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INTRODUCCION

Las reacciones químicas que se dan en los seres vivos no podrían tener lugar sin la presencia de los enzimas. Estas macromoléculas, que generalmente son proteínas, catalizan las reacciones bioquímicas, permitiendo que los sustratos se conviertan en los productos que necesita la célula. Como todo catalizador, los enzimas no se consumen en las reacciones que catalizan, pero a diferencia de otros catalizadores de naturaleza inorgánica, las reacciones que catalizan son muy específicas: sólo interaccionan con determinados sustratos, y sólo facilitan el curso de determinadas reacciones. Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución. Las enzimas son grandes proteínas que aceleran las reacciones químicas. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición. El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, hidrófobas, etc, en un lugar específico, el centro activo. Este centro es una pequeña porción del enzima, constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. Con su acción, regulan la velocidad de muchas reacciones químicas implicadas en este proceso. El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne (1837-1900), deriva de la frase griega en zyme, que significa 'en fermento'.

EXPERIENCIA N˚ 4 ACTIVIDAD ENZIMATICA OBJETIVOS  Observar que el oxígeno desplace al agua, dependiendo del material vegetal que se emplee  Diferenciar si una reacción es rápida o lenta.  Establecer una relación desplazamiento tiempo, según el material a emplearse.  Identificar la acción del peróxido de hidrógeno sobre la peroxidasa y catalasa.  Familiarizarse con las propiedades de los enzimas y observar la actividad de la catalasa y peroxidasa. FUNDAMENTO TEORICO Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que las reacciones metabólicas ocurran a gran velocidad en condiciones compatibles con la vida. En las células, la actividad secuencial de muchas enzimas permite que las moléculas se degraden, o bien se formen moléculas de mayor tamaño a partir de moléculas sencillas. Desde el punto de vista químico, las enzimas son proteínas globulares, algunas de ellas con estructura cuaternaria. Para cumplir su función requieren conservar su estructura nativa, en particular se destaca una región conocida como sitio activo, que es responsable de catalizar la reacción. Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan Las enzimas pertenecen a seis grupos que aparecen a continuación: 1. Oxidoreductasas, actúan en reacciones de oxidoreducción y se las llama también deshidrogenasas. 2. Transferasas, transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las quinasas representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato. 3. Hidrolasas, rompen un enlace adicionando una molécula de agua. 4. Liasas, rompen enlaces por mecanismos distintos a la hidrólisis o la oxidación. Las decarboxilasas y aldolasas son ejemplos de liasas. 5. Isomerasas, catalizan reacciones de interconversión de isómeros. 6. Ligasas, unen moléculas utilizando energía proveniente del ATP. También se llaman sintetasas. El nombre de cada enzima hace referencia al sustrato y al tipo de reacción que cataliza. La denominación sistemática de una enzima se realiza según reglas nomenclaturales mediante cuatro números precedidos de la abreviatura E.C. (Enzymatic Code). Propiedades generales de las enzimas 1. Son los catalizadores de las reacciones químicas de los sistemas biológicos 2. Tienen gran poder catalítico 3. Poseen un elevado grado de especificidad de sustrato 4. Funcionan en soluciones acuosas en condiciones suaves de pH y temperatura 5. La mayoría de las enzimas son proteínas La función depende de la integridad de la conformación proteica nativa Existen enzimas que son proteínas simples y otras que requieren componentes químicos adicionales: Las enzimas se clasifican según la reacción catalizada.

