidos reticuloendoteliales está aumentado y los normoblastos de la médula ósea contienen depósitos de hierro dentro de las mitocondrias (sideroblastos anillados). bilis El fluido verde amarillento secretado por el hígado y vertido al duodeno a través de los ductos biliares. canalículo biliar Los canales finos tubulares que circulan entre las células del hígado en donde la bilis es secretada. cirrosis Una enfermedad del hígado caracterizada por la pérdida de la arquitectura microscópica normal, con fibrosis y regeneración nodular. colestasis La interrupción del flujo biliar. concentración media de hemoglobina corpuscular (CMHC) La concentración promedio de hemoglobina por glóbulo rojo. eritropoyesis La producción de eritrocitos. fagocito Cualquier célula que ingiere microorganismos, otras células o partículas extrañas. fotoisómeros Isómeros producidos por exposición a la luz. fotosensibilidad Reactividad anormal de la piel a la luz solar. hemoglobina corpuscular media (HCM) La cantidad promedio de hemoglobina por glóbulo rojo. 1443

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hipocrómico Se refiere a los eritrocitos que son más pálidos que los normales debido a una disminución en el contenido de hemoglobina. microcítico Se refiere a los eritrocitos que son menores que el intervalo de referencia. parénquima El tejido funcional de un órgano (excluyendo el marco fibroso). porfirinuria La presencia de porfirinas en exceso en la orina. quelato Un compuesto químico en el cual un ion metálico está firmemente unido a una molécula quelante. sistema reticoloendotelial Un sistema funcional compuesto de células altamente fagocíticas con atributos tanto endotelial como reticular, localizado en los vasos sanguíneos, nódulos linfáticos, hígado, bazo, médula ósea, y otros tejidos. talasemia Un grupo heterogéneo de anemias hemolíticas hereditarias que exhiben una velocidad reducida de síntesis de una o más cadenas polipeptídicas de la hemoglobina. taquicardia Velocidad alta del pulso cardiaco. volumen corpuscular medio (VCM) El volumen promedio de los glóbulos rojos.

Parte I: Metabolismo del Hierro Función El hierro es uno de los elementos más abundantes en la tierra, aunque en las células vivas solamente se encuentra presente en cantidades traza. La mayor parte del hierro en los humanos se encuentra dentro del anillo de porfirina del hemo, el cual es incorporado a las proteínas tales como la hemoglobina, mioglobina, catalasa, peroxidasas, y citocromos. Hay también proteínas hierro-azufre, como la NADH deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa, en las que el hierro está presente en agrupaciones con azufre inorgánico. En todos estos sistemas, lo que hace que el hierro sea biológicamente indispensable es su habilidad para interactuar reversiblemente con el oxígeno y funcionar en las reacciones de transferencia de electrones. Un hombre adulto promedio tiene alrededor de 4g de hierro corporal. Alrededor del 65% al 70% del total se encuentra en la hemoglobina, y cerca del 10% está localizado en la mioglobina y las otras enzimas y proteínas que contienen hierro. El 20 a 25% restante consiste de una fuente de almacenamiento de hierro. En comparación, la mujer adulta promedio tiene solamente 2 a 3 g de hierro en su cuerpo. Esta diferencia es atribuible en parte a que en las mujeres las reservas de hierro son mucho menores. Hay también menos hierro en la hemoglobina porque las mujeres tienen una concentración baja de hemoglobina en la sangre y un volumen vascular menor que el de los hombres. La distribución del hierro se resume en la Tabla 35-1.

Metabolismo Los requerimientos diarios de hierro varían dependiendo de la edad de la persona, del sexo y del estado fisiológico. Aun cuando el hierro no es excretado en el sentido 1444

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convencional, hay una pérdida diaria de 1mg a través del desprendimiento normal de las células epiteliales de la piel, y de las células que cubren los tractos gastrointestinal y urinario. Cantidades menores de eritrocitos se pierden en la orina así como en las heces. Una entrada de hierro de 1 mg por día es por lo tanto suficiente para los hombres y las mujeres postmenopáusicas. Sin embargo, debido a que la pérdida de sangre el ciclo menstrual acarrea de 20 a 40 mg de hierro, las mujeres en sus años reproductivos necesitan 2 mg de hierro por día. La desviación de hierro al feto en crecimiento durante el embarazo, la pérdida de sangre durante el nacimiento, y la alimentación mamaria subsiguiente en el bebé consume 900 mg de hierro en promedio. Este aumento de hierro diario demanda de 2 a 4 mg en las mujeres embarazadas y en lactancia. Absorción Una dieta estadounidense saludable contiene entre 10 a 30 mg de hierro por día. De esta cantidad, se absorbe solamente del 5% al 10% principalmente en el duodeno y en el intestino delgado superior. La mayor parte del hierro de la dieta se encuentra en el estado férrico (Fe3+). El Fe3+ es soluble en el pH ácido del estómago pero se torna insoluble en el pH más alcalino del duodeno. El ácido gástrico, que convierte al Fe+3 en la forma mejor absorbible Fe+2, así como los componentes de la dieta que forman quelatos de hierro solubles (como el ácido ascórbico, azúcares, y los aminoácidos), aumenta la absorción del hierro. Las sustancias que forman complejos insolubles con el hierro, como los fosfatos (en huevos, queso y leche), los oxalatos y fitatos (en los vegetales) y los tanatos (en el té), disminuyen la absorción del hierro. El hierro hemo, que proviene principalmente de la carne y pescado, es procesado diferentemente. Después de que es liberado de la cadena polipeptídica que le rodea, el hemo es absorbido intacto por la célula de la mucosa, en donde el anillo de porfirina se rompe y el hierro es liberado. Este proceso es más eficiente que la absorción del hierro no hémico y no está afectado por los factores de la dieta. Debido a que la pérdida de hierro es un proceso continuo y no regulado en su mayor parte, el balance de hierro es controlado por cambios en la absorción. Las células intestinales toman considerablemente más hierro que el 5% a 10% que finalmente entra en la circulación. Una vez dentro de la célula intestinal el hierro es transferido directamente al plasma o es incorporado a la ferritina para almacenamiento. El hierro almacenado puede ser movilizado subsecuentemente si es necesario, pero la mayor parte de este hierro se pierde cuando las células de la mucosa se desprenden. Nuevas células toman su lugar, y el ciclo del hierro comienza nuevamente. Los mecanismos que controlan la transferencia de hierro desde la mucosa intestinal hacia el plasma no son bien comprendidos (Fig. 35-1). El efecto total es evitar la absorción de exceso de hierro mientras se mantiene un adecuado suministro para las necesidades generales. Los factores más importantes que afectan la absorción de hierro son los almacenamientos de hierro corporal y la velocidad de producción de glóbulos rojos. Cuando es necesario, la eficiencia en la absorción puede aumentar en tres o más veces. Por consiguiente, la deficiencia de hierro, el embarazo, y la eritropoyesis acelerada que ocurre en la anemia, estimulan el aumento de absorción de hierro. Por otro lado, la absorción se encuentra reducida después de un consumo de grandes cantidades inusuales de hierro (tales como, suplemento o envenenamiento por hierro). 1445

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Recambio celular de los eritrocitos El hierro absorbido representa solamente una fracción del hierro requerido para la síntesis del hemo. La mayor parte del hierro necesario, de 20 a 25 mg/día, proviene de la destrucción de los eritrocitos viejos por los macrófagos de los tejidos, principalmente en el bazo. Dentro de estas células, la hemooxigenasa rompe el anillo de porfirina para liberar el hierro. Los macrófagos transfieren la mayor parte del hierro a la transferrina del plasma, la cual entonces lo transporta a la médula ósea para la síntesis de la hemoglobina. De esta manera, el sistema retículoendotelial recicla el hierro usado en los glóbulos rojos viejos para que sea utilizado en los nuevos glóbulos rojos. Los macrófagos también mantienen una fuente de almacenamiento de hierro. Cuando la destrucción de los glóbulos rojos excede la velocidad de producción, el hierro se acumula dentro de los macrófagos y la reserva de almacenamiento se expande. Cuando el balance se desvía hacia la producción de glóbulos rojos, los macrófagos liberan hierro adicional a partir de sus depósitos. La infección, inflamación, y la neoplasia maligna interfieren con la liberación del hierro a partir de los macrófagos y pueden causar una caída en la producción de glóbulos rojos a pesar de la presencia de reservas de hierro adecuadas. Transporte e incorporación a la célula La transferrina, una glicoproteína de una sola cadena con un peso molecular de 79,500 daltones, es la proteína de transporte para el hierro en la sangre. Cada molécula de transferrina tiene dos sitios de unión para el Fe3+, y de 20% a 50% de estos sitios se encuentran normalmente saturados. La necesidad de una proteína transportadora específica deriva de la toxicidad e insolubilidad del hierro libre; virtualmente los 3 a 4 mg de hierro se encuentran unidos a proteína. El transporte de hierro es un proceso dinámico, y la vida media de un átomo de hierro en el plasma es entre 60 y 120 minutos bajo circunstancias normales. La transferrina libera hierro en las células con receptores de superficie específicos para esta proteína. Después de la unión al receptor, el complejo receptor-transferrina/transferrina, es tomado por la célula vía endocitosis y es incorporado dentro de una vesícula. Al pH ácido de la vesícula, el hierro es liberado de la transferrina. El complejo receptor-apotransferrina es luego devuelto a la superficie celular, en donde tanto la apotransferrina como el receptor se tornan disponibles para ciclos adicionales de transporte y entrada de hierro. Dentro de la célula, el hierro es utilizado para la síntesis del hemo dentro de la mitocondria o es almacenado como ferritina.

Almacenamiento El hierro es almacenado en los tejidos en cualquiera de las dos formas, ferritina u hemosiderina. La ferritina consiste de una cubierta proteica constituida de varias subunidades, conocida como apoferritina, rodeando un centro de hasta 4500 átomos de hierro. El hierro en la ferritina es depositado dentro de su centro como un complejo de hidroxifosfato férrico. La ferritina está presente en la mayor parte de las células y es una forma rápida de movilizar el hierro almacenado. Sirve para empaquetar y aislar los átomos de hierro a partir del ambiente intracelular, evitando de esta manera cualquier acción tóxica en los constituyentes celulares. La hemosiderina es un complejo insoluble derivado de la ferritina que ha perdido alguna de sus proteínas de superficie y se vuelve una forma agregada. Se encuentra presente en gránulos 1446

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de 1 a 2 µm de diámetro y es visible a través del microscopio óptico después de ser teñido con azul de Prusia. La hemosiderina tiene una concentración mayor de hierro que la que posee la ferritina, pero libera hierro más lentamente. Alrededor de un tercio de las reservas de hierro corporal se almacena en el hígado, un tercio en la médula ósea, y el restante en el bazo y otros tejidos.

Condiciones Patológicas Deficiencia de hierro Cuando la absorción de hierro disminuye por debajo de la cantidad requerida para la producción de glóbulos rojos, se agotan las reservas de hierro, y con el tiempo sobreviene anemia. La deficiencia de hierro es un desorden alimenticio común en los humanos y es la causa más frecuente de anemia. Se estima que alrededor del 3% de los hombres adultos, 20 % de las mujeres en su etapa reproductiva y 50% de las mujeres embarazadas son deficientes en hierro. La elevada prevalencia de la deficiencia de hierro entre las mujeres es el resultado de la pérdida de sangre que ocurre durante cada ciclo menstrual. El sangrado del tracto gastrointestinal es la causa común de deficiencia de hierro en los hombres. La demanda aumentada de hierro en bebés y niños pequeños, adolescentes y mujeres embarazadas puede conducir también a deficiencia de hierro, especialmente si estos individuos tienen dietas bajas en hierro. Los trastornos en la absorción de hierro después de una gastrectomía y en pacientes con diarrea crónica o mala absorción también causan agotamiento de las reservas de hierro. La deficiencia de hierro se lleva a cabo en estadios, el primero de los cuales es el agotamiento del almacenamiento de hierro en respuesta a un prolongado balance negativo de hierro. Una vez que las reservas de hierro se han agotado, los análisis bioquímicos del metabolismo del hierro se vuelven anormales. Luego, se observa una caída en la concentración de hemoglobina en la sangre, y al tiempo los glóbulos rojos se vuelven más pequeños y pálidos que los normales. En la anemia desarrollada completamente por deficiencia de hierro, un conteo sanguíneo completo revela una disminución en la hemoglobina y en todos los índices de glóbulos rojos: volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración de hemoglobina corpuscular media (CMHC). El examen de un frotis sanguíneo periférico muestra eritrocitos que son hipocrómicos y microcíticos con una variación anormal en el tamaño y la forma. En la médula ósea se visualiza hierro que no se puede teñir. Los análisis de laboratorio sobre el estado de hierro pueden distinguir la deficiencia de hierro de otras causas de anemia hipocrómica microcítica (Tabla 35-2). La concentración de hierro sérico disminuye, mientras que aumenta la capacidad total de fijación de hierro (CTFH), la cual mide la capacidad de la transferrina para el hierro, se incrementa. La saturación de la transferrina, calculada como la concentración de hierro dividida por la CTFH, se encuentra muy por debajo de su valor saludable. Una disminución en la ferritina sérica, la cual representa un reflejo de las reservas de hierro corporal, es el indicador simple más confiable de la deficiencia de hierro. La protoporfirina eritrocitaria se encuentra aumentada, pero este aumento no es específico de la deficiencia de hierro, y la medición de este compuesto se utiliza 1447

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más bien como una prueba exploratoria.

Exceso de hierro Hemocromatosis. La hemocromatosis es un desorden hereditario caracterizado por un aumento progresivo en las reservas de hierro, conduciendo a una disfunción y daño del órgano. La herencia es autosómica recesiva. Entre las poblaciones de descendientes del norte de Europa, alrededor del 10% de las personas llevan el gen y 0.3% son homocigotos. Por razones que no están aun claramente comprendidas, solamente una fracción de los homocigotos desarrolla completamente la enfermedad. Los hombres son afectados de cinco a 10 veces más frecuentemente que las mujeres debido al efecto protector de la pérdida de sangre menstrual y al embarazo. Los síntomas de la enfermedad son generalmente aparentes antes de los 40 años de edad. Los pacientes con hemocromatosis absorben 4mg de hierro o más por día, aun con una dieta normal. El mecanismo de aumento en la absorción del hierro permanece desconocido. Bajo condiciones normales, el exceso de hierro es procesado por las células del sistema retículoendotelial. Sin embargo, en individuos con hemocromatosis, el hierro se deposita directamente en las células parenquimales del hígado, páncreas, corazón y otros órganos. Después de acumularse por años, las cantidades excesivas del hierro intracelular conducen a daño tisular y por último a la falla del órgano. En este estado, la cantidad de almacenamiento de hierro puede exceder los 20g. Varios sistemas son afectados por hemocromatosis. El hígado se encuentra generalmente agrandado y al tiempo puede tornarse cirrótico, predisponiendo a los pacientes a un alto riesgo inusual de carcinoma hepatocelular. Alrededor de los dos tercios de los pacientes desarrollan diabetes mellitus; tanto una predisposición genética como un daño directo al páncreas a partir de exceso de hierro parecen jugar un papel en el desarrollo de la diabetes. La mayoría de los pacientes muestra un aumento en la pigmentación de la piel como resultado de la producción aumentada de melanina y de la deposición de hierro dentro de la piel. El daño cardíaco se expresa como falla congestiva del corazón o arritmias. La atrofia testicular en los hombres es causada por una caída en la producción de gonadotropinas por la glándula pituitaria, otro sitio de depósito de hierro. La artritis también aparece en más de la mitad de los pacientes. En la hemocromatosis, la concentración de hierro sérico aumenta y la capacidad total de fijación de hierro (CTBH) disminuye, en contraste a los cambios que se observan en la deficiencia de hierro. La saturación de la transferrina es mucho mayor que el intervalo de referencia y constituye un índice particularmente sensible al exceso de hierro. La concentración de ferritina sérica está aumentada al comienzo del curso de la enfermedad, antes de que se vuelvan aparentes los signos y síntomas. La prueba definitiva para la hemocromatosis está constituido por la medida y la evaluación histoquímica del hierro hepático en un especimen de biopsia del hígado. El gen para la hemocromatosis no ha sido aun identificado, pero se encuentra localizado en un brazo corto del cromosoma 6 cerca del locus del antígeno leucocitario humano (mas conocido por su acrónimo en inglés, HLA). En familias con un paciente conocido, a menudo es posible identificar otros homocigotos y heterocigotos al analizar los 1448

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miembros de la familia para sus haplotipos HLA y llevar a cabo análisis genético de ligamiento. Una vez que se aísle el gen para la hemocromatosis y que se definan las mutaciones que provocan la enfermedad, se dispondrá de pruebas más específicas y confiables basadas en el análisis de DNA. Hemacromatosis adquirida. El exceso de hierro puede también ser un trastorno adquirido. Primeramente, el hierro en exceso es depositado preferentemente en las células retículoendoteliales del hígado, bazo y médula ósea, en vez de que ocurra directamente en las células del parénquima. Los tejidos permanecen anatómica y funcionalmente saludables. A medida que aumenta la cantidad de hierro, su patrón de distribución cambia, y el hierro es depositado en las células parenquimales del hígado, páncreas, corazón y otros órganos. El cuadro clínico entonces se parece a la forma hereditaria de hemocromatosis. La hemocromatosis adquirida puede ser una complicación de anemias en las que existe eritropoyesis inefectiva, como la -talasemia (ver pág. 727). En esta enfermedad no solamente aumenta la absorción del hierro, sino que los pacientes son tratados con múltiples transfusiones sanguíneas, lo cual aumenta adicionalmente su carga de hierro. Los alcohólicos con enfermedad crónica del hígado pueden también desarrollar un aumento en las reservas de hierro tisular, pero aquellos con exceso masivo de hierro probablemente tengan la forma genética de la hemocromatosis. Es raro que el uso de suplemento medicinal de hierro por sí sólo sea causa de hemocromatosis.

Cambio del Compuesto Analizado en la Enfermedad Existen tres compartimentos para el hierro, que responden del 90% del total de hierro corporal, que el laboratorio clínico puede medir. El mayor de estos reservorios es el hierro contenido en la hemoglobina, que se mide como parte de un examen completo de sangre. El siguiente compartimento más grande es el del almacenamiento tisular, y la concentración de ferritina sérica es proporcional al tamaño de este reservorio. Finalmente, el hierro circulante es evaluado midiendo las concentraciones séricas de hierro y de su proteína de transporte, la transferrina. Esta combinación de estudios hematológicos y bioquímicos permite a uno identificar los trastornos en el metabolismo de hierro. Estudios hematológicos Un examen completo de sangre nos brinda el número de eritrocitos por litro, la concentración de hemoglobina y el índice de glóbulos rojos. La anemia surge cuando la concentración de hemoglobina desciende por debajo de alrededor de los 130 g/L en los hombres, por debajo de los 120 g/L en las mujeres, y por debajo de los 110 g/L en las mujeres embarazadas. La deficiencia de hierro causa una anemia hipocrómica microcítica, y por ello, el tamaño celular (VCM), el contenido de hemoglobina (HCM), y la concentración de hemoglobina por célula (CMHC) se encuentran totalmente reducidos. El frotis de sangre periférica muestra una amplia variación en el tamaño, forma, y contenido de hemoglobina de los eritrocitos, con una gran proporción de células que son menores y más pálidas que las normales. Este cuadro tan definido no se presentará en los primeros estadios del agotamiento, cuando tanto la 1449

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concentración de hemoglobina como los índices de glóbulos rojos permanecen normales. La anemia hipocrómica microcítica es característica de la talasemia, anemia sideroblástica y anemia de enfermedad crónica, así como de deficiencia de hierro. Los parámetros de los glóbulos rojos definen de esta manera la presencia o ausencia de anemia y su carácter morfológico, pero se requiere de otras pruebas para identificar la causa de la anemia. Los estudios de los eritrocitos no contribuyen al diagnóstico de la hemocromatosis. Hierro sérico (ver pág. 712, métodos ) La reserva del hierro circulante se recambia de 10 a 20 veces por día; de esta forma un átomo típico de hierro no está más de 2 horas en el plasma. Pueden ocurrir cambios súbitos en la concentración del hierro sérico de 20% o más aun en personas saludables, debido a los desbalances momentáneos en la entrada y salida de hierro. Existe una variación diurna, con una caída en la concentración del hierro por la noche; también ocurren variaciones significativas día tras día. Todos estos factores limitan la utilidad de diagnóstico de las mediciones de hierro sérico. El intervalo de referencia para los hombres es de 650 a 1750 g/L y para las mujeres de 500 a 1700 g/L. Las causas de los niveles anormales del hierro sérico están registradas en el cuadro de abajo. Los valores del hierro sérico siempre deben ser interpretados en combinación con la saturación de la CTFH y de transferrina.

Cambios en el Hierro Sérico Disminuido por: Deficiencia de Hierro Enfermedad crónica Neoplasia maligna Inflamación Pérdida reciente de sangre Menstruación Aumentado por: Eritropoyesis inefectiva Anemia megaloblástica Talasemia principal Anemia sideroblástica Anemia hemolítica Anemia aplástica Hepatitis viral Hemocromatosis Intoxicación aguda por hierro

Capacidad de la fijación total de hierro (CTFH) y saturación de la transferrina (ver pág. 712, métodos ) La CTFH mide la cantidad máxima de hierro que las proteínas séricas pueden fijar y es 1450

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por lo tanto una manera indirecta de evaluar los niveles de transferrina. La transferrina puede también ser medida directamente por inmunoensayo y convertida a CTFH mediante la aplicación de una fórmula de conversión. La concentración de hierro en el suero dividido entre la CTFH da como resultado la saturación de la transferrina. El intervalo de referencia para la CTFH es de 2500 a 4500 g/L y la saturación de la transferrina es del 20% al 50% en los hombres y del 15% al 50% en las mujeres. Las causas de los valores anormales de la CTFH están registradas en el cuadro de arriba a la derecha. La baja concentración de hierro en el suero y el valor elevado de la CTFH en la deficiencia de hierro produce una baja saturación de la transferrina; los valores bajos pueden también verse en el embarazo y en la enfermedad crónica. Una saturación alta de la transferrina es característica del exceso de hierro y constituye una prueba sensible para la hemocromatosis. La talasemia principal, la anemia sideroblástica y la intoxicación por hierro también provocan un aumento en la saturación de la transferrina. Cambios en la capacidad total de fijación de hierro (CTFH) Disminuido por: Neoplasia maligna Inflamación Síndrome nefrótico Malnutrición Anemia megaloblástica y hemolítica Hemocromatosis Aumentado por: Deficiencia de hierro Hepatitis Embarazo Uso de anticonceptivos orales

Ferritina sérica En el plasma circula una pequeña cantidad de ferritina, la mayor parte como apoferritina libre de hierro. La ferritina circulante se encuentra en equilibrio con los depósitos de hierro y, en casi todas las circunstancias, refleja exactamente la cantidad de hierro almacenado presente. El intervalo de referencia es depende del inmunoensayo usado para medir la ferritina, pero es aproximadamente de 20 a 250 g/L en los hombres y de 10 a 120 g/L en las mujeres. Una baja concentración de ferritina sérica es diagnóstico de deficiencia de hierro. Los niveles de ferritina caen al comienzo del desarrollo de la deficiencia de hierro, antes de que el hierro del suero y la saturación de la transferrina se tornen anormalmente bajos. La disponibilidad de esta confiable prueba sanguínea para la deficiencia de hierro ha eliminado la necesidad para la evaluación de la médula ósea en casi todos los casos. Un aumento de la ferritina sérica se observa cuando hay exceso de hierro, antes de que se desarrollen los signos y síntomas de hemocromatosis. Sin embargo, la liberación de ferritina de los tejidos dañados en la hepatitis, en las condiciones de inflamación aguda y en una variedad de tumores, aumenta también dramáticamente el nivel de ferritina sérica. En estas situaciones, los valores de ferritina normales pueden enmascarar la presencia de deficiencia de hierro, y por consiguiente, 1451

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para confirmar el diagnóstico puede requerirse de un examen de la médula ósea para hierro teñible. Protoporfirina eritrocitaria libre En el curso de la síntesis de hemo, un pequeño número de moléculas de protoporfirina escapan de la vía y no se acomplejan con el Fe2+. La mayor parte de estas moléculas fijan Zn2+ en lugar deFe++ para producir zinc protoporfirina, el cual luego se une al sitio hemo de la hemoglobina y circula en el eritrocito maduro. Los ensayos de las porfirinas eritrocitarias han incluido tradicionalmente un paso de extracción con ácido, el cual remueve el zinc y luego deja la protoporfirina libre de metal. De esta manera el término protoporfirina eritrocitaria libre (PEL) es realmente un nombre inapropiado. La medición de PEL indica la cantidad de protoporfirina sin hemo en los glóbulos rojos, constituyendo un parámetro clínico útil. Una información similar se obtiene por hematofluorometría, en la cual un solo instrumento mide tanto la protoporfirina con zinc (ZPP) como las concentraciones de hemo y expresa el resultado como una razón de los dos valores en mol ZPP/mol de hemo. Una disminución en el hierro disponible para el desarrollo de los glóbulos rojos aumenta la formación de zinc protoporfirina. Tanto la deficiencia de hierro (falta absoluta de hierro) como la enfermedad crónica (utilización errónea de hierro) aumentarán la PEL. La protoporfiria, una deficiencia hereditaria de ferroquelatasa, se encuentra asociada a valores muy altos de la PEL. El ensayo de la PEL es el más comúnmente utilizado como una prueba exploratoria para la deficiencia de hierro. Las mediciones de PEL han sido también utilizadas para detectar la intoxicación por plomo, pero ya no se considera lo suficientemente sensible y están siendo reemplazadas por medición directa de plomo en sangre. Cuando se desarrolla con un hematofluorómetro, la prueba es rápida, técnicamente simple, reproducible, y requiere solamente de una gota de sangre, haciéndola especialmente útil en los niños. Una relación creciente de PEL o ZPP/hemo debe ser seguida de pruebas más específicas del estado de hierro.

Parte II: Síntesis de Hemo y las Porfirias Estructura y Función Todas las porfirinas contienen un núcleo de cuatro unidades pirrólicas unidas por puentes metenilos (=CH-) dentro de una estructura de anillo macrocíclico (Fig. 35-2). La red extendida de uniones simples y dobles hacen que las porfirinas absorban luz visible; es este grupo el que le da el color rojo a la hemoglobina. Las porfirinas también fluorescen de un color rosado rojizo, bajo una luz de longitud de onda ultravioleta, una propiedad que es útil cuando se detecta y mide porfirinas en los fluidos corporales. Otra propiedad única es el arreglo de cuatro átomos de nitrógeno en el centro del anillo, permitiendo a las moléculas de porfirina quelar átomos de metal. En los sistemas biológicos, el hierro es el metal más importante que se acompleja con las porfirinas. Las diferencias en la estructura de las porfirinas dependen del tipo y posición de las 1452

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cadenas laterales localizadas en los vértices de los anillos pirrólicos. En los humanos, existen tres porfirinas principales: la uroporfirina (URO), la coproporfirina (COPRO) y la protoporfirina (PROTO) (Figs. 35-3 y 35-4). URO tiene como cadenas laterales cuatro propionatos y cuatro acetatos, mientras que COPRO tiene como cadenas laterales cuatro propionatos y cuatros metilos. Estos grupos pueden ser ordenados en cuatro configuraciones estructurales diferentes, de las cuales el isómero tipo III es el que se produce. PROTO tiene dos propionatos, dos vinilos y cuatros grupos metilos que pueden ordenarse en cualquiera de las 15 diferentes configuraciones. Solamente el isómero tipo IX es producido en el cuerpo. Las porfirinas libres son productos de la vía sintética del hemo y no presentan función biológica por sí mismas. El hemo, el quelato de hierro de la protoporfirina, es el grupo prostético para muchas proteínas y enzimas involucradas en el metabolismo del oxígeno y en las reacciones de transferencia electrónica (ver Tabla 35-1). También existen naturalmente cantidades traza de protoporfirina de zinc, pero no se le ha asignado ninguna función fisiológica a este compuesto.

Bioquímica La síntesis del hemo se realiza en todas las células pero ocurre en su mayor parte en la médula ósea (los precursores de los glóbulos rojos) y el hígado. Es útil considerar la vía en dos partes: (1) formación de la estructura de anillo por condensaciones repetidas de los precursores (Fig. 35-3) y (2) modificación de las cadenas laterales e inserción del hierro (Fig. 35-4). Esta división arbitraria simplifica lo que de otra manera sería una serie de reacciones larga y compleja. Vía sintética La vía sintética comienza con la condensación de succinil CoA y glicina, activada por fosfato de piridoxal, para formar ácido delta aminolevulínico (más conocido por su acrónimo en inglés, ALA). Esta reacción, catalizada por la ALA sintasa, es el paso limitante de reacción en la síntesis del hemo. Dos moléculas de ALA se condensan luego para formar porfobilinógeno (PBG), un pirrol con cadenas laterales de propionato y acetato en sus vértices. Luego, cuatro moléculas de PBG se condensan en una configuración cabeza con cola para formar un tetrapirrol lineal, el hidroximetilbilano que se cicliza para formar uroporfirinógeno. Este es un paso crítico en el que uno de los pirroles debe cambiar la orientación de sus cadenas laterales de propionato y acetato para producir el isómero tipo III de uroporfironógeno. La porfobilinógeno desaminasa cataliza la reacción de condensación, pero la uroporfirinógeno III cosintasa realiza la isomerización de una unidad pirrólica. En este punto la estructura básica de anillo está terminada. La modificación de las cadenas laterales comienza con la descarboxilación de cuatro grupos acetato para formar coproporfirinógeno III. Dos grupos propionato son entonces decarboxilados y deshidrogenados a grupos vinilos, produciendo protoporfironógeno IX. Los átomos de carbono que sirven como puente son oxidados pasando de metileno (-CH2-) a metenilo (=CH-) para producir protoporfirina IX. En el paso final, el Fe2+ es insertado dentro del anillo de protoporfirina para producir el hemo. Dentro del hígado, la síntesis de hemo está controlada primeramente por cambios en la 1453

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actividad de la ALA sintasa, la primera enzima y además la limitante de reacción. Pequeñas cantidades de hemo libre están presentes dentro de las células hepáticas. Un aumento en esta reserva celular inhibe la actividad de la ALA sintasa, mientras que una disminución estimula a la enzima. La regulación de la síntesis de hemo en los precursores de los glóbulos rojos parece involucrar a otras enzimas dentro de la vía como así también a la velocidad de la incorporación celular de hierro. Puntos de interés Varios aspectos de la síntesis de porfirina merecen una firme atención. Dos enzimas, la ALA deshidratasa y la ferroquelatasa, son inhibidas por el plomo, resultando en el aumento de sus respectivos sustratos (ALA y protoporfirina IX) en la intoxicación por plomo. Otra enzima interesante es la uroporfirinógeno III cosintasa, la cual produce el isómero tipo II de uroporfironógeno durante el paso de ciclización del anillo. Sin esta enzima solamente se forma el isómero tipo I, el cual no es un precursor del grupo hemo. Note también que durante la última mitad de la vía se forman intermediarios de porfirinógeno. Los porfirinógenos difieren de las porfirinas en que los átomos de carbono que forman el puente están completamente reducidos, y los cuatros átomos de nitrógeno se encuentran todos protonados. No existe un sistema para alternar los dobles y simples enlaces y por lo tanto estos compuestos son incoloros y no presentan fluorescencia. Los porfirinógenos que no se usan en la vía regular, se oxidan espontáneamente y reversiblemente a las porfirinas correspondientes. Esta es la razón de que URO, COPRO y PROTO son las principales formas de excreción, y no los porfirinógenos. Finalmente, la vía de las porfirinas comienza y termina en la mitocondria, pero cuatro de los pasos involucrados tienen lugar en el citosol. La distribución intracelular de las enzimas se muestra en la Fig. 35-5. Debido a que los eritrocitos pierden sus mitocondrias a medida que maduran, solamente la mitad de estas enzimas pueden ser analizadas en los glóbulos rojos circulantes.

Condiciones Patológicas ¿Qué sucedería si las enzimas involucradas en la síntesis de hemo no funcionan correctamente? La respuesta a esta pregunta puede encontrarse en el estudio de las porfirias, un grupo de trastornos de la síntesis de hemo genéticamente determinados. Cinco de las porfirias son hereditarias como un rasgo autosómico dominante. Debido a que el paciente tiene un único gen para producir una enzima funcional, hay alrededor de un 50% de actividad enzimática normal. Este defecto parcial no causa una deficiencia de hemo en los glóbulos rojos, y por ello los pacientes no desarrollan anemia. Sin embargo, las porfirinas y sus precursores se producen debido a la enzima deficiente y se acumulan en los tejidos y fluidos corporales. Las propiedades fotosensibilizadoras de las porfirinas son responsables de los signos cutáneos y de los síntomas observados en los pacientes con estos trastornos. La excreción del exceso de porfirinas y sus precursores es la base para diagnosticar las porfirias. La ruta de excreción es una función de la solubilidad. La URO, con ocho grupos carboxilos, es la más soluble y se excreta casi en su totalidad en la orina. La PROTO, con sólo dos grupos carboxilos, es excretada exclusivamente en las heces. La COPRO, que tiene cuatro 1454

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grupos carboxilos, es excretada por cualquier ruta. Los precursores de la porfirina ALA y PBG son ambos solubles en agua y eliminados en la orina. Tradicionalmente las porfirias han sido clasificadas como eritropoyéticas o hepáticas, basadas en el sitio de sobreproducción de las porfirinas y de sus precursores. Una enfoque más útil es la clasificación de las porfirias por los signos y síntomas (neurológicos versus cutáneos), ya que esto nos permite pensar en términos de su presentación clínica. Porfirias neurológicas Existen tres porfirias caracterizadas por ataques agudos y dolor abdominal, signos neuromusculares y disturbios psiquiátricos. Los ataques agudos, los cuales pueden durar de días a semanas, están acompañados por un aumento en la excreción de ALA y PBG en la orina. A pesar de la asociación de niveles aumentados de los precursores de porfirina con los ataques, su base bioquímica permanece se desconoce. No ha sido claramente demostrada que el ALA o el PBG causen neurotoxicidad. El ALA es un análogo estructural del ácido gama aminobutírico y, en altas concentraciones, podría imitar o interferir con las acciones de este neurotransmisor. Otra teoría sostiene que la deficiencia de hemo dentro de las células nerviosas es la responsable de los ataques. Cada defecto enzimático ese heredado como un rasgo autosómico dominante. Los signos y síntomas de las porfirias neurológicas generalmente comienzan durante la adolescencia o temprano en la edad adulta y afecta más a las mujeres que a los hombres. El dolor abdominal es el hallazgo más constante y se encuentra frecuentemente acompañado por constipación, náusea y vómitos. Las anormalidades del sistema nervioso autónomo incluyen taquicardia, hipertensión, sudor y retención urinaria. La neuropatía periférica puede ser expresada como dolor en las extremidades, áreas de sensación reducida o alterada, debilidad muscular, y parálisis. También pueden ocurrir disturbios visuales, accesos, y coma, así como secreción inapropiada de hormona antidiurética que puede contribuir a una concentración baja de sodio sérico. Algunos pacientes tienen una historia de nerviosismo, desórdenes del carácter, o pensamientos negativos, lo que sugiere una enfermedad psiquiátrica primaria. Los ataques agudos pueden ser precipitados por la acción de varias drogas, principalmente los barbitúricos y las sulfonamidas. El ayuno o la dieta pueden precipitar un ataque, y los pacientes necesitan mantener una entrada adecuada de calorías. El consumo de alcohol y de hormonas esteroides (como los anticonceptivos orales) están también asociados a los ataques. Durante el intervalo entre los ataques, se encuentran ausentes los signos y síntomas de porfiria. La mayoría de los portadores del gen para una de estas porfirias nunca presentan un ataque, y su enfermedad permanece clínicamente latente. Los únicos rasgos de cada porfiria neurológica son revisados adelante y en la Tabla 35-3. Porfiria aguda intermitente. La porfiria aguda intermitente es la más común de las porfirias neurológicas con una prevalencia estimada de 1 a 10 por cada 100,000 personas. Los pacientes con esta enfermedad tienen una deficiencia de un 50% de la porfobilinógeno desaminasa. El defecto provoca que el ALA y PBG se acumulen por bloqueo de la enzima, y la interrupción parcial de la vía induce la actividad de la ALA sintasa. De esta manera, ALA y PBG son excretados en grandes cantidades en esta porfiria. Debido a que el defecto no involucra la porción de 1455

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porfirinógeno de la vía, las porfirinas no son producidas en exceso, y no ocurre fotosensibilidad. El principal hallazgo del diagnóstico de laboratorio es un aumento en las concentraciones de ALA y PBG urinarios durante los ataques agudos. Sin embargo, en el lapso entre los ataques sus valores pueden revertirse a valores normales. Cuando el PBG se encuentra presente a altas concentraciones en la orina, se condensa espontáneamente y se cicliza para formar uroporfirinógeno, el cual luego se oxida a URO. Grandes aumentos en URO pueden estar presentes en cualquiera de las porfirias neurológicas, particularmente en la porfiria aguda intermitente. En contraste, las porfirinas fecales son normales. La porfobilinógeno desaminasa puede analizarse en los eritrocitos y generalmente está disminuida en alrededor del 50% del valor normal, cuando el paciente se encuentra críticamente enfermo o si tiene la forma latente sin expresar. Porfiria variegata. Los pacientes con porfiria variegata sufren de ataques agudos y sensibilidad de la piel tanto a la luz solar como al trauma mecánico. El defecto enzimático es una deficiencia parcial de la protoporfirinógeno oxidasa. Tanto PROTO como COPRO se acumulan en el cuerpo, dando lugar a fotosensibilidad y lesiones cutáneas. Es la enfermedad más común entre los blancos sudafricanos y fue detectada en una pareja que emigró de Holanda en 1688. En una nota histórica interesante pero no probada, varios autores han especulado que el Rey Jorge III de Inglaterra sufría de porfiria variegata. Coproporfiria. Una deficiencia parcial de coproporfirinógeno oxidasa en esta enfermedad hace que se acumule las COPRO. Además de los ataques agudos, pueden ocurrir fotosensibilidad y lesiones en la piel, aunque no tan a menudo como en la porfiria variegata. Los niveles urinarios de ALA y PBG se encuentran aumentados durante los ataques agudos. El hallazgo diagnóstico clave es un aumento en la excreción fecal de COPRO. Deficiencia de ALA deshidratasa. Se han descrito varios pacientes con una deficiencia casi completa de ALA deshidratasa. Los homocigotos presentan síntomas neurológicos pero no fotosensibilidad; los heterocigotos son asintomáticos. Los hallazgos de laboratorio son la excreción aumentada de ALA y COPRO en la orina. Porfirias cutáneas Las tres porfirias cutáneas tienen en común un exceso de porfirinas en los tejidos corporales, incluyendo la piel. Las moléculas de porfirina absorben la luz a alrededor de 400 nm, lo que eleva los electrones a un estado energético más alto. A medida que los electrones retornan a su estado basal, parte de la energía que ellos liberan puede ser transferida a la molécula de oxígeno, generando una especie de oxígeno excitado que puede atacar los constituyentes celulares. Estas reacciones a nivel molecular y celular se traducen finalmente en fotosensibilidad y en lesiones de la piel. En las porfirias cutáneas, ALA y PBG no se excretan en exceso como es en el caso de las porfirias neurológicas, y no se encuentran presentes signos o síntomas neurológicos. Se 1456

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debe recordar que las dos porfirias neurológicas en las que se acumulan las porfirinas (variegata y coproporfiria) también pueden presentar manifestaciones en la piel. Cada una de las porfirias cutáneas se discuten brevemente más abajo y son revisadas en la Tabla 35-3. Porfiria cutánea tardía. La porfíria cutánea tardía es un trastorno de la piel que no aparece generalmente hasta la edad adulta. Es el tipo más común de porfiria y es causada por una deficiencia parcial de uroporfirinógeno decarboxilasa. Algunos casos de la enfermedad son claramente familiares y se heredan como un rasgo autosómico dominante, pero la mayoría de los casos son esporádicos y probablemente representan una deficiencia adquirida de la enzima hepática. Los signos y síntomas de esta enfermedad incluyen piel frágil, formación de ampollas, engrosamiento y cicatriz en forma de anillo por exposición al sol, y áreas de hiperpigmentación. La enfermedad permanece sin manifestarse hasta que se desarrolla alguna forma de disfunción del hígado, como un exceso de hierro hepático o enfermedad alcohólica del hígado. La terapia con estrógenos puede también activar la enfermedad. La forma rara homocigota de esta enfermedad, llamada porfiria hepatoeritropoyética, produce fotosensibilidad severa. La deficiencia de uroporfironógeno decarboxilasa causa la producción de URO así como acumulación de 7-, 6-, y 5- carboxil porfirinas, y sus concentraciones en la orina se encuentran extremadamente aumentadas. Las porfirinas fecales están solamente moderamente elevadas, pero la presencia de isocoproporfirina, la cual es un isómero de COPRO, es característica de esta porfiria. Las porfirinas de los glóbulos rojos se encuentran dentro del intervalo de referencia. Protoporfiria. En la protoporfiria existe una deficiencia parcial de ferroquelatasa, la última enzima en la vía sintética del hemo. La acumulación resultante de PROTO causa fotosensibilidad al comienzo de la niñez o en la adolescencia. Cuando los pacientes se exponen a la luz solar, ellos desarrollan quemaduras, sarna, sudor, y piel rojiza. Las áreas expuestas al sol como las manos y la cara son las afectadas, pero los cambios en la piel son moderados y las manchas no son comunes. Una minoría de los pacientes desarrollan enfermedad de hígado o piedras biliares que contienen protoporfirina, ya que el hígado se halla involucrado en la excreción de grandes cantidades inusuales de PROTO. La concentración de protoporfirina eritrocitaria libre está muy elevada. La PROTO fecal está también generalmente aumentada, aunque la magnitud del aumento es variable. Las porfirinas urinarias y sus precursores son normales. Porfiria eritropoyética congénita. La porfiria eritropoyética congénita es un trastorno autosómico recesivo raro causado por deficiencia de la uroporfirinógeno III cosintasa. El defecto de la enzima no es completo, y se sintetiza suficiente uroporfironógeno II para hacer frente a las necesidades metabólicas. Sin embargo, grandes cantidades de la serie de isómeros tipo I son producidas también y son oxidados eventualmente para formar URO I y COPRO I. La enfermedad generalmente se presenta al comienzo de la niñez con fotosensibilidad extrema. Las áreas de la piel expuestas a la luz se tornan manchadas y a medida que los pacientes crecen, pueden ocurrir manchas 1457

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extensivas y mutilación de los dedos, nariz y ojos. Un hallazgo único de la enfermedad es la eritrodoncia, la coloración marrón rojiza de los dientes causada por depósito de porfirina. Los pacientes también desarrollan anemia hemolítica y engrosamiento del bazo. De todas las porfirias, ésta es la de peor pronóstico. Los pacientes excretan orina rosada o roja debido a las cantidades masivas de URO y COPRO presentes. Los glóbulos rojos contienen grandes cantidades de URO y COPRO y fluorescen cuando son examinados microscópicamente bajo la luz ultravioleta. Las porfirinas fecales se encuentran también aumentadas. Trastornos secundarios del metabolismo de las porfirinas Las alteraciones en el metabolismo y excreción de las porfirinas pueden ocurrir en situaciones diferentes a las de las porfirias. Varios trastornos comunes se describen adelante. Intoxicación por plomo. El envenenamiento por plomo puede ocurrir en los niños pequeños cuando comen restos de pintura con plomo o en los adultos que se encuentran expuestos a los compuestos con plomo en un ambiente industrial o quienes beben whisky ilegalmente destilado con un equipo que contiene plomo. Los signos y síntomas incluyen dolor abdominal y anormalidades neurológicas que pueden imitar un ataque agudo de porfiria. El plomo inhibe a dos enzimas en la vía de las porfirinas: la ALA deshidratasa y la ferroquelatasa. Consecuentemente, hay un aumento en la ALA urinaria (pero no de PBG) y en la concentración eritrocitaria de protoporfirina de zinc; el nivel de COPRO urinaria se encuentra también aumentado. Aunque estos hallazgos son típicos de la intoxicación por plomo, el diagnóstico está basado en la demostración de las concentraciones aumentadas de plomo en la sangre total. Deficiencia de hierro. Los pacientes con deficiencia de hierro tienen un desbalance entre la protoporfirina que es producida en cantidades normales, y el hierro, el cual no está disponible para la síntesis de hemo. Como resultado, la protoporfirina de zinc se acumula en los glóbulos rojos por encima de los valores normales. Debido a que es una condición tan difundida, la deficiencia de hierro es la causa más común de las porfirinas aumentadas de los eritrocitos. Las condiciones que disminuyen la disponibilidad de hierro, como la inflamación aguda o crónica, también aumentan las porfirinas de los glóbulos rojos. La medición de protoporfirina de zinc es una prueba exploratoria útil para la deficiencia de hierro, pero el diagnóstico es confirmado por medio de estudios de hierro sérico, capacidad total de fijación de hierro, y ferritina. Coproporfirinuria. Un aumento aislado en COPRO urinaria es el hallazgo anormal más común cuando se analiza la orina para las porfirinas. Aun cuando este hallazgo puede indicar una porfiria, es causado más a menudo por problemas no relacionados con la síntesis de hierro, como la enfermedad del hígado, enfermedad aguda o exposición a compuestos tóxicos. Un pequeño aumento aislado (menor del doble) en la COPRO urinaria es generalmente un hallazgo no específico de limitado valor diagnóstico.

Cambio del Compuesto Analizado en la Enfermedad 1458

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La preparación del trabajo de laboratorio para el análisis una preseunta porfiria depende de la presentación clínica. Para las porfírias neurológicas, el análisis de las muestras de orina y de heces es suficiente para realizar un diagnóstico. Las porfírias cutáneas son diagnosticadas a través del análisis de orina, eritrocitos, y de porfirinas fecales. Como una regla, las pruebas de exploración son usadas para identificar aumentos en PBG y en las porfirinas urinarias y fecales. Las pruebas exploratorias positivas deben confirmarse por mediciones cuantitativas en una muestra de orina de 24 horas o en muestras fecales al azar, así como por identificación de cuáles porfirinas se encuentran elevadas. Las pruebas exploratorias negativas no requieren análisis posteriores. La interpretación de los resultados es complicada debido a varios factores. En las pruebas exploratorias tradicionales, las porfirinas son extraídas en un solvente orgánico acidificado, y un resultado positivo se indica por una fluorescencia rojiza del extracto usando luz ultravioleta de longitud de onda larga. La prueba exploratoria para PBG se basa en su reacción con el p-dimetilaminobenzaldehido para formar un compuesto rojizo púrpura. Ambas técnicas requieren un juicio subjetivo que considere hasta dónde se forma el color esperado, y pueden dar resultados falsos positivos o falsos negativos debido a la existencia en la orina y heces de sustancias interferentes. Las pruebas de exploración más recientes, basadas en espectrofotometría y spectrofluorometría, han eliminado estas interferencias y proporcionan un valor numérico para la cantidad de PBG o de porfirina que se encuentra presente en la muestra. Otro problema es la excreción variable de porfirinas y de sus precursores en condiciones de salud y enfermedad. Las porfirinas urinarias, fecales y eritrocitarias se encuentran típicamente aumentadas de cinco a diez veces en los pacientes con porfiria. Lo mismo sucede para ALA y PBG en la fase aguda de la porfiria neurológica. Sin embargo, algunos compuestos analizados, principalmente ALA y PBG, se encuentran afectados por la actividad de la enfermedad que está ocurriendo, y el rango de valores observados en cualquiera de las porfirias puede variar demasiado. En personas que no presentan una porfiria pueden ocurrir también aumentos aislados de las porfirinas en la orina (< dos veces), en las heces (< tres veces), y en los glóbulos rojos (< cinco veces). Por estas razones, el diagnóstico debe basarse en una combinación de la presentación clínica, técnicas analíticas confiables e interpretación cuidadosa de los resultados de las pruebas. Los hallazgos clave de laboratorio en las porfirias se encuentran resumidos en la Tabla 35-4. Porfobilinógeno (PBG) El porfobilinógeno urinario se encuentra elevado en la porfiria intermitente aguda, porfiria variegata, y en la coproporfiria. La prueba exploratoria para el PBG es positiva durante los ataques agudos pero puede ser negativa entre los ataques. Una prueba exploratoria positiva es confirmada por un análisis cuantitativo de PBG, realizado en una toma de orina de 24 horas. El intervalo de referencia es 2 mg/día. Acido delta aminolevulínico (ALA) Los valores urinarios de ALA se asemejan al aumento en el PBG visto en las tres porfirias neurológicas. También se encuentra elevado en la intoxicación por plomo y en la 1459

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tirosinemia hereditaria y por lo tanto es un indicador menos específico para porfiria que para PBG. Las mediciones son realizadas en las tomas de orina de 24 horas, y el intervalo de referencia es de 1.5 a 7.5 mg/día. Porifirinas urinarias Las pruebas exploratorias para las porfirinas urinarias son generalmente positivas en todas las porfirias excepto en la protoporfiria y en la fase latente de la porfiria intermitente aguda. Los resultados exploratorios positivos de orina son seguidos de la identificación de porfirina (URO o COPRO, o ambas), la cual es elevada. Una elevación de leve a moderada de la concentración urinaria de COPRO se observa en la enfermedad hepática, intoxicación por plomo, ingestión de alcohol, y enfermedad aguda. Los grandes aumentos, especialmente en las concentraciones de URO, requieren de un análisis cuantitativo de una toma de orina de 24 horas. Los intervalos de referencia son de 7.3 disipan espontáneamente, mientras que un pH 1.015

< 30 g/L < 0.5

> 30 g/L > 0.5

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> 0.6

~ suero

Frecuentemente < 60 mg/dL

Tabla 41-3. Características físicas y químicas del líquido sinovial normal. Media Volumen (mL)* Viscosidad relativa a 38° C Ácido hialurónico (g/L) Proteína total (g/L) Inmunoglobulinas (mg/L) IgG

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Rango

1.1 235 3600 17.21

0.13 – 3.5 5.7 – 1160 1700 – 4050 0.2 – 21.3

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IgA IgM Fibrinógeno (mg/L) Complemento (CH50 U/mL) Glucosa (mg/dL) Ácido úrico

740 370 0 20† ‡ ‡

270 – 1770 0 – 840 0 16 – 25 650 – 1200 25 – 72

* En la rodilla; † Aproximadamente 10 % del valor plasmático; ‡ En el ayuno son similares al valor plasmático.

Tabla 41-4. Clasificación patológica del líquido sinovial.

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Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Volumen (mL) > 3.5 > 3.5 > 3.5 > 3.5

Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Color Amarillo Amarillo-blanquecino Amarillo-verdoso Rojo pardusco

Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Viscosidad Alta Disminuida Disminuida Disminuida

Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Leucocitos (células/ L) 200-2000 2000-100,00010,000 >100,000 > 500

Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Neutrófilos (%) < 25 > 50 > 75 > 25

Prueba: No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Glucosa (mg/dL) ~ suero > 250 mg/dL mas bajo que el suero > 25 mg/dL mas bajo que el suero ~ suero

Prueba:

Cultivo

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No inflamatorio: Inflamatorio: Séptico: Hemorrágico:

Negativo Negativo Positivo Negativo

Prueba: No inflamatorio:

Patología relacionada Osteoartritis Osteocondritis disecante Osteocondromatosis Artritis traumático Neuroartropatía Gota Pseudogota Artritis psoriásica Síndrome de Reiter Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistémico Infección bacteriana Infección micótica Tuberculosis Hemofilia Traumatismo Sinovitis dendritica pigmentada

Inflamatorio:

Séptico:

Hemorrágico:

Figuras

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Figura 41-1 Relación entre membranas serosas, cavidades orgánicas y vísceras. El corazón se encuentra incluido en el saco pericárdico. La membrana externa del pericardio se denomina pericardio parietal. El pericardio visceral también llamado epicardio recubre la superficie exterior del corazón. El peritoneo parietal delimita la pared de la cavidad peritoneal. El peritoneo visceral rodea al estómago, hígado e intestinos. La cavidad peritoneal esta representada del espacio presente entre las dos capas del peritoneo.

Figura 41-2 El líquido pleural se forma en la pleura parietal debido a que la fuerza neta que determina el flujo hacia el exterior del capilar sistémico excede la presión coloidosmótica neta. El fluido se mueve hacia la pleura visceral donde la presión coloidosmotica es mayor a la presión hidrostática en el capilar pulmonar. Los vasos linfáticos contribuyen a la absorción de agua, proteínas y material particulado. PCO, presión coloidosmótica; PH, presión hidrostática.

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Figura 41-3 Determinaciones químicas útiles como marcadores de la participación de un órgano específico.

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Figura 41-4 Diagrama de una articulación normal con la ubicación del líquido sinovial. (De Beck, EW: Mosby’s atlas of functional human anatomy, St. Louis, 1982, Mosby.)

CAPÍTULO 42

42. Sistema Nervioso Michael D. Privitera Christian Kohler

Neuroanatomía básica Fisiología y bioquímica Formación de líquido cefalorraquídeo Barrera hematoencefálica Funciones del líquido cefalorraquídeo Composición del líquido cefalorraquídeo Metabolismo cerebral

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Sistemas neurotrasmitores Condiciones patológicas: neurológicas Coma Hemorragia intracraneal Infecciones Enfermedades inflamatorias Isquemia Apoplejía Isquemia cerebral difusa e hipoxia Enfermedad neuromuscular Síndromes neoplásicos y paraneoplásicos Epilepsia Intoxicación con drogas y venenos Enfermedades metabólicas Endocrinopatías Condiciones patológicas: psiquiátricas Esquizofrenia Desordenes afectivos Desordenes de ansiedad Prueba funcionales Prueba de supresión de la dexametasona Cambio de compuesto analizado en la enfermedad: compuestos no fármacos Aspecto del líquido cefalorraquídeo Proteínas del líquido cefalorraquídeo Síntesis de gama-globulinas Bandas oligoclonales Glucosa en el líquido cefalorraquídeo Pruebas de funcionalidad tiroidea Rastreo toxicológico Cambio de compuesto analizado en la enfermedad: monitoreo de fármacos terapéuticas Fármacos antiepilépticos Medicación antipsicótica Medicación antidepresiva Antidepresivos atípicos Ansiolíticos Estabilizadores del humor Métodos de análisis Barbitúricos

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OBJETIVOS Definir el concepto de barrera hematoencefálica y su papel fisiológico. Describir la función y la composición del líquido cefalorraquídeo (LCR) y enunciar sus principales cambios en la enfermedad. Enlistar los principales neurotransmisores y definir su función. Enlistar las principales causas de coma o de alteración del estado mental. Enunciar seis clases de fármacos anticonvulsivos y describir los métodos más comúnmente usados para medir una de estas clases.

Términos clave anticonvulsivantes Drogas usadas terapéuticamente para evitar las convulsiones de diversos tipos. antipsicóticos Fármacos usadas para revertir o atenuar los síntomas psicóticos (alucinaciones, delirios y los trastornos de la consciencia). apoplejía Instalación repentina de síntomas provocados por una isquemia cerebral aguda como consecuencia de una hemorragia, embolismo o trombosis, que se manifiesta por la pérdida de las funciones neurológicas. También llamado ictus apopléjico o infarto cerebral. barrera hematoencefálica Barrera entre el cerebro y la sangre que permite mantener una composición del líquido cefalorraquídeo diferente a la de la sangre. coma Estado de inconsciencia que no es posible revertir incluso mediante los estímulos más potentes. convulsión trastorno repentino y transitorio de la función mental o de los movimientos corporales que resulta de una excesiva descarga eléctrica de un grupo de células cerebrales. depresión Disturbo del humor descrito como el estar triste, afligido, desconsolado, decaído o irritable, acompañado de una pérdida profunda del interés o del placer por las actividades comunes o las diversiones. epilepsia Trastorno caracterizado por la tendencia a tener convulsiones. espacio subaracnoideo Espacio situado entre las membranas aracnoides y piamadre. esquizofrenia Estado psicótico deteriorativo con alucinaciones, delirios y los trastornos de la cognición que duran por más de 6 meses y para el cual no se espera la recuperación total. índice de IgG Relación entre (IgG del LCR x albúmina sérica)/(IgG sérica x albúmina del LCR), utilizada como un indicador del origen de la elevación de las proteínas en el LCR. líquido cefalorraquídeo (LCR) Líquido claro e incoloro presente en el interior de los cuatro ventrículos cerebrales, del espacio subaracnoideo y de la médula espinal. manía Trastorno periódico en el cual el humor es alto, expansivo o irritable, acompañado por hiperactividad, presión por hablar, conflicto de ideas, excesivo 1711

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amor propio y disminuida necesidad de sueño. meninges Las tres membranas que recubren el cerebro y la médula espinal; duramadre, aracnoides y piamadre. meningitis Inflamación de las meninges causada a menudo por infecciones bacterianas o vitales. neurotransmisor Sustancia química liberada por una neurona hacia el receptor específico situado en una célula adyacente, que altera el funcionamiento de la célula. recaptación Proceso mediante el cual las neuronas conservan sus propios neurotransmisores recuperándolos del espacio sináptico para almacenarlos y posteriormente volver a liberarlos. receptor neuronal Proteína compleja de la membrana celular que liga a un neurotransmisor particular e inicia una serie de eventos que alteran el funcionamiento de la membrana. sinapsis Unión estructural de dos neuronas, donde se envían mensajes químicos mediante neurotransmisores, desde la neurona presináptica hacia el receptor postsináptico. trastorno afectivo Desorden de la regulación del humor manifestada clínicamente por episodios o períodos de depresión o manía o ambas. trastorno afectivo bipolar Trastorno con episodios de depresión y manía presentes en el mismo paciente. trastorno afectivo unipolar Trastorno en el cual sólo se presentan episodios de depresión, sin episodios de manía. trastorno de ansiedad Trastorno crónico caracterizado por sentimientos inapropiados, profundos, continuos o paroxísticos de preocupación o miedo. ventrículos Cuatro cavidades intracerebrales ocupadas por líquido cefalorraquídeo y tapizadas por la piamadre y el plexo coroideo. xantocromía Coloración amarillenta del LCR provocada por la presencia de productos de degradación de la hemoglobina.

Neuroanatomía básica El sistema nervioso central (SNC) se compone del cerebro y la médula espinal. El cerebro incluye los dos hemisferios cerebrales, que son casi una imagen especular uno del otro, el tronco cerebral, una estrecha estructura a través de la cual deben pasar todas las vías que ingresan y abandonan los dos hemisferios y en el que se encuentran los centros que controlan la respiración, frecuencia cardíaca, movimientos oculares y muchas otras funciones críticas, y el cerebelo, una estructura redondeada del tamaño aproximado de una pelota de béisbol que contribuye al control del movimiento y del equilibrio (Fig. 42-1). La porción inferior del tronco cerebral se une a la médula espinal, que es el sitio de salida de los nervios que se dirigen hacia los músculos y el punto de entrada de las fibras sensoriales que retornan desde los órganos sensoriales. Todos los nervios situados en el exterior del sistema nervioso 1712

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central son designados genéricamente bajo la denominación de sistema nervioso periférico. Los dos hemisferios cerebrales están formados alrededor de un sistema conector de espacios huecos denominado sistema ventricular. Los ventrículos están ocupados por líquido cefalorraquídeo (LCR) (Fig. 42-2). El cerebro y la médula espinal están recubiertos por una serie de membranas denominadas meninges (Fig. 42-3). Su capa interna, denominada aracnoides se ubica por debajo de la cubierta más externa del cerebro y de la médula espinal, la duramadre o dura. La dura es una membrana resistente, no elástica que envuelve al cerebro y a la médula espinal en un saco no distensible. De esta forma, el cerebro, la sangre y el LCR se encuentran confinados a un espacio cuyo volumen es fijo. El espacio situado entre la piamadre y la aracnoides se denomina espacio subaracnoideo y comunica directamente con el sistema ventricular.

Fisiología y Bioquímica Formación del líquido cefalorraquídeo El sistema ventricular y el espacio subaracnoideo están ocupados por el líquido cefalorraquídeo (LCR). El volumen total de LCR en los adultos es de aproximadamente 150 ml. El LCR es producido y reabsorbido constantemente con una velocidad de aproximadamente 500 ml/día (0,35 mL/min). Esto significa que la cantidad total de LCR es reemplazada cada 6 a 8 horas. El LCR es producido en los ventrículos por una estructura especializada similar a una esponja denominada plexo coroideo. El LCR pasa de los ventrículos laterales, en donde se forma, al tercer ventrículo y luego al cuarto ventrículo. Abandona el cuarto ventrículo a través de tres pequeños orificios, o forámenes, para circular a través del espacio subaracnoideo intracraneano y espinal. La circulación del LCR puede ser bloqueada en cualquiera de los ventrículos o a nivel de los forámenes que los comunican, dando lugar a una hidrocefalia obstructiva (acumulación de líquido en el cerebro). El LCR producido en forma constante, es absorbido a nivel de las vellosidades y granulaciones aracnoideas para mantener su volumen constante. Estas vellosidades y granulaciones subaracnoideas se encuentran diseminadas a lo largo del cráneo y del canal raquídeo hasta los sitios en que los nervios raquídeos atraviesan la dura. Por lo tanto, la reabsorción de LCR puede producirse a lo largo de la totalidad del eje neural. Si la absorción se altera, (por ejemplo, después de una inflamación meníngea, una meningitis bacteriana o una hemorragia subaracnoidea), la presión del sistema nervioso central y el volumen del LCR se incrementan, produciendo un cuadro denominado hidrocefalia comunicante. Los factores que determinan la velocidad con la que el LCR es formado y absorbido son complejos y no están completamente dilucidados. Cualquier incremento del volumen de uno de los componentes (es decir, cerebro, LCR o sangre) conduce a un incremento marcado de la presión en el interior del sistema, a menos que se produzca una disminución equivalente del volumen de uno de los otros dos componentes. Cuando la presión del LCR aumenta, el cerebro puede sufrir los efectos directos del incremento anormal de la presión o como consecuencia de una disminución del flujo sanguíneo. Barrera hematoencefálica El término barrera hematoencefálica se usa para designar una barrera fisiológica que 1713

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separa el cerebro y el LCR de las sustancias transportadas en la sangre. La barrera hematoencefálica permite el mantenimiento de la composición del cerebro y del LCR a niveles considerablemente diferentes a la sangre en lo que se refiere a proteínas, iones y otros elementos moleculares. La barrera hematoencefálica es sumamente importante en la práctica clínica, pues determina el acceso de los antibióticos al cerebro y meninges y contribuye al delicado control ejercido sobre el medio químico cerebral a pesar de la aparición de cambios simultáneos en la sangre periférica. El compartimento de líquido extracelular (LEC) del cerebro mantiene una comunicación relativamente libre con el LCR, mientras que existe una barrera entre la sangre capilar y la combinación de los compartimentos del LEC y LCR. Los factores que influyen significativamente sobre el acceso de las sustancias al cerebro y al LCR incluyen peso molecular, fijación de proteínas y liposolubilidad. Respecto al peso molecular, el ingreso es inversamente proporcional al tamaño de la molécula, por ello la relación de 1/200 de la albúmina del LCR respecto al plasma (pm de la albúmina = 69,000 daltones). Las drogas con gran capacidad de fijación a proteínas ingresan mucho menos fácilmente al LCR que las sustancias no fijadas de menor peso molecular. Por ejemplo, la fenitoína se encuentra fijada a las proteínas en una proporción del 90% y con un 10% de fenitoína libre en sangre. Sólo un 10% de la fenitoína sanguínea total es capaz de ingresar con facilidad al LCR y únicamente ese 10% es "activo". Calcio, magnesio y metabolitos como la bilirrubina que se encuentran fuertemente unidos a proteínas, no penetran fácilmente en el LCR. Las sustancias altamente liposolubles, como el monóxido de carbono, drogas neuroactivas y alcohol. ingresan fácilmente al sistema nervioso central. Las sustancias que se encuentran altamente ionizadas a pH fisiológico están relativamente excluidas del LCR. Las sustancias altamente polares. como algunos aminoácidos, ingresan lentamente y requieren un mecanismo de transporte activo. La barrera hematoencefálica es rápidamente permeable al agua. pero no a los electrólitos. Los principales cationes (sodio y potasio) requieren de horas para lograr un equilibrio con el LCR después de la aparición de modificaciones en la sangre periférico. Las alteraciones de la osmolalidad sanguínea se acompañan de cambios paralelos en el LCR después de un período de latencia de pocas horas. En el caso de fármacos, su pKa, o constante de disociación iónica es importante para determinar la facilidad con las que estas sustancias pueden atravesar la barrera hematoencefálica. El pKa se refiere al pH al cual se encuentra ionizado el 50% de un compuesto. Un fármaco no ionizado es relativamente liposoluble y por lo tanto ingresa más libremente al SNC, mientras que la fracción polar ionizada será relativamente excluida. Finalmente, las características de la barrera hematoencefálica pueden alterarse notablemente en estados patológicos. La penicilina, una sustancia ácida, normalmente no ingresa al SNC después de una inyección parenteral, no obstante es un agente terapéutico efectivo en el tratamiento de la meningitis. La explicación es que la inflamación meníngea altera la barrera hematoencefálica, facilitando el acceso de fármacos, como la penicilina, que normalmente no podrían llegar hasta el tejido infectado. Algunos factores específicos que alteran la permeabilidad de la barrera hematoencefálica son los siguientes: 1. La inflamación. Puede incrementar la capacidad de ingreso al SNC de 1714

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macromoléculas como la albúmina y la penicilina. 2. La neovascularización. asociada por ejemplo con tumores, traumatismo o isquemia, altera el estado de la barrera hematoencefálica. Esto puede deberse a defectos presentes en los nuevos vasos sanguíneos o a la inmadurez de estos vasos. 3. Las toxinas pueden modificar las características de la barrera hematoencefálica. y algunos agentes empleados en estudios radiográficos incrementan su permeabilidad a través de efectos tóxicos directos. Cuando estos agentes son inyectados en concentraciones hiperosmolares el efecto es mayor. 4. Finalmente, la barrera hematoencefálica del sistema nervioso inmaduro es más permeable a una variedad de sustancias. En los niños menores de 6 meses, el contenido proteico del LCR alcanza normalmente el valor de 100 mg/L.

Funciones del líquido cefalorraquídeo ¿Por que el cerebro se encuentra inmerso y bañado por este líquido particular? En primer lugar, el LCR proporciona un sostén mecánico para el cerebro. En segundo lugar, el LCR probablemente contribuye a la remoción de productos metabólicos del cerebro, función que no se ha dilucidado aún, pero que probablemente sea importante tanto en los estados fisiológicos como patológicos . En tercer lugar existen algunos datos que indican que el LCR transporta compuestos biológicamente activos que podrían funcionar como mensajeros químicos. Finalmente, el LCR desempeña un papel importante en el mantenimiento del medio químico del cerebro. Aunque su comunicación con el compartimiento plasmático se encuentra estrechamente regulada, el LCR parece establecer una comunicación relativamente libre con el compartimento de líquido extracelular del cerebro, que contribuye al funcionamiento de las células cerebrales propiamente dichas. La sección siguiente examina con mayor detalle la composición del líquido cefalorraquídeo.

Composición del líquido cefalorraquídeo La composición iónica y molecular del LCR difiere de la del plasma en el caso de algunos componentes y es idéntica en el de otros (ver el siguiente cuadro). Las alteraciones en la concentración sérica de sodio se acompañan de alteraciones correspondientes del nivel de sodio en el LCR, de modo que, después de un período de 1 hora, las concentraciones de sodio son casi las mismas en ambos medios. Sin embargo. el nivel de potasio del LCR es inferior al del plasma y ademas es mantenido dentro de un intervalo de concentración muy pequeño en el LCR a pesar de la existencia de amplias fluctuaciones de los niveles plasmáticos. Estas diferencias parecen deberse en gran parte a un proceso de transporte activo para la entrada y salida del LCR. El cloro y el magnesio muestran una concentración algo más elevada en el LCR que en el plasma, y el bicarbonato está algo más reducido en el LCR. La concentración de glucosa del LCR normalmente oscila entre 45 y 80 mg/dL (2.5 a 4.44 mmol/L), es decir, entre un 60 y un 80% de la concentración de glucosa en sangre una vez alcanzado el equilibrio. La glucosa sanguínea y del LCR se equilibran después de un período de latencia de aproximadamente 4 horas, de modo que la concentración de glucosa en el LCR en un momento dado refleja los niveles de glucosa sanguínea durante las últimas 4 1715

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horas. Cuando se lleva a cabo una punción lumbar (PL) con el objeto de determinar la concentración de glucosa en el LCR es necesario obtener una muestra simultánea de sangre periférico. La concentración de glucosa en el LCR es modificada por ciertos procesos patológicos, como se discutirá más adelante. El nivel de glucosa en el LCR es definitivamente anormal cuando equivale a menos del 40% de la glucemia determinada simultáneamente; valores inferiores a 40-45 mg/dL son casi siempre anormales. Debe tenerse en cuenta que el porcentaje esperado de glucosa del LCR respecto a la glucosa en sangre (entre 60 a 80%), desciende a medida que la glucosa sanguínea aumenta. Es decir, es de esperar una relación glucosa del LCR/glucosa en sangre de 0.5 cuando los valores de la glucemia alcanzan los 500 mg/dL y una relación de 0.4 si la glucemia llega a los 700 mg/dL. Las proteínas halladas en el LCR usualmente se originan en el suero y alcanzan el espacio del LCR mediante un proceso de pinocitosis a través del endotelio capilar. La relación normal entre la proteína séricas y las proteínas del LCR es de 200:1 (con una concentración sérica de 70 g/L y una concentración en el LCR de 350 mg/L).

