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Química Clínica

Manual de Prácticas de Laboratorio

Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez

PRACTINA NO________ DETERMINACION DE FOSFATASA ALCALINA (ALP) INTRODUCCION La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los monoésteres del ácido ortofosfórico en medio alcalino. En el adulto proviene en parte del higado (termoestable) y en parte de hueso, sistema reticuloendotelial y vascular (termolabil) dando lugar a distintas izoenzimas. La actividad serica de ALP ósea, en condiciones normales alcanza su mayor actividad en los niños en edad de crecimiento, llegando a triplicar los niveles del adulto, debido a que esta izoenzima se localiza en los osteoblastos. También es fisiológico el aumento que se produce al final de primer trimestre de embarazo, a expensad de la izoenzima placentaria que en este periodo alcanza niveles máximos. Entre las patologías que afecta la actividad sérica de ALP se pueden citar: carcinomas metastáticos en higado y hueso, colestasis biliar, infarto al miocardio, pulmonar o renal. FUNDAMENTO La ALP hidroliza al p-nitrofenilfosfato, incoloro, produciendo fosftato y p-nitrofenil a pH de 9.8, la velocidad de aparicion del anion p-nitrofenolto a 405nm, es proporcional a la actividad enzimatica en la muestra. La dietanolamina regula en pH de reaccion y actua como aceptor del fosftato liberado por la fosfatasa. ALP + p-NFF  PO4 + p-Nitrofenol (pH 9.8) Esta prueba se realiza en el contexto de otras pruebas hepáticas (GOT, GPT, Bilirrubina, GGT) y se utiliza para evaluar problemas hepáticos. Suele asociarse en la elevación de GGT excepto en problemas óseos donde solo se eleva la ALP. REACTIVO Buffer DEA : dietanolamina Sustrato pNFF MUESTRA Suero MATERIAL • Espectrofotómetro y cubetas • Baño maria • Agua destilada • Pipetas • Estandar de calibración • Reactivos de ALP

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PARAMETROS Longitud de onda Temperatura de reacción Tiempo Vol final de reacción

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Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez

405nm 25, 30 o 37ºC 3 minutos 2.52mL

PROCEDIMIENTO Colocar en cubeta a temperatura de Reaccion: Sustrato reconstituido 2.5mL Preincubar unos minutos, después agregar Muestra 20uL • •

•

Leer absorbancia inicial en espectro a 405nm, disparar cronómetro Registrar absorbancias después de 1,2 y 3 minutos después de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de Absorbancia / min (∆A/min), restando cada absorbancia y obteniendo el promedio.

CALCULOS ALP (U/I) = ∆A/min x 6812

RESULTADOS ALP= ______________ (U/I) VALORES DE REFERENCIA Adultos: Niños y adolescentes 25ºC = 40-190 U/I hasta 400 30ºC = 45-213 U/I hasta 450 37ºC = 65-300 U/I hasta 645 CONCLUSIONES

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PRACTICA NO. ____ DETERMINACION DE CREATININA DEPURACION DE CREATININA INTRODUCCION La determinación de niveles séricos de creatinina, producto de la degradación de la creatina, se utiliza como índice de funcionalismo renal, dado que su eliminación se efectúa a través del riñón y casi exclusivamente por filtración. FUNDAMENTO La creatinina reacciona con el picrato alcalino, según la reacción de Jaffé, para dar un cromógeno rojizo. La cantidad de cromógeno que se forma bajo condiciones controladas, es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra y se mide fotométricamente a 490-510nm. La reacción de jaffé es una reacción no específica para creatinina, pero las otras sustancias que reaccionan con el picrato alcalino, lo hacen durante los primeros 30 segundo de iniciada la reacción. MATERIAL REQUERIDO • Espectrofotómetro • Cubetas de lectura • Material volumétrico • Sistema de termostatizacion (20-30ºC) • Cronómetro PARAMETROS Longitud de onda Temperatura Ajuste a cero