PEROXIDASA Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas en toda la escala filogenética. Pertenecen a la categoría de las oxidorreductasas y según el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular se clasifican con los números EC 1.11. Catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido. En vegetales, es de destacar a la peroxidasa del rábano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes aplicaciones en técnicas inmunoquímicas y de diagnóstico clínico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugación con las inmunoglobulinas y sencillez para detectarla por métodos colorimétricos utilizando un gran número de reactivos. En animales, existen peroxidasas con una función predominantemente defensiva en la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carácter oxidante con fines germicidas y bactericidas del peróxido que se genera de forma endógena mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino ácido oxidasa etc.). No todas las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa (yoduro peroxidasa) es también la responsable de la síntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en este caso el yoduro a yodo para que éste se adicione a algunos de los anillos fenólicos de los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Otras peroxidasas, como la glutationa peroxidasa, están ampliamente distribuida en diversos tejidos con fines diferentes, pero relacionados con una función antioxidante. Prácticamente todas las peroxidasas son hemoproteínas (excepción notable es la glutationa peroxidasa, que es una selenoproteína) y tienen como sustrato común el H2O2 o peróxido de hidrógeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el inferior, dando lugar a una inhibición por exceso de sustrato ya que cuando ambas posiciones están ocupadas por el peróxido de hidrógeno no es posible la unión del otro sustrato. Respecto a ese otro sustrato, su naturaleza y estructura química puede ser muy distinta, tanto si nos referimos a los oxidados "in vivo" como si lo hacemos a los que se emplean "in vitro" con objeto de detectar esta actividad enzimática. Entre ellos se incluyen fenoles, aminas aromáticas, moléculas orgánicas complejas como el ABTS (ver práctica de Reflotrón para determinación de parámetros sanguíneos en tiras secas), o el ioduro y la glutationa antes citados. Esta pobre especificidad para el sustrato reductor hace que la afinidad sea también pequeña. La peroxidasa, EC 1.11.1.7, es una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno. Donante + H2O2

Donante oxidado + H2O

Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo. Es utilizada ampliamente en bioquímica clínica. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos como glucosa, ácido úrico, colesterol o triglicéridos en fluidos biológicos usan peroxidasa como enzima acoplada. También se utiliza en inmunoensayos para la detección de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

causante del sida o el herpesvirus. La peroxidasa también se utiliza como biocatalizador para la generación de productos de interés biotecnológico e industrial como resinas fenólicas, adhesivos, antioxidantes, antiestáticos y protectores de radiación magnética, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. Los genes de las peroxidasas humanas expresan una cadena ligera y una cadena larga. La enzimas activas son un h El ser humano también sintetiza la mieloperoxidasa. Esta enzima se utiliza en el sistema inmunitario con funciones bactericidas. Aplicaciones La peroxidasa se emplea para el tratamiento industrial de aguas contaminadas: por ejemplo, los fenoles pueden eliminarse mediante su polimerización catalizada mediante la peroxidasa de Armoracia rusticana. En caballo, la actividad promedio de la enzima mieloperoxidasa en sinovia está relacionada con la presencia de artritis séptica, por lo que puede emplearse como marcador. En investigación, es muy usada para el marcaje de anticuerpos en técnicas como el Western blot o ELISA. De esta forma se detecta la presencia de la enzima (del anticuerpo y, en último término, del antígeno) mediante la detección de la reacción química que cataliza. CATALASA Muchas reacciones químicas ocurren muy lentamente a temperatura ambiente. En un laboratorio, una reacción puede acelerarse calentando los reactivos, pero esto no es posible en las células. Por ello, las reacciones celulares son aceleradas mediante las enzimas. Las enzimas son los catalizadores biológicos que facilitan las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos. Sin ellas las reacciones químicas serían tan lentas que la vida se detendría.

La catalasa es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso. El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno. La ausencia congénita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta por la ausencia de actividad de la catalasa en los glóbulos rojos y con severas infecciones

gangrenosas de la boca, pudiendo producir la pérdida de los dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones blandas que los cubre. Enfermedad congénita del Japón (2 de 100.00 habitantes sufren de este trastorno). El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun así la reacción química se produce en dos etapas: H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2 Donde Fe-E representa el núcleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actuán como cofactores. La enzima se presenta en forma de homotetrámero y se localiza en los peroxisomas. Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para muchas sustancias orgánicas, especialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTO MATERIALES           

2 pomos mermeleros 1 pipeta Pasteur descartable Probeta 2 sondas 2 jeringas de 20 cc 100 ml de agua oxigenada 2 tubos de ensayo 20 x 200 Hojas de geranio Hojas de acelga Mortero Balanza electrónica PROCEDIMIENTO

         