Características del Líquido Cefalorraquídeo Normal Volumen total: 150 mL. Color: Incoloro, como el agua Transparencia: Claro como el agua Osmolaridad a 37° C: 281 mOsm/L Gravedad específica: 1.006 a 1.008 Balance ácido-base: pH

7.31

PCO2

47.9 mm Hg

HCO3-

22.9 mEq/L

Sodio: 138 a 150 mEq/L Potasio: 2.7 a 3.9 mEq/L Cloruro: 116 a 117 mEq/ Calcio: 2.0 a 2.5 mEq/L (40 a 50 mg/L) Magnesio: 2 .5a 2.5 mEq/L (24.4 a 30.5 mg/L) Lactato deshidrogenasa: La actividad absoluta depende del método; aproximadamente 10% del valor sérico Glucosa: 450 a 800 mg/L Proteínas: 200 a 400 mg/L En diferentes niveles de la columna: Lumbar

200 a 400 mg/L

Cisternal

150 a 250 mg/L

Ventricular

150 a 100 mg/L

Separación electroforética de proteínas de líquido cefalorraquídeo (% de la concentración de proteína total) Prealbúmina

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2% a 7%

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Albúmina 1-globulina

a2-globulina

56% a 76% 2% a 7% 3.5% a 12%

y -globulina

8% a 18%

globulina

7% a 12%

IgG

10 a 40 mg/L

IgA

0 a 0.2 mg/L

IgM

0 a 0.6 mg/L

Relación /

1

Cuenta eritrocitaria: Recién nacido

0 a 675/mm3

Adulto

0 a 10/mm3

Cuenta leucocitaria: 20 ng/mL. Uso:

Método: Principio:

Uso:

2. Inmunoensayo enzimático (EIE) El inmunoensayo tipo “sandwich” utiliza anticuerpo anti-CEA unido a fase sólida seguido de la adición de un segundo anticuerpo con enzima marcada. La adición del sustrato de la enzima resulta en la formación de un producto que puede se detectado espectrofotométricamente Plasma o suero Método en uso mas común

Tabla 49-12. Métodos de inmunoelectroforesis. Método: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Principio:

Uso: Comentarios:

1. Inmunmoelectroforesis (IEF) Las proteínas son separadas primeros en agarosa por electroforesis de zona. Luego el antisuero es colocado en un canal horizontal para separar proteínas. Las bandas precipitadas aparecen en áreas donde se encuentran los antígenos y anticuerpos Suero, orina, otros fluidos corporales Usado como prueba confirmatoria para identificación de proteínas monoclonales 2. Inmunofijación Las proteínas son separadas por electroforesis de zona seguido por la aplicación de antisuero monoespecífico al área conteniendo proteínas para ser identificadas Suero, orina, otros fluidos corporales Mas sensible que IEF para la identificación de proteínas monoclonales

Table 49-13.

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Método

Principio

Uso

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1. Inmunmo-

Las proteínas son

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Usado como prueba

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electroforesis (IEF)

separadas primeros otros fluidos en agarosa por corporales electroforesis de zona. Luego el antisuero es colocado en un canal horizontal para separar proteínas. Las bandas precipitadas aparecen en áreas donde se encuentran los antígenos y anticuerpos

2. Inmunofijación Las proteínas son separadas por electroforesis de zona seguido por la aplicación de antisuero monoespecífico al área conteniendo proteínas para ser identificadas

Suero, orina, otros fluidos corporales

confirmatoria para identificación de proteínas monoclonales

Mas sensible que IEF para la identificación de proteínas monoclonales

Tabla 49-13. Métodos para cuantificación de inmunoglobulinas. Método: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Principio:

Uso: Comentarios:

Método: Principio:

2049

1. Inmunodifusión radial (IRS) La inmunoglobulina difunde en el gel conteniendo anticuerpo resultando en la formación de inmunoprecipitado. El diámetro del anillo de precipitación es porporcional a la concentración de inmunoglobulina. Suero, LCR, otros fluidos corporales Usado frecuentemente Lento y laborioso Exacto 2. Nefelometría La reacción de la inmunoglobulina con el anticuerpo resulta en la formación de inmunoprecipitado, el cual dispersa la luz. La cantidad de luz dispersada es proporcional a la concentración de inmunoglobulina. Suero, LCR, otros fluidos corporales Usado mas comúnmente Automático Requiere instrumentación especializada Exacto 3. Turbidimetría La reacción de inmunoglobulina con el

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Uso: Comentarios:

anticuerpo resulta en la formación de inmunoprecipitado, el cual aumenta la turbidez de la muestra y dispersa la luz Suero Usado comúnmente Automático Requiere instrumentación especializada

LCR, líquido cefalorraquídeo

Tabla 49-14. Propiedades físicas de las inmunoglobulinas humanas. Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

Peso molecular (daltones) 150,000 900,000 160,000 (monómero) 320,000 (dímero) 185,000 200,000

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

Coeficiente de sedimentación, S 6.6 18.0-19.0 6.25-10.9 6.2-7.0 7.86-7.92

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

2050

Cadenas pesadas

a

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

Subclases de cadenas pesadas 1, 2, 3, 4 1, 2 1, 2 – –

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM:

Cadenas livianas o o

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IgA: IgD: IgE: Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

o o o Fórmula molecular IgG( )2 2 IgG( )2 2 IgM( )(2 2 )s IgM( )(2 2 )s IgA( )(2 2 )1-3 IgA( )(2 2 )1-3 IgD( )2 2 IgD( )2 2 IgE( )2 2 IgE( )2 2

Intervalo de referencia de las concentraciones del suero (mg/mL) (por edad)

2051

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

Especimen cord 7.66-16.93 0.04-0.26 0.0004-0.09

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

0.5-3 meses 2.99-8.52 0.15-1.49 0.03-0.66

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

3-6 meses 1.42-9.88 0.18-1.18 0.04-0.90

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

6-12 meses 4.18-11.42 0.43-2.23 0.014-0.95

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgE:

1-2 años 3.56-12.0 40.37-2.39 0.13-1.18 116-122ng/mL

Clase de inmunoglobulina:

2-3 años

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IgG: IgM: IgA: IgE:

4.92-12.69 0.49-2.04 0.23-1.37 80-122 ng/mL

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

3-6 años 5.64-13.81 0.51-2.14 0.35-2.09

Clase de inmunoglobulina: IgE:

4-7 años 140-442 ng/mL

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

6-9 años 6.58-415.35 0.50-2.28 0.29-3.84

Clase de inmunoglobulina: IgE:

10-14 años 374-674 ng/mL

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA:

12-16 años 6.80-15.48 0.45-2.56 0.81-2.52

Clase de inmunoglobulina: IgG: IgM: IgA: IgD: IgE:

Adulto 8.00-16.00 0.50-2.00 1.40-3.50 0-0.14 2-2000 ng/mL

Datos de Seligson O, editor: Handbook series in clinical laboratory science. Sección F. Inmunology, vol 1, part 1, Boca Raton, Fla., 1978, CRC Press; y Meites S, editor: Pediatric clinical chemistry, ed 2, Chicago, 1981, American Association for Clinical Chemistry.

Tabla 49-15.

Métodos para análisis de AEP.

Métodos

Principio

1. Radioinmunoensayo (RIA)

Unión competitiva entre Uso en AEP y 125I-AEP para descenso

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sitios de unión de anticuerpo de separación 2. Enayo AEP en muestra de Uso en inmunoradiométrico paciente unida a descenso (EIRM) anticuerpo unido a fase sólida. Segundo anticuerpo marcado con 125I unido a fase sólida del complejo anticuerpo-AEP para formar un sandwich

Requiere separación

3.Inmunoensayo enzimático basado en micropartícula (IAEM)

AEP en muestra unida a Usado mas Automático anticuerpo-complejo frecuentemente Buena micropartícula, el cual sensibilidad es luego atrapado en una matriz de fibra de vidrio. Segundo anticuerpo marcado con FAL es agregado, y éste se une al AEP en micropartículas. Es agregado el sustrato conteniendo 4-metilumbelliferil fosfato, y es medida la fluorescencia del producto 4-metilumbeliferona.

4. Inmunoensayo enzimático (EIE)

Similar al método 2 Usado Automático descrito arriba frecuentemente excepto el marcador usado es FAL en lugar 125I. La absorbancia del p-nitrofenol formado de la reacción de FAL y p-nitrofenil fosfato está directamente relacionado a la concentración de AEP en muestra de pacientes

Tabla 49-16. Intervalos de referencia aproximados para fracciones de proteínas séricas. Total

Albúmina

Cantidad (%) 50 Intervalo, g/dL* 3.2-5.5

Alfa1

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Gama

5 10 15 20 0.1-0.3 0.6-1.0 0.7-1.1 0.8-1.6

*Si uno asume un intervalo de referencia de proteína total usual de 6.0 a 8.3 g/dL

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CAPÍTULO 50

50. Evaluación de Laboratorio del Receptor y del Donante de Trasplante Timothy J. Schroeder Stephen J. Rossi Kevin T. Schlueter M. Roy First

Evaluación de pretrasplantes Donante vivo (riñón) Donante cadáver Riñón Hígado Páncreas Corazón Receptor Renal Otros receptores Diagnóstico clínico y patológico del rechazo de trasplantes Riñón Hígado Corazón Páncreas Monitoreo de laboratorio del receptor de trasplante Riñón Páncreas Hígado Pruebas estáticas Pruebas dinámicas Corazón Monitoreo farmacológico Corticosteroides Azatioprina y ciclofosfamida Ciclosporina A Farmacocinética Efectos adversos Interacciones de fármacos Monitoreo

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Tacrolimus Preparaciones antilinfocíticas policlonales OKT3 Monitoreo inmunológico Pruebas de antígenos de leucocitos humanos Batería de prueba de anticuerpos reactivos Compatibilidad cruzada de linfocitos Cultivos mixtos de linfocitos Monitoreo del receptor soluble de interleuquina-2 Conclusión

OBJETIVOS Delinear las pruebas de laboratorio realizadas antes del trasplante en los donantes renales potenciales vivos con parentesco y en cadáveres, donantes de hígado, donantes del corazón y donantes de páncreas así como los receptores de trasplante potenciales. Definir los diferentes tipos de rechazo que ocurren en los pacientes de trasplante con respecto al tiempo en que se realiza el proceso, desempeño del órgano y diagnóstico. Enumerar los componentes más importantes de la evaluación de laboratorio en los siguiente tipos de trasplante: Riñón Páncreas Hígado Corazón Enumerar los agentes inmunosupresores que se evalúan mediante el monitoreo de medicamentos terapéuticos. Definir los ensayos inmunológicos de pretrasplante utilizados para predecir la compatibilidad de un donante con un receptor potencial.

Términos clave alogénico Se refiere a los órganos o células de otra persona, que pueden o no tener los mismos antígenos de histocompatibilidad que el receptor. anticuerpo Clase de proteínas séricas inducidas después del contacto con un antígeno. Un anticuerpo se une específicamente al antígeno que indujo su formación. La mayoría de los anticuerpos están presentes en la fracción de gama globulinas de suero. antígeno Cualquier molécula que puede ser reconocido por el sistema inmune. En general, las inmunoglobulinas reconocen y se unen a los antígenos intactos. antígeno de leucocitos humanos Es el principal complejo de histocompatibilidad. Está dividido en siete grupos principales: A, B, C, Clase III, DR., DQ y DP. Se le conoce ampliamente bajo su abreviatura inglesa HLA, por "Human Leukocyte Antigen"). azatioprina y 6-mercaptopurina Análogos de purinas que actúan sobre los linfocitos pequeños y células en división, de ese modo bloquean el desarrollo de linfocitos T responsables del rechazo de órganos. 2055

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células B Linfocitos que se desarrollan en el hígado fetal y posteriormente en la médula ósea. Responden a estímulos antigénicos mediante la división y diferenciación en células plasmáticas bajo el control de citoquinas generadas por los linfocitos T. marcadores CD Este sistema de la nomenclatura se usa para las moléculas superficiales de leucocitos que se identifican por anticuerpos monoclonales. Más de 80 moléculas individuales son reconocidas por esta serie, y algunas de ellas se encuentran en células diferentes a los leucocitos. corticosteroides Agentes que tienen numerosos efectos inmunosupresores y antiinflamatorios. Interfieren con la presentación del antígeno, inhiben la respuesta primaria del anticuerpo y reducen el número de los linfocitos T circulantes. ciclofosfamida Medicamento que previene la replicación de DNA al unirse covalentemente a éste mediante una reacción de alquilación. Actúa principalmente en los linfocitos e inhibe fuertemente las respuestas de anticuerpos. ciclosporina A Medicamento que se obtiene de un hongo e interfiere con los eventos tempranos de activación y transformación de linfocitos. Actúa principalmente en los linfocitos T y se ha convertido en el principal agente inmunosupresor usado después del trasplante. citoquinas Sustancias liberadas por los leucocitos y otras células controlan el desarrollo de la respuesta inmune. A menudo denominadas las "hormonas del sistema inmune," modulan la diferenciación y la división de las células tronco hematopoyéticas así como la activación de los linfocitos y fagocitos. citotoxicidad Término general para designar las maneras en las cuales los linfocitos, fagocitos mononucleares y granulocitos pueden matar a las células blanco. complejo de histocompatibilidad El complejo de glucoproteínas en la superficie de las células que es usada por el sistema inmune para definir lo propio y lo ajeno. inmunosupresión Las medidas usadas para reducir las respuestas inmunes y después del trasplante para prevenir el rechazo del injerto. La mayoría no son específicos para los antígenos de trasplante. interleuquina-2 Una citoquina que es un factor esencial de crecimiento de linfocitos T, requerida para la división de los linfocitos T activados por antígeno. complejo mayor de histocompatibilidad Un grupo grande de genes incluidos los que codifican las moléculas de clase I y II del complejo mayor de histocimpatibilidad que participan en la presentación del antígeno a los linfocitos T. Se conoce ampliamente bajo su abreviatura inglesa MHC, por "Major histocompatibility Complex"). OKT3 Anticuerpo monoclonal murino dirigido contra el receptor de CD3 en los linfocitos T humanos. Se usa para que prevenir o tratar el rechazo agudo después del trasplante. agentes antilinfocíticos policlonales Anticuerpos inmunosupresores producidos al inyectar material linfoide humano (bazo, timo, ganglio linfático) en un animal (caballo, cabra, oveja, conejo) que genera una respuesta de anticuerpos contra el tejido humano. La globulina inmune de animales se purifica y se usa para prevenir o tratar el rechazo en los pacientes de trasplante humano. rechazo Reacción inducida por los linfocitos T del receptor que reconocen a las moléculas del MHC alogénico. Los linfocitos T pueden activar células mononucleares que infiltran injertos, dañando al injerto. 2056

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linfocitos T Linfocitos que se desarrollan en el timo y cuya función es reconocer los antígenos que se originan en el interior de las células del huésped como propios y los antígenos extraños como no propios. tacrolimus (FK506) Compuesto obtenido de hongos que previene la activación de linfocitos T al inhibir los eventos tempranos de las señales de calcio. Es aproximadamente 100 veces más potente que la ciclosporina A y ha sido aprobado recientemente por la Administración de Alimentos y Medicamentos. tipificación tisular Técnica empleada para determinar las especificidades principales de histocompatibilidad que tienen las células de un individuo. tolerancia La adquisición de la falta respuesta a una molécula que normalmente es reconocida por el sistema inmune.

El trasplante de órganos sólidos se ha convertido en la terapia de elección para tratar las enfermedades terminales del riñón, hígado y corazón. Los adelantos en las técnicas quirúrgicas y las capacidades de diagnóstico, el progreso en la inmunología y el análisis de histocompatibilidad, el desarrollo de agentes inmunosupresores más específicos y potentes, las mejoras en el manejo del donante, y la preservación de órganos y los nuevos agentes antimicrobianos han contribuido al éxito en el trasplante de órganos sólidos. Un reflejo de estas mejoras es que el número total de trasplantes de cada tipo se triplicó en los Estados Unidos durante el último decenio (Tabla 50-1). El término injerto se usa para describir un órgano trasplantado. Los aloinjertos se refieren al tejido que se toma de un individuo y se usa para un segundo individuo. Un aloinjerto de un pariente se denomina un injerto del donante familiar vivo (IDFV). Los aloinjertos de los individuos que han sido declarados legalmente muertos ("muerte cerebral") se denominan los aloinjertos del cadáver. Los trasplantes son procedimientos médicos de alto riesgo. El factor principal que limita el trasplante es la escasez de órganos. A finales de 1994, la lista de espera para los trasplantes de órganos sólidos en los Estados Unidos excedió los 35,000. Esto representó un aumento de más de100% con respecto a 1988. En los casos de las enfermedades del corazón y hepáticas, el no recibir un trasplante oportuno conduce a la muerte. De acuerdo a los registros, el porcentaje general de personas que murieron mientras esperaban un trasplante en 1993 fue 5.8%. Las tasas de mortalidad más altas fueron para los receptores del corazón y cardiopulmonares con 13.1% y 16.2% respectivamente. A medida que los trasplantes han evolucionado, la función del laboratorio clínico claramente se ha tornado más definida. Este capítulo es una descripción de la utilidad de monitorear tanto a los donantes de trasplante como a los receptores de órganos sólidos.

Evaluación de Pretrasplantes Ningún trasplante se realiza sin una investigación clínica minuciosa tanto del donante como del receptor. Cada órgano tiene criterios específicos que deben examinarse antes de que se realice el trasplante. Donante vivo (riñón) 2057

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Las tasas de supervivencia de aloinjertos son mayores cuando el injerto se obtiene de un I en vez de un donante cadáver. Una segunda ventaja importante de los trasplantes de donantes vivos es la naturaleza del procedimiento, ahorrando al receptor el largo período de espera en la diálisis que ocurre con frecuencia cuando uno está esperando un trasplante de un cadáver apropiado. Una tercera razón del uso continuado de los donantes familiares es la escasez de los donantes cadáveres. El donante potencial y el receptor deben evaluarse para demostrar la compatibilidad del tipo de sangre de ABO. Se debe realizar entre el donante y el receptor otra prueba de inmunocompatibilidad, llamada compatibilidad cruzada de linfocitos T citotóxicos. Esto asegura que el receptor no haya preformado anticuerpos contra el donante. Todos los donantes potenciales deben ser emocionalmente estables y deben comprender plenamente el proceso de donar un riñón. Los donantes potenciales se evalúan meticulosamente para asegurar que están en un estado de salud general excelente y que no hay ninguna contraindicación para la remoción de un riñón (Tabla 50-2). Una meta de esta evaluación es la detección de enfermedades insospechadas en el donante, como la diabetes, la hipertensión, la anemia, los cálculos renales, o alguna neoplasia maligna. Otra meta es detectar infecciones que pueden transmitirse al receptor. La meta del resto de los estudios es evaluar si la función renal y la estructura del aloinjerto renal potencial son completamente normales. La edad del donante familiar vivo potencial es obviamente importante. Los menores no son aptos para la donación de riñón, pero pueden usarse donantes más viejos, hasta 70 años de edad, si gozan de excelente salud. Los donantes renales a los que se ha dado seguimiento hasta 20 años después de la donación presentan una leve reducción en la tasa de filtración glomerular y un aumento moderado en la excreción proteína urinaria sin aumento en la hipertensión. Donante cadáver Los donantes cadáveres son individuos previamente sanos que padecen muerte cerebral irreversible. Una vez que son declarados legalmente muertos, se mantienen en un respirador y se les maneja clínicamente con líquidos y medicamentos apropiados para mantener la función cardiovascular, hasta que los órganos se extraen. Cada donante se somete a una extensa revisión de su historia clínica y rigurosas pruebas, tanto físicas como de laboratorio a fin de asegurar la función óptima del órgano. Los estudios de laboratorio obtenidos durante la admisión del paciente son importantes y establecen valores de comparación de los sistemas de órganos del individual. La Red Unida para Compartir Órganos (UNOS) ha establecido pruebas de laboratorio obligatorias (Tabla 50-3), aunque ocasionalmente pueden solicitarse pruebas adicionales. Por ejemplo, si el corazón o los pulmones del donante están considerándose para el trasplante, pueden ser ordenados en el momento de la evaluación un ecocardiograma, ECG, radiografía del tórax, y la medición de los niveles de creatina cinasa-MB. Riñón. La mayoría de los donantes cadáveres de riñón están entre 2 y 70 años de edad. Sin embargo, se han trasplantado con éxito los riñones de recién nacidos y de donantes mayores de 70 años de edad. Es necesaria una minuciosa historia médica pasada y presente del donante. Los estudios de laboratorio deben incluir aquellos enumerados en la Tabla 50-3, con atención específica en los resultados de creatinina sérica y en los niveles de urea en el análisis 2058

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de orina. Solamente los pacientes con valores de laboratorio que están dentro de los intervalos de referencia, o pacientes con valores de laboratorio o resultados clínicos que están regresando a la normalidad después del manejo, son aceptados generalmente como donantes cadáveres de riñón. Hígado. Se pueden usar con seguridad los hígados de donantes de individuos de hasta 70 años de edad. Los donantes de mayor edad que están lo bastante sanos como para permanecer hemodinámicamente estables después de la muerte cerebral pueden convertirse en donantes aceptables. Los antecedentes sociales y la causa de muerte son a menudo piezas valiosas de información para los donantes hepáticos potenciales. Las pruebas de laboratorio incluyen aquellas pruebas enumeradas en la Tabla 50-3 con especial atención a la bilirrubina, ASAT, ALAT y la fosfatasa alcalina. Son aceptables las elevaciones moderadas en los estudios de función hepática, especialmente si la tendencia es hacia el rango de referencia. Páncreas. En general, los donantes que son aceptables para los trasplantes renales hepáticos son también aceptables como donantes de páncreas. Las contraindicaciones principales para la aceptación de un donante para el trasplante de páncreas son una historia de diabetes y la pancreatitis aguda o crónica. La hiperglucemia se ve con frecuencia en los individuos después de un severo traumatismo craneoencefálico o como resultado de la administración de las soluciones que contienen glucosa. Estos factores no son una contraindicación para el restablecimiento del páncreas si el paciente no tiene ningún antecedente de diabetes. En los casos dudosos, la medición de los niveles de hemoglobina glucosilada puede demostrar que la función de páncreas de largo plazo ha sido normal. La amilasa sérica elevada no necesariamente es indicativa del traumatismo pancreático. La visualización directa del páncreas es la mejor manera de evaluar la lesión pancreática en los casos de traumatismo. La evidencia del traumatismo pancreático impide la remoción para trasplante. La edad del donante potencial no es generalmente un factor para los trasplantes pancreáticos, aunque los criterios edad son ligeramente más restrictivos que para los trasplantes renales. Corazón. La evaluación cardíaca del donante combina el interrogatorio, la exploración física, y las pruebas diagnósticas. Los problemas de contraindicación incluyen traumatismo del tórax contuso prominente, hipotensión prolongada, paro cardíaco, y síntomas cardíacos premórbidos. Si ocurrió traumatismo contuso o paro cardiaco, la medición de lactato deshidrogenasa sérica y los niveles isoenzimáticos de creatina cinasa, así como una radiografía del tórax y un ECG, pueden ayudar a juzgar la gravedad del daño al miocardio. En general, los individuos mayores que 50 años de edad no se consideran como donantes cardíacos aptos. Receptor Es esencial realizar una detallada evaluación médica y psicológica de todo los receptores potenciales de trasplante. Los pacientes deben estar suficientemente sanos y motivados para someterse al procedimiento quirúrgico, para resistir los problemas potenciales asociados con los agentes inmunosupresores y para cumplir con un régimen médico complejo 2059

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y demandante. Renal La evaluación pretrasplante del receptor de un riñón se enumera en la Tabla 50-4. La finalidad de esta evaluación es detectar cualquier problema que pueda disminuir las perspectivas de éxito del procedimiento y para tomar las medidas correctivas cuando sea necesario. No todos los pacientes con nefropatía terminal son candidatos a trasplante. Los pacientes de edad avanzada o con enfermedad sistémica prominente no son generalmente candidatos aceptables. La Sociedad Estadounidense de Médicos de Trasplantes ha publicado una lista de las contraindicaciones absolutas para trasplante, que incluye infección activa, enfermedad cardiovascular avanzada, enfermedad pulmonar avanzada, enfermedad hepática crónica grave, neoplasia maligna, vasculitis aguda o glomerulonefritis, enfermedad de vías urinarias inferiores no corregible, oxalosis primaria, una edad mayor que 70 años, obesidad mórbida, problemas psicosociales severos, abuso de drogas o alcohol, y compatibilidad cruzada positiva, actualizada de linfocitos T. Otros receptores. Se usan evaluaciones de laboratorio similares para evaluar a los receptores potenciales de hígado, corazón, páncreas y pulmones. La meta principal es asegurarse que el paciente esté suficientemente sano para sobrevivir la cirugía y las complicaciones de postrasplante asociadas con la inmunosupresión de por vida. Obviamente, las enfermedades cardíacas avanzadas no serían una contraindicación al trasplante de corazón pero serían una contraindicación al trasplante hepático. La infección activa, la neoplasia maligna, los problemas psicosociales graves y cualquier abuso activo de drogas o alcohol, son contraindicaciones para todos los trasplantes.

Diagnóstico Clínico y Patológico de Rechazo al Trasplante El rechazo de aloinjertos es la destrucción de un órgano trasplantado que resulta de un ataque inmune desarrollado por el cuerpo del receptor. El órgano rechazado pierde la función. El proceso de vigilar la salud de un órgano trasplantado incluye un componente importante de pruebas de laboratorio. El diagnóstico del rechazo de trasplantes es a menudo un proceso excluyente por el cual el clínico descarta otras complicaciones postrasplante. Por ejemplo, el rechazo renal debe diferenciarse de los efectos nefrotóxicos del medicamento ciclosporina A, que se usa para suprimir la respuesta inmune del receptor. El rechazo de aloinjertos hepáticos debe diferenciarse de la lesión hepática inducida por medicamentos, complicaciones quirúrgicas y hepatitis. Aunque las pruebas bioquímicas e inmunológicas y los síntomas clínicos pueden ser altamente sugestivos del rechazo de órganos, el diagnóstico definitivo se hace mediante el examen histológico del órgano trasplantado. Este es un procedimiento invasor que requiere una muestra del tejido del aloinjerto para examinarse mediante análisis microscópico. El rechazo de aloinjertos puede ser causado por los linfocitos T del sistema inmune, los anticuerpos producidos por las células B o ambos. La diferenciación entre estos procesos se basa en el cuadro clínico, la sincronización del evento y el examen histológico. El rechazo 2060

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hiperagudo, definido como el inicio del rechazo del órgano minutos después del trasplante, ocurre porque los anticuerpos contra el tejido de donantes ya están presentes en el receptor. Las manifestaciones clínicas se observan inmediatamente después que se restaura el suministro de sangre al injerto. El rechazo celular agudo es un proceso mediado por células T y es la forma más común de rechazo. Puede ocurrir en cualquier momento después del trasplante, pero es sumamente común dentro de los 6 primeros meses después del trasplante. El rechazo crónico es una pérdida lenta, progresiva de la función del órgano que generalmente sigue a los episodios del rechazo celular agudo. La evolución del rechazo crónico es generalmente de meses a años. Riñón El rechazo hiperagudo del riñón es un acontecimiento poco común con las técnicas actuales de compatibilidad cruzada. Los coágulos se forman en las arterias renales, seguidas de necrosis de la corteza renal. El rechazo celular agudo varía desde las formas moderadas hasta las severas, dependiendo del grado de daño renal (Tabla 50-5). El rechazo crónico da lugar a un deterioro progresivo e irreversible de la función renal. Hígado El rechazo hiperagudo de los aloinjertos hepáticos ocurre rara vez en los donantes compatibles con ABO, sin embargo, la escasez de los donantes ha hecho que el trasplante hepático incompatible sea más común, por lo tanto aumenta el riesgo para este tipo de rechazo. El rechazo celular agudo de los aloinjertos hepáticos se caracteriza por la inflamación portal con un infiltrado linfocítico predominante. La gravedad del rechazo (Tabla 50-6) determinará la terapia a seguir. El rechazo crónico hepático, o "síndrome del conducto biliar desaparecido," se caracteriza por la colestasis progresiva y la función hepática en deterioro. La lesión de los conductos biliares es el resultado de una arteriopatía vascular que disminuye el suministro de sangre al árbol biliar. Corazón El rechazo hiperagudo en los aloinjertos cardíacos es sumamente poco común pero se ha observado tanto en los trasplantes ABO compatibles como en los incompatibles. Debido a la rapidez de este proceso, la supervivencia de pacientes y del injerto es generalmente baja. El rechazo celular agudo es detectado mediante biopsias seriadas del endomiocardio. La magnitud de la gravedad del rechazo celular agudo se basa en los criterios establecidos por la Sociedad Internacional del Trasplante de Corazón y Pulmón (Tabla 50-7). El rechazo crónico se manifiesta generalmente como una arteriosclerosis acelerada. Páncreas La biopsia rutinaria del páncreas para diagnosticar el rechazo se realiza con poca frecuencia debido a la alta morbilidad asociada con este procedimiento. El rechazo hiperagudo no ha sido descrito claramente en el aloinjerto pancreático. En el rechazo celular agudo, un infiltrado linfocítico de los vasos pequeños del aloinjerto produce daño a los acinos circundantes y a las arterias pequeñas del dúctulo. El rechazo crónico conduce finalmente a la pérdida de la función pancreática tanto exocrina como endocrina. 2061

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Monitoreo de Laboratorio del Receptor de Trasplante El desarrollo clínico de rechazo agudo de un órgano trasplantado da lugar generalmente a la destrucción progresiva de aloinjertos acompañada de la disfunción del órgano. El examen histopatológico del tejido trasplantado sigue siendo la norma para la determinación del rechazo después que se ha evidenciado clínicamente. Sin embargo, el éxito continuo del trasplante de órganos es en gran parte el resultado del uso de pruebas de laboratorio para detectar signos tempranos del rechazo y para monitorear el tratamiento. Estas pruebas miden los marcadores bioquímicos que reflejan el daño del aloinjerto del órgano y la función del órgano. Riñón La evaluación de laboratorio de la función renal después del trasplante emplea las mismas pruebas usadas rutinariamente para monitorear la función glomerular y tubular. El rechazo sigue siendo una causa importante de la disfunción renal después del trasplante del riñón, pero la nefrotoxicidad de ciclosporina A, las enfermedades recurrentes, las infecciones, y las complicaciones vasculares pueden causar disfunción renal en estos pacientes. El análisis de rutina de creatinina sérica y urea sigue siendo la medida clínica más práctica de la función renal. Los incrementos en creatinina sérica son a menudo la indicación inicial de las complicaciones renales de postrasplantes. Tanto el grado de aumento de creatinina como la velocidad de dicho ascenso son importante en el diagnóstico. La velocidad de aumento de creatinina sérica, en combinación con otros resultados clínicos e histopatológicos (Tabla 50-8), puede usarse para diferenciar el rechazo agudo de la nefrotoxicidad por ciclosporina A. Otros resultados de la química sérica pueden tener alguna utilidad en este diagnóstico diferencial. La disfunción tubular inducida por ciclosporina A puede causar elevaciones en el potasio sérico, bicarbonato y ácido úrico, mientras que causa una disminución en el magnesio sérico. Las alteraciones en la excreción urinaria de sodio y potasio son compatibles con la nefrotoxicidad de ciclosporina A. Las pruebas funcionales como la manometría renal, la ultrasonografía, la generación de imágenes por resonancia magnética y las exploraciones con radioisótopos pueden delinear aún más la causa de la disfunción del aloinjerto renal.

Páncreas Debido a que el páncreas se trasplanta generalmente en combinación con el riñón, los marcadores bioquímicos de la función renal a menudo se utilizan como indicadores tempranos del estado del trasplante pancreático. Los aumentos en la amilasa sérica y glucosa ocurren muy al final del proceso de rechazo de páncreas y siguen siendo en gran parte poco seguros como indicadores del rechazo temprano de aloinjertos. La mayoría de los trasplantes de páncreas se realiza de manera que las enzimas pancreáticas se drenen en la vejiga. En consecuencia, se ha visto que la disminución de los niveles de amilasa urinaria correlacionan con la disfunción temprana de trasplante pancreático. La frecuencia de esta prueba es un factor importante en su sensibilidad para detectar el rechazo de aloinjertos. La mayoría de los 2062

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centros monitorean inicialmente los niveles de amilasa urinaria diariamente o al menos tres veces por semana. Otras enzimas pancreáticas como el tripsinógeno también pueden ser útiles. Los resultados citológicos del líquido pancreático también pueden ser de valor diagnóstico; un aumento en los linfocitos y blastocitos es indicativo del rechazo, mientras que un predominio de los neutrófilos es más característico de una infección. Las pruebas funcionales que evalúan la respuesta de insulina a la carga de glucosa también pueden ser útiles para la evaluación de la reserva pancreática.

Hígado Los marcadores bioquímicos se usan habitualmente para vigilar la función del aloinjerto hepático. Las diversas pruebas utilizadas para evaluar la función hepática pueden dividirse en dos categorías: (1) las pruebas estáticas, que permiten evaluar la función hepática indirectamente al medir las sustancias producidas por el hígado, y (2) las pruebas dinámicas, que miden directamente las capacidades metabólicas y de depuración del hígado. Las pruebas estáticas. En general, las concentraciones séricas de bilirrubina, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (ASAT) y alanina aminotransferasa (ALAT) son pruebas de función hepática comúnmente usadas. Estas pruebas se evalúan diariamente durante las primeras semanas del período de postrasplante. La frecuencia de evaluación disminuye en la medida que se demuestra la función estable del injerto y se incrementa cuando ocurre disfunción hepática. Otras pruebas de los compuestos analizado séricos, como lactato deshidrogenasa (LD), 5’-nucleotidasa (5-NT) y gama-glutamiltransferasa (GGT) se consideran pruebas secundarias y pueden no formar parte del monitoreo estándar después del trasplante hepático. Los aumentos pequeños de las pruebas hepáticas estándar no indican necesariamente el rechazo de aloinjertos hepáticos. Sin embargo, los incrementos seriados menores o iguales al 25% durante varios días se consideran un indicador confiable de la disfunción del aloinjerto hepático. Los resultados de las pruebas de función hepática, como la bilirrubina, fosfatasa alcalina, ASAT y ALAT, no siempre indican el rechazo del trasplante, ya que las evaluaciones de los resultados de las pruebas también se asocian con otras condiciones clínicas (Tabla 50-9). Por ejemplo, aunque la bilirrubina sérica y la fosfatasa alcalina se eleven progresivamente con el desarrollo de rechazo celular agudo, también ambas se elevan durante la colestasis secundaria a la obstrucción biliar, la toxicidad a medicamentos, las lesiones producidas en el proceso de preservación de órganos antes del trasplante, y las infecciones. Los aumentos tempranos en las aminotransferasas séricas pueden ocurrir con rechazo pero los incrementos se tornan progresivamente mayores (>2 veces el límite superior del valor normal) en los casos graves. Las elevaciones agudas de ASAT y ALAT son también reflejo de una lesión hepatocelular isquémica, necrosis y hepatitis. Los marcadores séricos de la función de síntesis hepática (proteínas séricas, amoníaco sérico y factores de coagulación) se vuelven en general anormales como resultado de enfermedades hepáticas progresivas de muchos años o por insuficiencia hepática fulminante severa. En general, las pruebas estáticas son indicadores tempranos sensibles de la disfunción del aloinjerto hepático pero no son específicas para el rechazo. 2063

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Las pruebas dinámicas. Se han desarrollado pruebas dinámicas de la función hepática en un intento de medir el estado funcional del hígado. Las pruebas dinámicas evalúan la capacidad del hígado de depurar o metabolizar diversos sustratos. Varias de estas pruebas se han evaluado ampliamente como parte de la evaluación clínica de los donantes y receptores de trasplante hepático (Tabla 50-10). El estado de la oxigenación hepatocelular se refleja por la relación del acetoacetato sérico (AcAc) a 3-hydroxybutyrate (HB), conocido como la razón de cuerpos cetónicos (RCC). A medida que disminuyen el estado de oxigenación del hígado y la razón de NAD/NADH, se forma más HB a partir de AcAc. Clínicamente, una RCC de 40 años) exploración con ultrasonido Exploración ultrasónica de la vesícula biliar Cistouretrograma evacuado Mamografía (mujer >40 años)

2075

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* No hay rangos absolutos aceptables para estas pruebas de laboratorio. El objetivo es asegurar que el receptor potencial esté suficientemente motivado para experimentar el procedimiento quirúrgico y para resistir los problemas potenciales de los agentes inmunosupresores.

Tabla 50-5. Escala de clasificación Banff del rechazo de aloinjerto renal agudo * Clasificaciones

Descripción

Cambios dudosos

Invasión linfocítica leve de los túbulos (tubulitis)

Rechazo agudo leve (grado I)

Infiltrados intersticiales con tubulitis moderada

Rechazo agudo moderado (grado II)

Infiltrados intersticiales con tubulitis severa y/o moderada, arteritis intimal.

Rechazo agudo severo (grado III)

Arteritis severa intimal y/o transmural, cambios de fibrinoides, necrosis celular de músculo liso a menudo con infarto por zonas y hemorragia intersticial

Estandarización internacional de los criterios para el diagnóstico histológico del rechazo de aloinjertos renales desarrollado por un grupo de patólogos renales, nefrólogos y cirujanos de trasplante que se reunieron en Banff, el Canadá, 2-4 de agosto de 1991. * La clasificación histológica puede o no correlacionarse con los índices bioquímicos como la creatinina sérica.

Tabla 50-6 Clasificación del rechazo de aloinjerto celular hepático agudo *

Grado

2076

Descripción

Consistente con el rechazo

Infiltrado portal linfocítico o mixto con daño mínimo del conducto biliar (50%), con o sin endotelialitis

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Rechazo severo

Infiltrados linfocíticos o portales mixtos, arteritis, escasez de conductos biliares, hinchamiento hepatocelular central con deserción confluente de los hepatocitos

* La clasificación histológica puede o no correlacionar con índices bioquímicos como ASAT, ALAT y bilirrubina.

Tabla 50-7. Clasificación estándar de biopsias cardiacas de la Sociedad Internacional para Trasplantes de Corazón *

Grado

Descripción

0

Ningún rechazo

1A

Infiltrado focal perivascular o intersticial sin daño de miocitos

1B

Infiltrado difuso pero perivascular disperso y/o intersticial sin daño de miocitos

2

Un foco sólo con infiltración dinámica y/o daño focal de miocitos

3A

Infiltrados multifocales y/o daño de miocitos

3B

Proceso inflamatorio difuso con daño de miocitos

4

Infiltrado polimórfico difuso agresivo edema hemorragia vasculitis con necrosis

*La clasificación histológica no correlaciona con índices bioquímicos como la creatina fosfocinasa y la lactato deshidrogenasa.

Tabla 50-8. Comparación del rechazo agudo con la nefrotoxicidad de ciclosporina A (CYA) Parámetro

Rechazo agudo

Nefrotoxicidad de CYA

Clínico Aparición

37.°C

+

-

Aumento de peso >0.5 kg

+

Oliguresis

++

Bioquímico

2077

Creatinina

Ascenso rápido (>3 mg/L/día)

Ascenso gradual (1-2 mg/L/día)

BUN:creatinina

20:1

Potasio (suero)

Aumentado

Aumentado ++

Bicarbonato (suero)

Disminuido +

Disminuido ++

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Ácido úrico (suero)

Ningún cambio

Aumentado +

Magnesio (suero)

Ningún cambio

Disminuido +

Sodio (orina)

Disminuido ±

Disminuido ++

Ciclosporina A* nivel directo Bajo, 400 ng/mL

Linfocitos (orina)

++

-

Endovasculitis

Arteriolopatía

Tubulitis

Vacuolización tubular y mitocondrial

Edema intersticial

Edema mínimo

Glomerulitis

Fibrosis intersticial

Infiltrados difusos

Infiltrados focales

Ultrasonografía

Area transversal del injerto aumentada

Área transversal del injerto normal

Imagen de resonancia magnética

Hinchamiento

Normal

Radionucleótidos

Perfusión reducida. Flujo arterial irregular

Función tubular reducida Perfusión normal o reducida

Patológico Biopsia

Pruebas diagnósticas

+ Indica una respuesta positiva y - indica falta de respuesta. * Sangre entera de TDx, ensayo monoclonal.

Tabla 50-9. Cambios Relativos en los valores de laboratorio después del trasplante hepático

Condición clínica

Bilirrubina

Fosfatasa alcalina

ASAT

ALAT

Rechazo Leve

++

++

+

+

Moderado

++

++

++

++

Severo

+++

+++

+++

+++

++

++

±

±

Necrosis isquémica

++

++

+++

+++

Hepatitis

+

+

++

++

Otras condiciones Colestasis

ALAT, Alanina aminotransferasa; ASAT, aspartato aminotransferasa.

Tabla 50-10. Pruebas dinámicas de función hepática 2078

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Prueba

Evaluación funcional

Utilidad

metabolismo de lidocaína / formación de monoetilglicinexilidida

Actividad de Citocromo P-450, flujo sanguíneo hepático

Evaluación del donante potencial y receptor antes del trasplante y evaluación del receptor después del trasplante

Depuración del verde de indocianina

Flujo sanguíneo hepático

Evaluación del receptor potencial antes del trasplante

Eliminación de galactosa

Función hepatocelular a través de la capacidad de saturación enzimática

Evaluación del donante potencial antes del trasplante

Relación acetoacetato/3-hidroxibutirato (relación de cuerpos cetónicos)

Función de reducción/oxidación, respiración hepatocelular

Evaluación del donante potencial antes del trasplante y del receptor después del trasplante

Tabla 50-11. Protocolos inmunosupresores comunes

Monoterapia Ciclosporina A Tacrolimus Doble terapia Ciclosporina A + prednisona Tacrolimus + prednisona Prednisona + azatioprina Triple terapia Ciclosporina A + prednisona + azatioprina Tacrolimus + prednisona + azatioprina Cuádruple terapia Terapia antilinfocítica (OKT3 o ATG) + Ciclosporina A + Prednisona + Azatioprina Terapia antilinfocítica (OKT3 o ATG) + Tacrolimus + Prednisona + Azatioprina

Tabla 50-12. Interacciones farmacológicas de Ciclosporina A Niveles reducidos de ciclosporina A

2079

Niveles aumentados de ciclosporina A

Sinergismo nefrotóxico

Carbamazepina

Diltiazem

Aciclovir

Isoniazida

Eritromicina

Aminoglucósidos

Fenobarbital

Fluconazol

Amfotericina B

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Fenitoína

Itraconazol

Cotrimoxazol

Rifampicina

Ketoconazol

Furosemida

Nafcilina

Metoclopramida

Ganciclovir

Metilprednisolona

Antagonistas de H 2

Nicardipina

Melfalán

Verapamil

Agentes anti-inflamatorios no esteroideos Vancomicina

Tabla 50-13. (Parte A) Resumen de los parámetros de ensayo para el monitoreo de ciclosporina A Ensayo

Tipo de anticuerpo, automatizado

Matriz de la muestra, automatizado

Linealidad

3H Sandoz

Policlonal, No

Plasma Sangre entera

62.5-2000 50-1000

HPLC

No aplicable

Sangre entera

50-1000

TDx

Policlonal, Sí

Plasma Sangre entera

10-1000 25-2000

INCstar

Policlonal, No

Plasma Sangre entera

50-1000

3H Sandoz

Monoclonal, No

Plasma Sangre entera

INCstar

Monoclonal, No

Plasma Sangre entera

50-1000

10-500

TDx

Monoclonal, Si

Sangre entera

25-1500

Du Pont

Monoclonal, Sí

Sangre entera

25-350

Syva

Monoclonal, Sí

Sangre entera

50-500

Tabla 50-13 (Parte B) Resumen de los parámetros de ensayo para el monitoreo de ciclosporina A Tiempo de entrega Ensayo

2080

Matriz de la muestra, automatizado

% de CV

Tiempo estimado

Específico o no específico

3H Sandoz

Plasma Sangre entera

4-12

8 horas

No específico

HPLC

Sangre entera

7-10

8 horas

Específico

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Plasma Sangre entera

3-4 2-6

45 min 45 min

No específico

INCstar

Plasma Sangre entera

5-10

3 horas

No específico

3-6

8 horas

Específico o no específico

3H Sandoz

Plasma Sangre entera

INCstar

Plasma Sangre entera

5-10

3 horas

Específico o no específico

TDx

Sangre entera

5-7

45 min

Específico

Du Pont

Sangre entera

2-8

30 min

Específico

Syva

Sangre entera

5-8

120 min

Específico

Tabla 50-14. Rangos terapéuticos para el ensayo de ciclosporina A con TDx monoclonal en sangre completa en la Universidad de Cincinnati

Trasplantes del riñón y de riñón-páncreas 6 meses (100-250 ng/mL) Trasplantes hepáticos 1 mes (350-450 ng/mL) 2-6 meses (250-350 ng/mL) >6 meses (170-240 ng/mL) Trasplantes cardiacos 12 semanas (120-180 ng/mL)

CAPÍTULO 51

51. Toxicología Alphonse Poklis Steven H. Y. Wong Amadeo J. Pesce Definiciones Relaciones de dosis Mecanismos de toxicidad Factores que afectan la toxicidad Naturaleza del agente tóxico

2081

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Variables de exposición Variables biológicas Farmacología quiral Toxicocinética Biotransformación de agentes xenobióticos Medicamentos y agentes no terapéuticos presentes en el laboratorio clínico Agentes químicos usados en suicidios Fármacos utilizados en situaciones de emergencia Antídotos y tratamiento Interacciones de fármacos Aspectos médico-legales Métodos de análisis Acetaminofén Tamizaje de fármacos Plomo Salicilatos

OBJETIVOS Definir toxicología, agente tóxico, toxicidad y LD50. Describir los mecanismos de toxicidad y los factores que influyen en la toxicidad. Enumerar algunos efectos generales de agentes tóxicos. Enumerar y describir las clases de fármacos que se encuentran frecuentemente en situaciones de sobredosis. Definir las interacciones entre fármacos.

Términos clave agente tóxico o veneno Substancia que, cuando se toma en cantidad suficiente, causará una enfermedad o la muerte. agentes xenobióticos Compuestos, a menudo fármacos, que no se producen normalmente en el cuerpo. analgésicos Clase de fármacos que reducen el dolor. antidepresivos Clase de fármacos que alivia la depresión. antidepresivos tricíclicos Fármacos que elevan el estado de animo. antídoto Cualquier agente que contrarresta los efectos de un agente tóxico. benzodiazepinas Grupo de fármacos sedantes que reducen la ansiedad. biotransformación Modificaciones químicas de sufren los agentes compuestos a medida que pasan a través del cuerpo. confirmación El proceso de verificar la identidad de un fármaco o de su(s) metabolito(s) mediante el uso de cuando menos dos diferentes pruebas. La prueba inicial de tamizaje es seguida de una segunda prueba confirmatoria, la cual debe utilizar un principio analítico distinto al usado en la prueba de tamizaje. dosis letal Cantidad de substancia que si se ingiere causará la muerte. 2082

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dosis terapeútica Cantidad de substancia que producirá el efecto farmacológico deseado. enantiómeros Isómeros estereoquímicos de un compuesto que son capaces de girar la luz polarizada. Se denominan d cuando giran la luz en sentido de las manecillas del reloj y l cuando el giro es en sentido contrario a las manecillas del reloj. También se denotan como (R) y (S), respectivamente. fármacos de diseño Análogos de substancias controladas cuya condición legal aún no ha sido definida por la Agencia de Control de Drogas de los Estados Unidos (DEA). .fármacos quirales Fármacos (isómeros estereoquímicos) con cuatro diferentes grupos químicos unidos a un átomo de carbono, que producen estructuras que no se superimponen. (Quiral proviene del griego “mano”). fenotiazinas Fármacos usados para tratar las psicosis. hipnóticos Clase de fármacos que se usan frecuentemente como sedantes. inhalantes Agentes químicos volátiles, como el tolueno, que son componentes de productos de uso doméstico pero que pueden ser de fármacos de abuso cuando se inhalan sus vapores, produciendo daño neurológico. interacción farmacológica La diferencia que se observa entre las acciones independientes de dos o más fármacos y sus acciones combinadas cuando son administrados juntos. LD50 La cantidad de substancia que causará la muerte en la mitad de la población de animales de prueba. opiáceos Fármacos con estructuras químicas semejantes a las de la heroina y la morfina. Los opiáceos sintéticos incluyen meperidina, oxicodona y otros. oxidasas de función mixta Grupo de enzimas presente en los microsomas del hígado que adicionan oxigeno a un compuesto. substancias de abuso Compuestos potencialmente adictivos, como el alcohol, la cocaína y la mariguana que son administrados para inducir sensaciones placenteras. Estos compuestos son a menudo agentes tóxicos. tamizaje de fármacos Prueba que identifica cualitativamente la presencia de uno o más fármacos o clases de fármacos. toxicidad aguda Se refiere usualmente al efecto dañino de un agente tóxico que se manifiesta en segundos, minutos, horas o días después de admitir al paciente. toxicidad crónica Usualmente se refiere a los efectos dañinos a largo plazo causados por un agente, semanas, meses, o años después de afectar inicialmente al paciente. toxicocinética El estudio cuantitativo de la disponibilidad de un agente tóxico en el cuerpo de una persona afectada, en el tiempo. Semejante a la farmacocinética. toxicología El estudio de los agentes tóxicos. toxicología forense Rama de la toxicología que estudia los aspectos médicos y legales de los efectos dañinos de compuestos o agentes tóxicos.

Definiciones La toxicología es el estudio de los venenos. Más específicamente, la toxicología trata de las propiedades físicas y químicas de los venenos, sus efectos fisiológicos o conductuales en los organismos vivos, los métodos cualitativos y cuantitativos para su análisis en materiales 2083

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biológicos y no biológicos, y el desarrollo de procedimientos para el tratamiento de intoxicaciones. Un veneno (o agente tóxico) es considerado como cualquier substancia que, cuando se toma en cantidad suficiente, causará una enfermedad o la muerte. La frase clave en esta definición es “cantidad suficiente.” Desde el siglo dieciséis el médico Paracelso afirmó a partir de sus observaciones, “Todas las substancias son venenos; no existe alguna que no sea veneno.” La dosis adecuada a menudo distingue un veneno de un “remedio.” Por ejemplo, cantidades muy pequeñas de cianuro, arsénico, plomo, y diclorodifeniltricloroetano (DDT) son ingeridas regularmente a partir de fuentes alimenticias o inhaladas como contaminantes ambientales y retenidas en el cuerpo humano. Sin embargo, las cantidades de estos agentes tóxicos son insuficientes para causar efectos adversos obvios. Por otra parte, una substancia tan aparentemente inocua como el agua pura, causará un desequilibrio electrolítico que puede causar incapacidad o incluso la muerte si se ingiere en cantidad suficiente. A menudo, no existe diferencia entre el mecanismo de acción de un fármaco del de un veneno. Un medicamento es administrado en dosis que alteran la función fisiológica para producir el efecto terapéutico deseado. Si se administra en cantidades mayores a las dosis terapéuticas, un fármaco puede producir efectos tóxicos (dañinos). Así pues, la toxicología es una disciplina cuantitativa que busca identificar la cantidad de una substancia que, en situaciones particulares de exposición, causará efectos dañinos en un determinado animal o paciente. Debido a la diversidad de intereses y aplicaciones, la toxicología moderna se ha desarrollado en cinco ramas de especialización: clínica, monitoreo de fármacos terapéuticos, forense, control de substancias en medicina deportiva, y pruebas ambientales. La toxicología clínica estudia los efectos dañinos de agentes químicos en organismos vivos. El monitoreo terapéutico de fármacos consiste en la utilización racional de terapia química para grupos seleccionados de fármacos, mediante su seguimiento con pruebas de laboratorio de acuerdo a los principios toxicocinéticos clínicos. La toxicología forense es la rama de la toxicología involucrada con los aspectos médicos y legales de los efectos nocivos de agentes químicos o venenos. Dentro del área especializada de pruebas forenses de fármacos urinarios, se realizan análisis de drogas previos a la contratación para un empleo o por sospecha, a fin de disuadir del uso de drogas ilícitas. La toxicología de la medicina deportiva es una especialidad establecida recientemente que trata los efectos nocivos de las drogas que incrementan el desempeño físico, como los esteroides anabólicos y estimulantes como las anfetaminas y la cafeína. La toxicología ambiental se enfoca principalmente en los efectos adversos a la salud de agentes químicos cuya exposición es incidental debido a su ubicuidad en la atmósfera, cadena alimenticia, o en ambientes recreativos u ocupacionales.

Relaciones de Dosis Toxicidad es un término relativo que se usa para comparar una substancia con otra. Afirmar que una substancia es más tóxica que otra es hacer una comparación cuantitativa en términos de la dosis. Esta comparación es válida únicamente en un organismo específico bajo condiciones idénticas de exposición. En la Tabla 51-1 se presenta una escala de la dosis letal de una substancia para un hombre normal (70 Kg de peso corporal ó 150 libras). En el 2084

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lenguaje ordinario, substancia tóxica se refiere a substancias con una toxicidad definida in la Tabla 51-1 como “extremadamente tóxica” o “super tóxica” (arsénico, cianuro, estricnina). Los parámetros importantes en toxicología incluyen la cantidad de un agente introducido en una persona (esto es, una dosis), la ruta de administración, el número de dosis, y el período en el cual el agente es administrado. El tiempo es una medida esencial, ya que el efecto de una gran cantidad de agentes es dependiente del tiempo. Términos tales como toxicidad aguda y toxicidad crónica son utilizados por conveniencia. En cierta medida, estos términos se traslapan. En general, las reacciones tóxicas observadas en las salas de emergencia son causadas por ingestión aguda, inhalación o inyección de algún agente, mientras que las reacciones causadas por agentes tóxicos ambientales se observan mas frecuentemente en instalaciones de atención médica crónica. De esta manera, los agentes tóxicos pueden tener un efecto agudo cuando la acción del compuesto se observa en cuestión de segundos a días después de la dosificación, o un efecto crónico cuando el esquema temporal es de semanas, años o décadas. Una relación dosis-respuesta ocurre cuando se observa un incremento en el efecto tóxico a medida que se incrementa la dosis. Sin embargo el incremento en el efecto tóxico puede no ser observado en todas las personas a la misma dosis. Solamente una parte de la población puede ser afectada a una dosis dada, pero a medida que aumenta la cantidad del agente tóxico, ésta resulta lo suficientemente alta como para que la población entera sea afectada. La Fig. 51-1 muestra la sobreposición entre los efectos terapéutico y tóxico en una población. El eje horizontal (en escala logarítmica) representa una dosis del agente que va de 1 a 10 U, en tanto que el eje vertical muestra el porcentaje acumulativo de individuos tratados que manifiestan una respuesta, esto es, el porcentaje total de la población que es afectada. La curva denominada efecto terapéutico se aplica al efecto del agente químico designado, como lo es la prevención de convulsiones en el caso de fenitoína. El punto en la curva en el cual el 50% de los sujetos son tratados eficazmente es el ED50. La curva de efecto tóxico describe un efecto no deseado, como náusea, mareo, o en casos extremos la muerte. Es importante remarcar que en este ejemplo, y ciertamente en muchos casos, los rangos de dosis terapéutica y tóxica se superimponen. En algunos individuos se requiere una dosis alta para su tratamiento, mientras que en otros casos esta misma dosis puede producir un efecto tóxico. Por consiguiente, el rango terapéutico normalmente describe el rango de dosis en que ocurre el efecto deseado. Sin embargo, en este rango unos cuantos pacientes no obtendrán beneficio del medicamento, mientras que otros tendrán una reacción tóxica. Las razones de tal variabilidad en la respuesta individual son muchas, la cuales incluyen edad, sexo, raza, condición de salud, y factores genéticos. Todas contribuyen a la distribución del efecto de un agente en una población. Un parámetro cuantitativo importante usado en toxicología es la dosis necesaria para causar la muerte en un animal. Si se administran dosis crecientes, también un porcentaje creciente de animales morirá. La dosis letal para el 50% de la población, denominada LD50, es un valor importante que se emplea para varios medicamentos o agentes químicos. La Tabla 51-2 muestra la LD50 de un número seleccionado de medicamentos y agentes químicos.ref(2000) En humanos, dichos valores son extrapolados de sobrevivientes o de muertes reportadas en la literatura. El agente químico no tiene que afectar a la población completa. Si únicamente 1% 2085

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de los animales murieron a una dosis dada, el término viene a ser la LD1, la dosis letal para 1% de los animales. Si murieron el 99%, el término sería entonces LD99.

Mecanismos de Toxicidad Hay una diversidad de formas en que los agentes tóxicos pueden causar sus efectos. Estos pueden ser leves, como los de las moléculas promotoras que ejercen su efecto en las células solamente cuando se ha administrado un carcinógeno, o drásticos, como los causados por un agente cáustico, que destruyen el tejido al entrar en contacto con éste. Los ejemplos enumerados en el cuadro siguiente pág. 1020 ilustran solamente algunas de las formas en que actúan los agentes tóxicos.

Factores que Afectan la Toxicidad Naturaleza del agente tóxico Propiedades de solubilidad. Una de las propiedades más importantes de un agente tóxico es su solubilidad en varios tejidos del cuerpo. Por ejemplo, los compuestos solubles en agua difícilmente penetran la piel. Aquellos que son solubles en lípidos tienden a ser más fácilmente absorbidos; sin embargo la forma iónica del compuesto y su tamaño molecular son también propiedades importantes que afectan la solubilidad. Propiedades físicas. Otra propiedad importante de un agente tóxico es el estado físico, ya sea gas, líquido o sólido. Los gases son fácilmente inhalados y pasan inmediatamente al torrente sanguíneo. También pasan a través de la piel. En contraste, los líquidos no se inhalan a menos que se encuentren en fase de vapor o como aerosoles. Los líquidos, no obstante, pasan a través de la barrera epidérmica. Aunque las partículas pueden ser inhaladas, no se absorben rápidamente a través de la piel. Los sólidos normalmente tienen que ser ingeridos o disueltos antes de presentar un efecto. Los compuestos (tales como el mercurio) con una forma líquida que posee una fase gaseosa importante en las condiciones de la exposición, pueden tener una cantidad adecuada del compuesto en la fase gaseosa para inducir toxicidad por inhalación del vapor. Variables de exposición Dependencia de la dosis. Para los agentes farmacológicos o medicamentos comunes, un incremento en la dosis produce un aumento en el porcentaje de la población que será afectada, así como también un incremento en la severidad de la reacción toxicológica. En contraste, una exposición continua a muy bajas concentraciones puede ser no acumulativa y relativamente inocua. Este efecto de la concentración se observa con el medicamento acetaminofén. En bajas concentraciones este analgésico se usa comúnmente para tratar el dolor y es metabolizado en el hígado a formas no tóxicas mediante una vía que involucra glutatión. En altas concentraciones de acetaminofén, esta vía está deprivada de glutatión, y se produce un daño mediante la generación de radicales libres. Esto puede afectar irreversiblemente el tejido hepático, causando la muerte celular. 2086

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Es importante tener en mente que los síntomas de una respuesta toxicológica pueden no estar relacionados de una manera obvia a la respuesta clínica esperada del fármaco. En el caso de antidepresivos tricíclicos, el efecto deseado es una elevación en el ánimo producida por la acción del medicamento sobre los receptores del sistema nervioso central. Cuando el agente terapéutico está presente en una sobredosis, puede afectar receptores semejantes en el corazón, causando arritmias. A medida que la concentración del antidepresivo aumenta, las arritmias también y pueden provocar una falla cardiaca y la muerte. Ruta, velocidad, y sitio de administración. La ruta de administración puede ser percutánea, por inhalación, oral, rectal, subcutánea o intravenosa. De todas estas rutas, la percutánea no se considera común en un ambiente hospitalario ya que la mayoría de fármacos se administra por otras rutas. Sin embargo, la piel tiene una gran superficie y es permeable a varios agentes químicos. Una gran cantidad de nuevos sistemas para administrar medicamentos usando membranas transcutáneas o parches, han originado sobredosis cuando al realizarse incorrectamente la formulación de liberación lenta, el fármaco es liberado de manera rápida. Puede haber una gran variación en las cantidades de un compuesto necesarias para causar la muerte basado en la vía de administración. Por ejemplo, se ha demostrado una diferencia de veinte veces entre el efecto de procainamida aplicada intravenosamente contra la administración subcutánea. Para otros compuestos como pentobarbital, hay una diferencia en dosis de menos del doble entre estas dos vías para alcanzar el mismo efecto letal. De esta manera, la ruta de administración puede producir una diferencia considerable en la curva dosis-respuesta a un agente tóxico. Duración y frecuencia de la exposición. La duración de la exposición es el tiempo en segundos, minutos, horas, días, meses, o años que una persona está expuesta a un agente tóxico. Para algunos agentes, como el monóxido de carbono, la duración puede ser de unos cuantos segundos o minutos, como es el caso de una exposición intramuros a una alta concentración de monóxido de carbono, o crónica, como hábito del tabaquismo. Una medición que se usa frecuentemente es tiempo de exposición dosis. El valor obtenido se usa para comparar individuos con diferentes cantidades del agente tóxico, como los niveles sanguíneos de plomo en trabajadores y los síntomas toxicológicos, como en la enfermedad renal. La exposición frecuente conlleva en muchos casos la acumulación de efectos tóxicos, pero estos variarán dependiendo del agente tóxico. Un caso poco común es la reacción de hipersensibilidad retrasada, en la que una cantidad muy pequeña de la substancia puede desencadenar una reacción anafiláctica, aún cuando dicha cantidad no produzca efectos tóxicos en la misma persona en condiciones de presensibilización.

Variables biológicas La edad afecta la tasa metabólica de los compuestos. En general, los sujetos más jóvenes metabolizarán un fármaco más rápidamente que los más viejos. A menudo los pacientes de mayor edad reciben la misma dosis que los pacientes jóvenes; sin embargo, en virtud de que la velocidad de su metabolismo puede ser la mitad o una tercera parte de la de 2087

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los pacientes jóvenes, el fármaco se puede acumular hasta alcanzar niveles tóxicos. Parte de la diferencia por la edad se atribuye a cambios en la función de los órganos. Por ejemplo, la depuración renal de una población de edad avanzada es de 20% a 50% el nivel de la de jóvenes estudiantes de tecnología médica. La diferencia en la constitución genética puede ser uno de los factores que mayormente afectan los efectos tóxicos de una substancia. La succinilcolina, un relajante muscular, se hidroliza a ácido succínico y colina. Sin embargo, ciertas personas (1 en 3000) no tienen la enzima que hidroliza el compuesto o tienen una forma defectuosa de la enzima. Por lo tanto, estos individuos presentan una relajación muscular prolongada y posible apnea (interrupción respiratoria) y por lo tanto están en riesgo cuando reciben este medicamento. Es posible realizar el tamizaje de una población para esta deficiencia mediante la determinación de los niveles de acetilcolinesterasa en presencia del inhibidor dibucaína, y de esta manera encontrar aquellas personas con esta deficiencia enzimática. Otro ejemplo de diferencias genéticas en el metabolismo de fármacos involucra la capacidad de N-acetilación de ciertos compuestos. Un medicamento, la procainamida, es acetilada como parte del proceso normal de detoxificación. Se ha encontrado que hay dos grupos de personas, aquellas que son acetiladores rápidos y los acetiladores lentos. Esto puede ser caracterizado por una distribución bimodal (ver capítulo 19). Los acetiladores lentos, que forman N-acetil procainamida a una velocidad menor, son más susceptibles de tener una reacción inmunológica al compuesto. Sin embargo, el fármaco N-acetilado es depurado más lentamente, generando entonces niveles sanguíneos mayores en los acetiladores rápidos a la misma dosis. Los niveles del fármaco son dependientes de la velocidad de N-acetilación.

Farmacología quiral Los enantiómeros de fármacos son compuestos quirales con cuatro grupos diferentes unidos a un átomo de carbon, capaz de girar la luz polarizada a la derecha o izquierda, y son designados como d o (+), y l o (-) respectivamente.refs(2001) Las propiedades de los enantiómeros pueden variar desde ser idénticas hasta tener diferentes grados de eficacia o toxicidad. A fin de ilustrar las diferencias en toxicología, la (S)- (+)-metanfetamina tiene un potencial considerable como fármaco de abuso mientras que la (R)-(-) -metanfetamina es usada como un descongestionante nasal. Estos enantiómeros pueden distinguirse entre sí mediante un inmunoensayo estereoespecífico en orina.

Toxicocinética.

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Los principios de toxicocinética son semejantes a los de farmacocinética discutidos en el capítulo 56 sobre monitoreo de fármacos terapéuticos. La mayoría de agentes tóxicos, como los gases o drogas, tienen que pasar a través de la membranas o ser absorbidos y después pasar a través de la circulación antes de ejercer sus efectos en un tejido blanco particular. Consecuentemente, los primeros pasos de liberación y absorción pueden ser muy diferentes cuando ocurren sobredosis. Además, varios agentes tóxicos pueden ser tranformados por procesos metabólicos antes que ejerzan su acción en receptores o en células. Finalmente, la mayoría de fármacos o compuestos debe metabolizarse antes de excretarse. En general, es posible utilizar las mismas ecuaciones presentadas para monitoreo terapéutico a fin de rastrear estos agentes. Sin embargo, en situaciones de sobredosis, como con fenitoína, el patrón de eliminación puede cambiar de primer orden a orden cero a medida que las vías de eliminación se saturan. Otros compuestos, como los agentes cáusticos (álcalis, ácidos, corrosivos), tienen un efecto dañino directo y por lo tanto no se pueden estudiar de esta manera.

Biotransformación de agentes xenobióticos La mayoría de las substancias o agentes que entran en el cuerpo (xenobióticos) sufren un cambio en estructura llamado biotransformación. Existen numerosas vías para que esto ocurra. En el recuadro se presenta una lista de dichas reacciones. Las moléculas biotransformadas tienen propiedades que las hacen biológicamente menos activas, más activas, o igual de reactivas que el compuesto original. La Atropina se hidroliza para dar origen a los compuestos inactivos ácido trópico y tropina. Por otra parte, la ciclofosfamida, un agente alquilante anticancerígeno, tiene que ser activada por los microsomas hepáticos para ser eficaz. Finalmente, el medicamento amitriptilina es desmetilado para formar nortriptilina, la cual tiene la misma potencia que un antidepresivo tricíclico. Los microsomas hepáticos contienen un grupo de enzimas que oxidan una amplia gama de compuestos como esteroides, ácidos grasos, medicamentos, plaguicidas y carcinógenos. Estos sistemas microsomales son denominados oxidasas de función mixta. La última oxidasa en esta cadena es el citocromo P-450, llamado así debido a su absorción en el espectro a 450 nm. Recientemente, la superfamilia P-450 (CYP) ha sido caracterizada, consistiendo de 16 genes en el hombre.ref(2002) La oxidación de un fármaco se lleva a cabo a través de una reacción que comprende oxígeno, el fármaco o substrato y la enzima del citocromo P-450 apropiada: Citocromo P-450

Substrato + O2 + NADPH + H+ –––––––––––

Substrato oxidado + H2O + NADP+

Varias de las reacciones de biotransformación antes enumeradas son reacciones catalizadas por la superfamilia del citocromo microsomal CYP; éstas incluyen epoxidaciones, hidroxilaciones de aril y alquil hidrocarburos, oxidación de alcoholes, remoción del grupo alquilo de los enlaces tipo éter, N-hidroxilación, nitroxidación, N-desalquilaciones, desaminación oxidátiva, sulfoxidación, y deshalogenación. Por ejemplo, la subfamilia de CYP2D6 cataliza la hidroxilación de debrisoquin y amitriptilina. Estas reacciones enzimáticas son inducidas por algunos fármacos como fenobarbital o alcohol, y son inhibidas por otros como cimetidina. De esta manera, la administración de uno de estos fármacos cambiará la 2089

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velocidad del metabolismo y modificará sustancialmente el nivel basal del compuesto. En general, los fármacos oxidados por el sistema de enzimas microsomales son liposolubles. Después de la oxidación, éstos son más hidrosolubles y por lo tanto tienen mayor probabilidad de ser excretados. El sistema P-450 está bajo control genético, y la variación en la capacidad para metabolizar compuestos se atribuye a estas diferencias genéticas de los sistemas P-450.

Reacciones de biotransformación de agentes xenobióticos* Azorreducción (azobenceno anilina) Nitrorreducción (nitrobenceno anilina) Hidrólisis de ésteres (procaína 2-dietilaminoetanol y ácido p-aminobenzóico) Acilación (procainamida N-acetilprocainamida) Conjugación con ácido glucorónico (morfina glucoronidato de morfina) Conjugación con ácido mercáptico (diclorobenceno ácido mercáptico de diclorobenceno) Desaminación oxidativa (anfetamina fenilacetona) Desalquilación (meperidina normeperidina) Oxidación de anillos aromáticos (n-butilanilina n-butil-p-aminofenol) N-oxidación (trimetilamina óxido de trimetilamina) S-oxidación (cloropromazina sulfóxido de clorpromazina) Oxidación de alcoholes (alcohol benzílico ácido benzóico) Hidroxilación de cadenas laterales de alquilo (pnitrotolueno p-nitrobencil alcohol) * Ejemplos de cada reacción aparecen en paréntesis

Fármacos y Agentes No Terapéuticos que se Encuentran en el Laboratorio Clínico Una función del laboratorio de toxicología clínica es ayudar al profesional médico a determinar si la condición patológica de un paciente es causada por un agente tóxico. A pesar de que muchas muertes son debidas a intoxicaciones, un número aún mayor de individuos ingresan al hospital con diagnóstico de intoxicación potencial. El médico debe diferenciar entre una condición que es resultado de una intoxicación y una que no lo es. Los avances recientes en metodologías de inmunoensayo proporcionan evaluaciones rápidas de acuerdo al nivel de cuidado requerido para un número determinado de agentes terapéuticos y drogas ilícitas como cocaína, canabinoides, fenciclidina, anfetaminas, barbituratos y benzodiazepinas. Estas pruebas rápidas de tamizaje permiten mejorar el manejo de los pacientes.

Agentes químicos usados en suicidios La Tabla 51-3 muestra el número de muertes por intoxicación en 1991 por tipo de 2090

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agente químico.ref(2003) La mayoría de estas muertes son debidas a suicidios y el resto son resultado de intoxicación accidental. Es importante señalar que la mayoría de intoxicaciones son causadas por agentes que son fácilmente accesibles, como los medicamentos que no requieren receta médica o los que se prescriben con propósitos medicinales. Estos fármacos incluyen analgésicos, tranquilizantes, agentes psicotrópicos, barbituratos y otros. El problema más común que enfrenta el laboratorio es la determinación del agente empleado en un intento de suicidio. Cuando los individuos que sufren depresión tienen acceso a agentes letales potenciales, frecuentemente intentan suicidarse con estos agentes.

