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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA TROPICAL

PROYECTO DE TESIS

PROPAGACIÓN Fernandez.

IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &

CÓDIGO CTI

:

01010101 Conservación y caracterización de germoplasma para el desarrollo de variedades mejoradas en calidad y producción.

CÓDIGO UNESCO

:

3103.05 Técnicas de cultivo

EJECUTOR

:

Gutierrez Huisa, Isaac Elias

DOCENTE

:

MSc. Carlos Marcelo Oyague

FECHA DE INICIO

:

15 de Abril del 2017

FECHA DE CULMINACIÓN

:

15 de Marzo de 2018

SATIPO – 2017

I.

TÍTULO PROPAGACIÓN IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

II. TEMA Propagación in vitro III. PLANTEAMIENTO Y FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 3.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Los bosques tropicales de nuestro país, sufren constantemente un proceso de degradación, debido al incremento de áreas para la agricultura, la tala y quema indiscriminada de los bosques, el cual hace que se pierda material genético, que aún no presentan una identificación completa y otras aun no descubiertas (Cavero et al., 1991 citado en León 1995). La población de orquídeas está disminuyendo drásticamente, debido a la falta de conciencia de los colonos quienes por no saber trabajar organizadamente talan los bosques, queman, siembran y luego cuando el terreno ya no es fértil siguen depredando los bosques para instalar nuevamente sus cultivos. También los comerciantes de orquídeas los extraen de su habitad natural, para luego comercializarlos ilegalmente y no podemos evitarlo (Gálvez, 2005). En nuestro país existen laboratorios de propagación in Vitro, en Satipo se encuentra Ubicado el laboratorio de la Facultad de ciencias Agrarias (E.P Agronomía tropical) de la UNCP,

que pueden contribuir a recuperar

especies de Phragmipedium y otras especies de orquídeas que están en riesgo de extinción. De esta forma estaríamos comercializando sin poner en peligro de extinción. 3.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuál es la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez?

IV. OBJETIVOS 4.1. GENERAL Determinar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez. 4.2. ESPECÍFICO  Precisar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la germinación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.  Evaluar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la formación de protocormos y rizoides in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.  Tasar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en las características morfológicas in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

V. MARCO TEÓRICO 5.1. ANTECEDENTES Manrique (2006) menciona en su trabajo de investigación titulado “Efecto del medio básico, carbón activado, ácido giberélico y calidad de luz en la germinación in vitro de Masdevallia auropurpurea Reich” con el objetivo de evaluar el efecto de la interácción entre los cuatro factores. Logrando un resultado para su conclusión que el mejor porcentaje y tiempo de germinación se logra en el medio básico Hidro-Coljap®, enriquecido con 2.68 ph4 de ácido giberélico, bajo luz roja con un fotoperiodo de 16 horas. Salazar (2012) en su trabajo de investigacion titulado “Germinación asimbiótica de semillas y desarrollo in vitro de plántulas de Cattleya mendelii Dombrain (Orchidaceae)” con el objetivo de evaluar el efecto de cinco medios de cultivo en el desarrollo de Cattleya mendelii Dombrain (Orchidaceae) con el método de cultivo in vitro de orquídeas a partir de semillas llegó a la conclusión al final de su investigación que la viabilidad de las semillas fue del 93% y el mejor porcentaje de germinación se halló en el medio de cultivo

Murashige-Skoog más agua de coco (MS + AC) con diferencias significativas (P < 0.05, Tukey).

Suárez, Hernández, Chávez, Sandoval y Martínez (2007) mencionan en su trabajo de investigacion titulado “Propagación In Vitro y Aclimatización de Euchile Mariae (Ames) Withner (Orchidaceae)” que la función del ANA no jugó un papel preponderante en la formación de PLB´s, mientras que la adición de BA al medio de cultivo favorece la formación de éstos tanto en las secciones apicales como basales de los protocormos. El objetivo fue investigar el efecto de los reguladores de crecimiento ANA y BA para inducir una respuesta morfogenética a partir de estos explantes. Díaz y Garciglia (2006) mencionan en el trabajo de investigación titulado “Propagación y mantenimiento in vitro de orquídeas mexicanas, para colaborar en su conservación” que obtuvieron a los 4 meses plántulas de hasta 5 cm de altura con formación de pseudobulbo y raíces con velamen, la adición de la auxina ANA en combinación con GA3 promueve el mejor desarrollo de plántulas. El objetivo de la investigación fue lograr establecer los métodos óptimos de propagación y mantenimiento in vitro de 9 especies de orquídeas Mexicanas. León (1995) en su tesis “Conservacion de Especies Peruanas de Orquideas Utilizando Técnicas de Cultivo de Tejidos In Vitro”

