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Practica 2. MICROSCOPIA 1. INTRODUCCION

Desde los inicios de la microscopia, los investigadores vienen desarrollando métodos cada vez más sensibles, eficaces y con mejor resolución. Al principio, se enfrentaron a los problemas de aberraciones ópticas, imágenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los cuales se mantuvieron hasta mediados del siglo XIX, donde aparecieron los lentes objetivos que reducían la aberración cromática con una apertura numérica entre 0.65 y 1.25. Estos avances se iniciaron con los reportes sobre los métodos de iluminación que propuso el profesor August Kölher, en 1893, y que sentaron las bases de la microfotografía moderna. En las últimas décadas se ha incrementado la aplicación de la microscopía óptica en los laboratorios de investigación de una amplia variedad de disciplinas como la biología celular y molecular, microbiología, inmunología y virología. El rápido desarrollo de diferentes métodos como los de fluorescencia, contraste de fases, confocal y de campo oscuro entre otros, que sumados a los avances en la digitalización y análisis de imágenes, han permitido a los microscopistas obtener resultados rápidos, cuantificables y confiables de una gran variedad de especimenes biológicos. Al margen de estos avances, las bases del funcionamiento de los distintos tipos de microscopios ópticos siguen siendo los mismos que se presentan en esta práctica y con los cuales el estudiante deberá familiarizarse. CLASES DE MICROSCOPIOS Existen dos tipos de microscopios ópticos: 1. Microscopios simples: Constan de un solo sistema de lentes. 2. Microscopios compuestos: Constan de dos (2) sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El microscopio compuesto es un instrumento que aumenta considerablemente la imagen de los objetivos que en él se observan. Entre las variedades de éste microscopio encontramos el electrónico y el fotónico u óptico; este último, está formado por una parte mecánica y una parte óptica. PARTE MECÁNICA Consta de las siguientes partes. a. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo de las demás piezas del microscopio. El pie debe ser sólido y pesado para asegurar su estabilidad.

b. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie; sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrará el microscopio cuando se traslada durante los trabajos. En algunos microscopios la columna es móvil. c. Tubo del Ocular: Está colocado en la parte superior del microscopio, donde están acoplados los oculares, que pueden tener movimiento vertical, con ayuda de una cremallera sobre la columna. En algunos microscopios el tubo del ocular es inclinado y se mantiene fijo, en este caso se mueve la platina. d. Revólver o Disco Giratorio: Está debajo del tubo ocular donde están acoplados los objetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro. e. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un orificio central que permite el paso de la luz a través de ella. Su función es sostener las placas con los preparados biológicos que se van observar. f. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya función es sujetar y mover la placa que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales (hacia adelante, hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto. Cuando la platina carece del anterior dispositivo, lleva dos soportes para fijar las placas llamadas ganchos. g. Mecanismos de Movimiento: Está integrado por el tornillo macrométrico y el micrométrico h. Tornillo Macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo del preparado a observar; su función es lograr un enfoque más o menos claro o aproximado del objeto. i. Tornillo Micrométrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero lentamente, casi imperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo del ocular. Durante la observación y enfoque este tornillo debe estarse moviendo permanentemente; su función es darle nitidez al enfoque. PARTE ÓPTICA Está integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminación (espejo, diafragma, condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminación, ampliación y la visión aumentada del objetivo. a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. Ellos se acoplan mediante roscas estándar al revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos. Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que están más cerca del objeto. La mayoría de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivos son de aumentos diversos, los más usados son: Objetivos de pequeños aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersión 90x, 95x y 100x. Las lentes de inmersión se emplean con aceite de inmersión para conectar la lente frontal (lente inferior del objetivo) al porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto se produce una pérdida de luz por reflexión que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceite de cedro (aceite de inmersión) cuyo índice de refracción 1.515, es próximo al cristal. Este aceite también reduce o suprime por completo la refracción de los rayos de luz provenientes de la fuente luminosa.

b. Ocular: Están colocados en la parte superior del tubo ocular. Está formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran más cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x.El aumento de la imagen de un objeto observado a través de un microscopio, se calcula multiplicando el número de aumento del objetivo con el cual se está trabajando por el número de aumento del ocular que se está utilizando. c. Aparato de iluminación: Está conformado por la fuente de luz, el diafragma, el condensador y los filtros. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la refleja a través del objeto y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un bombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito eléctrico de bajo voltaje. d. Diafragma: Está ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamente debajo de la platina, su función es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. El diafragma tiene una palanca que al moverla hacia delante o hacia atrás aumenta o disminuye el orificio central, dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente. e. Condensador: Es un elemento cónico que posee un sistema de dos lentes convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo por el agujero de la platina. Existe un tornillo manual que permite guardar la altura del condensador. Esta graduación es importante cuando se trabaja con objetivos de gran aumento (40x, 100x), porque en la medida que se trabaja con éstos objetivos el condensador debe subirse. Lo contrario sucede cuando se trabaja con objetivos de menor aumento (4x, 10x). f. filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los filtros son elementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo o verde.