Fármacos en situaciones de emergencia En los hospitales, particularmente en aquellos involucrados en atención de emergencias, el patrón de ingestión o abuso de drogas tóxicas en pacientes que presentan crisis agudas es algo diferente al que se observa en casos de suicidio. En la Tabla 51-4 se enumeran los casos que muestran la presencia de una droga en particular.ref(2004) Nótese que las drogas o clases de drogas más importantes observadas fueron cocaína, etanol, acetaminofén, canabinoides, antidepresivos y benzodiazepinas. De nuevo, los fármacos que requieren receta médica representan una fracción importante de los agentes tóxicos observados. Una observación aún más importante es que un número considerable de pacientes ingieren más de un medicamento. En un estudio, se encontró que alrededor de la mitad de los pacientes admitidos en el servicio de emergencia habían ingerido dos o más fármacos.ref(2005) Las pruebas de tamizaje de fármacos son solicitadas para una variedad de pacientes en situaciones de emergencia que parecen clínicamente hiperactivos, con alucinaciones, o en estado de coma. Una descripción de los diferentes grados de coma en casos tóxicos es proporcionada por Hanenson a continuación:ref(2006)

Clasificación comatosa Grado 1 - Somnoliento pero responde a órdenes verbales Grado 2 - Inconsciente pero responde a estímulos dolorosos de baja intensidad Grado 3 - Inconsciente pero responde solamente a estímulos dolorosos de alta intensidad Grado 4 - Inconsciente sin responder a estímulo doloroso

Cuando un paciente comatoso o que actúa de manera extraña es atendido en la sala de emergencia, uno de los diagnósticos que debe considerar el médico es la posibilidad de una sobredosis por fármacos. Es importante para el médico que trate de establecer la naturaleza o identidad del fármaco o fármacos utilizados, a fin de hacer un uso más eficiente de las instalaciones del laboratorio. El juicio del médico respecto a la presencia de fármacos intoxicantes o letales se basa en varias observaciones clínicas (Tabla 51-5). La historia obtenida de un paciente en estado alerta puede ser útil, aunque en general la historia de un paciente no es un índice confiable para conocer que clase de fármacos pudo haber tomado (menos del 50% de confiabilidad). 2091

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Los efectos generales de agentes tóxicos incluyen síntomas como depresión respiratoria, conmoción, convulsiones, hipertermia o hipotermia. Algunos efectos clínicos y síntomas observados en pacientes intoxicados con dosis muy altas de estos agentes se resumen en la Tabla 51-5. El tamaño de las pupilas, la frecuencia respiratoria, el estado cardíaco, y la condición de otros sistemas son todos signos importantes y pueden proporcionar información sobre la naturaleza de la substancia tóxica. Un enfoque alternativo es establecer el toxídrome (síndromes tóxicos). En virtud de que los fármacos de abuso y agentes tóxicos causan disfunción autónoma acompañada de signos físicos, los toxídromes son enlistados en la Tabla 51-5.ref(2007) Cuando el médico sospecha de uno o más fármacos, se pueden ordenar pruebas de laboratorio para confirmar su presencia y para determinar la cantidad presente. Estos datos pueden determinar la terapia a utilizar. Si el médico no tiene la certeza de la presencia de fármacos, se puede ordenar un tamizaje general para fármacos. El tamizaje probará rápidamente la presencia de algunos de los grupos mayores de fármacos; los resultados positivos deben confirmarse mediante procedimientos alternativos (ver pág. 1026). Se pueden ordenar pruebas de electrolitos, BUN, y glucosa a fin de descartar padecimientos renales o diabetes.

Antídotos y Tratamiento La historia de los venenos está entrelazada con la de los antídotos. Actualmente existen solamente unos cuantos antídotos específicos para aquellos agentes que comúnmente se encuentran en el ambiente hospitalario. Estos se presentan en la Tabla 51-7. Usualmente se aplican terapias de apoyo en la mayoría de los casos, que incluyen tratamiento para depresión respiratoria, aspiración, conmoción, convulsiones, delirio, methemoglobinemia, hipertermia e hipotermia. La terapia de apoyo se emplea para mantener las funciones vitales del paciente hasta que la el fármaco es depurado del organismo. La remoción del agente tóxico se puede efectuar a menudo por emesis (vómito), lavado gástrico, o descontaminación dérmica. Otras formas de tratamiento incluyen agentes que facilitan la erradicación del compuesto del cuerpo. Para tratar la intoxicación por mercurio y arsénico se emplea dimercaprol y las sales de los metales divalentes (plomo, mercurio, cobre, níquel, zinc, cadmio, cobalto, berilio y manganeso) son acomplejados con etililéndiaminotetracetato (EDTA). El compuesto deferoxamina se usa para eliminar las cantidades en exceso de fierro y aluminio. Se puede administrar carbón activado por ingestión o por deposición en el estómago para aumentar la velocidad de eliminación del agente tóxico del cuerpo. En el caso de intoxicación infantil por plomo, los Centros para el Control de Enfermedades de los Estados Unidos (conocidos bajo la abreviatura inglesa CDC por “Centers for Disease Control”) han diseñado protocolos específicos que utilizan BAL (British anti-Lewisita), EDTA, y succimer. Varios agentes tóxicos son removidos más rápidamente si se incremente el flujo de orina (diuresis forzada). Esto se efectúa a menudo mediante la administración intravenosa de un diurético como manitol. Además, se reduce el potencial nefrotóxico de algunos agentes (como cisplatino) debido a que su concentración es disminuida en condiciones diuréticas. El 2092

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pH de la orina también es importante. Para los fármacos básicos como las anfetaminas, la excreción se incrementa cuando la orina es ácida. La excreción de barbituratos es aumentada por la orina alcalina, donde la molécula está ionizada y por lo tanto es más soluble.

Interacción de Fármacos Cuando se administran dos fármacos a un paciente, puede ocurrir que sus acciones no sean independientes; esto es, un agente puede afectar la acción farmacológica del otro. Este fenómeno es denominado interacción de fármacos. Los efectos de dichas interacciones no son obvios y se ha reunido considerable información al respecto a partir de reportes de casos. Se han determinado varias interacciones y no es posible proporcionar una lista completa aquí. Los tipos de interacciones han sido compilados por Stockley,ref(2008) aunque él señala que “las interacciones que ocurren cuando los fármacos son administrados concurrentemente, a menudo no son resultantes de un solo mecanismo sino de dos o más mecanismos que actúan concertadamente....@ La Tabla 51-8 muestra una lista con un ejemplo de cada tipo de interacción. Se han observado importantes interacciones farmacológicas entre el etanol y otros agentes que afectan el sistema nervioso central. El etanol se encuentra comúnmente en las interacciones de fármacos debido a su amplio uso y también porque tiene un extenso rango de efectos depresivos en el sistema nervioso central. Por ejemplo, el uso concomitante de barbituratos y alcohol puede tener efectos dañinos. La dosis letal de barbituratos es casi 50% menor cuando éstos se combinan con alcohol. Este mismo efecto ocurre con el uso simultáneo de agentes como el hidrato de cloral, paraldehído, glutetimida, meprobamato y otros tranquilizantes.

Aspectos Médico Legales Los profesionales de laboratorio de toxicología pueden llegar a involucrarse en el sistema médico-legal debido a su necesidad de documentar bajo juramento la validez de los resultados analíticos. Estos tecnólogos también deben documentar los procedimientos del laboratorio y producir un documento, la cadena de custodia (ver capítulo 3), para asegurar que el especimen no sea alterado. En algunos tipos de pruebas, como la detección de algunas drogas de abuso, los métodos de tamizaje por inmunoensayo y confirmación por cromatografía de gases o espectrometría de masas pueden estar especificados por una agencia federal como el Servicio de Administración de Substancias de Abuso de Salud Mental (SAMHSA) (antiguamente llamado Instituto Nacional de Drogas de Abuso). Las pruebas actuales para substancias de abuso (alcohol, mariguana, cocaína, heroína, anfetaminas, fenciclidina) se basan en la presunción de que el uso de ciertas drogas, particularmente cocaína y mariguana, puede ser ilegal y deteriorar el desempeño de los individuos, afectando su trabajo, o dando origen a accidentes. En cualquier caso, esto puede conducir a un litigio que involucre un juicio civil o criminal. La función del laboratorio es proporcionar y documentar datos legalmente admisibles y defendibles. 2093

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Métodos de Análisis Acetaminofén HELEN M. DODDS JULIA M. POTTER

Principios del análisis. Se han descrito una variedad de métodos cromatográficos y espectrofotométricos para determinar cualitativa y cuantitativamente el acetaminofén. La prueba cualitativa más común para la detección de acetaminofén en orina es “la prueba de la mancha” (Tabla 51-9, método 1). Este método simple y económico se basa en la reacción de los metabolitos conjugados de acetaminofén con o-cresol en hidróxido de amonio para producir un color azul índigo (azul de indofenol). La prueba de la mancha tiene buena sensibilidad; un resultado positivo se puede obtener en una muestra de orina colectada 24 horas después de la ingestión de 1 g de acetaminofén. Se pueden obtener falsos positivos de la prueba de la mancha en pacientes que han tomado p-aminofenol debido a que ambos, acetaminofén y p-aminofenol se metabolizan a fenacetín, que da un resultado positivo a la prueba. Otro método cualitativo para la detección de acetaminofén, es por cromatografía de capa fina en sílica gel (ver capítulo 5 para una descripción de los principios de cromatografía de capa fina). El análisis cuantitativo de acetaminofén se basaba originalmente en métodos espectrofotométricos pero ha sido reemplazado en gran parte por procedimientos de inmunoensayo. Los métodos espectrofotométricos originales consumían mucho tiempo. El método modificado de Glynn y Kendalref(2009) (Tabla 51-9, método 2) posee una sensibilidad adecuada y no se han reportado interferencias. En este procedimiento, el plasma se desproteiniza con ácido tricloroacético y luego se centrifuga. Después se mezcla una alícuota del sobrenadante libre de proteína con ácido clorhídrico 6M y nitrito de sodio para formar un derivado de ácido nitroso. En el paso final del ensayo se agrega ácido sulfámico seguido de la adición de hidróxido de sodio, obteniéndose un color amarillo que se lee a 430 nm. También se han empleado procedimientos de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) para el análisis de acetaminofén. Los enfoques empleados incluyen la purificación del compuesto de interés utilizando intercambio catiónico y absorción en sílica. Se ha sugerido la cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa como un posible método de referencia para cuantificar acetaminofén (Tabla 51-9, método 3).ref(2010) Los métodos más populares que se usan actualmente para medir acetaminofén son inmunoensayos. Un procedimiento de inmunoensayo frecuentemente usado (Syva Co., Palo Alto, CA 94303) emplea una técnica inmunoenzimática homogénea (TIAE) (Tabla 51-9, método 4). En este procedimiento, el acetaminofén en la muestra del paciente compite con acetaminofén marcado con glucosa-6- fosfato deshidrogenasa para unirse al anticuerpo dirigido contra el acetaminofén. La unión del anticuerpo con el acetaminofen marcado enzimáticamente produce inhibición de la actividad enzimática. Así pues, en los casos donde altas concentraciones de acetaminofén están presente en la muestra del paciente, se unirá 2094

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menos del acetaminofén marcado con la enzima produciendo mayor actividad enzimática. El NADH generado por la acción enzimática se monitorea espectrofotométricamente a 340 nm. Otro procedimiento común por inmunoensayo para el análisis de acetaminofén utiliza el principio de polarización de la fluorescencia (Tabla 51-9, método 5). Este ensayo se basa en la unión competitiva entre el acetaminofén de la muestra del paciente y acetaminofén marcado con fluoresceína por una cantidad limitada de anticuerpo. Los especímenes que contienen altas concentraciones de acetaminofén experimentarán una reducción en la emisión de luz flourescente polarizada debido a que se unen al anticuerpo pocos complejos acetaminofén- fluoresceína. Cuando hay una cantidad pequeña o nada de acetaminofén en la muestra del paciente, una mayor cantidad de acetaminofén-fluoresceína permanece unido al anticuerpo y entonces hay una mayor emisión de luz fluorescente polarizada. Especimen. Puede utilizarse suero o plasma en procedimientos cuantitativos. Para la prueba de la mancha, el especimen utilizado es orina. Rango terapéutico. La concentración terapéutica de acetaminofén en plasma o suero es de 10 a 20 µg/mL (66 a 132 µmol/mL). En casos de ingestión tóxica de acetaminofén, una concentración mayor de 200 µg/mL 4 horas después de la ingestión o una vida media mayor de 4 horas del fármaco, es indicador de un daño severo potencial al hígado por radicales libres y otros metabolitos tóxicos resultantes del metabolismo hepático de acetaminofén. El tratamiento con N-acetil cisteina (Mucomyst) puede proporcionar protección en estas situaciones. Este tratamiento ayuda a restituir el glutatión, el cual es utilizado por el hígado durante el metabolismo de acetaminofén y previene la producción de radicales libre. La Figura 51-2 muestra un nomograma desarrollado para estimar la severidad del daño hepático como una función de las concentraciones de acetaminofén en plasma a diferentes tiempos después de la ingestión. Tamizaje de drogas F. MICHAEL HASSAN

Principios de análisis. El análisis expedito de drogas de abuso en orina es importante para la detección de sobredosis aguda de drogas. El análisis de drogas se usa actualmente en el tamizaje previo a la contratación en un empleo, para verificar el cumplimiento de pacientes que participan en programas de rehabilitación de drogas, y en la investigación de lesiones relacionadas con accidentes. En el examen de drogas de abuso se emplea un enfoque jerarquizado de dos niveles, que involucra comúnmente pruebas de tamizaje y pruebas de confirmación. Las muestras que dan un resultado positivo a la prueba usando un procedimiento de tamizaje pueden ser objeto de un análisis más detallado mediante el uso de un método diferente al que se usó originalmente, a fin de confirmar la presencia de la droga de interés. Idealmente, los procedimientos de tamizaje deben ser simples, rápidos, económicos, y tener la capacidad de automatizarse.ref(2011) Se pueden realizar procedimientos de tamizaje para la detección de una droga o clase de drogas en particular, o pueden incluir el análisis del número de drogas que 2095

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sea factible técnica y económicamente. Cuando el tamizaje se realiza específicamente para una droga, la prueba que se usa debe garantizar especificidad y sensibilidad adecuadas para lograr una identificación inequívoca del compuesto de interés. Cuando el tamizaje de drogas comprende un análisis integral de un gran número de compuestos, se pueden emplear métodos menos específicos capaces de detectar varios compuestos diferentes. Característicamente, seis o siete diferentes clases de drogas son analizadas en un tamizaje limitado. Los compuestos que usualmente son tamizados, que han sido enumerados por el Departamento de Salud y Servicios Humanos para el examen de drogas en el sitio de trabajo, incluyen metabolitos de cocaína, benzoilecgonina, opiáceos, anfetaminas, tetrahidrocanabinol y fenciclidina.ref(2012) Otras clases de drogas que también comprenden varios procedimientos de tamizaje integrales incluyen barbituratos y benzodiazepinas. Los métodos para el análisis de drogas de abuso se pueden dividir en varias categorías, en base a los procedimientos analíticos generales empleados. Las principales categorías incluyen pruebas de la mancha, procedimientos basados en inmunoensayos, y procedimientos cromatográficos. Los métodos más simples y rápidos que se usan para el tamizaje de drogas son las pruebas de la mancha. Estas pruebas se pueden usar para la detección de una droga específica, como acetaminofén o salicilato, o para una clase de drogas como las fenotiazinas. Las pruebas de la mancha usualmente no requieren generalmente de algún tipo de pretratamiento del especimen; la orina o suero sin procesar se adicionan directamente al reactivo de prueba. La presencia de la droga (o drogas) de interés se manifiesta por la formación de un producto de reacción colorido. En la Tabla 51-10 se muestran las pruebas de mancha comúnmente usadas en los laboratorios. Aunque las pruebas de mancha ofrecen la ventajas de simplicidad y rapidez de procesamiento, varias carecen de especificidad en la medición para la cual la prueba está diseñada. Además, debido a que la formación de un complejo colorido por la presencia de la droga se determina visualmente, la interpretación de las pruebas de la mancha puede ser subjetiva, especialmente cuando el cambio de color que se presenta es muy débil. El desarrollo y automatización de procedimientos basados en inmunoensayos han venido a ser los métodos más ampliamente usados para la detección de drogas de abuso. Los procedimientos de radioinmunoensayo o radioinmunoanálisis (RIA) fueron los primeros que se desarrollaron, sin embargo, éstos han sido reemplazado por inmunoensayos enzimáticos y métodos de fluorescencia polarizada. Los métodos RIA adolecen de varias limitaciones prácticas, incluyendo la corta vida de almacenamiento del reactivo, el manejo especial del reactivo y los requerimientos el manejo de los residuos, así como la falta de un procedimiento completamente automatizado.ref(2013) Los ensayos enzimáticos homogéneos, como el sistema TIAE (Syva Co., Palo Alto, CA 94303) están bien establecidos y son ampliamente usados para el tamizaje de drogas de abuso en orina (DAU). Este procedimiento se basa en la unión competitiva entre la droga no marcada presente en la muestra del paciente y la droga marcada con la enzima por el anticuerpo. Este ensayo se puede efectuar utilizando orina o suero como especimen y ofrecen buena sensibilidad y especificidad para una amplia variedad de drogas. El ensayo se debe realizar separadamente para cada droga individual o clase de droga que está siendo evaluada. Además se pueden obtener resultados cuantitativos. Los ensayos de fluorescencia polarizada (Abbott Labs, Chicago, IL 60064) también se usan ampliamente y ofrecen buena sensibilidad y especificidad para la detección de drogas. 2096

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Estos ensayos utilizan una curva de calibración de seis puntos y pueden proporcionar resultados cuantitativos. Un segundo sistema de inmunoensayo homogéneo, el método de inmunoensayo del donador enzimático clonadoref(2014) (Tabla 51-11, método 2) se puede aplicar para el análisis de drogas. En este procedimiento, la enzima ß-galactosidasa es producida como dos fragmentos inactivos, denominados fragmento enzimático donador y fragmento enzimático aceptante. El fragmento enzimático donador se conjuga con la droga de interés que se determinará en el especimen del paciente. En ausencia de la droga en el especimen, el anticuerpo dirigido contra la droga de interés se une al complejo donador enzimático-droga. Esta unión del anticuerpo al complejo donador enzimático-droga evita la asociación de los fragmentos donador y aceptante para formar la enzima activa. Por otra parte, si la droga está presente en el especimen del paciente, ésta competirá con el conjugado por los sitios de unión al anticuerpo. Mientras mayor sea la cantidad de droga presente en el especimen del paciente, mayor será la probabilidad de que el fragmento enzimático donador y el aceptante sean capaces de formar la enzima activa. La cantidad de enzima activa está directamente relacionada a la concentración de la droga en la muestra. La enzima activa es monitoreada por la conversión del substrato enzimático galactopiranósido a un producto colorido. Otra metodología reciente de inmunoensayo para drogas de abuso es la interacción cinética de microparticulas en solución, o ICMS (Tabla 51-11, método 3). En este procedimiento turbidimétrico, la droga de interés se conjuga a las micropartículas del reactivo. La unión del anticuerpo específico antidroga a los conjugados micropartícula-droga produce la formación de retículas micropartícula- anticuerpo que bloquean la transmisión de luz, causando un incremento en la absorbancia de la solución de reacción. La adición del especimen del paciente conteniendo la droga da como resultado la competencia entre la droga y los conjugados droga-partícula por la unión al anticuerpo presente en el reactivo. De esta manera, concentraciones altas de la droga de interés causan una inhibición de la formación de la retícula de micropartículas, incrementando la transmisión de luz a través de la solución del reactivo con una disminución subsecuente de la absorbancia. La concentración de la droga está inversamente relacionada con la absorbancia de la mezcla de reacción. Existe un inmunoensayo que ofrece simultáneamente una detección visual discreta de siete clases de drogas en 10 minutos (Triage DOA, Biosite Diagnostica, San Diego, CA 92121).ref(2015) Este sistema consiste en una técnica inmunoquímica que utiliza siete anticuerpos monoclonales diferentes para analizar múltiples compuestos simultáneamente por unión competitiva. El conjugado que lleva la marca consiste de una droga representativa de cada clase que está conjugada a una partícula de oro coloidal. La competencia entre la droga libre y la droga conjugada por los sitios de unión al anticuerpo se lleva a cabo en la muestra de orina que contiene una o más drogas. La competencia entre la droga libre y la droga conjugada provoca que una cierta cantidad de los conjugados de la droga no se unan al anticuerpo. Después de un período de incubación de 10 minutos, la mezcla de reacción es transferida a una área de detección que consiste de una membrana de nylon conteniendo anticuerpos monoclonales inmovilizados. Los especímenes de orina que contienen la droga o drogas a ser medidas causarán que algunos de los conjugados de la droga no se mantengan unidos por el anticuerpo en la mezcla de reacción. Los conjugados de la droga que no están unidos al anticuerpo en la fase inicial del ensayo 2097

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serán capturados por el segundo anticuerpo inmovilizado, generando una banda colorida en la zona correspondiente a cada droga positiva. La presencia o ausencia de las bandas de color se determina visualmente. El uso de procedimientos cromatográficos, como la cromatografía en capa fina (conocida ampliamente bajo su abreviatura inglesa TLC por “thin layer chromatography”) (Tabla 51-11, método 4), tiene la ventaja de que no requiere instrumentación y el procedimiento es relativamente económico.ref(2016) Este procedimiento también permite la detección simultánea de un gran número de drogas. Aunque la sensibilidad de la TLC no es tan buena como la de los procedimientos de inmunoensayo, es apropiada para identificar pacientes con una sobredosis de droga así como consumidores de drogas con fines recreativos. La naturaleza cualitativa de la TLC así como el tiempo que consume cada ensayo, hasta tres horas, no permite el manejo estadístico de los resultados. Además, el método es laborioso y susceptible a errores de interpretación. El análisis de TLC ha sido reemplazado principalmente por inmunoensayos. La cromatografía de líquidos de alta eficacia (conocida ampliamente bajo su abreviatura inglesa HPLC por “high performance liquid chromatography”) y la cromatografía de gases (CG) permiten separar y cuantificar mezclas complejas de fármacos. El análisis de drogas de abuso por técnicas cromatográficas es un procedimiento de etapas múltiples que requiere extracción de la muestra, elución y reducción de datos. El uso de HPLC y CG para el tamizaje de drogas de abuso ha sido limitado debido a su naturaleza tediosa. Un sistema automatizado de HPLC que ha sido introducido recientemente(REMEDI, Bio Rad Laboratories, Hercules, CA 94547) utiliza un diseño de multicolumnas para extracción y separación. Las drogas o metabolitos son identificados primero haciendo una exploración por ultravioleta y subsecuentemente se realiza la identificación por comparación con el tiempo de retención relativo y las características espectrales con una biblioteca de drogas “en línea”, almacenada en el sistema de la computadora. Este sistema tiene un alto grado de automatización, facilidad de operación, y un tiempo relativamente rápido de análisis de aproximadamente 30 minutos. Especimen. Varios especímenes biológicos incluyendo la orina, lavado gástrico o emesis, y suero o plasma pueden ser sometidos al tamizaje de drogas de abuso. La orina es considerada generalmente el especimen ideal porque es usualmente fácil de obtener y la mayoría de las drogas se encuentran en cantidades suficientes para ser identificadas. Las desventajas de usar orina como especimen incluyen la presencia de varios productos metabólicos que interfieren en la identificación, y el hecho de que el compuesto original a menudo ya no está presente. Además, la cuantificación de drogas en orina generalmente no correlaciona con los efectos de la droga. El análisis de lavado gástrico o emesis ofrece la ventaja de que la droga original puede estar presente, aunque las drogas que son rápidamente absorbidas o aquellas que no son ingeridas no serán detectadas. Además, la interferencia de alimentos ingeridos obstaculiza la identificación. El análisis de suero o plasma permite identificar la droga original, y su cuantificación puede ser de ayuda en el manejo del paciente. Las desventajas del tamizaje en suero o plasma incluyen limitaciones como la disponibilidad del volumen de la muestra, la baja concentración de la droga y la incapacidad para identificar ciertas drogas en una situación de sobredosis. 2098

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Plomo M. WILSON TABOR

Principios del análisis El método complejométrico de ditizona (difeniltiocarbazona), que ha sido utilizado por varios años, se desarrolló para medir plomo en muestras biológicas y ambientales (Tabla 51-12, método 1).ref(2017) En este procedimiento, las muestras (sangre, orina o tejido) son calcinadas mediante oxidación ácida y calentamiento a 400 C para remover el material orgánico. Después de reducir a cenizas, la muestra es redisuelta en agua acidificada y luego se alcaliniza con KCN-NH4+ a pH de 9 ó 10. Enseguida se agrega cianuro para prevenir reacciones laterales con otros metales y después la muestra se hace reaccionar con difeniltiocarbazona para producir un complejo rojo de plomo-ditizonato. El complejo se extrae con cloroformo y la absorbancia es medida a 510 nm. Este procedimiento es tedioso y lento, requiere de grandes cantidades de material de vidrio y reactivos limpios (libres de plomo), y está sujeto a interferencia por estaño (II), bismuto y talio. La técnica más frecuentemente usada para determinar plomo es la espectroscopía de absorción atómica (EAA), usualmente la que no utiliza flama (EAAsF). En el método clásico de EAA (Tabla 51-12, método 2a) la muestra se calcina mediante un método semejante al descrito para ditizona. Después de calcinar la muestra, la solución que contiene el plomo iónico es conducida por aspiración a una flama de aire-acetileno donde el plomo es reducido al estado atómico Pb0. La cuantificación de plomo se lleva a cabo por medición espectrofotométrica de la luz absorbida por el plomo en su frecuencia de resonancia característica de 283.3 nm. Se han descrito numerosas variaciones a este procedimiento.refs(2018) La técnica en microescala de Delves (Tabla 51-12, método 2b) es una variación de la EAA que se usa comúnmente para determinaciones de plomo en sangre y en orina.ref(2019) Este método no utiliza el procedimiento de calcinado. Aquí, el especimen se coloca en una copa especial de níquel que contiene peróxido de hidrógeno, el cual oxida parcialmente la muestra. Las ventajas de esta técnica incluyen el uso de un tamaño de muestra pequeño y una mayor velocidad de análisis, debido a que el pretratamiento de la muestra es mínimo. Sin embargo, se debe tener especial cuidado en las variaciones en la calidad de las copas que llevan la muestra. El procedimiento más ampliamente usado y recomendado para medir plomo en suero es el “libre de flama” (EAAsF) o procedimiento electrotérmico de AA, también conocido como técnica de horno de grafitoref(2020) y barra de carbónref(2021) (Tabla 51-12, método 2c). En los procedimientos electrotérmicos, la muestra se aplica a un tubo de grafito o barra de carbón. La muestra se mezcla usualmente con un “modfiicador de matriz”, que mantiene el plomo en una forma constante y minimiza las interferencias causadas por la matriz. El tubo de grafito es entonces calentado por una resistencia eléctrica en una secuencia gradual; una temperatura de secado de 100 C, una temperatura de carbonización de 400 C, y finalmente una temperatura de atomización de 2000 C a 2500 C. El paso de carbonización remueve el material orgánico o inorgánico que pueda interferir en el ensayo. La atomización genera 2099

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vapor de Pb0, que absorbe luz a 280.2 y 283.3 nm. Debido a que el Pb0 formado durante la atomización se escapa rápidamente por difusión, la señal es generada solamente por unos cuantos segundos. La concentración de plomo en la muestra usualmente se calcula a partir del área bajo el pico de absorbancia.ref(2022) Otra técnica para análisis de plomo es el método electroquímico de voltametría de remoción anódica (VRA) (Tabla 51-12, método 3). Este método se usa extensamente para la cuantificación de plomo en muestras biológicas. En este procedimiento, el plomo iónico en sangre u orina es reducido a plomo elemental mediante el potencial negativo de un electrodo de mercurio: Pb++ + 2e

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Pb0 (depositado en el electrodo de mercurio)

Después de un intervalo de tiempo preseleccionado, el potencial del electrodo de mercurio se ajusta a valores positivos, dando lugar a la reoxidación de plomo del electrodo. La reoxidación de plomo origina la producción de una corriente anódica que es proporcional a la concentración de plomo en el especimen. Pb0 (del electrodo de mercurio)

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Pb++ + 2e

Los métodos de VRA han presentado dificultades para alcanzar la sensibilidad para medir plomo en sangre por debajo del límite superior del intervalo de referencia de 100 µg/L, aunque mejoras recientes en el método pueden haber resuelto este problema. La técnica de VRA tiene un amplio rango lineal de aproximadamente 60 a 10,000 µg/L.ref(2023) Las desventajas de esta técnica son la interferencia por talio, que puede ocurrir cuando el plomo y cadmio están presentes en el especimen en concentraciones comparables, y su relativamente pobre respuesta. Especimen La sangre total es el especimen de elección para la determinación de plomo en humanos, aunque también se puede utilizar orina. Se pueden usar tubos vacutainerJ libres de plomo conteniendo heparina o EDTA. Se debe tener cuidado extremo para prevenir contaminación externa del especimen. Los tubos libres de plomo para muestreo de sangre están disponibles comercialmente (Becton Dickinson, Rutherford, NJ 07070). El plomo se puede perder durante el almacenamiento por absorción al recipiente usado para almacenarlo. Se puede perder hasta el 80% de plomo después de almacenarlo por una semana.ref(2024) La adición de ácido cítrico al 1% o de peróxido de hidrógeno al 3% al especimen contribuirá a preservar la muestra hasta por 5 días.ref(2025) Las muestras colectadas con EDTA (1.5 mg/mL de sangre) y congeladas a -20 C son estables por varios meses.ref(2026) Una vez elegido el método de análisis y usando EDTA como anticoagulante, se debe adicionar cloruro de calcio (1.4 mg/L de sangre) para aumentar la recuperación de plomo del especimen.ref(2027) La orina para las determinaciones de plomo se debe colectar en botellas libres de plomo. Este ensayo requiere de la adición de timol (500 mg/mL de orina) como preservativo. Los especímenes que se colectan y conservan adecuadamente son estables hasta por una 2100

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semana si se mantienen refrigerados. Intervalo de referencia La exposición de individuos a plomo se puede clasificar como ocupacional o ambiental. El límite de exposición de plomo en sangre en trabajadores se ha establecido en 600 µg/L (2.9 µmol/L).ref(2028) Los valores en niños son menores que los encontrados en adultos; los valores 34

2-3 % 11 % 7% 2-3 %

Tabaco Marihuana

Cocaína

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? 13% 8.6 % 2%

* Los grandes bebedores son aquellos que toman cinco o más bebidas por vez, en cinco o más días durante los treinta días previos.

Tabla 52-3. Ejemplos de fisiopatología médica asociada con abuso. Substancia

Enfermedad

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Cirrosis hepática Síndrome fetal por alcohol Cáncer gastrointestinal

Cardiomiopatía Traumas de todo tipo Ataques Depresión

Cocaína

Perforación del septum nasal Convulsiones Paranoia Fase de retirada en neonatos

Paro cardíaco Ataques de pánico Nacimientos prematuros

Opiáceos

Infecciones, SIDA Autointoxicación

Hepatitis Fase de retirada en neonatos

Tabaco

Enfisema Ataque cardíaco Bajo peso al nacer

Cáncer de varios tipos Osteoporosis

* En adición a los síntomas de la fase de retirada

Tabla 52 – 4. Criterios diagnósticos de adicción. Tolerancia Pérdida de control Limitaciones en el estilo de vida

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Consumo a pesar de las razones para no consumir Síntomas de retirada

CAPÍTULO 53

53. Clasificación y Descripción de Proteínas, Lípidos y Carbohidratos. Lawrence A. Kaplan Herbert K. Naito

Parte I: PROTEÍNAS Definición y clasificación Propiedades químicas Propiedades físicas Propiedades biológicas Parte II: LIPIDOS Definición y clasificación Propiedades químicas y físicas Parte III: CARBOHIDRATOS Definición y clasificación Propiedades químicas Propiedades físicas Propiedades biológicas

OBJETIVOS Describir como se clasifican las proteínas. Listar las características químicas propias de las proteínas. Remarcar algunas de las propiedades biológicas de las proteínas. Describir como se clasifican los lípidos. Remarcar alguna de las propiedades biológicas de los lípidos y su localización en tejidos específicos. Describir como se clasifican los hidratos de carbono. Entender como las propiedades físicas y químicas de los carbohidratos se relacionan con sus propiedades biológicas.

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Términos Clave aldosa Forma química de monosacárido en la cual el grupo carbonilo es un aldehído. apoproteína Cadena polipeptídica aún no complejada a su grupo prostético. carbohidratos Compuestos químicos con fórmula general de hidratos de carbono, (CH2O)n, que son derivados de aldehídos y cetonas de polialcoholes. Comúnmente llamados azúcares. proteínas compuestas (conjugadas) Cadena polipeptídica acomplejada con otra forma química tal como lípidos (lipoproteínas), carbohidratos (glicoproteínas), o ácidos nucleicos (nucleoproteínas). lípidos conjugados Esteres de ácidos grasos y alcoholes que contienen estructuras químicas adicionales. Este grupo incluye fosfolípidos, esfingolípidos, esteroles, ácidos biliares, etc. desnaturalización Desplegamiento de la estructura terciaria de una proteína que frecuentemente la torna insoluble, causando su precipitación en solución. derivados lipídicos Lípidos derivados de la hidrólisis de grasas simples o conjugadas; incluyen los ácidos grasos. disacárido Dos monosacáridos unidos entre sí por uniones glicosídicas 1 4 o 1 6, tales como sucrosa, maltosa o lactosa. furanosa Anillo de cinco unidades de monosacáridos formados por reacciones intramoleculares entre el grupo carbonilo y un grupo hidroxilo; presente en formas estereoisoméricas alfa o beta. punto isoeléctrico pH al cual una molécula que contiene muchos grupos ionizables es eléctricamente neutra es decir, el número de grupos cargados positivamente iguala al número de grupos cargados negativamente. cetosa Forma química de monosacárido en la cual el grupo carbonilo es una cetona. monosacárido Unidad básica monomérica de carbohidrato en la cual n en la fórmula (CH2O)n varía de 3 a 8. unión peptídica Unión amida covalente entre grupo amino primario de un aminoácido y el grupo ácido carboxílico de un segundo aminoácido. polisacárido Polímero que usualmente contiene más de 10 monosacáridos unidos por uniones glicosídicas; con cadenas ramificadas y no ramificadas que pueden llegar incluso a muchos millones de peso molecular, como la celulosa, el almidón o el glucógeno. estructura primaria Secuencia lineal aminoacídica de una proteína, definida en el código genético presente en el DNA. grupo prostético Un grupo químico no proteico que está unido a una proteína y que es responsable por la actividad biológica de la misma. El 2134

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complejo funcional entre la proteína y un grupo prostético es llamado holoproteína, y la proteína sin el grupo prostético es llamada apoproteína. piranosa Anillo de seis unidades de carbono formado por una reacción intramolecular entre el grupo carbonilo y un grupo hidroxilo, presente en forma estereoisomérica alfa o beta. estructura cuaternaria Arreglo tridimensional espacial de las cadenas polipeptídicas resultante de la combinación de una o más cadenas polipeptídias en un complejo más estable de mayor tamaño . base de Schiff Complejo covalente entre una amina primaria y la función carbonilo de una aldosa. estructura secundaria Rearreglo espacial de una cadena lineal de aminoácidos en un polipéptido; las estructuras más comunes son la de hoja beta plegada, alfa hélice y ovillo al azar. ácido siálico N-acetil derivados de ácido neuramínico que están covalentemente unidos a muchas proteínas. Lípidos simples Esteres de ácidos grasos con varios alcoholes, incluyendo los triglicéridos y algunos esteroides. Proteínas simples Cadena polipeptídica que sólo tiene aminoácidos. Esteroides Lípidos que contienen cuatro anillos de seis carbonos, incluyen muchas hormonas, vitaminas y drogas. Estructura terciaria Plegamiento intramolecular de una cadena polipeptídica sobre sí misma que resulta de interacciones entre grupos laterales de aminoácidos individuales. zwitterion Molécula que contiene dos grupos ionizables de carga opuesta.

Este capítulo no intenta proveer una revisión bioquímica completa de los compuestos a determinar en el laboratorio químico. Para ello, se recomienda a los lectores consultar los excelentes textos de bioquímica mencionados en la bibliografía. En su lugar, se enfatizará en aquellas propiedades de proteínas, lípidos e hidratos de carbono que afecten la forma en que los compuestos deben ser medidos.

Parte I: Proteínas Lawrence A. Kaplan

Definición y Clasificación Las proteínas son polímeros lineales de alfa aminoácidos. Hay 20 aminoácidos naturales con una estructura general mostrada en la Fig. 53-1. Estos existen como formas estereoisoméricas-L con el grupo amino ubicado en el átomo de carbono alfa próximo al grupo carboxílico. El pKa del grupo ácido carboxílico es, aproximadamente 1.8 a 2.4, mientras que 2135

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el pKa del grupo alfa amino es de 8.53 a 10.53, aproximadamente. Esto significa que a un pH menor que 2.53, el ácido carboxílico estará en forma no-ionizada (COOH), mientras que el grupo alfa amino permanecerá ionizado a valores de pH menores que 9.53 (Fig. 53-2). A pH fisiológico (aproximadamente 7.4), ambos grupos están ionizados. Un compuesto, como por ejemplo un aminoácido, con dos cargas opuestas es llamado zwitterion ("ion híbrido ," o "ion hermafrodita"). Los grupos laterales de los 20 aminoácidos están listados en la Tabla 53-1, junto con los pKa de todos los grupos ionizables. Estos residuos laterales pueden interactuar unos con otros para determinar el total de propiedades químicas, físicas y biológicas de la cadena polipeptídica. Los aminoácidos son covalentemente unidos por la maquinaria de síntesis de la célula. El orden real o la secuencia de aminoácidos en una cadena proteica está determinado en el código genético de la célula. La secuencia de información genética localizada en el DNA es transcripta en el RNA mensajero, el cuál es transcripto en una proteína en el citoplasma (Fig. 53-3). La secuencia específica para una proteína se denomina estructura primaria. Los aminoácidos están unidos entre sí por uniones peptídicas. Como se observa en la Fig. 53-4, esta unión tiene una distribución espacial en tres dimensiones. La cadena lineal polipeptídica puede existir en tres conformaciones posibles, alfa hélice, hoja beta plegada y ovillo al azar (Fig. 53-5). Estas conformaciones son conocidas como estructura secundaria de la proteína. Cuando una cadena polipeptídica está en solución, es lo suficientemente flexible para doblarse permitiendo que los grupos laterales interacciones entre sí. Los tipos de interacciones están listados en la Tabla 53-2. Aunque la energía con que interaccionan los grupos es pequeña, la energía neta de todas las interacciones es lo suficientemente grande como para estabilizar a las proteínas en un arreglo tridimensional espacial plegado y arrollado conocido como estructura terciaria (Fig. 53-6). La particular estructura terciaria para cada proteína le confiere sus propiedades biológicas específicas. Las cadenas polipeptídicas plegadas con frecuencia se organizan como agregados, con polipéptidos idénticos o diferentes. El número y tipo específico de esas cadenas polipeptídicas determina las propiedades específicas del complejo. El arreglo espacial de estas proteínas multicatenarias se denomina estructura cuaternaria de la proteína. En general, las propiedades de estas proteínas cuaternarias es la suma de las de sus cadenas individuales. Las proteínas por lo común se clasifican en dos grupos mayores, simples o conjugadas, con sucesivas divisiones dentro de cada grupo. Este esquema de clasificación se basa en las propiedades físicas y en la composición química de la proteína. I. Proteínas simples-generalmente no asociadas con otras clases químicas más complejas A. Proteínas globulares-proteínas relativamente simétricas, solubles en agua o en solución salina 1. Albúmina-proteína mayoritaria en suero 2. Globulinas-el resto de las proteínas del suero 3. Histonas-proteínas básicas, se encuentran asociadas con ácidos nucleicos 4. Protaminas-proteínas fuertemente básicas 2136

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asociadas con ácidos nucleicos Proteínas fibrilares y/o proteínas asimétricas que son insolubles en agua y/o en sales diluidas; altamente resistentes a la mayoría de las enzimas proteolíticas 1. Colágeno -proteína mayoritaria del tejido conectivo, con un alto contenido en hidroxiprolina 2. Elastinas -se encuentran en tejidos elásticos tales como tendones y arterias 3. Keratinas -proteínas mayoritarias en pelo animal, uñas, etc. II. Proteínas conjugadas -combinadas con compuestos no aminoacídicos; que deben tener dos constituyentes- la proteína llamada apoproteína, y el grupo prostético no proteínico (La habilidad del grupo prostético y de la apoproteína de disociarse varía de un grupo a otro.) A. Nucleoproteínas los grupos prostéticos son los ácidos nucleicos (DNA o RNA) B. Mucoproteínas en las cuales grandes cantidades (mas del 4 % en peso) de carbohidratos complejos están unidos covalentemente a la proteína C. Glicoproteínas -también contienen residuos de carbohidratos unidos covalentemente pero usualmente menos del 4 % en peso. D. Lipoproteínas -contienen colesterol, triglicéridos y fosfolípidos asociados a proteínas altamente insolubles en agua. E. Metaloproteínas -incluye proteínas que contienen metales fuertemente unidos a la proteína, tales como el hierro, o como metales complejos como las flavoproteínas y las hemoproteínas F. Fosfoproteínas -contienen grandes concentraciones de grupos fosfatos covalentemente unidos a la proteína B.

Las funciones biológicas de las proteínas son extraordinariamente variadas, pero muchas funciones (ver adelante) son específicas para sólo una o dos de esta clase de proteínas.

Propiedades químicas Las propiedades químicas de las proteínas están basadas en la suma de sus partes, es decir, los aminoácidos constituyentes y los grupos prostéticos. La unión peptídica es químicamente reactiva y es la base del método más específico y popular utilizado para la cuantificación de proteínas totales en suero. Esta es la reacción de Biuret. Las cadenas laterales de los aminoácidos también son químicamente reactivas, de todas formas sólo unas pocas de estas reacciones son utilizadas en el laboratorio químico. Los grupos amino en la zona N- terminal de la cadena polipeptídica y los pertenecientes a las lisinas o guanidinas de la arginina pueden reaccionar con numerosos compuestos para producir una intensa fluorescencia. Estos mismos grupos pueden reaccionar con la ninhidrina para dar color azul. Ambas reacciones han sido usadas para cuantificar proteínas totales. El grupo fenólico de la tirosina y el grupo indol del triptofano reaccionan con el reactivo de Folin-Wu o la reacción de 2137

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Lowry para formar un color azul. Este método se emplea en soluciones diluidas o en microanálisis.

Propiedades Físicas Los aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina y tirosina) le confieren a la mayoría de las proteínas un espectro de absorción con un máximo de absorbencia único en 278 a 280 nm. La absorbencia a 280 nm se usa para estimar la concentración de proteínas puras en solución. Además, proteínas complejas como la hemoglobina, que tiene un grupo prostético con propiedades únicas de absorción, puede ser cuantificada individualmente sin una extensa purificación sobre la base de su espectro de absorción específico. La banda Soret de absorción de la hemoglobina a 415 nm se usa extensivamente para cuantificar la concentración de hemoglobinas. Las cadenas polipeptídicas tienen una amplia variación en pesos moleculares. Los polipéptidos más pequeños, tales como las endorfinas o las hormonas hipotalámicas contienen de 5 a 25 aminoácidos, mientras que las proteínas más grandes, conteniendo numerosas subunidades pueden tener peso molecular de millones de daltones. Aunque la separación de proteínas de acuerdo a su peso molecular puede hacerse, es un método rara vez usado en el laboratorio químico. La densidad de la mayoría de las proteínas cae en un estrecho rango de 1.33 g/ml aproximadamente. Las lipoproteínas representan una importante excepción debido a que su contenido lipídico les confiere una densidad inusualmente baja, permitiendo la separación de varias clases de lipoproteínas de otras proteínas sobre la base de su densidad. Esta técnica se utiliza principalmente en laboratorios especializados. Una propiedad física importante de las proteínas es la carga neta de la molécula proteica. La carga neta de la proteína es la suma de todas las cargas iónicas de los aminoácidos, carbohidratos y grupos prostéticos de la proteína. Ya que los diferentes grupos químicos están ionizados a valores distintos de pH , la carga neta de una proteína varía con el pH. El pH al cual una proteína no tiene carga se denomina pI , o punto isoeléctrico; el punto isoeléctrico de una proteína es el punto en el cual el número de grupos cargados positivamente iguala al número de grupos cargados negativamente. A un pH mayor que el pI, la proteína estará negativamente cargada, mientras que a un pH menor que el pI estará cargada más positivamente. A un pH fisiológico la mayoría de las proteínas séricas están cargadas negativamente. Ya que las proteínas difieren en el tipo y número de aminoácidos constituyentes, también difieren en su pI. Por lo tanto a niveles de pH diferentes, las proteínas llevarán distinta carga neta. Esta diferencia en la carga neta es la base de muchos procesos para separar y cuantificar clases de proteínas o proteínas individuales. Los procesos más comunes son la electroforesis, la cromatografía de intercambio iónico y el isoelectroenfoque. Después de su separación las proteínas individuales son detectadas por el uso de tinciones específicas. Las proteínas en los fluidos corporales son en general solubles en agua pero pueden precipitar en presencia de un amplio rango de agentes desnaturalizantes o precipitantes. Estos incluyen solventes orgánicos (tales como acetona y acetonitrilo), metales pesados (tales como ácido túngstico), algunas sales (tales como hidróxido de zinc y sulfato de amonio), y ácidos 2138

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fuertes (tales como ácido sulfosalicílico, ácido tricloroacético y ácidos minerales). La habilidad de precipitar proteínas de soluciones usando uno o más de estos reactivos químicos es la base para algunos análisis clínicos de rutina. Las cuantificaciones de proteínas en líquido cefalorraquídeo y orina son hechos comúnmente por análisis turbidimétricos. Por otra parte, el paso de precipitación de la proteína frecuentemente se incluye en los esquemas de purificación de compuestos, previo a su análisis.

Propiedades Biológicas Todas las proteínas cumplen alguna función fisiológica o biológica. Las funciones conocidas de las proteínas cubren un amplio rango de actividades y son enumeradas en la Tabla 53-3. Con frecuencia la propiedad biológica conocida de una proteína es la base de un método para su detección y cuantificación. De las funciones fisiológicas importantes de las proteínas, las más importante para el laboratorio bioquímico son las de transporte, las de receptor, y las funciones catalíticas. Muchas proteínas séricas funcionan como transportadores específicos de moléculas pequeñas. La mayoría de las proteínas transportadoras son proteínas globulares. Son ejemplo la proteína transportadora de tiroxina (GFT), que une tiroxina; la trascortina, que une cortisol; la albúmina, que transporta ácidos grasos libres, bilirrubina no conjugada, calcio, y muchos otros compuestos endógenos y exógenos. La capacidad específica de unión de estas proteínas ha sido usada como base para los procesos de medición de concentraciones séricas de cortisol, saturación de GFT y otros compuestos analizados. Las lipoproteínas funcionan como transportadoras de lípidos en suero (ver capítulo 33). Muchas proteínas celulares actúan como procesadores intermediarios de información para moléculas hormonales. Cada proteína, llamada receptor, une una hormona específica y luego actúa para trasmitir el mensaje hormonal a la célula. Las proteínas receptoras son generalmente glicoproteínas. Los ensayos para receptores específicos, tales como el receptor de estriol o progesterona, son muy importantes en el manejo de ciertos tipos de cáncer. Una importante actividad biológica es la capacidad de algunas proteínas de catabolizar reacciones bioquímicas. Las concentraciones séricas de estas proteínas, llamadas enzimas, son importantes en la determinación de la naturaleza de una enfermedad. La mayoría de las proteínas que exhiben actividad catalítica son globulares o metaloproteínas. Una enzima es, la mayoría de las veces medida por el monitoreo de la reacción especifica que ella cataliza. Las condiciones del ensayo enzimático son cuidadosamente definidas como para rendir una actividad enzimática máxima y por lo tanto una sensibilidad óptima al análisis (ver capítulo 54). Una de las más importantes propiedades biológicas de las proteínas es su habilidad para actuar como antígenos (ver capítulo 11). La acción de un antígeno sobre un sistema inmunológico competente estimula la síntesis de anticuerpos del huésped. Los anticuerpos también son proteínas globulares. Un anticuerpo sintetizado contra un antígeno específico será capaz de unirse específicamente a tal antígeno. Esta interacción antígeno-anticuerpo es la base de muchos ensayos para la medición sensible y específica de proteínas que no pueden ser detectadas por otros medios debido a su baja concentración, y es usada para incrementar tanto la sensibilidad como la especificidad de los ensayos clásicos. 2139

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Las proteínas juegan un papel importante tanto a nivel intracelular, como en los tejidos. Por ejemplo, el tejido conectivo está compuesto principalmente por colágeno y mucoproteínas. Las proteínas que forman el endoesqueleto citoplasmático también entran en este grupo.

Parte II: Lípidos Herbert K. Naito

Definición y Clasificación Los lípidos (grasas) comprenden un amplio grupo de compuestos orgánicos que difieren considerablemente en sus propiedades químicas, físicas y en sus roles fisiológicos. Estos incluyen una variedad de sustancias como ácidos grasos, esteroles, triacilglicéridos (más comúnmente llamados triglicéridos), compuestos que contienen fósforo (fosfolípidos), vitaminas liposolubles, ácidos biliares, ceras y otras grasas complejas. De esta manera, resulta difícil enunciar una definición uniforme y concisa que, a su vez, sea suficientemente amplia para abarcar a todos estos compuestos diferentes. Sin embargo, en general, se puede decir que los lípidos son sustancias insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos como alcohol, cloroformo, éter, acetona, hexano y benceno. Aún en esta definición general, hay excepciones como ser los fosfolípidos que son relativamente insolubles en acetona. Más aún, algunos fosfolípidos, como la fosfatidilcolina, el fosfatidilinositol y la fosfatidiletanolamina, presentan una habilidad limitada, pero significativa, para disolverse en agua. Por lo tanto, no existe un acuerdo general para clasificar a los lípidos, aunque por simplicidad, se puede utilizar la siguiente clasificación comúnmente empleada.

Lípidos simples Los lípidos simples son los ésteres formados por ácidos grasos y diferentes alcoholes. Grasas neutras. Las grasas neutras son los ésteres formados por los ácidos grasos y el glicerol (triglicéridos). Dado que no poseen carga, el colesterol y el colesterol esterificado también son denominados lípidos neutros. Sin embargo, desde un punto de vista estructural, éstos son esteroides y no grasas neutras. Las grasas neutras contienen mezclas de triglicéridos-ésteres de glicerol y ácidos grasos (por ejemplo ácidos esteárico, palmítico u oléico). La fórmula general de estas grasas es:

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Si R1 = R2 = R3 (donde R = ácido graso), se trata de un triglicérido simple. Si los Rs no son iguales, se trata de un triglicérido mixto. En la naturaleza, las grasas existen como mezclas de triglicéridos mixtos. Las grasas son entonces triésteres del trialcohol (glicerol) y de algunos, pero no todos, los ácidos orgánicos. Dado que los tres radicales alcohólicos están esterificados, se los denomina triacilglicéridos, o más comúnmente llamados triglicéridos. Un éster simple estaría formado por la combinación de un ácido y un alcohol: CH3COOH + C2H5OH ––––

CH3COOC2H5 + H2O

Una grasa está formada por la combinación de un ácido graso (generalmente, de peso molecular relativo elevado) con el alcohol glicerol. Por el hecho de ser ésteres, las grasas son rápidamente hidrolizadas:

Dicha hidrólisis se lleva a cabo mediante el uso de un ácido, un álcali, vapor sobrecalentado o una enzima apropiada (como ser la lipasa pancreática). En una hidrólisis ácida, se libera el ácido graso. Cuando se emplea un álcali, se forma un jabón y el proceso es denominado saponificación: C3H5(O–CO–C17H35)3 + 3NaOH–––––– 3C17H35COONa + C3H5(OH)3 Estearina Estearato de sodio Glicerol (jabón)

Las grasas que comemos son en su mayoría triglicéridos que contienen ácidos grasos 2141

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con número par de átomos de carbono, debido a la forma en que son biosintetizados. Estos abarcan desde el ácido butírico (C4) hasta el ácido lignocérico (C24) y, probablemente, ácidos grasos mayores (ver Tabla 53-5). Los ácidos grasos con número impar de átomos de carbono también se encuentran naturalmente. Ceras. Las ceras son ésteres de ácidos grasos con alcoholes de mayor peso molecular que el glicerol. Ejemplos son la cera de carnauba, de lana, de abeja, y el aceite de esperma. En la industria, son utilizadas en la fabricación de lubricantes (aceite de esperma), lustradores (cera de carnauba), ungüentos (lanolina, la cual contiene cera de lana), velas (espermacetil) y otros. Aparte del colesterol, los alcoholes comúnmente encontrados en las ceras son el alcohol cetílico (C16H33OH), alcohol cerílico (C26H53OH) y alcohol melísico (C30H61OH).

Lípidos conjugados Los lípidos conjugados son ésteres de ácidos grasos que contienen grupos tales como un alcohol y un ácido graso (Tabla 53-4). Fosfolípidos. Los fosfolípidos son lípidos que, además de los ácidos grasos y el glicerol, contienen un residuo de ácido fosfórico, bases nitrogenadas y otros constituyentes. Estos lípidos incluyen a la fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, esfingomielinas y plasmalógenos. La fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina y el fosfatidilinositol (lipositol) también son conocidos como cefalinas. Esta clase de lípidos complejos también es llamada glicerofosfátidos, fosfoglicéridos, fosfatidatos del glicerol, o más comúnmente fosfolípidos. No todos los lípidos que contienen fósforo son fosfoglicéridos; por ejemplo, la esfingomielina es un fosfolípido porque contiene fósforo, pero se lo clasifica mejor como un esfingolípido debido a su estructura medular a la cual se une el ácido graso. En los fosfolípidos, uno de los grupos OH primarios del glicerol es esterificado por el ácido fosfórico, mientras que los otros grupos OH son esterificados por ácidos grasos. El compuesto precursor de los fosfolípidos es el ácido fosfatídico, el cual no posee la cabeza polar alcohólica. Los fosfolípidos son constituyentes de todas las células vegetales y animales. Son abundantes en cerebro, corazón, riñones, huevos, porotos de soja, entre otros. Los fosfolípidos comúnmente han sido separados en cinco grupos de compuestos diferentes: ácido fosfatídico, lecitina, cefalina, plasmalógenos y esfingolípidos. Además de carbono, hidrógeno y oxígeno, estos compuestos tienen elementos nitrogenados y fósforo. En la lecitina y la cefalina, la relación entre nitrógeno y fósforo es de 1:1; en la esfingomielina es de 2:1.

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Acido fosfatídico. El ácido fosfatídico es importante como intermediario en la síntesis de triglicéridos y fosfolípidos, pero no se lo encuentra en los tejidos. Es el fosfolípido más simple y deriva del ácido glicerofosfórico por esterificación de los dos grupos OH restantes con ácidos grasos. Lecitinas. Al ser hidrolizada, una lecitina típica forma glicerol, 2 moles de ácidos grasos, ácido fosfórico y la base nitrogenada colina. La mayoría de las lecitinas tienen un ácido graso saturado en la posición C-1 y un ácido graso insaturado en la posición C-2. La fórmula estructural puede escribirse de la siguiente manera:

Las lecitinas, al igual que el colesterol, son constituyentes celulares comunes que se encuentran principalmente en tejidos animales y que cumplen tanto funciones estructurales (como parte de las membranas celulares) y metabólicas. A pesar de que no están presentes en la grasa de depósito, constituyen una proporción considerable de los lípidos del hígado y del cerebro. También están presentes en el plasma como parte de complejos lípidos-proteínas 2143

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denominados lipoproteínas; por lo tanto, resultan importantes para la formación de estas macromoléculas, las cuales cumplen un rol importante en el transporte de las grasas. Las lecitinas juegan un papel relevante en la esterificación del colesterol libre para formar colesterol esterificado, son un importante precursor para la formación de los surfactantes pulmonares y forman soluciones coloidales con el agua, aunque se puede preparar una solución acuosa de lecitina por adición de sales biliares. Se cree que un compuesto de ácido biliar lecitina-sal que se forma es hidrosoluble. Las lecitinas no son solubles en acetona; esta propiedad es empleada para separarlas de otros fosfolípidos y lípidos. Cefalinas. Las cefalinas son estructuralmente parecidas a las lecitinas excepto por el componente correspondiente a la colina. Hay tres fracciones principales: cefalinas de etanolamina, cefalinas de serina y cefalinas de inositol. Las cefalinas se diferencian de las lecitinas en su insolubilidad en etanol o metanol. Fosfatidiletanolamina. La fosfatidiletanolamina difiere de las lecitinas en que la etanolamina reemplaza a la colina. Se conocen tanto la alfa, como la beta cefalina. Ésta es una de las cefalinas más abundantes encontradas en plantas y animales superiores.

Fosfatidilserina. La fosfatidilserina, la cual contiene al aminoácido serina en lugar de etanolamina, ha sido encontrada en algunos tejidos como el cerebro. Fosfatidilinositol. El fosfatidilinositol se encuentra entre los fosfolípidos del tejido cerebral, de los porotos de soja y también entre los fosfolípidos de otras plantas. El inositol está presente como estereoisómero del mioinositol. Plasmalógenos. Los plasmalógenos constituyen tanto como el 10% de los fosfolípidos de las membranas de los nervios y de los músculos. También se los encuentra en el hígado y en otros órganos. Estructuralmente, los plasmalógenos se asemejan a las lecitinas y cefalinas, pero dan reacción positiva cuando se testean los grupos aldehídos con reactivo de Schiff (fucsina-ácido sulfuroso) después de hacer un tratamiento del fosfolípido con cloruro mercúrico. Estos fosfolípidos contienen aldehídos grasos mayores en lugar de ácidos grasos. De esta manera, las unidades básicas de esta clase de compuestos incluyen al glicerol, al 2144

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fósforo, al aldehído graso y a la etanolamina. Esfingolípidos. El grupo dialcoholamino, esfingosina, es característico de todos los esfingolípidos. Sirve como una unidad estructural de sustitución, así como ocurre con el trihidroxialcohol, glicerol, en los glicéridos. La esfingosina es un compuesto de cadena larga C18 que contiene un doble enlace trans, un grupo NH2 en C-2 y dos grupos OH (en C-1 y C-3). Los esfingolípidos son especialmente abundantes en el cerebro. Algunas enfermedades de almacenamiento se caracterizan bioquimicamente por la acumulación de ciertos esfingolípidos. Existen cuatro tipos principales (ver Tabla 53-2): esfingomielinas, cerebrósidos, sulfátidos y gangliósidos. Esfingomielinas. Las esfingomielinas se encuentran en el cerebro y en otros órganos. Los ácidos esteárico, lignocérico y nervónico son los únicos ácidos grasos presentes en las esfingomielinas del cerebro, mientras que los ácidos palmítico y lignocérico son los ácidos grasos de los fosfolípidos del pulmón y del bazo. Una fórmula tipo se muestra siguente.

Cerebrósidos. Los cerebrósidos contienen galactosa o glucosa, un ácido graso de alto peso molecular, y esfingosina. De esta manera, los cerebrósidos tienen la siguiente estructura básica:

Estructuralmente, son similares a las esfingomielinas. Los cerebrósidos también pueden ser 2145

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clasificados junto con las esfingomielinas como esfingolípidos. Los cerebrósidos individuales se diferencian por el tipo de ácido graso que contienen en su molécula: las kerasinas contienen ácido lignocérico, los cerebrones contienen un ácido hidroxilignocérico (ácido cerebrónico); los nervones contienen un homólogo del ácido lignocérico denominado ácido nervónico y los oxinervones aparentemente contienen el hidroxil derivado del ácido nervónico como ácido graso constituyente.

CH3–(CH2)22–COOH Acido lignocérico CH3–(CH2)21–CH(OH)–COOH Acido cerebrónico CH3–(CH2)7–CH=CH–(CH2)13–COOH Acido nervónico CH3–(CH2)7–CH=CH–(CH2)12–CH(OH)–COOH Acido oxinervónico

Los cerebrósidos se encuentran en muchos tejidos además del cerebro. En la enfermedad de Gaucher, el contenido de cerebrósidos de las células reticuloendoteliales (como el bazo) es muy alto. Los cerebrósidos se hallan en concentraciones mucho mayores en fibras nerviosas mielinizadas que no mielinizadas. Sulfátidos. Los sulfátidos derivan del residuo galactosil de los cerebrósidos. Gangliósidos. Los gangliósidos son glicolípidos que están presentes en el cerebro (en las células gangliónicas). Los componentes principales son esfingosina, ácidos grasos y carbohidratos de cadena ramificada hasta con siete residuos de azúcar. La construcción de los gangliósidos es similar a la de los cerebrósidos, aunque la parte de carbohidratos es mucho más compleja. Los gangliósidos se diferencian entre sí primariamente por el número de residuos de azúcares.

Derivados lipídicos Los derivados lipídicos son compuestos derivados de la hidrólisis de grasas simples y conjugadas. Estos incluyen a los compuestos que se describirán más adelante. Acidos grasos. Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos de cadena elongada (tanto saturados como insaturados). Se han aislado más de 100 clases diferentes de ácidos grasos a partir de varios lípidos de animales, plantas y microorganismos. Todos ellos poseen una larga cadena hidrocarbonada y un grupo carboxi terminal. Los ácidos grasos pueden obtenerse de la hidrólisis de las grasas o pueden ser sintetizados a partir de unidades de dos carbonos (radicales acetilos). Los ácidos grasos de origen natural generalmente contienen un número 2146

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par de átomos de carbono (porque se sintetizan a partir de unidades de dos carbonos) y son derivados de cadenas elongadas. La cadena puede ser saturada (sin dobles enlaces) o insaturadas (con uno o más dobles enlaces). Se pueden hacer algunas generalizaciones acerca de los ácidos grasos presentes en las plantas y animales superiores. Prácticamente todos tienen número par de átomos de carbono que constituyen cadenas con 14 a 22 átomos de largo; aquellos con 16 y 18 átomos de carbono son los más abundantes. En general, los ácidos grasos insaturados predominan por sobre los saturados, particularmente en las grasas neutras y en las células de organismos poiquilotermos (sangre fría) que viven en zonas de bajas temperaturas. Los ácidos grasos insaturados tienen punto de fusión más bajo que los saturados. La mayoría de las grasas neutras ricas en ácidos grasos insaturados son líquidos hasta 5o C o menores. En la mayoría de los ácidos grasos insaturados de los organismos superiores, hay un doble enlace entre los átomos de carbono 9 y 10; otros dobles enlaces usualmente están presentes entre el C-10 y el metilo terminal de la cadena. En los ácidos grasos con dos o más dobles enlaces, éstos nunca están conjugados, pero se encuentran separados por un grupo metileno. Los dobles enlaces de casi todos los ácidos grasos que se encuentran en la naturaleza tienen configuración cis. Los ácidos grasos más abundantes en los organismos superiores son los ácidos oleico, linoleico, linolénico y araquidónico (Tabla 53-5). Alcoholes. Los alcoholes de cadena elongada y los alcoholes cíclicos (como los esteroles) son una subclase de derivados lipídicos. Los esteroides pueden ser clasificados en los grupos siguientes: Esteroles Ácidos biliares Sustancias obtenidas de glucósidos cardiotónicos Sustancias obtenidas de las saponinas Hormonas sexuales Adrenocorticosteroides Vitamina D Estos compuestos están ampliamente distribuidos en las plantas y tejidos animales, tanto al estado libre como bajo la forma de ésteres (en combinación con ácidos grasos mayores). Químicamente se sabe que son derivados fenantrénicos, o más correctamente, derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno. Esteroides. El esteroide más conocido es el colesterol. Está presente en todas las células animales y es particularmente abundante en el tejido nervioso y en el hígado. Cantidades variables de este esteroide se encuentran en las grasas animales pero no en las grasas vegetales. La estructura de la molécula de colesterol está ilustrada en la Fig. 53-7. El colesterol es el precursor de muchos esteroides en tejidos animales, incluyendo los ácidos biliares, los compuestos tipo detergentes que ayudan en la emulsificación y absorción de los lípidos en el intestino; los andrógenos u hormonas sexuales masculinas; los estrógenos u hormonas sexuales femeninas; las hormonas progestacionales; y las hormonas adrenocorticales. El colesterol es un miembro de un amplio grupo de esteroides llamados esteroles. Es un alcohol esteroideo que contiene un grupo hidroxilo en el carbono 3 del anillo A y una 2147

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cadena ramificada alifática de ocho o más átomos de carbono en el carbono 17. Los esteroles se presentan tanto como alcoholes libres o como ésteres de ácidos grasos de cadena larga en el grupo hidroxilo del carbono 3; todos son sólidos a temperatura ambiente. El colesterol se funde a 150o C y es insoluble en agua, aunque se extrae de los tejidos con cloroformo, éter o alcohol caliente. El colesterol se encuentra en las membranas plasmáticas de las células animales y en las lipoproteínas de la sangre. Sólo se encuentra en los tejidos y fluidos de origen animal, nunca en las plantas. Otros esteroides similares son los fitosteroles, que son esteroides de las plantas. Entre ellos están el estigmasterol, el campesterol y el sitosterol. Los hongos y levaduras contienen aún otros tipos de esteroles, los micosteroles. Entre ellos se encuentra el ergosterol, el cual es convertido en vitamina D. Ácidos biliares. Los ácidos biliares (un esteroide de C24) son constituyentes de la bilis que promueven la digestión. Son agentes tensioactivos. Esto significa que disminuyen la tensión superficial y por lo tanto pueden emulsificar grasas, un paso importante en la formación de las micelas. Los ácidos biliares también activan las lipasas gastrointestinales. Por estos motivos, los ácidos biliares cumplen un rol fisiológico importante en la digestión y absorción de las grasas. Los mayores ácidos biliares primarios son el ácido cólico y el ácido quenodesoxicólico, los cuales se originan en el hígado por clivaje enzimático de los tres carbonos terminales de la molécula de colesterol (un hidrocarbono de C27). De esta manera, los ácidos biliares son uno de los productos finales del metabolismo del colesterol; sin embargo, debería destacarse que los ácidos biliares constituyen la fracción esterol ácida de la bilis, lo cual es entre 50% y 60% del total de los esteroides excretados. El resto de los esteroides eliminados en la bilis están bajo la forma de esteroides neutros, como el colesterol. Hidrocarburos. Los hidrocarburos son a la vez alifáticos y compuestos cíclicos. Vitaminas. Las vitaminas y sus estructuras son presentadas en el capítulo 39. Las hormonas son presentadas en el capítulo 43. Otros compuestos lipídicos. Los sulfolípidos, los aminolípidos y las lipoproteínas también pueden ser ubicados dentro de esta categoría.

Propiedades Físicas y Químicas Punto de fusión El punto de fusión de los ácidos grasos es influenciado por el largo de la cadena y el grado de insaturación de la misma. Al aumentar el largo de la cadena y disminuir el número de dobles enlaces insaturados, aumentará el punto de fusión de los ácidos grasos. El punto de fusión de los ácidos grasos y de otros lípidos puede usarse para identificar el compuesto, aunque esta propiedad no es utilizada de rutina en los análisis.

Solubilidad La relativa insolubilidad de los lípidos en soluciones acuosas es una importante 2148

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propiedad de los lípidos. La mayor consecuencia de esta insolubilidad es que frecuentemente el análisis de los lípidos requiere un tratamiento previo de la muestra para extraer el lípido en un medio más soluble como metanol, cloroformo o éter. La insolubilidad del colesterol no esterificado se usó en el pasado para ciertos ensayos de colesterol. El colesterol puede ser cuantitativamente separado de los ésteres de colesterol por precipitación con digitonina como un complejo molecular 1:1 de digitónido de colesterol. La medida gravimétrica de la cantidad del complejo digitónido formado ha sido la base de la cuantificación del colesterol en el pasado.

Gravedad específica La densidad de todas las grasas es menor a 1 g/mL; en consecuencia todas las grasas flotan en agua. Esta característica ha permitido que la lipoproteínas fueran selectivamente separadas de las proteínas más densas y de las otras lipoproteínas en base a las diferentes proporciones del contenido lipídico. Grupos alcohol de los esteroides El grupo alcohol químicamente reactivo de los esteroides es la base de muchos ensayos de cuantificación del colesterol. El grupo puede reaccionar con ácidos minerales fuertes como el ácido sulfúrico, y con sales para así formar el cromógeno. La reacción de Burchard-Liebermann es la más frecuentemente utilizada. El grupo hidroxilo puede ser oxidado específicamente por la enzima colesterol oxidasa. El monitoreo de esta reacción es la base de los ensayos enzimáticos para colesterol. Composición de los triglicéridos La composición química de los triglicéridos (es decir, la esterificación del glicerol por tres ácidos grasos) es la base de todos los métodos de cuantificación de los triglicéridos. Estas técnicas se basan en la cuantificación del glicerol liberado de los triglicéridos después de la hidrólisis química o enzimática de los ésteres de ácidos grasos. El glicerol puede ser oxidado química o enzimáticamente para que forme cromógenos medibles.

Composición química Los fosfolípidos son detectados por reacciones específicas para el fósforo después de la reacción química.

Propiedades Biológicas Las propiedades biológicas más importantes de los lípidos son estructurales, nutricionales y hormonales. Casi todas las clases de lípidos son usados como componentes estructurales de las membranas. Los triglicéridos son componentes esenciales en la formación de las membranas bimoleculares proteína- lípido- lípido- proteína. Las membranas celulares también contienen cantidades variables de esteroides, fosfolípidos y otros lípidos complejos. Los triglicéridos también funcionan como una importante fuente de calorías y de 2149

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átomos de carbono para la síntesis de otras macromoléculas. El rol de los esteroides como hormonas tiene una gran influencia en el trabajo del laboratorio debido a la necesidad de su determinación. Estas hormonas fueron medidas inicialmente por alguno de los métodos discutidos previamente. Sin embargo, éstos han sido reemplazados por métodos inmunoquímicos.