500nm (490-510) 25ºC agua destilada

PROCEDIMIENTO Pipetear en cubetas Estandar Muestra espectrofotométricas: Reactivo de Trabajo 2.0mL 2.0mL Equilibrar a temperatura de trabajo y pipetear Estandar 0.4mL Muestra 0.4mL Mezclar inmediatamente y disparar el cronómetro A los 30 seg exactos de incubación registrar las lecturas de Abs de S1 y M1. A los 5 minutos exactos de incubacion registrar las lecturas de Abs de S2 y M2. CALCULOS *SUERO Creatinina (mg/L) = (M2-M1) x f

*ORINA DE 24 HORAS Creatinina (g/24h) = (M2 – M1) x f

f= 20mg/L S2-S1

f= 0.020g/L x 50 x V S2-S1

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Donde 50 es el valor de dilución y V= vol de diuresis en litros en 24h. *DEPURACION DE CREATININA ENDOGENA D.C.E. ml/min =

creatinina en orina (g/24h) Creatinina en suero (mg/L)

x 694

RESULTADOS Creatinina en Suero ___________________mg/L Creatinina en Orina ___________________g/24h D.C.E. ___________________ml/min VALORES DE REFERENCIA Suero 8-14mg/L Orina 8-23 mg/kg / 24h DCE 80-140 ml/min CONCLUSION

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PRACTINA NO___ CLORO FUNDAMENTO El cloro reacciona con el tiocianato de mercurio para formar un compuesto coloreado. REACTIVO Reactivo: formado por tiocianato de mercurio, nitrato de hierro y ácido nitrico. Estandar: Cloro MUESTRA Suero Plasma heparinizado Orina PARAMETROS Longitud de onda Temperatura Cubeta Ajustar a cero

480nm 37ºC 1cm de paso de luz blanco de reactivo

PROCEDIMIENTO Blanco Reactivo 1mL Agua destilada 10Ul Estandar Muestra Mezclar, incubar 5 minutos Leer abosrbancias (densidad optica DO) Color final estable 1 hora. CALCULO Muestra DO Estandar DO

Estandar 1mL 10uL

x n

n= 100mEq/L 100mmol/L 335mg/dL RESULTADO Cloro = ___________mg/dL VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma 98-107 mEq/L 98-107 mmol/L 348-380 mg/dL CONCLUSION

Muestra 1mL

orina 110-250 mEq/24h 3900-8870 mg/24h

10uL

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PRACTICA NO._____ TRIGLICERIDOS PRINCIPIO DEL METODO Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula, al igual el colesterol son transportados por LPL en la sangre. Una dieta alta en grasa eleva los triglicéridos, cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar, pueden estar relacionadas con esta enfermedad. Los triglicéridos son incubados con LPL, liberan glicerol y ácidos grasos libres, el glicerol es fosforilado por glicerofosfato deshidrogenada y ATP en presencia de glicerol quinasa para producir glicerol 3 fosfato y ADP, el D3P es convertido en dihidroxifosfato y peróxido de Hidrógeno por GPO. Al final el H2O2 reacciona con 4-AF y p-clorofeno por la enzima peroxidasa provocando coloración roja. MUESTRA Suero o plasma PROCEDIMIENTO Longitud de onda Temperatura 37ºC o 15 a 20 ºC Ajustar el cero con agua destilada.

505nm

Blanco Patron Muestra R ml 1mL 1mL 1mL Patrón uL 10uL Muestra uL 10uL Mezclar Incubar 10 minutos a temperatura ambiente Leer absorbancia del calirador, de la muestra frente a blanco. Color estable 30 min. CALCULOS ABS muestra ABS Patron

x 200 (conc) =__________mg / dL

RESULTADO Triglicéridos = ____________mg/dL VALORES DE REFERENCIA Hombres 40 a 160 mg/dL Mujeres 35 a 165 mg /dL CONCLUSION