Con el objetivo de

estandarizar técnicas de propagación in vitro para 3 especies de orquídeas peruanas: Cattleya rex O’brien, Cattleya máxima Lindley, y Psychopsis versteegianum (pulle) Lueckel & Braem, concluye que: La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano homogenizado (100 g/l) y endospermo líquido de coco (100 ml/l), en la composición de los medios, promueven una rápida diferenciación del protocormo así como el desarrollo vegetativo y radicular de plantas. 5.2. MARCO CONCEPTUAL 5.2.1. Especies del genero Phragmipedium existentes en el perú Hatton

(2003)

menciona

que

actualmente

existen

especies

descubiertas de Phragmipedium en el Perú, de los cuales el más importante es el Phragmipedium kovachii; el siguiente listado menciona alguna de las especies de Phragmipedium en el Perú:

1.

1 831

Phragmipedium vitatum

2.

1 840

Phragmipedium caudatum

3.

1 850

Phragmipedium carícinum

4.

1 852

Phragmipedium longifolium

5.

1 854

Phragmipedium boissierianum

6.

1 856

Phragmipedium pearcei

7.

1 873

Phragmipedium wallisii

8.

1 981

Phragmipedium besseae

9.

1 994

Phragmipedium richteri

10.

2 002

Phragmipedium kovachii

5.2.2. Taxonomía de la especie Phragmipedium kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez división

: spermatophyta

Orden

: Orchidales

Familia

: orchidacea

Sub familia

: Cypripedium

Tribu

: Cypripedieae

Género

: Phragmipedium

Especie:

: phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez

5.2.3. Condiciones edafológicas Atwoot (2002 citado en Gálvez, 2005) menciona que debido a que el Phragmipedium en su naturaleza crece en un pH a partir de 5.5 a más bajo se adapta al agua limpia así como de lluvia y destilada. Requieren una temperatura promedio de 20 a 25° C, es decir temperaturas intermedias, la luz no les afecta tanto en su desarrollo ya que pueden adaptarse bien.

5.2.4. Características generales del género Phragmipedium El género Phragmipedium presenta las siguientes características morfológicas:  Descripción general Según Zuiderwir (2003 citado en Gálvez, 2005) “proviene del nombre Phragma = separación o demarcación y el pedium (pedilón) = zapatilla o sandalia que apuntan a la forma del labio. Las plantas de este género son terrestres, otras son epífitas. Las hojas están plegadas a lo largo de su longitud, normalmente es verde ligero y pueden ser de tamaño variado. Las flores son derechas y surgen del centro de las hojas. Ellos desnudan flores múltiples que abren consecutivamente, dependiendo de las especies.”

La flor como en la mayoría de las especies de Phragmipedium abren en sucesión, pero en algunas especies abren una sola vez. Un hecho notable sobre las flores es que cuando ella se cae de la inflorescencia parecen como si estarían frescos. Los granos de polen están unidos en la polinia, (Zuiderwir, 2003 citado en Gálvez, 2005) Oakes y Donovan (1952 citado en Gálvez, 2005) mencionan que las orquídeas del género Pliragmipedium tienen diferentes formas de vida siendo de hábito terrestre, epifita y litófita, se encuentran distribuidos en todos los trópicos de América , viviendo desde los 900 a 2000 msnm. 5.2.5. Propagación in vitro de orquídeas Arditti (1990 citado en Gálvez, 2005) Menciona que las técnicas de propagación in vitro de orquídeas deben seguir los siguientes procesos de acuerdo al tipo de semilla obtenida para su germinación in vitro:

 Por semillas provenientes de cápsula dehiscente Se utiliza semillas de cápsulas dehiscentes, las semillas son esterilizadas con una solución de hipoclorito de sodio en concentraciones de 0,5 a 1,0% por 10 - 30 minutos, dependiendo del tipo de semilla, para favorecer su esterilización es conveniente usar un agente que rompa la tensión superficial de la solución esterilizante (Tween 20), es un agente que permite el mejor contacto del esterilizante con la semilla, se utiliza a razón de 2 gotas/100 ml o reemplazado por detergente casero, como Hipoclorito de calcio y sodio.  Por semillas provenientes de cápsula no dehiscente (cápsula verde) La cápsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes que no serán necesarias o que pueden ser una fuente de contaminación (restos de pétalos y de columna), se enjuaga con agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol etílico al 75%, luego se esteriliza sumergiéndola en una solución de Hipoclorito de calcio al 2 - 4% por 20 minutos.