Parte III: Carbohidratos Lawrence A. Kaplan

Definición y Clasificación Se asignó a los primeros carbohidratos la fórmula empírica (CH 2O)n. De esta forma estos químicos fueron definidos simplemente como compuestos consistentes en carbonos hidratados (H2O), de ahí el nombre de carbohidrato. Más tarde se notó la existencia de carbohidratos complejos conteniendo otras estructuras químicas. Por ejemplo, pueden estar unidos a proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. En adelante discutiremos la variadas clases de carbohidratos. Carbohidratos monoméricos simples (sacáridos) Los sacáridos son conocidos también como azúcares, y sus nombres comunes terminan en todos los casos con el sufijo -osa, que significa "azúcar". La unidad azúcar más pequeña se denomina monosacárido, en los cuales n en la fórmula de arriba y va desde 3 a 8. Si n = 3, el azúcar es una triosa; si n = 4, una tetrosa; etc. Los monosacáridos son cadenas lineales en las que cada átomo de carbono, excepto uno, contiene un grupo hidroxilo (–OH); el átomo de carbono remanente contiene un grupo carbonilo. Si el grupo carbonilo está en el primer o en el último átomo de carbono es un aldehído y el monosácarido se denomina aldosa. Si el grupo carbonilo está en un átomo de carbono interno, es una cetona, y el monosacárido se denomina cetosa (Fig. 53-8). Por lo tanto una aldosa de 4-carbonos es una aldotetrosa, una cetosa de 6-carbonos es una cetohexosa, etc. Los monosacáridos que encontramos en la naturaleza son todos estereoisómeros. El etereoisomerismo está físicamente definido como la habilidad de una molécula de rotar el plano de la luz polarizada. Las propiedades físicas y químicas de, por ejemplo, las ocho aldohexosas (6-átomos en la cadena carbonada) son exactamente las mismas excepto por sus diferentes acciones sobre la luz polarizada. Todos los monosacáridos en bioquímica humana son de la forma dextroisomérica (D) . Algunos ejemplos de monosacáridos están dados en la Fig. 53-9. Los monosacáridos y pentosas hexosas también tienen la capacidad de formar estructuras anulares por reacciones intramoleculares entre el grupo hidroxilo terminal con la función carbonilo. Las formas anulares de seis miembros se denominan piranosas, mientras que los anillos de cinco miembros se llaman furanosas. Las aldohexosas, tal como la D-glucosa, forma anillos de seis miembros, en tanto una aldocetosa, como por ejemplo la D-fructosa, forma un anillo de cinco miembros.(Fig. 53-9). 2150

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La glucosa puede formar dos tipos de anillos de seis unidades. Los anillos difieren en la forma en que el grupo hidroxilo en el átomo de carbono uno se posiciona respecto al plano del anillo. Si el grupo hidroxilo está del mismo lado de la molécula que el anillo del oxígeno (Fig. 53-9), el isómero es conocido como -D-glucosa, mientras que si el grupo hidroxilo está en el lado opuesto al anillo del oxígeno el isómero es conocido como la forma -D-glucosa. Las enzimas que actúan sobre los carbohidratos en general tienen especificidad dirigida hacia una de las formas estereoisoméricas, en principio hacia la más comúnmente encontrada, por ejemplo - D-fructosa.

Monosacáridos derivados Los monosacáridos derivados se forman por la reducción u oxidación del grupo carbonilo. Los productos de reacciones reductoras son poliholes (polialcoholes) tales como el D-sorbitol o el D-mannitol, mientras que los productos de oxidación son ácidos, como por ejemplo el ácido D-glucorónico (de la D-glucosa). Muchas formas ácidas de monosacáridos son importantes constituyentes de carbohidratos más complejos, tales como los mucopolisacáridos. Un grupo importante de monosacáridos derivados resultan del reemplazo de un grupo hidroxílico por un grupo amino. El término ácido siálico se usa para describir los N-acetil derivados del ácido neuramínico, los cuales están con frecuencia unidos covalentemente a proteínas (Fig. 53-10).

Carbohidratos complejos Estas moléculas están formadas por unión de dos o más monosacáridos por medio de una unión glicosídica (Fig. 53-11). Los disacáridos más simples, importantes desde un punto de vista nutricional, son la maltosa (dos glucosas), lactosa o azúcar de la leche (una galactosa y una glucosa) y la sucrosa (una fructosa y una glucosa). Los oligosacáridos se definen con frecuencia como carbohidratos que contienen de 2 a 10 unidades de monosacáridos. Los polisacáridos son polímeros mayores de hasta 100 millones de daltones. Los tres polisacáridos más importantes contienen glucosa como subunidad monomérica. La celulosa, un componente estructural de las paredes de las plantas, consiste en unidades de glucosa unidas por puentes glicosídicos a -(1 4) para formar cadenas largas y no ramificadas. El almidón, una forma de almacenar glucosa en las plantas, consiste en residuos de glucosa conectados por uniones glicosídicas -(1 4) , las cuales, a diferencia de las uniones -(1 4) de la celulosa, son factibles de degradarse por enzimas hidrolíticas humanas (tal como la amilasa). El almidón también se diferencia de la celulosa en tanto que es una molécula ramificada . Los puntos de ramificación distribuídos en la molécula son formados por puentes -(1 6). El almidón está constituido por dos compuestos: la amilosa (el fracción de cadena lineal) y la amilopectina (fracción altamente ramificada). El glucógeno es la forma de almacenaje de glucosa encontrado en las células animales. El glucógeno se asemeja más a la amilopectina que a la amilosa debido a su estructura altamente ramificada (ver Fig. 32-4). Los polisacáridos complejos conteniendo ácido hialurónico, condroitin-4 sulfato y keratin sulfato como unidades repetitivas son constituyentes importantes del líquido sinovial y 2151

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del tejido conectivo. La heparina es un polisacárido complejo que contiene ácido 2-sulfato Dglucorónico-N-acetil-D-glucosamina-6-sulfato como unidades repetitivas.

Propiedades Químicas Los monosacáridos (pentosas o de mayor tamaño aún) pueden sufrir deshidrataciones en presencia de ácidos minerales en caliente para formar los derivados furfurados cíclicos. Podemos deshidratar glucosa de esta forma y obtener 3-hidroximetilfurfural, en una reacción que es la base del ensayo colorimétrico para medir proteínas glicosiladas. Una importante propiedad química de los monosacáridos es su susceptibilidad a la oxidación o reducción a cambio de reducir u oxidar otros compuestos. La habilidad de las aldosas reductoras, como por ejemplo la glucosa, de ser oxidadas a la forma ácida ha sido, históricamente la base para los ensayos químicos de glucosa. A su vez, la glucosa reduce compuestos tales como el Cu++ o Fe(CN6)- formando complejos coloreados con las formas reducidas de estas sustancias (por ejemplo Cu+ y Cu2O). La oxidación enzimática de la glucosa por la glucosa oxidasa es la base de muchos de los procedimientos corrientes para el dosaje de glucosa, mientras que la oxidación de la glucosa-6-fosfato es la base del ensayo de hexokinasa para glucosa. Las aldosas, por ejemplo la glucosa, pueden reaccionar con aminas primarias para formar las bases de Schiff. Esta condensación no enzimática es el mecanismo para la formación de glicoproteínas en sangre. Además, la reacción de la glucosa con aminas primarias aromáticas, tal como la o-toluidina, es la base de un método histórico importante para la medida de glucosa sanguínea.

Propiedades Físicas Los monosacáridos y disacáridos comúnmente medidos son compuestos altamente solubles en agua. Los ensayos para estos analitos por lo tanto no requieren extracciones o purificaciones previas. La separación de monosacáridos por cromatografía de absorción es posible, aunque esta técnica es en general realizada por laboratorios especializados en metabolismo. Los monosacáridos simples, disacáridos, o polisacáridos en realidad no son distinguibles por sus propiedades espectrales o electroforéticas.

Propiedades Biológicas Los monosacáridos y disacáridos son la mayor fuente de calorías en el cuerpo humano y como tal se utilizan como forma primaria de nutrición. Las formas poliméricas de glucosa, tales como el glucógeno sirven como forma de almacenaje de glucosa en hígado y células musculares. Los polisacáridos complejos se encuentran en los fluidos corporales y en tejido conectivo. 2152

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Bibliografía General Friedman PJ: Biochemistry, New York, 1995, Little, Brown & Co. Glick DM: Biochemistry, Stamford, Conn., 1995, Appleton & Lange. Werner R: Essential biochemistry and molecular biology, Stamford, CT, 1992, Appleton & Lange.

Proteínas y aminoácidos Creighton TE: Proteins: structure, New York, 1995, WH Freeman. Kyle J: Structure in protein chemistry, New York, 1995, Garland Press.

Lípidos Sebedio JL, Perkins EG, editors: New trends in lipid and lipoprotein analysis, Champaign, Ill., 1995, AOCS Press. Cave G, Paltauf F, editors: Phospholipids: characterization, metabolism, and novel biological applications, Champaign, Ill., 1995, AOCS Press.

Carbohidratos Brinkley RW: Modern carbohydrates chemistry, New York, 1988, Marcel Dekker. Chaplin MF, Kennedy JF, editors: Carbohydrate analysis, ed 2, New York, 1994, Oxford University Press.

Tablas Tabla 53-1. Clasificación y propiedades para las cadenas laterales (grupos R) de aminoácidos que se encuentran naturalmente. NH2 | R grupo (R–CHCOOH)

L-Aminoácido

(símbolo)

Nopolar (hidrofóbico) H– Glicina (gly), G CH3–

Alanina (ala), A

pKa* (25o C) ––––––––––––––– Primario Primario –COOH –NH2

Aminoácido peso molecular

75.07

89.09

Grupos Secundarios

2.34

9.60

–

2.34

9.69

–

2.32

9.62

–

CH3 \ CH– / CH3 H3C \

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Valina (val), V

117.15

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CH–CH2– Leucina / (leu), L H3C CH3–CH2–CH– Isoleucina, | (ile), I CH3 –CH2 – Fenilalanina (phe), F HC2–CH2– | | Prolina HC2–CH2 (pro), P \ / N H CH3–S–CH2CH2 Metionina (met), M Neutro polar (hidrofilico) OHCH2– Serina (ser), S CH3–CH– | Treonina OH (thr), T O || NH2–CCH2 Asparagina O (asp), D || NH2–CCH2CH2– Glutamina (gln), Q HSCH2– Cisteína (cys), C HO

–CH2–

Tirosina (tyr), Y

C–CH2– Triptofano (trp), W

131.18

2.36

131.18

2.36

9.68

–

165.19

1.83

9.13

–

115.13

1.99

10.60

–

149.21

2.28

9.21

–

105.09

NH

2154

2.21

119.12

–

132.12

–

9.15

–

–

–

2.02

8.80

–

146.15

2.17

9.13

–

121.16

1.96

10.28 (30o)

181.19

2.20

9.11

10.07 (OH)

204.23

2.38

9.39

–

1.88

9.60

2.19

9.67

2.18

8.95

Acídico polar (hidrofílico) HOOCCH2– Acido aspártico 133.10 (asp) HOOCCH2–H2– Acido Glutámico 147.13 (glu) Básico polar (hidrofílico) H2NCH2CH– Lisina CH2C (lys)

9.60

146.19

8.18 (SH)

3.65 (COOH) 4.25 (COOH)

(10.53 (E–NH3)

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|| H2N–N–CH2CH2CH2–Arginina H (arg) HC=CH2– | | Histidina N NH (his) \\ / C H

174.20

2.17

9.04

12.48 (guanidino)

155.16

1.82

9.17

6.00 (imidazolio)

De Cohn EJ, Edsall JT: Proteins, amino acids and peptides, New York, 1943, Reinhold Co. *El valor de pKa sea significativamente diferente en una molécula de proteína.

Tabla 53-2. Tipos de interacciones intramoleculares de cadenas laterales de grupos-R de proteínas Tipo de unión Covalente Disulfuro (cistina)

Lisinonorleucina(en colágeno)

Nocovalente Electrostática

Hidrógeno

Hidrofóbica

Van der Waals

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Esquemática*

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*Wavy line, Cadena polipeptídica.

Tabla 53-3. Funciones Biológicas de las proteínas. Función

Ejemplo

Transporte de moléculas pequeñas Receptores Catalíticas Estructurales Nutricionales (fuente de calorías y aminoácidos) Presión oncótica Defensa del huésped frente a antígenos externos Hormonas Coagulación

Transcortina (cortisol), tiroxina (GFT) Receptores de estriol (citoplasmático), receptor de insulina (superficie) Todas las enzimas Colágeno Albúmina Albúmina Anticuerpos (todas las clases) Hormona estimulante de tiroides (TSH) Fibrinógeno

Tabla 53-4. Clasificación de fosfátidos y glicolípidos.

Nombre Glicerofosfátidos Ácido fosfatídicos Lecitina Cefalina Inositido Plasmalógenos (acetal fosfátidos) Esfingolípidos Esfingomielinas Cerebrósidos

2156

Principales alcoholes

Diglicéridos (= diesteres de glicerol) Diglicérido (= diéteres de glicerol) Diglicéridos (= diesteres de glicerol) Diglicérido (= diesteres de glicerol) Éster de Glicerol y éter etílico

N-Acilesfingosina N-Acilesfingosina

Otros componentes alcohólicos

Colina Etanolamina, serina Inositol Etanolamina, colina

Colina Galactosa,*

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Sulfátidos Gangliósidos

glucosa* Galactosa* Hexosas,* hexosamina,* ácido neuramínico*

N-Acilesfingosina N-Acilesfingosina

* Estos componentes no están presentes como esteres fosfóricos pero sí en uniones glicosídicas; por esta razón, los cerebrósidos, sulfátidos, y gangliósidos se denominan glicolípidos.

Tabla 53-5. Ácidos grasos no saturados más comunes, números de doble uniones, y largo de la cadena carbonada.

Acido graso Palmitoleico Oleico Linoleico Linolenico Araquidónico

Número de doble uniones 1 1 2 3 4

Número de carbonos 16 18 1 18 20

Figuras

Figura. 53-1 Estructura general de aminoácidos de la forma estereoisomérica-L. Líneas gruesas, uniones que salen del plano de la pág.; líneas punteadas, uniones que se extienden hacia atrás del plano del papel.

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Figura 53-2 Varias formas ionizadas y noionizadas de aminoácidos presentes a diferentes niveles de pH. Cuando dos cargas opuestas se presentan en la misma molécula, la molécula se denomina zwitterion.

Figura 53-3 Esquema de síntesis de proteínas. AA, Amino ácido; DNA, ácido deoxiribonucleico; tRNA, ácido ribonucleico de transferencia; mRNA, ácido ribonucleico mensajero; rRNA, ácido ribonucleico ribosomal (formas 18S y 28S); tRNA-AA, aminoácido activado unido covalentemente a tRNA-aminoácido específico.

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Figura 53-4 Arreglo espacial de la unión peptídica. C, átomo de carbono; N, átomo de nitrógeno; H, atomo de hidrógeno; O, átomo de oxígeno. (De Orten JM, Neuhaus OW: Human biochemistry, ed 10, St. Louis, 1982, Mosby.)

Figura 53-5 Esquema de las tres distribuciones espaciales posibles de las cadenas polipeptídicas que definen la estructura secundaria de las proteínas.

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Figura 53-6 Esquema de la estructura terciaria de una proteína. Cilindros, -hélice; flechas planas, hojas -plegada; líneas, ovillo al azar de la estructura secundaria de lactato deshidrogenasa. (De Orten JM, Neuhaus OW: Human biochemistry, ed 10, St. Louis, 1982, Mosby.)

Figura 53-7 Estructura de la molécula de colesterol , un esterol hidrocarbonado C27. 2160

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Figura 53-8 Diferencias estructurales entre aldosas y cetosas, las cuales son respectivamente, aldehídos y cetonas.

Figura 53-9 Interrelaciones entre cadenas lineales y formas anulares de D-glucosa y D-fructosa, las cuales forman anillos de piranosa y furanosa. (De Orten JM, Neuhaus OW: Human biochemistry, ed 10, St. Louis, 1982, Mosby.)

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Figura 53-10 Estructura del ácido N-acetilneuramínico ("ácido siálico"). (De Orten JM, Neuhaus OW: Human biochemistry, ed 10, St. Louis, 1982, Mosby.)

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Figura 53-11 Disacáridos más comunes unidos por uniones b-glicosídicas. (De Orten JM, Neuhaus OW: Human biochemistry, ed 10, St. Louis, 1982, Mosby.)

CAPÍTULO 54

54. Enzimología Clínica David C.Hohnadel La naturaleza de las enzimas Composición y estructura Cofactores y apoenzimas Catalizadores Sitios reactivos Especificidad de reacción Estructura de subunidades Catabolismo y anabolismo Clasificación de las enzimas Códigos y nombres de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) Clasificación según la Comisión de Enzimas (EC) Abreviaturas no estándares Medición de enzimas Ensayos enzimáticos Principios de ensayos cinéticos Vmáx y Km Cálculo de la actividad enzimática Factores analíticos que afectan la medida enzimática pH Amortiguadores Cofactores Inhibidores y activadores Enzimas acoplantes Temperatura Definición de las condiciones de ensayo Enzimas como reactivos Almacenamiento de enzimas Medición de enzimas en la clínica Enzimas celulares versus enzimas extracelulares Las enzimas como marcadores tumorales Factores que afectan los valores de referencia

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Tiempo de muestreo Edad Sexo Raza Ejercicio Isoenzimas Nomenclatura Isoformas Significado clínico

OBJETIVOS Conocer la clasificación de las enzimas según la Unión Internacional de Bioquímica (ampliamente conocida bajo su abreviatura inglesa IUB, por “International Union of Biochemistry”)y el por qué del uso de otros nombres. Describir las diferencias entre apoenzimas, cofactores, holoenzimas. Enumerar los principales parámetros cinéticos usados para describir la actividad enzimática. Aprender a derivar la ecuación de Michaelis-Menten. Entender cómo el pH, amortiguadores, cofactores, y temperatura afectan los ensayos cinéticos. Describir como las variables preanalíticas influyen sobre los intervalos de referencia.

Términos clave activadores Son los iones inorgánicos llamados cofactores, que son requeridos para una reacción enzimática. actividad Es la cantidad de sustrato que se transforma en producto por unidad de tiempo y bajo condiciones definidas, para una reacción enzimática en particular. actividad específica Es la actividad enzimática expresada como unidades por miligramo de proteína. aminoácidos hidrofóbicos Son aminoácidos no polares, insolubles en agua. aminoácidos hidrofílicos Son aminoácidos polares, solubles en agua. apoenzima Es una enzima sin ningún cofactor ni grupo prostético asociado. catalizador Sustancia que aumenta la velocidad de una reacción sin experimentar cambios en su estructura química. cinética enzimática Es el estudio de la velocidad de una reacción enzimática y los factores que la afectan. cinética de primer orden Es un estado que se da cuando la velocidad de una reacción enzimática es proporcional a la concentración de sustrato. cinética de orden cero Estado que ocurre cuando la velocidad de una reacción enzimática es independiente de la concentración de sustrato. coenzimas Son cofactores orgánicos tales como el fosfato de piridoxal y el pirofosfato de tiamina. cofactores Son sustancias no proteicas asociadas con una enzima, necesarias para la actividad catalítica. complejo enzima-sustrato Es un complejo intermediario, activo, formado entre el sustrato y 2164

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la enzima durante la reacción. condiciones óptimas de ensayo Son las condiciones para la reacción en cuanto a la concentración de sustrato, cofactores, activadores y soluciones amortiguadoras que producen la máxima velocidad de catálisis enzimática. constante de equilibrio Es el cociente entre la concentración de producto y la concentración de sustrato cuando la reacción está en equilibrio. código EC Es el código de cuatro números de la Comisión de Enzimas para la clasificación sistemática de las reacciones enzimáticas. constante de Michaelis-Menten Es una constante que relaciona las constantes de velocidad de una reacción enzimática y que es igual a la concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad catalítica máxima. desnaturalización Es la pérdida de las propiedades biológicas de una proteína, usualmente como resultado de cambios en la estructura terciaria o cuaternaria. energía de activación Es la energía requerida en una reacción química para transformar los reactantes a especies en estado de transición o activadas que espontáneamente se transformarán en productos. ELISA Ensayo en el que una enzima está unida a un inmunoadsorbente. ensayos acoplados Son ensayos con varias reacciones enzimáticas que conducen a una reacción indicadora que posee una sustancia fácilmente cuantificable. ensayos cinéticos Son ensayos en los cuales se forman cantidades crecientes de producto con el tiempo, y que se monitorean a través de múltiples lecturas. enzima auxiliar Es una enzima que relaciona la enzima que está siendo medida con una enzima indicadora, en un sistema de reacciones acopladas. enzimas Son materiales biológicos (proteínas) con propiedades catalíticas. enzimas constitutivas Son enzimas que están siempre presentes durante la vida de una célula. enzimas indicadoras Enzimas que producen (o consumen) una sustancia fácilmente cuantificable. enzimas inducibles Enzimas cuya concentración celular aumenta en presencia de estímulos apropiados. enzimas lábiles Proteínas inestables o que se desnaturalizan fácilmente. endopeptidasas Son enzimas que hidrolizan proteínas mediante la ruptura de enlaces en el interior de un sustrato proteico. especificidad de unión Es la capacidad de la acción enzimática de producir la ruptura de sólo ciertas uniones entre átomos. especificidad enzimática Es el grado con que una enzima catalizará una o más reacciones enzimáticas. especificidad estereoisomérica Es la especificidad de una enzima por una de las formas de un par DL de compuestos que poseen un átomo de carbono asimétrico. estructura cuaternaria Es la relación estructural entre varias subunidades de una enzima. estructura primaria Es la secuencia de aminoácidos de una proteína. estructura secundaria de una enzima Es la secuencia de aminoácidos dentro de una relación estérica semifija en dos dimensiones. estructura terciaria de una enzima Es el plegamiento de las cadenas de aminoácidos en una estructura tridimensional 2165

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exopeptidasas Son enzimas que hidrolizan proteínas mediante la ruptura de uniones procediendo desde un extremo del sustrato proteico hacia el centro del mismo. fase de consumo de sustrato Es el período de tiempo en un ensayo enzimático en el cual la concentración de sustrato cae y el ensayo no sigue una cinética de orden cero. fase lineal Etapa en la que un ensayo sigue una cinética de orden cero generando una cantidad constante de producto por unidad de tiempo. grupos prostéticos Son cofactores que están tan estrechamente unidos que son considerados parte de la estructura de la enzima. holoenzimas Es el complejo completo enzima-cofactor que confiere máxima actividad catalítica. inactivación Es la desnaturalización reversible de la proteína. inhibidor competitivo Es un inhibidor de una reacción enzimática que compite con el sustrato por la unión en el sitio activo. inhibidor acompetitivo Es un inhibidor que se une sólo al complejo enzima-sustrato y no a la enzima libre. inhibidores Materiales que reducen la actividad catalítica de una enzima. inhibidor no competitivo Es un inhibidor que se une a un sitio alostérico de una enzima y no compite con el sustrato por su unión al sitio activo. isoenzimas Diferentes formas de una enzima que catalizan la misma reacción. katal (kat, k) Es una unidad enzimática en moles por segundo definidas por el sistema SI: 1 K = 6.0 x 107 U. Km Es el símbolo para referirse a la constante de Michaelis-Menten. metaloenzimas Enzimas que se encuentran unidas estrechamente a iones metálicos. período lag Es el intervalo de tiempo inicial en un ensayo, cuando ocurre la mezcla de reacción y comienza a establecerse el equilibrio cinético y de temperatura en un ensayo enzimático. reacciones de punto final Son reacciones en la cual se realiza una única medición a un tiempo fijo. reactivación Es la recuperación de las propiedades biológicas de una proteína luego de una pérdida temporal. Sistema Internacional de Unidades Es un sistema internacional de unidades para todo tipo de cantidades científicas; unidades SI. sistemas in vitro Son aquellos sistemas que se llevan a cabo en un tubo de ensayo, fuera de un organismo vivo. sitio catalítico Es otro nombre para designar el sitio activo. sitios activos Son las áreas específicas ubicadas en una enzima, donde el sustrato se une y donde ocurre la catálisis. sitios alostéricos o sitios regulatorios Son los sitios distintos al o a los sitios activos de una enzima que unen moléculas regulatorias y afectan la actividad de la enzima. sitios de unión Son sitios sobre la superficie de la enzima que sirven para unir el sustrato o el producto de la reacción. sitios regulatorios Ver sitios alostéricos subunidades Cadenas proteicas simples provenientes de enzimas formadas por dos o más cadenas peptídicas en su forma activa. 2166

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sustratos Materiales sobre los cuales actúan las enzimas. TIAE Es una técnica de inmunoanálisis amplificado por una enzima. unidad internacional de actividad enzimática Es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de una micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas; 1 U = 1,67 x.10-8 katal. velocidades iniciales Mediciones enzimáticas realizadas al comienzo de una reacción inmediatamente después del período lag. Vmáx Es la velocidad máxima de catálisis obtenida a partir de la variación de sustrato.

La Naturaliza de las Enzimas Las enzimas son materiales biológicos con propiedades catalíticas, es decir, que aumentan la velocidad de reacciones químicas en las células y en sistemas in vitro que de otra manera procederían muy lentamente. Son proteínas grandes con peso molecular usualmente entre13,000 y 500,000 daltones. El estudio de estas moléculas y los cambios en la actividad enzimática que ocurren en los líquidos corporales con el tiempo, son una herramienta diagnóstica valiosa para la elucidación de varios estados de enfermedad y pruebas de la función orgánica. Los diferentes tejidos o materiales celulares no contienen la misma cantidad o tipos de enzimas. Cientos de enzimas en cada célula están pegadas a sus membranas y paredes, otras están disueltas en el citoplasma o secuestradas en el núcleo y otros organelos subcelulares especializadas, incluyendo microsomas, mitocondrias y lisosomas. Frecuentemente la determinación de una o varias enzimas en plasma da un patrón de actividades que es indicativo del tejido o tipo celular del cual provienen estas enzimas. Diferentes células o diferentes compartimentos dentro de una misma célula pueden contener diferentes formas de una enzima que catalizan la misma reacción química. Los ensayos para esas diferentes formas a veces pueden realizarse para determinar el tejido o compartimento de los que proviene la enzima. Hay pocas enzimas que se encuentran en el plasma u otros fluidos extracelulares donde ellas parecen cumplir una función fisiológica, pero muchas enzimas catalizan reacciones dentro de la célula o en el lumen de varios órganos.

Composición y estructura Todas las enzimas son proteínas; es decir, son compuestos complejos de alto peso molecular; contienen cantidades de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, y azufre similares a las encontradas en otros materiales proteicos y la hidrólisis con ácidos fuertes produce una mezcla de aminoácidos y pequeños péptidos. Las enzimas se distinguen de otras proteínas por su acción catalítica. El comportamiento catalítico de una enzima depende de la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de la molécula proteica, lo cual es discutido en la pág.1042. Los cambios en la secuencia primaria de aminoácidos usualmente resultarán en diferentes estructuras tridimensionales, porque el plegamiento terciario y secundario será distinto. De la misma manera, los cambios en algunas de estas estructuras pueden afectar la actividad 2167

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enzimática de la proteína, usualmente reduciéndola o anulándola.

Apoenzimas y cofactores Una enzima puede tener sustancias no proteicas asociadas que le son necesarias para su actividad máxima. Estas sustancias, llamadas cofactores, pueden estar débil o fuertemente unidas a la porción proteica de la enzima. Los que están débilmente unidos pueden, a menudo, ser removidos por diálisis. Estos materiales pueden ser compuestos orgánicos tales como la forma oxidada de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) y el fosfato de piridoxal, los que se denominan coenzimas, o iones inorgánicos como el cloruro (Cl-) y el magnesio (Mg2+), que son llamados activadores. Aquellos cofactores, como la porción hemo de la peroxidasa, que están tan fuertemente unidos que son considerados parte de la estructura de la enzima son llamados grupos prostéticos. Las enzimas que tienen iones metálicos muy fuertemente unidos son llamadas metaloenzimas. Dos ejemplos de metaloenzimas son la ferroxidasa, también llamada ceruloplasmina, una enzima que contiene una cantidad relativamente grande de cobre unido fuertemente y la carbonato dehidratasa, también llamada anhidrasa carbónica, una enzima con una gran cantidad de zinc. El término coenzima es frecuentemente usado en forma inexacta para hacer referencia al compuesto NADH (o NADPH) en una reacción como es la reacción de lactato deshidrogenasa. LD +

Piruvato + NADH + H

L-Lactato

+ NAD+

En la reacción directa, tanto el piruvato como el NADH son sustratos para la reacción enzimática y el lactato y NAD+ son los productos. En este caso, piruvato y NADH reaccionan mol a mol. El NADH es llamado comúnmente coenzima ya que es una molécula orgánica no proteica necesaria para la actividad máxima; aunque debería ser llamado más correctamente segundo sustrato o cosustrato. Ya que es posible remover por diálisis los cofactores unidos débilmente a algunas enzimas y aún éstas pueden retener cierta actividad, una enzima sin los cofactores asociados se denomina apoenzima, y el complejo completo enzima-cofactor es llamado holoenzima. En el uso clínico de los ensayos enzimáticos, la mezcla de reacción enzimática debe contener un exceso de todos los cofactores y activadores para asegurar que la forma enzimática medida sea la holoenzima y no una mezcla de las formas de holoenzima y apoenzima.

Catalizadores Las enzimas funcionan como catalizadores biológicos. Son proteínas que tienen la propiedad de acelerar reacciones químicas específicas próximas al equilibrio sin ser consumidas en el proceso. El material con el que reacciona la enzima es llamado el sustrato; y una reacción enzimática simple para un sustrato y un producto es enumerado adelante: k+1 k+2

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(ES)

P + E Ec. 54-1

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En este caso, la enzima se representa por E; el sustrato sobre el cual actúa la enzima por S, el complejo enzima-sustrato por {ES}, y el producto de la reacción por P. Las constantes de velocidad de la reacción directa son representadas por k+1 y k+2, mientras que las constantes de velocidad de la reacción inversa están representadas por k-1 y k-2. Un ejemplo de la reacción de una enzima sobre un solo sustrato es la acción de la enzima ureasa sobre el sustrato urea; aunque en este caso son generados dos productos: k+1

H2N-CO-NH2 + E Urea

k+2

{Urea - E} k-1

2NH3 + CO2 + E

k-2 Amoniaco Bióxido de carbono

El agua también participa en la reacción pero no ha sido incluida por claridad. Estos catalizadores biológicos son similares a otros catalizadores químicos en muchos aspectos, excepto que funcionan en sistemas biológicos. Los catalizadores enzimáticos, aunque son inestables y se destruyen fácilmente, tienen propiedades catalíticas similares a las de otros catalizadores químicos. Éstas incluyen las siguientes: son efectivos en pequeñas concentraciones, no son modificados por la reacción, afectan la velocidad para alcanzar el equilibrio pero no cambian las concentraciones finales de los sustratos y productos en el equilibrio, y poseen un mayor grado de especificidad que los catalizadores químicos usuales para las reacciones que aceleran. La primera, es la propiedad principal que hace que las enzimas sean una valiosa herramienta diagnóstica. Como son efectivas en tan pequeñas cantidades, las mediciones de los cambios en la concentración de enzimas es una manera muy sensible de seguir los cambios que ocurren en varios tipos de tejidos. La cantidad de enzima involucrada en un ensayo enzimático es mucho menor que la cantidad de glucosa presente en un ensayo para glucosa. Un ensayo químico convencional para enzimas sería muy difícil de producir y requeriría grandes cantidades de muestra. De los varios de miles de enzimas presentes en plasma, la medición de la concentración de una sola enzima, aún cuando esté presente en un valor muy elevado, es menor que el límite detección para la mayoría de los ensayos químicos de proteínas. El parámetro más fácil de medir y que está biológicamente relacionado a muchas condiciones clínicas es la cantidad de actividad catalítica de la enzima y cómo cambia con el tiempo. La actividad de una enzima es la cantidad de sustrato para una reacción enzimática particular que es convertida a producto por unidad de tiempo bajo condiciones definidas (ver pág.1067). Para usar la actividad como una concentración se asume que un peso dado de enzima tiene un número fijo de unidades de actividad. Esto es, la actividad específica de la enzima, en unidades por miligramo de proteína, permanece constante, aún cuando el aumento de la actividad enzimática observado durante un desorden particular pueda provenir de un tejido distinto. Se considera que el aumento en la actividad enzimática ocurre debido a la presencia de 2169

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más enzima con la misma actividad específica; más que a la presencia de otras formas de la enzima con una diferente, y quizás mayor, actividad específica. En la práctica, las mediciones de la actividad enzimática son usadas como si fueran concentraciones de enzimas. Si la enzima estuviera actuando como un catalizador, no sería modificada por la reacción, pero debido a la naturaleza inestable de la mayoría de las enzimas, esta propiedad es difícil de demostrar. En muchos ensayos en uso corriente, es posible usar tiempos de análisis muy cortos con suficiente precisión para calcular la actividad enzimática en un primer período de un ensayo y, realizarlo nuevamente, luego de diez a quince minutos sin mostrar una disminución en la actividad enzimática. La cantidad de sustrato convertida a producto durante ese tiempo podría ser 5 % a 10 % de la cantidad presente inicial. Aún cuando la actividad enzimática determinada en los dos tiempos es la misma, se concluyó que la enzima no participa mol a mol con el sustrato y está actuando como un catalizador. Otra propiedad de los catalizadores biológicos es que aceleran la llegada al equilibrio pero no cambian la proporción final de S y P en el estado de equilibrio. Una forma de considerar este proceso es examinar el efecto de la lactato deshidrogenasa sobre la conversión de piruvato a lactato. En presencia de la enzima LD y la coenzima NADH, la conversión de piruvato a lactato ocurre rápidamente, pero sin la enzima el proceso es tan lento que apenas puede ser demostrado: LD +

Piruvato + NADH + H

Piruvato + NADH + H+ –––––

L-Lactato

+ NAD+

Reacción no cuantificable

Este no es un proceso de una sola dirección; en concentraciones de piruvato y lactato cercanas al equilibrio, la misma enzima convierte lactato a piruvato con la coenzima NAD+. La velocidad de reacción y las condiciones empleadas no son las mismas en ambas direcciones, aunque están relacionadas a la constante de equilibrio. Es posible medir la conversión en ambas direcciones, y los dos métodos son ampliamente usados para determinar la actividad de LD en el laboratorio clínico.

Sitios reactivos La variación de energía libre de Gibbs (- G) es la medida de la cantidad de trabajo que una reacción química puede producir. Todas las reacciones que se llevan a cabo desde reactivos a productos tienen una energía libre neta negativa (- G). Sin embargo, los reactivos no se convierten a productos directamente sino que deben absorber suficiente energía para pasar a través de un estado activado o de transición. Las enzimas disminuyen la energía requerida para la activación al estado de transición. Sin la enzima presente, aún con una energía libre negativa favorable, es decir, con productos que tienen un - G menor que la de los sustratos la reacción no puede proceder en grado apreciable (Fig. 54-1). Los reactivos deben ganar energía con el fin de superar esta barrera energética de activación para entrar al estado de transición (estado activado) y entonces convertirse en productos. Sin un catalizador presente, la reacción ocurriría únicamente si se adicionan calor o energía suficiente al sistema de reacción. Con un catalizador enzimático la 2170

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reacción puede proceder fácilmente a temperaturas fisiológicas normales. Redefiniendo la ecuación 54-1 para explicar el estado de transición en una reacción catalizada por enzimas, encontramos que: k+1

E+S

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{ES –– k-1

ES* ––

EP}

P+E

Ec. 54-2

k-2

donde ES* es la forma del estado de transición de los sustratos mientras que ES y EP son las formas enzima-sustrato y enzima-producto con materiales unidos pero no activados. Cuando las enzimas son usadas como catalizadores en los procesos, se encuentran reducciones sustanciales en los requerimientos de energía libre de activación. Por ejemplo, la energía libre de activación necesaria para la descomposición del peróxido de hidrógeno es 18,000 cal/mol; pero en presencia de la enzima catalasa la energía de activación es menor que 2,000 cal/mol. Uno de los problemas más difíciles que los enzimólogos tuvieron que enfrentar fue explicar cómo una enzima puede reducir la energía de activación y al mismo tiempo permanecer sin cambios por la reacción. La ecuación 54-2 muestra esquemáticamente una posibilidad general. Para un mejor entendimiento de los mecanismos de catálisis enzimática, uno necesita un examen de los detalles de la estructura de la enzima. Una amplia variedad de aminoácidos hidrofóbicos no polares e hidrofílicos polares están presentes en las proteínas enzimáticas. La superficie externa de la enzima, por razones de solubilidad, se cree que está compuesta de cadenas laterales de aminoácidos principalmente polares pero generalmente no reactivas. Las cadenas laterales de aminoácidos no reactivos pueden contener estructuras tales como grupos isopropilos y metilos (esto es, R-CH3 y R-CH3-CH3), encontrados en alanina y leucina. Algunas áreas de la superficie enzimática contienen aminoácidos con cadenas laterales reactivas como parte de sus estructuras. Las cadenas laterales de aminoácidos reactivos pueden contener grupos cargados tales como grupos aminos y carboxilos (que son RCOO- y RNH3+) encontrados en los ácidos glutámico y aspártico, o arginina y lisina. Las fracciones no cargadas como grupos sulfhidrilos e hidroxilos (que son ROH y RSH) encontrados en serina, tirosina y cisteína, son también reactivas. Existen otros tipos de grupos reactivos que están presentes en aminoácidos como histidina, los cuales tienen una estructura en anillo que presenta un nitrógeno activo. Los aminoácidos reactivos dentro de un sitio catalítico activo unen porciones de sustratos, productos, activadores, e inhibidores a través de uniones iónicas y de puentes de hidrógeno. Estas áreas reactivas de las enzimas deben estar sobre la superficie o pueden existir en muchas hendiduras ocultas en la superficie enzimática y pueden estar involucradas en los procesos catalíticos. Hay solamente un número limitado de lugares en la enzima donde puede llevarse a cabo la catálisis. Estas áreas específicas son llamados sitios activos o centros activos, y pueden involucrar únicamente 5 a 10 aminoácidos de un total de 200 a 300 en la enzima entera. El sitio activo, que tiene propiedades catalíticas, sirve para unir el sustrato en forma específica y de esa forma facilitar la formación y la ruptura de nuevas uniones. El sustrato está ubicado de manera tal que otros aminoácidos reactivos en el sitio activo causen la conversión de sustrato a producto. 2171

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Los sitios sobre la superficie de la enzima que unen el sustrato o el producto de la reacción son llamados sitios de unión. Las enzimas, particularmente aquellas de una estructura compleja compuesta de muchas subunidades, frecuentemente tienen estos sitios que están lejanos al sitio activo a lo largo de la secuencia aminoacídica primaria, pero que afectan la actividad enzimática. Estos sitios son llamados sitios regulatorios o alostéricos. Aunque uno esperaría gran diversidad entre los tipos de sitios catalíticos para que ocurran muchas clases de reacciones catalizadas por enzimas, se han observado algunas características comunes. El sustrato de la reacción se une al sitio activo y es orientado de manera que una unión particular sea sujeta al ataque (Fig. 54-2). Las mitades de las cadenas laterales reactivas de la enzima interaccionan con los grupos sobre los sustratos, por lo tanto, la unión covalente es alterada para comenzar su debilitamiento. Esta unión débil disminuye la energía de activación necesaria para la reacción química. La unión débil ahora conduce a una reacción química que rompe la unión covalente y permite que se formen nuevas uniones. En este punto, el producto ya no tiene la misma afinidad por el sitio activo que el sustrato original y será liberado de la enzima. Los cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína podrían producir distintas enzimas presumiblemente con sitios de unión y actividad diferentes, o aun proteínas similares sin actividad catalítica. Tales cambios, causados por mutaciones genéticas, frecuentemente son la causa de errores congénitos del metabolismo y otras enfermedades de origen genético (ver capítulo 47). Las reacciones químicas en las que participan estos aminoácidos reactivos no solamente definen la actividad catalítica específica de la enzima, sino que también determinan la sensibilidad de la enzima a pérdidas de actividad por factores tales como metales pesados, detergentes, o inclusive otras partes reactivas de la misma molécula proteica. Los metales pesados o detergentes pueden unirse a los grupos activos, inactivándolos. Los cambios en la tensión superficial y la agitación vigorosa, causan desnaturalización o desdoblamiento de la proteína. Consecuentemente, las relaciones espaciales de estos aminoácidos reactivos con el resto son destruidas, previniendo que se lleve a cabo la reacción normal.

Especificidad de reacción Se cree que las diferencias en la especificidad enzimática están relacionadas a diferencias físicas en el sitio activo. Algunas enzimas reaccionarán con algunos compuestos relacionados y se dice que tienen una amplia especificidad. La fosfatasa ácida es una de las enzimas que exhiben una amplia especificidad de unión porque hidrolizan muchos tipos de ésteres fosfato orgánicos como el glicerol fosfato, timolftaleína fosfato, para nitro fenil fosfato, -naftil fosfato. A un pH ácido, la reacción catalizada por la enzima es: Fosfatasa ácida

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P + H2O –––––––––

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+ Pi

Produce un fosfato inorgánico y un alcohol orgánico. Algunas enzimas que hidrolizan proteínas también exhiben una especificidad de unión 2172

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amplia, hidrolizando un gran número y variedad de uniones peptídicas dentro de un sustrato proteico. Si las uniones peptídicas del sustrato que son hidrolizadas están localizadas dentro de la proteína; la enzima es llamada endopeptidasa, como la pepsina A. Alternativamente, las carboxipeptidasas son enzimas que actúan sobre sustratos proteicos rompiendo uniones peptídicas, comenzando desde el carboxilo terminal del sustrato hacia el centro de la proteína. Estas enzimas son llamadas exopeptidasas y también exhiben una especificidad amplia por el sustrato. En contraste a la especificidad amplia de algunas peptidasas, otras enzimas son más específicas en su acción, ellas catalizan solamente una reacción definida con pocos sustratos. En casos extremos, se ha demostrado una especificidad casi absoluta cuando un único compuesto puede servir como sustrato, como el fosfoenol piruvato para la reacción de la piruvato cinasa. Fosfoenolpiruvato (PEP)

Piruvato (PIR)

PC

+

+

Adenosina difosfato (ADP)

Adenosina trifosfato (ATP)

La especificidad de una enzima debe ser descrita para cada sustrato involucrado en una reacción. En contraste a la especificidad absoluta mostrada por fosfoenolpiruvato en la reacción de la piruvato cinasa; varios nucleósidos difosfatos sintéticos, como UDP, IDP, GDP, y CDP servirán como aceptores de fosfato en la reacción, en lugar del ADP. Por lo tanto, aunque se muestra una especificidad absoluta para un sustrato (PEP), un grado de especificidad intermedia se presenta para el otro sustrato (ADP). Un grado intermedio de especificidad para cada sustrato se muestra para la reacción de la hexocinasa, en la que d-glucosa y varios otros azúcares pueden ser fosforilados como la d-manosa, 2-deoxi-d-glucosa y d-glucosamina. Sin embargo, la d-galactosa y los azúcares de cinco carbonos como la d-xilosa no son sustratos. La enzima puede también usar una variedad de nucleósidos trifosfatos como donadores de fosfatos, como ITP y GTP además del ATP. D-Glucosa +

Glucosa-6-fosfato HK + –––

Adenosina trifosfato Adenosina difosfato (ATP) (ADP) Muchas enzimas muestran una especificidad estereoisomérica por la forma l o la forma d de un par de compuestos. La hexocinasa es absolutamente específica para la forma d de la glucosa; la forma l no es sustrato. La malato deshidrogenasa actúa sólo sobre la forma l del malato, y no sobre la forma d. La lactato deshidrogenasa actúa sólo sobre el l-lactato y no sobre el d-lactato. Sin embargo, la especificidad estereoisomérica no necesariamente es el medio por el cual la enzima es absolutamente específica, ya que algunas formas de lactato deshidrogenasa actúan tanto sobre lactato como sobre hidroxibutirato y como se mencionó 2173

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anteriormente, la hexocinasa funciona con varios sustratos en su forma d.

Estructura de subunidades Algunas enzimas se encuentran en la naturaleza en varias formas, esto es, puede haber varios tipos de enzimas que catalizan la misma reacción. Estas se conocen como isoenzimas o isozimas. En unas pocas enzimas bien estudiadas, se encontró que las diferentes formas de isoenzimas aparecen porque las enzimas están compuestas por dos o más cadenas polipeptídicas distintas o subunidades que se unen en una forma activa. Las subunidades por sí solas no tiene las propiedades catalíticas de la enzima entera. Las isoenzimas pueden tener diferente cinética u otras propiedades físicas que permiten su diferenciación o cuantificación en una muestra. Se pueden encontrar otros tipos o clases de isoenzimas y son consideradas en la sección de isoenzimas (pág.1077), pero las formas más ampliamente usadas clínicamente son los tipos de subunidades de las isoenzimas. Se recomienda consultar el capítulo 55 para una mayor discusión de isoenzimas.

Anabolismo y catabolismo: Se considera que la síntesis de todas las enzimas ocurre por las vías de síntesis de proteínas intracelulares en los tejidos que contienen las enzimas. Las enzimas extracelulares como las involucradas en los procesos de coagulación son sintetizadas en hígado y vertidas al plasma. En algunos casos, otros órganos como riñón, pulmón, y páncreas también contribuyen al reservorio de enzimas extracelulares. El mayor tamaño y complejidad de la estructura enzimática resulta en formas moleculares que son algo inestables y, por lo tanto, lábiles. In vitro, muchas enzimas pierden su actividad catalítica con cambios relativamente leves de pH, temperatura, o aun en la concentración salina del medio que las rodea. Se presume que ocurren procesos similares intracelularmente y por consiguiente, aunque escasamente, ocurre síntesis de enzimas en un modo constante para mantener la cantidad requerida de enzimas intracelulares necesarias para el metabolismo intermediario. Una pérdida de actividad enzimática puede ser reversible y temporal, o irreversible y permanente. La desnaturalización es un proceso por el cual una proteína pierde sus propiedades biológicas; es decir, pierde su actividad enzimática. Se ha sugerido que el proceso de desnaturalización es un desplegamiento o "fusión" de las cadenas peptídicas fuertemente enrolladas dando lugar a una estructura más desorganizada. Muchos experimentos sustentan esta idea, incluyendo la reactividad aumentada de cadenas laterales; cambios en la viscosidad, y cambios en la formas de sedimentación de las soluciones de proteínas. La desnaturalización irreversible puede ocurrir cuando las cadenas de la proteína enzimática se despliegan y son incapaces de volver a plegarse a su forma biológicamente activa, o cuando un metal pesado (como mercurio o plomo) u otros materiales se unen fuertemente al sitio activo o próximos a él. Muchos otros factores y eventos pueden conducir a la desnaturalización y pérdida de actividad, incluyendo cambios en la temperatura, la adición de ácidos o bases fuertes; la exposición a alta presión, el tratamiento con rayos ultravioletas, operaciones repetidas de congelamiento y descongelamiento, y la adición de detergentes, o solventes orgánicos, o la presencia de altas concentraciones de urea o guanidina. 2174

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Una desnaturalización reversible, o pérdida de la actividad enzimática, es llamada inactivación. Por ejemplo, la inactivación puede ocurrir si una solución de enzima es dejada demasiado tiempo a temperatura ambiente y la enzima pierde actividad parcialmente. Esta pérdida de actividad temporal puede tener varias causas, incluyendo inestabilidad al calor con la ruptura de puentes de hidrógeno, u oxidación de grupos sulfhidrilos. En ambos casos, se pierde algo de la forma estructural natural. Con algunas enzimas, la disminución de la temperatura de la solución o la adición de agentes reductores sulfhidrilos como el ditiotreitol, puede permitir a la enzima replegarse a su forma activa original con la reconstitución de puentes de hidrógeno, o la reducción de grupos sulfhidrilos oxidados, y así producir una reactivación de la enzima y una recuperación de la actividad perdida. Se conoce poco acerca del mecanismo de remoción de las proteínas enzimáticas del compartimento extracelular. Probablemente las proteasas extracelulares hidrolizararían el material proteico, inactivando así a las enzimas que son liberadas de la célula. Las proteínas degradadas inactivas son luego removidas por una de las diversas rutas excretoras, como la excreción en bilis, en intestino, hígado, riñón, o sistema reticuloendotelial. En suma, es sabido que las enzimas tienen distintas vidas medias, indicando la presencia de varios mecanismos de remoción.

Clasificaión Enzimática Muchas enzimas fueron denominadas primero por su función (como lactato deshidrogenasa) pero algunas han sido denominadas por el tipo de sustrato sobre el que actúan: la ureasa hidroliza la urea, la lipasa hidroliza los lípidos y las fosfatasas actúan sobre los fosfatos inorgánicos. Muchas de las enzimas clínicamente importantes son aún conocidas por nombres triviales que surgieron de circunstancias históricas y que continuarán en la literatura debido a su simplicidad. Una convención sistemática para la nomenclatura de las enzimas fue desarrollada por la Comisión de Enzimas (EC) de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) y es ampliamente usada.

Nombres y códigos de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) La nomenclatura sistemática de la IUB describe la reacción catalizada. La IUB también reconoce que los nombres triviales son importantes y asigna a muchas enzimas nombres prácticos pero no abreviaturas. Para cada enzima individual, el sistema da un código EC numérico que consiste de cuatro números separados por puntos. El primer número asigna a la enzima una de las seis categorías de reacciones. El segundo número denota la subclase, que a menudo está basada en el tipo de grupo, como el grupo amino o grupo hidroxilo, que participa en la reacción. El tercer número indica las diferentes subclases de reacción, frecuentemente el grupo aceptor, y el cuarto número es simplemente el número de orden de esa enzima en particular en ese sub subgrupo. Para la enzima lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27), el primer número 1 indica que la enzima es una oxidorreductasa; el segundo número 1 indica que la enzima actúa en el grupo CH de los donadores; el tercer número 1, indica 2175

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que el aceptor es NAD+ o NADP+; y el cuarto número, 27 es simplemente el número de orden de la enzima en el grupo EC 1.1.1.x

Clasificación de la Comisión de Enzimas: Todas las enzimas son divididas en seis clases generales, dependiendo del tipo de reacción que catalizan. Algunas enzimas clínicamente importantes se enumeran en la Tabla 54-1 con el código EC y su nombre sistemático. La primer clase incluye las oxidorreductasas, aquellas enzimas que catalizan la transferencia de electrones o reacciones de oxidación–reducción, que pueden ser ilustradas esquemáticamente de la siguiente manera: Ared + Box

Aox + Bred

Un ejemplo de una enzima en esta categoría es la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27). Algunos nombres comunes de enzimas en esta categoría, incluyen: deshidrogenasas, reductasas, oxidasas y peroxidasas. El segundo grupo de enzimas contiene a las transferasas, enzimas que catalizan la transferencia de un grupo como un amino, carboxilo, glucosilo, metilo, o grupos fosforilos de una molécula a otra. Estas reacciones pueden ser esquemáticamente enumeradas así: A

+ B

A + B X

La alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.2) es un ejemplo de este grupo. Otras enzimas comunes en esta categoría incluyen cinasas y transcarboxilasas. Un tercer grupo incluye a las hidrolasas; que catalizan la ruptura de C , C N y algunas otras uniones con la adición de agua. Estas reacciones de hidrólisis pueden ser ilustradas como sigue: A

+ H2O

A OH + B H

Un ejemplo de este grupo es la fosfatasa ácida (EC3.1.1.3.2). Otras enzimas comunes en esta categoría son la amilasa, ureasa, pepsina, quimotripsina, y varias peptidasas y esterasas. Un cuarto grupo contiene a las liasas, que hidrolizan uniones C C, C O y C N por eliminación, con formación de un doble enlace, o catalizan la reacción inversa, es decir, la adición de un grupo al doble enlace. En los casos en los que la reacción inversa es importante se usa el término sintasa en el nombre. Este tipo de reacción se ilustra de la siguiente manera: A + B

AB (sintasa) o AB

A + B (liasa)

Un examen del listado de EC muestra que éstos y los grupos subsecuentes contienen relativamente pocas enzimas usadas en el diagnóstico clínico. El quinto grupo incluye las isomerasas, que catalizan cambios estructurales o geométricos en una molécula. También son llamadas epimerasas, isomerasas y mutasas 2176

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dependiendo del tipo de isomería involucrada. Esta reacción puede ser ilustrada como sigue: ABC

CAB

Un ejemplo de este grupo es la enzima glucosa fosfato isomerasa (EC 5.3.1.9). No es comúnmente usada en el diagnóstico. Un sexto y último grupo consiste en las ligasas o sintetasas. En esta reacción, dos moléculas son unidas, acopladas con la hidrólisis del pirofosfato en ATP. Muchas de estas enzimas están involucradas en la síntesis de proteínas, RNA y DNA; ninguna es usada corrientemente en el diagnóstico clínico. El tipo de reacción sintética es ilustrada de la siguiente manera: A + B + ATP

AB + ADP + Pi

Un ejemplo de esta reacción es la enzima glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2), la cual es raramente usada en la clínica.

Abreviaturas no estándares Una variedad de abreviaturas simples conteniendo cuatro o menos letras mayúsculas también son usadas para representar las enzimas que se miden rutinariamente. Estas abreviaturas son ampliamente usadas en la práctica pero no forman parte del sistema IUB. Son tan populares que se han vuelto de uso muy común y es muy difícil descartarlas. Estas abreviaturas son enumeradas en la Tabla 54-1.

Determinaciones Enzimáticas En la mayoría de los procedimientos enzimáticos las velocidades de reacción no son constantes con el tiempo. Mediante la observación de la variación de absorbancia para un producto o sustrato a una longitud de onda específica, se puede monitorear la reacción. Inicialmente, hay un período lag con muy poca variación de absorbancia por unidad de tiempo cuando los reactivos son mezclados y alcanzan el equilibrio cinético y térmico, luego una fase lineal donde el cambio de absorbancia por unidad de tiempo es constante, y finalmente una fase de agotamiento del sustrato con pequeños cambios de absorbancia por unidad de tiempo. Los ensayos enzimáticos deben ser realizados durante la fase lineal de cambios de absorbancia, donde se puede determinar una cantidad constante de actividad por período de tiempo (Fig. 54-3, A). Por consiguiente, las mediciones no comienzan al tiempo cero sino después que la fase lag ha ocurrido. Las mediciones pueden llevarse a cabo a cualquier tiempo durante la fase lineal y pueden continuar hasta la fase de agotamiento del sustrato. Si la actividad enzimática es demasiado elevada, el consumo de sustrato ocurrirá antes que las mediciones hayan sido completadas. En lugar de variar el tiempo de lectura, la forma más común de manejar estas muestras con elevada actividad es diluir a la mitad a una tercera parte con solución fisiológica o agua (Fig. 54-3, B). Sin embargo, no todas las enzimas 2177

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demuestran linealidad luego de la dilución, particularmente si éstas son activas en la interfase lípido/agua, como ocurre con la lipasa (EC 3.1.1.3), o si se encuentran presentes inhibidores en la muestra, como LD (EC 1.1.1.27) cuando es medida en orina. Uno de los métodos más convenientes para medir la actividad enzimática está basado en la medida de la absorbancia ya sea de los productos o de los sustratos. Existen algunos sistemas enzimáticos que involucran la conversión de NAD+ a su forma reducida NADH+, o viceversa. La forma reducida tiene mayor absorbancia a 340 nm que la oxidada, por lo que las reacciones que interconvierten una y otra forma pueden ser monitoreadas por la medición de la variación de absorbancia a esta longitud de onda. La diferencia entre los espectros de absorbancia de los compuestos oxidados y reducidos es mostrada en la Fig. 54-4.

Ensayos enzimáticos Las enzimas generalmente son medidas teniendo en cuenta sus propiedades catalíticas o inmunoquímicas. Los dos métodos más comúnmente empleados basados en las propiedades catalíticas, son el método de un punto a tiempo fijo, algunas veces llamado de punto final, y los ensayos a tiempo fijo de múltiples puntos, llamado método cinético. Los ensayos de punto final son usados todavía en algunos casos, pero en general se emplean períodos más cortos. En estos ensayos, una reacción es iniciada e incubada a una temperatura constante a un tiempo fijo, por ejemplo 30 minutos. La reacción entonces es detenida, normalmente por la adición de otro reactivo, y se mide la cantidad de producto. En este tipo de ensayos, se asume que se genera una cantidad constante de producto a lo largo del período del ensayo completo. Si la velocidad de reacción es seguida de manera continua o utilizando varios puntos, en función del tiempo, el ensayo se denomina ensayo cinético. Usualmente el tiempo de reacción es corto, es decir de unos pocos segundos a unos pocos minutos, y existe poco peligro de degradación enzimática. El término ensayo cinético es también usado para describir reacciones que forman cantidades crecientes de producto con el tiempo; las reacciones pueden ser monitoreadas como ensayos de punto final de un punto o ensayos de múltiples puntos (monitoreo continuo). Aunque la terminología de este método cinético no es estrictamente correcta, los ensayos de múltiples puntos o continuos son superiores a los de un solo punto, ya que es más fácil demostrar una linealidad aproximada de la reacción sobre el período entero de medición.

Principios de análisis cinéticos La cinética enzimática es el estudio de las velocidades de reacción de la enzima y los factores que la afectan. Inicialmente, se hicieron varios experimentos para examinar los efectos de distintas condiciones del ensayo sobre la medición de la actividad de la enzima. Finalmente, una serie de condiciones específicas son definidas para establecer la velocidad máxima de la actividad enzimática. La reacción enzimática general dada previamente para una reacción de un sólo sustrato puede ser cambiar ligeramente para las velocidades iniciales, como en la ecuación 54-3. En este caso, la cantidad de producto es muy pequeña y la reacción inversa de P combinándose con E para formar{ES}es ignorada, ya que se van a realizar las mediciones de 2178

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la velocidad inicial. La velocidad inicial, es la velocidad al comienzo de la reacción, después del período lag y durante la fase lineal en la Fig. 54-5A, pero antes de la formación sustancial de producto. k+1 E + S

{ES} ––

P + E

Ec. 54-3

k-1

Para una cantidad de enzima dada, la velocidad de actividad que se observa se incremente al aumentar la cantidad de sustrato, como se muestra en la Fig. 54-5. A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad depende linealmente de la cantidad de sustrato, es decir, es una reacción primer orden, pero a altas concentraciones de sustrato la velocidad es esencialmente independiente de la concentración de sustrato, o sea, es una reacción de orden cero. Una descripción matemática de la reacción podría explicar cómo la reacción puede ser de primer orden a baja concentración de sustrato y de orden cero a altas concentraciones de sustrato. Si la enzima tiene un número limitado de sitios activos, a bajas concentraciones de sustrato la velocidad será dependiente de la cantidad de sustrato presente, ya que habrá una gran concentración efectiva de sitios activos incompletos. Sin embargo, ya que el número total de sitios en la enzima es limitado y la cantidad de enzima es constante, entonces, cuando la cantidad de sustrato es incrementada, los sitios comenzarán a saturarse con sustrato hasta que la reacción será independiente de la concentración de sustrato. A estas concentraciones altas de sustrato todos los sitios activos de la enzima están llenos y la reacción procede a máxima velocidad. Pequeños cambios en la concentración de sustrato después de la saturación no afectarán la velocidad enzimática. La segunda etapa, la formación de producto, se considera como la etapa limitante de la velocidad o la que determina la actividad total. El equilibrio para la formación del complejo ES puede ser escrito como sigue con la concentración molar de todos las especies reactivas expresadas entre paréntesis: k+1 [ES] Keq = –––––– = –––––––– k+1 [E] [S]

La constante de equilibrio, Keq es igual al cociente de la constante de velocidad de la reacción directa sobre la constante de la reacción inversa. De la ecuación 54-3, la velocidad de formación del producto P es la cantidad de [ES] multiplicada por la velocidad k+2 a la cual el complejo enzimático es convertido a E+P. Por lo tanto, la velocidad de formación del producto es: Velocidad o tasa = [ES] x k+2

Ya que la velocidad es la cantidad de producto formado en un período de tiempo: P Velocidad = –––––– = [ES] x k+2 T

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y sustituyendo Keq[E][S] por [ES] y reordenando se obtiene: P = Keq x [S] x [E] x k+2 x T

La cantidad de producto formado es proporcional a la cantidad de enzima presente, el tiempo de ensayo, y la cantidad de sustrato presente. Cuando la constante de proporcionalidad es sustituida por las constantes de velocidad, la ecuación es: P = K1 x [S] x [E] x T

donde P es la cantidad de producto formado durante el tiempo de ensayo, [E] es la cantidad de enzima, [S] es la cantidad de sustrato, T es el tiempo de ensayo, y K1 es una constante de proporcionalidad. La actividad enzimática o velocidad de formación de producto con el tiempo, entonces está dada por: P Velocidad = –––––– = K1 x [S] x [E] T

Usualmente los ensayos enzimáticos son realizados a una alta concentración de sustrato por un período de tiempo lo suficientemente corto como para que la concentración de sustrato puede considerarse como constante. El valor de esta concentración constante de sustrato puede ser combinado con K1 para producir una segunda constante de proporcionalidad, K2, la cual es el producto de K1 por la concentración de sustrato. El cociente puede ser luego expresado para que sea solamente dependiente de la cantidad de enzima presente, eso es, una reacción de orden cero, independiente de la concentración de sustrato. P Velocidad = –––––– = K2 x [E] T

Esta tasa de reacción, o velocidad, generalmente es llamada v, o Vi, o V0, en la literatura referente a cinética enzimática.

Km y Vmáx La actividad enzimática, esto es, la tasa o velocidad, depende de la concentración de sustrato cuando la cantidad de sustrato es baja con relación a la cantidad de enzima presente en el ensayo. Esta relación para una reacción de un sólo sustrato se muestra gráficamente en la Fig. 54-5, con la misma concentración de enzima ensayada a varias concentraciones diferentes de sustrato. En un estado estable, antes de que esté presente demasiado producto, la velocidad de formación del complejo [ES] será igual a la velocidad de ruptura. Uno puede escribir esto 2180

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usando la siguiente ecuación. Formación | Ruptura k+1[E][S] = k-1 [ES] + k+2 [ES] Agrupando y reordenando los términos, uno puede remover las constantes de velocidad y una constante Km es definida. [ES] ––––––– = [E] [S]

k+2 + k+2 –––––––––– = Km k+1

Ec. 54-4

El cociente o velocidad de formación de producto, v, a un tiempo dado, y la concentración de enzima libre, [E], son descritas por: v = k+2 [ES] y [E] = [Et] - [ES]

donde [Et] es la cantidad total de enzima y [ES] es la cantidad acomplejada con sustrato. Cuando toda la enzima está presente en la forma de [ES] (esto es, a muy alta [S] en una reacción de orden cero), la velocidad máxima, Vmáx, es la siguiente: Vmáx = k+2 [Et] Combinando las tres ecuaciones anteriores, se obtiene: Vmáx [E] = ––––––– k+2

v Vmáx v ––––– = ––––––––– k+2 k+2

De la ecuación 54-4: Km [ES] [E] = ––––––––– [S]

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v [ES] = ––––– k+2

Entonces: Km [ES] Vmáx v [E] = ––––––––– = ––––––––– o [S] k+2

Km x v Vmáx v ––––––––– = ––––––––– k+2 [S] x k+2

Reordenando se obtiene: Km x v = (Vmáx

v) [S] o v (Km + [S]) = Vmáx [S]

Cuando esta ecuación es resuelta para v, da la ecuación de Michaelis-Menten, la cual es la 2181

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ecuación para la hipérbola rectangular mostrada en la Fig. 54-5A. Vmáx [S] v = –––––––––––– Km + [S]

[S] es la concentración de sustrato, v es la velocidad, Vmáx es la velocidad máxima de reacción cuando la enzima está saturada con el sustrato, y Km, la constante de Michaelis-Menten, es la concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima. A la alta concentración fija de sustrato encontrada en los ensayos usuales del laboratorio clínico, la velocidad, v, se aproxima a Vmax y es proporcional a la cantidad de enzima presente, ya que los demás factores son constantes. Se dice que a reacción es de orden cero con respecto al sustrato, es decir, es independiente de la concentración de sustrato. La condición común usada para ensayar actividad enzimática es una alta concentración de sustrato donde [S] Km o mayor. La velocidad a una concentración de sustrato de 10 x Km está dada por la siguiente ecuación: Vmáx(10 x Km) 10 x Km v = ––––––––––––––– = Vmáx –––––––––––– = 0.91 Vmáx Km + (10 x Km) 11 x Km

Por lo tanto, a [S] = 10 x Km la velocidad producida es mayor que el 90% de Vmax. Otra manera de analizar la ecuación de Michaelis-Menten es ver si es consistente con una cinética de primer orden a bajas concentraciones de sustrato y con una cinética de orden cero a una alta concentración de sustrato. A bajas concentraciones de sustrato donde [S]>Km, Vmáx [S] v = ––––––––––– Km + [S]

Vmáx [$] ––––––––––– = Vmáx [$]

se muestra que la velocidad (v) no depende de la concentración de sustrato. Como muestra la Fig. 54-5A. La relación de concentración de sustrato a la actividad enzimática es una curva que generalmente es similar a una hipérbola rectangular. Para reacciones enzimáticas de múltiples sustratos las cinéticas son más complejas. La presencia de 2182

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activadores e inhibidores actuando en sitios alostéricos o regulatorios tienden a hacer las curvas menos lineales debido a las cinéticas complejas. La determinación exacta de Km y Vmax para cada sustrato o activador de las curvas de Michaelis-Menten tal como se muestra en la Fig. 54-5A, es muy difícil, aun si las curvas son bastante lineales. Sin embargo, es necesario determinar esas constantes de manera que los ensayos puedan ser establecidos usando condiciones óptimas para medir correctamente la actividad enzimática. Si la curva es transformada en una línea recta, la Km y Vmax pueden ser determinadas con mayor exactitud. Uno puede transformar la ecuación de Michaelis-Menten matemáticamente y obtener la ecuación de una línea recta e interpolar usando estas ecuaciones transformadas. Las presentaciones gráficas comunes se muestran en la Fig. 54-6.

Cálculo de la actividad enzimática Los resultados de una determinación enzimática son expresados como unidades de actividad en términos de la cantidad de producto formado por unidad de tiempo bajo condiciones definidas para un volumen dado de muestra, el cual generalmente es suero. Por lo tanto, una unidad de actividad enzimática sería la cantidad de enzima que debería, bajo ciertas condiciones especificadas, causar la formación de 1 mg de producto, P, por minuto cuando 1 mL de muestra es usado. En procedimientos antiguos a menudo se usaban unidades arbitrarias similares. En 1961 la Comisión de Enzimas recomendó la adopción de una unidad internacional (UI) de actividad enzimática. La UI fue definida como la cantidad de enzima que podía convertir 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones estándares. 1 UI = 1 micromol/minuto

En aquellos casos donde una molécula de sustrato es transformada en dos o más moléculas de producto, la definición es por micromol de producto formado. Esta unidad ha sido ampliamente adoptada, y en algunos aspectos tiene unidades de ensayo estandarizadas. No se ha reducido el número de intervalos de referencia debido a que si las condiciones estándares cambian, la actividad aparente de la enzima cambia. Por ejemplo, si se usa un nuevo amortiguador en el ensayo, esto puede afectar la velocidad enzimática y producir un intervalo de referencia diferente. El Sistema Internacional de Unidades (SI), originalmente adoptado por la Organización Mundial de la Salud, estableció como unidad de actividad enzimática al katal (K). Éste es definido como 1 mol/seg de sustrato transformado. Esta unidad es demasiado grande para ser útil clínicamente, y tuvo poca aceptación en los Estados Unidos aunque fue recomendado por la EC en 1972. Para convertir unidades internacionales a katales: Micromol

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Por lo tanto, 1.0 UI = 16.7 nK (nanokatales). Solamente las unidades internacionales UI han sido ampliamente adoptadas por los trabajadores en el campo de la enzimología clínica. El katal no ha tenido una aceptación general. Los materiales enzimáticos humanos puros no son accesibles y por eso los ensayos enzimáticos no pueden ser estandarizados en cada laboratorio por calibración con materiales puros. Pueden usarse otros métodos de estandarización de los ensayos enzimáticos. El método alternativo que es usado más ampliamente depende de tener un espectrofotómetro calibrado apropiadamente. Muchos ensayos enzimáticos son seguidos por medidas espectrofotométricas realizadas a una determinada longitud de onda. Con un método espectrofotométrico generalmente uno asume que a 340 nm, el NADH tiene un coeficiente de absorción molar, , de A/(l x c) = 6.22 x 103 L · mol-1· cm-1

donde A es la absorbancia real de una solución, l es el paso de luz en centímetros a través de la solución, y c es la concentración en moles por litro de la sustancia absorbente (ver capítulo 4). En el caso se una trayectoria de 1 cm de paso de luz, se puede reordenar para c: c = A x 10-3/6.22 mol/L

Cuando la concentración está expresada en micromoles por litro en lugar de moles por litro, la expresión es: c =A x 103/6.22 µmol/L

A partir del cambio de absorbancia que fue medido y el volumen de solución usada, uno puede calcular realmente el número de micromoles de NADH formado o usado durante el período de medición de la enzima. c = A x 103/6.22 µmol/L

Por ejemplo, en la reacción de lactato deshidrogenasa, si se observa un cambio en la absorbancia de 0.06 a 340 nm en una cubeta de 1 cm y si se usó una muestra de 0.1 mL con un volumen total de ensayo de 3.0 mL, el cálculo de actividad sería el siguiente: 0.06 x 1000 µmol/mmol x 3.0 mL Unidades internacionales/L = ––––––––––––––––––––––––––––––––– = 289 UI/mL 6.22 mmol/L x 0.1 mL

Las dos unidades enzimáticas que han sido descritas expresan la actividad en términos de unidades por volumen de muestra. Esta es una unidad de medida particularmente conveniente en el laboratorio clínico cuando uno está ensayando enzimas en fluidos biológicos como suero o plasma. S i uno está midiendo una enzima que se encuentra en eritrocitos (GR) o en glóbulos blancos (GB), se necesitan otras unidades de medida. En el caso de enzimas de GR 2184

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y GB, la actividad enzimática puede ser expresada como unidades por 1010 células. En laboratorios bioquímicos donde la purificación de enzimas es importante, la actividad puede ser expresada como miligramos de proteína o como peso seco de células o como microgramos de DNA, pero éstas no son unidades convenientes para el laboratorio clínico.