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PRACTICA NO._____ COLESTEROL Los esteres de colesterol se hidrolizan por la acción de la colesterol ester hidrolasa para liberar colesterol y ácidos grasos. El colesterol libre exisente junto con el producido por esta reacción se oxida por la acción de colesterol oxidasa en 4-colestenona y peróxido de hidrógeno. Este ultimo, en presencia de peroxidasa, oxida el sistema cromógeno (4-aminoantipirina/fenol) en un compuesto de color rojo. PRECAUCIONES ¡toxico! El estandar coniene 2-mettoxietanol, evitese la exposición, nocivo por inhalación, ingestión o contacto con la piel. Inflamable. Puede perjudicar la fertilidad, riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. MUESTRAS Suero Plasma heparinizado PROCEDIMIENTO Longitud de onda Temperatura Cubeta Leer contra blanco de reactivo Reactivo Agua destilada Estandar Muestra

Blanco 1mL 10uL -

500nm (492-550) 37ºC 1cm de paso de luz Estandar 1ml 10uL -

Muestra 1mL 10uL

Mezclar, y tras una incubación de 5 min, leer la densidad óptica (DO) El color final se mantiene estable durante 1 hora. CALCULOS Muestra DO *n = Estandar DO

RESULTADO CHOL= ___________mg/dL VALORES DE REFERENCIA 150-260 mg/dL 1.5 – 2.6 g/L 3.87 – 6.71 mmol/L CONCLUSION

n= concentración de std, 200mg/dL 2g/L 5.17mmol/DL

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PRACTINA NO______ BILIRRUBINA Significado Clínico La bilirrubina es un compuesto de degradación de la Hemoglobina, captada por el hígado para su conjugación y excretada en la bilis. Alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar su aumento (hiperbilirrubinemia). La determinación de la bilirrubina sérica en niños recien nacidos es de gran importancia, ya que aumenta con un consecuente riesgo de difución al sistema nervioso, esto se debe a que en la eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recien nacido, patología provocada por incompatibilidad materno-fetal, se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Fundamento del Método La bilirrubina reacciona con el ácido sulfanílico diazotado originando un producto color rojovioleta (azobilirrubina), que se mide a 530nm. La bilirrubina directa reacciona con el diazorreactivo , pero la indirecta requiere de un desarrollador acuoso. De manera, que para que reaccione la Bilirrubina Total (directa e indirecta) de la muestra, es necesario agregar benzoato de cafeína al medio de reacción. Reactivos • Desarrollador solución acuosa de Benzoato de cafeina 0.13mol/L • Nitrito de Sodio • Reactivo Sulfanílico • Bilirrubina STD (no provista) • Agua destilada (no provista) Muestra • Suero o Plasma heparinizado. Libre de hemolisis. Estable 48 horas de 2 a 10ºC. la acción de la luz puede destruir en una hora el 50% de la bilirrubina, es necesario proteger. Material • Espectrofotómetro • Pipetas y micropipetas • Reloj Condiciones de Reacción Longitud de Onda Temperatura de Reaccion Tiempo de Reacción Vol Muestra Vol final de Reaccion PROCEDIMIENTO Colocar en tubos separados Blanco Muestra 200Ul Agua destilada 2.5mL Desarrolador Reactivo Sulfanílico 200uL Diazorreactivo

530nm en espectrofotómetro Ambiente 5 min 200uL 2.9mL

Directa 200uL 2.5mL

Total 200uL 2.5mL

200uL

200uL

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CALCULOS Bilirrubina Total (mg/L) = Bilirrubina Directa Bilirrubina Indirecta (libre) Factor RESLTADOS Bilirrubina Directa Bilirrubina Indirecta Bilirrubina Total

(T – B) x f (D – B) x f BR Total – Br Directa Calclar con en el Estandar de bilirrubina

____________mg/L ____________mg/L ____________mg/L

VALORES NORMALES Adultos Directa hasta 2mg/L Total hasta 10mg/L Recien Nacidos Sangre de cordon 24 horas 48 horas 3 a 5 dias CONCLUSION