Pesar de 10 a 20 g del vegetal a usar. Moler con el pilón en el mortero. Simultáneamente graduar la cinta Masking tape y pegarla sobre los tubos de ensayo. Llenar el frasco mermelero con agua. Unir la sonda con la jeringa. El otro extremo de la sonda introducirlo en el tubo de ensayo y llenarlo con agua hasta el ras. Tapar con el dedo el tubo de ensayo y con mucho cuidado introducirlo al pomo mermelero cuidando que el agua del tubo no sea desplazada por oxígeno. Introducir en el émbolo de la jeringa 2 a 3 g del machacado inicial y agregar 3 ml de agua oxigenada. Tapar suavemente. Inmediatamente tomar el tiempo. Observar como la acción del vegetal y el agua oxigenada desplaza al agua del tubo de ensayo. Medir la distancia desplazada y hallar el volumen.

RESULTADOS Volumen de agua desplazada: Para hallar el volumen de agua desplazada se considerará: r= 0.9 cm El tubo de ensayo se compone de dos superficies  Volumen de casquete:  Volumen del cilindro:

Donde   

H= altura que recorre el agua en el interior del cilindro S= área de la base cilíndrica h= altura del centro a la curva del sector esférico.

Desplazamiento del agua utilizando agua oxigenada y acelga: Tiempo: 80 seg.

Desplazamiento del agua utilizando agua oxigenada y geranio: Tiempo:10 min.

Resultados de las mesas adyacentes: Mesa 3: acelga Tiempo: 90 seg.

Mesa 5: geranio Tiempo:15 min

ANALISIS DE RESULTADOS



En estas reacciones pudimos evidenciar la actividad enzimática y la cuantificamos a través del volumen de oxigeno desprendido por dicha reacción.

volumen desplazado de agua utilizando acelga (cc)

4 3 2 1 0 mesa 4

mesa 3

Como se puede observar el volumen desplazado de agua tanto para la mesa 4(nuestra) y la mesa 3 es similar, este volumen representa el oxígeno que es liberado en esta reacción. Es una reacción semi violenta comparada con la albahaca y la alfalfa. La acción de la peroxidasa fue instantánea.

volumen de desplazamiento de agua utilizando geranio (cc) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 mesa4

mesa 5

Aquí se observa que no hubo desplazamiento de agua, es decir el peróxido de hidrogeno no tuvo influencia sobre el machacado de geranio, no genero oxígeno. Podría decirse que el geranio tiene cantidades muy reducidas de peroxidasa. CONCLUSIONES  Las enzimas son biocatalizadores que sirven para acelerar los procesos, son sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas siempre que sea termodinámicamente posible. La importancia de una enzima es que aceleran las reacciones, en los vegetales las enzimas constituyen el principal catalizador de las reacciones indeseables del pardea miento de tipo enzimático lo cual hace que las frutas o vegetales maduren mucho más rápido.  El oxígeno desplazo a la acelga en un tiempo breve, pero al geranio no lo desplazo debido a que el geranio no tiene cantidades considerables de peroxidasa y catalasa.  La acelga es uno de los vegetales con mayor porcentaje de catalasa.

ANEXOS

Pesado y machacado del material

Desplazamiento del agua

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS  Solomon Berg Martin. 2001. BIOLOGIA. Editorial Mc Graw Hill. Quinta edición.1263 págs.  Claude A. Villee. 1993. BIOLOGIA. Editorial Mc Graw Hill. Séptima edición. 875 págs.  Audesirk Audesirk Bayers. 2008. BIOLOGIA, LA VIDA EN LA TIERRA. Editorial Pearson. Octava edición. 975 págs.  Raymond Oram. 2007. BIOLOGIA, SISTEMAS VIVOS. Editorial Mc Graw Hill. Última edición. 966 págs. Referencias de internet:  http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/profesor/practicas/Actividad_e nzimatica.pdf  http://cienciadictos.blogspot.com/2010/04/que-es-una-holoenzima-que-es-una.html  http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20071214151904AAv3R9k  http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa  http://es.wikipedia.org/wiki/Peroxidasa http://html.rincondelvago.com/experimentos-en-biologia-celular.html http://www.uned.es/pea-nutricion-y-dietetica-I/guia/guianutr/enzimas.htm