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• María Camila Ojeda

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PREINFORME EXTRACCIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCÍNICO DESHIDROGENASA CITOCROMO OXIDASA Y EL EFECTO DE ALGUNOS INHIBIDORES MARIA CAMILA OJEDA ROJAS Marco Teórico:  Qué tipo de inhibición efectúa el Malonato en la acción de la succínico deshidrogenasa? Efectúa una inhibicion competitiva, la Succinato deshidrogenasa usando malonato que es un inhibidor de la respiración celular, se une al sitio activo del succinato deshidrogenasa el cual va a acumular succinato, alfa-cetoglutarato y citrato. Según Hans Adolph Krebs se encuentra que la inhibición especifica de la enzima Succinato deshidrogenasa con Malonato, anula el efecto catalítico de todos los ácidos, con acumulación de Succinato en forma proporcional a la cantidad añadida de acido. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy)  Succinato deshidrogenasa: Esta Óxido- reductasa cataliza la oxidación del Succinato mediante la eliminación estereoespecifica de dos átomos de hidrogeno, en forma de hidruro H- y protón H+ , para formar el enlace trans del fumarato. La enzima es un complejo formado por cuatro subunidades, con FAD Y un Hemo tipo b como grupos prostéticos, además de 3 núcleos con Hierro y azufre. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy)

La oxidación de Succinato reduce el FAD a FADH2 .

El FADH2 se oxida transfiriendo los electrones, atraves de los complejos de hierro y azufre, hasta la Coenzima Q componente de la cadena respiratoria.

La Succinato deshidrogenasa es inhibida por el Malonato, con estructura semejante al succinato, pero que únicamente tiene un metenilo (-CH2-) y no se puede oxidar por deshidrogenacion. Tambien la inhibe el Oxalacetato, que tampoco se puede deshidrogenar. La Succinato Deshidrogenasa está incluida en la membrana interna de la mitocondria, formando parte del complejo II de la cadena respiratoria. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy)

 Mecanismo de acción del cianuro sobre la citocromo oxidasa:  Forma complejos estables con iones metálicos, teniendo una gran afinidad por el hierro férrico.  El complejo que forma con el metal inactiva ciertas enzimas, siendo la mas importante la citocromo-oxidasa.  La inhibición de la citocromo-oxidasa produce anoxia citotóxica y paso de la glucolisis aerobia a anaerobia.  Se inhibe la transformación del piruvato en el ciclo de Krebbs, resultando en hiperproducción de lactato y acidosis metabólica severa. (AVV, 2008)  El empleo de espectrofotometría diferencial o la medida del consumo de oxígeno mediante un electrodo de oxígeno combinados con el empleo de compuestos exógenos que actuaban como inhibidores respiratorios o como donadores o aceptores artificiales de electrones ha sido de gran utilidad en el establecimiento de la secuencia de actuación en la cadena respiratoria. Algunos de estos inhibidores son:      

Rotenona: producto vegetal de Sudamérica que se utiliza como insecticida que bloquea el flujo de electrones desde el NADH a la coenzima Q en el CI.. Amital: fármaco barbitúrico que bloquea el flujo de electrones desde el NADH a la coenzima Q en el CI. Piericidina A: antibiótico. Bloquea el flujo desde el NADH al CoQ en el Complejo 1, al inhibir el flujo de electrones desde los centros sulfoférricos al CoQ. Antimicina A: antibiótico de Streptomyces que bloquea el flujo electrónico desde el cit bH a CoQ en el CIII. Se une a Qn, cerca del hemo bH por el lado de la matriz. Mioxitiazol: previene el flujo de electrones desde CoQH2 a la proteína Rieske en el CIII. Se une al sitio Qp, cerca del centro Rieske y del hemo bL al lado intermembranar de la membrana. Cianuro, Azida, Monoxido de carbono: Actúan sobre la citocromo oxidasa, CIV. Cianuro y azida reaccionan con la forma oxidada del citocromo objeto y CO con la forma reducida.

 Donadores y aceptores de electrones artificiales son compuesto que pueden ceder o captar electrones de la cadena respiratoria en reacciones espontáneas no enzimáticas: 

dinitrofenol (dnp) y carbonilcianida-p-trifluorometoxifenilhidrazona (fccp): desacoplante químico que no afecta a la estructura mitocondrial. Son ácidos débiles con propiedades hidrofóbicas, lo que les permite difundir a través de las membranas mitocondriales. Después de entrar en la matriz mitocondrial en forma protonada, pueden liberar el protón, disipando de esta forma el gradiente de protones formado por la cadena respiratoria.



Ionóforos: Compuestos como la valomicina permiten a los iones inorgánicos atravesar la membrana. Estos ionoforos desacoplan la cadena de transferencia de electrones de la fosforilación oxidativa disipando la contribución eléctrica al gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial.

El empleo de estos compuestos fue utilizado como método para determinar la secuencia de transportadores de electrones en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial.

Fichas técnicas:

Nombre

Formula

Aspecto

Peligrosida d

Primeros auxilios y medidas de higiene

Información adicional

Buffer de Fosfatos

--

Forma: Líquida Color: Amarillo Olor: Inodoro

No tóxico, anticorrosi vo. No presenta ninguna peligrosida d para la salud significativ a. (N)

Inhalación: coloque en un lugar con ventilación, respiración artificial en caso de ser necesario. Piel: Lavar con abundante agua. Ojos: Enjuagar con abundante agua manteniendo los parpados bien abiertos. Consultar medico. Ingestión: Hacer que el afectado beba mucha agua.

Para usos de laboratorio, análisis, investigación y química fina.

Inhalación: Aire limpio y someter atención medica. Piel: Quitar la ropa contaminada y lavar con abundante agua. Ingestión: Enjuagar la boca y someter a atención medica.