Factores analíticos que afectan la medición de enzimas: La velocidad de las reacciones que involucran enzimas está fuertemente influenciada por la temperatura, pH, concentración de sustrato, y varios otros factores. Por consiguiente, todos los detalles de un procedimiento dado deberían ser seguidos exactamente para producir resultados precisos y exactos. Los ensayos de actividad enzimática deben ser llevados a cabo bajo condiciones óptimas de cinética de orden cero y de esta manera, la velocidad medida es dependiente sólo de la cantidad de enzima presente. Para optimizar un ensayo como la reacción de lactato deshidrogenasa dada anteriormente, se implementan una serie de reacciones con concentraciones crecientes de lactato pero con una alta concentración fija de NAD+ y una cantidad fija de enzima. Las actividades enzimáticas son luego medidas y se construye una gráfica similar a la de la Fig. 54-6. Luego se realiza una segunda serie de ensayos con cantidades crecientes de NAD+ pero con la concentración alta de lactato determinada en el primer experimento; esto es, [S] 10 Km para el lactato, y la misma cantidad de enzima presente. Las velocidades enzimáticas son determinadas nuevamente y se crea otra gráfica para determinar la Km para el NAD+. Este mismo tipo de experimento es llevado a cabo para cada parámetro de la mezcla de reacción (como iones metálicos, pH, amortiguador) hasta que todas las variables hayan sido evaluadas para la producción de máxima actividad enzimática. Las condiciones finales determinadas de este conjunto de experimentos serán las condiciones óptimas del ensayo. Los experimentos para determinar las condiciones óptimas de ensayo han sido llevados a cabo para las enzimas corrientes de importancia clínica; y los estuches diagnósticos son accesibles comercialmente con todos los materiales a las concentraciones usualmente óptimas.

pH Los cambios en el pH afectarán considerablemente la velocidad de reacción enzimática. La mayoría de las enzimas tienen un rango de pH definido en el cual la enzima es más activa. Un pH cercano al centro del rango es usualmente especificado para la determinación de una enzima particular. El pH óptimo es distinto para las diferentes enzimas. A valores de pH mayores o menores que el óptimo se observa una actividad reducida. En la Fig. 54-7 se muestra una curva característica de pH y actividad enzimática. Es una curva con forma de campana que muestra los cambios en la actividad enzimática con respecto al pH. A valores de pH diferentes al óptimo, la actividad enzimática puede estar afectada debido a cambios en la estructura de la enzima. Estos cambios pueden ocurrir en el sitio activo, o pueden resultar de cambios conformacionales que afectan la estructura 2185

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tridimensional. Como el sitio activo de la enzima a menudo contiene residuos de aminoácidos ionizables, como RCOO- o RNH3+; un cambio significativo en el pH puede conducir a la ganancia o pérdida de un protón. El resultado será un cambio sustancial en la carga superficial del sitio activo. El sitio activo podría, entonces, perder la capacidad de atraer un sustrato con carga opuesta. Una pérdida similar de actividad ocurrirá si el cambio en la carga fuera en la molécula del sustrato en lugar de la enzima. Un cambio de pH podría llevar a un desplegamiento de la enzima y pérdida de la actividad si el efecto de dicho cambio de pH rompiera los puentes de hidrógeno y otras fuerzas intramoleculares que mantienen a la enzima en una conformación activa.

Amortiguadores: En muchos casos, a medida que ocurre la reacción enzimática, se forman productos que tienden a alterar el pH. La mayoría de los ensayos incluyen un amortiguador para mantener el ensayo en el rango óptimo de pH. El amortiguador elegido debe tener un pKa dentro de una unidad de pH del pH óptimo de la enzima para ejercer un efectivo control. Los amortiguadores no sólo sirven para regular el pH de un ensayo, sino que también participan en la reacción. El ensayo de fosfatasa alcalina (FAL, EC 3.1.3.1) con p-nitrofenil fosfato como sustrato usa el amortiguador 2-amino-2-metil propanol (AMP) para mantener el pH a 10.2. La enzima hidroliza el sustrato en fosfato inorgánico y p-nitrofenol en un proceso de varias etapas; parte del cual involucra una fosforilación temporal de la enzima. La etapa final y limitante de la reacción incluye la hidrólisis del fosfato unido a la enzima para regenerar la enzima libre. A valores similares de pH, los amortiguadores que actúan como aceptores de fosfato en un proceso de transfosforilación con la enzima, producirán mayores actividades de fosfatasa alcalina que cuando se usan amortiguadores que no actúan como aceptores de fosfatos. Por esto, el amortiguador AMP produce mayores velocidades de actividad de fosfatasa alcalina que cuando se usa como amortiguador glicilglicina a pH=10.2, dado que el AMP es un aceptor de fosfatos. En el caso de los amortiguadores que no participan en la reacción, la concentración de amortiguador que produce máxima actividad enzimática al pH óptimo también debe ser determinada experimentalmente. Se ha encontrado que el amortiguador y ciertas sales puedan tener un efecto inusual en la Km. Cuando el cociente amortiguador/sustrato es muy grande; el amortiguador puede competir con el sustrato por la enzima haciendo parecer que la actividad enzimática está relacionada con la concentración de sustrato en forma no lineal. Esto se ha observado con el NADH en la reacción de LD. En este caso, el cociente molar amortiguador/sustrato es 104:1 y la velocidad de reacción es afectada por los amortiguadores Tris, fosfato, y NH4HCO3, además de ciertas sales como NaCl y (NH4)2SO4, que están a menudo en las enzimas auxiliares o acoplantes usadas para efectuar los ensayos. Esto parece no tener efecto a concentraciones de amortiguador menores que 0.05 moles/L; lo cual es consistente con varias recomendaciones para las condiciones óptimas del ensayo de LD. Parecería prudente mantener una concentración de amortiguador lo más baja posible sin comprometer la estabilidad del pH o la velocidad enzimática. 2186

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Cofactores: Muchas enzimas requieren un material no proteico, a menudo dializable, para su actividad máxima. Algunos de estos materiales están relacionados con ciertas estructuras de vitaminas. Por ejemplo, la tiamina o vitamina B1, puede ser convertida a pirofosfato de tiamina, un cofactor en muchas reacciones de descarboxilación. La niacina puede convertirse a nicotinamida adenina dinucleótido y la vitamina B12, rivoflavina, puede convertirse a flavina adenina dinucleótido. Ambos compuestos participan en muchas reacciones de deshidrogenación. La piridoxina, vitamina B6, es modificada a fosfato de piridoxal que es utilizada en muchas reacciones de transaminación. En los ensayos analíticos de actividad de transaminasas, el 5-fosfato de piridoxal es un ejemplo de un cofactor fuertemente unido que no es un sustrato. La concentración óptima de un cofactor es determinada de la misma forma que un sustrato; por eso las condiciones de ensayo pueden ser establecidas con una concentración de cofactor de aproximadamente 10 Km o mayor.

Activadores e inhibidores Muchas enzimas requieren iones para alcanzar su máxima actividad. Todas las enzimas que transfieren fosfato, como la hexocinasa, requieren iones magnesio (Mg2+). Otros iones metálicos activadores comunes son el manganeso (Mn2+), calcio (Ca2+), Zinc (Zn2+); hierro (Fe2+) y el potasio (K+). La amilasa requiere cloruro (Cl-) para su máxima actividad; y hay enzimas que requieren varios iones para desarrollar su actividad máxima, por ejemplo, la piruvato cinasa requiere magnesio (Mg2+) y potasio (K+). En cada caso, la concentración óptima del activador deberá ser determinada, tal como es determinada la concentración del sustrato. Los inhibidores son materiales que disminuyen la actividad catalítica de una enzima. Hay muchos tipos de inhibidores y varias clases de inhibición. Los inhibidores pueden actuar removiendo un activador por quelación; por ejemplo; Ca2+ y Mg2+ son removidos por EDTA u oxalato para causar la inhibición de la hexocinasa. También pueden actuar uniéndose al sitio activo para competir con el sustrato o por formación de un complejo en un sitio diferente, esto es, un sitio alostérico, lo cual afecta la actividad enzimática. Los inhibidores son clasificados en tres grupos principales. Los inhibidores competitivos se unen al sitio activo y compiten con el sustrato por los sitios de unión. Estos materiales muestran una inhibición reversible que a menudo puede reducirse usando una concentración de sustrato mayor.

La velocidad máxima de reacción no es afectada si hay suficiente sustrato debido a la reversibilidad de las reacciones. La unión del sustrato es afectada y por eso la Km aparente 2187

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será mayor aunque la Vmáx permanezca sin cambio. Los inhibidores no competitivos se unen a un sitio regulatorio o alostérico. Estos inhibidores no pueden revertirse por la adición de más sustrato, porque se unen en un lugar diferente de la superficie de la enzima.

Como el inhibidor no compite con el sustrato, la Km no estará afectada pero la cantidad de E o ES que convierte el sustrato a producto estará disminuído y consecuentemente la Vmáx será menor. Los inhibidores acompetitivos, un tercer grupo de inhibidores son aquellos que se unen al complejo enzima sustrato y no a la enzima libre. En este caso, a bajas concentraciones de sustrato, la adición de más sustrato aumenta la inhibición pues se produce más complejo enzima sustrato que reacciona con el inhibidor. El resultado de este tipo de inhibición es que la Vmáx disminuye y la Km aumenta.

El tipo de inhibición que una sustancia ejerce puede ser determinada cuando uno examina los resultados de los estudios cinéticos, con y sin inhibidores, usando una gráfica lineal de actividad enzimática como se muestra en la Fig. 54-8. Un breve resumen de los efectos de los tipos de inhibición se da en la Tabla 54-2. El tipo de inhibición puede ser clasificado por observación de los efectos cinéticos sobre la Vmáx y la Km.

Enzimas acoplantes Algunas reacciones enzimáticas de interés, como las de la alanina aminotransferasa (ALAT) y aspartato aminotransferasa (ASAT) no tienen sustratos ni forman productos que puedan ser monitoreados directamente. Uno debe acoplar la reacción enzimática inicial a una segunda reacción enzimática indicadora que, por ejemplo, incluya la conversión NAD+/NADH para hacer un ensayo conveniente. La reacción enzimática de la ASAT puede ser acoplada con la reacción de la malato deshidrogenasa (MD; EC 1.1.1.37). ASAT L-Aspartato

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Esto da la siguiente reacción neta: L-Aspartato

+ -Cetoglutarato + NADH + H+

Glutamato + L-Malato+ NAD+

En este caso, el sustrato para la segunda reacción, el oxaloacetato, es el producto de la primera reacción. El oxaloacetato de la reacción de ASAT y el cofactor NADH sirven como sustrato para la reacción de la malato deshidrogenasa. Este ensayo tendrá l-aspartato, -cetoglutarato, NADH y la enzima malato deshidrogenasa (MD) presente en gran exceso por lo que el factor limitante de la velocidad de reacción será la cantidad de ASAT en la muestra. Para otras enzimas, como la creatina cinasa (CC; EC 2.7.3.2), la medición de la primera enzima requiere una reacción enzimática auxiliar intermediaria y luego una enzima indicadora. En la medida de CC, la hexocinasa (EC 2.7.1.1) es usada como una enzima auxiliar y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49) es usada como enzima indicadora. Estas dos enzimas adicionales tendrán que estar presentes en gran exceso para medir correctamente la CC. Es difícil establecer ensayos óptimos que tengan más de dos reacciones acopladas debido al gran número de componentes en el sistema y a los problemas que conlleva la optimización de todos los componentes sin causar inhibición de la reacción limitante.

Temperatura No hay una temperatura óptima para los ensayos enzimáticos. La mayoría de las enzimas aumentan su actividad a medida que la temperatura se eleva por encima de un rango limitado de temperatura, como puede ser de 10° a 40° C; un ejemplo se muestra en la Fig. 54-9. Para minimizar cualquier pérdida de actividad debido a que la enzima no es determinada inmediatamente después de ser tomada la muestra, se deben conservar las muestras en refrigeración, a temperatura de 2° a 6° C; o en congelador (Tabla 54-3). Se ha encontrado en algunos casos que ciertas formas enzimáticas como la LD4 y LD5, resultaron ser más estables a temperatura ambiente que refrigeradas. El congelamiento y descongelamiento repetido de una muestra causará a menudo desnaturalización y pérdida de actividad enzimática. Por encima de 40 °C, la mayoría de las enzimas son rápidamente desnaturalizadas y pierden casi toda su actividad en poco tiempo. Una excepción a esta regla general es la amilasa, que parece ser más estable hasta alrededor de los 60° C antes de que ocurra una pérdida significativa de actividad. Para muchas enzimas, el cambio de un grado Celsius de temperatura producirá una variación del 10 % en la actividad. Se recomienda una tolerancia de 0.1 grados Celsius para el control de temperatura de un análisis enzimático, ya que esto producirá aproximadamente una variación de 1% en la actividad medida. Esta variación será lo suficientemente pequeña por lo que se puede considerar como una fuente de error insignificante en el trabajo clínico. Se ha sugerido una recomendación de 0.05 grados Celsius en el control de temperatura, el cual podría disminuir la variación en la actividad a 0.5 %. El aumento aparente en la actividad con el aumento de la temperatura significa que los ensayos sean realizados a temperaturas mayores, como 37° C; serán más sensibles a pequeños 2189

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cambios en la cantidad de enzima de la muestra. Las enzimas que se usan comúnmente en el diagnóstico clínico son menos estables a esta temperatura que a 25° ó a 30° C y, por eso, los ensayos llevados a cabo a 37° C deben ser realizados en tiempos relativamente cortos con el fin de minimizar la desnaturalización de la enzima. Los argumentos para el uso de temperaturas mayores, 37° C, y menores, 25° C se han presentado principalmente con base a un razonamiento científico y técnico. Un compromiso razonable parece ser la medición a 30° C, que es la recomendación de la Federación Internacional de Química Clínica (más ampliamente conocida bajo su abreviatura inglesa IFCC, por “International Federation of Clinical Chemistry”). En la actualidad, existe un estándar de galio muy exacto del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, que está accesible a todos los laboratorios. Este material tiene un plateau de temperatura de fusión de 29.772° C y puede usarse para calibrar o verificar la temperatura de trabajo de una amplia variedad de instrumentos.

Definición de las condiciones de ensayo Aunque se pueden establecer las condiciones óptimas para el ensayo de una enzima, está claro que no todas las determinaciones pueden llevarse a cabo óptimamente. A veces, las diferencias entre los ensayos no parecen significativas y aun así los resultados obtenidos serán sustancialmente distintos. El efecto entre los diversos componentes de un ensayo, y por lo tanto, el resultado, es todavía más significativo cuando se considera un ensayo acoplado. En estos ensayos no solamente tienen que considerarse las concentraciones de sustratos y activadores de la reacción primaria, sino también deben tener un exceso de enzimas indicadoras y auxiliares y de sus activadores asociados. La alanina aminotransferasa (ALAT) es frecuentemente medida en un ensayo que contiene un exceso de lactato deshidrogenasa y NADH, más l-alanina, alfa cetoglutarato y amortiguador. El estuche disponible comercialmente a menudo especifica que cerca de 500 U/L de LD están presentes como una enzima indicadora y, tal vez, la fuente animal de la cual proviene esta enzima. Esto no es suficiente para definir el ensayo completamente, debido a que la Km del piruvato varía con el tipo de isoenzima de LD. Se requerirán cerca de cuatro veces más unidades de M4-LD1 que si se usara H4-LD5 para obtener una velocidad de reacción equivalente. Una mezcla cruda de isoenzimas estará entre estos extremos. Aun sí las unidades de LD agregadas a diferentes ensayos comerciales fueran las mismas, la medida de las velocidades enzimáticas podrían variar con cada lote de un estuche sí la enzima indicadora fuera adicionada independientemente del contenido de la isoenzima. La misma clase de variabilidad ocurrirá entre estuches que contienen la misma concentración de sustratos, activadores, y unidades de LD, sí la enzima indicadora usada proviniera de una fuente diferente, como la bacteriana. Es por esta razón que el intervalo de referencia para cada ensayo enzimático deberá ser verificado por cada laboratorio, particularmente cuando se cambian los fabricantes que suministran los reactivos.

Enzimas como reactivos Es posible medir los niveles séricos del sustrato de muchas reacciones enzimáticas usando muchos de los principios de cinética enzimática aplicados de una manera ligeramente 2190

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diferente. La actividad enzimática a bajas concentraciones de sustrato es de primer orden, es decir, es lineal con respecto a la concentración de sustrato. Para medir la concentración de piruvato en una muestra, por ejemplo, se deberá preparar una mezcla de ensayo especial, con sólo una pequeña cantidad de la muestra agregada de manera que la cantidad de piruvato desconocida en el ensayo sea baja, esto es, menor que la Km. Se debe usar una mezcla de ensayo que contenga un exceso de LD, un exceso de la coenzima NADH, la cantidad de piruvato presente y un amortiguador. La reducción en la cantidad de NADH en este ensayo está relacionada con la cantidad de piruvato presente y el coeficiente de absorción milimolar de NADH a 340 nm. Alternativamente, podrían ser usados una serie de estándares de piruvato para calibrar el ensayo. Otros ensayos enzimáticos de naturaleza similar que son comúnmente usados en el laboratorio clínico incluyen la determinación de glucosa, urea, etanol, colesterol, triglicéridos y ácido úrico. Las enzimas son también usadas como indicadores para inmunoensayos.

Almacenamiento de las enzimas La mayor parte de las enzimas que son utilizadas clínicamente son estables a temperaturas de refrigerador de 2 a 3 días hasta cerca de una semana y a temperatura ambiente por un tiempo más corto. La Tabla 53-3 resume los datos para tres temperaturas. Varias enzimas merecen un comentario particular. La fosfatasa ácida es inestable a todas las temperaturas a menos que el pH del suero sea reducido cerca de 5 a 6 con citrato o acetato. La fosfatasa alcalina en suero humano muestra un aumento lineal en la actividad dependiendo de la temperatura y el tiempo. En 96 horas (4 días), y a temperatura ambiente, hay un 6% de incremento, a temperaturas refrigeradas aumenta un 4 %, y a -20° C aumenta un 1%. Las enzimas en materiales control no son usualmente de origen humano y son mucho más variadas, siendo algunas más estables y otras menos estables que en el suero humano. Las vidas medias biológicas observadas de varias enzimas humanas en plasma son dadas en la Tabla 54-4.

Medición Clínica de las Enzimas Pocas enzimas han sido usadas desde fines del siglo pasado para evaluar enfermedades crónicas, pero no fue sino hasta 1954 que LaDue, Wróblewski, y Karmen encontraron un aumento temporal en la actividad de aspartato aminotransferasa sérica luego de un infarto agudo de miocardio. Después de esto, la medición de cambios en la actividad enzimática plasmática ganó importancia como un medio de seguimiento del curso de una enfermedad o para mejorar el diagnóstico clínico. Muchos investigadores comenzaron a ver cambios en la actividad enzimática que fueron específicos para un estado de la enfermedad o reflejaban daño de un tejido en particular. Los cambios en la actividad enzimática plasmática o sérica son seguidos, ya que es sabido que las enzimas son principalmente constituyentes intracelulares que son liberados luego que el daño celular ha ocurrido en un órgano o tejido específico. Los cambios que ocurren con muchas enfermedades o en un órgano particular, a menudo pueden ser entendidos 2191

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mediante el examen del patrón de varias enzimas o cambios isoenzimáticos durante un período de horas o días.

Enzimas extracelulares versus enzimas celulares Las enzimas que se encuentran en plasma pueden ser clasificadas dentro de dos grandes grupos. Estas dos subdivisiones mayores están constituidas por las enzimas específicas de plasma y las enzimas no específicas de plasma. Las enzimas específicas de plasma son aquellas enzimas que tienen una función definida y específica en plasma. El plasma es su sitio normal de acción, y ellas están presentes en concentraciones más altas que en la mayoría de los tejidos. Entre éstas están las enzimas involucradas en la coagulación de la sangre, así como la ferroxidasa, seudocolinesterasa y lipoproteínlipasa. Estas enzimas son sintetizadas en el hígado y son constantemente liberadas al plasma para mantener una concentración constante. Estas enzimas son de interés clínico cuando su concentración disminuye en plasma y algunas han sido históricamente usadas como valoradoras de la función hepática. Las enzimas no específicas de plasma son aquellas enzimas con función desconocida en plasma. Las enzimas que no son específicas de plasma son aquellas enzimas que no tienen una función conocida en el plasma. Sus concentraciones en plasma usualmente son más bajas que en la mayoría de los tejidos, y puede haber una deficiencia en plasma de los activadores o cofactores que son necesarios para la actividad enzimática máxima. Estas enzimas pueden ser divididas además en: enzimas de secreción, y enzimas del metabolismo intermediario. Las enzimas de secreción son aquellas enzimas secretadas desde las glándulas exocrinas, esto es, el páncreas y próstata, y algunas enzimas provenientes de la mucosa gástrica y de los huesos. Las enzimas de este grupo son de importancia clínica cuando sus concentraciones son más altas o más bajas que el intervalo de referencia. Se encuentran valores elevados cuando la manera usual de excreción es bloqueada o cuando la cantidad de enzima producida está aumentada. Disminuciones en la cantidad de enzima son encontradas cuando el tejido que ordinariamente produce la enzima está dañado o necrótico. Ejemplos comunes de este grupo son amilasa, lipasa, y las fosfatasas ácida y alcalina. El otro grupo de importante enzimas no específicas de plasma son las enzimas del metabolismo. Las concentraciones de estas enzimas en los tejidos son muy altas, algunas veces miles de veces más altas que en el plasma. El daño celular que conduce a la pérdida o necrosis deja que una fracción pequeña de estas proteínas escape al plasma y cause un aumento marcado en la concentración usualmente observada. Algunos ejemplos comunes son creatina cinasa (CC), lactato deshidrogenasa (LD), alanina aminotransferasa (ALAT), y aspartato aminotransferasa (ASAT),

Enzimas como marcadores tumorales Frecuentemente, un exceso de proteínas específicas es liberado al plasma durante el crecimiento celular tumoral. En algunos casos, estas proteínas específicas son enzimas, como la fosfatasa ácida prostática (FAP), o creatina cinasa (CC) y pueden ser convenientemente medidas para monitorear la respuesta a la terapia y estimar la masa tumoral. 2192

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Factores que Afectan los Valores de Referencia Varios factores importantes afectan los valores de referencia para las determinaciones enzimáticas. Si estos factores no son tomados en cuenta en la interpretación de los resultados, es posible hacer un mal diagnóstico. En los siguientes tópicos se da un breve comentario sobre el problema y se muestra un ejemplo. Tiempo de muestreo Ya que las enzimas no experimentan ningún ritmo circadiano significante, el tiempo de muestreo con respecto al momento del día no es importante para la determinación de los valores de referencia para las enzimas. Por otro lado, el momento en el cual se tome la muestra con respecto al inicio de una condición clínica puede ser importante para la detección de una variedad de condiciones crónicas y agudas sí los cambios observados son suficientemente rápidos. Los tiempo típicos promedio reportados para la elevación máxima de una serie de enzimas en pacientes con un infarto de miocardio son los siguientes: CC-MB, 6 horas;CC, 18 horas, ASAT, 24 horas; y LD, 48 horas. No todos los pacientes siguen este patrón clásico, y se ha observado un margen de varias horas para los compuestos de interés que cambian rápidamente y de varios días para los compuestos que cambian más lentamente, cuando se examina una variedad de pacientes.

Edad Hay variaciones en las cantidades de enzimas usualmente presentes en suero, que son el resultado de las diferencias en edad entre varios subgrupos en la población. Hay tres edades principales a considerar como un factor para determinar un intervalo de referencia para un ensayo enzimático. Estas son: durante el primer año de vida, cuando varios órganos, como el hígado, están haciéndose funcionales, durante la pubertad, y en la última mitad de la vida, cuando ocurren cambios hormonales. Algunos de los cambios más dramáticos son observados con la enzima fosfatasa alcalina. Usando un método de fosfatasa alcalina con amortiguador AMP y sustrato paranitrofenil fosfato a 30° C, se encuentran los siguientes valores: 135 a 270 U/L para niños de 6 meses a 10 años de edad, 90 a 320 U/L para individuos de 10 a 18 años, y 40 a 100 U/L para adultos.

Sexo Con algunas enzimas se ven diferencias entre los intervalos de referencia para poblaciones masculinas y femeninas. Estas diferencias están probablemente más relacionadas a masa muscular, ejercicio, o concentración de hormonas. Un ejemplo de estos efectos se ve con la enzima creatina cinasa, donde se han reportado intervalos de referencia más altos para los hombres que para las mujeres, lo cual es más atribuible a un aumento en la masa muscular. La alcohol deshidrogenasa en mucosa gástrica también fue reportada más alta en los hombres que en las mujeres, permitiendo a los 2193

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hombres metabolizar el etanol más rápidamente. Por lo tanto, una carga de alcohol no afectará tanto a los hombres como a las mujeres.

Raza La raza también puede ser un factor en un número limitado de ensayos pero los datos son escasos. Se ha reportado que poblaciones negras tienen intervalos de referencia más altos comparados con poblaciones blancas para creatina cinasa, pero el efecto puede ser un resultado indirecto de varios factores además de la raza en las dos poblaciones.

Ejercicio El ejercicio y caminar son variables importantes en la consideración de intervalos de referencia para varias enzimas. Se ha encontrado que pacientes que han estado en reposo total por varios días tienen valores de CC en 20-30 % menores que en los pacientes ambulatorios. Cantidades normales de ejercicio también elevarán creatina cinasa. La creatina cinasa adicional causada por ejercicio normal es de tipo MM, tipo CC3. Así, la distinción entre estas elevaciones y aquellas causadas por un infarto agudo de miocardio, en el cual hay aumento de la CC tipo MB o CC2, se efectúa fácilmente por medio de la determinación del patrón isoenzimático o por medición directa de CC2. El aumento visto luego del ejercicio, usualmente desaparece después de 12 a 24 horas, a menos que el ejercicio sea muy extenuante. En corredores de maratón, que corren carreras mayores que 42 Km, la CC2 puede llegar a ser tres veces mayor que el intervalo de referencia y la CC total puede llegar a ser 40 veces mayor que lo usual. Aún cuando se determinen las isoenzimas de CC, puede ser difícil distinguir un corredor con dolor en el pecho de un corredor con dolor en el pecho e infarto de miocardio.

Isoenzimsa Nomenclatura Las múltiples formas de una enzima que catalizan la misma reacción en una única especie son conocidas como isoenzimas o isozimas. La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica, ha designado que este termino sólo se aplica a aquéllas formas de enzimas surgidas de diferencias determinadas genéticamente en la estructura de aminoácidos, aunque no hay un acuerdo completo sobre esta designación. Las isoenzimas se distinguen en base a su movilidad electroforética y la primer forma es la que tiene la movilidad más cercana al ánodo (+). Por ejemplo, la CC BB será llamada CC1; la CC MB como CC2 y la CC MM como CC3. Aunque existen en la literatura varios reportes que indican lo contrario, las isoenzimas no pueden ser designadas sobre la base de su distribución tisular (esto es, tipo corazón, tipo cerebro); pues se puede originar confusión como resultado de las diferencias en las formas predominantes encontradas en varias especies. La IUB ha definido tres grupos de múltiples formas enzimáticas como isoenzimas. Son agrupadas de la siguiente manera: proteínas genéticamente independientes como las formas citosólicas y mitocondriales de CC y malato deshidrogenasa; heteropolímeros de dos o más subunidades distintas como CC y LD; variantes genéticas en la estructura proteica, como 2194

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la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, con más de 50 variedades conocidas en el hombre. En unos pocos casos no usuales, una subunidad enzimática, como es el caso de la glutamato deshidrogenasa puede tener actividad catalítica por sí misma. En estos casos, la forma natural de la enzima tiene varias subunidades y tiene una actividad mayor que la suma de actividades de las subunidades por separado. Además, la forma de subunidad múltiple de una enzima a menudo tiene activadores e inhibidores que controlan más estrechamente la actividad enzimática. En este caso, existe una estructura biológica más compleja cuya actividad enzimática puede ser regulada más finamente. Las formas poliméricas de la glutamato deshidrogenasa y fosforilasa no son isoenzimas según la definición de la IUB, ya que son polímeros de una única subunidad y no difieren en la composición aminoacídica. Algunas formas adicionales de enzimas que no encuadran en la definición estricta de isoenzima son aquellas con variaciones en el peso molecular (o longitud). Estas formas pueden originarse por ruptura de diferentes segmentos de una proteína sin que afecten la actividad catalítica, por lo que se producen varias isoenzimas. La hexocinasa y la deshidratasa carbónica son ejemplos de este tipo de isoenzimas.

Isoformas Las isoenzimas que son liberadas del tejido (CC MM o CC MB) son una forma isoenzimática no modificada. Como parte del proceso de depuración normal del cuerpo, las carboxipeptidasas séricas rompen en la lisina terminal de la subunidad M de la CC y producen otras isoformas de la isoenzima con cargas ligeramente diferentes. La electroforesis de alta resolución o el enfoque isoeléctrico pueden usarse para demostrar la presencia de tres isoformas de CC MM y dos de CC MB, que se forman y desaparecen con el tiempo. Las isoformas de CC MM difieren solamente en que ninguna, una, o dos lisinas, han sido removidas de la subunidades CC-M. Las dos isoformas de CC MB son la CC MB intacta y la CC MB, cuya subunidad M ha perdido una lisina. Esto es de interés como posible marcador diagnóstico temprano de infarto agudo de miocardio. Ejemplos de isoformas de CC son dados en la Tabla 54-5. Una descripción más completa de isoenzimas se da en el capítulo 55.

Importancia clínica Creatina cinasa. La creatina cinasa (CC) se encuentra principalmente en tejido muscular. Aumentos significativos de CC ocurren en suero cuando el músculo esquéletico o el músculo cardíaco han sido dañados. Debido a que la isoenzima principal en músculo esquelético es la CC MM, los mayores aumentos en esta isoenzima en suero ocurren cuando el daño compromete al sistema esquelético (o por accidentes de autos). Por el contrario, hay cantidades significativas de CC MB y CC MM en músculo cardíaco y son liberados cuando el corazón es dañado por anoxia, cirugía, o infarto de miocardio. Se requiere el análisis isoenzimático para diferenciar el tejido fuente del incremento de CC que está presente, luego de la lesión del músculo esquelético o del miocardio. Si la isoenzima CC MM es la isoenzima predominante y la CC MB está presente en menos del 5%, se puede demostrar que un gran aumento de CC es debido al músculo esquelético. Los aumentos de CC MM sérica con una cantidad de CC MB 2195

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mayor al 5 %, generalmente ocurren cuando el corazón ha sido dañado. Existen algunos problemas de interpretación, ya que tanto el músculo esquelético como el tejido miocárdico tienen la isoenzima CC MB. La simple presencia de CC MB en suero no es suficiente para indicar un problema cardíaco. Por ejemplo, ciertas enfermedades musculares incluyendo la distrofia muscular de Duchenne, están asociadas con regeneración muscular, lo cual aumenta la cantidad de CC MB que está usualmente presente en músculo desde menos del 5 % hasta entre 5% y 15 %. El daño muscular producirá entonces un patrón en suero que es consistente con daño miocárdico, y no con daño de músculo esquelético. A veces la isoenzima CC BB es vista en muestras de pacientes. La presencia de esta isoenzima es más rara que el hallazgo de CC MB. Lactato deshidrogenasa La lactato deshidrogenasa (LD) está ampliamente distribuida en muchos tejidos. El corazón, sin embargo, contiene una distribución inusual de las isoenzimas de LD, con una concentración de LD1 mayor que de LD2. Este resultado de LD es similar al hallazgo de una distribución inusual de las isoenzimas de CC, en este tejido. La determinación combinada de las isoenzimas de LD y de CC es más útil que cada determinación por separado, ya que estos resultados tienden a sustentarse entre ellos mismos, pero en cierto grado son medidas independientes de daño cardíaco. Es importante el tiempo de muestreo luego de un evento. Para los eventos clínicos agudos como infartos de miocardio, la toma de varias muestras espaciadas en el tiempo es importante desde el punto de vista diagnóstico. Por este camino se obtiene más información, ya que el patrón de aparición de isoenzimas a varios tiempos en suero es importante. El tiempo promedio para la máxima elevación de una serie de enzimas e isoenzimas en pacientes con un infarto de miocardio se ha reportado como: CC MB, 6-12 horas; CC total 18-24 horas; y LD 48-72 horas. La LD1 parece ser menor que la LD2 en muestras tempranas, cuando la CC MB aumenta, pero cuando la concentración de LD total aumenta, tanto LD1 como LD2 aumentan en suero. Hay un momento en que el cociente LD1/LD2 se invierte y por lo tanto la concentración de LD1 es mayor que la de LD2. A medida que aumenta el tiempo después del evento clínico, la concentración de LD1 eventualmente vuelve a sus valores normales después de varios días, los cuales son menores que los de LD2. No todos los pacientes siguen el patrón clásico, y se observa un intervalo de dispersión de varias horas para los compuestos analizados que cambian rápidamente y de varios días para aquellos que cambian más lentamente.

Métodos de análisis Muchos métodos antiguos de análisis aprovechan la ventaja que proporcionan las ligeras diferencias en las propiedades físicas, o en la especificidad de sustrato, o en patrones de inhibición de algunas de las isoenzimas. En la actualidad, estos métodos son raramente usados. Los métodos comunes de análisis aprovechan la ventaja de las diferencias de migración en los campos eléctricos o están basados en diferencias inmunológicas en las subunidades de las isoenzimas. Estos métodos son revisados en el capítulo 55. El método de referencia para el análisis de las isoenzimas de CC y LD es la 2196

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electroforesis. Este método es en cierta medida dependiente de la técnica, pero generalmente es fácil y relativamente poco costoso. También son accesibles una gran variedad de métodos inmunológicos. Estos métodos han ganado popularidad debido a su facilidad de uso y a su sensibilidad. Algunos tienen poca especificidad, y son mucho más costosos que la electroforesis.

Bibliografía Bakerman P,Strausbauch P:Bakerman's ABC's of interprative laboratory data, ed 3, Myrtle beach, S.C.,1994, Interpretative Laboratory Data, Inc. Baron DN, Moss DW, Walker PG, Wilkinson JH: Revised list of abbreviations for names of enzymes of diagnostic importancce, J Clin Pathol 28:592-593, 1975. Bowers GN Jr, Inman SR:The gallium melting-point standard: its evaluation for temperature Measurements in the clinical laboratory, Clin Chem 23:733-737, 1977. Committee on Standards,Expert Panel of Enzymes: Provisional recommendation (1974) of IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of enzymes, Clin Chem 22:384-391, 1976. Enzyme nomenclature: recommendations on enzyme nomenclature of the Commission on Nomenclature and Classification of the Enzymes of the International Union of Biochemistry, New York,1979, Academic Press. Hohnadel DC: Clinical enzymology. In Tilton RC, Balows A, Hohnadel DC, Reiss RF: Clinical laboratory medicine, St Louis, 1992, Mosby. Kaplan LA, Pesce AJ, editors: Clinical chemistry: theory, analysis, and correlation, ed 2, St.Louis, 1989, Mosby, Chapters 52 and 53. Pappas NJ Jr,editor:Theoretical aspects of enzymes in diagnosis. Why do serum enzymes change in hepatic, myocardial, and other diseases? Clin Lab Med 9:595-626, 1989. Swaroop A : CK isoenzyme variants in electrophoresis, Lab Med, pp 305-310, May 1989. Wallach JB: Interpretation of diagnostic tests, ed 5, Boston, 1992, Little, Brown &Co. Wu AHB:Creatine kinase isoforms in ischemic heart-disease, Clin Chem 35: 7-13, 1989. Zilva JF,Pannall PR, Mayne PD: Clinical chemistry in diagnosis and treatment, ed 5,St. Louis, 1988, Mosby, Chapter 15.

Tablas Tabla 54-1. Ejemplos de nomenclatura enzimática. Código EC

Abreviatura*

Oxidoreductasas 1.1.1.27 Lactato deshidrogenasa

LD

1.1.1.37

Malato deshidrogenasa

MD

Isocitrato deshidrogenasa (NADP+)

ICD

1.1.1.42

2197

Nombre recomendado

Nombre sistemático

L-lactato:NAD+

Otro nombre

LDH

oxidorreductasa L-malato:NAD+

oxidorreductasa treo-Ds-isocitrato: NADP+ oxidorreductasa

MDH

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(decarboxilante) 1.1.1.49

Glucosa-6-fosGDP fato deshidrogenasa

D-glucosa-6-

1.4.1.2

Glutamato deshidrogenasa

L-Glutamato:NAD+

1.16.3.1

Ferroxidasa

Transferasas 2.1.3.3 Ornitina carbamailtransferasa

–

oxidorreductasa (deaminate) –

Hierro(II): Oxígeno oxidorreductasa

Ceruloplasmina

OCT

Carbamilfosfato:1- ornitina carbamailtransferasa

Ornitina carbamiltransferasa

GGT

(5-glutamil)péptido: aminoácido 5glutamiltransferasa

2.3.2.2

-Glutamiltransferasa

2.6.1.1

Aspartato ASAT aminotransferasa

L-aspartato:2-

Alanina ALAT aminotransferasa

L-alanina:2-

2.7.1.1

Hexocinasa

HC†

ATP:Dhexosa-6fosfotransferasa

–

2.7.1.40

Piruvato cinasa

PC

ATP: piruvato 2-Ofosfotransferasa

–

2.7.3.2

Creatina cinasa

CC

ATP:creatina Nfosfotransferasa

CPK

Hidrolasas 3.1.1.3 Triacilglicerol lipasa

LPS

Triacilglicerol acil hidrolasa

Lipasa

3.1.1.8

CHS

Acilcolina acil hidrolasa

Pseudocolinesterasa

2.6.1.2

2198

GLD

G-6-PDH, fosfato: NADP+ G-6-PDH 1-oxidorreductasa

Colinesterasa

oxoglutarato aminotransferasa

oxoglutarato aminotransferasa

–

Transaminasa glutámico oxalacético sérica SGOT

Transaminasa glutámico pirúvica sérica, SGPT

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3.1.3.1

Fosfatasa alcalina

FAL

Monoésterortofosfórico fosfohidrolasa (alcalina óptimo)

–

3.1.3.2

Fosfatasa ácida

FA

Monoésterortofosfórico fosfohidrolasa ácido optimo)

–

3.1.3.5

5'-Nucleotidasa

5'-Ribonucleótido fosfohidrolasa

–

3.2.1.1

3.4.11.1

-Amilasa

Liasa 4.1.2.13

4.2.1.24

Ligasas

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–

1,4- -D-glucan Diastasa glucano hidrolasa -Aminoacilpeptidohidrolasa (citosol)

Arilaminidasa (citosol), LAP, Leucina aminopeptidasa

No (clivaje preferido: Tir, Trp,Phe; Leu)

Quimotripsina A y B

No (clivaje preferido: Arg, Lys)

-y tripsina

Tripsina

TPS

Fructosa bifosfato aldolasa

ALS

D-fructosaAldolasa 1,6-bifosfato: D-gliceraldehido3-fosfato liasa

–

5-aminolevulinato hidrolasa

Porfobilinógeno sintasa

Isomerasas 5.3.1.1 Triosa fosfato isomerasa

5.3.1.9

AMS

Aminopeptidasa LAS‡ (citosol)

3.4.21.1. Quimotripsina

3.4.21.4

NT

TPI

Glucosa fosfato GPI isomerasa

D-gliceraldehído

-3- fosfato: cetoisomerasa D-glucosa-

6-fosfato: ceto-isomerasa

–

Triosa fosfato mutasa Fosfohexosa isomerasa

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6.3.1.2

Glutamina sintetasa

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l-glutamato: amonio ligasa (formando ADP)

–

*Baron DN et al: J Clin Pathol 24:656-657,1971 (ref 4) and Baron DN te al: J Clin Pathol 28:592-593, 1975 (ref. 5) no están recomendados por la Unión Internacional de Bioquímica pero son de uso común. †No están listados en las referencias 4 y 5 pero son de uso común en los laboratorios bioquímicos. ‡La referencia 5 lista incorrectamente (EC 3.4.11.2) la forma microsomal de esta enzima como "leucina aminopeptidasa"

Tabla 54-2. Efectos cinéticos de la inhibición Tipo de inhibición

Cambio en la Km

Competitiva No competitiva Acompetitiva

Aumenta No cambia Aumenta

Cambio en la Vmax No cambia Disminuye Disminuye

Tabla 54-3. Estabilidad de la enzima bajo varias condiciones de almacenamiento (menos de10% de cambio en la actividad).

Enzima

Temperatura ambiente Refrigeración (cerca de 25o C) (0o a 4o)

Aldolasa (ALS) 2 días Alanina aminotransferasa 2 días (SESgo, GPT) -amilasa(AMS) 1 mes Aspartato aminotransferasa 3 días (ASAT,GOT) Ferroxidasa I (ceeruloplasmina)1 día Colinesterasa (CHS) 1 semana Creatina cinasa (CC) 1 semana -Glutamiltransferasa (GGT) 2 días Isocitrato deshidrogenasa (ICD)1 día Lactato deshidrogenasa (LD) 1 semana Leucina aminopeptidasa (LAP)1 semana Lipasa (LPS) 1 semana Fosfatasa, ácida (ACP) 4 horas‡ Fosfatasa, alcalina (FAL) 2-3 días||

2200

Congelamiento (-25o)

2 días 5 días

Inestable* Inestable*

7 meses 1 semana

2 meses 1 mes

2 semanas 1 semana 1 semana 1 semana 2 días 1-3 días† 1 semana 3 semanas 3 días' 2-3 días

2semanas 1 semana 1 mes 1 mes 1 día 1-3días† 1 semana 3 semanas 3 días' 1 mes

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*Estas enzimas no toleran bien el descongelamiento. † Dependiendo del patrón de isoenzimas en el suero. ‡ Sin acidificar. ' Con agregado de citrato o acetato para llegar a pH -5. || Actividad puede aumentar.

Tabla 54-4. Vida media plasmáticas de enzimas clínicamente importantes.

Enzimas LD1 LD5 CC ASAT (GOT) SESgo (GPT) AMS LPS FAL GGT

Vida media (horas) (media +2 °C) 53-173 8-12 15 12-22 37-57 3-6 3-6 3-7 días 3-7 días

Tabla 54-5. Isoformas de CC. Isoforma

Subunidad

MM3 MM2 MM1 MB2 MB1

CC-MM CC-MM-L CC-M-LM-L CC-MB CC-M-LB

Comentario Isoenzima sin cambio Lisina terminal removida de una subunidad M Lisina terminal removida de ambas subunidades Isoenzima sin cambio Lisina terminal removida de la subunidad M

Las isoformas son numeradas con la misma convención que las isoenzimas, la banda con movilidad electroforética más rápida hacia el ánodo (+), es nombrada como la primera forma.

Figuras

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Figura 54-1 Diagrama de energía que muestra la reducción en la energía de activación GEA 95%) dentro del compartimento intracelular; CC-MM2 muestra una migración intermedia y se forma después que CC-MM3 se libera de la célula por ruptura de la lisina terminal de una de las dos subunidades M de CC-MM3; CC-MM1 migra más cercana al ánodo y resulta de la ruptura de la lisina terminal intacta restante de la subunidad M no modificada de CC-MM2.refs(2067) Un procesamiento enzimático similar de CC-MB ocurre para permitir la formación de CC-MB1 de la isoforma tisular CC-MB2.ref(2068)

Finalidad o Función Factores microambientales La importancia funcional de las isoenzimas y las isoformas sigue siendo una pregunta biológica intrigante que se ha sido abordada a través de estudio de células individuales mediante el estudio de la organización de las células en los tejidos y estudiando los procesos de desarrollo del organismo en su totalidad. El hecho de que las isoenzimas e isoformas estén compartamentalizadas dentro de los organelos celulares ha conducido a teorías que proponen una función para estos compuestos en las interacciones subcelulares y en procesos metabólicos específicos. Las diferentes cargas netas de las isoenzimas pueden influir en sus interacciones con otras moléculas cargadas dentro de la célula. Esto puede dar lugar a una ubicación diferencial lógica de isoenzimas específicas con respecto a los organelos especializados de la célula. Los factores microambientales también son importantes para la FAL. Todas las isoenzimas e isoformas de FAL se adhieren a las membranas celulares por una ancla de glicanfosfatidilinositol con un carboxilo terminal.ref(2069) Aunque se desconoce la función exacta de la FAL (ver ensayo de FAL, pág. 521), basado en la ubicación de la enzima se propone la hipótesis de que la FAL puede desempeñar una función relativamente no específica en varios procesos de transporte en que participan metabolitos defosforilantes, de ese modo 2213

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facilitan su entrada celular a través de la membrana celular selectivamente permeable.ref(2070) Además, en virtud de que las isoformas óseas de FAL en la membrana de células de los osteoblastos no son específicas para cualquier tejido, y debido a la asociación de esta FAL con la mineralización ósea, se ha sugerido que FAL funciona para promover la mineralización ósea a través de remover los inhibidores de la cristalización como el fosfato inorgánico. ref(2071) La evidencia en favor de esta teoría ha provenido principalmente de la hipofosfatasia, que se caracteriza por la deficiencia tanto de la enzima como de la mineralización.ref(2072)

Factores macroambientales También se ha observado la ubicación diferencial de las isoenzimas e isoformas en gran escala, o sea, dentro de diferentes tejidos. Por ejemplo, los tejidos como el corazón, cerebro y corteza renal muestran un predominio de LD1y LD2, mientras que otros tejidos como el músculo esquelético tienen un alto contenido de LD5. El tetrámero de cadenas H que constituyen LD1 tiene una afinidad por el piruvato que es diez veces menor que la afinidad de LD5, un tetrámero de cadenas M. Por lo tanto, LD1 cataliza preferentemente la conversión del lactato a piruvato. Se ha sugerido que debido a sus propiedades cinéticas la isoenzima LD1 predomina en los tejidos que reciben un suministro abundante de oxígeno, ya que estos tejidos experimentan metabolismo oxidativo y comúnmente no acumulan el lactato (o piruvato) porque pueden usar el lactato como combustible.ref(2073) La isoenzima LD5 es la forma principal de LD en el músculo esquelético, la cual es más dependiente de la glucólisis anaeróbica y acumula piruvato en condiciones anaeróbicas. Debido a que las células musculares tienen la isoenzima LD5, son más capaces de convertir el piruvato en lactato y regenerar NAD+, permitiendo que se lleven a cabo las reacciones productoras de energía de la vía Embden-Meyerhof (ver capítulo 32 para detalles adicionales). Por lo tanto se ha propuesto que la distribución de isoenzimas e isoformas en los tejidos se basa en las necesidades y las demandas metabólicas particulares que han evolucionado para diversos tejidos.

Factores del desarrollo Los cambios del desarrollo en el organismo se reflejan mediante un cambio en la distribución de las isoenzimas e isoformas para muchos tejidos como resultado de la activación y represión génicas diferenciales durante la ontogenia. Estos cambios en la distribución son indicativos de los extraordinarios cambios de la interacción del organismo con su ambiente. Durante el desarrollo fetal, el organismo debe optimizar las reacciones enzimáticas para adaptarse a los notables cambios en el metabolismo aeróbico intracelular. Esto se realiza a través de cambios importantes en la composición de isoenzimas tisulares por la activación de diferentes genes. Este proceso es muy similar al cambio de la forma fetal de la hemoglobina hacia la forma adulta (ver capítulo 36). Aunque las afinidades por oxígeno de la hemoglobina purificada fetal y adulta son muy similares, a concentraciones fisiológicas de 2,3-difosfoglicerato en la sangre, el tipo adulto de hemoglobina tiene menor afinidad por el oxígeno que la que tiene la forma fetal. La mayor afinidad de oxígeno de la hemoglobina fetal 2214

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permite una rápida transferencia del oxígeno de la hemoglobina materna a la circulación fetal. Por lo tanto diferentes hemoglobinas, al igual que ciertas isoenzimas e isoformas, satisfacen las diferentes necesidades biológicas del organismo en desarrollo. La evidencia bioquímica indica que la FAL intestinal fetal puede ser un heterodímero de la FAL placentaria y las subunidades intestinales que se encuentran en el adulto.ref(2074) Este patrón de expresión resulta probablemente porque, durante el desarrollo fetal, el gen placentario y el gen intestinal son coexpresados en enterocitos, dando lugar a la aparición de una isoenzima híbrida de la FAL. La cantidad de esta enzima híbrida se reduce hacia el término del embarazo como resultado de la expresión disminuida del gen placentario. Este patrón es similar al cambio ontológico en la expresión de las subunidades de CC en el músculo esquelético. Durante el inicio del desarrollo fetal sólo el gen de la subunidad B se expresa, permitiendo la formación del dímero CC-BB. Posteriormente, durante la diferenciación, hay un cambio hacia la expresión del gen de la subunidad M, dando lugar primero a la aparición transitoria del heterodímero CC-MB a medida que se expresan tanto la subunidad M como la B y después a la aparición del dímero CC-MM, el cual está presente casi exclusivamente al término de la gestación. Las isoenzimas de LD también muestran diferencias del desarrollo; los tejidos embrionarios no diferenciados muestran máxima actividad para las isoenzimas híbridas LD2, LD3 y LD4.ref(2075) A medida que los tejidos se diferencian, el patrón de LD cambia a fin de adaptarse a los requerimientos de producción de energía para las funciones específicas de los tejidos (ver anteriormente).

Distribición Tisular de los Isoenzimas Principales Aunque muchas enzimas existen como isoenzimas e isoformas, sólo unas cuantas tienen valor clínico confirmado. Esta sección se enfoca en las isoenzimas e isoformas de CC, LD, FAL y fosfatasa ácida (FA) porque son las principales enzimas de interés clínico. CC-MM es la isoenzima predominante de CC en el tejido muscular esquelético adulto, con sólo una concentración pequeña de CC-MB, que representa hasta 3% de la actividad total de CC en la mayoría del músculo esquelético. Sin embargo, la proporción de CC-MB puede alcanzar hasta un 10% en algunos tipos de músculos no cardíacos (ver pág. 602). A diferencia del músculo esquelético, el miocardio adulto contiene de 14% a 42% de CC-MB, siendo proporcionada la actividad restante por CC-MM. En el tejido cerebral, la isoenzima de CC que se expresa principalmente es CC-BB (Tabla 55-1). El corazón es el órgano más rico en la isoenzima LD1 (H4), mientras que LD5(M4) se encuentra predominantemente en hígado y en músculo esquelético.ref(2076) Los eritrocitos son ricos también en LD1. En el pulmón, predominan las isoenzimas LD2y la LD3 (Tabla 55-2). La forma FALIT de la fosfatasa alcalina (hígado/hueso/riñón) se expresa en prácticamente todos los tejidos. Una actividad alta se observa en particular en la mineralización del hueso donde la FAL está ubicada en la membrana plasmática de las células osteoblásticas. La FAL intestinal se expresa en la mucosa intestinal y es abundante en los bordes de cepillo de las células epiteliales. Recientemente, también se ha observado la expresión de esta enzima en el riñón donde se localiza principalmente en el segmento distal 2215

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(S3) del túbulo proximal.ref(2077) La FAL placentaria se vuelve detectable en el suero de mujeres embarazadas entre la decimosexta y vigésima semana del embarazo y desaparece en un lapso de 3 a 6 días después del parto. También está presente en cantidades relativamente pequeñas en pulmón y en cuello uterino. La FAL de células germinales de tipo placenta se ha encontrado en cantidades muy pequeñas, en el testículo y en el timo de individuos sanos. Al nacer, la FAL en suero parece provenir casi enteramente del hueso, siendo diferente del patrón observado en fetos cuyo suero contiene las formas fetales tanto ósea como la intestinal. El suero de los adultos contiene muchas isoenzimas e isoformas de FAL (Tabla 55-3), aunque las formas principales liberadas en el suero son las de hueso, hígado, riñón e intestinal.ref(2078) No se saben las razones de las diferencias que son características de la expresión de diversas isoenzimas e isoformas en diferentes tejidos y en diferentes células dentro del mismo tejido. La fosfatasa ácida, FA, es una enzima ubicua, localizada en los lisosomas de todas las células. Los eritrocitos, leucocitos, plaquetas y la glándula prostática tienen concentraciones particularmente altas de FA. Inmunológicamente, las isoenzimas de FA de los tres últimos tejidos enumerados están estrechamente relacionadas. La mayoría de la actividad de FA encontrada en el suero de individuos normales probablemente se deriva de los eritrocitos, mientras que en los hombres sólo una fracción pequeña se deriva de la glándula prostática (ver también pág. 992).

Cambios en el Patrón Isoenzimático Asociado a los Procesos Patológicos Los cambios en la proporción y concentración relativa de cada isoenzima o isoforma pueden producirse como resultado de una variedad de procesos patológicos. Por ejemplo, la actividad de LD en el tejido aórtico de adulto normal involucra principalmente a la fracción LD3,ref(2079) sin embargo, en el tejido aórtico ateroesclerótico, la actividad máxima de LD está presente como la fracción LD5. Asimismo, la actividad de LD miocárdica cambia predominantemente de LD1a LD3 durante la evolución de la cardiopatía isquémica.ref(2080) Hay una mayor expresión de la actividad de CC-MB en el tejido miocárdico isquémico comparada con la del miocardio de adulto normal. Las condiciones patológicas que dan lugar a la regeneración del tejido lesionado pueden causar cambios en la composición de isoenzimas que se asemejan al patrón observado durante el desarrollo embrionario. Por ejemplo, muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular de Duchenne, se caracterizan por la regeneración de fibras musculares que resulta de la destrucción de las fibras musculares adultas. Estas fibras musculares recién formadas e inmaduras pueden contener distribuciones de isoenzimas que son similares a aquellas observadas en el desarrollo temprano. Dado que CC-MB se expresa en el músculo esquelético fetal, esta isoenzima híbrida a menudo se identifica en la sangre de los pacientes con enfermedades musculares, que presentan regeneración muscular esquelética activa. Debe realizarse con cuidado la interpretación de las isoenzimas y las isoformas porque la isoenzima fetal de un tejido puede representar la forma de la isoenzima adulta de otro tejido. Por ejemplo, la isoenzima de CC-MB representa una proporción significativa de la actividad de CC tanto en el miocardio fetal como en el adulto, mientras que en el feto, CC-MB también 2216

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está presente en cantidades grandes en el músculo esquelético. Las cantidades aumentadas de la isoenzima CC-MB en los sueros de adultos normales probablemente representarían daño al corazón, mientras que los incrementos de CC-MB en los niños pueden ser ya sea de corazón o de músculo esquelético. Para una discusión más completa de los problemas interpretativos asociados con la presencia de CC-MB en sueros de pacientes, refiérase al capítulo 31. La desdiferenciación celular asociada con el desarrollo de neoplasias malignas también puede dar lugar a patrones alterados de las isoenzima e isoformas. Las isoenzimas y las isoformas asociadas con tumores a menudo se denominan marcadores tumorales oncofetales, porque su expresión es similar a aquella observada durante el desarrollo embrionario temprano. Por ejemplo, aunque CC-BB es la isoenzima predominante en todo el tejido embrionario temprano, la expresión de esta isoenzima en la mayoría de los tejidos adultos se asocia principalmente con el cerebro y algunos tejidos encontrados en los intestinos (ver Tabla 55-1). En los pacientes sin neoplasia maligna, la detección de CC-BB en el suero a menudo se asocia con una condición patológica que afecta a los sistemas nerviosos, pulmonares o del aparato digestivo.ref(2081) Sin embargo, durante el proceso de desdiferenciación celular, algunas células pueden expresar cantidades significativas de CC-BB, que pueden detectarse en el suero.ref(2082) Las isoenzimas de LD en el suero de los pacientes con neoplasias malignas linfoides son predominantemente la LD2, LD3, y la LD4.ref(2083) Un cambio hacia este patrón en el suero puede indicar la presencia de un mayor número de células linfoides como resultado de una proliferación maligna. Un cambio hacia la expresión de LD5 se observa en muchos tumores sólidos, especialmente en los carcinomas de los genitales o del aparato digestivo, mientras que en algunos tumores, como los que se originan en las células germinales, hay un cambio hacia la expresión de LD1. Se ha encontrado que los tumores humanos producen concentraciones mayores de las isoenzimas e isoformas placentaria (FAL-PL), intestinal (FAL-I), y de células germinales (FAL-CG) de FAL. Aparentemente los procesos malignos activan o amplifican la expresión de un gen de FAL que normalmente está reprimido o expresado a un nivel muy bajo. En los trastornos del hueso, la producción aumentada de enzimas da lugar a niveles elevados de FAL ósea debido a una mayor actividad osteoblástica. Los niveles séricos aumentados de FAL hepática en las enfermedades hepatobiliares son resultado probablemente de la lesión a los hepatocitos así como de la acumulación de los ácidos biliares como resultado de la colestasis. Una explicación para algunas de las isoformas alternativas de la FAL detectables en suero, especialmente en enfermedades hepatobiliares,ref(2084) es proporcionada por la presencia de la actividad de fosfolipasa D específica de inositol en suero y su aparente ausencia en la bilis. En la enfermedad hepatobiliar, se libera una FAL hidrofílica de los hepatocitos al suero por la acción de la fosfolipasa D sérica. Ya que esta fosfolipasa D está ausente en la bilis, se libera de los hepatocitos un agregado de alto peso molecular de FAL formando un componente denominado fracción rápida de hígado. Esta fracción entra en el suero donde su presencia se considera como una evidencia valiosa de enfermedad obstructiva hepáticas, en particular en la circulación extrahepática.

Importancia Clínica de Isoenzymes Específicas 2217

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Para que una enzima, isoenzima o isoforma sea clínicamente útil como un marcador de enfermedad, deben cumplirse varios criterios. Por ejemplo, el marcador debe tener una relación de concentración favorable de tejido con respecto plasma, y debe tener un tiempo de vida sustancial en la sangre. Estos criterios y otros se tratan aún más en el capítulo 54. Para propósitos prácticos, el suero y el plasma han sido los únicos especímenes clínicos examinados para marcadores de las isoenzimas e isoformas de anormalidades tisulares específicas. El recambio celular normal y las “fugas” características de las células vivas son responsables de las concentraciones basales séricas de las enzimas, isoenzimas, e isoformas en el suero. Estas concentraciones basales definen los intervalos de referencia del laboratorio. Las concentraciones de las enzimas, isoenzimas, e isoformas que están por arriba de estos intervalos de referencia se asocian con una variedad de anormalidades patológicas, que conducen a la destrucción celular y por lo tanto constituyen la base para la utilidad clínica de las determinaciones enzimáticas. El objetivo de la próxima sección es tratar los principales estados de enfermedad asociados con los niveles aumentados de las isoenzimas e isoformas y proporcionar una base para la interpretación de los valores anormales. La determinación de las isoenzimas e isoformas en otros fluidos corporales es poco común y se discute brevemente al concluir esta sección. Aunque se ha mostrado que las isoenzimas e isoformas son una herramienta importante para el diagnóstico de muchas afecciones, se debe desalentar la suposición de que las isoenzimas anormales se asocian solamente con un tejido particular.

Creatina cinasa Aunque las isoenzimas CC-MM, CC-MB y CC-BB son citoplásmicos, hay actividad de la creatina cinasa (CC) en otros compartimentos subcelulares, en particular en la mitocondria. El peso molecular de CC de 85,000 daltones impide su paso a través de la barrera hematoencefálica excepto en los casos de traumatismo grave; por consiguiente, los aumentos significativos en los niveles de CC sérica reflejan generalmente la liberación proveniente del músculo ya sea esquelético o cardíaco. Mediante la medición de las isoenzimas de CC, generalmente puede discriminarse la liberación del músculo esquelético de la liberación del músculo cardíaco. Al igual que la mayoría de los estudios de laboratorio, las complejidades en la liberación de enzimas y los diversos mecanismos de depuración requieren que la interpretación de las concentraciones sérica de enzimas o isoenzimas se realicen en el contexto de la situación clínica. A menudo, la combinación de múltiples marcadores séricos produce información que hace más práctica la interpretación de las concentraciones enzimáticas. Anteriormente, era necesario el uso combinado de las isoenzimas de LD y CC para producir la información necesaria que permitiera evaluar a los pacientes admitidos por diagnóstico de infarto miocárdico (IM). Sin embargo, el papel de CC-MB ha ido evolucionando hacia el establecimiento de un estándar para diagnosticar la mayoría de los casos de IM. La LD es un marcador tardío de IM que no está sustancialmente anormal sino hasta 18 a 24 horas después del suceso agudo. El análisis de isoenzimas de LD se vuelve útil cuando las muestras séricas están disponibles únicamente después de que han ocurrido los niveles máximos de la actividad de CC sérica (ver pág. 600). Existe un problema común de interpretación cuando la lesión muscular esquelética da lugar a una elevación significativa de la actividad de CC en el suero. Debido a que el músculo esquelético contiene concentraciones de CC ocho veces mayores por gramo de tejido húmedo 2218

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que las del tejido cardíaco, algunas áreas pequeñas de daño del músculo esquelético o de la enfermedad, pueden dar lugar a concentraciones séricas de CC-MB compatibles con daño sustancial al corazón. En los casos sin complicaciones, el uso del fraccionamiento de isoenzimas generalmente puede diferenciar la fuente de la elevada actividad de CC sérica, porque el músculo esquelético consiste generalmente de más de 97% de la isoenzima CC-MM. El cálculo de un índice relativo, en el cual la concentración de CC-MB es el numerador y CC total es el denominador, puede ayudar a dilucidar la fuente de CC-MB. Para los casos en los que se sospecha de daño tanto cardíaco como muscular, como en los casos de traumatismo o cirugía (ver adelante), la interpretación de los niveles de CC-MB es más difícil (ver adelante y en la pág. 602). Es importante señalar que una mayor proporción del contenido de CC-MB se asocia frecuentemente con regeneración de la fibra muscular. Por este motivo, ciertas enfermedades del músculo esquelético, como la distrofia muscular de Duchenne o la polimiositis, a menudo dan lugar a elevaciones séricas de CC total y a un aumento anormal de las concentraciones séricas de CC-MB, a menudo de hasta un 5% a un 15% de la actividad total de CC. Dado que la mayoría de los pacientes con estas enfermedades musculares no está siendo evaluado para el infarto miocárdico (IM), la interpretación errónea de estas elevaciones de CC-MB es infrecuente. Sin embargo, esta situación subestima la importancia de obtener información clínica apropiada para la interpretación correcta de los resultados de la isoenzima. Se pueden encontrar dificultades adicionales en la interpretación de la isoenzimas e isoformas de CC cuando uno está evaluando a los pacientes que se someten a cirugía de tórax o a alguna otra, en particular la cirugía del injerto de la derivación de la arteria coronaria. Puede esperarse que los procedimientos quirúrgicos que involucran el corazón causen la liberación de las enzimas e isoenzimas miocárdicas con concentraciones de isoenzimas que alcanzan niveles compatibles con un IM. En tales pacientes el médico clínico está preocupado frecuentemente por la condición perioperatoria del IM durante la cirugía o durante la recuperación. En estos casos, los resultados isoenzimáticos de CC son sumamente difíciles de interpretar. La experiencia ha llevado a muchos laboratorios a requerir múltiples muestras séricas para el análisis de las isoenzimas de CC durante el período de recuperación (4, 12, 24 y 48 horas, y 3, 5 y 7 días después de la operación). En una recuperación sin complicaciones los niveles de CC-MB regresan a la normalidad en un plazo de 24 horas o se reducen a niveles cercanos al normal. Cuando hay graves complicaciones que incluyen la extensión de la necrosis miocárdica o el reinfarto, los niveles de CC-MB continúan subiendo durante el período de recuperación o aumentan después de una disminución inicial. Existen más marcadores específicos de la lesión miocárdica, como la troponina-I o la troponina-T, que son promisorios para mejorar la capacidad para diagnosticar el IM perioperatorio.ref(2085) Información adicional sobre esta materia se encuentra en el capítulo 31. Las isoenzimas CC-MB y CC-MM pueden fraccionarse mediante electroforesis de alto voltaje en subtipos o isoformas que difieren en sus puntos isoeléctricos. La formación de isoformas parece desempeñar una función en la depuración normal de las isoenzimas CC-MM y CC-MB de plasma. De las cinco isoformas colectivas de CC-MM y CC MB, solamente MM3 y MB2se encuentran dentro del tejido; cuando son liberadas a la circulación se convierten irreversiblemente en sus isoformas (ver pág. 1079). Las isoformas de CC-MM se han usado para el diagnóstico precoz del infarto 2219

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miocárdico agudo (IM) y para monitorear el éxito de la terapia trombolítica, que puede disolver los coágulos que causa el IM.refs(2086) El patrón de las isoformas de CC-MM puede indicar que tan recientemente ha ocurrido liberación de la enzima del tejido. Poco después de la liberación, la isoforma CC-MM3 predomina en el suero; posteriormente, después de la ruptura enzimática de ambas lisinas terminales, la isoforma CC-MM1 es la más prevalente. Un cociente aumentado de las concentraciones MM3/MM1 indica una liberación reciente de CC-MM3 del tejido o su entrada reciente a la circulación sistémica; un cociente menor de las concentraciones MM 3/MM1 indica, ya sea que la liberación no ha ocurrido o que ha ocurrido mucho antes (ver el capítulo 31 para el detalle). Ocasionalmente las isoenzimas de CC se usan para evaluar tejidos diferentes al corazón o músculo. Por ejemplo, las concentraciones de CC-BB pueden elevarse en los sueros de pacientes con diversas condiciones, incluida las neoplasias malignas y los desórdenes prostáticos, pulmonares y neurológicos. Sin embargo, debe señalarse que aunque las elevaciones de CC-BB sérica pueden asociarse con estos estados de la enfermedad, los niveles de CC-BB tienen sensibilidad y especificidad deficientes para estas enfermedades, haciendo que tales mediciones sean útiles sólo ocasionalmente.

Fosfatasa ácida Aunque las isoenzimas de fosfatasa ácida (FA) se encuentran en una variedad de células incluidos los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, la isoenzima más frecuentemente medida en el laboratorio clínico es la fracción denotada como fosfatasa ácida prostática (FAP). El método de medición de la FAP afecta a la utilidad clínica de los resultados y se trata en el capítulo 49 en la pág. 992. Durante casi 40 años se ha visto que la FAP se eleva con frecuencia en los pacientes con estadios avanzados de cáncer prostático. Sin embargo, la FAP rara vez es útil para el diagnóstico de los estadios iniciales del cáncer de próstata porque la sensibilidad clínica de la FAP es baja y las concentraciones de la isoenzima son a menudo normales cuando un paciente tiene cáncer de próstata. Los resultados falsos positivos de la FA se asocian con hipertrofia prostática benigna en donde hay aumento en el crecimiento del tejido prostático no canceroso, que conducen a diversos problemas urológicos. Desafortunadamente, las personas con esta condición son con frecuencia los mismos pacientes que tienen un alto riesgo de cáncer de próstata. Otras elevaciones de falsos positivos se han observado en los pacientes con neoplasias malignas diferentes a las del cáncer prostático como la leucemia, y por consiguiente la interpretación de las concentraciones de isoenzimas depende de una información clínica adecuada. La función diagnóstica de la FAP se ha reemplazado en gran parte por la prueba del antígeno específico de próstata (AEP; ver el capítulo 49). No obstante, los niveles de la FAP todavía se consideran útiles cuando uno está monitoreando a los pacientes que reciben tratamiento para evaluar la carga tumoral, esto es, la cantidad relativa de tejido tumoral que está presente antes del tratamiento o la que permanece después del tratamiento. Otras situaciones clínicas en las cuales pueden solicitarse estudios de la isoenzima FA incluyen el diagnóstico de la enfermedad de Gaucher, un error congénito del metabolismo así como diversas leucemias en donde se puede medir la fosfatasa ácida (también denominada 2220

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fosfatasa alcalina leucocitaria). La FA total y la isoenzima prostática asociada con secreciones prostáticas se han usado en los casos de violación como evidencia legal del asalto sexual.

Fosfatasa alcalina El valor de la caracterización de las isoenzimas e isoformas de fosfatasa alcalina (FAL) en el suero como una ayuda diagnóstica, ha venido a ser mejor establecida a medida que están disponibles mejores métodos para diferenciar más apropiadamente las diversas formas de FAL. Con mayor frecuencia se solicita el fraccionamiento de FAL para determinar sí el hueso o el hígado es la fuente de un nivel elevado de la actividad total de FAL sérica. Las mediciones específicas de las isoenzimas e isoformas de FAL, en comparación con las mediciones totales de FAL, son al menos dos veces más sensibles para la evaluación de enfermedades hepáticas y óseas. Ha sido probado extensamente que la medición de isoformas hepáticas y del hueso es clínicamente útil para diagnosticar y vigilar ciertas enfermedades de estos tejidos. Se observan altos niveles de la isoforma ósea de FAL en varios trastornos óseos incluidas las enfermedades de Paget, osteosarcoma, hipertiroidismo, y quizás osteoporosis. Además, hay una mayor producción de FAL hepática en las enfermedades hepatobiliares. Las mediciones cuantitativas de la fracción de FAL "ósea" pueden ser importantes para monitorear a los pacientes con enfermedades óseas a fin de evaluar la respuesta del paciente a la terapia. La expresión aumentada de ciertos genes de FAL, principalmente las variantes de FAL placentaria así como las isoenzimas "Regan" y "Nagao", se asocian con tumores de células germinales. Estas isoenzimas de FAL se expresan predominantemente en los carcinomas hepatocelulares o cuando el hígado es el sitio de un tumor metastásico. Es interesante el hecho de que una cantidad significativa de FAL se expresa en algunas pero no todas las neoplasias malignas. Se desconocen todavía. las razones de por las qué sólo algunos tumores expresan cantidades significativas de FAL Anteriormente, las implicaciones prácticas del análisis de las isoenzimas e isoformas de FAL impedían su medición en muchos casos. Sin embargo, el uso de mejores métodos para medir FAL ósea para el monitoreo de las enfermedades de Paget, osteoporosis, y cáncer óseo puede aumentar el uso futuro del fraccionamiento de FAL.refs(2087)

Lactato Deshidrogenasa Aunque se han investigado ampliamente las isoenzimas de la lactato deshidrogenasa (LD), la utilidad clínica de estas isoenzimas está limitada principalmente al diagnóstico del infarto miocárdico (ver pág. 596), en parte porque la LD se encuentra en prácticamente todos los tejidos. Aunque hay alguna especificidad tisular relativa para las diversas isoenzimas, hay considerable traslape en la especificidad tisular de la isoenzima con las cinco formas isoenzimáticas comúnmente encontrada en el suero. Por ejemplo, aunque la isoenzima LD5 se usa con frecuencia para evaluar el daño al músculo esquelético, la LD5 también es la isoenzima predominante en el hígado. Una situación similar existe para cada una de las otras cuatro isoenzimas, que ha conducido a que la mayoría de los médicos clínicos dependan de otras 2221

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pruebas más específicas para la evaluación primaria de hígado, músculo, o corazón. Durante varias décadas se ha observado que hay un aumento de la isoenzima LD5 en los sueros de pacientes con diversos tipos de cáncer; sin embargo, la asociación de las isoenzimas de LD con tumores es un resultado no específico. Por lo tanto, el fraccionamiento de isoenzimas de LD es sumamente útil para el diagnóstico tardío del daño miocárdico y lesión muscular, y ocasionalmente para monitorear la evolución de ciertas neoplasias malignas.

Otras isoenzimas Son dignas de mención las isoenzimas e isoformas de la amilasa, aspartato aminotransferasa y aldolasa porque se ha reportado que tienen algunas aplicaciones clínicas. El fraccionamiento de estas y otras enzimas se realiza por pocos laboratorios ya que la utilidad clínica de estas isoenzimas e isoformas no está bien establecida. Fluidos corporales diferentes del suero Algunos informes indican que el fraccionamiento isoenzimática de varias enzimas tiene importancia en el líquido cefalorraquídeo, derrames pleurales, orina y otros fluidos. La finalidad principal de los estudios de las isoenzimas e isoformas en las efusiones, es generalmente poder determinar la fuente del fluido corporal. Estos fluidos se examinan rara vez para la determinación cuantitativa de isoenzimas, y los métodos para el fraccionamiento de las isoenzimas de fluidos son ocasionalmente muy diferentes de aquellos usados para el suero. Dado que existen escasos datos, los laboratorios que participan en el análisis de estos fluidos determinan en general sus propios lineamientos para la consulta e interpretación clínica. Debe ser desalentada la comparación de los resultados con los intervalos de referencia en el suero.

