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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

EFECTO DE LA ADICION DE INHIBIDORES SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION, ELABORADO POR: ESPINOZA CASANOVA GLORIA Y HERNANDEZ OBREGON YARA PATRICIA, LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR, DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, GRUPO: 3IV1, SECCION: V.

INTRODUCCION: Muchas sustancias alteran la actividad de una enzima al combinarse con el mismo en una forma que afecta la fijación del sustrato y/o numero de recambio. Las sustancias que reducen la actividad de un enzima de esta manera se denominan inhibidores. Muchos inhibidores son sustancias que se parecen estructuralmente al sustrato del enzima, pero que o bien no reaccionan o reaccionan muy lentamente con el sustrato. Este tipo de inhibidores se utilizan usualmente para conocer la naturaleza química y conformacional de un sitio de fijación de sustrato como parte de un esfuerzo para dilucidar el mecanismo catalítico del enzima. Además muchos inhibidores enzimáticos son agentes quimioterapéuticos efectivos. Efecto de inhibidores en la actividad enzimática Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas. Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas responsables de reacciones vitales para la célula. La interacción de un inhibidor y una enzima varía dependiendo de la naturaleza química del inhibidor y de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se determina el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima. Tipos de inhibidores: Inhibidor competitivo. Son moléculas que tienen una similitud estructural y química con el sustrato de la enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin embargo, debido a que el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertirlo en producto y el inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, porque no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo dentro de éste. Si se adiciona más sustrato (y el inhibidor no se une de manera irreversible a la enzima) se reduce la inhibición. En un gráfico de dobles recíprocos el intercepto en y es el mismo en ausencia y presencia del inhibidor, es decir el inhibidor no afecta la Vmax de la enzima, sin embargo la pendiente de la curva se incrementa. El incremento en la pendiente indica la fuerza de unión del inhibidor. De tal manera que el valor de la Km de la reacción catalizada por la enzima se incrementa a este nuevo valor de Km se le llama Km aparente. Inhibidor incompetitivo o acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre sino que sólo se une al complejo enzima-sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el sitio activo o fuera de éste. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor incompetitivo altera tanto la Km

como la Vmax de la enzima pero no afecta la pendiente, por lo que las curvas de dobles recíprocos a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas. Los valores nuevos de las constantes cinéticas son Km aparente y Vmax aparente. Inhibidor no competitivo. El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato. Un inhibidor no competitivo puro es aquel que modifica tanto la Km de la enzima como la pendiente de la curva de dobles recíprocos, así las curvas en ausencia y presencia del inhibidor presentan diferencias en ambos interceptos, 1/Vmax y 1/Km. La mayor parte de los inhibidores no competitivos en realidad son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km. Sin embargo, la gráfica de dobles recíprocos muestra que además de que se afectan ambos interceptos las curvas en ausencia y presencia de inhibidor se intersectan en el segundo cuadrante. OBJETIVO: Se observo el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y se determino la constante de Michaelis-Menten por los métodos conocidos, asi como su aplicación. Se determino el tipo de inhibición producido por una sustancia (anilina) sobre la actividad de la invertasa. RESULTADOS: INHIBICIÓN ENZIMATICA:

Absorbencia Azúcar reductor Velocidad

Sin Inhibidos 0.326 0.36 0.56 4 6 2.95 3.25 5.25 0.295

Concentraci ón del sustrato

0.022 5

Absorbencia

0.155

Azúcar reductor Velocidad

0.105

Concentraci ón del sustrato

0.32 5 0.04 5

0.52 5 0.06 7

0.022 5

0.13 6 0.06 7

0.5 0.4 sin inhibidor

0.3

con inhibidor

0.2 0.1 0 0

0.42 9 3.93

0.55 3 4.86

0.48

0.39 3 0.11 2

0.48 9 0.18

0.42

0.07 0 1.43

0.09 6 1.46

0.14 3 0.18

0.14 6 0.22 5

Con inhibidor 0.12 0.09 0.10 3 7 1 1.05 1.35 1.36 1.40 0.13 5 0.04 5

0.6

0.14 0.11 2

4.2

0.22 5

La reacción que se llevo acabo fue como sigue: E + S ES E + P  + I EI  + I ESI

0.05

Michaelis-Menten:

0.1

0.15

0.2

0.25

12 10 8 6

y = 0.1167x + 6.3849

4 2 -80

-60

-40

-20

0 y = 0.0336x + 2.0081 20 40 -2 0

Lineweaver-Burk: Resultados: Se obtuvo que la reacción que se llevo acabo es una inhibición no competitiva, el valor de Km obtenido por la ecuación de lineweaver-Burk y michaelismenten es de 0.016 lo que significa que existe una gran afinidad de la enzima por el sustrato. BIBLIOGRAFIA: 1. NELSON DAVID L. (2009 )BIOQUÍMICA LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY EDITORIAL: FREEMAN 5 ED 2. STRYER / BERG (2007) BIOQUÍMICA 6ª. ED. EDITORIAL: REVERTÉ

1/v = 0.03361/[s] + 2.0081 m= Km/V m= Km/Vmax 1/Vmax= 2 Km= mVmax Km= 0.03361 (0.5)= 0.016 DISCUSIÓN: El inhibidorse unió a la enzima en puntos distintos al centro activo, su unión incapacita a la enzima para desarrollar su acción catalítica, y en este caso, el aumento en la concentración de sustrato no revierte la inhibición. Su capacidad de unirse a la enzima esté ésta en solitario o esté unida al sustrato, da lugar a que la Vmáxima. Se encuentre disminuida, mientras que el Km no se modifica ya que la afinidad de la enzima por el sustrato y su capacidad de unirse a él no se ve disminuida.