La siembra se hace directamente sin necesidad de enjuague, para abrir la cápsula se hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la sutura de dehiscencia y dos cortes transversales se retiran el pedazo de cápsula seleccionado y se procede a la siembra.  propagación in vitro Se retiran el pedazo de cápsula seleccionado y se procede a la siembra in vitro. 5.3. Definición de términos 7.6.1. Cultivo In Vitro Cultivo in vitro (cultivo en vidrio) están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes. Por tanto el estudio y control del ambiente de los cultivos también incidirá positivamamente en la optimización de los procedimientos de micropropagación (Kozai, Oki y Fujiwara, 1992).

7.6.2. Micro propagación Es una técnica, desarrollada para la producción en masa de plantas, que ha sido utilizada con éxito desde los años 60. La principal ventaja de esta técnica estriba en la multiplicación rápida de material clonal libre de enfermedades, (Cañal, Rodriguez, Fernandez, Sanchez y Majada 2001).

7.6.3. Auxinas Son un grupo de hormonas vegetales naturales que regulan muchos aspectos del desarrollo y crecimiento de plantas. La forma predominante en las plantas es el ácido indol acético (IAA), muy activo en bioensayos y presente comúnmente en concentraciones nanomolares. Otras formas naturales de auxinas son el ácido 4-cloroindolacético (4-Cl-IAA), ácido fenilacético (PAA), ácido indol butírico (IBA) y el ácido indol propiónico (Jordán y Casaretto, 2006).

7.6.4. Giberalinas (GAs) Son hormonas de crecimiento diterpenoides tetracíclicos involucrados en varios procesos de desarrollo en vegetales. Su efecto en plantas se descubre en los años 30, cuando científicos japoneses aislaron una sustancia promotora del crecimiento a partir de cultivos de hongos que parasitaban plantas de arroz causando la enfermedad del “bakanoe” o “subida de las plantas”. El compuesto activo se aisló del hongo Gibberella fujikoroi por Eichi Kurosawa en 1926 por lo que se denominó “giberelina”. El efecto del hongo sobre las plantas afectadas consistía en un notable incremento en altura aunque con fuerte merma en la producción de grano (Jordán y Casaretto, 2006).

7.6.5. Biotecnología Thieman (2010) menciona que se define como el “uso de organismos vivos, o los productos de los mismos, para el beneficio humano (o el beneficio de su entorno) con el fin de desarrollar un producto o resolver un problema.”

7.6.6. Explante Azcon-Bieto y Talón (2008) mencionan que es un fragmento de planta que se prepara de forma aséptica para su cultivo in vitro en un medio nutritivo. 5.4. Marco legal  Ley N° 26834, Ley de Áreas Naturales Protegidas del 17.JUN.97, norma los aspectos relacionados con la gestión de las Áreas Naturales Protegidas y su conservación de conformidad con el Artículo 68° de la Constitución Política del Perú (PERUANO, 1997).  Ley N° 26839 (1997) Ley sobre la Conservación y Aprovechamiento Sostenible de la Diversidad Biológica, del 08.JUL.97, señala que el Estado es soberano en la adopción de medidas para la conservación y utilización sostenible de la diversidad biológica.  Ley N° 27308 (2001) Ley Forestal y de Fauna Silvestre del 15.JUL.2000, tiene por objeto normar, regular y supervisar el uso sostenible y la conservación de los recursos forestales y de fauna silvestre del país.

VI. FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS La dosis 1.5 mg x L-1 de AUXINA en medio basal es el apropiado para la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez. VII. METODOLOGÍA 9.1. Características del lugar El trabajo se realizara en el laboratorio de Agronomía Tropical de la Facultad de ciencias Agrarias - UNCP, ubicada en el distrito de Río Negro. a). UBICACIÓN POLITICA: Distrito

: Rio Negro

Provincia Departamento

: Satipo : Junín

b). UBICACIÓN GEOGRÁFICA Coordenadas UTM

: E 541581

Altitud

: N 8764267

Altitud

: 635 msnm

Temperatura

: 22 °C

Precipitación Anual

: 2 200 mm

Humedad Relativa

: 60%

Clima

: Sub tropical húmedo

Suelo

: Fuertemente ácido

9.2. Variables a) factores o variables que permanecen constantes. Los aspectos que se citan son considerados como generales para toda la investigación.  Medio de cultivo  pH  temperatura  Luz  Fotoperiodo  Tamaño de explante  Variedad  Cantidad del medio de cultivo b) Factores o variables a controlar: (factores que variarán) Factor “A” (reguladores de crecimiento)  a1: AIA (Ácido indol-3-acético)  a2: GA3 (Ácido giberélico) Factor “B” (dosis)  b1 : 0 mg x L-1 de medio de cultivo  b2 : 0,5 mg x L-1 de medio de cultivo  b3 : 0,7 mg x L-1 de medio de cultivo  b4 : 1 mg x L-1 de medio de cultivo  b5 : 1,5 mg x L-1 de medio de cultivo

c) Variables en las que se medirán las respuestas

Variable dependiente Porcentaje de Germinación Numero de protocormos Numero de rizoides en vitroplantas Numero de hojas de vitroplantas Días de aparición del primordio foliar Longitud de vitroplantas