PROPIEDADES DEL MICROSCOPIO. El microscopio, al desempeñar su función se le han determinado tres propiedades: 

PODER SEPARADOR O RESOLUCIÓN: Esto depende mucho de la calidad del microscopio, pero se lo puede definir como la posibilidad de poder distinguir a través de un instrumento dos puntos muy próximos.



DEFINICIÓN: Se refiere a la nitidez con la que se obtiene las imágenes a través del microscopio, y está relacionada directamente con la cantidad de luz utilizada y con el sistema de lentes empleados.



AUMENTO DEL MICROSCOPIO: Esta propiedad es la relación directa entre la imagen real y la que obtenemos por medio del objetivo, queriendo decir con esto que si ampliamos el aumento del objetivo, obtendremos una imagen aumentada cuantas veces como aumentos tenga el objetivo.

DETERMINACIÓN DEL PODER DE AUMENTO. El poder de aumento es la capacidad que posee el microscopio para dar una imagen aumentada de un objeto. El microscopio compuesto consta de dos lentes que aumentan la imagen, los oculares y los objetivos. El poder de aumento del microscopio se calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento del objetivo utilizado. (EJ: Objetivo de 40x x Ocular 10x se obtiene un aumento de 400 veces). CAMPO DE VISIÓN El campo de visión de un microscopio es la zona circular que se observa al mirar la preparación bajo un determinado aumento. Para medir el campo de visión de un microscopio, se debe usar una unidad llamada micra. Una micra equivale a 0,001 mm; en otras palabras, hay 1000 micras en un milímetro. El diámetro de este campo es su medida. MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO El microscopio estereoscópico es un binocular con aumentos de 4 a 40 veces, que permite observar muestras opacas y realizar disecciones de estructuras en organismos pequeños, ya que en él puede manipularse. la muestra mientras se. El microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio. Se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares, por lo que a veces se confunden ambos términos. El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios permiten distancias que van desde un par de centímetros a varios de ellos, desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía, industria, (microelectrónica), medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones

que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial) como macroinvertebrados.

Imagen extraída manual de funcionamiento y mantenimiento del estereoscopio Universidad Nacional UNAL código: a-mo-10.001.002 versión: 0.0. TEMAS DE CONSULTA 1. Definir los siguientes términos: Resolución, definición, Aumento, campo de visión, lentes convergentes, lentes convexas. 2. Una célula de epidermis de cebolla tiene una longitud de 0,03 cm y de ancho 0,001 cm. Exprese los resultados en micras. 3. Una célula bacteriana tiene un diámetro de 0,2 micras. A cuantos Ao equivale? 4. Establezca diferencias y semejanzas entre el microscopio óptico y estereoscopio en cuanto a: tipos de lentes, tipo de imágenes, utilidad y usos COMPETENCIAS  Adquirir conocimiento y destreza en el uso del microscopio como herramienta elemental en investigación.  Dar el pertinente uso de las partes del microscopio óptico.  Preparar adecuadamente las muestras a observar en el microscopio óptico y estereoscopio.

MATERIALES Y REACTIVOS Lista de Equipos: Microscopio óptico, Estereoscopio. Materiales: Gotero, Láminas portaobjeto, láminas cubreobjeto, Solución limpiadora de lentes, Aceite de inmersión, Papel arroz, cristales de sulfato de cobre, papel milimetrado,

Materiales que trae el estudiante: Recorte de periódico, Recortes de tela o hilos de colores, Polen de flores, cristales de azúcar, tijeras. METODOLOGIA ACTIVIDAD 1. IDENTIFICACIÓN DE LAS PARTES DEL MICROSCOPIO Una vez se socializan las partes del microscopio según las instrucciones dadas por el docente, pase a identificar las partes del microscopio compuesto y posteriormente ubíquelas en el esquema adjunto en la hoja de los resultados.

ACTIVIDAD 2. RECOMENDACIONES MICROSCOPIO.