Modalidades del Análisis de Isoenzimas La mayoría de las diferencias físicas y catalíticas entre las isoenzimas e isoformas individuales han sido utilizadas para determinar las concentraciones de isoenzimas en el suero (Tabla 55-4). Todos estos métodos dependen de las diferencias en las modificaciones postraduccionales de las subunidades polipeptídicas individuales, las cuales imparten variaciones detectables a la molécula de interés. Los métodos más sofisticados que usan inmunoensayos específicos pueden diferenciar entre las isoenzimas y las isoformas basados en las diferencias inmunológicas de las cadenas de la subunidad. Actualmente es raro el uso de las tasas catalíticas y de afinidad del sustrato para diferenciar entre las isoenzimas de CC. De igual manera, el uso de alfa-hidroxibutirato como un sustrato "específico" para la medición de la actividad de LD1 se considera ahora un método inadecuado y poco eficaz. Aunque los métodos que usan sustratos específicos para la medición de FA, como el fosfato de alfa-naftilo, todavía se usan para discriminar entre la FAP y otras formas de FA, los métodos que usan L-tartrato para inhibir la actividad de FAP están siendo reemplazados con los inmunoensayos. Los métodos de termoestabilidad, inhibición catalítica, y precipitación de lectina de trigo germinal para la diferenciación de las isoenzimas y 2222

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las isoformas con actividad de fosfatasa alcalina, también se usan ocasionalmente para el análisis clínico corriente. Las técnicas electroforéticas para fraccionar CC han sido consideradas históricamente como los métodos de "referencia" para el análisis de CC-MB. Sin embargo, el uso generalizado de las técnicas de inmunoensayo para la medición de CC-MB que tienen mayor sensibilidad analítica han hecho un anacronismo el uso de la electroforesis como el estándar para la medición de CC-MB. La medición de las isoformas de CC-MM y CC-MB se hace después del fraccionamiento por electroforesis de alto voltaje. Los intentos destinados a desarrollar inmunoensayos para la medición de las diversas isoformas de CC han tenido poco éxito.refs(2088) También se han desarrollado métodos electroforéticos para la separación y cuantificación de la amilasa, FAL, FA, y otras isoenzimas e isoformas. Los métodos electroforéticos separan las formas óseas y hepáticas de FAL en la medida en que la técnica permite un estimado visual de sus proporciones relativas; la cuantificación por barrido densitométrico es posible solamente después del tratamiento con neuraminidasa. Los métodos electroforéticos se basan en las diferencias de la carga neta de cada forma (ver capítulo 10). Los métodos electroforéticos han sido populares porque proporcionan un registro visual de los resultados y son relativamente fáciles de usar. Los inmunoensayos más recientes se basan en los anticuerpos monoclonales derivados contra sitios específicos de reconocimiento (epítopes) en la molécula de la isoenzima o isoforma. El análisis isoenzimático basado en diferencias inmunológicas entre las isoenzimas y las isoformas se ha convertido en una técnica importante y generalizada. Los métodos de inmunoensayo incluyen técnicas competitivas e immunométricas de sándwich (ver capítulos 12 y 13) y técnicas de inmunoinhibición. El inmunoensayo y los ensayos inmunométricos de "sandwich" de fase sólida están comercialmente disponibles para la medición de CC-MB, FAL ósea y FAP. Para mayor información sobre el análisis isoenzimático de las isoenzimas más comúnmente analizadas, refiérase a las tecnologías individuales enumeradas en la Tabla 55-4.

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9. Moss DW: Alkaline phosphatase isoenzymes, Clin Chem 28:2007-2016, 1982. 10. Moss DW, Whitaker KB: Modification of alkaline phosphatases by treatment with glycosidases, Enzyme 34:212-216, 1985. 11. Perryman MB, Knell JD, Roberts R: Carboxypeptidase-catalyzed hydrolysis of C-terminal lysine: mechanism for in vivo production of multiple forms of creatine kinase in plasma, Clin Chem 30:662-664, 1984. 12. Fishman WH: Alkaline phosphatase isoenzymes: recent progress, Clin Biochem 23:99-104, 1990. 13. Russell RGG: Excretion of inorganic pyrophosphate in hypophosphatasia, Lancet 2:461-464, 1965. 14. Cahn RD, Kaplan NO, Levine L, Zwilling E: Nature and development of lactic dehydrogenases, Science 136:962-969, 1962. 15. Behrens CM, Enns CA, Sussman HH: Characterization of human foetal intestinal alkaline phosphatase: comparison with the isoenzymes from the adult intestine and human tumor cell lines, Biochem J 211:553-558, 1983. 16. Wilhelm A: Topochemical variation of LDH and CK isoenzyme patterns in aorta, Artery 8:362-367, 1980. 17. Pfleiderer G et al: Tissue enzymes in phylogenetic and ontogenetic development. In Schmidt E et al, editors: Advances in clinical enzymology, Hannover, West Germany, 1979, S Karger AG. 18. Verpooten GF, Nouwen EJ, Hoylaerts MF, et al: Segment specific localization of intestinal-type alkaline phosphatase in human kidney, Kidney Int 36:617-625, 1989. 19. Bowers GN, McComb RB, Statland BE, et al: Measurement of total alkaline phosphatase activity in human serum (selected method), Clin Chem 21:1988-1995, 1975. 20. Lang H, Wurzburg U: Creatine kinase, an enzyme of many forms, Clin Chem 28:1439-1447, 1982. 21. Schapira F: Isoenzymes and cancer, Adv Cancer Res 18:77-153, 1973. 22. Raymond F, Datta H, Moss D: Alkaline phosphatase isoforms in bile and serum and their generation from cells in vitro, Biochim Biophys Acta 1074:217-222, 1991. 23. Adams JE, Sicard GA, Allen BT, et al: Diagnosis of perioperative myocardial infarction with measurement of cardiac troponin I, N Engl J Med 330:670-674, 1994. 24. Mair J, Dienstl F, Puschendorf B: Cardiac troponin T in the diagnosis of myocardial injury, Crit Rev Clin Sci 29:31-57, 1992. 25. Christenson RH, Ohman EM, Clemmenson P, et al: Characteristics of creatine kinase-MB and the MB isoforms in serum after reperfusion in acute myocardial infarction, Clin Chem 35:2179-2185, 1989. 26. Kaddam IM, Iqbal SJ, Holland S, et al: Comparison of serum osteocalcin with total and bone specific alkaline phosphatase and urinary hydroxyproline:creatine ratio in patients with Paget's disease of bone, Ann Clin Biochem 31:327-330, 1994. 27. Garnero P, Delmas PD: Assessment of serum levels of bone alkaline phosphatase with a new immunoradiometric assay in patients with metabolic bone disease, J Clin Endocrinol Metab 77:1046-1053, 1993. 28. Christenson RH: Specificity of an immunochemical reagent for quantifying the isoforms of creatine kinase-MB, J Clin Lab Anal 7:220-224, 1993. 29. Panteghini M, Bonora R, Pagani F, Alebardi O: An immunochemical procedure for determination of creatine kinase 3 (serum-specific) isoform in human serum evaluated, Clin Biochem 23:225-228, 1990. 1

Tablas Tabla 55-1 Actividad de la creatina cinasa en diversos tejidos humanos Distribución de isoenzimas en U/g de tejido húmedo (% de actividad total) Tejido

2224

MM

MB

BB

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Músculo esquelético

3281 (100)

0-623 (0-19)

0

Corazón

313 (78)

56-169 (14-42)

0

Cerebro

0

0

157 (100)

Colon

4 (3)

1 (1)

143 (96)

Estómago

4 (3)

2 (2)

114 (95)

Útero

1 (2)

1 (3)

45 (95)

Tiroides

7 (26)

0.3 (1)

21 (73)

Riñón

2 (8)

0

19 (92)

Pulmón

5 (35)

0.1 (1)

9 (64)

Próstata

0.3 (3)

0.4 (4)

9.3 (93)

Bazo

5 (74)

0

2 (26)

Hígado

3.6 (90)

0.2 (6)

0.2 (4)

Páncreas

0.4 (14)

0 (1)

2.6 (85)

Placenta

1.4 (48)

0.2 (6)

1.4 (46)

De: Chapman J, Silverman L: Bull Lab Med (National Committee for Mental Health), no 60, pp 1-7, Jan 1982.

Tabla 55-2 Actividad de lactato deshidrogenasa, expresada como porcentaje de la distribución de actividad Distribución de isoenzimas Órgano

H4

H3 M1

H2 M2

H1M3

M4

Corazón

60

30

5

3

2

Riñón

28

24

21

11

6

Cerebro

28

32

19

16

5

Hígado

0.2

0.8

1

4

94

Músculo esquelético

3

4

8

9

76

Piel

0

0

4

17

79

Pulmón

10

18

28

23

21

Bazo

5

15

31

31

18

De: Pfleiderer G et al: In Schmidt E et al, editors: Advances in clinical enzymology, Hannover, West Germany, 1979, S Karger AG.

Tabla 55-3 Actividad de la fosfatasa alcalina en los tejidos humanos * Actividad (U/g de tejido húmedo)

2225

Tejido

MAP

DEA

Adrenal

30

66

Placenta

36

Hígado

12.6

27

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Hueso

7.5

18

Bazo

7.5

18

Pulmón

6.6

15

Intestino

4.8

9

Riñón

4.2

11

Próstata

3.3

6.6

Tiroides

2.1

5.1

Corazón

1.8

3.6

Eritrocitos

0.02

Datos calculados de: Bowers GN et al: Clin Chem 21:1988-1995, 1975. MAPA, solución amortiguadora de 2-metil-2-amino-1-propanol. DEA, solución amortiguadora de dietilamina. * La actividad promedio en los dos sistemas amortiguadores de especímenes tisulares de autopsias humanas. Nótese que la diferencia de actividad es del doble entre los sistemas de amortiguadores.

Tabla 55-4 Modalidades del análisis de isoenzimas (isoformas) Técnica

Principios del análisis

Isoenzima, isoforma

Electroforesis isoenzimas se separan

Las subunidades tienen diferentes cargas; las isoenzimas son separadas en un campo eléctrico.

Todas

Cromatografía de intercambio iónico

Las subunidades tienen diferentes cargas; las isoenzimas son separadas por afinidad diferencial mediante una resina de intercambio iónico

CC, LD

Inmunoinhibición

El anticuerpo reacciona específicamente CC, LD, fosfatasa ácida con un tipo de subunidad; esta propiedad puede usarse para dejar una isoenzima o isoenzimas catalíticamente inactivas o para eliminar físicamente una isoenzima o isoenzimas de la solución.

Inmunoensayo

El anticuerpo reacciona específicamente CC, LD, fosfatasa ácida, con un tipo de subunidad; el avance de fosfatasa alcalina, amilasa la reacción se monitorea mediante el uso de una marca radioisotópica, enzimática, o fluorescente.

Termoestabilidad

Las subunidades de la isoenzima individual se vuelven catalíticamente inactivas a diferentes temperaturas.

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Fosfatasa alcalina

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Inhibición catalítica

Las subunidades de la isoenzima individual se unen a inhibidores de bajo peso molecular con diferentes afinidades; tal unión produce una inhibición diferente para cada isoenzima.

Fosfatasa ácida (l-tartrato) Fosfatasa alcalina (urea y l-fenilalanina), colinesterasa (dibucaína)

Especificidad por el sustrato

Cada subunidad de la isoenzima se une a CC, fosfatasa ácida un sustrato con diferente afinidad (Km), (fosfato de -naftilo), LD1 dando cada una de las isoenzimas diversas tasas de actividad. También cada subunidad de la isoenzima se puede unir a diversos sustratos con diferente afinidad; diferentes isoenzimas han incrementado las tasas catalíticas con ciertos sustratos, mientras que otras tienenactividades muy bajas.

CC, creatina cinasa; LD, lactato. deshidrogenasa

CAPÍTULO 56

56. Monitoreo de Fármacos Terapéuticos Wolfgang A. Ritschel Michael Oellerich Victor W. Armstrong

PARTE I : REVISIÓN DE PRINCIPIOS BÁSICOS Destino del fármaco y necesidad del monitoreo de fármacos terapéuticos Concepto de rango terapéutico Sistema LADME para describir la disposición de fármacos Niveles sanguíneos como indicadores de respuesta clínica Niveles sanguíneos después de una dosis única de fármaco Efectos de niveles elevados de fármacos Necesidad de monitorear la terapia con fármacos Regímenes de dosificación usados para obtener la concentración terapéutica deseada Predicción de dosificación para niveles terapéuticos en estado estacionario Regímenes de dosis Farmacocinética Cinética de primer orden Cinética de orden cero

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Cinética de Michaelis – Menten Modelos compartimentales Constante de velocidad de eliminación final Nivel sanguíneo a tiempo cero Constante de velocidad de absorción Vida media de eliminación Volumen de distribución Área bajo la curva concentración sanguínea – tiempo Depuración total Estado estacionario Aplicación de conceptos de farmacocinética al MFT Evaluación clínica Evaluación por análisis de fármacos Evaluación por cálculos farmacocinéticos Análisis farmacocinéticos más complejos

PARTE II : ASPECTOS PRÁCTICOS DEL MFT Rango terapéutico. Métodos para predicción de dosis Ajuste de dosificación en el estado estacionario Método de tres puntos de Sawchuk Predicción Bayesiana Indicaciones clínicas para el MFT Muestreo y frecuencia del monitoreo de fármacos Muestreo Frecuencia del monitoreo de fármacos Tiempos de respuesta Análisis de urgencia ( tipo stat ) Aseguramiento de calidad Control de calidad Aviso de valor crítico Fármacos que predicen funcionamiento de órganos Perspectivas futuras Métodos de análisis Fármacos anticonvulsivantes Ciclosporina A Gentamicina y otros aminoglucósidos Litio Teofilina y cafeína

OBJETIVOS 2228

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Describir los pasos involucrados en el proceso fisiológico de un fármaco administrada a un paciente. Definir índice terapéutico y rango terapéutico. Describir las razones que justifican el monitoreo de fármacos terapéuticos (MFT). Describir varios regímenes de dosis y la influencia que tienen en los programas de MFT del laboratorio. Enumerar los factores que pueden tener influencia en la necesidad de realizar un análisis de MFT tipo stat.

Términos clave absorción Paso a la circulación del fármaco no modificado. biodisponibilidad Cantidad de fármaco en la formulación que puede ser absorbido por el sistema del paciente. biofase Sitio de interacción entre la molécula del fármaco y su receptor. cinética de Michaelis – Menten Método de transformación de los niveles plasmáticos del fármaco en una relación lineal, utilizando los parámetros de concentración de fármaco y una constante Km. CEM, CIM Concentración efectiva mínima o concentración inhibitoria mínima, para que un fármaco sea activo. Un fármaco es efectivo a cualquier nivel superior a este valor. ss C av Concentración promedio en el estado estacionario. C máx Nivel máximo del fármaco en plasma. ss C máx Concentración máxima en el estado estacionario (concentración pico). ss C mín Concentración mínima en el estado estacionario (concentración valle). cinética de orden cero La velocidad de cambio de la concentración plasmática, independiente de la concentración plasmática. Una cantidad constante es eliminada por unidad de tiempo, o sea, dC/dt = ko . cinética de primer orden La velocidad de cambio de la concentración plasmática de un fármaco que es dependiente de su propia concentración, lo que implica que una proporción constante del fármaco es removida con el tiempo, o sea, dC / dt = - k . C. compartimento Término farmacocinético para la concentración del fármaco, C, y el volumen de distribución de ese fármaco. concentración pico La más alta concentración alcanzada después de una dosis (por lo general, rápidamente después de la administración de la dosis). concentración valle La concentración del fármaco más baja alcanzada, generalmente antes de administrar la dosis siguiente. constante de velocidad de absorción Valor que describe cuánto fármaco es absorbido por unidad de tiempo. constante de velocidad de eliminación final Eliminación completa del fármaco del organismo por unidad de tiempo. depuración total (Dp tot ) Término que describe cuánto del volumen de distribución de un fármaco es depurado por unidad de tiempo. 2229

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distribución División proporcional de fármaco en diferentes compartimentos del organismo, tales como sangre y fluido extracelular. difusión pasiva Transporte de fármaco a través de una membrana gracias a un gradiente de concentración. dosis de mantenimiento Cantidad de fármaco requerida para mantener la concentración media deseada en el estado estacionario. efecto farmacológico Influencia de un fármaco en el estado bioquímico o fisiológico de un paciente (por ejemplo, disminución de la presión arterial y bacteriostasis) eliminación Excreción final de un agente. estado estacionario Condición en la cual son equivalentes la entrada del fármaco y su salida. Se obtiene cuando, después de múltiples dosis, la concentración pico y la concentración valle oscilan dentro de cierto rango después de cada dosis fármaco libre Agente farmacológico presente en fluidos biológicos sin unirse a otras moléculas. fármaco unido Agente farmacológico que existe en la sangre, formando un complejo con otra molécula (generalmente con una proteína o con un lípido). farmacocinética Estudio cuantitativo de la disponibilidad del fármaco en el organismo. indice terapéutico Relación entre las concentraciones plasmáticas que producen los efectos deseados y los efectos no deseados de un fármaco. LADME Acrónimo para la distribución de un fármaco en función del tiempo: Liberación, Absorción, Distribución, Metabolismo y Eliminación. liberación Proceso por el cual el fármaco se libera de su forma de dosificación. liberación lenta Forma de dosificación del fármaco que le permite disolverse lentamente. metabolismo Biotransformación del fármaco padre en sus metabolitos. método de dosificación de fluctuación limitada Método de dosificación en el que la cantidad de fármaco administrada no debe exceder ni estar por debajo de límites especificados. Método de dosificación pico Método mediante el cual el fármaco, para ser efectivo, debe alcanzar un nivel máximo específico. nivel sanguíneo a tiempo cero Hipotética concentración sanguínea obtenida por extrapolación a tiempo inicial o tiempo cero de administración. Generalmente da por resultado un valor máximo. prodroga Compuesto madre que generalmente no es activo y que debe ser metabolizado a la forma activa. rango terapéutico Relación entre el efecto clínico deseado de un ármaco y su concentración plasmática. receptor Estructura en el organismo con la cual interactúa el fármaco, produciendo su efecto farmacológico. Está frecuentemente localizado en una membrana celular o en otro componente celular. subterapéutico Nivel de fármaco menor que el necesario para obtener el efecto clínico deseado. t Intervalo de dosis. t máx Tiempo de concentración máxima del fármaco. tóxico Término que implica los efectos colaterales adversos o deletéreos, a veces fatales, de un agente terapéutico que está presente en un nivel demasiado alto. 2230

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transporte activo Movimiento de un fármaco a través de una membrana, que involucra su unión a una molécula transportadora y su paso al lado opuesto de la membrana, con gasto de energía. ventana terapéutica Término que describe la curva, con forma de campana, del nivel del fármaco versus la respuesta farmacológica. vida media ( t 1/2 ) Cantidad de tiempo requerida para reducir el nivel de un fármaco a la mitad de su valor inicial. Generalmente, se refiere al tiempo necesario para reducir el valor plasmático a la mitad de su valor inicial. El término también se aplica a la desaparición de la cantidad total del fármaco del organismo.

PARTE I: REPASO DE PRINCIPIOS BÁSICOS Wolfang A. Ritschel

Disposición del Fármaco y Necesidad del Monitero de Fármacos Terapéuticos Concepto de rango terapéutico Se ha establecido para muchos fármacos una relación entre su concentración en plasma y los efectos clínicos. En general, para lograr el efecto farmacológico deseado que provoque el efecto clínico (por ejemplo, disminución de la presión sanguínea, alivio del dolor, o bacteriostasis), se debe alcanzar una determinada concentración en el sitio de interacción entre la molécula del fármaco y el receptor (membrana celular, componente celular). Normalmente, las únicas mediciones disponibles para evaluar las interacciones de los fármacos a nivel celular son las mediciones de los niveles del fármaco en suero. Si se representa gráficamente el grado de respuesta clínica a un fármaco versus el logaritmo de la dosis o la concentración sanguínea del fármaco, se obtiene una curva lineal. La misma curva semilogarítmica se obtiene si se representa gráficamente la dosis del fármaco o la concentración sanguínea versus el porcentaje de una determinada población que tiene una respuesta clínica específica al fármaco. Se considera subterapéutica a cualquier dosis o concentración que no provoque un efecto cuantificable. Cualquier dosis o concentración mayor que la dosis o concentración mínima para alcanzar 100 % de efectividad no es garantía, y puede ser tóxica (ver siguiente cuadro).

Principales causas que provocan concentraciones no esperadas del fármaco en suero, fuera del rango terapéutico No cumplimiento por parte del paciente Dosificación inapropiada Mala absorción Pobre biodisponibilidad de la preparación administrada

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Interacciones entre fármacos Enfermedad renal y/o hepática Unión alterada a proteínas Fiebre Metabolismo lento o rápido, genéticamente determinado

Similar a la curva de logaritmo de la dosis versus respuesta clínica , también existe generalmente una curva similar de logaritmo de la dosis versus toxicidad (ver capítulo 51). Se encuentra frecuentemente una superposición entre la porción superior de la curva D-R y la porción inferior de la curva D-T. Para la mayoría de los fármacos, el rango terapéutico es un rango de concentraciones ubicado entre el tercio inferior y la porción media de la curva log de concentración versus respuesta. La pendiente de esta curva indica la magnitud del rango terapéutico. La toxicidad absoluta es menos importante que la relación entre la dosis tóxica promedio y la dosis terapéutica promedio o concentración promedio (ver más adelante). Esta relación, llamada índice terapéutico, es estrecha para algunos fármacos (digoxina, litio) y amplia para otras. Por lo tanto, el rango terapéutico también puede ser estrecho o amplio. Es particularmente deseable monitorear las concentraciones de aquellos fármacos que tienen un rango terapéutico estrecho y un índice terapéutico bajo (digoxina, litio, gentamicina), que presenten una cinética de eliminación dependiente de la dosis (fenitoína), o que exhiban grandes variaciones individuales en su metabolismo (antidepresivos tricíclicos). En estos casos, es importante para el médico saber si el fármaco está presente en una concentración dentro del rango terapéutico. El objetivo de este capítulo es describir el destino del fármaco una vez administrada, comentar los regímenes de dosis utilizados para alcanzar el rango terapéutico, y describir algunos principios farmacocinéticos básicos.

Sistema LADME para describir el destino de un fármaco en el organismo Es generalmente aceptado que los cambios en la concentración de un fármaco en el organismo, que ocurren con el tiempo, están relacionados al curso de los efectos farmacológicos. Estos cambios de la concentración del fármaco con el tiempo están descritos por el sistema LADME, en el cual se consideran en forma secuencial la Liberación, Absorción, Distribución, Metabolismo, y Eliminación del fármaco.

Liberación del fármaco a partir de su forma de dosificación Para ser absorbida, un fármaco debe estar presente en forma de solución verdadera en el sitio de absorción. Por ello, el ingrediente activo de cualquier forma de dosificación debe ser liberado de ella para permitir su absorción, excepto de aquellas que ya constituyen soluciones verdaderas (por ejemplo, inyecciones intravenosas, elixires o jarabes perorales, enemas rectales, gotas oculares y nasales). La liberación es un proceso mediante el cual el fármaco pasa a una solución: (a) Cuando es administrada en forma oral (tabletas, cápsulas, pastillas o suspensiones), el fármaco se disuelve en el fluido gástrico. (b) Después de una inyección 2232

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intramuscular o subcutánea de una suspensión, el fármaco se disuelve en el fluido tisular. (c) Luego de una administración rectal, los supositorios se derriten en el recto, y el fármaco se disuelve en el fluido rectal. (d) Después de la aplicación de ungüentos, el fármaco se disuelve en el agua de transpiración presente en la interfase entre la piel y el ungüento. Estos son algunos de los casos que requieren la liberación del fármaco para que éste sea absorbido. Para aquellas sustancias que no permanecen demasiado tiempo en el organismo, se han desarrollado formas de dosificación de liberación controlada o prolongada, que son preparaciones que presentan una lenta velocidad de liberación. Dado que el fármaco no puede ser absorbido a una velocidad mayor que su velocidad de liberación, la velocidad de absorción aparente se transforma en una función de la velocidad de liberación, y todo el proceso de absorción lleva más tiempo, provocando una duración prolongada del efecto clínico. Absorción Es el proceso mediante el cual la molécula del fármaco pasa a la circulación sistémica, generalmente denominada torrente sanguíneo. El proceso de absorción debe ocurrir siempre y cuando un fármaco sea administrado extravascularmente, es decir, en forma peroral, oral, intramuscular, subcutánea, rectal, tópica y otras. Cuando el fármaco se administra intravascularmente, en forma intravenosa, intra-arterial o intracardíaca, no hay absorción debido a que el fármaco es introducido directamente en el torrente sanguíneo. Existen varios mecanismos de absorción: difusión pasiva, transporte activo, transporte facilitado, transporte convectivo y pinocitosis. La difusión pasiva se aplica al 95 % de todas los fármacos. Depende de que la concentración del fármaco no ionizado sea mayor en un lado de la membrana que en el otro. Siempre y cuando exista un gradiente de concentración a través de la membrana, el fármaco será absorbido hacia la zona de menor concentración. Para electrolitos débiles, el pKa del fármaco y el pH en el sitio de absorción (estómago pH 1,5 a 3; intestinos pH 5 a 7; recto pH 7,8; o piel pH 5) influyen en el grado de ionización. El pH de la sangre es 7,4 y es relativamente constante. Como regla general, las especies ionizadas del fármaco son absorbidas en forma pasiva menos fácilmente que las especies no ionizadas. A dos unidades de pH por debajo del pKa de una fármaco ácido, y a dos unidades de pH por encima del pKa de un fármaco básico, los compuestos estarán 99 % no ionizados y tendrán velocidades de absorción máximas. El transporte activo requiere la unión de la molécula del fármaco a un transportador (proteína) de la membrana, que deposita al fármaco en el lado opuesto de la membrana mediante un gasto de energía. Este proceso moviliza al fármaco (por ejemplo, glucósidos cardíacos, hexosas, monosacáridos, aminoácidos, riboflavina) en contra de un gradiente de concentración. El transporte facilitado es un mecanismo similar al anterior, pero el movimiento de la sustancia está facilitado porque tiene la misma dirección que el gradiente de concentración (ejemplo, vitamina B12). El transporte convectivo: mecanismo de absorción por el cual pequeñas moléculas (como la urea), pasan a la circulación sistémica a través de poros llenos de agua presentes en la membrana. Para todos los mecanismos mencionados anteriormente, el fármaco debe estar presente en el sitio de absorción en una solución acuosa verdadera. Un mecanismo distinto y único es la pinocitosis de las grasas y de las partículas 2233

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sólidas. Se forman vesículas atrapantes en la membrana celular, que se abren hacia el lado intracelular, y liberan las gotas de lípidos o partículas. Ejemplo: vitaminas A, K , D y E, huevos de parásitos, grasa y almidón. Distribución Una vez que las moléculas del fármaco son absorbidas y pasan al torrente sanguíneo, pueden : (1) permanecer en el mismo, (2) abandonarlo y pasar a otros fluidos extravasculares, como el fluido intersticial, o (3) migrar hacia varios tejidos y órganos. El proceso completo de transferencia del fármaco desde el torrente sanguíneo hacia otros compartimentos se denomina distribución. Generalmente, dura entre 30 minutos y dos horas, pero también puede completarse en pocos minutos, o tomar mucho más de dos horas (por ejemplo, el tiempo de distribución del methotrexate es 15 horas). Metabolismo Es el proceso de biotransformación de la molécula del fármaco padre en uno o más metabolitos. Estos son generalmente más polares, es decir, más hidrosolubles, y por lo tanto, pueden ser más fácilmente excretados por el riñón. El metabolismo se realiza fundamentalmente en hígado y riñón, aunque también se lleva a cabo en plasma y tejido muscular. Generalmente, aunque no siempre, los metabolitos son menos activos y menos tóxicos que los correspondientes compuestos que les dieron origen. Sin embargo, debe mencionarse un grupo de drogas, denominadas prodrogas, que son compuestos madre generalmente no activos, que deben ser metabolizados a su forma activa. Por ejemplo, el compuesto anticancerígeno ciclofosfamida es inactiva, y debe ser biotransformada al compuesto activo 4-hidroxi-ciclofosfamida. La forma activa de las prodrogas es inestable, o no es fácilmente soluble, o bien es pobremente absorbida. Algunas drogas forman metabolitos que también son activos. Por ejemplo, el fármaco activo procainamida es biotransformado en un metabolito igualmente potente, la acetilprocainamida. El conocimiento de los metabolitos activos es de particular importancia en la monitoreo de fármacos terapéuticos para correlacionar la concentración total de todas las formas activas con los efectos farmacológicos. Eliminación Es el proceso de excreción final del fármaco del organismo, ya sea como compuesto padre no modificado o en la forma de sus metabolitos correspondientes. Las principales vías de excreción son los riñones a través de la orina, y el hígado a través de la bilis, y consecuentemente de las heces. Otras vías de eliminación son: piel (sudor), pulmones (aire espirado), glándulas mamarias (leche) y glándulas salivales (saliva). La vida media de eliminación es el tiempo requerido, una vez alcanzado el equilibrio, para reducir la concentración sanguínea a la mitad. Después que el fármaco es absorbido y distribuido, se requiere una (1) vida media para eliminar el 50 % del fármaco, siete (7) vidas medias para eliminar el 99 %, y diez (10) vidas medias para eliminar el 99,9 % del fármaco. Efecto de la variación biológica en LADME Si un fármaco es administrado en cantidades iguales a gemelos univitelinos, por la misma vía de administración, y a la misma hora del día, los parámetros farmacocinéticos 2234

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diferirán sólo muy ligeramente. Las diferencias serán mayores si los gemelos son bivitelinos. Las diferencias serán aún mayores dentro de un grupo poblacional, aún si este grupo es homogéneo en cuanto a edad, sexo, peso corporal y estado de salud. Estas diferencias expresan variaciones de origen genético en el manejo del fármaco, que pueden influenciar su absorción, distribución, metabolismo, eliminación, e interacciones fármaco-receptor. Por lo tanto, los parámetros farmacocinéticos para individuos sanos que se encuentran en bibliografía son valores promedios con sus rangos, que realmente son válidos únicamente para el grupo estudiado. Factores fisiológicos y patológicos que afectan el destino del fármaco Además de las variaciones biológicas causadas por diferencias genéticas, existen muchos factores fisiológicos y patológicos que pueden alterar considerablemente la disposición del fármaco.ref(2089) Los factores fisiológicos más importantes incluyen peso y composición corporal, edad, temperatura (hipertermia e hipotermia), tiempo de vaciado gástrico y motilidad intestinal, flujo sanguíneo (en reposo y en ejercicio), condiciones del medio ambiente (por ejemplo, altitud o mal de montaña), nutrición, embarazo y ritmo circadiano. Entre los factores patológicos más importantes se pueden mencionar: disfunción renal, disfunción hepática, insuficiencia cardíaca congestiva aguda, quemaduras, shock, trauma, y enfermedades gastrointestinales. Niveles sanguíneos como indicadores de la respuesta clínica El fundamento para la utilización de los niveles sanguíneos como indicadores de respuesta clínica está basado en el concepto que para aquellos fármacos que interactúan con el receptor sin sufrir cambios, su concentración en el sitio de acción determinará la duración e intensidad del efecto farmacológico. Dado que es imposible tomar una muestra en el mismo sitio de acción o biofase (por ejemplo, la membrana celular), la mejor alternativa es emplear sangre entera, plasma, o suero, que son fluidos biológicos en equilibrio con el receptor, y son fáciles de obtener. Después que finaliza la fase de distribución, las concentraciones del fármaco en los compartimentos central y periférico (es decir, en la sangre) disminuirán en forma paralela. En ese momento, se obtiene un pseudoequilibrio de distribución, independientemente del compartimento en que se encuentre el sitio de acción. Aunque la concentración del fármaco total puede diferir considerablemente entre los compartimentos centrales y periféricos, la concentración del fármaco libre (no unida) será la misma. Por lo tanto, una vez alcanzado el mencionado pseudoequilibrio de distribución, existirá una correlación entre el efecto farmacológico y la concentración del fármaco en sangre. Generalmente, se mide solamente la concentración del fármaco total en plasma, lo cual es bastante aceptable en condiciones normales, porque las diferencias individuales son pequeñas respecto a la unión a proteínas plasmáticas.ref(2090) Sin embargo, en algunos casos esto no es cierto.refs(2091)

Niveles sanguíneos después de una dosis única del fármaco La respuesta farmacocinética se visualiza a través del gráfico de la concentración sanguínea en función del tiempo (Fig. 56-1). La forma de la curva depende de la vía de 2235

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administración y del sistema LADME. Después de una administración intravenosa rápida, todo el fármaco se encuentra instantáneamente en la circulación sistémica. Si es administrado por vía extravascular, nada habrá en la circulación sistémica en el momento de la administración, es decir, a tiempo cero. La curva nivel sanguíneo - tiempo aumenta debido a la continua absorción, después de producirse la liberación del fármaco de su forma farmacéutica. Una vez absorbida, el fármaco queda expuesto a los procesos de distribución, metabolismo y eliminación. Como inicialmente existe mayor proporción del fármaco absorbida que distribuida, metabolizada y eliminada, la curva continúa su aumento hasta que se equiparan la entrada y la salida del fármaco. A este tiempo ( t máx ), se alcanza la concentración pico ( C máx ), y la curva nivel sanguíneo tiempo declina a medida que la eliminación supera a la absorción (Fig. 56-1). La velocidad y la magnitud de la liberación son dos factores que pueden modificar la forma de la curva. El mismo producto farmacéutico elaborado por diferentes fabricantes puede liberar el fármaco a distintas velocidades. La liberación lenta también puede ser intencional, como en el caso de las formas de dosificación de liberación lenta o sostenida. Sin embargo, si todo el fármaco es liberado, serán iguales las áreas bajo las curvas nivel sanguíneo - tiempo correspondientes a distintas formulaciones. Si el fármaco no es completamente liberado, podría presentarse un problema de biodisponibilidad, y el área bajo la curva sería menor. (Fig. 56-2). El término biodisponibilidad se refiere a la cantidad del fármaco sistémicamente absorbida. El proceso de absorción puede estar influenciado por varios factores. Los alimentos (cuando el fármaco es administrado en forma oral antes, durante, o después de las comidas), pueden acelerar o prolongar la absorción, no tener efecto alguno, o incluso influenciar la magnitud de la misma. Por ejemplo, el nivel sanguíneo de griseofulvina aumenta en forma significativa cuando el fármaco se administra junto a grasas, mientras que el nivel sanguíneo de la tetraciclina disminuye cuando se ingiere junto con leche. El volumen de distribución puede cambiar en varias condiciones patológicas. Si aumenta, el nivel sanguíneo disminuye y viceversa. En la insuficiencia cardíaca congestiva, disminuye el volumen de distribución para ciertos fármacos, como digoxina y quinidina, y por lo tanto, la misma dosis dará como resultado una mayor concentración (Fig. 56-3). Para aquellas drogas que son extensamente metabolizadas, los cambios en los niveles sanguíneos (Fig. 56-4) pueden ser el resultado de un metabolismo deficiente (por ejemplo, debido a daño hepático), o de la administración concomitante de otros fármacos que, o bien compiten por las vías metabólicas (inhibición enzimática), o bien aceleran el metabolismo (inducción enzimática). La eliminación de fármacos, particularmente aquellos que son predominantemente eliminados por riñón, puede ser altamente prolongada en caso de daño renal o en personas de edad avanzada. La eliminación reducida puede dar como resultado una vida media de eliminación varias veces prolongada. Un ejemplo clásico son los aminoglucósidos: la vida media normal de la gentamicina es dos horas, pero puede fácilmente prolongarse a 20 o más horas (Fig. 56-5). Efecto de los niveles elevados de fármacos Como se enunció anteriormente, existe para muchos fármacos una relación entre la concentración del fármaco en sangre y las respuestas farmacológica y tóxica. Por lo tanto, un 2236

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aumento en los niveles sanguíneos está generalmente asociado con un aumento en la intensidad no sólo de la efectividad clínica sino también de la toxicidad. Para muchos fármacos es deseable alcanzar un rango terapéutico con la concentración pico o mantener durante el intervalo de dosis el nivel sanguíneo dentro del rango terapeútico. Una concentración por debajo del rango terapéutico es subterapéutica o inefectiva, y una concentración por encima del rango terapéutico es probablemente tóxica y puede causar efectos colaterales. Sin embargo, el rango terapéutico y subterapéutico, y el rango terapéutico y el rango tóxico a menudo se superponen (Fig. 56-6). Adicionalmente, se ha establecido un rango terapéutico que puede ser aplicado a la mayoría de los pacientes, pero que puede ser demasiado bajo o demasiado alto para un paciente individual. Un ejemplo de ello es la teofilina, para la cual el rango terapéutico está entre 10 y 20 microgramos/mL. Sin embargo, algunos pacientes están perfectamente controlados con niveles tan bajos como 5 microgramos/mL. Por otro lado, mientras la mayoría de los pacientes no experimentan los efectos colaterales de la teofilina a niveles aproximados a 23 µg/mL, algunos pacientes manifiestan signos tóxicos a esos niveles.

Necesidad del monitoreo en la terapia con fármacos Muchos pacientes, tanto hospitalizados como ambulatorios, reciben más de un fármaco durante un día determinado,ref(2092) lo cual aumenta la probabilidad de enfermedad inducida por fármacos, interacción de fármacos, y efectos colaterales. Se ha descrito que uno de los fármacos más ampliamente usada, la cimetidina, interactúa con 21 fármacos diferentes.ref(2093) La imperiosa necesidad del monitoreo del fármaco también está indicada por el hallazgo de que 30 % a 50 % de las dosis administradas en hospitales y enfermerías fueron erróneas.ref(2094) Otra razón para el monitoreo de fármacos es el incumplimiento con el régimen prescrito de dosis. Se describió en un estudioref(2095) en el que el porcentaje de pacientes que no toma su medicación en la forma indicada oscila entre el 20% y el 82%.ref(2096) El monitoreo de fármacos para todos los fármacos y para todos los pacientes no es posible ni tampoco factible. Más aún, el monitoreo del fármaco total no es, al menos por ahora, relevante para todos los fármacos. Hay otros fármacos, para los cuales la respuesta farmacológica es fácil, rápida y exactamente cuantificable, por lo cual es clínicamente más relevante monitorear directamente la respuesta clínica (tal como presión sanguínea, glucemia o excreción de electrolitos), en lugar del nivel sanguíneo del fármaco que la provoca. Si un paciente está respondiendo bien a la terapia con fármaco sin presentar ningún signo de toxicidad, el correspondiente régimen de dosificación debe ser mantenido, aún cuando el nivel sanguíneo pudiera estar fuera del rango terapéutico normal. Podría contestarse a la pregunta "¿Para cuáles fármacos está indicado el monitoreo? ", de la siguiente manera: el monitoreo está indicado para muchos grupos de fármacos, tales como fármacos antiepilépticas, agentes antiarrítmicos, anticoagulantes perorales, teofilina, antidepresivos tricíclicos, carbonato de litio y aminoglucósidos, que muestran gran variación individual, o que son tóxicos por encima de su rango terapéutico. La Fig. 56-7 presenta un diagrama en el que se muestran los factores que fundamentan la necesidad del monitoreo.

Regímenes de Dosis Usados para Lograr la Concentracion Terapéutica 2237

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Deseada Predicción de dosis para niveles terapéuticos en el estado estacionario Muchos fármacos no son administradas en una dosis única, sino por medio de una serie de dosis administradas a intervalos específicos durante todo el transcurso de la terapia con el fármaco. Si el fármaco es administrado repetidamente usando intervalos de dosis más cortos que el tiempo requerido para eliminar del organismo el fármaco remanente de la dosis precedente, éste se acumulará hasta que se alcance un estado estacionario, o sea cuando la entrada y la salida del fármaco son iguales. El estado estacionario se obtiene cuando, con un régimen específico de dosis, la concentración pico (Cmáxss, o concentración máxima en estado estacionario), y la concentración valle (Cmínss, o concentración mínima en estado estacionario), oscilan, luego de cada dosis, dentro de un cierto rango. El objetivo es lograr alcanzar el rango terapéutico. A partir de una curva de nivel sanguíneo - tiempo luego de una dosis individual, se pueden obtener los parámetros necesarios para predecir el estado estacionario, y a la inversa, la dosis requerida para alcanzar el estado estacionario deseado. La dosis de mantenimiento requerida para mantener una concentración promedio deseada en el estado estacionario, Cavss, a un intervalo de dosis dado, t, depende de la magnitud de Cavss (la concentración del fármaco requerida en sangre para desencadenar la respuesta farmacológica), de los parámetros farmacocinéticos de disposición del fármaco, y del peso corporal del paciente. La ecuación general para determinar la dosis de mantenimiento correcta se muestra en el siguiente cuadro:ref(2097)

Factores que determinan una dosis individualizada * Dosis de mantenimiento (µg) DM

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Depuración corporal totalH mL/hr/kg Dt

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Concentración promedio deseada para el estado estacionario (µg/mL) ss C av Rango X terapéutico

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Coeficiente de partición líquidoagua aparente pKa Fluido corporal total Grasa corporal total Magnitud de la unión de la proteína Velocidad de flujo sanguíneo tisular

Metabolismo: Velocidad de flujo sanguíneo hepático Actividad enzimática Cambios subcelulares Factores extrahepáticos Excreción: Velocidad efectiva de flujo sanguíneo renal Velocidad de filtración gromerular Transporte activo celular Cambios morfológicos

Sensibilidad del receptor Número de receptores Neurotransmisión Homeostasis

Incremento o no del cambio con una dosis reducida

Relación de masa de grasa a masa muscular magra Peso corporal de masa muscular magra Peso corporal total

*Para mayor información consulte a Ritschel WA: Contemp Fharmacy Pract 5:209-218, Washington, D.C., 1982, American Pharmaceutical Association. †Vd, Volumen de distribución aparente (mL/kg); Ke o ß, constante de velocidad de disposición terminal -1

global (hr ); Dt = Vd · ß

Regímenes de dosis El régimen de dosificación para una terapia de mantenimiento con dosis múltiples puede diseñarse de acuerdo a cinco métodos diferentes, dependiendo de la concentración deseada que se desee alcanzar o mantener durante cada intervalo de dosis. Es necesario conocer, para el propósito de monitoreo, cuál es el método utilizado, porque el protocolo óptimo de toma de muestra para el análisis de laboratorio depende del método en cuestión. Los cinco métodos se refieren a concentraciones en estado estacionario, y son los siguientes: 12345-

Método de la concentración efectiva mínima (CEM), o concentración inhibitoria mínima (CIM) Método del pico (Cmáxss ). Método de fluctuación limitada (Cmáxss - Cmínss) Método del log dosis - respuesta (Cavss ) Método de la ventana terapéutica (VT)

Método CEM o CIM. Para que algunos fármacos sean efectivos deben alcanzar y mantener en el estado estacionario una concentración inhibitoria mínima (CIM), o una concentración efectiva mínima (CEM). Por encima de los valores de CIM o CEM, el fármaco será efectiva independientemente de la magnitud del pico alcanzado, siempre y cuando la curva completa de nivel sanguíneo - tiempo en estado estacionario esté por encima de la CIM o CEM requerida. Si la curva de nivel sanguíneo - tiempo cae por debajo del nivel de la CIM o CEM, el fármaco será inefectivo mientras la concentración permanezca por debajo de ese nivel. 2239

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Fármacos tales como antibióticos bacteriostáticos y otros agentes antimicrobianos (sulfonamidas), que tienen un índice terapéutico relativamente amplio, se prescriben frecuentemente con un régimen de dosificación calculado según este método. Método del pico (Cmáxss ). Es conveniente para algunos fármacos alcanzar una determinada concentración pico en el estado estacionario durante cada intervalo de dosis. Sin embargo, para el remanente del intervalo de dosis no se requiere que la concentración del fármaco permanezca por encima de un nivel mínimo. Este es el caso particular de los fármacos bactericidas, que sólo actúan sobre los microorganismos proliferantes, y en el cual no se quiere inhibir el crecimiento de aquellos microorganismos que no han sido matados por la dosis previa. Los fármacos que se prescriben frecuentemente con regímenes de dosificación basados en este método incluyen penicilinas, cefalosporinas, gentamicina y kanamicina. Método de fluctuación limitada ( Cmáxss - Cmínss ) Para algunos fármacos podría ser deseable mantener en el estado estacionario una CIM o CEM a lo largo del intervalo de dosis sin nunca exceder un determinado valor de pico. Éste es el caso particular de aquellos fármacos que tienen un estrecho rango terapéutico. Los fármacos que podrían ser administrados usando este método para calcular la dosificación incluyen gentamicina, kanamicina, estreptomicina, isoniazida y teofilina. Método del log dosis - respuesta ( Cavss ) Para las fármacos cuyo efecto clínico sigue una curva de log dosis - respuesta, las dosis del fármaco se eligen para estar ubicadas en la porción inferior de esa curva. Por ello, la concentración deseada en el estado estacionario está generalmente en el tercio inferior de la curva de log dosis - respuesta. Para este tipo de fármacos, la intensidad del efecto clínico (y también la toxicidad), se incrementa con el aumento de tamaño del pico. Los fármacoss cuyas dosificaciones se basan generalmente en este método son digoxina, lidocaína, teofilina, procainamida, quinidina, antibióticos bactericidas, analgésicos, antipiréticos y agentes hipoglucemiantes. Método de la ventana terapéutica (VT) En algunos fármacos, como los antidepresivos y los antipsicóticos, el efecto clínico se incrementa con el tamaño de la dosis sólo hasta un cierto punto, y luego disminuye aún cuando la dosis se siga incrementando. En lugar de un rango terapéutico, existe una ventana terapéutica, que presenta una curva log dosis - respuesta con forma aproximada de campana.

Farmacocinética Se define como el estudio cuantitativo de la disposición del fármaco en el organismo, y permite: 1describir matemáticamente el destino de un fármaco, después de su 2240

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administración en una forma de dosificación dada por una determinada vía de administración. 2comparar un fármaco con otros, o una forma de dosificación con otras formas de dosificación. 3predecir los niveles sanguíneos de un fármaco con diferentes regímenes de dosificación o estados de enfermedad. En farmacocinética, se usan básicamente tres tipos de procesos cinéticos para caracterizar el destino de los fármacos en el organismo: cinética de primer orden, o lineal; cinética de orden cero, o no lineal; y cinética de Michaelis-Menten o de saturación.

Cinética de primer orden La mayoría de los procesos de ingreso del fármaco (absorción), difusión y permeación en el organismo (distribución), y excreción (eliminación urinaria), pueden describirse con cinéticas de primer orden o lineales, lo cual significa que la velocidad de cambio de concentración del fármaco es dependiente de la concentración del mismo. Cuando se representa gráficamente concentración versus tiempo en papel milimetrado, se obtiene una curva cóncava, y cuando se representa gráficamente en papel semilogarítmico se obtiene una línea recta. La relación está expresada por la ecuación 56-1: dC / dt = - k . C

Ec. 56-1

donde C es la concentración del fármaco, k es la constante de velocidad de primer orden, y t es el tiempo. El signo menos indica que la concentración de fármaco decrece con el tiempo. Un fármaco es eliminado de una manera que puede ser descrita por una cinética de primer orden cuando un porcentaje constante de fármaco es eliminado por unidad de tiempo. Las cinéticas de primer orden describen la eliminación de muchao fármacos, entre ellas, antibióticos y sulfonamidas, digoxina, lidocaína, procainamida y teofilina.

Cinética de orden cero Si la velocidad de eliminación de un compuesto del organismo no es proporcional a la concentración del fármaco tomado, la eliminación sigue generalmente una cinética de orden cero o no lineal, lo cual significa que la velocidad de cambio de concentración es independiente de la concentración del fármaco respectivo. En otras palabras, más que una proporción constante, una cantidad constante de fármaco es eliminada por unidad de tiempo (la eliminación depende de la cantidad por unidad de tiempo). Cuando se representa gráficamente concentración versus tiempo en papel milimetrado, se obtiene una línea recta, mientras que en papel semilogarítmico se obtiene una curva convexa. El ejemplo clásico para cinéticas de orden cero es la eliminación de alcohol (etanol). La relación puede ser expresada por la Ecuación 56-2: dC / dt = - k o

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Ec. 56-2

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donde la velocidad de cambio de concentración, dC/dt , es igual a la constante de velocidad de orden cero, k o, que tiene unidades de masa por unidad de tiempo.

Cinética de Michaelis-Menten En el metabolismo, prácticamente todos los procesos de biotransformación son catalizados por sistemas enzimáticos específicos con una capacidad limitada para el fármaco. Los transportadores, responsables del transporte activo para fármacos a través de membranas, también tienen una capacidad limitada. Cuando la concentración de fármaco presente en un sistema dado excede la capacidad del sistema, la velocidad de cambio de concentración se describe más precisamente por la ecuación de Michaelis-Menten: dC/dt = - ( Vmáx . C ) / ( Km + C )

Ec. 56-3

donde C es la concentración de fármaco, t es el tiempo, Vmáx es una constante que representa la máxima velocidad del proceso, y K m es la constante de Michaelis, la concentración de fármaco a la cual el proceso transcurre exactamente a la mitad de su velocidad máxima. Fenitoína, barbituratos en dosis altas y glutetimida son ejemplos de fármacos que muestran este tipo de cinéticas de saturación – eliminación.

Modelos compartamentales Para describir los procesos cuantitativos de un fármaco en el organismo, la farmacocinética emplea el concepto de compartimentos. Un compartimento es una unidad caracterizada por dos parámetros: la concentración de fármaco, C , y el volumen, Vd. Multiplicando la concentración de fármaco por el volumen aparente de distribución, se obtiene la cantidad, A , de fármaco en ese compartimento: C . Vd = A

Ec. 56-4

Un modelo compartimental dado no es necesariamente específico para un fármaco dado. Por ejemplo, un fármaco administrado intravenosamente se describe con frecuencia por un modelo abierto de dos compartimentos, mientras que el mismo compuesto administrado oralmente o por otra vía extravascular, puede ser descrito por un modelo abierto de un compartimento. Abierto significa que hay entrada hacia y salida desde el compartimento. En realidad, el cuerpo humano es un sistema de multimillones de compartimentos. Sin embargo, en el organismo intacto se tiene fácil acceso a sólo dos tipos de fluidos biológicos: sangre (suero, plasma), y orina. Estando restringida a sangre u orina, el fármaco tiene un destino en el organismo generalmente descrito por modelos abiertos de uno o dos compartimentos. Clínicamente hablando, el concepto de modelos de uno y de dos compartimentos es generalmente satisfactorio para uso terapéutico. La diferencia entre un modelo de un compartimento y otro modelo de dos compartimentos, es que en el primero la distribución ocurre instantáneamente, mientras que en el último, el proceso de distribución 2242

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necesita de un tiempo cuantificable antes de que el pseudoequilibrio sea alcanzado.

Constante de velocidad de eliminación final En el modelo abierto de un compartimento, la última porción o porción terminal de la pendiente recta (monoexponencial) de una curva semilogarítmica de nivel sanguíneo - tiempo permite obtener la constante global de velocidad de eliminación, k e , (metabolismo, excreción renal, y otras vías de eliminación). En el modelo de dos compartimentos, permite obtener , la constante de velocidad de eliminación lenta (Figs. 56-9 y 56-10).

Nivel sanguíneo a tiempo cero En la curva de nivel sanguíneo – tiempo, luego de una administración intravenosa, la extrapolación resulta ser Co , el nivel sanguíneo a tiempo cero. Luego de una administración extravascular, el nivel sanguíneo a tiempo cero "ficticio", Co , es la intercepción de la pendiente k e con la ordenada en un gráfico semilogarítmico para el modelo de un compartimento, y la suma de las intercepciones A + B de las pendientes y para el modelo de dos compartimentos (Figs. 56-9 y 56-10). Constante de velocidad de absorción La pendiente k e se extrapola a tiempo cero, dando por resultado Co , una concentración teórica aproximadamente equivalente a aquella obtenida a partir de una inyección intravenosa de la misma cantidad de fármaco.. Por sustracción de la concentración de fármaco observada durante la fase de absorción, de la concentración leída de la pendiente extrapolada k e , se obtienen puntos residuales, que cuando se representa gráficamente en papel semilogarítmico, generan una línea recta, cuya pendiente es la constante de velocidad de absorción k a (Fig. 56-9), para el modelo de un compartimento.

Vida media de eliminación Siempre que una línea recta monoexponencial sea obtenida, puede calcularse la vida media de una fármaco. Nótese la línea que describe los términos k e y en las (Figs. 56-9 y 56-10). Otras vidas medias usadas frecuentemente son la vida media de absorción (t1/2 abs) y la vida media de distribución (t1/2). Los términos tiempo medio, vida media, vida media plasmática, vida media de eliminación, y vida media biológica se usan a menudo indistintamente. La vida media es igual al tiempo requerido para la eliminación de la mitad de la dosis total de fármaco del organismo. La vida media de eliminación , o vida media plasmática, es el tiempo requerido para la eliminación de la mitad de la cantidad de fármaco presente en la sangre (plasma o suero). En aquellos casos en los cuales la disminución de las concentraciones de fármaco en todos los tejidos no es paralela a la disminución de la concentración de fármaco en plasma, sangre o suero, la vida media y la vida media de eliminación serán diferentes. La mayoría de los conceptos sobre disposición de fármaco se refieren a la vida media de eliminación. En la Fig. 2243

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56-10 se representa gráficamente la vida media de eliminación ( t 1/2 b ). Volumen de distribución El volumen de distribución no es un volumen real, y generalmente no tiene relación con algún espacio fisiológico o con algún volumen de fluido corporal. Es simplemente un término para hacer válida la ecuación de balance de masa. En la administración intravenosa, la cantidad de fármaco en el cuerpo es conocida. Sin embargo, sólo pueden extraerse muestras de sangre. Dado que una cantidad de fármaco, A , iguala el producto de concentración por volumen (microgramos/mL x mL), el volumen de distribución es el volumen hipotético que sería requerido para disolver la cantidad total de fármaco de modo de alcanzar la misma concentración que se encuentra en la sangre. El volumen de distribución se expresa en mililitros. Si este valor se divide por el peso corporal del paciente, se obtiene el coeficiente de distribución, ' , en mL/g, o L/kg.

Area bajo la curva de nivel sanguíneo - tiempo La integral debajo de una curva de nivel sanguíneo-tiempo es una medida de la cantidad total de fármaco en el organismo. Puede calcularse el área bajo la curva de nivel sanguíneo - tiempo desde tiempo cero a infinito, AUC (más conocida por su acrónimo en inglés por "Area Under the Curve"), o puede obtenerse por aproximación representando la curva en papel gráfico, recortando el área y pesándola. (Fig. 56-11).

Depuración total En farmacocinética, la depuración total describe cuánto del volumen de distribución del fármaco se depura por unidad de tiempo, sin considerar las vías de pérdida del fármaco del organismo. En efecto, es la suma de todos los procesos de depuración que se realizan por diferentes rutas. La depuración total es el producto del volumen aparente de distribución y la constante de velocidad de eliminación final.

Estado estacionario El estado estacionario se refiere a la acumulación de fármaco en el organismo, después de dosis múltiples, cuando la entrada y la salida de fármaco son iguales dentro de un intervalo de dosis. La magnitud de la acumulación depende de la vida media de eliminación del fármaco y del intervalo de dosis. Cuanto menor sea el intervalo de dosis para una dosis dada, mayor será la acumulación y menor será la fluctuación alrededor del valor promedio en suero. En el estado estacionario, la concentración de fármaco oscila alrededor de una concentración promedio, Cavss, con una definida concentración máxima de estado estacionario, Cmáxss, y una concentración mínima de estado estacionario, Cmínss. Las tres concentraciones mencionadas son idénticas solamente en el caso de una infusión intravenosa continua.

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Aplicación de la Farmacocinética al MFT Evaluación clínica La evaluación clínica o médica de la respuesta del paciente es la primera y más importante tarea del monitoreo terapéutico. No debe olvidarse que toda terapia requiere de un enfoque que considere todos los aspectos de la condición del paciente, incluyendo la propia enfermedad y sus síntomas, otras enfermedades presentes, su condición física general, edad, estado nutricional, y aspectos psicológicos. Es más, no debe olvidarse que la farmacocinética clínica es una herramienta útil que puede ayudar, pero nunca substituir a la evaluación clínica. Aplicación. La evaluación clínica de la respuesta del paciente comprende la evaluación de sus signos vitales y el cambio de los síntomas en respuesta a la terapia con el fármaco, por ejemplo, presión sanguínea, pulso, electrocardiograma, medición de edema y excreción urinaria. Además, pueden ser requeridos análisis de laboratorio, tales como glucosa en suero y electrolitos. En todos los casos, la respuesta farmacológica es evaluada clínicamente, ya sea por medición directa del efecto farmacológico o por medición de parámetros bioquímicos, pero no por la medición de la concentración de fármaco en fluidos biológicos. Limitaciones. A veces, la evaluación clínica podría ser dificultosa debido a la presencia de dos o más estados de enfermedad con síntomas similares o superpuestos, polifarmacia (varias fármacos administradas simultáneamente), o resultados inesperados. Estos últimos aparecen cuando el paciente (1) no responde de acuerdo a lo esperado, mostrando poca o ninguna efectividad de la terapia, o (2) presenta inesperados efectos colaterales o tóxicos. Una fármaco puede ser menos efectiva de lo esperado porque: (1) tiene baja biodisponibilidad, (2) el paciente no cumple con las indicaciones prescritas, (3) existe un síndrome de mala absorción, y debido al mismo, la cantidad de fármaco absorbida es menor de la esperada. Un paciente puede exhibir toxicidad inesperada o efectos colaterales a causa de las interacciones entre fármacos, inducción enzimática, inhibición enzimática, falla renal o hepática, edema, deshidratación, etc. En estos casos es aconsejable, cuando sea posible, solicitar el monitoreo de fármacos en muestras biológicas (ver Fig. 56-7 y el cuadro A).

Evaluación por análisis de fármacos Cuando se conoce la concentración terapéutica deseada, el rango terapéutico o la concentración tóxica, el monitoreo de fármacos terapéuticos puede ser usado para avalar la evaluación clínica. Cuando un paciente está tratado con fármacos de bajo índice terapéutico, tales como los aminoglucósidos, digoxina y compuestos de litio, o cuando aparecen efectos colaterales inesperados o toxicidad (ver Fig. 56-7) y debe efectuarse el monitoreo de fármacos terapéuticos. Bases para el monitoreo. Es esencial para el monitoreo completar ciertos requerimientos, pues de otro modo, cualquier evaluación será errónea:ref(2098) 2245

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1. Debe conocerse la dosis, la forma de dosificación y la vía de administración. 2. Debe seguirse el régimen de dosificación. 3. Debe conocerse el tiempo entre la administración de la última dosis y la extracción de la muestra sanguínea. 4. Debe registrarse con exactitud el tiempo o tiempos de muestreo sanguíneo. 5. Los tiempos de muestreo deben ser apropiados. Los requerimientos enumerados anteriormente son por sí mismos explicativos. Para entender el punto 5, debe recordarse que cualquier muestra tomada durante las fases de absorción o distribución no es útil para el monitoreo. Las muestras tomadas en el tiempo pico permiten sólo una aproximación de datos farmacocinéticos. Las muestras tomadas en el tiempo pico y durante la fase final de eliminación resultarán en una sobreestimación de la constante de velocidad de eliminación y en una subestimación de la vida media de eliminación. Los tiempos óptimos de muestreo para varios métodos de regímenes de dosificación figuran en la Fig. 56-12. En la Tabla 56-1 figuran los tiempos de muestreo, las vidas medias de eliminación y los rangos terapéuticos de 18 fármacos comúnmente monitoreadas.ref(2099) Limitaciones. La capacidad de monitorear un fármaco específico en una muestra sanguínea puede a veces estar limitada porque (1) no está disponible la información exacta acerca de los tiempos de administración de fármaco y de extracción de sangre, (2) no está disponible un método de ensayo confiable, y (3) no es razonable el tiempo de análisis de laboratorio. La mayoría de las dificultades experimentadas en el monitoreo son causadas por información limitada o inexacta, debiendo también considerarse la precisión del ensayo. El coeficiente de variación de un ensayo puede ser importante cuando la concentración de fármaco se encuentra en el extremo inferior o superior del rango terapéutico. Los rangos terapéuticos reportados en la Tabla 56-1 son valores promedio aplicables a la mayoría de los pacientes. Debe recordarse que la concentración terapéutica o la concentración tóxica pueden ser diferentes para un paciente en particular (ver Fig.56-6).

Evaluación por cálculos farmacocinéticos Para evaluar muestras de sangre farmacocinéticamente, debe conocerse si la concentración de fármaco corresponde al estado estacionario. Para decidir si se ha alcanzado el estado estacionario, es necesario conocer el régimen de dosificación (dosis e intervalo de dosis) y por cuánto tiempo ha estado vigente este régimen de dosificación. Generalmente, se asume que se alcanza un estado estacionario cuando el régimen de dosificación ha sido implementado por un tiempo mayor a cuatro veces la vida media de eliminación del fármaco. Si el régimen ha estado en vigencia por menos de 4 vidas medias, debería saberse el número de dosis administradas antes de obtener la muestra. Usando las ecuaciones farmacocinéticas clásicas, puede calcularse cuál sería la concentración de fármaco, basándose en parámetros farmacocinéticos promedio de la literatura y en la información propia del paciente (edad, peso corporal, sexo, altura, estado renal, etc.). El propósito del monitoreo de fármacos es comparar la concentración de fármaco observada con la esperada o deseada. La concentración 2246

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observada puede ser igual, menor, o mayor que la deseada. En los últimos dos casos puede indicarse y recomendarse un ajuste del régimen de dosificación. Si la concentración de fármaco medida, C x , difiere de la concentración deseada (C av ss ss des , o C máx des ), debe tratarse de encontrar la razón de la desviación. Enseguida se presentan algunas causas generales y probables. Una concentración mayor que la esperada podría asociarse con una biodisponibilidad incrementada de una fármaco de biodisponibilidad generalmente baja (por ejemplo, la cimetidina incrementa la biodisponibilidad del propranolol), incumplimiento del paciente (tal como uso de mayor cantidad de fármaco o a intervalos de dosificación más cortos que los prescritos, o depuración total disminuida (como ocurre en el fallo renal o hepática y en la insuficiencia cardíaca congestiva), o aumento de la unión a proteínas. Una concentración menor que la esperada podría ser el resultado de una biodisponibilidad disminuida (posible interacción con otras fármacos), dosificación insuficiente de fármaco (intervalos de dosis más largos, dosis perdidas, o incumplimiento), incremento en la depuración total (interacción de fármacos o inducción enzimática), o disminución de la unión a proteínas

Análisis farmacocinéticos más complejos Las ecuaciones anteriormente presentadas son básicas, pero razones de espacio y conocimiento previo impiden el tratamiento del tema en forma más detallada. El propósito de este capítulo es presentar una revisión general y transmitir una comprensión general de los principios farmacocinéticos involucrados, incluyendo los regímenes de dosificación.

Parte II: Aspectos prácticos del MFT MICHAEL OELLERICH VICTOR W. ARMSTRONG

Rango Terapéutico Aunque los rangos terapéuticos han sido establecidos empíricamente en numerosos estudios clínicos para ayudar a la interpretación de las mediciones de fármacos, la concentración de fármaco debe ser siempre interpretada en el contexto de todos los datos clínicos. A diferencia de los intervalos de referencia en química clínica, no hay un concepto o protocolo aceptado generalmente acerca de cómo establecer el rango terapéutico de una fármaco. Estos rangos terapéuticos, por lo tanto, varían ligeramente en toda la literatura y deberían usarse sólo como una guía general. Ellos representan el rango de concentraciones de fármaco dentro del cual es relativamente alta la probabilidad de la respuesta clínica deseada y es relativamente baja la probabilidad de toxicidad inaceptable. Los médicos nunca deben asumir, sin embargo, que una concentración sérica dentro del rango terapéutico es segura y efectiva para cada paciente. Los rangos terapéuticos recomendados para algunos fármacos comúnmente monitoreados figuran en la Tabla 56-1. Las concentraciones séricas dentro del 2247

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rango terapéutico de una fármaco producirán una respuesta farmacológica en la mayoría de los pacientes. A concentraciones por encima del límite superior del rango terapéutico puede esperarse una mayor incidencia de efectos tóxicos colaterales sin que aparezca por regla general un progreso sustancial en el efecto terapéutico. El rango entre la concentración de fármaco requerida para producir la respuesta terapéutica y aquélla que produce un efecto tóxico determina cuán cuidadosamente debe monitorearse la dosificación del fármaco. La relación entre estas concentraciones se llama índice terapéutico, y se expresa como la mínima concentración (o dosis) que produce toxicidad dividida por la mínima concentración (o dosis) que produce la respuesta terapéutica en una población de pacientes. Cuando esta relación es igual o menor de 2, el compuesto puede ser difícil de utilizar sin que aparezca en los pacientes significativa toxicidad. En la Tabla 56-1 figuran los valores de concentración tóxica de fármaco por encima de los cuales existe una alta probabilidad o un aumento de la probabilidad de efectos adversos. Los rangos terapéuticos pueden necesitar un ajuste si se administran conjuntamente otras fármacos con acción sinérgica o antagónica. Una concentración sérica de fenitoína considerada dentro del rango terapéutico, puede provocar síntomas tóxicos cuando están presentes otras fármacos de acción depresora sobre el sistema nervioso central. Cuando se interpretan concentraciones séricas, también deben tomarse en consideración la existencia de metabolitos farmacológicamente activos y alteraciones en la unión a proteínas. Cuando ciertas fármacos, como el fenobarbital, son administradas durante largo tiempo, los pacientes pueden desarrollar tolerancia a el fármaco, y puede aumentar el valor del límite superior del rango terapéutico. Las concentraciones deseadas para ciclosporina A dependen de la indicación para el tratamiento, del tiempo posterior a la iniciación de la terapia, y de la terapia inmunosupresiva concurrente.refs(2100) Por lo tanto, el rango terapéutico para ciclosporina A puede tomarse sólo como una guía general. Muchos centros de transplanteref(2101) recomiendan concentraciones deseadas más altas durante el período temprano postoperatorio y luego ir disminuyendo las dosis hasta alcanzar una concentración de mantenimiento menor, generalmente tres a seis meses después del transplante. Para una correcta interpretación de los niveles de fármacos, es imperativo conocer el intervalo de tiempo entre la administración de la última dosis y la extracción de sangre. Las tomas de muestras siempre deben ser realizadas en el estado estacionario para terapias de largo plazo. En la práctica, las muestras generalmente se toman después de transcurridas cuatro a cinco vidas medias, cuando normalmente se ha alcanzado más del 90 % de la concentración correspondiente al estado estacionario (Fig. 56-8). Se mide la concentración pico o la concentración valle inmediatamente antes de la administración de la próxima dosis, dependiendo de cual sea el interrogante clínico a responder. Cuando una fármaco es administrada por infusión intravenosa, las muestras de sangre deben tomarse después de que la fase inicial de distribución se ha completado, generalmente una a dos horas después. Sin embargo, para digoxina y digitoxina el tiempo para llegar al equilibrio después de la administración oral o intravenosa es normalmente de ocho a doce horas. Para que las concentraciones en suero reflejen mejor el efecto en la actividad cardíaca, las muestras deben tomarse cuando el fármaco alcanzó el equilibrio entre suero y tejido.ref(2102) Para fármacos como fenitoína y fenobarbital, el tiempo de muestreo no es importante, 2248

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porque son relativamente pequeñas las fluctuaciones entre las concentraciones pico y valle en el estado estacionario. Para fármacos como teofilina, de estrecho rango terapéutico y corta vida media, puede ser necesario obtener muestras de sangre en ambos niveles, pico y valle, para determinar si se utiliza la correcta dosificación. En el caso de dosis múltiples diarias de aminoglucósidos, también deben monitorearse ambos valores, pico y valle, para prevenir la administración de dosis inapropiadamente elevadas, que podrían predisponer al paciente a la nefrotoxicidad u ototoxicidad.ref(2103) Para dosis diarias únicas,ref(2104) puede ser necesario solamente monitorear el nivel valle, o un nivel obtenido a un intervalo definido después de la infusión.ref(2105) Algunas de las causas más comunes para explicar los inesperados resultados de concentraciones séricas de fármaco que pueden aparecer en ciertos pacientes, figuran en el cuadro A de páginas anteriores. Será necesario ajustar la dosificación del fármaco si estos factores no pueden ser eliminados, o si no puede asegurarse el adecuado cumplimiento por parte del paciente.

Métodos de Predicción de Dosis La estimación de la dosis requerida para alcanzar una concentración de fármaco en el rango terapéutico ha sido establecida basándose en los niveles hallados en poblaciones control. El uso de esta información se denomina dosificación farmacocinética basada en la población. Los valores estimados se presentan en forma de tablas o nomogramas que permiten al médico elegir la dosis adecuada basándose en ciertos rasgos del paciente (por ejemplo edad, enfermedades, hábito de fumar). Aunque estos métodos no son caros, tienen frecuentemente un importante error de predicción. Por ello, para facilitar la adaptación de la dosificación individual, han sido desarrollados métodos de predicción que permiten estimar en un individuo la depuración del fármaco a partir de unas pocas mediciones de su concentración.

Ajuste de la dosificación en el estado estacionario La depuración es el parámetro más importante a considerar cuando se pretende diseñar un régimen de dosificación racional. En el estado estacionario, se puede estimar fácilmente la depuración, dividiendo la velocidad de dosificación por la concentración sérica promedio de fármaco en dicho estado estacionario. Para aquellos fármacos que presentan una depuración linealmente proporcional a la dosis, puede calcularse la dosis nueva (DN) para alcanzar la concentración deseada a partir de la dosis real (DR), la concentración sérica real en estado estacionario (CR), y la concentración sérica deseada (CD), de acuerdo a la siguiente ecuación: DN = DR / CR x CD

Ec. 56-5

En la práctica, son empleadas las concentraciones valle en lugar de las concentraciones promedio en estado estacionario. El uso de la ecuación 56-5 es limitado en aquellos pacientes cuyos parámetros LADME se encuentran en los extremos de los rangos habituales. En esos casos, los niveles pico y valle pueden no modificarse de una manera lineal después de un ajuste 2249

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de la dosificación. Debido a ello, para estimar los parámetros farmacocinéticos individuales, se utilizan métodos más sofisticados que emplean un pequeño número de mediciones de concentraciones séricas. Los valores estimados son usados para predecir el esquema óptimo de dosificación, para cuando las mediciones no se realizan en condiciones de estado estacionario, o para aquellos fármacos cuya eliminación no puede ser descrita por una cinética de primer orden.