Unidad de medida

Método

Instrumentos o Equipos

Por ciento

Contadas

Ninguno

Unidades

Contadas

Ninguno

Unidades

Contadas

Ninguno

Unidades

Contadas

ninguno Calendario y

día

Contadas

cuaderno de apuntes

mm

Medición

Escalímetro y regla

9.3. Población y Muestra 7.3.1. Población Será de 3 semillas en una Unidad Experimental por cada tratamiento, habiendo 10 tratamientos con 4 repeticiones, teniendo un total de 120 semillas en todo el experimento. 7.3.2. Muestra Será de 2 semillas en una Unidad Experimental por cada tratamiento, habiendo 10 tratamientos con 4 repeticiones, teniendo un total de 80 semillas en todo el experimento. Cada UNIDAD EXPERIMENTAL estará constituida por 3 semillas en un medio de cultivo de 10 ml en un frasco de 250 ml.

9.4. Plan de ejecución  limpieza y desinfección del laboratorio Se realizara la limpieza de todos los ambientes del laboratorio y luego se desinfectara con una mezcla de lejía 250 ml en cinco litros de agua.  Esterilización de los materiales La esterilización de los materiales se realizara en el autoclave. La esterilización es a 250°C durante 15 minutos, luego se apaga el autoclave y se espera que baje la presión a 0°C para destapar y sacar los materiales esterilizados. el medio de cultivo se esterilizará en el autoclave por un periodo de 20 min a una temperatura de 121 °C y una presión de 2 kg/cm2.  Medio asimbiótico y condiciones de cultivo El medio de cultivo basal será MS en concentraciones de macro y micronutrientes al 100% (Murashigue y Skoog, 1962). El Na2EDTA y el FeSO4•7H2O se disuelven por separados cada uno en 200ml de agua destilada. Se calienta la solución de Na2EDTA y poco a poco se agrega la solución de FeSO4•7H2O, calentando y agitando continuamente hasta obtener un color amarillo. Se deja enfriar y se ajusta a 1000ml con agua destilada. El calor y la mezcla en dilución dan lugar a un complejo FeEDTA más estable.

Es conveniente preparar Stocks por separado de cada una de las vitaminas en caso de modificaciones. Por ejemplo es muy común utilizar únicamente Tiamina 1mg/L.  Preparación de ácido indol acético (AIA) y ácido Giberélico (GA3) Solución concentrada delos 2 reguladores: 1000 ppm c/u. 

Pesar 0.2 g del regulador y disolver bien con algunas gotas de alcohol añadir 200 ml de agua destilada.



Guardar en un frasco debidamente rotulado y conservar a 0°C



Se recomienda esterilizar por filtración.



Un ml de la solución concentrada (1000 ppm) contiene 1 mg del regulador.

 Desinfección y siembra de semilla  Para la desinfección y siembra de las semillas se utilizara el método de la jeringuilla, el método consiste en colocar algunas de ellas en una jeringa estéril de 5 ml con un filtro de tela.  Las semillas se sumergiran en la solución de etanol al 70% durante 30 segundos, luego serán sometidas a la solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1.0% con 2 gotas deTween-20® (agente tensio-activo) durante cinco minutos en agitación constante.  Se realizaran cinco lavados con agua desionizada estéril.  Se retirara el filtro de la jeringa para llevar acabo la siembra en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar.  Se cultivaran 3 semillas en cada frasco de 250 ml del medio de cultivo. 9.5. Evaluación de variables Son del tipo cuantitativo y cualitativo, esto quiere decir que las respuestas obtenidas variarán en cada tratamiento.  Germinación de semillas: Se contará el número de semillas germinadas por cada UE a los 30días después de la siembra, para determinar las medias de semillas germinadas con cada regulador de crecimiento y su respectiva dosis, para su análisis respectivo y determinación con cuál de los reguladores es viable la germinación. 

Numero de protocormos: Se evaluara por el método de conteo a partir de los 30 primeros días de haber sembrado en el medio líquido de multiplicación y cada 15 días hasta el final del experimento.



