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• Dano Dino

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Introducción. Durante esta práctica se hablará de la cinética enzimática y los factores que la afectan, es por eso que daremos una pequeña introducción acerca de este tema, para que resulte más sencilla la comprensión de la práctica. La cinética enzimática estudia la cinética de las reacciones catalizadas por enzimas, es decir la velocidad con la que se lleva a cabo la reacción, esta velocidad se ve afectada por las condiciones en la que la reacción se lleva cabo, por ejemplo: 







El pH ya que las enzimas dependen mucho del pH ya que si se realiza una curva de la actividad enzimática de acuerdo a este valor se encuentra una campana casi simétrica en las cuales el punto máximo de la campana es el pH óptimo y después de este la actividad empieza a decaer porque la enzima contiene grupos que pueden ionizarse en medida del pH, esto hace que la enzima se desnaturalice. El tiempo, la actividad enzimática es lineal pero sólo hasta un periodo de tiempo determinado, las razones de este comportamiento son varias, la primera porque se ha alcanzado el equilibrio es decir el sustrato se haya agotado para formar más producto,la segunda es porque la enzima siendo proteína empiece a desnaturalizarse con el tiempo y deje de funcionar, la tercera que el producto de la reacción sea un inhibidor de la actividad enzimática. Se ha visto que al aumentar la temperatura se observa una aceleración de la actividad debido a la aceleración del movimiento de las moléculas generado por el calor, pero a determinada temperatura la actividad empieza a decrecer por desnaturalización de la enzima hasta perderse en su totalidad. La concentración del sustrato, para poder explicar la influencia de este parámetro en la actividad enzimática tenemos que establecer lo siguiente:

E+ S ↔ E−S → P+ E

De acuerdo con la ley de acción de masas la velocidad de reacción será proporcional a la concentración de E-S que a su vez depende de la concentración de E y S pero como E queda disponible al final de la reacción se puede calcular que la velocidad de la reacción depende directamente de la concentración de S, aunque esto sólo aplica en bajas concentraciones ya que a concentraciones más altas la velocidad ya no cambia llegando a lo que se llama Vmáx.. Esto es bien explicado en el modelo de Michaelis - Menten que se expresa por la siguiente ecuación y se grafica de la manera siguiente:

V=

V máx [ S ] Km+ [ S ]

V= velocidad de la reacción Vmáx. = velocidad máxima a la que trabaja la enzima Km= la constante global de velocidades para cada enzima.

Sin embargo en el modelo anterior se dificulta el cálculo de la V máx. por lo que surge otro modelo de Lineweaver-Burk en el cual la ecuación de MichaelisMneten se vuelve lineal y queda de la siguiente forma:

1 Km 1 1 = + v Vmax [S] Vmax Donde :

Km 1 Vmax [S] = a la pendiente de la recta (m)

1 Vmax = la ordenada al origen (b)

Objetivos: 





Conocer, comprender e interpretar el comportamiento de las enzimas (ureasa) al ser enfrentadas frente a los diferentes factores que alteran la velocidad enzimática. Mediante el uso de diferentes factores a controlar, tales como, pH (4.5, 6, 7.2, 8.5, 10) concentración de sustrato (8, 7.5, 6.5, 3.5, 1), temperatura (0°C, temperatura ambiente,50°C y 80°C) y tiempo (10,20,30,40,50 minutos), estos factores alteran la velocidad enzimática. Para comparar, justificar e interpretar las mejores condiciones de los cuatro factores mencionados sobre los cuales la enzima logra su máxima velocidad.

Resultados y Observaciones Cuadro 1: Efecto del tiempo en la velocidad de reacción Cuadro que corresponde a la parte de la experimentación que llevamos a cabo Foto

Tiem po (Min)

V. de tit. blanco

V de tit. proble ma

V de tit. corregi do

µmoles de urea hidroliza dos

10

.3 mL

.5 mL

.2mL

10

20

.3 mL

1.1 mL

.8 mL

40

30

.6 mL

1.3 mL

.7 mL

35

40

.1 mL

.5 mL

.4 mL

20

50

.4 mL

.5 mL

.1 mL

5

Observaciones: El volumen de titulación fue obtenido a partir del volumen gastado de HCl hasta el momento del vire de amarillo a color canela Cuadro2: Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción Tabla que corresponde a la parte de la experimentación que llevamos a cabo T(C°)