A termino 25mg/L 60mg/L 75mg/L 120mg/L

prematuros 80mg/L 120mg/L 230mg/L

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PRACTICA NO.______ ELECTROLITOS EN SUERO CALCIO El calcio tiene numerosas funciones dentro del cuerpo, no solo es factor estructural de huesos y dientes sino que también se encuentra en la sangre y en la función neuromuscular. INCREMENTOS Hipercalemia se puede desarrollar en pacientes con enfermedad de Pager de hueso e hiperparatiroidismo, el incremento se debe al aumento de la reabsorción en los huesos causada por metastasis o factor humoral producido por celulas tumorales. DECREMENTO Hipocalemia METODO Arsenazo III El Arsenazo III se combina con los iones del calcio a pH de 6.75 y forma un cromoforo coloreado cuya absorbancia es directamente proporcional a la concentración de calcio en la muestra. Arsenazo tiene alta afinidad por los iones de calcio y no muestra interferencia por los otros cationes que se encuenran en suero, plasma u orina. Reactivo El reactivo esta listo para su uso Muestra Suero, plasma heparinizada u orina. Muestra estable 7 dias a temperatura de 2 a 8ºC y seis meses en congelación. PARAMETROS Longitud de Onda Volumen de la muestra Volumen de Reactivo Incubación Concentración STD Blanco

630nm 10/20 uL 500-1000uL 1 min a 37ºC 10mg/dL Reactivo

PROCEDIMIENTO Pipetear dentro de BLANCO tubos marcados Reactivo 1000 Agua destilada 20 Estándar Muestra Mezclar y leer absorbancia a 630nm CALCULOS Calcio mg/dL =

STD

MUESTRA

1000

1000

20

ABS M / ABS STD X (Concentración STD) =

RESULTADO Calcio = _______________mg/dL

20

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MAGNESIO El magnesio forma coloracion purpura al reaccionar con la calmadita en medio alcalino, proporcional a la concentración de Mg en la muestra. Es el segundo cation mas numeroso en el organismo. Niveles altos de Mg se hallan en uremia, fallo renal o enfermedad de Addison. REACTIVOS Reactivo 1 Reactivo 2 Magnesium cal

amino metil propanol - EGTA Calmagita Patron de Mg

MUESTRA Suero o plasma heparonizado libre de hemolisis, estable 7 dias a temperatura de 2 a 8ºC. tambien puede utilizarse orina. PROCEDIMIENTO Longitud de onda Temperatura Ajustar Pipetear en cubeta Rt Ml Patron uL Muestra uL

520 nm 371C o 15-20 con agua destilada Blanco 1

Patron 1 10

10

CALCULOS ABS M / ABS P X 2 (CONC PAT) = mg / dL de Mg. RESULTADO Magnesio :

_______________mg/dL

VALORES NORMALES Suero o plasma Orina

Muestra 1

1.5 a 2.5 mg/ dL 24 a 244 mg /dL

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FOSFORO INTRODUCCION El fósforo es esencial para la formación de tejido oseo y en el metabolismo energético celular. Aprox. El 85% se encuentra en hueso y dientes. Niveles bajos se deben a hipervitaminosis D, hipertiroidismo, desordenes renales, mala absorción. Niveles altos se atribuyen a la dieta, metástasis de huesos, alcoholismo, diarreas, alteraciones de hígado. FUNDAMENTO Método para detección de fósforo inorgánico. El Pi reacciona en medio ácido con molibdato amónico formando un complejo fosfomolibdico de color amarillo, de intensidad proporcional a la concentración de Pi presente en la Muestra. REACTIVO R molibdico Phosphorus Cal MUESTRA Suero o plasma libre de hemolisis Orina PARAMETROS Longitud de onda Cubeta Temperatura Ajustar a cero

340nm 1cm 37-30-25ºC con agua destilada

PROCEDIMIENTO Pipetear en una cubeta Blanco Patrón Reactivo 1Ml 1mL Patrón 10uL Muestra Mezclar e incubar 5 min Leer abs Patron y Muestra frente a Blanco de Reactivo. CALCULOS Suero ABS M x 5 (conc. P) = mg/dL ABS P Orina 24h ABS M ABS P

x 5 x Vol (dL) orina /24h = mg/24h

RESULTADO Fósforo = _____________mg/dL VALORES NORMALES Suero o plasma Orina Niños 4-7mg/dL Adultos 2.5-5mg/dL 0.4-1.3g/24h