Numero de rizoides en vitroplantas: Se contara el número de raíces de cada vitroplanta al final del experimento.



Numero de hojas: Se evaluara a partir de los 15 primeros días de haber multiplicado, se contara los números de hojas cada 15 días hasta al final de la fase.



Días de aparición de la primera hoja: Se evaluara a partir de la emergencia de la primera hoja en todo el experimento.



Longitud de vitroplantas: Haciendo uso de una regla de 20 cm y un escalímetro para dar mayor precisión se medirá la longitud de la vitroplanta en mm al final del experimento.

7.6. PRUEBA ESTADÍSTICA 7.6.1. Modelo de las observaciones DCA con arreglo factorial 2x5, el modelo aditivo lineal a utilizar será: Yij = U + Ai+Bj+(AB)ij+ Eij Donde: U = Media poblacional Ai = Efecto de los reguladores de crecimiento Bj = Dosis (AB)ij = interacción de los reguladores de crecimiento con las dosis Eij = Error experimental 7.6.2. Diseño experimental El tipo de diseño a utilizar para ésta investigación será el Diseño Completamente al Azar (DCA), con arreglo factorial de (2x5), siendo los factores a probar:  Factor A: Niveles (Reguladores de Crecimiento) a1 : AIA (auxina) a2 : GA3 (giberalinas)  Factor B: Niveles (dosis) b1 : 0 mg x L-1 de medio de cultivo b2 : 0,5 mg x L-1 de medio de cultivo b3 : 0,7 mg x L-1 de medio de cultivo b4 : 1 mg x L-1 de medio de cultivo b5 : 1,5 mg x L-1 de medio de cultivo

Cuadro 01: combinación de los niveles A y B Dosis (mg)

Reguladores de crecimiento

0

0.5

0.7

1

1.5

AIA

0

0,5

0,7

1

1,5

GA3

0

0,5

0,7

1

1,5

Cuadro 02: tratamientos y dosificaciones de reguladores de crecimiento.

TRATAMIENTOS

Reguladores de

Dosis

crecimiento

(mg x L-1 de Medio de cultivo)

T1

Ácido indol-3-acético (AIA)

0,0

T2

Ácido indol-3-acético (AIA)

0,5

T3

Ácido indol-3-acético (AIA)

0,7

T4

Ácido indol-3-acético (AIA)

1,0

T5

Ácido indol-3-acético (AIA)

1,5

T6

Ácido giberélico (GA3)

0,0

T7

Ácido giberélico (GA3)

0,5

T8

Ácido giberélico (GA3)

0,7

T9

Ácido giberélico (GA3)

1,0

T10

Ácido giberélico (GA3)

1,5

7.6.3. Prueba estadística Para el análisis estadístico se empleara la prueba de análisis de varianza a un nivel de significación α = 0,05. Para la comparación de medias entre tratamientos se utilizara la prueba de significación de Tukey a un nivel de significación α = 0,05. Para el procesamiento y análisis de datos se empleara el paquete estadístico SPSS.

7.7. Croquis

Características del experimento para las fases de multiplicación y enraizamiento: N° de tratamientos : 250 ml N° de repeticiones : 1 cm N° de unidades experimentales (UE) : 1cm N° de explantes por (UE) : 0.25 m2 N° de explantes por experimento

: 10

Volumen de los frascos

:4

Ancho de calles

: 40

Distancia entre frascos

:3

Área que se ocupara

: 120

VIII. CRONOGRAMA Actividad Semana Elaboración del proyecto Aprobación del proyecto Reconocimiento de equipos, materiales e insumos Limpieza y desinfección del laboratorio

Esterilización de materiales Obtención del material biológico PRIMER INFORME Preparación del medio de cultivo Explante y desinfección

Meses 2017 AB

MA

JU

JUL

AG

SE

OC

NO

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 x

x

x

x

x

x

x

x

x

x x x

x

x

x

x

x x

x

x

x

x

x

x

DI

EN

FE

MA

Introducción de los explantes Toma de datos SEGUNDO INFORME Enraizamiento Procesamiento y análisis de datos Tabulación y representación de resultados Redacción y presentación de tesis

x

x

x x x

x

x

x x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

IX. ELABORACIÓN DE DATOS 9.1. Refinamiento de Datos. VARIABLE DEPENDIENTE Porcentaje de Germinación Numero de protocormos Numero de rizoides en vitroplantas