Métodos de tres puntos de Sawchuk El método de Sawchuk para la predicción de la dosificación requiere de la determinación de (1) un nivel de pre dosis, (2) una concentración del fármaco obtenida 30 minutos después de la finalización de una infusión intravenosa continua, y (3) una concentración adicional medida una hora antes de la próxima dosis.ref(2106) Si se asume un modelo de un compartimento, la constante de velocidad de eliminación puede estimarse de la pendiente de la curva concentración - tiempo (ver Fig. 56-9). El volumen de distribución, V d , puede calcularse de acuerdo a la siguiente ecuación:

Vd

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Ec. 56-6

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donde: D t k C0 C

= = = = =

dosis duración de la infusión continua constante de velocidad de eliminación nivel de pre dosis concentración inicial teórica

La depuración, Dp , será el producto de la constante de velocidad de eliminación k por el volumen de distribución V d.

Predicción Bayesiana La depuración y el volumen de distribución de un paciente individual pueden ser obtenidos a partir de la aplicación de la fórmula de Bayes a la estimación de parámetros farmacocinéticos.ref(2107) Esta aproximación utiliza información obtenida previamente acerca del rango de distribución de los parámetros farmacocinéticos dentro de la población, en combinación con los datos de una o más concentraciones séricas del fármaco observadas en forma individual. La estimación de los parámetros farmacocinéticos en el paciente individual se obtienen a partir de la fórmula de Bayes. Puede mejorarse la calidad de la estimación tomando en cuenta datos específicos del paciente (como edad, sexo, enfermedades, medicación). 2250

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Teniendo los datos correspondientes al paciente, se obtiene el mejor ajuste para los valores de depuración y volumen de distribución. Estos programas Bayesianos están disponibles actualmente en forma comercial y pueden aplicarse a distintos fármacos.refs(2108) El valor prospectivo del modelo de predicción Bayesiano ha sido demostrado en pacientes recibiendo aminoglucósidos.refs(2109) Las recomendaciones de tipo farmacocinético clínico facilitadas por el laboratorio conducen a menores costos directos de hospitalización, incluyendo reducción de la estancia en el hospital, ilustrando así el efecto de ahorro de costos provocado por el uso racional de los modelos predictivos para el monitoreo de fármacos terapéuticos.

Indicaciones clínicas para el MFT La necesidad de monitoreo es muy dependiente del estado clínico del paciente para aquellos fámacos de las cuales se conoce su respuesta a la dosis y su toxicidad. Las indicaciones clínicas para la necesidad de obtener información acerca de las concentraciones del fármaco figuran en el cuadro siguiente:

Situaciones clínicas que requieren MFT Sospecha de sobredosis del fármaco * Ausencia de efecto terapéutico Problemas de cumplimiento Efectos tóxicos indiferenciables de los síntomas específicos de la enfermedad Interacción con otros fármacos o terapia multifármaco Fármaco utilizada profilácticamente Etapas de la enfermedad que alteran la respuesta farmacocinética Optimización de la dosis en el paciente crítico * Medicación desconocida, como ocurre en un paciente en estado de coma * Terapia de rescate con leucovorina durante el tratamiento con altas dosis de methotrexate * *Indicaciones para medir los niveles del fármaco en un laboratorio capaz de realizar pruebas de urgencia

En la aplicación profiláctica de fármacos es esencial conocer si la concentración del fármaco se encuentra en el rango terapéutico deseado para prevenir los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo típico es la determinación de los niveles de teofilina para asegurarse que están dentro del rango que previene los ataques de asma. El conocimiento de las concentraciones del fármaco es crítico para el manejo del paciente cuando son similares los síntomas provocados por la toxicidad del fármaco y los 2251

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propios de la enfermedad subyacente. Pueden citarse los siguientes ejemplos: (1) Las contracciones ventriculares prematuras pueden indicar tanto una enfermedad cardíaca intrínseca, como toxicidad a digitalis. (2) Niveles elevados de quinidina o procainamida pueden inducir arritmias ventriculares similares a las controladas terapéuticamente por estos mismos fármacos. (3) La taquicardia no puede utilizarse para diagnóstico de sobredosis con teofilina, porque también está presente en pacientes con obstrucción respiratoria severa. (4) Dosis tóxicas de fenitoína pueden provocar convulsiones, que son también sintomáticas de la enfermedad epiléptica subyacente. La medición de los niveles del fármaco en suero es requerida para optimizar la dosificación del fármaco en los casos en los que se sospecha una interacción con otros fármacos, o cuando se conoce que el fármaco en cuestión presenta considerable variabilidad farmacocinética intraindividual e interindividual. Debe enfatizarse que cuando el paciente está severamente enfermo, la absorción del fármaco, la unión a proteínas, y la eliminación del fármaco, pueden modificar la concentración del fármaco efectiva, o facilitar la acumulación de metabolitos potencialmente tóxicos. La determinación de las concentraciones del fármaco es necesaria cuando se sospechan cambios en su biodisponibilidad o cuando aparecen efectos adversos en forma persistente. El monitoreo también es necesario para evitar la toxicidad que se observa, por ejemplo, en pacientes bajo tratamiento con altas dosis de methotrexate, donde las severas reacciones adversas son generalmente evitables si las dosis del antídoto correspondiente, leucovorina, se ajustan de acuerdo a las concentraciones séricas de methotrexate.

Muestro y Frequencia del Monitoreso de Fármacos Muestreo Se utilizan muestras de suero o plasma para la determinación de los niveles circulantes de la mayoría de los fármacos. Sin embargo, hay excepciones como la ciclosporina A,refs(2110) para la cual la matriz preferida es sangre entera. En el monitoreo de fármacos terapéuticos, son de fundamental importancia la exactitud y precisión del tiempo de administración del fármaco y del tiempo al cual se obtiene la muestra de sangre. Este parámetro, el tiempo, es frecuentemente el más difícil de respetar. Los programas de aseguramiento de calidad deben estar dirigidos a asegurar la obtención de esa información. Los tiempos de toma de muestra para los fármacos más comúnmente monitoreados figuran en la Tabla 56-1. La muestra debe estar acompañada de un formulario que contenga todos los datos demográficos del paciente, como así también, fecha y hora de extracción. Deben incluirse también los datos de cantidad de dosis, intervalo de dosis, tiempo desde la última dosis, vía de administración, y otras medicaciones administradas.

Frecuencia del monitoreo de fármacos 2252

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Además de los casos críticos descritos anteriormente, la frecuencia del monitoreo dependerá mucho de la situación clínica del paciente, la experiencia del médico, la vida media del fármaco, y si las concentraciones séricas alcanzaron o no el estado estacionario. En pacientes críticos tratados con fármacos como los aminoglucósidos, que tienen rápidos cambios en su depuración, puede ser necesaria una modificación diaria de la dosis del fármaco. Para otros fármacos, como la ciclosporina A, la variabilidad de la respuesta, y por lo tanto, la variabilidad de la dosis requerida, implica que el monitoreo del nivel sanguíneo de este fármaco debe empezar inmediatamente después de la iniciación de la terapia. En estos casos, hay que recordar que el fracaso para alcanzar una adecuada concentración en sangre puede ser fatal debido a que la sobredosis provoca severos efectos tóxicos. Sin embargo, el monitoreo puede relajarse con el tiempo por razones de conveniencia y de costos. El monitoreo de los niveles de ciclosporina A se realiza de 4 a 7 veces por semana durante la hospitalización temprana post-transplante, después de un transplante de hígado, corazón o riñón. Después de este monitoreo inicial intensivo, las mediciones de los niveles sanguíneos pueden gradualmente reducirse. Por ejemplo, en casos de pacientes que recibieron un transplante renal, y tienen una evolución sin complicaciones, las concentraciones de ciclosporina A deben ser monitoreadas una vez por mes durante el primer año, y en adelante, a intervalos de 1 a 3 meses.ref(2111) Sin embargo, no hay reglas fijas ni rígidas, y las mediciones deben ser realizadas si los signos clínicos o síntomas indican la necesidad de un ajuste de la dosis. El monitoreo frecuente suele ser requerido cuando se inicia una terapia con una determinado fármaco, o cuando se busca optimizar la dosis de la misma. Por ejemplo, en aquellos pacientes con insuficiencia renal moderada a severa, el monitoreo frecuente (en este caso, a diario) de los niveles séricos de digoxina es conveniente al inicio de la terapia, debido a la variabilidad del volumen de distribución y a la variabilidad de la eliminación, asociadas a una función renal disminuida. El conocimiento de las concentraciones del fármaco es particularmente importante cuando se administra una alta dosis. Las mediciones frecuentes pueden ser necesarias para monitorear si fue apropiada una modificación del régimen de dosificación, o para evaluar los cambios de la concentración sérica de digoxina inducidos por interacción con otros fármacos. La frecuencia de monitoreo generalmente disminuye para pacientes ambulatorios que reciben un determinado fármaco según una terapia de largo plazo. La frecuencia es en parte dependiente del propio fármaco. Las mediciones de las concentraciones séricas de teofilina son esenciales para el manejo del paciente, debido a su estrecho índice terapéutico y a la relación de la concentración sérica con su eficacia y con su toxicidad. Deben monitorearse durante la fase inicial hasta que se alcance el estado estacionario, y a partir de ese momento, a intervalos regulares, de 6 a 12 meses. Las concentraciones séricas de fenitoína deben monitorearse después de la iniciación de la terapia, para determinar si se alcanzó una concentración terapéutica en suero. Las mediciones pueden realizarse dos semanas a un mes después de iniciada la terapia, porque a ese tiempo generalmente se alcanza el estado estacionario. El dato de la concentración medida debe ser utilizado en forma conjunta con información clínica relevante con el objeto de decidir si se requiere un ajuste de la dosis diaria. En aquellos pacientes con fracasos terapéuticos, signos de sobredosis, o sospecha de incumplimiento, una respuesta inmediata es necesaria para obtener la apropiada medición de 2253

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la concentración sérica del fármaco. La terapia con altas dosis de methotrexate requiere el monitoreo seriado de las concentraciones séricas de methotrexate durante la fase de rescate con leucovorina, porque la dosis necesaria de leucovorina depende del nivel de methotrexate en suero. En pacientes con función renal normal, generalmente es suficiente la medición de los niveles séricos de methotrexate a las 24, 48 y 72 horas.

Tiempos de entrega de resultados Un servicio de laboratorio, que entregue los resultados de las mediciones de las concentraciones séricas del fármaco en el mismo día, es apropiado para la mayoría de los fármacos que figuran en la Tabla 56-1. Cuando es necesario un ajuste de la dosis, los resultados serán obviamente requeridos antes de la administración de la dosis siguiente. Dado que los niveles de aminoglucósidos son solicitados tanto en su nivel pico como en su nivel valle, es más exacto y eficiente obtener ambas muestras durante el mismo intervalo de dosis. El laboratorio puede medir ambos niveles en la misma tanda analítica y minimizar así la varianza. Esta respuesta inmediata del laboratorio permite frecuentemente entregar los resultados al médico solicitante en el mismo día, brindando así el tiempo suficiente para establecer un nuevo régimen de dosificación.

Análisis de urgencia (tipo stat) En ciertas situaciones clínicas, puede ser necesaria la inmediata determinación de los niveles séricos del fármaco. Algunas de la indicaciones más importantes para la rápida medición de los mismos, figuran en el cuadro B. Los fármacos que más probablemente requieran ser monitoreadas por un laboratorio de urgencia (tipo stat) figuran en el cuadro C, y pueden ser divididas en dos categorías, dependiendo de la urgencia del análisis.

Fármacos para los cuales debe disponerse de análisis tipo stat en el laboratorio de urgencia Análisis tipo stat en sospecha de sobredosis Teofilina Digoxina Fenitoína, Fenobarbital, Carbamazepina Ácido salicílico, acetaminofeno Litio, antidepresivos tricíclicos, barbituratos, benzodiazepinas Otros análisis Tobramicina, amikacina, gentamicina, netilmicina Ciclosporina, tacrolimus (FK506) Methotrexate

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Si se sospecha de una sobredosis, inmediatamente debe llevarse a cabo un análisis, porque es una situación con potencial riesgo de muerte. La medición de antidepresivos tricíclicos en intentos de suicidio es un ejemplo de lo mencionado. El conocimiento de los niveles del fórmaco padre y metabolitos es útil para dilucidar la intoxicación con estos fármacos. Ocasionalmente, los análisis deben realizarse fuera de la rutina normal de trabajo del laboratorio o fuera de los horarios habituales. Ejemplos: (1) la determinación urgente de los niveles séricos de aminoglucósidos en enfermos críticos para quienes es necesario un ajuste en la dosis individual, (2) protocolos específicos de tratamiento con altas dosis de methotrexate y terapia de rescate con leucovorina, en los que es necesario conocer las concentraciones séricas de methotrexate, (3) medición de los niveles de ciclosporina A y tacrolimus, que pueden ser requeridos los siete días de la semana, particularmente después de un transplante hepático.

Aseguramiento de la Calidad Control de Calidad Los programas de control de calidad utilizan materiales de control de calidad comercialmente disponibles, como así también programas específicos para MFT. El MFT se diferencia de otras determinaciones de química clínica en que el nivel del compuesto analizado se alcanza modificando la dosis administrada. Por ello, los médicos tienen que tener confianza en los datos de las concentraciones medidas, y para el laboratorio es importante alcanzar una exactitud satisfactoria y una precisión analítica que estén dentro de límites aceptables. Han sido propuestos ciertos indicadores de calidad basados en la teoría farmacocinética y en estrategias de consenso.ref(2112) Recientemente, han sido aplicados principios estadísticos para el establecimiento de objetivos analíticos para la determinación de la concentración de teofilina en suero.ref(2113)

Aviso de valores críticos A veces, es necesario comunicar en forma urgente una concentración crítica del fármaco al médico o institución de salud solicitante. Los valores críticos incluyen altas concentraciones asociadas con riesgo aumentado de toxicidad para ese fármaco particular (ver Tabla 56-1), o bajas concentraciones inadecuadas para lograr el efecto terapéutico deseado. Como posibles causas de concentraciones inesperadas del fármaco, habitualmente deben excluirse (1) el error analítico, chequeando el control de calidad interno utilizado en la determinación analítica de la muestra, y (2) el posible error preanalítico, (por ejemplo, inversión de valores pico y valle como consecuencia de una confusión de muestra, tiempo de toma de muestra inapropiado, o muestra tomada de alguna vía de infusión usada para administrar el fármaco).

Fármacos Utilizados para Precidir el Funcionamiento de Órganos 2255

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Dado que los fármacos no son compuestos pasivos, su metabolismo ha sido utilizado para medir el funcionamiento de un órgano, basándose en que la incapacidad de metabolización es indicativa de una disfunción orgánica. Se ha utilizado el metabolismo de fármacos para determinar la función hepática, asumiendo que la medición cuantitativa de la capacidad del hígado para metabolizar ciertos fármacos puede servir como una estimación de la función hepática. Por ejemplo, una prueba de función hepática utiliza lidocaína, fármaco que es convertido a su metabolito monoetilglicinxilidida (MEGX), por medio del sistema citocromo P-450 presente en hígado. Una prueba dinámica de función hepática ha sido diseñadaref(2114) basándose en la medición de MEGX en suero, antes y 15 o 30 minutos después de la administración de un bolo estandarizado de lidocaína ( 1 mg/kg de peso corporal inyectado durante dos minutos). La pérdida de la habilidad para metabolizar el fármaco, como así también una disminución del flujo sanguíneo hepático funcional, provocan una disminución en la producción de MEGX. Como este metabolito puede ser rápidamente medido, la prueba de MEGX es particularmente valiosa en el campo del transplante hepático,refs(2115) y en la evaluación de función hepática en niños con enfermedad hepática crónica.ref(2116) Además, dada la versatilidad de esta prueba, su empleo está siendo intensamente estudiado para monitorear función hepática en otras enfermedades.refs(2117)

Perspectivas Futuras El número de fármacos que debe monitorearse para optimizar la terapia continúa en crecimiento a medida que nuevos agentes son aprobados para uso clínico en seres humanos. El monitoreo es esencial para aquellas medicaciones con índices terapéuticos bajos. Para monitorear dichos fármacos serán necesarios recursos adicionales. El beneficio terapéutico será mayor en aquellas situaciones clínicas en las que sea posible medir nivel del fármaco libre en lugar de nivel del fármaco total.refs(2118) Serán requeridos análisis más específicos para el monitoreo de los enantiómeros del fármaco, en vez de las mezclas racémicas que se miden actualmente.ref(2119) Los anticuerpos monoclonales utilizados con fines terapéuticos también son candidatos potenciales para el monitoreo de sus concentraciones en suero. Finalmente, la individualización de la terapia basada en el conocimiento de la farmacogenética del paciente jugará un papel importante en el monitoreo de fármacos.

Métodos de Análisis Fármacos anticonvulsivantes PAUL SALM PAUL J. TAYLOR JULIA M. POTTER

Principios del análisis y uso corriente. La mayoría de los fármacos anticonvulsivantes tienen características específicas en el espectro ultravioleta que fueron explotadas en los intentos iniciales para monitorear los niveles 2256

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terapéuticos de estos fámacos.ref(2120) Por ejemplo, después de su extracción y separación por cromatografía de capa delgada, la cuantificación se hacía examinando mediante un barrido la placa a la luz ultravioleta, o eluyendo el fármaco de la placa y registrando su absorción ultravioleta.ref(2121) Durante muchos años, las técnicas de cromatografía gaseosa (GC) fueron las más importantes para el análisis de estos compuestos en fluidos biológicos. (Ver Tabla 56-2, método 1).ref(2122) Los métodos de cuantificación más comúnmente usados eran los sistemas de detección por ionización de llama (FID) o el más sensible, por nitrógeno selectivo (NSD). Aproximadamente la mitad de los métodos de CG no requieren transformación de los fármacos anticonvulsivantes,ref(2123) pero, en aquellos procedimientos que utilizan la transformación de la muestra, la metilación es el método más comúnmente empleado. Las columnas capilares de sílica fundida son las preferidas debido a su estabilidad a altas temperaturas y a su calidad de inertes, lo cual no sólo elimina la necesidad de transformación, sino que además ofrece mayor selectividad, sensibilidad y velocidad.ref(2124) Los métodos de HPLC, Cromatografía Líquida de Alta Resolución, (Tabla 56-2, método 2), requieren la purificación del fármaco antes del análisis, ya sea por extracción con solventes orgánicos o por precipitación con proteínas. Casi todos los métodos utilizan cromatografía en fase reversa con detección por absorción ultravioleta.refs(2125) Los procedimientos inmunológicos (Tabla 56-2, métodos 3 a – 3 h) desarrollados para la medición de anticonvulsivantes incluyen radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (IEE), inmunoensayo enzimático fluorométrico (IEFE), inmunoensayo fluorescente (IEF), inmunoensayo de polarización fluorescente (IEPF), inmunoensayo de inhibición nefelométrico (NIA), inmunoensayo de enzima donante clonada (IDEC), e inmunoensayo de multicapa de película seca (IMPS). La introducción de la técnica de inmunoensayo enzimático (EMIT, Syva Co., Inc., Palo Alto, CA 94303) en los años 1970s hizo posible el monitoreo de rutina para todos los fármacos anticonvulsivantes (Tabla 56-2, método 3b). Este inmunoensayo enzimático homogéneo está basado en la técnica de unión competitiva a proteína, con una enzima como marca y un anticuerpo como proteína de unión (ver capítulo 13). Este es el segundo método más frecuentemente utilizado de acuerdo a los programas sobre monitoreo de fármacos terapéuticos llevados a cabo por el C.A.P. en 1995. El inmunoensayo enzimático fluorométrico (FEIA, Baxter Diagnostics Inc., Deerfield, IL 60015) es un método de unión competitiva que está basado en el principio de inmunoensayo de partición radial, el cual combina la técnica inmunológica en fase sólida y la cromatografía radial (Tabla 56-2, método 3c). En IEFE, el fármaco de interés presente en la muestra clínica se premezcla con el conjugado de enzima marcada y se coloca en un papel de filtro de fibra de vidrio que contiene al anticuerpo inmovilizado. El fármaco y el fármaco marcado compiten por los sitios de unión del anticuerpo. Después de un adecuado período de incubación, la marca no unida es removida del centro de la zona de reacción a través de una elución radial cuando se aplica una solución de lavado. Esta solución también contiene el sustrato para la enzima e inicia la actividad enzimática simultáneamente con el lavado. La actividad enzimática de la fracción unida en el centro de la zona de reacción es cuantificada por fluorescencia de superficie frontal, y es inversamente proporcional a la concentración del fármaco presente en la muestra.ref(2126) La automatización de esta tecnología requiere 2257

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equipamiento especializado y sólo es utilizada por pocos laboratorios. El inmunoensayo de polarización fluorescente (IEPF) está basado en el principio de unión competitiva y mide la unión del fármaco marcada con fluoresceína directamente por polarización fluorescente (ver Tabla 56-2, método 3d , y capítulo 13 para una descripción más detallada). El método IEPF puede ser altamente automatizado y proporciona resultados muy precisos.ref(2127) Se ha convertido en el procedimiento más ampliamente utilizado, de acuerdo a los datos obtenidos a partir de diferentes programas de monitoreo de fármacos terapéuticos. El Ames Seralyser tiene métodos para la dosificación de fenitoína y fenobarbital que emplean un ensayo de grupo prostético marcadoref(2128) (ver Tabla 56-2, método 3e, y capítulo 13 para una descripción más detallada). Este ensayo también se usa en consultorios médicos, según técnicas de pruebas en el sitio de atención. Un inmunoensayo nefelométrico cinético de inhibición es el procedimiento empleado por el Inmunochemistry Systems (ICS) de Beckman Instruments,Inc.(Fullerton, CA 92634) (Tabla 56-2, método 3f). En este ensayo el fármaco anticonvulsivante está unido en forma covalente a una proteína. El fármaco de la muestra del paciente compite con el fármaco unido a proteína por la unión a un anticuerpo. La velocidad de cambio de la dispersión de la luz está inversamente relacionada a la concentración del fármaco.ref(2129) Este método sólo es utilizado por un pequeño número de laboratorios. Una técnica de inmunoensayo homogéneo, inmunoensayo de enzima donante clonada (CEDIA, Microgenics Corporation, Concord, CA 94520) utiliza fragmentos de enzima Beta-galactosidasa obtenidos por ingeniería genética (Tabla 56-2, método 3g).ref(2130) La automatización de esta tecnología puede efectuarse en muchos analizadores de rutina de química clínica. El sistema OPUS de inmunoensayo (PB Diagnostic Systems Westwood, MA 02090) está basado en la combinación de la tecnología de película multicapa y el inmunoensayo competitivo (Tabla 56-2, método 3h).ref(2131) Un chip recubierto por una película de múltiple capa es encasillado en un módulo plástico de prueba. Se aplica la muestra de suero a la capa superior del módulo de prueba. Esta capa contiene componentes amortiguadores, surfactantes, y otros reactivos (tales como el anticuerpo y el fármaco hapteno marcado), y también actúa como un filtro para prevenir la interferencia de la proteína con la inmunorreacción. La muestra difunde desde la capa superior recubierta a través de un tamiz de óxido de hierro hacia la capa de señal. El óxido de hierro sirve para bloquear la excitación de la marca fuera de la capa de señal. La capa de señal contiene fármaco con marca fluorescente unida a un anticuerpo monoclonal específico para el fármaco a ensayar. El antígeno de la muestra desplaza al antígeno marcado de los sitios de unión de los anticuerpos. El antígeno marcado no unido luego difunde a las capas superiores donde no puede ser medido. El equilibrio ocurre entre 3 a 5 minutos, después de los cuales la señal fluorescente del conjugado remanente es medida desde el fondo del módulo de prueba por fluorometría de superficie frontal. La intensidad fluorescente medida es inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra de suero. Especimen. La muestra habitual es suero, aunque los tubos separadores de suero no son recomendables porque pueden adsorber fármaco y dar por lo tanto resultados no confiables. 2258

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Rango terapéutico. Los rangos terapéuticos generalmente aceptados para la mayoría de los fármacos anticonvulsivantes que están supeditadas al monitoreo de fármacos terapéuticos son los siguientes:

Carbamacepina Etosuccimida Fenitoína Fenobarbital Primidona Valproato

mg/L 4 - 12 40 - 100 10 - 20 15 - 30 5 - 12 50 - 100

µmol/L 17 - 51 280 - 460 40 - 80 65 - 170 23 - 55 350 - 700

Ciclosporina A LESTER SHAW

Fundamentos del análisis La dosificación de ciclosporina A (CsA) se efectúa por una de dos técnicas: cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) e inmunoensayo. Todos los procedimientos de inmunoensayo disponibles han mostrado buena correlación con HPLC. Sin embargo, tanto el fármaco padre, ciclosporina A, como sus metabolitos están presentes en la sangre. Los inmunoensayos detectan los metabolitos por reacción cruzada con la CsA. Por lo tanto, se reportan concentraciones mayores de ciclosporina A por métodos de inmunoensayos que por métodos de HPLC. Por ejemplo, se ha reportado que los inmunoensayos que utilizan anticuerpos policlonales sobreestiman las concentraciones de CsA entre un 51% y 132% cuando se comparan con HPLC.ref(2132) Los nuevos inmunoensayos que utilizan anticuerpos monoclonales de alguna manera han mejorado la especificidad, siendo las concentraciones medidas de CsA sólo de 8% a 48% mayores que por HPLC.ref(2133) Han sido desarrollados varios métodos de HPLC para la dosificación de CsA en sangre entera o plasma (Tabla 56-3, método 1). Las diferencias entre estos métodos incluyen el uso de condiciones de elución isocrática o en gradiente, y la elección del solvente usado para la extracción de la CsA. La extracción de CsA ya sea con éter etílico o metil butílico produce una eficiencia de extracción de aproximadamente el 90%. Aunque los métodos de HPLC tienen la mayor especificidad y exactitud, y continúan siendo el método de referencia, los inmunoensayos han reemplazado ampliamente al HPLC como método de elección. Las diferencias entre las concentraciones de ciclosporina A medidas por HPLC y los varios procedimientos de inmunoensayo parecen ser menos significativas en pacientes con transplantes renales y más significativas en pacientes con enfermedad hepática o transplantes hepáticos.ref(2134) Este perfil es consistente con la inactivación de la ciclosporina A por el metabolismo hepático.ref(2135) Las técnicas de radioinmunoensayo (RIA) (Tabla 56-3, método 2) fueron los procedimientos originales de inmunoensayo usados para medir CsA; desde entonces han sido 2259

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desarrollados radioinmunoensayos monoclonales y policlonales. La resolución analítica de los procedimientos de RIA es similar a la de los procedimientos que no son RIA. Las desventajas de los procedimientos de RIA, tales como la manipulación y el desecho de los compuestos marcados radioactivamente, sumados al largo tiempo de ensayo (6-8 horas), han llevado al incremento del uso de técnicas de inmunoensayo que emplean un marcaje no radioactiva. El inmunoensayo más popular normalmente usado para CsA es el inmunoensayo de polarización fluorescente (FPIA; Abbott Diagnostics Inc., Abbott Park, Illinois),ref(2136) que es un procedimiento automatizado que proporciona un rápido informe del resultado (Tabla 56-3, método 3). Originalmente se introdujo utilizando un anticuerpo policlonal, pero desde entonces, el método ha sido actualizado con el uso de un anticuerpo monoclonal más selectivo para la CsA droga madre. El ensayo requiere un pretratamiento de la muestra de sangre entera antes de su análisis. Ha sido introducido recientemente un inmunoensayo enzimático homogéneo (EMIT; Syva Inc.,Palo Alto,California) (Tabla 56-3, método 4). De todos los inmunoensayos para CsA, el procedimiento de EMIT exhibe la mayor especificidad por el fármaco padre.refs(2137) Aunque el resto del ensayo es automatizado, este procedimiento también requiere, al igual que IEPF, un paso de pretratamiento de la muestra para lisar los glóbulos rojos, solubilizar la CsA, y precipitar las proteínas de la sangre. Especimen Suero, plasma y sangre entera han sido utilizados para la determinación de la concentración de CsA. En sangre entera a 37 ºC, la CsA se halla predominantemente en eritrocitos (57%) y en leucocitos (15%).ref(2138) Sin embargo, ocurre una redistribución de la CsA del plasma hacia las células a medida que la temperatura de la muestra decrece. Por lo tanto, varios factores han conducido a la aceptación general de sangre entera como muestra de elección: (1) No hay efecto alguno de la temperatura sobre el análisis de CsA en sangre entera, (2) el uso de sangre entera elimina los problemas asociados con la separación de la muestra, y (3) el uso de sangre entera resulta en concentraciones medibles de CsA más altas.refs(2139) Sin embargo, desde una perspectiva clínica, no se ha reportado ninguna ventaja entre monitorear CsA en sangre entera versus monitorear CsA en plasma.ref(2140) Aunque también se ha empleado heparina, el anticoagulante recomendado para las muestras de sangre entera es EDTA.ref(2141) Las muestras para el análisis de CsA pueden conservarse hasta una semana entre 2 º C - 8 º C. Para mayores períodos de conservación las muestras deberán congelarse a - 20 º C.60 Rango terapéutico El establecimiento de un rango terapéutico para ciclosporina A ha sido difícil porque es pobre la correlación entre las concentraciones sanguíneas y el efecto inmunosupresor. La incidencia de rechazo de órgano es mayor a concentraciones bajas de CsA, mientras que la toxicidad ocurre más frecuentemente a concentraciones altas. En predosis, las concentraciones en sangre entera mayores de 400 µg/L durante la terapia de mantenimiento están asociadas con una alta posibilidad de toxicidad. Algunos rangos recomendados para CsA en sangre entera, medidos por HPLC, en pacientes con transplante renal, bajo terapia triple del fármaco, son los siguientes: hasta 3 meses después de la cirugía, 150 a 225 µg/L ; después de 3 meses 2260

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de la cirugía, 100 a 150 µg/L (ver capítulo 50).

Gentamicina y otros aminoglucósidos JOSEPH R. DiPERSIO

Fundamentos del análisis La gentamicina y otros antibióticos aminoglucósidos (estreptomicina, kanamicina, tobramicina, amikacina,y netilmicina) son importantes agentes para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos aerobios gram-negativos. El tratamiento con aminoglucósidos es complicado por ser bastante estrecha la ventana terapéutica que existe entre las concentraciones efectivas y tóxicas. Como resultado de esta estrecha ventana terapéutica, es necesario realizar frecuentes mediciones para asegurarse que las concentraciones terapéuticas apropiadas han sido alcanzadas. Los métodos usados para la medición de gentamicina son también aplicables para la medición de los otros aminoglucósidos. Por lo tanto, la medición de gentamicina sirve como prototipo para el análisis de los demás compuestos. El método original usado para cuantificar gentamicina fue el ensayo microbiológico que medía actividad biológica. El método de difusión en placa de agar se basaba en la magnitud de la inhibición del crecimiento bacteriano causado por la difusión de antibiótico desde un disco de papel hacia el agar conteniendo una bacteria indicadora de crecimiento. El procedimiento actual agrega estándares de gentamicina y muestras desconocidas a discos de papel en cantidades cuidadosamente medidas. Los discos son luego colocados sobre la superficie de una placa de agar que contiene la bacteria en crecimiento susceptible al antibiótico. La placa se deja incubar aproximadamente de 4 a 18 horas. Los discos de papel conteniendo antibiótico inhibirán el crecimiento bacteriano en un área que circunda los discos de papel. El diámetro de la zona de inhibición de crecimiento bacteriano está directamente relacionado con la concentración de antibiótico inicialmente aplicada sobre el disco de papel. Se traza una curva estándar representando gráficamente en papel semilogarítmico el diámetro de las zonas de inhibición de crecimiento para cada estándar versus la concentración de antibiótico en cada disco. La concentración de antibiótico en la muestra desconocida se determina por interpolación en la curva estándar. El método en placa de agar tiene varios inconvenientes, incluyendo entre ellos, la presencia de otros fármacos antimicrobianos además de la que está siendo dosificada, y el largo tiempo de análisis. El desarrollo de los inmunoensayos a principios de la década del 70 permitió el análisis rápido y automatizado de los aminoglucósidos y reemplazó a los ensayos microbiológicos. El primer inmunoensayo usado para medir gentamicina fue el radioinmunoensayo ref(2142) (RIA) (Tabla 56-4, método 1). En este procedimiento, la gentamicina es marcada radioactivamente con una enzima bacteriana que transfiere enzimáticamente un sustrato marcado con radioactivo a la gentamicina: (Enzima bacteriana)

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Gentamicina marcada

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El RIA no es muy adecuado para análisis de urgencia tipo stat, y además tiene la desventaja del manejo del desecho del material radioactivo. Por ello, se han desarrollado inmunoensayos de unión competitiva que utilizan marcas enzimáticas o fluorescentes, que son los métodos más populares actualmente en uso. El inmunoensayo de polarización fluorescente (IEPF) es un inmunoensayo homogéneo de unión competitiva que mide el cambio en la fluorescencia polarizada causado por la gentamicina del suero del paciente, que compite con la gentamicina marcada con fluoresceína, por un número limitado de sitios de unión del anticuerporef(2143) (Tabla 56-4, método 2). Otro procedimiento de inmunoensayo homogéneo ampliamente utilizado es la técnica de inmunoensayo enzimático múltiple (EMIT, Syva Co., Palo Alto, California) (Tabla 56-4, método 3). Este procedimiento se basa en la unión competitiva al anticuerpo entre la gentamicina marcada con la enzima glucosa-6-fosfato y la gentamicina de la muestra del paciente. La unión de la gentamicina marcada con enzima al anticuerpo produce una pérdida de la actividad enzimática. Por lo tanto, concentraciones crecientes de gentamicina en la muestra del paciente están directamente relacionadas con la actividad enzimática en la mezcla de reacción. Los procedimientos cromatográficos para aminoglucósidos incluyen cromatografía en placa delgada, cromatografía líquida de alta resolución, y cromatografía de intercambio iónico. Estas técnicas no son generalmente usadas en los laboratorios clínicos para la determinación de aminoglucósidos. Especimen Los especímenes de elección para el análisis de aminoglucósidos por cualquiera de los inmunoensayos son el suero o el plasma obtenido con EDTA. La heparina no es recomendada como anticoagulante porque interfiere en el ensayo.refs(2144) Otros tipos de especímenes como el fluido cerebroespinal, líquido sinovial y otros fluidos no viscosos pueden ser usados en el método inmunológico. Rango Terapéutico En la Tabla 56-5 se muestran los intervalos de referencia aceptados para los antibióticos aminoglucósidos. Litio STEVEN C. KAZMIERCZAK

Principios del análisis y uso corriente El litio no se une a las proteínas plasmáticas, pasando libremente a través de la membrana glomerular y siendo luego absorbido en el túbulo proximal convoluto. Debido a que el litio tiene un índice terapéutico relativamente restringido, el monitoreo de su concentración en sangre debe ser llevado a cabo en forma rutinaria. Hasta hace poco tiempo, la determinación de litio en los laboratorios clínicos era realizado por espectrometría de emisión atómica (AES) (Tabla 56-6, método 1) o por espectrometría de absorción atómica (EAA) (Tabla 56-6, método 2). La EAA es el método de referencia para la determinación del litio.ref(2145) Con la introducción del electrodo 2262

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ion-selectivo para el litio y más recientemente, un ensayo colorimétrico, el uso de la EAA y AES para la determinación de litio ha declinado considerablemente. Los principios generales de la AES fueron discutidos en el capítulo 4. La energía térmica de una llama de aire-propano vaporiza las sales de litio para formar átomos de litio libre. El calor también hace que una pequeña fracción de los átomos de litio en estado basal se excite, elevando un electrón del orbital 2s al orbital 2p, de mayor energía. Debido a la inestabilidad del estado excitado, el electrón del orbital 2p vuelve instantáneamente a su orbital original 2s con una emisión concomitante de energía en forma de luz de 671 nm. La muestra se diluye con una solución que contiene potasio o cesio, que sirve como estándar interno. El potasio o cesio del estándar interno sigue el mismo camino de vaporización, excitación y retorno al estado basal con emisión de luz. La emisión de luz, sin embargo, ocurre a una longitud de onda diferente que para el litio. Midiendo la relación entre la emisión de luz del estándar interno y la del litio se pueden corregir posibles fuentes de error en el análisis. Las fuentes de error pueden ser introducidas por fluctuaciones en la temperatura de la llama, velocidad de aspiración de la muestra, relación de combustible a oxidante y composición de los gases reductores presentes en la llama. Dado que se mide la relación entre la emisión del estándar interno y el litio, las fluctuaciones en la resolución del instrumento que afecten ambos elementos se anularan, y de esta manera el error de medición será minimizado. La mayoría de los procedimientos actuales de AES utilizan cesio como estándar interno. En contraste con el potasio, el cesio no es detectable en suero o plasma, y por lo tanto no es necesaria ninguna corrección por cesio endógeno. Además, utilizando cesio como estándar interno, pueden analizarse en la misma muestra el sodio, el potasio y el litio. La EAA no se usa frecuentemente para determinar litio en fluidos corporales. En el capítulo 4 se hace una revisión de la teoría y aplicaciones de la EAA, que es similar a la AES en que los átomos de litio en estado basal son producidos por el calor generado por una llama de acetileno-aire. Los átomos de litio en estado basal absorben luz de 670.8 nm producida por una lámpara de litio de cátodo hueco. La cantidad de luz que es absorbida es proporcional a la cantidad de litio presente en la llama. El sodio y el potasio en concentraciones de hasta 180 y 8 mmol/L, respectivamente, no interfieren en las determinaciones de litio por EAA.ref(2146) Una cantidad muy pequeña de iones de litio se ionizará en estas condiciones y emitirá luz de 670.8 nm en lugar de absorber la luz de 670.8 nm producida por la lámpara de cátodo hueco. Debido a que el litio que se ioniza puede introducir un error en la medición, a veces se incorpora un donante de electrones que suprime la ionización como el cloruro de estaño. Sin embargo, dado que la cantidad de litio que se ioniza es muy pequeña (aproximadamente 1%), el uso de un compuesto que suprima la ionización no es necesario. El uso de un electrodo ion selectivo (Tabla 56-6, método 3) para la determinación de litio es ahora predominante en los laboratorios clínicos. A diferencia de la EAA y la AES, los instrumentos que incorporan la tecnología del electrodo ion selectivo son automatizados más fácilmente, y necesitan menos tecnología. La membrana ion selectiva incorpora un ionóforo con alta especificidad por el litio. Sin embargo, otros cationes como el sodio, aunque también el potasio, calcio, magnesio y amonio pueden interferir en este método.ref(2147) La mayoría de los instrumentos que incorporan la tecnología del electrodo ion selectivo para las determinaciones de litio corrigen la interferencia del sodio, pero no la de otros cationes. Las concentraciones de litio determinadas usando la tecnología del electrodo ion selectivo pueden 2263

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compararse favorablemente con las encontradas usando AES o dilución isotópica/espectrometría de masa.ref(2148) El método más reciente para la determinación de litio es colorimétrico (Tabla 56-6, método 4), y usa como cromóforo un tipo específico de éter, de los que químicamente forman una corona y de los cuales hay 15 tipos disponibles. La muestra se deposita sobre una placa de reactivo seco donde el litio se une específicamente a un conjugado del éter mencionado. Debido a que el cromóforo es específico para el litio, no se requiere ninguna corrección por interferencia de otros cationes endógenos. La unión del litio al éter provoca un corrimiento de 400 a 600 nm en el pico de absorbancia del cromóforo. El incremento de absorbancia en 600 nm es proporcional a la concentración de litio en la muestra. La comparación entre las determinaciones de litio llevadas a cabo por el método colorimétrico y la técnica de AES reveló una desviación insignificante y una buena correlación entre los resultados.ref(2149) Especimen El suero o plasma son especímenes aceptables. Si se usa plasma, los anticoagulantes preferidos son la heparina sódica o amónica. Se han observado interferencias con la tecnología del electrodo ion selectivo cuando se usa plasma anticoagulado con EDTA, oxalato/fluoruro y citrato de sodio.ref(2150) Debe evitarse el uso de heparinato de litio. El litio es completamente absorbido del tracto gastrointestinal dentro de 1 a 2 horas después de la ingestión. Para el monitoreo de rutina, normalmente se toman muestras 8 a 10 horas después de una dosis oral. El suero o plasma debe ser separado de las células si el análisis no se va a llevar a cabo dentro de las 4 horas de la toma de muestra. Una vez separado el suero o plasma, el litio es estable por lo menos 24 horas a temperatura ambiente, 7 días a 4 ºC y más de 6 meses a –18 ºC. Rango Terapéutico Se han reportado concentraciones terapéuticas de litio en suero o plasma en el rango de 0.3 a 13 mmol/L, mientras que las concentraciones tóxicas son las superiores a 2.5 mmol/L.ref(2151) Los efectos secundarios asociados con la toxicidad del litio son: vómitos, ataxia, pérdida de conciencia que conduce al coma, rigidez muscular, pirexia suave y cambios en el electroencefalograma. Las concentraciones de litio dentro de los glóbulos rojos pueden ser determinadas como una guía para estimar las concentraciones de litio dentro de los tejidos y para detectar el incumplimiento de la terapia por parte del paciente, ya que el equilibrio entre el plasma y los glóbulos rojos sólo se establece después de un uso regular.ref(2152) Para pacientes con concentraciones terapéuticas de litio en suero, las concentraciones correspondientes de litio en los glóbulos rojos son de 0.2 a 0.8 mmol/L.ref(2153)

Teofilina y cafeína SAEED A. JORTAMI Principios del análisis y uso corriente La teofilina y la cafeína son agentes farmacológicos que poseen la capacidad de relajar 2264

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los músculos lisos de los bronquiolos, llevando a la vasodilatación. Después de la administración, la teofilina es rápida y casi completamente absorbida, alcanzándose el pico de concentración en el plasma a las 2-3 horas. En neonatos, la teofilina es metilada para formar cafeína. La cafeína es tan efectiva como la teofilina para el tratamiento de la apnea en neonatos. Por lo tanto, en los neonatos que reciben teofilina deben monitorearse las concentraciones tanto de teofilina como de cafeína. Una gran cantidad de técnicas han sido desarrolladas para la determinación de teofilina en suero. Algunos de esos métodos pueden ser también utilizados para la determinación de cafeína. El primer método de rutina desarrollado para la determinación de teofilina fue espectrofotométrico (Tabla 56-7, método 1). La teofilina del suero se extrae con una mezcla de cloroformo e isopropanol, y luego ésta se reextrae con una solución diluida de hidróxido de sodio. La absorbancia del extracto final se mide en 277 y 310 nm. La concentración del fármaco en la muestra desconocida se determina por interpolación en una curva estándar preparada con calibradores que contienen cantidades conocidas de teofilina. Este método espectrofotométrico es sólo de interés histórico y hoy es raramente usado. La determinación de teofilina por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Tabla 56-7, método 2) es una técnica aceptable, aunque en la actualidad es muy poco usada. Aunque los métodos por HPLC son menos costosos que otras técnicas, la amplia disponibilidad de métodos inmunológicos para teofilina, que son fácilmente automatizables, limitan su uso. Se han reportado métodos por HPLC que no requieren extracción de la teofilina del suero y pueden realizarse con sólo 10 microlitros de muestra. ref(2154) Sin embargo, se ha encontrado que varios fármacos como la ampicilina, meticilina,ref(2155) cloramfenicol y algunas cefalosporinasref(2156) interfieren con los métodos por HPLC. La interferencia de estos compuestos puede ser eliminada mediante una etapa de extracción.ref(2157) El acetonitrilo es típicamente usado como fase móvil. La mayoría de los métodos por HPLC usan 8-cloro teofilina u 8-hidroxietil teofilina como estándar interno.refs(2158) La concentración de teofilina es determinada por comparación de la altura o el área del pico del cromatograma producido por el suero de un paciente con el producido por un estándar. Una ventaja importante de este método es que simultáneamente puede ser determinada la cafeína, que eluye en un pico separado. HPLC es un procedimiento usado comúnmente para la determinación de cafeína en neonatos. Otro método cromatográfico para la determinación de teofilina es la cromatografía gas-líquido (GLC). Debido a la complejidad y al tiempo requerido para el análisis de teofilina, este método es muy poco usado en el laboratorio clínico. Una técnica muy exacta para la determinación de teofilina es la cromatografía gaseosa con espectrometría de masa (GC/MS). Este método ha sido recomendado como método de referencia para la teofilina.ref(2159) Al suero del paciente se agrega un estándar interno marcado radiactivamente, [13-15N, 2-13C] teofilina, y luego la teofilina marcada y la teofilina presente en el suero del paciente se extraen con una mezcla de cloroformo-isopropanol (pH 5,2). Luego, el estándar interno y la teofilina se conjugan por incubación del residuo extraído con iodopentano, y la cromatografía gaseosa se utiliza para separar la teofilina de otros compuestos similares. Se utiliza un detector de masa para monitorear el perfil espectral de los iones de la teofilina y del estándar interno a m/z (relación de masa a carga) 250 y 253 2265

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respectivamente. Las relaciones de estos iones son luego comparadas contra estándares de concentración conocida de teofilina, y la concentración de teofilina en la muestra del paciente se calcula a partir de la curva estándar. La técnica más comúnmente usada para la determinación de teofilina es el inmunoensayo por polarización de fluorescencia IEPF (Tabla 56-7, método 3). En este método, la teofilina marcada con fluoresceína compite por una cantidad limitada de anticuerpo con la teofilina presente en la muestra del paciente.ref(2160) La teofilina marcada con fluoresceína unida al anticuerpo es una molécula mucho más grande que el fluoróforo solo y, como resultado, rota mucho más lentamente que el fluoróforo no unido. Un haz de luz polarizada que incide sobre el complejo anticuerpo-teofilina marcada excitará el fluoróforo fluoresceína. La fluorescencia emitida por el complejo será mucho más polarizada que la emitida por el fluoróforo no unido. Entonces la intensidad de la fluorescencia polarizada emitida es inversamente proporcional a la concentración de teofilina en el suero del paciente. Otro método popular de inmunoensayo para teofilina es un inmunoensayo enzimático homogéneo (EMIT) (Tabla 56-7, método 4). Esta técnica utiliza un formato de unión competitiva donde la teofilina marcada con la enzima glucosa 6 fosfato dehidrogenasa (G-6-PD) compite con la teofilina presente en el suero del paciente por la unión a un anticuerpo específico para teofilina. Cuando la teofilina marcada con G-6-PD se une al anticuerpo anti-teofilina, el complejo resultante causa una reducción en la actividad de G-6-PD. La actividad enzimática remanente después de un determinado período de incubación es proporcional a la concentración de teofilina en el suero del paciente. La cantidad remanente de G-6-PD enzimáticamente activa después del período de incubación se mide espectrofotométricamente a 340 nm por monitoreo de la velocidad de formación de NADH. Una técnica similar ha sido desarrollada para la determinación de cafeína en suero. Otro método inmunoenzimático ampliamente usado para la medición de teofilina es una técnica inmunoenzimofluorométrica basada en la unión competitiva entre teofilina marcada con una enzima y la teofilina presente en el suero del paciente por la unión a un anticuerpo anti-teofilina conjugado sobre la superficie de un papel de fibra de vidrio. La enzima marcadora usada comúnmente en la fosfatasa alcalina bacteriana (FAL). Después que se estableció el equilibrio para la unión de la teofilina marcada y no marcada al anticuerpo, los complejos teofilina-anticuerpo no unidos son lavados, y se agrega el sustrato fosfato de 4-metil umbeliferona, que es convertido en un producto fluorescente por la FAL presente en los complejos teofilina-enzima-anticuerpo. Cuando en el suero del paciente no hay o hay una cantidad muy pequeña de teofilina, una cantidad máxima de complejo teofilina-enzima se unirá al anticuerpo inmovilizado, resultando en una producción máxima de producto fluorescente. Un procedimiento de inmunoensayo relativamente nuevo que utiliza la tecnología del DNA recombinante es el ensayo IDEC para teofilina (Microgenics Corp., Concord, CA 94520) (Tabla 56-7, método 5). En este ensayo, la enzima beta-galactosidasa es sintetizada como 2 fragmentos separados; un fragmento diseñado como porción dadora de enzima (ED) y el otro diseñado como porción receptora de enzima (ER). La teofilina es unida covalentemente a la porción ED de la enzima.ref(2161) La asociación de ED y ER resulta en la formación de beta-galactosidasa enzimáticamente activa. El agregado de un anticuerpo anti-teofilina al sistema de reactivos inhibirá la asociación de los fragmentos ED y ER para formar la enzima activa. La competencia por la teofilina presente en el suero del paciente creará enzima activa en proporción directa a la concentración de teofilina en el suero. La 2266

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cantidad de enzima creada es monitoreada a través de la hidrólisis de un sustrato como el rojo de clorofenol- -D-galactopiranósido.ref(2162) Se han desarrollado métodos automatizados para teofilina que pueden utilizar suero, plasma o sangre total, basados en un inmunoensayo de inhibición enzimáticaref(2163) (Tabla 56-7, método 6). En este procedimiento, la teofilina está conjugada a un inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa. La teofilina presente en el suero del paciente compite con el conjugado teofilina-inhibidor por la unión al anticuerpo anti-teofilina. La unión del anticuerpo al complejo inhibidor impide que el inhibidor se una a la enzima, resultando en una actividad enzimática aumentada. Entonces, la concentración de teofilina en la muestra del paciente es inversamente proporcional a la cantidad de enzima activa remanente. La actividad de acetilcolinesterasa se monitorea usando el sustrato yoduro de acetil- -metil-tiocolina, que es hidrolizado por la enzima para producir tioles libres. Los tioles libres formados reaccionan con ácido 5,5’ ditiobis(2-nitrobenzoico) para formar tionitrobenzoato, que puede ser medido espectrofotométricamente. En algunos laboratorios clínicos se utiliza un ensayo inmunonefelométrico para cuantificar la teofilina en el suero (Tabla 56-7, método 7).ref(2164) En este procedimiento, la teofilina está conjugada a una proteína de alto peso molecular. La teofilina presente en el suero del paciente compite con el conjugado proteína-teofilina por la unión a un anticuerpo anti-teofilina. La unión del conjugado proteína-teofilina al anticuerpo resulta en la formación de un complejo insoluble, que precipita y causa dispersión de la luz. La unión de teofilina soluble, presente en el suero del paciente, al anticuerpo no resulta en dispersión de la luz. La velocidad de incremento de dispersión de la luz es inversamente proporcional a la concentración de teofilina en el suero del paciente, y es monitoreada mediante un nefelómetro. Un método para la determinación de teofilina que es análogo al ensayo de inhibición inmunonefelométrico antes descrito, es el inmunoensayo de inhibición turbidimétrico con partículas mejoradas (PETINIA) (Tabla 56-7, método 8). En este procedimiento, la teofilina unida covalentemente a partículas de látex compite con la teofilina presente en el suero del paciente por los sitios de unión de un anticuerpo específico. La unión del complejo teofilina-látex al anticuerpo resulta en la formación de agregados que provocan un aumento de la turbidez de la solución. La velocidad de formación de estos agregados puede ser monitoreada espectrofotométricamente a 340 nm y es inversamente proporcional a la concentración de teofilina en el suero del paciente. Un novedosa aproximación para la determinación de teofilina utiliza un procedimiento de película delgada (Johnson y Johnson, Rochester, NY 14650) (Tabla 56-7, método 9). Este ensayo se basa en que la teofilina es un inhibidor de la fosfatasa alcalina (FAL) obtenida de hígado vacuno. La enzima y un sustrato adecuado son incorporados al sistema reactivo en placa. La aplicación de suero de pacientes conteniendo teofilina a la placa resulta en una inhibición de la actividad enzimática proporcional a la concentración de teofilina en la muestra. En ausencia de teofilina la conversión de sustrato en producto por la FAL ocurre a velocidad máxima. Otra técnica que utiliza el formato de película seca para la determinación de teofilina hace uso de la competencia entre la teofilina y un complejo teofilina-enzima-grupo prostético por la unión a un anticuerpo (Bayer Inc., Tarrytown, New York) (Tabla 56-7, método 10).ref(2165) En este procedimiento, la enzima glucosa oxidasa sin su grupo prostético es 2267

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incorporada en un film seco junto con un sustrato adecuado. La glucosa oxidasa requiere que su grupo prostético (flavina adenina dinucleótido, FAD) esté unido para ser activa. La FAD, que ha sido unida covalentemente a la teofilina, forma parte del reactivo además de un anticuerpo específico para la teofilina. La aplicación al sistema del suero de un paciente que contenga teofilina resulta en una competición entre los complejos teofilina-FAD y la teofilina contenida en el suero del paciente por la unión al anticuerpo. Cuanto mayor sea la cantidad de teofilina presente en el suero, menos probable será que los complejos teofilina-FAD puedan unirse al anticuerpo y entonces estarán disponibles para combinarse con la enzima para formar un complejo activo enzima-grupo prostético. Si no hay teofilina en el suero del paciente, se formará una cantidad máxima de complejo anticuerpo-teofilina-FAD, y la cantidad de teofilina-FAD remanente que puede unirse a la enzima para dar un complejo activo será mínima. La cantidad de glucosa oxidasa enzimáticamente activa es monitoreada por la conversión de glucosa y oxígeno a gluconolactona y agua oxigenada. Una peroxidasa usa el agua oxigenada generada para oxidar el sustrato 3,3’,5,5’-tetrametilbenceno y formar un cromógeno coloreado que puede ser monitoreado a 740 nm. Especimen Para la mayoría de los análisis mencionados puede utilizarse suero o plasma heparinizado. Para aquellos métodos que pueden usar sangre entera, cuando se interpretan los resultados debe tenerse en cuenta el tipo de muestra utilizada, ya que la sangre entera tiene sólo el 82% de la concentración de teofilina del suero o plasma. La saliva puede ser también usada como muestra cuando se emplean HPLC o IEPF como métodos de análisis.refs(2166) La saliva se colecta mientras el paciente masca parafina y la muestra es luego centrifugada para eliminar el sedimento. Rango terapéutico El rango terapéutico para la teofilina en suero y plasma de niños y adultos es de 8 a 20 µg/mL (44 a 111 µmol/L).refs(2167) Para el tratamiento de la apnea en neonatos el rango terapéutico para la teofilina es de 6 a 11 µg/mL (33-61 µmol/L).refs(2168) Las concentraciones terapéuticas de cafeína en esos mismos individuos son de 5 a 20 µg/mL, y puede causar dolores de cabeza, hipotensión, náuseas, insomnio, convulsiones y taquicardia.refs(2169) Las concentraciones de cafeína superiores a 30 µg/mL pueden producir síntomas como insomnio, delirio, taquicardia, tensión muscular y temblores.

Referencias 1.Ritschel WA: Handbook of basic pharmacokinetics including clinical applications, Hamilton, Ill., 1986, Drug Intelligence Publications. 2. Borga O, Azarnoff DL, Plym Forshell G, Sj`qvist F: Plasma protein binding of tricyclic antidepressants in man, Biochem Pharmacol 18:2135-2143, 1969. 3. Reidenberg MM, Odar-Cederlof I, von Bahr C, et al: Protein binding from diphenylhydantoin and desmethylimipramine in plasma from patients with poor renal function, N Engl J Med 285:264-267, 1971. 4. Levy G: Relationship between pharmacological effects and plasma or tissue concentrations of drugs in man.

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Tablas Tabla 56-1. Fármacos comúnmente monitoreados, tiempos recomendados de muestreo, vidas medias, rangos terapéuticos, valores críticos.

Fármaco

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Tiempo de muestreo recomendado

Saludable t1/2 (horas)

Rango terapéutico (µg/mL

Rango crítico (µg/mL

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Amikacina

0.5-1 hora después de la dosis (valle) y al final del pico del intervalo

0.5 - 3.0

Máx.20 - 30 Mín. 35 Min.>10

Amitriptilina

Fin del intervalo de dosis

17 - 40

0.120 - 0.250

>0.500

Carbamacepina

Fin del intervalo de dosis

10 - 60

4 - 11

>15

Ciclosporina

Fin del intervalo de dosis

4.7 - 12.7

0.1 - 0.3

>0.4

Digitoxina

8 - 24 hs. después de la dosis

72 - 384

0.01 - 0.025

>0.035

Digoxina

8 - 24 hs.después de la dosis

20 - 50

0.0008 - 0.002

>0.0024

Etosuccimida

Fin del intervalo de dosis

40 - 100

>150

Gentamicina

0.5-1 hora después de la dosis y fin del intervalo de dosis

0.5 - 3.0

Máx 5 - 10

Máx >12

Min. 2

Lidocaína

Durante la infusión

1.2 - 2.3

Litio

Fin del intervalo de dosis

14 - 33

0.3 - 1.3 (mmol/L)

> 1.5

Fenitoína

Fin del intervalo de dosis

20 - 100

10 - 20

> 20

Fenobarbital

Fin del intervalo de dosis

50-150

10-40

> 50

Primidona

Fin del intervalo de dosis

4-22

5-12

> 15

Procainamida

Fin del intervalo de dosis

3-5

4-10

> 16*

Salicilato

1-3 hs después de la dosis

3-20

150-300**

>400

Teofilina

Infusión intravenosa a intervalos 4-8, 12-24 y 24 horas después del comienzo de la infusión. Oral o inyección intravenosa; 2 horas después de la dosis 2 horas después de la dosis 4-6 horas después de la dosis

3-12 No fumadores

8-20

> 20

Tobramicina

0.5-1 hora después de la dosis y fin del intervalo de dosis

0.5-30

Máx.5-10 Mín.12 Mín. >2

Vancomicina

1 hora después de la dosis y fin del intervalo de dosis

4-10

Máx 20-40 Mín. 5-10

Máx >80 Mín.>20

* **

1.5 - 5.0

>7

2-6 , fumadores

Rango terapéutico que incluye fármaco padre y metabolito ; rango crítico > 35 para ambas. Antiinflamatorio.

Tabla 56-2 Métodos para el análisis de anticonvulsivos

Método

Principio

1- Cromatografía de gases (CG )

Extracción en fase sólida en; columna capilar de C18; detección por ionización de llama.

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Matriz Sangre, plasma; suero, saliva

Comentario Puede resolver todos los anticonvulsivos simultáneamente, requiere extracción de la muestra.

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2. Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)

Extracción de fármacos con solventes orgánicos o precipitación de proteínas de las muestra; los anticonvulsivos se separan por cromatografía de fase inversa y se monitorean por espectroscopía ultravioleta.

Plasma, suero, saliva

Puede reseolver todos los anticonvulsivos simultáneamente excepto el valproato; comúnmente usada

a. Radioinmunoensayo (RIA)

Unión competitiva de ligando marcado; el hapteno radiomarcado compite con el desconocido por el sitio de unión del anticuerpo.

Plasma, suero, saliva

Se usa rara vez; todos los problemas de uso de radiactividad; más lento que los otros inmunoensayos

b. Técnica de inmunoensayo amplificado enzimáticamente (TIAE)

Unión competitiva con el fármaco unido a la enzima

Plasma, suero, saliva

Puede medir todos los fórmacos, pero debe hacerse cada uno por separado; comúnmente usada; puede usar analizadores químicos de rutina

c. Inmunoensayo enzimático fluorescente (IEF)

Combinación de unión competitiva con enzima-conjugado marcado por el sitio de unión al anticuerpo (en una matriz de fase sólida) y cromatografía radial.

Plasma, suero, saliva

Mide todos los anticonvulsivos excepto valproate y etoxisuximida

d. Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (IPF)

Unión competitiva con el fármaco marcado con fluoresceína; el fármaco fluorescente compite con el desconocido por el sitio del anticuerpo.

Plasma, suero, saliva

Cada compuesto se analiza individualmente; requiere instrumentación especializada; es el más frecuentemente usado

e. Ensayo del grupo prostético marcado

La unión del anticuerpo al fármaco marcado con el grupo prostético impide la actividad de la glucosa oxidasa. La competencia con fármacos endógenos permite que el grupo prostético active a la enzima. La glucosa oxidasa se acopla a una reacción colorímetrica

Suero

Diseñado para instrumentación económica; espectrofotómetro de reflectancia; prueba rápida

f. Inmunoensayo de inhibición de la velocidad nefelométrica

Unión competitiva por el hapteno; el complejo proteína-hapteno compite con el desconocido por el sitio de unión al anticuerpo

Plasma, suero

Cada fármaco se analiza individualmente; requiere instrumentación especializada

3. Ensayos de unión competitiva

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g. Inmunoensayo del donador enzimático clonado IDEC

Unión competitiva con el conjugado donador enzimático (DE)-ligando por el sitio de unión al anticuerpo. El fármaco endógeno modula la actividad enzimática afectando el conjugado DE libre-ligando disponible para la complementación.

Suero

Cada fármaco se analiza individualmente; requiere instrumentación especializada; actualmente no se utiliza ampliamente

Tabla 56-3 Métodos para la medición de ciclosporina A (CsA)

Método

Principio

Uso Menos común

Comentarios

1. Cromatografía Líquida de alta Resolución (HPLC)

Extracción de CsA de una matriz biológica seguida de una cromatografía HPLC en fase inversa y detección a 210 nm - 214 nm.

2. Radioinmunoensayo (RIA)

Unión competitiva de CsA marcada Menos común radioactivamente y CsA no marcada, a una cantidad limitada de anticuerpo monoclonal o policlonal

- Problemas referidos al uso y desecho de material radioactivo - Reacción cruzada con metabolitos

2. Inmunoensayo por polarización fluorescente (IPF)

Unión competitiva de CsA marcada Método más frecuentemente con con fluoresceína y CsA no usado marcada, a una cantidad limitada de anticuerpo.

- Automatizado - Reacción cruzada con metabolitos

- Mide fármaco padre - Método laborioso - Inadecuado para análisis de urgencia tipo stat

La cantidad medida de luz fluorescente plana polarizada está relacionada en forma inversa a las concentraciones de CsA del paciente. 3. Inmunoensayo del donador enzimático clonado (IDEC)

Unión competitiva de CsA marcada Recientemente introducido con enzima y CsA no marcada, a una cantidad limitada de anticuerpo. La actividad de la enzima marcadora decrece después de unirse al anticuerpo. Por lo tanto, la actividad enzimática está directamente relacionada a la concentración de CsA del paciente.

Tabla 56-4 Métodos de análisis para gentamicina 2275

Automatizado - Mayor especificidad comparado con IPF

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Método

Principio

Uso

Comentario

1.Radioinmunoensayo ( RIA )

La unión competitiva ocurre entre Poco frecuente la gentamicina radiomarcada y la gentamicina del suero del paciente.

- Sensible, específico, exacto, uso de radioisótopos -Inadecuado para análisis de urgencia tipo Stat

2. Inmunoensayo de Polarización Fluorescente

La unión competitiva ocurre entre el fármaco marcada con fluoresceína y el fármaco del suero del paciente. El fármaco marcado unido al anticuerpo tiene polarización fluorescente más alta que la que tiene el fármaco libre.

Frecuente

- Sensible, específico, exacto

La unión competitiva ocurre entre la gentamicina marcada con enzima y la gentamicina del suero del paciente por la unión al anticuerpo. La unión de la gentamicina marcada con enzima al anticuerpo produce una pérdida de la actividad enzimática.

Frecuente

(IEPF)

3. Técnica de Inmunoensayo Enzimático Amplificado (IDEC)

- Adecuado para análisis de urgencia tipo Stat - Automatizado - Sensible, específico, exacto. - Adecuado para análisis de urgencia tipo Stat - Automatizado.

Tabla 56-5. Dosis habituales y concentraciones séricas deseadas ( g/mL) para aminoglucósidos

ANTIBIÓTICO 1. Gentamicina Tobramicina

DOSIS NORMAL* 3-6 mg/Kg/día dividido cada 8 h

PICO† 5-10

VALLE‡ 3 P1 > 35 T1 > 10 > 40-50

* Para adultos con función renal normal. † Concentración en el pico P1 determinada una hora después de una dosis intramuscular o 30 minutos después de una dosis intravenosa. ‡ Concentración en el valle, T1, determinada justo antes de la próxima dosis.

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Tabla 56-6 Métodos para análisis de litio

Método

Tipo de análisis

Principio

Uso

1. Espectrometría de emisión atómica

Cuantitativo

Emisión de luz de un átomo inestable de litio a 670.8 nm

Uso poco frecuente Suero, plasma

2. Espectrometría de absorción atómica

Cuantitativo

Absorción de luz a 670.8 nm por litio en el estado basal

Uso poco frecuente Suero, plasma, orina, eritrocitos

3. Electrodo selectivo de iones

Cuantitativo

La interacción de litio con un ionóforo especifico para litio genera una diferencia de voltaje proporcional a la concentración de litio

El método más comúnmente usado Suero, plasma, sangre total Se requiere corrección por sodio endógeno

4. Colorimétrico

Cuantitativo

Litio + colorante de éter de corona (400 nm) Complejo colorido

Comúnmente usado Suero, plasma

Tabla 56-7 Métodos para el análisis de teofilina

Método

Tipo de análisis

Principio

1- Ultravioleta

Espectrofotométrico

Extracción de teofilina; medición de la absorción a dos longitudes de onda.

Suero, plasma

Histórico

2. Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)

Cromatográfico con destección espectrofotométrica

Dependiendo del método, el análisis de la muestra extraida o no extraida se hace por cromatografía de fase inversa.

Suero, plasma

Posible método de referencia

3. Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (IPF)

Unión competitiva con polarización de fluorescencia

El fármaco marcado unido tiene una mayor fluorescencia polarizada y es inversamente proporcional a la cantidad del fármaco no marcado.

Suero, plasma

Comúnmente usado

4. Técnica de inmunoensayo amplificado por enzima (TIAE)

Unión competitiva con la marca enzimática

La unión del anticuerpo al hapteno-enzima inhibe la reactividad catalítica; la competencia por el compuesto a analizar en la muestra impide la inhibición.

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Comúnmente usado

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Uso

Comentario

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5. Inmunoensayo enzimático usando una enzima genéticamente construida (IDEC)

Unión competitiva con detección espectrofotométrica

La enzima se ha sintetizado en dos fragmentos (donador enzimático, DE y aceptante anzimático, AE); la asociación de DE y AE forma una enzima activa que degrada un sustrato produciendo un cambio de color; el fármaco y el fármaco marcado con DE compiten por un anticuerpo, y una mayor cantidad del fármaco permite que más DE permanezca libre para unirse a AE, creando la actividad enzimática.

Suero, plasma

6. Inmunoensayo de inhibición enzimática

Unión competitiva con detección espectrofotométrica

El conjugado fármaco-inhibidor compite con el fármaco por sitios de un anticuerpo; la unión del conjugado al anticuerpo produce una reducción en la inhibición de la enzima; la cantidad del producto formado es inversamente proporcional a la concentración del fármaco.

Suero, plasma, sangre total

7. Inmunoensayo de inhibición de la velocidad nefelométrica (IIN)

Unión competitiva con detección nefelométrica

El conjugado hapteno-proteína compite con el fármaco para unirse al anticuerpo; la producción de los complejos proteína-anticuerpo aumenta la dispersión de luz; la cantidad de fármaco libre es inversamente proporcional a la velocidad del aumento en la dispersión de luz

Suero, plasma

8. Inmunoensayo de inhibición turbidimétrica (IIT)

Unión competitiva con inhibición turbidimétrica

El conjugado partícula-fármaco marcado compite con el fármaco libre para unirse al anticuerpo; la velocidad de formación del agregado es inversamente proporcional a la cantidad del fármaco.

Suero, plasma

9. Inhibición enzimática

Inhibición no competitiva y detección espectrofotométrica del producto

La conversión del sustrato a producto por fosfatasa alcalina de hígado bovino es inhibida por el fármaco; la cantidad de producto formado es inversamente proporcional a la cantidad del fármaco.

Suero, plasma

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Tecnología de capa fina

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10. Ensayo del grupo prostético marcado

Unión competitiva con procedimiento enzimático

La unión del anticuerpo al fármaco marcado con el grupo prostético impide la actividad de la glucosa oxidasa; la competencia con el fármaco permite que el grupo prostético active a la enzima; la actividad está acoplada a una reacción colorimétrica.

Suero

Figuras

Figura 56-1 Curvas de nivel-tiempo sanguíneas de un fármaco hipotético bajo diferentes rutas de administración

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Figura 56-2 Influencia del proceso de liberación de un fármaco en el desarrollo de las curvas de nivel-tiempo sanguíneas. I, Tableta de disolución rápida; II, tableta con una velocidad de disolución menor; III, tableta de liberación sostenida; IV, tableta de baja disponibilidad.

Figura 56-3 Influencia del proceso de distribución en el desarrollo de las curvas de nivel-tiempo sanguíneas de digoxina. Se observa un nivel sanguíneo alto en insuficiencia cardiaca congestiva aguda debido a un volumen de distribución disminuido.

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Figura 56-4 Influencia de los procesos metabólicos en el desarrollo de las curvas de nivel-tiempo sanguíneas. La inhibición enzimática y el daño hepático pueden aumentar considerablemente el nivel sanguíneo, mientras que la inducción enzimática puede dismunuirlo.

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Figura 56-5 Influencia de los procesos de eliminación en el desarrollo de la curva de nivel-tiempo sanguínea de gentamicina. En presencia de insuficiencia renal, la concentración pico después de una infusión de corto plazo es má alta y el nivel sanguíneo permanece elevado con una vida de eliminación más larga.

Figura 56-6 Relación entre la concentración de teofilina sérica, efectividad y toxicidad. 2282

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Figura 56-7 Esquema para identificar casos y situaciones cuando está indicado el monitoreo de un fármaco. (Modificado de Pippenger CE: Ther Drug Monitor 1:3-9, 1979.)

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Figura 56-8 Gráfica de las concentraciones sanguíneas del fármaco como función de la dosis y el tiempo. DM, Dosis; , intervalo entre las dosis Cssmax, concentración máxima en estado de equilibrio; Cssmin, concentración mínima en estado de equilibrio. En esta muestra se escogió como el equivalente a la vida media de eliminación.

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Figura 56-9 Curva de nivel-tiempo sanguínea para un modelo de un compartimento después de la administración extravascular, con pendientes de eliminación no exponenciales, ke, y de absorción, ka. (De Ritschel WA: Graphic approach to clinical pharmacokinetics, Barcelona, 1983, JR Prous.)

Figura 56-10 Curva de nivel-tiempo sanguínea en un modelo de dos compartimentos después de la administración extravascular, con pendientes monoexponenciales de disposición lenta, ß; disposición rápida, ; y absorción, ka. (De Ritschel WA: Graphic approach to clinical pharmacokinetics, Barcelona, 1983, JR Prous.)