Se utiliza para fabricar tintes para el pelo y otras tinturas, poliuretano, revelado de fotografías…

Inhalación: Trasladar a la persona al aire libre. Piel: Lavar abundantemente con agua. Quitarse las ropas contaminadas. Ojos: Lavar con agua abundante manteniendo los párpados abiertos. Ingestión: Beber agua abundante. Provocar el vómito. En caso de malestar, pedir atención médica. Inhalación: Trasladar al aire fresco, si no respira dar respiración artificial, si respira con dificultad suministrar oxigeno. Ingestión: Lavar la boca con agua, no dar nada de beber ni inducir el vomito. Piel: Retirar ropa contaminada lavar la zona afectada con abundante agua. Ojos: Lavar con abundante agua Mínimo durante 15 min.

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito.

C6H8N2/C6H4(NH2)2 p– fenilendiamina

Cristales blancos a ligeramente rojos.

(C)

Succinato de sodio

(CH2COONa)2.6H2O

Solido Blanco inodoro.

--

Cianuro de potasio

KCN

Terrones amorfos o masa cristalina de color blanco. Sin olor cuando esta seco.

(Xn)

(N)

Estable si esta seco. En presencia de aire o humedad se descompone para formar cianuro de hidrogeno.

Azida de sodio

NaN3

Solido, blanco, inodoro.

(C)

(N)

(Xn)

Malonato de sodio

C3H2Na2O4

Polvo, cristalino blanco, inodoro.

Sustancia no peligrosa.

Oxalato de sodio

C2Na2O4

Solido, blanco, inodoro

(Xn)

(C)

(Hojas de datos de Seguridad, 2005)

Inhalación: aire fresco. Tras parada respiratoria: Inmediatamente proceder a respiración instrumental. En su caso, aplicar oxígeno. Piel: aclarar con abundante agua. Eliminar inmediatamente la ropa contaminada. Ojos: Aclarar con abundante agua, manteniendo abiertos los párpados. Ingestión: estando consciente, beber abundante agua, provocar vómito, administrar carbón activo (20 - 40 g de suspensión al 10%). Llamar inmediatamente al médico. Inhalación: Ir al aire fresco. En caso de asfixia proceder a la respiración artificial. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica. Piel: Lavar abundantemente con agua y jabón. Quitarse las ropas contaminadas. Ojos: Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir atención médica. Ingestión: Enjuagarse inmediatamente la boca. Por ingestión de grandes cantidades: En caso de malestar, pedir atención médica. Inhalación: aire fresco. Piel: aclarar con abundante agua. Eliminar ropa contaminada. Llamar al médico. Ojos: Aclarar con abundante agua, manteniendo abiertos los párpados. Ingestión: hacer beber inmediatamente agua abundante. Llamar al médico.

Mantener seco el lugar de trabajo. La sustancia no debe entrar en contacto con agua.

Asegurar una buena ventilación y renovación de aire del local.

Evitar la penetración del agua de extinción en acuíferos superficiales o subterráneos.

Procedimiento:

Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas Pesar una muestra de 6g de tejido

Colocarla en un mortero

Enfriar en baño con hielo Cuidadosamente hasta formar una pasta suave

Macerar

con arena lavada

Poco a poco, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL.

Adicionando buffer de fosfatos

Centrifugar por 5 minutos Identificado como extracto enzimático

Transferir el sobrenadante a un erlenmeyer pequeño

Mantenerlo en baño de hielo todo el tiempo



a 1500 rpm

Hasta el momento de usarlo.

Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa.

Hipótesis:

4 Tubos de ensayo Preparar una serie de tubos según la tabla Debidamente marcados e identificados.

Reactivos (mL)

Blanco

1

2

3

4

Buffer fosfatos

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Malonato de sodio

0,0

0,0

0,0

1,0

0,0

Cianuro de potasio

0,0

0,0

1,0

0,0

0,0

Azida de sodio

0,0

0,0

0,0

0,0

1,0

Agua destilada

2,0

1,0

0,0

0,0

0,0

Extracto enzimático

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

0,0

1,0

1,0

1,0

1,0

p-fenililendiamina

Mezclar bien el contenido o

Incubar a 37 C

Hasta cuando aparezca el complejo coloreado

Observe y escriba los resultados obtenidos en cada tubo.



Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa y la actividad de algunos inhibidores.

Hipótesis:

6 Tubos de ensayo

Pipetee los reactivos en el siguiente orden

Reactivos (mL) Solución tampón Succinato de sodio Azul de metileno Malonato de sodio Oxalato de sodio Oxalacético

Blanco

1

2

3

4

5

1.5

1,5

1,0

0,5

0,5

1,0

-

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,20

-

-

-

-

1,0

-

-

1,0

-

-

-

-

-

-

1,0

-

-

-

Dejar tubos a baño de maría Y agregue sin retirarlos

Extracto enzimático (mL)

Tomando como el momento cero aquel en el que se adiciona la enzima

1,0

0,5

1,0

1,5

1,0

Agite cada tubo invirtiéndolo

Adicione 0,5 mL de aceite mineral

Registre el tiempo necesario para que se presente la decoloración

termostatado a o 37 C durante 10 minutos

1,0

déjelos en reposo

Bibliografía:

AVV, A. (16 de Febrero de 2008). Intoxicacion por Cianuro. Recuperado el 10 de noviembre de 2013, de http://es.slideshare.net/ALVARO_AAV/intoxicacin-por-cianuro Hojas de datos de Seguridad. (21 de Marzo de 2005). Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de http://www.cisproquim.org.co/HOJAS_SEGURIDAD/Cianuro_de_potasio.pdf Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy. (s.f.). Ciclo del Ácido Cítrico. Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad62.pdf