PARA

REALIZAR

OBSERVACIONES

EN EL

 Aleje el objetivo de la platina y coloque la lente de menor aumento (4x).  Abra las pinzas del carro que se encuentran sobre la platina y coloque la preparación con el cubreobjeto hacia arriba y cierre el carro.  Ajuste la posición del carro de modo que la región a observar quede justo en el orificio de la platina.  Utilice el tornillo macrométrico para acercar la lente a la preparación. Cuando logre un enfoque aproximado utilice el tornillo micrométrico (girarlo lentamente) para ajuste de precisión.  Para cambiar el aumento, gire el revólver y seleccione el nuevo objetivo a utilizar. Uso del objetivo de inmersión  La preparación debe estar enfocada a 40X (objetivo seco), basta con girar el revólver de modo que el objetivo de inmersión quede en una posición intermedia (40X y 100X).

 Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubre objeto, sin mover la platina para evitar que se desenfoque la muestra a observar.  Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico.  Utilice el tornillo micrométrico para lograr el enfoque del objeto, si es necesario modifique la cantidad de luz del condensador para que la imagen se vea más clara.  Al finalizar la observación baje la platina, retire la preparación y limpie tanto el objetivo como la preparación con un paño humedecido con solución para limpiar lentes. Disposición del microscopio al terminar las observaciones. Una vez finalice las observaciones debe tener en cuenta:  Apagar la lámpara del microscopio.  Verificar que esté limpio y seco.  Dejar el revolver en objetivo de menor aumento (4x o 5 x).  Enrollar el cable del microscopio alrededor del brazo. ACTIVIDAD 3: (PODER DE MAGNIFICACIÓN) MONTAJE O PREPARADO DE LETRAS. 

Seleccione una letra (e, x, o, r) de papel periódico que tenga un tamaño mediano, (arial 8 ) sobre una lámina portaobjetos deje caer una gota de agua en el centro de la placa, ubique la letra sobre la gota de agua, cubra la letra con una lámina cubreobjetos formando un ángulo de 45 grados entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Déjelo caer lentamente para evitar la formación de burbujas en la placa.



Coloque la placa ya preparada sobre la platina de tal manera que quede bien ajustada. Enfoque con el objetivo de 4X utilizando el tornillo macrométrico. Abra el diafragma hasta que obtenga una buena iluminación de la muestra. Utilice el tornillo micrométrico para obtener mayor nitidez, dibuje lo que observa en el espacio asignado para esto en los resultados.

Luego gire lentamente el revólver para colocar el objetivo 10X. Utilice el tornillo micrométrico para obtener una imagen nítida. No utilice el tornillo macrométrico; éste no es necesario si usted enfocó correctamente con el objetivo de 4X. Si se requiere abra un poco el diafragma para aumentar la entrada de luz.  Dibuje lo que observa en el objetivo de 10X. Repita la operación con el lente de 40X.  Al terminar su observación gire lentamente el revólver y coloque el objetivo de 4X, ahora realice desplazamientos del microscopio de izquierda a derecha y luego de arriba abajo. Observe con atención que pasa con los movimientos que realiza y que sucede con la imagen? Cuál es la posición de la imagen? Escribir los resultados. Realice esquemas secuenciales en 4X, 10X y 40 X. (Utilice un círculo para simular el campo visual)

ACTIVIDAD 3. (PROFUNDIDAD DE ENFOQUE Y PODER DE RESOLUCIÓN) MONTAJE CON HILOS DE COLORES Al examinar un espécimen en el microscopio no siempre se puede enfocar todo al mismo tiempo debido a su espesor y profundidad. Por tanto, se hace necesario enfocar ciertas secciones en muestras que están superpuestas. Prepare una lámina fija con hilos de tres colores donde se superpongan en un punto. Use el objetivo de baja potencia (10X) y localice el punto donde los tres hilos se cruzan. Cuál es el orden de los hilos en su laminilla de arriba hacia abajo enfocando con el tornillo macrométrico? Según vaya enfocando, usted verá que los diferentes hilos enfocan a diferente nivel. Un hilo o parte de un hilo está enfocado mientras que los otros se verán opacos. Enfocando hacia arriba y hacia abajo los hilos, usted puede percibir la profundidad de enfoque que no es evidente cuando el enfoque se deja en un mismo punto. Qué importancia tiene la profundidad de enfoque en la observación de estructuras celulares? Relaciónelo con el poder de resolución del microscopio. Elabore esquema en objetivo de 10 x. ACTIVIDAD 4. PREPARACION DE MONTAJE DE EPIDERMIS DE Allium Cepa (CEBOLLA) En un montaje húmedo de la epidermis de la cebolla se observa la pared celular, la cual aparece como líneas que forman redes entre las células. La pared celular rodea la membrana celular y ésta última encierra el citoplasma. En la parte central de una célula vegetal se observa la vacuola, la cual tiene forma redondeada y contiene agua y sales. El núcleo aparece como una estructura densa y esférica. Coloque una gota de reactivo de LUGOL en la lámina portaobjetos, remueva una porción de la epidermis de cebolla, deposítela en la lámina y cubra con la lámina cubreobjetos. Realice los dibujos de sus observaciones indicando el objetivo utilizado (4X, 10X, o 40X). Qué estructuras celulares observó? Es posible contar las celulas que se aprecian en el campo visual? ¿ Cual objetivo le permite más fácilmente realizar el conteo? Qué poderes del microscopio pudo comprobar con este montaje?