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Figura 56-11 Esquema del área total bajo la curva de nivel-tiempo sanguínea. AUC , Area bajo la curva desde el tiempo = 0 hasta el tiempo = . (De Ritschel WA: Graphic approach to clinical pharmacokinetics, Barcelona, 1983, JR Prous.)

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Figura 56-12 Esquema que muestra los tiempos de muestreo óptimos para monitoreo por diferentes métodos usados en regímenes de dosificación.

CAPÍTULO 57

57. Análisis de Orina. G. Berry Schumann Susan C. Schweitzer

Introducción y utilidad clínica del uroanálisis.

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Colecta de especímenes. Examen físico de la orina. Volumen Olor Apariencia (color y turbidez) Gravedad específica Osmolalidad Examen químico de la orina. Constituyentes normales Análisis en tiras reactivas Análisis confirmatorios pH urinario Proteínas Azúcares Cetonas Sangre y mioglobina Bilirrubina Urobilinógeno Nitritos Leucocitos Porfirinas Melanina Examen microscópico de la orina Métodos Estandarización Cristales Organismos Células Cilindros renales Grasas Citología de orina Cálculos (litiasis) Hallazgos en enfermedades renales comunes y del tracto urinario inferior Enfoque coordinado para el uroanálisis Control de calidad.

OBJETIVOS

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Entender el método adecuado de recolección de especímenes de orina para un análisis específico. Discutir las propiedades físicas más importantes de la orina y sus relaciones con la enfermedad. Identificar los constituyentes químicos más importantes de la orina, como cuantificarlos, y como confirmar su presencia. Describir métodos adecuados para estandarización de los especímenes de orina y de los hallazgos microscópicos más comunes. Enumerar los hallazgos comúnmente observados en enfermedades renales y del tracto urinario inferior. Entender los procedimientos de control de calidad propios del análisis de la orina.

Términos clave albuminuria. Incremento en la concentración de albúmina en la orina. aminoaciduria Exceso de uno o más aminoácidos en la orina. análisis húmedo de orina Prueba de tamizaje para de la orina que combina una valoración fisicoquímica y un examen del sedimento urinario en una preparación húmeda no coloreada. análisis de orina por tira húmeda Examen químico de la orina empleando tiras reactivas de prueba para la determinación de albúmina, glucosa, cetonas, bilirrubina, hemoglobina, bacterias, leucocitos, y otros constituyentes químicos. análisis por tira reactiva Uso de tiras de prueba conteniendo reactivos químicos para determinar si hay concentraciones patológicas de diversas sustancias en la orina. bacteriuria Presencia de bacterias en la orina. bilirrubinuria Presencia de bilirubina en la orina. cálculos Concreciones anormales, usualmente compuestas de sales, presentes en el sistema urinario u otros tejidos; una piedra renal. cateterización Inserción de un instrumento delgado, flexible y tubular en la vejiga o uréter para obtener o sacar orina. células pálidas Neutrófilos de tinción tenue, hinchados y degenerados, que se encuentran en la orina diluida, los cuales tienen gránulos citoplasmáticos que presentan un movimiento browniano característico. cetona Cualquier compuesto que contiene un grupo carbonilo -CO- y grupos de hidrocarburos unidos al carbono del grupo carbonilo. cetonuria Presencia de cetonas en la orina, las cuales son un producto intermedio del metabolismo de las grasas, como ocurre en la diabetes mellitus. cilindros Estructura cilíndrica formada como resultado de conglutinación de células y precipitación de proteínas en el lumen de los túbulos convolucionados distales y ductos colectores del nefrón, los cuales son expulsados en el sedimento urinario. cilindros hialinos Cilindros transparentes formados de mucoproteína. cilindruria Presencia de cilindros en la orina. cistitis Inflamación de la vejiga. citodiagnóstico de orina Análisis especializado de orina que combina una valoración fisicoquímica y un examen del sedimento urinario concentrado teñido para Papanicolaou. cristales amorfos Precipitado de sales no cristalino, granular, sin importancia patológica. cristaluria Presencia de cristales en la orina. 2289

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diurético Un agente que promueve la producción de orina. eritrocituria Presencia de eritrocitos en orina. eritrocituria dismórfica Presencia de fragmentos de eritrocitos en el sedimento de orina indicativos de hematuria renal (glomerular y tubular). funguria Presencia de hongos en la orina. glomérulo Enrollamiento de vasos sanguíneos que se proyecta en el extremo de la cápsula de cada uno de los túbulos uriníferos del riñón. glucosuria Presencia de glucosa en la orina. gravedad específica El peso de una sustancia comparada con un volumen igual de otra sustancia tomada como estándar. hematuria Presencia de sangre en la orina. hemoglobinuria Presencia de hemoglobina libre en la orina. hidrómetro Instrumento empleado en medir la gravedad específica de un fluido. levadura Microorganismo unicelular nucleado que se reproduce por gemación. melanina Pigmento oscuro amorfo presente en la piel, cabello, y diversos tumores. Es producido por la polimerización de productos de oxidación de la tirosina y compuestos dihidroxifenólicos; contiene carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y, a menudo, azufre. mioglobinuria Presencia de hemoglobina en la orina, esta es una proteína que se combina con el oxígeno de las células musculares. necrosis tubular aguda Enfermedad caracterizada por la destrucción de las células del epitelio tubular renal, está comúnmente asociada con la reducción de la circulación (isquemia) en los túbulos renales o la exposición a agentes tóxicos. nefritis Inflamación del riñón. nefrosis Una enfermedad del riñón. piuria Cantidad anormal de leucocitos en orina. porfirinas Un grupo de derivados del pirrol libres de hierro o magnesio que se encuentran universalmente en todas las células. Estos compuestos constituyen la base de los pigmentos respiratorios en animales y plantas. proteinuria Incremento en la concentración de proteína en la orina. recuento de Addis. Análisis cuantitativo del sedimento urinario, en el cual se cuantifica el número de eritrocitos, leucocitos y cilindros en un especimen de orina recolectado en un determinado tiempo. tinción de Papanicolau Tinción diferencial que ayuda a la identificación de la cromatina nuclear, propiedades citoplásmicas como la queratinización, elementos no celulares (como cristales y cilindros) y elementos hematopoyéticos. urobilinógeno Grupo de compuestos incoloros formados por la reducción de la bilirrubina conjugada por la acción de bacterias intestinales. Cerca del 1% del total del urobilinógeno producido pasa a la orina. virus Agente que se autorreplica, consta de una estructura fundamental de ácidos nucleicos encapsulados por una cubierta de proteínas. Este microorganismo puede multiplicarse solamente dentro de las células de su hospedero.

Introducción y Utilidad Clínica del Análisis de Orina 2290

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El análisis de orina realizado en el laboratorio clínico, puede proporcionar una información amplia, variada y útil del riñón de un individuo y de las enfermedades sistémicas que pueden afectar este órgano excretor. Por medio de este análisis, es posible elucidar tanto desórdenes estructurales (anatómicos) como desórdenes funcionales (fisiológicos) del riñón y del tracto urinario inferior, sus causas, y su pronóstico. La realización cuidadosa del examen de orina, por parte del laboratorio, ayuda al diagnóstico diferencial de numerosas enfermedades del sistema urinario. Usualmente, los datos de laboratorio obtenidos por medio de este análisis, se logran sin dolor, daño o tensión para el paciente. Esta es la razón por la cual, la realización e interpretación correcta del análisis de orina, por parte del laboratorio permanecerá siempre como una herramienta esencial de la práctica clínica. En la actualidad, se practican tres tipos de exámenes de orina: análisis de orina por tira húmeda, empleado generalmente por los médicos en sus consultorios y por los pacientes en sus casas; tamizaje de análisis húmedo de la orina, comúnmente llamado análisis básico o rutinario de orina; y citodiagnóstico de la orina, que es una evaluación citológica especializada del sedimento urinario que correlaciona con los análisis realizados por medio de la tira reactiva. El análisis de orina realizado con la tira húmeda es un ensayo de primera etapa para la detección y monitoreo de pacientes con anormalidades químicas.refs(2170) Los pacientes diabéticos a menudo monitorean permanentemente su propia enfermedad, buscando signos de glucosuria, proteinuria, e infecciones del tracto urinario, mediante pruebas realizadas en casa.ref(2171) El análisis de orina húmedo o rutinario, proporciona, a costos razonables, un tamizaje adecuado para la detección de anormalidades químicas y morfológicas presentes en la orina. Este procedimiento se compone de dos partes: 1) un análisis macroscópico, en el cual se determinan las características fisicoquímicas (apariencia, gravedad específica y la medición de los constituyentes químicos por medio de la tira), y 2) un examen microscópico del sedimento, en campo claro o contraste de fases, para verificar hematuria, piuria, cilindruria, cristaluria, y otros signos. Por medio de este simple examen de orina, un uromicroscopista experimentado puede detectar y monitorear muchas entidades que afectan al riñón y al tracto urinario inferior.refs(2172) Recientemente, el citodiagnóstico de la orina ha ganado aceptación médica como un análisis nuevo, más sensible en el diagnóstico de ciertas patologías renales y del tracto urinario inferior.refs(2173) Como este análisis requiere mayor inversión de tiempo debido a la preparación de coloraciones, debe reservarse para pacientes sintomáticos con enfermedades renales, del tracto urinario inferior, o neoplasias. Este análisis especializado ha reemplazado al recuento de Addis, proporcionando información secuencial del progreso o regresión de muchas de las patologías renales o del tracto urinario inferior.ref(2174) El propósito de este capítulo, dirigido a los laboratorios médicos o de química clínica, es describir en forma breve las metodologías mas comúnmente empleadas en la mayoría de los laboratorios de análisis rutinarios, haciendo énfasis en las responsabilidades del laboratorio de uroanálisis en los siguientes aspectos: 1) procedimientos y equipos más comunes; 2) calidad de los reactivos; 3) sensibilidad, especificidad, y limitaciones de cada procedimiento; 4) pruebas confirmatorias; 5) identificación precisa de los elementos principales del sedimento urinario empleando microscopía de campo claro; y 6) control de calidad. Se discutirá la importancia 2291

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técnica y diagnóstica de los resultados del análisis urinario y los mecanismos de las enfermedades que producen anormalidades en dichas pruebas. Se hace énfasis en la importancia que tiene la revisión de literatura para ampliar y mejorar conocimientos.

Colecta de Especímenes El cuidado en la recolección de la orina y su entrega rápida en el laboratorio, son cruciales para obtener una información óptima.refs(2175) La orina debe ser colectada en un recipiente limpio, estéril, que tenga un cierre seguro para prevenir posibles derramamientos, evaporación o contaminación. Estos recipientes deben rotularse con el nombre del paciente, fecha y hora de recolección. La primera orina de la mañana es usualmente la mejor para el análisis porque es la orina más concentrada. Se debe obtener una colecta en que no se produzca contacto del recipiente con el área distal de la uretra para evitar la contaminación de la muestra. Las muestras deben estar libres de secreciones vaginales u otra clase de partículas extrañas. Kuninref(2176) describe minuciosamente, una variedad de técnicas de recolección para las enfermedades del tracto urinario. Para que los datos del uroanálisis sean precisos, es esencial que la orina sea examinada dentro de las dos horas siguientes a su recolección o preservada de alguna manera, usualmente por refrigeración (2° a 8° C). Se pueden usar fijadores o preservativos adecuados, siempre y cuando se entiendan claramente sus efectos sobre la orina y sobre los ensayos en ella realizados. Si la orina es recolectada sin preservativos y permanece a temperatura ambiente se empezará a descomponer. Los preservativos actúan impidiendo los cambios químicos asociados a la descomposición y previniendo el crecimiento y metabolismo de los microorganismos. El tolueno, fenol, timol y preservativos ácidos son usados frecuentemente para los análisis químicos de la orina. Otras formas de preservación incluyen el ajuste del pH y la protección de la luz. Para preservar las estructuras celulares puede emplearse etanol (95%), hay también disponibles fijadores comerciales como Mucolexx y Saccomanno. Los laboratorios son responsables de la selección adecuada del tipo y cantidades de preservativo de la de orina necesarios para preservar las estructuras celulares. Para cuantificar diversos aspectos de la función renal, frecuentemente se emplean análisis de orina recolectada durante un determinado período de tiempo. La orina debe reflejar la excreción en un intervalo de tiempo medido con precisión. Estos especímenes no deben incluir la orina que se encuentra en la vejiga antes de la iniciación de la recolección. En la toma de muestras de orina de 24 horas, se debe desechar la orina de la primera micción de la mañana del día en el cual se inicia la recolección y recolectar toda la orina producida durante 24 horas, incluyendo la primera orina de la mañana del segundo día. La Tabla 57-1 muestra los tipo de especímenes de orina recomendados según el examen requerido. Cuando una muestra es recibida para un análisis de orina, los laboratoristas que realizan el ensayo, deben tomar la decisión de aceptarlo o no. Se deben establecer por escrito, criterios específicos acerca de la forma de recolección, signos visibles de contaminación, identificación incompleta o incorrecta, tipo inapropiado de especímenes o preservativos, y el tiempo transcurrido después de la recolección. 2292

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Examen Físico de la Orina El examen físico de la orina es la parte inicial del análisis rutinario de la orina. Este examen incluye una valoración del volumen, olor, apariencia (color y turbidez), y gravedad específica u osmolalidad.

Volumen. El volumen urinario está influenciado por la ingesta de líquidos; por los solutos excretados, principalmente, sodio y urea; por la pérdida de fluidos en la transpiración y la respiración; y por el estado de los sistemas cardiovascular y renal. Normalmente un adulto excreta de 750 a 2000 mL en 24 horas. En el capítulo 26 se discuten las condiciones que llevan al incremento o disminución en la cantidad de orina. Aunque el volumen de orina de un especimen recolectado al azar no tiene importancia clínica, el volumen del especimen recibido debe ser anotado para efectos de documentación y estandarización.

Olor Una orina normal fresca tiene un olor inofensivo. Un olor desagradable, puede indicar que el especimen es demasiado viejo para obtener un análisis preciso. Un olor fétido en un especimen recolectado desde hace más de dos horas (y no preservado o refrigerado) indica que el especimen es inadecuado. El olor puede también dar señales de ciertas anormalidades de la orina. Un olor parecido al amoniaco, es sugestivo de presencia de bacterias degradadoras de la urea, un olor a frutas indica la presencia de acetona (cetonas), un olor dulce es sugestivo de la presencia de glucosa u otros azúcares, un olor fétido es sugestivo de pus o inflamación. El olor es importante en la detección clínica de la enfermedad llamada orina de miel de maple (un defecto metabólico congénito).

Apariencia (color y turbidez). El color de la orina esta determinado, en gran medida, por su grado de concentración. Las orinas normales varían ampliamente de colores, desde incoloras hasta amarillo oscuro. La interpretación del color es subjetiva y varía según el laboratorio que la examine. Para que el analista describa adecuadamente el color de la orina, puede emplear como puntos de referencia una escala estandarizada de colores, evitando el uso de términos ambiguos como pajizo o sangriento. En la Tabla 57-2 hay un listado de los colores comunes de la orina. La orina roja es, tal vez, la coloración de mayor importancia clínica. Este color puede ser producido por hemoglobina urinaria o mioglobina, eritrocitos intactos, eritrocitos hemolisados, o hemoglobina libre (hemólisis). La hemólisis puede producirse intravascularmente o después de que la orina se ha formado. La mioglobinuria ocurre rara vez y es el resultado de una severa destrucción muscular. La hemoglobina urinaria y la mioglobina no pueden diferenciarse por simple inspección o por análisis sencillos. La ingestión de remolacha o de ciertos fármacos puede también enrojecer la orina y por lo tanto estos cromógenos deben ser excluidos como causa de coloración. 2293

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En la glomerulonefritis aguda el color característico de la orina es pardo rojizo. La orina es ácida y contiene sangre, esta combinación produce un color parduzco debido a la formación de hematina ácida. La sangre en la orina también puede producir una apariencia ahumada. Esto se puede observar agitando la orina y observándola contra la luz. El “humo” o turbidez es producido en realidad por eritrocitos en suspensión, en este caso después de la centrifugación aparecerá un sobrenadante claro con un botón rojo en el fondo del tubo. La apariencia ahumada debida a los eritrocitos no debe confundirse con la turbidez pálida producida por otros elementos en suspensión como cristales y células. Normalmente una orina fresca es clara. Cuando la orina se deja reposar, se precipitan cristales amorfos, generalmente ureatos, produciendo turbidez. La turbidez de la orina debe ser registrada y explicada mediante la evaluación microscópica. La Tabla 57-3 enumera las causas más comunes de turbidez en la orina. Gravedad específica. La gravedad específica de la orina es una medida parcial de la capacidad del riñón para concentrar orina. Su rango normal es de 1.003 a 1.035 g/mL. Los valores iguales o superiores a 1.020 indican una buena función renal y la excreción de una cantidad aumentada de solutos disueltos excretados por los riñones. Valores de densidad específica iguales o superiores a 1.035 indican la presencia de solutos extraños, lo cual debe ser investigado. En la deshidratación, diabetes mellitus, insuficiencia cardíaca congestiva, proteinuria e insuficiencia adrenal se encuentra una gravedad específica con valores mayores a 1.030. Una disminución de la gravedad específica se observa en pacientes con hipotermia o en quienes usan diuréticos. En pacientes con enfermedad renal severa, la orina es producida con una gravedad específica fija, que es igual a la del filtrado glomerular, esto es, aproximadamente 1.010. Los constituyentes del sedimento son pobremente preservados en orinas diluidas, por lo tanto en orinas con una gravedad específica baja, el análisis microscópico del sedimento puede no producir resultados óptimos. Las sustancias de alto peso molecular afectan la gravedad específica en un grado mayor que la producida por simples cristaloides. Esto es importante cuando la orina contiene moléculas grandes como glucosa, proteínas o medios de contraste radiográficos. Cuando se presentan niveles elevados de glucosuria o proteinuria, es necesario aplicar factores de corrección para ajustar la gravedad específica a un valor más representativo; se debe restar 0.004 por cada 10 g/l de glucosa y 0.003 por cada 10 g/l de proteína. Valores de 1.040 o superiores están asociados con la presencia de medios de contraste radiográficos o preservativos. La gravedad específica se puede medir empleando un hidrómetro y un recipiente apropiado. El uso de los hidrómetros tiene varias limitaciones: 1) requieren un volumen grande de orina (10 a 15 mL); 2) están calibrados para ser usados a 20¢ C, si la orina no está a esta temperatura de referencia se deben aplicar factores de corrección; 3) los hidrómetros no pueden ser recalibrados. Por estas razones, los laboratorios ya no emplean estos elementos. La mayoría de los laboratorios poseen refractómetros que relacionan la densidad de una solución con la gravedad específica (ver capítulo 4). El uso de estos refractómetros tiene algunas ventajas: 1) requieren solo una o dos gotas de orina; 2) tienen la temperatura compensada; 3) las lecturas están menos afectadas por la densidad que las de los urinómetros; y 4) poseen un tornillo para calibrar a cero. Su gran desventaja es el costo. 2294

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Es esencial aplicar regularmente una metodología para la calibración. Debe verificarse con agua destilada y calibrarse con soluciones estandarizadas de sales o sacarosa. Método del refractómetro 1. Limpie la superficie de la cubierta con un paño húmedo y luego séquela. 2. Usando dos aplicadores o pipetas capilares, aplique una gota de orina en la muesca de la cubierta y deje fluir la orina por acción capilar, sobre la superficie del prisma. 3. Coloque el refractómetro contra una fuente de luz y lea el valor de la gravedad específica directamente en la escala para gravedad específica allí donde se forma una nítida línea divisoria entre la luz y el contraste oscuro. 4. Para una gravedad específica mayor a 1.030, diluya la orina con partes iguales de agua y lea. Multiplique los tres últimos dígitos por tres.ref(2177) Método de la tira reactiva. Las tiras reactivas disponen de un método colorimétrico indirecto para medir la gravedad específica. Este método usa una tira que contiene un electrolito pretratado que muestra un cambio de pH de acuerdo a la concentración iónica de la orina. Este ensayo es rápido, sencillo y no requiere equipos adicionales. El producto empleado no debe presentar interferencias con glucosa, proteínas, o medio de contraste radiográficos. La sensibilidad de este método es menor que la del refractómetro (0.005 unidades) y las muestras de orina con pH de 6.5 o mayores requieren factor de corrección. Método de la gota que cae. El método de la gota que cae es un método directo para la determinación de la gravedad específica usado en equipos automatizados, como el Cliniteck Auto 2000 (Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart Indiana). Este instrumento usa aceite de silicona en una columna especialmente diseñada. La gravedad específica esta relacionada con el tiempo que tarda una gota de orina en caer una distancia definida por dos aperturas ópticas. Este procedimiento es más específico y preciso que el refractómetro y más preciso que el uso de hidrómetros.ref(2178)

Osmolalidad El riñón normal es capaz de producir orina con un rango de 50 a 1200 mOs/Kg (ver capítulo 26). Los rangos de la osmolalidad en orina oscilan desde 1/6 a cuatro veces la osmolalidad del suero normal (280-290 mOs/Kg). La osmolalidad es medida por un osmómetro (ver capítulo 14). La osmolaridad está determinada por el número de partículas por unidad de masa, mientras la gravedad específica es un reflejo de la densidad (tamaño o peso) de las partículas en suspensión. Generalmente la gravedad específica y la osmolaridad son directamente proporcionales de un modo lineal, aunque hay excepciones importantes. Por ejemplo, si a un paciente se le administran medios de contraste yodados por pielografía intravenosa, la gravedad específica puede elevarse hasta 1.070 o 1.080, mientras que la osmolalidad permanecerá dentro de los límites normales. Las partículas de contraste tienen una masa lo suficientemente grande para elevar la gravedad específica, pero hay muy pocas moléculas 2295

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presentes que puedan producir un notable incremento en la osmolalidad.

Examen Químico de la Orina Varios constituyentes químicos son analizados rutinariamente en el uroanálisis. Para su análisis se emplean tiras reactivas cualitativas y tabletas, además de métodos cuantitativos para determinación de proteínas, electrolitos y porfirinas. Constituyentes normales. La orina está formada por numerosas sustancias químicas. La Tabla 57-5 enumera los constituyentes químicos más comúnmente medidos por los laboratorios de uroanálisis. Análisis por tira reactiva. Los análisis por tira reactiva han permitido a los laboratorios de uroanálisis producir resultados químicos semicuantitativos de una manera rápida, exacta y eficiente. En general, los análisis de orina adecuadamente realizados por medio de tiras reactivas, son sensibles, específicos y económicos. El laboratorio de uroanálisis es responsable de seleccionar los tipos más adecuados de tiras reactivas para su hospital o práctica clínica. Las siguientes guías son importantes para asegurar mejores resultados: 1. Para pruebas rápidas de orina; use solamente las lecturas de los análisis cronometrados. 2. Tenga cuidado con las sustancias que producen interferencias. 3. Entienda las ventajas y limitaciones del ensayo. 4. Emplee controles. Los análisis realizados por medio de tiras reactivas deben efectuarse en orinas bien mezcladas y equilibradas a la temperatura ambiente. Cada parámetro químico debe ser evaluado en un intervalo de tiempo específico, de acuerdo a lo indicado en las instrucciones del fabricante. Deben tomarse del envase, solamente el número de tiras requerido para los análisis inmediatos y el envase debe taparse nuevamente asegurando que la tapa quede bien ajustada. Las tiras reactivas deben ser almacenadas en un lugar fresco (no refrigeradas). El medio ambiente debe estar libre de humedad. Nunca se deben usar tiras para orina caducadas o expuestas al aire.ref(2179) Después de sumergir la tira reactiva en la orina, se debe remover el exceso de orina golpeando la tira suavemente en el borde del recipiente que contiene el especimen. Se debe comparar individualmente la reacción de cada zona reactiva con su correspondiente en la carta de colores, bajo una iluminación adecuada. Hay disponible una amplia variedad de lectores automáticos de tiras reactivas (fotométros de reflectancia). En la Tabla 57-6 se anota la sensibilidad de dos tipos de tiras para pruebas múltiples, que son disponibles comercialmente. Los resultados positivos de las tiras reactivas pueden requerir confirmaciones por métodos químicos y microscópicos. La información proporcionada por los fabricantes debe ser revisada para identificar fuentes de inhibidores y resultados falsos positivos y negativos. El ácido ascórbico presente en la orina, puede interferir con las reacciones de la tira reactiva para glucosa, hemoglobina, bilirrubina y nitritos. Se ha exhortado a los fabricantes a minimizar o 2296

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eliminar estas interferencias porque es común la ingestión de suplementos de vitamina C. ref(2180) Con objeto de verificar los resultados de las tiras reactivas es esencial el uso de muestras para control de calidad. Pruebas confirmatorios. Muchos laboratoristas equiparan un análisis confirmatorio con la verificación de un parámetro dado. Esto no confirma nada; solo establece el grado de precisión para ese parámetro.refs(2181) Un análisis confirmatorio, es aquel que establece la exactitud de otro procedimiento. Algunos ejemplos de análisis confirmatorios son los ensayos cuantitativos de proteínas, electroforesis de proteínas, cultivos para bacterias, y el aspecto citológico (Tabla 57-7). Un análisis confirmatorio debe tener la misma o mejor especificidad, estar basado en principios diferentes, y tener una sensibilidad igual o mejor que la de la prueba original. pH Urinario. Aunque el método estándar para la medición del pH emplea electrodos de vidrio, el pH urinario, usualmente, es medido con indicador de papel, debido al hecho de que pequeños cambios en el pH son de poca importancia clínica. La mayoría de los laboratorios de uroanálisis emplean tiras reactivas multitest con dos indicadores, rojo de metilo y azul de bromotimol. Estos indicadores proporcionan un rango de pH de 5.0 a 9.0, el cual se manifiesta por un cambio de color de naranja (ácido) a verde y azul (alcalino). El rango de pH urinario es 4.7 a 7.8. Las muestras de orina extremadamente ácidas o alcalinas, usualmente indican especímenes mal recolectados. El pH es importante para el manejo clínico de las piedras o cristales. Los cálculos de ácido úrico se precipitan en orinas ácidas y son más solubles en orinas básicas. En orina alcalina se precipitarán cálculos de calcio y fosfato de calcio, mientras que la orina ácida tiende a disolverlos. Durante las terapias con sulfonamidas y estreptomicina, es deseable una orina alcalina para prevenir la precipitación de medicamentos en los riñones y la formación de cálculos de ácido úrico, cistina y oxalatos. Un pH alcalino debe mantenerse en el tratamiento de las reacciones debidas a transfusión y a la intoxicación con salicilatos. En la cistitis el pH debe mantenerse ácido para combatir la bacteriuria y prevenir la formación de cálculos alcalinos. Los analistas deben estar conscientes de que una orina alcalina interfiere con la determinación de proteínas y puede alterar el examen del sedimento urinario. Proteínas Las personas sanas pueden tener una excreción diaria de proteínas de 100 mg/día, una fracción muy pequeña del contenido de proteínas plasmáticas. La mayoría de la proteína en la orina es albúmina que pasa la membrana glomerular, pero también pueden estar presentes proteínas de peso molecular pequeño como las globulinas. Una vez filtradas las proteínas son casi completamente reabsorbidas en el túbulo proximal. La proteinuria, por lo tanto, puede ser el resultado tanto de un incremento en la filtración como de una disminución en la reabsorción (función tubular). Las tiras reactivas son un procedimiento de tamizaje para la proteinuria. Como la especificidad de las tiras reactivas está limitada a la detección de albúmina, es altamente recomendable que el laboratorio procese simultáneamente una prueba por tira reactiva y una prueba de precipitación por ácido para la detección de todos los tipos de proteínas. Las tiras 2297

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reactivas son sensibles al pH y dependen de la presencia de proteínas para la generación de color (error de proteína de Sørensen). La presencia de la proteína en la tira cambia el pH del medio de contraste impregnado en la zona reactiva, produciéndose el cambio de color pH 3

Azul de tetrabromofenol –––––––– Proteína

Resultados positivos (azul verdoso)

pH 3

Azul de tetrabromofenol ––––––––

Resultados negativos (amarillo)

Sin proteína

Un resultado positivo o débilmente positivo debe ser confirmado por otros métodos más específicos como el ácido tricloroacético o el ácido sulfosalicílico. Un resultado débilmente positivo y uno fuertemente positivo pueden indicar la presencia de fármacos o proteínas de Bence Jones. Ensayo del ácido sulfosalicílico y método de turbidez semicuantitativo Principio Las proteínas desnaturalizadas por el ácido se precipitan produciendo una turbidez que es progresivamente mayor de acuerdo al incremento en la concentración de las proteínas. Materiales Acido sulfosalicílico al 3%, (30g/L) en solución acuosa. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Procedimiento 1. Añada 3 mL de reactivo de ácido sulfosalicílico a 1 mL de orina centrifugada. 2. Mezcle y deje en reposo 5 minutos. 3. Observe el grado de turbidez (ver Tabla que acompaña, no numerada en la parte de abajo) y compare la muestra analizada con el especimen original en un tubo de 13 x 100 mm. La orina de individuos sanos no debe presentar turbidez y las proteínas representarán menos de 75 mg/L. La Tabla 57-9 muestra la sensibilidad, tipos de proteínas detectadas, y fuentes de resultados falsos negativos y positivos para análisis realizados con tiras reactivas y ácido sulfosalicílico. Hay disponibles estándares comerciales de ácido sulfosalicílico. Reporte de confirmación de turbidez con ASS Grado proteína

Turbidez *

Rango de (mg/L)

Ninguno Trazas 1+

Claro Se puede ver y leer fácilmente un material impreso cuando No se puede ver y leer fácilmente un material impreso

alguna dificultad cuando se cuando se mira a través del tubo

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Se puede ver pero no leer fácilmente un material impreso cuando se mira a través del tubo. No se puede ver un material impreso cuando se mira a través del tubo.

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Se ha formado un precipitado.

>4500

2500-4500

* Claridad de la orina al paso de la luz en un especimen colocado en un tubo transparente.

Azúcares Ensayos enzimáticos. El ensayo de la tira reactiva es un excelente análisis específico para glucosa. Detecta la oxidación de la glucosa a ácido glucónico: Glucosa oxidasa

Glucosa + Oxígeno del aire ambiental ––––––––

Acido glucónico y peróxido de hidrógeno

Peroxidasa

Peróxido de Hidrógeno + Cromógeno ––––––––

Cromógeno oxidado + H2O

Una clase de tira reactiva emplea o-toluidina como el cromógeno indicador de la reacción. Reducción del Cobre (Clinitest y prueba de Benedict) Calor

Iones Cúpricos + Glucosa (o sustancias reductoras) –––––– Álcali

Oxido cuproso + Hidróxido Cuproso (rojo) (amarillo)

La tableta Clinitest (Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana) brinda la posibilidad de detectar otros azúcares. Este es un ensayo basado en la reducción del cobre que mide el total de sustancias reductoras presentes en la orina. Además de glucosa, el Clinitest puede detectar azúcares como galactosa, lactosa y pentosa. También puede reaccionar con el ácido ascórbico y ciertos fármacos como ácido nalidíxico (GramNeg) empleado para el tratamiento de infecciones del tracto urinario, Probenecid empleado en el tratamiento de la gota y cefalosporina, un antibiótico. Clinitest es un ensayo importante en el tamizaje pediátrico. Un resultado negativo obtenido por medio de una tira reactiva (especifica para glucosa) pero positivo para Clinitest puede detectar la presencia de desórdenes metabólicos congénitos en el recién nacido. Clinitest puede detectar sustancias reductoras a una concentración de 200 mg/L o más alta. Las tiras reactivas detectarán concentraciones de glucosa de 400 a 750 mg/L. Ya que Clinitest es menos sensible y específico que las tiras reactivas, no puede ser empleado como ensayo confirmatorio para resultados positivos de glucosa obtenida por medio de la tira. Clinitest debe reservarse para poblaciones de pacientes en quienes se necesita detectar sustancias reductoras diferentes a la glucosa. Los azúcares aparecerán en la orina por un incremento en la carga de filtración, como en la diabetes mellitus, o por disminución de la reabsorción tubular, como en la glucosuria 2299

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renal. La presencia de ácido ascórbico puede producir resultados erróneos bajos. Cetonas. El término cuerpos cetónicos incluye tres componentes químicos diferentes pero muy relacionados: ácido acetoacético, ácido beta hidroxibutírico y acetona (ver pág. 631 en capitulo 32). Los ensayos realizados por medio de tiras reactivas emplean la reacción de nitroprusiato de sodio que detecta acetona y ácido acetoacético pero no beta hidroxibutírico, el cuerpo cetónico primario. Es importante saber que el reactivo de nitroprusiato de sodio reacciona principalmente con el ácido acetoacético; la acetona tiene solo un 20% de reactividad comparada con el ácido acetoacético: pH alcalino

Acido acetoacético + Nitroprusiato de sodio + Glicina ––––––

Color púrpura

La determinación de cetonas es importante en el monitoreo de la diabetes y de la cetoacidosis y debe realizarse siempre que se determinen azúcares. Sangre y mioglobina Como se discutió anteriormente, una orina roja indica usualmente la presencia de eritrocitos, hemoglobina o mioglobina. La hematuria, a menudo, representa una combinación de eritrocitos intactos (más de 5 por campo de alto poder), eritrocitos fragmentados y hemoglobina libre. La hematuria gruesa o macroscópica implica hemorragia o sangrado fresco, lo que en un medio de orina ácida, da como resultado una apariencia de roja a parda, turbia, o ahumada. El método empleado por la tira reactiva para determinar hemoglobina o mioglobina se fundamenta en una actividad semejante a la de las peroxidasas: Mioglobina o hemoglobina

Peróxido de Hidrógeno (H2O2) + Cromógeno ––––––

Cromógeno oxidado (azul) + H2O

Un ensayo positivo indica la presencia de hematuria, hemoglobinuria o mioglobinuria, siendo necesario un análisis microsópico para confirmar la presencia de eritrocitos. La presencia en la orina de agentes oxidantes como los yoduros y bromuros, puede causar resultados falsos positivos; grandes cantidades de ácido ascórbico (usado en algunos antibióticos) pueden producir resultados falsos positivos en algunas tiras reactivas. La mioglobina es una porfirina ferrosa similar a la hemoglobina; se encuentra, comúnmente, en la orina en pacientes con traumas severos que involucran destrucción muscular. Cuando la mioglobina es liberada a la circulación, es rápidamente excretada por el riñón. Al igual que la hemoglobina, su presencia producirá orinas de apariencia rosada a roja. La mioglobina debe ser confirmada siempre por métodos rápidos de inmunodifusión o por radioinmunoensayo. Bilirrubina Orinas espumosas, de color amarillo a pardo, u oscuras son sugestivas de la presencia de bilirrubina conjugada. La orina normal no contiene bilirrubina. Los pacientes ictéricos con 2300

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enfermedad hepatocelular como hepatitis o enfermedad obstructiva como cirrosis biliar pueden tener bilirrubina conjugada en la orina. El método empleado por las tiras reactivas para determinar bilirrubina se basa en la reacción de diazoación. ácido

Bilirrubina glucorónido + Sal de diazonio ––––––

Azobilirrubina (pardo)

Los resultados negativos de orinas sospechosas y los resultados positivos cuestionables provenientes de orinas coloreadas, deben ser confirmados empleando tabletas de Ictotest (Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana). El Ictotest emplea la misma reacción de diazoación que las tiras reactivas. Se pueden encontrar resultados falsos negativos, en orinas no frescas porque la bilirrubina urinaria puede hidrolizarse u oxidarse por acción de la luz. Urobilinógeno El urobilinógeno es un compuesto coloreado, resultado de la reducción de la bilirrubina por acción de las bacterias en el intestino (ver capítulo 27). Las orinas normales contienen pequeñas cantidades de urobilinógeno. El urobilinógeno se encuentra disminuido en niños deficientes en bacterias intestinales; en pacientes después de la administración de antibióticos que reducen la flora intestinal, y en pacientes con enfermedades obstructivas hepáticas. Se encuentra un aumento del urobilinógeno en pacientes con anemias hemolíticas (aumento de formación de bilirrubina) y disfunción hepática. El método empleado por las tiras reactivas para la determinación del urobilinógeno varía según el fabricante. Ames emplea la reacción de Erlich, usando p-dimetilaminobenzaldehído en una reacción simple de color con el profobilinógeno. Esta reacción no es específica para urobilinógeno, pudiéndose encontrar resultados falsos positivos con otros compuestos que también reaccionan con el reactivo de Ehrlich (porfobilinógeno, PAS). Boehringer Mannheim Diagnostics emplea una reacción específica para el urobilinógeno: el urobilinógeno reacciona con un compuesto de diazonio produciéndose un color rojo. Para la determinación del urobilinógeno es necesario un especimen fresco porque el compuesto es sensible a la luz. El especimen preferido par la determinación cuantitativa del urobilinógeno urinario es una orina recolectada durante las dos primeras horas de la tarde. Este tiempo de recolección se debe a los patrones de excreción diurna del urobilinógeno. Nitritos El ensayo de nitritos es empleado en los laboratorios de uroanálisis para detectar bacteriuria. El método empleado en las tiras reactivas para determinar nitritos se basa en la reducción de nitratos a nitritos por la ación enzimática de ciertas bacterias presentes en la orina. En un pH ácido los nitritos reaccionan con el ácido p-arsanílico formando un compuesto de diazonio, el cual a su vez reacciona con N-(1- naftil) etiléndiamina produciendo un color rojo.ref(2182) El ensayo de nitritos debe ser realizado en especímenes recolectados en la primera orina de la mañana o en una muestra de orina que haya sido recolectada después de 4 horas o más, a partir de la última evacuación de la vejiga, con el fin de permitir que durante este tiempo los microorganismos metabolicen el nitrato dentro de la vejiga. En orinas pasadas o viejas, el 2301

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ensayo de nitritos puede ser positivo como resultado de la contaminación con bacterias después de la micción. La prueba de nitritos es específica para organismos gram negativos, sin embargo, se pueden obtener resultados falsos negativos si están presentes microorganismos como enterococos, estreptococos o estafilococos. La sensibilidad de la prueba de nitritos es del 60% comparada con procedimientos microbiológicos.ref(2183) Hay muy pocos casos de falsos positivos en la prueba de nitritos. Esta prueba es de dudoso valor en el análisis de orinas en medios hospitalarios, porque no hay controles efectivos sobre la forma y tiempo de recolección de las muestras. En clínicas y consultorios médicos tiene mayor validez porque allí se puede tener un control más adecuado sobre las muestras. Esterasa leucocitaria La presencia de leucocitos (piuria) es un indicador de inflamación clínicamente importante. El método empleado para la determinación de leucocitos intactos y lisados en las tiras de orina está basado en la presencia de esterasas intracelulares. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de los ésteres, liberando componentes que son luego empleados en una reacción de color. La intensidad de la reacción de color es directamente proporcional a la cantidad de leucocitos presentes en el especimen. En la Tabla 57-6 se muestra la sensibilidad de dos clases de tiras reactivas. La presencia de tricomonas y agentes oxidantes pueden producir falsos positivos. Aunque no está bien establecido, los eosinófilos y los histiocitos también pueden producir reacciones falsas positivas. Se pueden encontrar resultados falsos negativos con niveles altos de proteínas y ácido ascórbico. Varios estudios han documentado la utilidad clínica de la prueba de leucocitos como un tamizaje para la piuria, y muchos profesionales de laboratorio creen que un examen microscópico para leucocitos solamente debe realizarse en orinas positivas para esterasa, realizada por tira reactiva.refs(2184) Porfirinas Las porfirinas son productos intermedios en la biosíntesis del hemo y citocromos, los cuales son producidos en el hígado y en la médula ósea (ver capítulo 27). La identificación de diversas porfirinas y precursores de porfirinas (especialmente porfobilinógeno) es importante en el diagnóstico clínico de las porfirias, un grupo de trastornos metabólicos genéticos. En orinas normales la excreción de porfirinas es aproximadamente de 2 mg/día. Un incremento en la cantidad de excreción de porfirinas (porfirinuria) produce una orina de color rojo o vino. El análisis de tamizaje para porfobilinógeno en orina está basado en la prueba de Waston-Schwartz (ver pág. 714).ref(2185) Hay disponibles ensayos confirmatorios cuantitativos. Melanina Las orinas normales no contienen melanina. La melanina se encuentra en orinas de pacientes con melanoma maligno. Los pacientes con esta neoplasia maligna excretan precursores incoloros de melanina (melanógenos), los cuales al ser expuestos al aire se polimerizan formando un pigmento oscuro de melanina. Los análisis para tamizaje emplean cloruro férrico que oxida los melanógenos a melanina, la cual vuelve la orina a un color pardo oscuro.

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Examen Microscópico de la Orina Métodos Una identificación microscópica precisa del sedimento urinario es importante para el reconocimiento temprano de infecciones, procesos inflamatorios, y neoplasias que pueden afectar el tracto urinario.ref(2186) Está en debate sí todos los especímenes de orina seden someterse rutinariamente al análisis microscópico, el cual exige mayor inversión de tiempo. En su lugar, la mayoría de los trabajadores del laboratorio, están de acuerdo en que el examen microscópico de orina solo debe practicarse a pacientes sintomáticos, cuando el médico lo requiera específicamente y cuando se encuentre un análisis macroscópico anormal, es decir, cuando se encuentre hematuria, proteinuria o piuria (resultado de nitratos o esterasa positivos).refs(2187) Existen algunos procedimientos microscópicos establecidos para realizar el examen del sedimento urinario. La microscopía de campo claro estandarizada es aún la técnica que se emplea más frecuentemente.ref(2188) Las coloraciones supravitales pueden ser combinadas con la microscopía de campo claro para mejorar el detalle celular. La microscopía de contraste de fases es, probablemente, el mejor método para evaluaciones rápidas del sedimento de orina sin el uso de tinciones. Comercialmente hay disponibles métodos estandarizados de lectura del sedimento urinario en láminillas, que son superiores a los métodos convencionales realizados en laminillas de vidrio y cubre objetos, brindando una alternativa práctica con respecto al uso de la cámara de conteo hemocitómetro.ref(2189) Hasta la fecha la automatización no ha sido aceptada ampliamente por la necesidad de identificar y clasificar numerosas entidades presentes en el sedimento urinario. Están en vía de desarrollo, sistemas para automatizar parcialmente el análisis microscópico de la orina, empleando citometría de flujo o flujo celular montado en un escenario microscópico. Estandarización. La estandarización del examen microscópico de la orina es necesaria para reducir la ambigüedad y minimizar la subjetividad.ref(2190) Los aspectos del examen microscópico que deben estandarizarse son: 1. El volumen de la orina analizada. 2. La longitud y fuerza de la centrifugación. 3. El volumen de resuspensión y concentración del sedimento. 4. El volumen y cantidad del sedimento examinado. 5. La terminología y forma del reporte. Microscopía de campo claro de una orina no teñida. La microscopía de campo claro no coloreada emplea luz reducida para delinear los elementos más translúcidos de la orina, como, cilindros hialinos, cristales y filamentos de moco. La identificación precisa de leucocitos, macrófagos, células del epitelio tubular renal, y células que contienen inclusiones virales puede ser muy difícil en preparaciones no coloreadas. Para confirmar los resultados deben emplearse técnicas citológicas y preparaciones teñidas.refs(2191) Procedimiento. La orina debe examinarse mientras esté fresca, algunas células y cilindros 2303

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pueden desintegrarse en un lapso de una a tres horas. La refrigeración de 2° a 8° C por 48 horas, usualmente previene la desintegración de las células y entidades patológicas. Con propósitos de estandarización, cada especimen de orina debe concentrarse de diez a veinte veces. El examen se realiza de la siguiente manera: 1. Mezcle bien el especimen. 2. Ponga un volumen fijo (10, 12, ó 15 mL) de orina en un tubo de centrífuga graduado. 3. Centrifugue a 1500 rpm o aproximadamente 80 G por 5 minutos. 4. Extraiga el sobrenadante por decantación cuidadosa o aspiración hasta un volumen fijo: 1ml y 0.4 mL, son los más comunes. Resuspenda el sedimento golpeando suavemente en el fondo del tubo. 5. Ponga una gota el sedimento resuspendido en un área de una lámina estandarizada. 6. Examine con bajo poder (100x) y luz atenuada. Ajuste el enfoque fino permanentemente mientras se explora al azar el área cubierta. Durante la revisión evalúe el especimen en busca de células epiteliales transicionales y escamosas, cristales, moco, bacterias, levaduras y artefactos. Elabore el reporte de acuerdo a los protocolos del laboratorio. La identificación posterior de cilindros, células epiteliales renales, eritrocitos y leucocitos debe ser refinada empleando el objetivo de alto poder. 7. Examine, al menos, diez campos empleando luz tenue. Asegúrese de examinar los bordes porque a menudo los cilindros se encuentran a lo largo de los bordes del cubre objeto. Los cristales anormales, cuando están presentes, deben contarse con el objetivo de bajo poder. Una bacteriuria visible en bajo poder debe ser reportada, por lo menos, con 2+. 8. Examine, al menos, diez campos con alto poder (440x) y reporte con valores numéricos eritrocitos, leucocitos, y células del epitelio tubular renal. 9. Reporte todos los conteos (promedio de 10 campos) y evalúe cualitativamente de acuerdo a la terminología estandarizada. Microscopía de campo claro con tinciones supravitales. El detalle celular se realiza en sedimentos teñidos.refs(2192) Es frecuente el uso de un colorante de cristal violeta-safranina O para la evaluación rápida de ciertos elementos celulares. 27 Reactivo (Tinción de Sternheimer-Malbin) Solución 1

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Oxalato de amonio

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Agua destilada

80.0 mL

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1.0 g

Etanol (95%) Agua destilada

40.0 mL 400.0 mL

Mezclar y filtrar 3 partes de la solución 1 con 97 partes de la solución 2. La mezcla debe ser clarificada por filtración cada 2 semanas y descartarse después de 3 meses. Separadas y a temperatura ambiente, las soluciones 1 y 2 son estables indefinidamente. Con orinas altamente alcalinas, el colorante puede precipitar. 2304

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Procedimento. 1. Añadir una o dos gotas de colorante violeta-safranina O a, aproximadamente, 1 mL de sedimento de orina precentrifugado y concentrado a ese volumen. 2. Mezclar con una pipeta y poner una gota de esta suspensión en una laminilla. Microscopio de fases e interferencia. Muchos laboratorios de uroanálisis recomiendan el uso de la microscopía de contraste de fases para una mejor detección de los elementos formados más translúcidos del sedimento urinario. Los cilindros hialinos, moco, y bacterias pueden escapar a la detección empleando la microscopía convencional, no teñida, bajo campo claro. La microscopía de contraste de fases tiene la ventaja de endurecer los contornos inclusive de los elementos más efímeros, haciendo más sencilla su detección. 24 Siempre se logra un detalle morfológico mejor de los elementos formados (notablemente en cilindros y células) con el uso de un microscopio de contraste de interferencias. Métodos que emplean una laminilla estandarizada. Kova (ICL Scientific, Fountain Valley, Califormia), Count-10 y Count 6 (V-Tech, Palm desert, California), y Urisystem (Fisher Scientific, Pittsburgh) ofrecen procedimientos estandarizados completos que son técnicamente más precisos, reproducibles, y seguros que los métodos convencionales por microscopía de campo claro.ref(2193) La Tabla 57-10 muestra una comparación de esos sistemas estandarizados para la microscopía del uroanálisis. Todas esas laminillas estandarizadas son superiores a las laminillas de vidrio convencionales. Algunos laboratorios continúan empleando los hemocitómetros para cuantificar los elementos del sedimento de orina. Kessons y cols.ref(2194) proporcionan evidencias de que las cámaras para conteo son más precisas para detectar anormalidades del sedimento que los métodos convencionales de conteo de células en campos de alto poder. Estación de trabajo semiautomatizada para uroanálisis Un instrumento automatizado para uroanálisis, el Yellow IRIS (International Remote Imaging Systems Chastworth, California) combina la microscopía automatizada, un lector de tiras, y un módulo para gravedad específica. Esta tecnología puede ofrecer resultados más exactos que los sistemas manuales estandarizados, cuando hay un alto volumen de muestras y muy bajas concentraciones de elementos en el sedimento urinario.ref(2195) Los métodos manuales parecen ser más sensibles para detectar cilindros.ref(2196) Citocentrifugación y tinción de Papanicolaou combinados. Se ha recomendado una técnica que combina la citocentrifugación y la coloración de Papanicolaou para una valoración más exacta del sedimento de orina. Este método más especializado brinda una forma sencilla, reproducible y semicuantitativa para identificar los elementos del sedimento urinario. Con este método, los cilindros celulares, células mononucleares, fragmentos de tejido, y células neoplásicas pueden ser claramente identificados. Aunque no se encuentra rutinariamente en los laboratorios, la aceptación de este método está creciendo.refs(2197) Cristales Los cristales urinarios son vistos comúnmente (Figs. 57-1 a 57-5). Usualmente los cristales 2305

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no están presentes en orinas frescas recién obtenidas y en general, la formación de los cristales es considerada como un artefacto del sistema de recolección. Los cristales se forman cuando varios constituyentes químicos llegan a saturarse o sufren un cambio en su solubilidad, cuando la orina es almacenada a temperaturas más bajas. Ciertas sustancias químicas, como la albúmina, previenen la cristalización. Cuando la orina se calienta a 37oC, la mayoría de los cristales desaparecen. Aquellos cristales que todavía permanecen, tienen importancia diagnóstica, cuando se correlacionan con síntomas clínicos. Los tipos de cristales urinarios dependen del pH de la orina fresca. La Tabla 57-11 muestra los tipos más comunes, las propiedades, y la importancia clínica de varios cristales urinarios. La cistina, ácido úrico, leucina, y tirosina son los cristales de mayor importancia diagnóstica y por tanto deben ser identificados. Debido a la limitada relevancia clínica de los cristales, algunos laboratoristas están de acuerdo en que no debe desperdiciarse tiempo en su identificación específica. La formación de muchos cristales está inducida por varios medicamentos y su importancia clínica no es clara aún. Organismos. En un especimen de orina bien recolectado y procesado, la presencia de organismos es importante desde el punto de vista clínico. Se reportan, frecuentemente, bacterias, hongos, parásitos, y células infectadas con virus. Los organismos vistos en un especimen de orina son microscópicamente reconocibles como estructuras intra o extracelulares.ref(2198) Con la microscopía de campo claro se detectan fácilmente bacterias, hongos y parásitos. La detección de bacterias intracelulares fagocitadas y hongos, organismos de Toxoplasma, y cuerpos de inclusión viral, usualmente requieren procedimientos citológicos. La identificación exacta de los organismos ayuda en el diagnóstico clínico diferencial de infecciones del sistema urinario. Las preparaciones coloreadas son importantes en la evaluación de organismos, identificación de células inflamatorias asociadas, en la valoración de la exfoliación epitelial, y en la formación de cilindros renales con el fin de identificar su localización.ref(2199) Se deben emplear técnicas microbiológicas para confirmar y clasificar completamente algunos organismos urinarios. Bacterias. La orina de individuos normales es estéril y no contiene bacterias. Algunas bacterias pueden estar presentes por contaminación durante la recolección o por almacenamiento prolongado. Se puede determinar una concentración de menos de 103 bacterias/mL, cuando se han visto bacterias en un especimen de orina centrifugado pero no en el especimen sin centrifugar. La presencia de bacterias en un especimen sin centrifugar indica que hay una concentración mayor de 103 bacterias/mL. La presencia de 105 bacterias/ml o más sugiere una infección de tracto urinario. Este número corresponde a 10 o más bacterias por campo de alto poder. La identificación de bacterias, cocos o bacilos puede hacerse por microscopía de campo claro o por contraste de fases. Ocasionalmente hay dificultad en diferenciar bacterias de cristales amorfos. Hongos Las infecciones del tacto urinario (ITU) producidas por hongos son comunes en pacientes diabéticos, en aquellos que toman medicamentos desde el nacimiento, o en aquellos 2306

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que han recibido terapia intensiva con antibióticos o terapia inmunosupresora. En la mayoría de las ITUs de pacientes no inmunocomprometidos, se ha observado un patrón inflamatorio asociado. Candida albicans es el hongo más común, identificándose como levadura o micelio (Fig. 57-6). En general, la apariencia de gemación de levadura indica que el hongo ha coexistido con el huésped, mientras que la forma miceliar aparece durante la invasión al tejido. Las levaduras de Candida albicans son altamente refráctiles y miden de 3 a 5 µm. Suelen ser confundidas con eritrocitos (7um). A diferencia de los eritrocitos, las levaduras no son lisadas por ácidos. Parásitos La presencia de parásitos en la orina indica contaminación fecal o vaginal. La Trichomona vaginalis, un flagelado, es el parásito que más comúnmente se observa en la orina. La incidencia de este tipo de parásito en mujeres es muy alta pudiendo producir vaginitis severa. En el hombre, el parásito causa una uretritis asintomática. Debido a la motilidad de este organismo oval, la microscopía de campo claro es empleada como la forma más sencilla y rápida de identificación. Los tricomónidos inmóviles pueden ser confundidas con leucocitos o células epiteliales. Se han encontrado huevos de helmintos (Enterovius vermicularis) en la orina de niños por contaminación fecal. Morfológicamente un huevo de helminto está rodeado por una cápsula con dos capas, transparente y delgada, pudiéndose ver, enrollado dentro de ella, un embrión. En la orina, también pueden encontrarse huevos de trematodos, Schistosoma haematobium (encontrado en el norte de Africa) y Schistosoma mansoni (encontrado en Centro América). Células infectadas de virus Con una frecuencia cada vez mayor, se encuentran cambios celulares inducidos por virus en el sedimento de orina de pacientes inmunocomprometidos. Se deben emplear técnicas citológicas para asegurar la identificación de citomegalovirus, herpes simplex y Polyomavirus, los cuales producen células con inclusiones intranucleares diagnósticas, siendo estas las infecciones virales más comunes del sistema urinario. Las células de inclusión viral deben distinguirse de las células de inclusión provenientes de fuentes no virales, como la exposición a metales pesados (plomo y cadmio) y de cambios celulares degenerativos no específicos. En los textos de citología de orina se puede encontrar una descripción detallada de las células de inclusión viral. Células Una parte importante del análisis de la orina es la identificación y evaluación de las células. Normalmente las células más comunes en la orina incluyen unos cuantos leucocitos, eritrocitos, y células epiteliales de origen renal o del tracto urinario inferior. Todas las células de importancia patológica deben ser cuantificadas normalmente por examen del campo con el objetivo de alto poder. Eritrocitos. Una orina normal, examinada con objetivo de alto aumento, no debe contener más de unos cuantos eritrocitos.refs(2200) Estas células aparecen en la orina después de lesiones vasculares o trastornos del riñón o del tracto urinario inferior. La presencia de eritrocitos 2307

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acompañada de cilindros hemáticos o eritrocitos dismórficos (Fig. 57-7) es sugestiva de sangrado del parénquima renal o del glomérulo. La detección urinaria de eritrocitos dismórficos, especialmente acantocitos, es un marcador morfológico importante de sangrado glomerular o tubular.refs(2201) Su cuantificación ayuda en el diagnóstico y manejo del paciente. Cuando se examinen orinas de mujeres, es importante evitar la contaminación con sangre menstrual. Los eritrocitos miden, aproximadamente, 7 µm de diámetro, tienen forma de discos biconcavos los cuales aparecen de un color amarillo pálido cuando se examinan bajo microscopía de campo claro (Fig. 57-8). En orinas hipertónicas aparecen pequeños y dentados, mientras que en orinas hipotónicas aparecen más grandes e hinchados. Cuando los eritrocitos han permanecido en la orina por un tiempo considerable, la hemoglobina puede escapar de las células. En ocasiones, las tiras reactivas pueden detectar hemoglobina en ausencia de eritrocitos en el examen microscópico. Una posible explicación de esta discrepancia es la presencia de orinas alcalinas o hipotónicas, ambas pueden causar lisis de los eritrocitos. En ausencia de estas condiciones, es muy sugestivo que el pigmento que aparece en la orina (puede ser hemoglobina o mioglobina) se origine por filtración desde la sangre. Leucocitos (Fig. 57-8) La velocidad de excreción normal de eritrocitos en la orina es de 1 leucocito por cada 3 campos con objetivo de alto aumento, 3000 células/mL, o más de 200,000 células/hora. Un elevado número de leucocitos (piuria) está asociado a numerosos procesos inflamatorios e infecciosos del tracto urinario. La mayoría de los leucocitos vistos por microscopía de campo claro son neutrófilos segmentados. La identificación de linfocitos, células plasmáticas, y eosinófilos requiere de coloraciones especiales. Littleref(2202) ha mostrado que una velocidad de excreción en exceso de 400,000 células/hora siempre indica una infección del tracto urinario. Esta velocidad corresponde a más de 10 neutrófilos por campo de alto poder. Los pacientes con infecciones activas del tracto urinario superior tienen, frecuentemente, más de 50 neutrófilos por campo de alto poder o una velocidad de excreción de leucocitos que excede 2 o aún 3 millones/hora. Células del epitelio tubular renal ( Figs. 57-9 a 57-11) En el nefrón están alineados varios tipos de células del epitelio tubular renal y las células enfermas o viejas están constantemente siendo arrojadas a la orina. Aunque ellas representan la exfoliación renal real, la presencia de más de dos células del epitelio tubular renal por campo de alto aumento indican daño o lesión activa de los túbulos renales. Hay grandes dificultades en la identificación precisa de las células de los túbulos renales, especialmente, para diferenciarlas de las células mononucleares comúnmente encontradas en la orina. Por microscopía de campo claro, las células tubulares renales son poligonales y de tamaño ligeramente menor que los leucocitos. Se requieren técnicas citológicas para la identificación exacta de los diferentes tipos de células tubulares renales (ductos convolucionados versus ductos colectores), de capas o fragmentos.refs(2203) Cuerpos grasos ovales (Fig. 57-12) Los cuerpos grasos ovales son células del epitelio tubular renal que están llenas de 2308

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lípidos absorbidos o que han sufrido cambios degenerativos celulares. A menudo los cuerpos grasos ovales son asociados con proteinuria y lipiduria y son característicos del síndrome nefrótico y diabetes mellitus. Células epiteliales de transición (Fig. 57-13) En la orina normal se pueden encontrar unas pocas células de transición (uroteliales). Un gran número de células transicionales puede indicar procesos inflamatorios de la vejiga, cateterización o estados patológicos malignos. Por microscopía de campo claro, las células transicionales aparecen redondas u ovaladas, miden de 40 a 60 µm, y tienen un núcleo localizado centralmente. Los bordes citoplásmicos de esas células aparecen engrosados y rígidos. Cuando los núcleos de las células transicionales llegan a agrandarse o a tornarse irregulares, se recomienda emplear técnicas citológicas con el fin de detectar enfermedades malignas del sistema urinario. Células epiteliales escamosas (Fig. 57-14) Las células epiteliales escamosas se alinean en la porción distal del tracto urinario inferior y en el tracto genital femenino. Las células escamosas son las células más grandes encontradas en la orina. Tienen un citoplasma grande y plano con un núcleo pequeño. Frecuentemente, una o más hileras de esas células pueden plegarse. La presencia de células escamosas en la orina usualmente indica contaminación (vaginal, en mujeres y uretral en hombres no circuncidados) o metaplasia escamosa de la vejiga, y representan el tipo menos importante de células epiteliales encontradas en la orina. Fragmentos de tejidos en la orina (Fig. 57-15) En la orina, pueden observarse algunos conglomerados o fragmentos de material de apariencia sólida. Debido a su gran tamaño, este material es identificado en la inspección inicial de la orina. Es de color generalmente blanco o bronceado. Es muy importante establecer la identidad de este material para un diagnóstico seguro. Esto implica transferirlo a un fijador apropiado con el fin de preservarlo para una evaluación citológica o histológica. La necrosis papilar renal o los tumores de la vejiga son las entidades mas frecuentemente responsables de desprender grandes fragmentos de tejido en la orina. Espermatozoides. Los espermatozoides pueden ser fácilmente reconocidos en la orina de un hombre después de la eyaculación o en la orina de una mujer por contaminación vaginal después del coito. Su identificación es de limitada importancia clínica y la presencia de espermatozoides, generalmente, no es reportada. Cilindros renales (Figs. 57-16 a 57-21) Los cilindros renales (urinarios) son estructuras cilíndricas que se organizan en el nefrón y su importancia proviene de su localización. Están formados por uromucoide (mucoproteína de Tamm-Horsfall), que está siempre presente en la orina, usualmente en suspensión. Este uromucoide es producido por las células del epitelio tubular renal de la sección ascendente del asa de Henle. Los cilindros se forman como consecuencia del estancamiento de la orina y de la precipitación del uromucoide. El incremento en la concentración de proteínas, sales, y un pH urinario bajo son algunos de los factores que contribuyen a su formación. Debido a que la 2309

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precipitación de esta proteína depende de la concentración y composición de la orina, los cilindros se forman más fácilmente en la porción distal del nefrón y en los ductos colectores del riñón, donde la orina es más concentrada. En pacientes con proteína de Bence Jones (mieloma múltiple), los cilindros pueden formarse en los túbulos convolucionados proximales. Estas formaciones cilíndricas presentes en la orina reflejan las formas (largas o cortas) y diámetros (delgados y gruesos) de los lúmenes de los túbulos renales en donde se formaron. Su número y propiedades cuantificables aportan valiosos indicios sobre la naturaleza de la enfermedad del parénquima renal. Microscópicamente, los cilindros se caracterizan por la apariencia de su matriz (hialina, granular, cérea), por los constituyentes celulares (eritrocitos, leucocitos, o células del epitelio tubular renal) o por el tipo de material particulado embebido en la matriz (gránulos finos, gruesos o fibrina). La identificación exacta de los cilindros, especialmente de los tipos celulares, es difícil cuando se hace en preparaciones húmedas no coloreadas visualizadas en microscopios bajo la luz directa o campo claro. Se necesita un microscopista hábil para evitar las interpretaciones erróneas. La visualización de los cilindros mejora con el empleo de microscopios con contraste de fases, de filtros de contraste o coloraciones especiales. La técnica de citocentrifugación de Papanicolaou es el mejor método para asegurar la identificación de cilindros en orina en pacientes con enfermedad renal. Para propósitos diagnósticos de enfermedad renal, los cilindros se han clasificado como fisiológicos o patológicos. En la Tabla 57-12 se encuentra una lista de los tipos, propiedades, e importancia clínica más comunes de los cilindros. Grasas. Las grasas se encuentran en la orina de pacientes quienes han presentado embolismo graso después de lesiones severas con aplastamiento óseo, degeneración grasa del riñón o síndrome nefrótico. La grasa aparecerá en la superficie de la orina recolectada en la última parte de la micción. En el sedimento urinario se pueden encontrar células epiteliales vacuoladas. La identificación de las gotas de grasa se facilita empleando coloraciones especiales para grasa como Oil Red O o Sudán III.

Citología de Orina Los laboratoristas que trabajan el uroanálisis deben ser capaces de reconocer células mononucleares anormales, sugestivas de malignidad. Esto debe ser referido para citología de orina. Holmquist ha promovido el uso de coloraciones supravitales para la detección de células malignas y ha sugerido la función del laboratorio de uroanálisis en el tamizaje del cáncer.

Cálculos (Litiasis) Los cálculos urinarios son precipitaciones, concreciones, o cristaloides embebidos en una sustancia de moco y proteínas y pueden también encontrarse bacterias y células epiteliales incluidas en estas formaciones. Aunque la causa de su formación es aún controvertida, la 2310

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detección e identificación de los cálculos es muy importante en el diagnóstico de las afecciones del sistema urinario. La formación de cálculos en el riñón o en el tracto urinario inferior puede ser fuente de hematuria severa, causar daños anatómicos serios, y dolor muy agudo en el paciente. El conocimiento de la composición específica de un cálculo expulsado o extraído quirúrgicamente puede ayudar al médico en el tratamiento efectivo de la litiasis y a prevenir su formación futura. El análisis de los constituyentes químicos de los cálculos es un procedimiento complejo de laboratorio. Los cálculos urinarios están usualmente compuestos de oxalato de calcio, oxalato de calcio mezclado con fosfato de calcio, fosfato de amonio y magnesio, ácido úrico, o cistina. La mayoría de los laboratorios refieren sus especímenes para análisis de cálculos a laboratorios especializados.

Hallazgos Urinarios en Enfermedades Renales Comunes y del Tracto Urinario Inferior Hay numerosos estados y enfermedades primarias y secundarias del riñón y del tracto urinario inferior. Un diagnóstico preciso de las enfermedades del sistema urinario requiere la correlación de hallazgos anormales en la orina con la historia clínica del paciente, su examen físico, signos y síntomas, prueba de función renal, y otros datos de laboratorio. Para ser clasificado como anormal, un sedimento urinario debe cumplir por lo menos uno de los siguientes criterios: 1.Más de cinco eritrocitos o leucocitos por campo de alto aumento (400X). 2.Más de dos células tubulares por campo de alto aumento (400X). 3.Más de tres cilindros hialinos, más de un cilindro granuloso, o la presencia de cualquier cilindro patológico por campo de bajo aumento (100X). 4.Más de diez bacterias por campo de alto aumento (400X). 5.Presencia de hongos, parásitos, o células de inclusión. 6.Presencia de cristales patológicos(cistina) o un gran número de cristales no patológicos (como el ácido úrico). El Tabla 57-13 muestra un resumen de las anormalidades encontradas en el uroanálisis en enfermedades renales comunes y en enfermedades del tracto urinario inferior, así como una breve revisión de los hallazgos en los exámenes macroscópico y microscópico.

Un Enfoque Coordinado para el Uroanálisis El uroanálisis continua siendo uno de los procedimientos de laboratorio clínico mas comúnmente requeridos y solicitados.ref(2204) Los laboratorios dedicados al análisis de la orina deben definir nuevas responsabilidades tanto en el proceso de los métodos rápidos y rutinarios como en el proceso e interpretación de los análisis especializados para los que se requiere mayor inversión de tiempo.ref(2205) La estandarización del examen de orina realizado bajo microscopía de luz en campo claro, empleando tiras húmedas rápidas y tecnología actualizada, ofrece un buen programa de calidad para el análisis de especímenes provenientes de individuos asintomáticos. Sí los 2311

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pacientes sintomáticos van a recibir un análisis de orina más integral, se requiere de una evaluación más definitiva y la realización de procedimientos confirmatorios. La Fig. 57-22 describe un enfoque coordinado que puede seguirse en el proceso del examen de orina. El uso adecuado de este enfoque, exige que el clínico y el tecnólogo encargado del análisis de la orina entiendan claramente las funciones y posibilidades que ofrecen tanto el laboratorio de análisis básico como el especializado, el cual posibilita un examen más integral del sedimento urinario. Después de la recolección de la orina y de su análisis macroscópico, el médico o el laboratorio deben diferenciar los resultados provenientes de los pacientes sintomáticos y de los asintomáticos. Debe hacerse énfasis en la capacidad del tecnólogo responsable del uroanális para reconocer los resultados que requieren seguimiento y análisis adicionales. Este enfoque coordinado representa un sistema flexible a través del cual las responsabilidades técnicas pueden ser compartidas, integrando al sistema procedimientos confirmatorios especiales (Fig. 57-22). La comunicación entre los médicos, los analistas del laboratorio y el médico director es esencial para aclarar resultados no concluyentes y restablecer la credibilidad en el examen de la orina.

Control de Calidad Para asegurar la exactitud de los resultados del uroanálisis es crucial establecer un programa efectivo de control de calidad. Debe implementarse un programa de aseguramiento de la calidad que cubra todos los aspectos del uroanálisis y que sea similar al de las otras áreas del laboratorio clínico involucradas con el fin de lograr resultados confiables.ref(2206) Existen preparaciones disponibles comercialmente de control de calidad para gravedad específica y pruebas de la tira reactiva. Estas preparaciones pueden ser presentadas en forma de tabletas, tiras, líquidos o liofilizados. Hocltge y Ertsref(2207) describen una experiencia de tres años, empleando un control de orina sintética preparado en su laboratorio. Actualmente no existe ninguna preparación comercial ideal para elementos del sedimento urinario. El control de calidad en la evaluación del sedimento debe enfocarse a las técnicas y políticas estandarizadas. La Tabla 57-14 sugiere un esquema de control de calidad. Es importante que los reactivos sean fechados cuando son recibidos en el laboratorio y usados antes de su expiración. Las soluciones de orina control son estables si se almacenan refrigeradas, en recipientes con cierres bien ajustados y protegidas de la luz.ref(2208) Deben llevarse registros de los números de lote que se reciben. Se debe mantener y revisar anualmente un manual que contenga instrucciones de operación y documentación del mantenimiento de los equipos. Debe enfatizarse en la importancia de un programa de educación continua para tecnólogos y el uso de referencias actualizadas.ref(2209)

Referencias 1. Bonnardeau A, Sommerville P, Kaye M: A study on the reliability of dipstick urinalysis, Clin Nephrol 41:167-172, 1994. 2. Kennedy TJ, McConnell JD, Thall ER: Urine dipstick vs. microscopic urinalysis in the evaluation of abdominal trauma, J Trauma 28:615-617, 1988.

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Tablas Table 57-1.

Table 57-2.

Tabla 57-3. Causas comunes de orina opaca o turbia. Causas Químicas Ureatos Fosfatos y carbonatos Cristales

Mucus

2314

Métodos de aclaramiento

Comentarios

Solubles a 60 °C o álcali Solubles en ácido diluido Ver las caracteristicas específicas de solubilidad (Tabla 57-11)

Sedimento rosado

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Viscosa

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Medios de contraste radiográficos Lípidos Quilo

Solubles en hidroxido de sodio al 10% Solubles en éter Solubles en éter

Células Bacterias Hongos Eritrocitos Leucocitos Epitelio Espermatozoides

Centrifugación Centrifugación Centrifugación Centrifugación Centrifugación Centrifugación

Opalecente Lechosa

Olor desagradable Olor a sudor Roja, ahumada

Tabla 57-4. Estandarización de soluciones para gravedad específica. Solución Agua destilada Cloruro de sodio al 3% Cloruro de sodio al 5% Sucrosa al 9%

Gravedad específica 1.000 1.015 +/- 0.001 1.022 +/- 0.001 1.034 +/- 0.001

Tabla 57-5. Composición de la orina de individuos normales. Constituyente Albúmina Calcio Creatinina Glucosa Cetonas Osmolaridad Fósforo Potasio pH Sodio Gravedad específica Bilirrubina total Proteinas totales Nitrógeno ureico Acido úrico Urobilinógeno

Valor < 15-30 mg/l 100-240 mg/24h 1.2-1.8 mg/24h