Muestra 1mL 10uL

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PRACTICA NO.____ ALBUMINA FUNDAMENTO La albúmina se une al azul de bromocresol a pH ligeramente ácido produciendo coloración amarilla a azul verdoso dependiendo de la concentración de la albúmina en la muestra. La albúmina es una proteína plasmática importante producida por el hígado, sus niveles se alteran en enfermedades hepáticas, desnutrición, dermatitis. REACTIVO Verde bromocresol pH 4.2 Patrón primario acuoso de albúmina MUESTRA Suero o plasma libre de hemólisis Estable 1 mes a 2-8ºC. PARAMETROS Longitud de onda Temperatura Cubeta Ajustar a cero

630nm 15-25ºC 1cm agua destilada

PROCEDIMIENTO Blanco Patrón Muestra Reactivo 1mL 1mL 1mL Patron 5uL Muestra 5uL Mezclar, incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer absorbancia de Patrón y Muestra contra blanco, color estable 1 hora. CALCULOS ABS M X 5 (conc. Patrón) = g/dL ABS P

RESULTADO Albúmina =

_______________g/dL

VALORES NORMALES 3.5 a 5 g/dL CONCLUSIONES

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PRACTICA NO.____ PROTEÍNAS TOTALES En medio alcalino las proteínas dan color violeta azulado en presencia de sales de cobre, la intensidad es proporcional a la concentración de la proteína total en la muestra. Las proteínas se encuentran distribuidas en el organismo actuando estructuralmente y de transporte. Se dividen en dos fracciones: Albúmina y Globulina Se detección es util para detección de: Hiperproteinemia Hipoproteinemia. REACTIVO Reactivo de Biuret T protein Cal MUESTRA Suero o plasma heparinizado. Estable un mes en nevera a 2-8ºC PARAMETROS Longitud de onda Cubeta Temperatura Ajustar a cero

540nm 1cm 37ºC/15-25ºC con agua destilada

PROCEDIMIENTO Blanco 1ml

Patrón 1mL 25uL

Muestra 1mL

Reactivo Patron Muestra 25uL Mezclar, incubar 5 min a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente. Leer absorbancia de Patrón y Muestra contra blanco, color estable 30 min. CALCULOS Abs M Abs P

x 7 (conc. P) = g/dL

RESULTADOS Proteinas Totales = ___________g/dL VALORES NORMALES Adultos : 6.6-8.3 g/dL Recien Nacidos : 5.2-9.1 g/dL CONCLUSIONES

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PRACTICA NO__ AST ASPARTATO AMINOTRASMINASA INTRODUCCION La AST tiene una alta concentración en el músculo cardiaco, las células hepáticas, las células músculo esquelético y en menores grados en otros tejidos. Aunque un nivel elevado se AST en el suero no es especifico de la enfermedad hepática, se utiliza principalmente para diagnosticar y verificar el curso de esta enfermedad ( junto con otras enzimas como la ALT, ALP y bilirrubina) Tambien se ha usado para monitorear a los pacientes con los ataque cardiacos, pero es mucho menos especifica que los izo enzimas CPK y DHL para este propósito. MUESTRA Suero sin hemolisis Plasma EDTA

Reactivo 1

Reactivo 2

L- aspartato LDH Acida sodica

a-cetogluterato NADH azida sodica

PARAMETROS • • • •

340 nm longitud de onda 30-37°C Cubeta de 1 cm paso de luz Blanco agua destilada

PROCEDIMIENTO Procedimiento de un reactivo Reactivo de trabajo Muestra

1 ml 100 ul

Mezclar uncubar un minuto, medir cambio de densidad óptica durante 3 min. Procedimiento de dos reactivos Reactivo 1 1mL Muestra 100uL Mezclar y esperar 1 minuto Reactivo 2 100uL Mezclar, incubar 1 minuto, y medir cambio de Densidad Optica por 3 minutos Obtener Diferenta promedio de Densidad Optica. CALCULOS 340nm : actividad U/L = cambio DO/ min x 334mn : actividad U/L = cambio DO/ min x 365mn : actividad U/L = cambio DO/ min x RESULTADO AST = _______________ U/L VALORES NORMALES 30°C hasta 30 U/L 37°C hasta 46 U/L CONCLUSION:

Un reactivo 2 reactivos 1.746 1.780 3.235

1.905 1.942 3.529

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ALT ALANINA AMINO TRANSAMINASA INTRODUCCION Este examen se usa para determinar si un paciente tiene lesión hepática. La ALT es una enzima que involucrada en el metabolismo del aminoácido alanita y se encuentra en varios tejidos, pero presenta concentraciones mayores en el hígado. Cualquier lesión en el hígado hace que se libere esta enzima a la sangre. MUESTRA

Reactivo 1

Reactivo 2

Suero sin hemólisis Plasma EDTA

L-alanina LDH Azida sodica

a-cetogluterato NADH azida sodica

PARAMETROS • 340nm longitud de onda • 30-37°C • Cubeta de 1 cm paso de luz • Blanco agua destilada PROCEDIMIENTO Procedimiento de un reactivo Reactivo de trabajo Muestra

1ml 100ul

Mezclar, incubar un minuto, medir cambio de densidad optica durante 3 min. Procedimiento de dos reactivos Reactivo 1 1ml Muestra 100uL Mezclar y esperar 1 minuto Reactivo 2 100uL Mezclar, incubar 1 minuto, y medir cambio de Densidad Optica por 3 minutos Obtener Diferenta promedio de Densidad Optica.

CALCULOS

un reactivo

2 reactivos

340nm : actividad U/L = cambio DO/ min x 334nm : actividad U/L = cambio DO/ min x 365nm : actividad U/L = cambio DO/ min x

1.746 1.780 3.235

1,905 1,942 3,529

RESULTADOS ALT = __________________UL VALORES NORMALES 30°C hasta 35 UL 37°C hasta 49 UL CONCLUSION

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PRACTICA NO_____ LIPASA FUNDAMENTO La lipasa en una enzima que se usan en el organismo para disgregar las grasas de los alimentos de manera que se puedan absorber. La enzima se encuentra en la leche materna y, según estudios bioquimicos, es idéntica a la enzima colesterol esterasa (o lipasa pancreática no especifica) por lo que se supone que le origen que el origen es pancreático y llega a las glándulas mamarias a través de la circulación sanguínea. La lipasa gástrica, producida por las glándulas gástricas, reduce los triglicéridos, u tipo de lípidos presentes en la leche, a ácidos grasos y glicerol. REACTIVOS • •

Reactivo de trabajo Patron de lipasa

MUESTRA •

Suero

PROCEDIMIENTO 1. Precalentar reactivo de trabajo a 37°C durante unos minutos 2. Pipetear a una cubeta Reactivo de trabajo Muestra/Patron

750 ul 15 ul

3. Mezclar e insertar en los portacubetas del termostalizado a 37°C. poner el cronometro en marcha, a los 3-5 minutos añadir: Reactivo C 250uL Mezclar 4. leer y anotar absorbencias inicial y cada minuto durante 3 minutos 5. Comprobar que las difencias sean sensiblemente iguales, obtener incremento de absorbencia por minuto promedio (∆A/min) CALCULOS (∆A/min)MUESTRA (∆A/min)PATRON

X Concentración del patron = U/L

RESULTADOS Lipasa = _________________U/L VALORES NORMALES 7-59 U/L

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AMILASA INTRODUCCION La amilasa es una enzima que tiene la función de dirigir el glicógeno y el almidón para formar azucares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares ( glándulas partidas) y en el páncreas. Cuando una de estas glándulas se inflama derrama amilasa a la sangre y aparece elevado su nivel en el análisis de la amilasa serica. MUESTRA • • •

Suero Plasma heparinizado Orina diluida una parte en dos de agua

PROCEDIMIENTO Longitud de onda 405 nm Temperatura 30 a 37° C Cubeta 1 cm Blanco Agua destilada 30°C 1mL 25uL

REACTIVO MUESTRA

37°C 1mL 15uL

Mezclar y medir densidad optica por minuto durante 3 minutos Obtener (∆A/min) CALCULOS Actividad

Cambio Densidad Optica / min X 2715 a 30°C Cambio Densidad Optica / min X 4640 a 37°C

RESULTADOS Amilasa = _______________ U/L VALORES DE REFENCIA En suero: •