ACTIVIDAD 5. DETERMINACIÓN DEL DIÁMETRO DEL CAMPO VISUAL DEL MICROSCOPIO.

Cálculo del diámetro del campo de visión Para calcular el diámetro del campo de visión para un determinado aumento hay que seguir los siguientes pasos: Recortar un cuadrado de 1 cm de lado de papel milimetrado. Ponerlo sobre la abertura central del portaobjetos. Observando por el ocular y con el objetivo de 4X, mover la muestra hasta lograr que la línea 0 mm quede en el borde izquierdo del campo visual. Enfocar con el objetivo de menor aumento 4X hasta que se vea con claridad. Enfocar la preparación quiere decir situarla a la distancia del objetivo que permite su observación nítida. Esta distancia s e conoce como distancia de trabajo y es tanto menor cuanto mayor es el poder de aumento del objetivo Medir el campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo de visión. Contar el número de milímetros que se ven (recuerde que la distancia entre dos líneas es un milímetro) y estimar aproximadamente la fracción sobrante, si la hay. El resultado será el diámetro del campo visual para ese aumento (objetivo x ocular). Se hallara utilizando el teorema de Pitágoras, así: C2= a2+b2 ; donde C, corresponde al diámetro del campo visual en este objetivo de menor aumento. Teniendo en cuenta que lado a= 3mm; y lado b= 3 mm, se despeja la fórmula. Si queremos calcular el diámetro del campo de visión para aumentos mayores, se tener en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, el campo será menor, es decir, se verá menos de la muestra que estemos observando. De forma que, si el aumento es el doble, el campo de visión será la mitad, si el aumento es el triple, el diámetro del campo visual será la tercera parte, etc. (inversamente proporcionales). Por tanto, bastará con realizar un sencillo cálculo matemático para saber el nuevo diámetro. Diámetro del objetivo por hallar= Diámetro calculado en objetivo anterior/ objetivo de donde se determinó el diámetro/objetivo por determinar el diámetro.

Tabla 1 Equivalencia mm en micras Medida en mm (escala del portaobjetos)

Equivalencia en μm

Tamaño de las marcas (divisiones)

1mm 0.1 mm 0.01mm

1000 μm 100 μm 10 μm

Grandes Medianas más pequeñas

ACTIVIDAD 6. USO DEL MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO

Escoja un espécimen. Puede ser una hoja, una flor o un insecto, o unos cristales de sal o sulfato de cobre. Ponga el espécimen o muestra en la platina; si está húmedo colóquelo sobre una placa Petri o una laminilla. Prenda y ajuste la fuente de luz. Algunos microscopios tienen la fuente de luz integrada al microscopio mientras que otros la tienen aparte. Asegúrese de que la fuente de luz esté iluminando su espécimen. Enfoque el objeto que desea ver y muévalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados. ¿Hacia dónde se mueve la imagen? ¿Puede explicar estas observaciones. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 1. Becker Wayne; Kleismith Lewis; Hardin Jeff. El mundo de la célula. sexta edición 2007. 2. Audesirk, T., Audesirk, G. y Byers, B.E. (2008). Biología. La vida en la tierra. 8a Edición. Editorial Prentice-Hall. [LIBRO TEXTO] 3. Curtis, H., N. S. Barnes., A. Schnek y G. Flores. (2008). Biología. . 7a edición, Editorial Médica Panamericana, S. A. Argentina. 4. Cooper Geoffrey y Hausman Robert. La célula. Marban libros. 2008. 5. http://www.curtisbiologia.com/node/70