UNIDAD DE MEDIDA

MÉTODO

Porciento %

Contadas

Unidad

Contadas

Unidad

Contadas

Numero de hojas

Unidad

Contadas

Días de aparición del primordio foliar

Unidad

Contadas

mm

Medición

Longitud de vitroplantas

REFINADO

REFINAMIENTO

Análisis critico Análisis critico Análisis critico Análisis critico Análisis critico

arcsen √ √ √ √ √

Análisis crítico

Ninguna

9.2. Sistematización de datos Cuadro de ANVA para realizar los cálculos de los datos de investigación en un arreglo factorial de 2x5 FUENTE DE VARIABILIDAD Efecto A: Reguladores de Crecimiento Efecto B: Dosis Interacción (AB) Error Total

GL

SC

CM

1

SCA

CMA

4 4 30 39

SCB SC(AB) SCE SCtotal

CMB CM(AB) CME

F exp SCA/SCE SCB/SCE SCAB/SCE

9.3. Prueba TUKEY Prueba de comparación de medias tukey se aplica cuando f es significativa mediante la siguiente formula. A.L.S. ( T ) = qα(p1, n2 ) √ Dónde: 

A.L.S. ( T ) = W: amplitud del límite de significación de tukey



qα : valor tabular que se encuentra en la tabla de tukey con el número de tratamientos y los grados de libertad del error experimental



n2: grados de libertad del error del experimental.



CME: cuadrado medio del error.



n: número de repeticiones.



Tabla 04. Comparación de medias según tukey.

Orden de medio

tratamientos

01 02 03 04 . . . 10

Tn . . .

valor

significación a a a . . .

X. FINANCIAMIENTO Recurso propio del ejecutor del proyecto. XI. PRESUPUESTO RUBRO

UNIDAD

CANTIDAD

COSTO UNITARIO S/.

COSTO TOTAL S/.

INSUMOS PARA LA EJECUCIÓN DEL PROYECTO Compra de medio MS de PROBIOTEK S.A. Sales Principales (Macronutrientes) Nitrato de amonio (NH4NO3)

g

83

1.37

113.00

Cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)

g

88

0.41

36.50

Sulfato de magnesio (MgSO4 7H2O)

g

74

0.55

40.83

Fosfato de potasio (KH2PO4 )

g

34

0.56

19.15

Nitrato de potasio (KNO3)

g

95

0.75

71.57

Ácido bórico (H3BO3)

g

1.24

0.51

0.64

Cloruro de cobalto (CoCl2 6H2O)

g

0.05

7.26

0. 36

Sulfato cúprico (CuSO4 5H2O)

g

0.05

0.41

0. 21

Sulfato ferroso (FeSO4 7H2O)

g

5.57

0.68

3.79

Sulfato de manganeso (MnSO4 4H2O)

g

3.45

1.41

4.86

Yoduro de potasio (KI)

g

0.166

2.05

0.34

Molibdato de sodio (Na2MoO4 2H2O)

g

0.05

2.49

0.12

Sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O)

g

1.72

0.42

0.72

Na2 EDTA.H2O

g

7.46

2.13

15.89

Mioinositol

g

1

10.88

10.88

Ácido Nicotínico

g

0.1

3.76

0.38

Piridoxina – HCl

g

0.4

45.28

18.11

Tiamina – HCl

g

0.02

11.00

0.22

Glicina

g

0.4

3.96

1.58

Edamina (opcional)

g

1

3.96

3.96

Sacarosa

g

10

0.30

3.00

Tetrazolio

g

50

0.30

15.00

Sales Menores (Micronutrientes)

Vitaminas

Ácido clorhídrico

l

1

20.00

20.00

Agua estéril

l

5

2.00

10.00

Agua destilada

l

5

1.00

5.00

Alcohol industrial

l

0.75

17.50

13.13

Hidróxido de sodio

kg

1

22.00

22.00

Lejía NaOCl (clorox)

