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• Anthony Vargas

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Primera Unidad

Enzimología y Metabolismo Energético

- DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA -INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia; permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. 2. Verificando los productos liberados después (PRODUCTOS FORMADOS) de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. FINALIDAD:  Determinar la actividad enzimática, utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa; verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. MATERIAL Y EQUIPO:  Solución de almidón pH 6.0 al 1%.  Cloruro de sodio solución 0.1M  Enzima al 1% (amilasa salival).  Ácido Clorhídrico 0.05N  Solución yodada.  Reactivo Folin Wu: o Solución Cúprica alcalina. o Solución fosfomolíbdica. PROCEDIMIENTO: 1) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el SISTEMA A, Colocando lo que se indica en el siguiente cuadro: COMPONENTES (en ml)

TUBOS DE ENSAYO

I II Solución de almidón pH 6.0 al 1% 5.0 5.0 Solución de Cloruro de sodio 0.1M 1.0 1.0 Agua destilada 4.0 3.0 Mezclar y colocar los tubos a incubación por cinco minutos a 37 °C Agregar: Amilasa Salival al 1.0% -1.0 Mezclar y continuar la incubación por 10 minutos (computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado al tubo)

Primera Unidad

Enzimología y Metabolismo Energético

2) Realizar el control de la actividad enzimática de acuerdo al: SUSTRATO RESIDUAL, el cual se realiza por la reacción del yodo: a. Cumplidos los 10 minutos de incubación, sacar los tubos y armar una serie paralela agregando: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml) I II Ácido Clorhídrico 0.05N 5.0 5.0 Incubado de cada uno de los tubos del 0.5 0.5 preparado anterior (Sistema A) Solución Yodada 0.5 0.5 Observe los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color). 3) Realizar el control de la actividad enzimática de acuerdo a: LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin Wu), el cual se realiza en base a la capacidad reductora de los productos que se forman en la reacción, para esto armar la siguiente serie: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml) I II Incubado correspondiente del Sistema A 1.0 1.0 Solución cúprica alcalina 1.0 1.0 Mezclar por inversión y colocarlos en baño de agua hirviendo por 8 minutos. Sacar los tubos y enfriarlos con agua corriente. Observe los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, mediante la formación de precipitado. ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO: Confeccione cuadros y/o gráficos con los resultados observados en cada uno de los pasos del procedimiento realizado y explique bioquímicamente lo encontrado. PREGUNTAS DE APLICACIÓN: 1) ¿Cuál fueron los objetivos de la práctica? 2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. 3) ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? 4) Defina que es la energía de activación y el estado de transición. 5) Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 6) ¿Qué se utilizó para objetivar la presencia del sustrato residual y cuál es su fundamento bioquímico? 7) ¿Qué se empleó en la práctica para objetivar los productos formados en la reacción enzimática y cuál es su fundamento bioquímico? REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.