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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular” Profesora: Gabriela Edith Olguín Ruiz 3IM1 Sección III Córdova Félix Juan Manuel, Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Pérez Sndoval Práctica 5.5 y 5.6: Efecto de la Concentración del Sustrato sobre la Velocidad de Reacción e Inhibición Enzimática. Introducción: El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. En las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de producto depende linealmente de la concentración de sustrato añadido. A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad de la reacción aumenta en forma proporcional a la concentración de sustrato, obteniéndose una relación de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones más altas de sustrato, la relación proporcional no se cumple ya que al aumentar la concentración de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente. Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas.

1.- Efecto de Concentración del Sustrato: Lecturas de Absorbancia obtenidas en el espectrofotómetro a 540 nm con diferentes concentraciones de sacarosa 0.2 M en presencia de enzima: Invertasa 10 ug/mL. Con las lecturas de absorbancia obtenidas en efecto de [sustrato] interpolando y usando la ecuación de la recta: Abs = 0.0645 [Az. Red.] + 0.0031, estos valores en la curva tipo de azucares reductores para tener la [Azúcares Reductores] en cada tubo.

Curva Tipo Azucares Reductores 0.8 0.6

Objetivos: Observar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y determinará la constante de Michaelis-Menten por los métodos conocidos, así como su aplicación.

Absorbancia

0.4 0.2 0 0

Determinar el tipo de inhibición producido por la anilina sobre la actividad de la invertasa.

2

4

6

8

10

12

[Azucar Reductor] (μmoles)/2.0 mL

Resultados:

Tubo No.

Reacción del 3,5 Dinitrosalicílico (DNS) con Azúcares Reductores

f(x) = 0.06x + 0 R² = 0.99

Sacarosa 0.2 M (ml) Absorbancia Azúcar Reductor (μmoles)/2. 0 mL Velocidad (unidades de invertasa) Concentraci ón de Sustrato

Bl an co T 0.5

Problemas

1 0.1

2 0.2

3 0.3

4 0.5

5 0.8

6 1.0

0

0.323

0.585

0.637

0.655

0.680

0.707

0

4.959 6

9.021 7

9.827 9

10.10 69

10.49 45

10.913 1

0

0.495 9

0.902 1

0.982 7

1.010 7

1.049 4

1.0913

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular” Profesora: Gabriela Edith Olguín Ruiz 3IM1 Sección III Córdova Félix Juan Manuel, Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Pérez Sndoval (moles/L) = M)

Gráfica de Dobles Reciprocos 4

De esta forma la ecuación de Michaelis- Menten:

V0

Vmax [ S] ¿ [ S ] + Km

f(x) = 0.03x + 0.8 R² = 1

3 , tomando los recíprocos de ambos miembros1 2

/ se transforma a la ecuación de Lineweaver-Burk, la cual es V 1

Km ∗1 1 Vmax 1 = + V0 S Vmax

f(x) = 0.01x + 0.36 R² = 0.91

0 0

20

40

60

80

100

120

1/[S] Que es la ecuación que representa la tendencia lineal de la Gráfica de Dobles Recíprocos, que al ser de la forma: y= mx + b nos permite calcular el valor de la “Km” (Constante de Michaelis) y la Vmax. Siendo:

De esta forma pudimos calcular la Vmax: 1/Vmax= 0.3604, Entonces Vmax= 1/0.3604= Vmax= 2.7746 U.I

y = 1/Vo, m = Km/Vmax, x=1/ [S] y b= 1/Vmax

Con este valor de Vmax calculamos la Km: Km/Vmax =0.0059

Gráfica V vs [S] 3

Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746

2

Km= 0.0163

V 1

Gg2.- Inhibición Enzimática: Resultados con Inhibidor

0 0

0.02

0.04

0.06 [S]

0.08

0.1

0.12

Tubo No. Sacarosa 0.2 M (ml) Absorbancia Azúcar Reductor (μmoles)/2. 0 mL Velocidad (unidades de invertasa) Concentraci ón de Sustrato (moles/L) = M)

Blan co T 0.5

Problemas 1 0.1

2 0.2

3 0.3

4 0.5

5 0.8

6 1.0

0

0.192

0.321

0.401

0.435

0.552

0.211

0

2.928 6

4.928 6

6.168 9

6.696 1

8.510

3.22 32

0

0.292 8

0.492 8

0.616 9

0.669 6

0.851 0

0.32 23

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

Así mediante la obtención de las dos ecuaciones de tendencia lineal de la forma:

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular” Profesora: Gabriela Edith Olguín Ruiz 3IM1 Sección III Córdova Félix Juan Manuel, Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Pérez Sndoval

Km ∗1 1 Vmax 1 = + V0 S Vmax

ó y= mx + b

Calculamos la ordenada al origen “y”, y la abscisa al origen “x”

Por otro lado al elaborar la gráfica de Doble Recíprocos o Lineweaver-Burk logramos obtener la constante de Michaelis-Menten “Km” con un valor de 0.0163 la cual relaciona la [sustrato] con la velocidad de reacción y la velocidad máxima que se alcanza, del mismo modo con la ecuación de Lineweaver-Burk obtuvimos la Vmax=2.7746 U.I

Respecto a la práctica de Inhibidores en esta práctica utilizamos como Inhibidor a la Anilina realizando el mismo proceso de hidrólisis de la XCI= -0.8017/0.0258 =-31.0736 Sacarosa con la enzima Invertasa obteniendo Glucosa y Fructosa, que al dar color XSI=-0.3604/0.0059 = -61.0847 reaccionando con el 3,5 DNS deteniendo la Act. Enzimática por el medio Básico. Logramos YSI= 0.3604, YCI= 0.8017 observar como es que los Inhibidores disminuyen De esta forma al observar que las rectas no son paralelasla Actividad Enzimática al unirse ya sea a la (Inhibidor Acompetitivo), y que tampoco se cortan entre sí en el eje enzima en su sitio activo, al complejo ES, o a la de las ordenadas “1/V” (Inhibidor Competitiva), entoncesenzima pero en un lugar que no es su sitio activo, observamos que las rectas si se cortan entre sí pero en un punto teniendo como función “retrasar” la velocidad de en el segundo cuadrante pero que no es sobre ninguno de los ejes reacción enzimática, al graficar los dobles por lo que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo. recíprocos con y sin inhibidor llegamos a la conclusión de que la Anilina es un Inhibidor No Discusión: Competitivo por el comportamiento observado al Como en la práctica de Inhibidores el ultimo valor de absorbanciagraficar. Para así conocer el tipo de Inhibidor que era la ANILINA con la actividad de la INVERTASA.

obtenida fue menor que el anterior a este, los valores calculados a partir de este fueron mucho menores debido a esto concluimos que la enzima se saturo en este caso de glucosa al tener demasiada cantidad de este azúcar reductor por lo cual en ese momento ya no dejo que la Invertasa trabajara. Por lo que decidimos descartar el último valor, en la Gráfica de Dobles Recíprocos. Conclusión: A partir de estas dos prácticas logramos observar cual es el efecto que tiene la concentración del sustrato y la acción de los inhibidores en la Velocidad de Reacción a la que llamamos Actividad Enzimática De los cuales observamos que al cambiar la concentración del sustrato la enzima (Invertasa) actúa cada vez más rápido mientras más sustrato tenga para trabajar en este caso Sacarosa y que si graficamos Velocidad de la enzima en U.I contra [sustrato] se observa un comportamiento lineal solo al inicio de la gráfica por lo cual se podría a decir que este comportamiento solo se da en un inicio a bajas concentraciones de sustrato ya que conforme aumenta la [sustrato] la grafica de velocidad adquiere el comportamiento de una parábola rectangular es decir cada vez la velocidad se incrementa menos, llegando incluso a ser independiente en cierto punto al aumento de [sustrato], debido a que la enzima tiene mucho sustrato (sacarosa) con el cual trabajar teniendo alrededor de 5 millones más de moléculas de sacarosa que de Invertasa por lo cual incluso puede llegar a saturarse la enzima de la glucosa obtenida por la ruptura de sacarosa y bloquear su sitio activo y hacer que la gráfica se caiga como sucedió en nuestro caso.



  



Comprobamos que al aumentar la concentración del sustrato la velocidad aumenta hasta llegar a un valor máximo Calculamos la Vmax y encontramos su valor que es de 2.7 U.I. Encontramos el valor de la Km (constante de michaelis) el cual es de 0.0163 en este caso Comprobamos que los inhibidores reducen la actividad enzimática al comparar las graficas de velocidad vs concentración. Identificamos que el inhibidor que usamos (anilina) es un inhibidor no competitivo debido a la grafica realizada.

Bibliografía Nelson D.L y Cox M.M, Lehninger: Principios de Bioquímica, 4ta Edición, Ed.: Omega, 2006, págs.: 202211

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