l

1

3.00

3.00

Jabón líquido

l

1

13.00

13.00

Semillas

g

200

0.50

100.00

GA3

g

5

18

90

AIA

g

5

18

90 726.70 COSTO TOTAL S/. 1.50

Sub total

Cepillo de dientes

Unidad

1

COSTO UNITARIO S/. 1.50

Papel graf

Unidad

5

0.30

1.50

Papel toalla

Unidad

2

2.00

4.00

Papel aluminio

Unidad

3

3.00

9.00

Plástico para embalaje

Rollo

1

10.00

10.00

Bisturí

Unidad

3

1.50

4.50

Bandejas de germinación

Unidad

15

2.00

30.00

Plástico

m

1

1.00

1.00

MATERIALES

UNIDAD

CANTIDAD

Sub total

61.50

MATERIALES PARA EVALUACIÓN Regla 20 cm

Unidad

3

1.00

3.00

Escalímetro graduado

unidad

1

7.00

7.00

Papel toalla

Unidad

1

2.00

2.00

Sub total

12.00

MATERIALES DE ESCRITORIO Papel bond A4

Millar

1

30.00

30.00

CD

Unidad

5

1.00

5.00

Folder

Unidad

10

0.50

5.00

USB 8G

Unidad

1

34.00

34.00

Cuaderno de campo A4

Unidad

1

3.50

3.50

Lapiceros

Unidad

3

0.50

1.50

Lapiz

Unidad

1

1.00

1.00

Sub total

80.00

MANO DE OBRA Limpieza y desinfección

Jornal

0.5

30.00

15.00

Esterelización

Jornal

0.5

30.00

15.00

Preparación de medio de cultivo

Jornal

1

30.00

30.00

Desinfección de explante

Jornal

0.25

30.00

7.50

Actividades en introducción

Jornal

0.5

30.00

15.00

Actividades en multiplicación

Jornal

0.5

30.00

15.00

Actividades en enrraizamiento

Jornal

0.5

30.00

15.00

Evaluación de % de Germinación

Jornal

0.5

30.00

15.00

Evaluación de n° de protocormos

Jornal

1

30.00

30.00

Evaluación de n° de rizoides en vitroplantas

Jornal

1

30.00

30.00

Evaluación de n° de hojas de vitroplantas

Jornal

1

30.00

30.00

Ev. de los dias de aparicion de la primera hoja

Jornal

1

30.00

30.00

Evaluación de las longitudes de vitroplantas

Jornal

1

30.00

30.00

Longitud de la vitroplanta (LVT)

Jornal

1

30.00

30.00

Sub total

257.50

GASTOS EN TRANSPORTE

VEHICUL O

Adquicición de semillas

Bus

transporte al lugar del experimento

Moto lin

Transporte de insumos

Motokar

Moyobamb a Maz - R. Neg. Satipo

Compra de materiales de laboratorio

Motokar

Satipo

LUGARES

COSTO IDA Y VUELTA

COSTO TOTAL

320.00

320.00

150.00

150.00

3.00

3.00

3.00

3.00

Sub total

476.00

SERVICIOS Impresiones

Unidad

540

0.30

162.00

fotocopias

Unidad

300

0.10

30.00

Espiralados

Unidad

3

2.50

7.50

Empastado

Unidad

3

20.00

60.00

Quemado de CD

Unidad

3

2.00

6.00

Servicios de internet

Horas

50

1.00

50.00

Sub total

116.00

TRÁMITES ADMINISTRATIVOS Gastos en tramites hasta la sustentación

646.00

sub total

646.00

IMPREVISTOS 10%

249.67

TOTAL

2,689.37

XII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 

Azcon-Bieto, J. T., & Talón, M. M. (2008): Fundamentos de Fisiología Vegetal. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Madrid, España.

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Galvez Panduro, R. A. (2005). Desarrollo de protocolo para la propagación in vitro

de

Phragmipedium

kovachii

Atwood,

Dalström

&

Fernández

(Orchidaceae) a partir de semillas. (Tesis de grado). UNSM. Tarapoto-Perú. Recuperado de: https://f721dad5-a-site/inibico/publicaciones/tesis/tesis-VITRODELPhra 

Jordán, M., & Casaretto, J. (2006). Hormonas y reguladores del crecimiento: auxinas, giberelinas y citocininas. Squeo, F, A., & Cardemil, L.(eds.). Fisiología Vegetal, 1-28. Recuperado de: http://www.biouls.cl/librofv/web/pdf_word/Capitulo%2015.pdf

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Kozai, T., Oki, H. y Fujiwara, K. (1992). Photosynthetic characteristics of Cymbidium plantlet in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 22:205-211.

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Ley, N. 26839. (1997). Ley sobre la Conservación y Aprovechamiento Sostenible de la Diversidad Biológica de Perú, publicada en la Gaceta, (134).

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Ley, N. 27308. (2001). Ley forestal y de fauna silvestre.

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León, M. (1995). Conservación de Especies Peruanas de Orquídeas Utilizando Técnicas de Cultivo de Tejidos In Vitro. (Tesis de grado). UNALM. Lima-Perú. Pp 14 - 15. Recuperado de: https://f721dad5-a-62cb3a1a-s-tILaTpkqFEfZNBpxqzo_5-f&attredirects=0

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Loreto Reza, M.E. (2016) Optimización de medio de cultivo para crecimiento de orquídeas a partir de semillas. (Tesis de grado). IPN Mexico. Pp. 24

14. Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., & Mroginski, L. (2010). Biotecnologia y Mejoramiento vegetal II. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Argentina. Recuperado de: http://argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Indice_e_introduccion.pdf

15. Manrique, J. P. (2006). Efecto del medio básico, carbón activado, ácido giberélico y calidad de luz en la germinación in vitro de Masdevallia auropurpurea Reich. Revista Científica, (9), 117-141. Recuperado de: http://revistas.udistrital.edu.co/ojs/index.php/revcie/article/download/354/534

16. PERUANO, E. (1997). Ley de Areas Naturales Protegidas Ley Nº 26834. Normas Legales, 15(6215), 150721.

16. Salazar Mercado, S. A. (2012). Germinación asimbiótica de semillas y desarrollo

in

vitro

de

plántulas

de

Cattleya

mendelii

Dombrain

(Orchidaceae). Acta Agronómica, 61(1), 69-78. Recuperado de: http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/3246 3

17. Sedano, G. (2015). Propagación in vitro de orquídeas y otras ornamentales. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas. Pp. 5. Recuperado de http://www.redalyc.org/pdf/2631/263139243061.pdf

18. Suárez-Quijada, I., Hernández-Altamirano, M., Chávez-Ávila, V., SandovalZapotilla, E., & Martínez-Palacios, A. (2007). Propagación in vitro y aclimatización de Euchile mariae (Ames) Withner (Orchidaceae). Lankesteriana, 7(1-2). http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/lankesteriana/article/view/19609/19693 19. Thieman, W. J., & Palladino, M. A. (2010). Introducción a la biotecnología. Pearson Educación.

XIII.

MATRIZ DE CONSISTENCIA PROPAGACIÓN IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuál es la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez?

HIPÓTESIS -1

La dosis 1.5 mg x L de AUXINA en medio basal es el apropiado para la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

SOPORTE Ávila y Salgado (2006) manifiestan que el desarrollo de plántulas in vitro para su conservación, fuentes de explantes para la micropropagación y plántulas que estén aptas para ser cultivadas ex vitro; se ha implementado el medio de cultivo MS con reguladores de crecimiento.

SOPORTE Loreto (2016) menciona en la conclusión de su proyecto de investigación titulado “Optimización de medio de cultivo para crecimiento de orquídeas a partir de semillas” que en semillas de Barkeria Obovata, se logró la generación de estructuras tipo protocormos y desarrollo de plántulas, utilizando el medio nutritivo MS con reguladores de crecimiento (ANA/BA/GA3) a los 3 meses.

OBJETIVOS

VARIABLES

METODOLOGÍA

GENERAL Determinar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la propagación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

INDEPENDIENTE (Estudio)

ESPECÍFICO  Precisar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la germinación in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

DEPENDIENTE

 Evaluar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la formación de protocormos y rizoides in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

DEPENDIENTE

 Tasar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la aparición de la primera hoja in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

DEPENDIENTE

TIPO DE INVESTIGACIÓN Investigación básica (se llevará a cabo en laboratorio) NIVEL DE INVESTIGACIÓN Explicativo DISEÑO DE INVESTIGACIÓN Experimental POBLACIÓN Y MUESTRA POBLACIÓN Estará constituida por 10 tratamientos y 4 repeticiones haciendo un total de 40 frascos de 25 ml cada uno con 10 ml de medio de cultivo y 3 semillas. Teniendo un total de 120 semillas en todo el experimento. MUESTRA La muestra estará constituida por dos semillas elegidas al azar en una unidad experimental siendo un total de 80 semillas en todo el experimento. MODELO DE LAS OBSERVACIONES DCA con arreglo factorial 2x5, el modelo aditivo lineal a utilizar será: Yij = u + Ai+Bj+(AB)ij+ Eij Donde: u = Media poblacional Ai = Efecto de los reguladores de crecimiento Bj = Dosis (AB)ij = interacción de los reguladores de crecimiento con las dosis Eij = Error experimental

Reguladores Crecimiento

de

AIA (auxina) GA3 (giberalinas)

 Porcentaje de

Germinación

 Numero de protocormos  Numero de rizoides en

vitroplantas

 Numero de hojas

 Días de aparición del primordio foliar  Longitud de vitroplantas

PRUEBA ESTADÍSTICA El tipo de diseño a utilizar para ésta investigación sera el Diseño Completamente al Azar (DCA), con arreglo factorial de (2x5). Para el análisis estadístico se empleara la prueba de ANVA (Analisis de varianza) y la prueba estadística de TUKEY a un nivel de sugnificación de α = 0,05. PROCEDIMIENTO Se evaluara en forma periódica y con criterio para cada variable.