Foto

V. de tit. blanc o

V. de tit. proble ma

V. de tit. corregi do

µmoles de urea hidroliz ada

0°

.7

.1

-.6

-30

24°

.8

.2

-.6

-30

50°

.8

.9

.1

5

80°

.8

.2

-.6

-30

Cuadro 3: Efecto del tiempo en la velocidad de reacción Resultados que se obtuvieron por mesa Vol. De titulación corregido

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

tiempo .2 10 .7 .5 .8 20 ---.8 .7 30 .3 1.1 .4 40 .7 1.2 .1 50 .6 1.3 Cuadro 4: Efecto del pH en la velocidad de reacción

Mesa 4

Mesa 5

.3 .4 .5 .6 .7

-3 .6 .9 1 .9

Resultados que se obtuvieron por mesa Vol. De titulación corregido

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

pH 4.5 6 7.2 8.5 10

2.5 3.4 1.4 1.8 -.8

.5 3.7 2 -------------

1.5 4.1 .7 1.9 1.2

2.9 4 2.9 2.2 1.5

2.7 1 2.3 1.6 -------

Cuadro 5: Efecto de la concentración en la velocidad de reacción Resultados que se obtuvieron por mesa Vol. De titulación corregido

Tubo [S] 1 2 3 4 5

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

----------------

.8 1.7 2.5 3.8 2.7

.5 1.2 1,6 1.9 2.1

.7 1.5 1 2.3 ----

----------------

Cuadro 6: Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción Resultados que se obtuvieron por mesa Vol. De titulación corregido T° 0° 24° 50° 80°

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

0 0 .1 0

.3 1.3 3.3 ----

.3 .4 3.2 .4

.6 .5 .3 ----

-------------

Análisis de Resultados Nuestros resultados no fueron exactos e incluso algunos datos numéricos no coinciden con el resto, debido a que la prueba depende mucho de la percepción que se tenga del color del indicador para detener la titulación.

En el cuadro 3 estudiamos el efecto del tiempo en una reacción enzimática. Esta prueba fue realizada a factores óptimos y constantes, en nuestros resultados obtenidos encontramos que los tiempos en que hubo una mayor cantidad de productos fue al dejar transcurrir la reacción por 20 y 30 minutos, y al observar nuestra curva observamos que la velocidad de reacción desciende con el tiempo, esto puede ser debido a varios factores como: 



Que si la reacción es significativamente reversible, la velocidad de la reacción inversa aumentara según aumente la concentración de producto, por tanto descenderá la velocidad de transformación de sustrato. Si no se proporciona suficiente sustrato en exceso, su concentración descenderá significativamente durante el desarrollo de la reacción causando un descenso progresivo en la velocidad. (J.G. Morris, 2001)

Por lo que no se obtuvo una cantidad óptima de producto a los 10 min. debido a que apenas estaba transcurriendo la reacción y tampoco se obtuvo a los 40 y 50 min. debido a que quizá la concentración de sustrato ya era mínima o que la reacción se hubiera regresado por la cantidad significativa de productos. Al estudiar el efecto del pH en la velocidad de reacción cuyos resultados podemos observar en el cuadro 4, encontramos al llevar a cabo nuestra curva salió con una forma de campano más o menos simétrica, donde el valor mayor corresponde al pH óptimo de la enzima; la mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la velocidad de reacción disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos. De ahí la conocida importancia biológica de los sistemas buffer. (Campbell y Reece, 2007). El pH óptimo de la ureasa es de 7.2. (Macfaddin, 2003). En el cuadro 5 observamos el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción, aquí se observó que la concentración del tubo 4 fue la más óptima debido que en el tubo 5 descendió la cantidad de producto ya que en toda reacción catalizada por un enzima, si se mantiene constante la concentración del E, la velocidad de la reacción aumenta exponencialmente al incrementarse la concentración del sustrato, ya que al existir más moléculas de sustrato es más probable el encuentro con la enzima y la formación del complejo E-S. Este aumento de velocidad es rápido para concentraciones bajas de sustrato y, a medida que este aumenta, se va haciendo más lento hasta que la concentración del sustrato alcanza un cierto valor, a partir del cual, aunque aumente la concentración del mismo, no aumenta la velocidad de la reacción. Esto es debido a que el enzima está saturada por el sustrato; es decir, todas las moléculas del

enzima están unidas al sustrato formando el complejo E-S. Cuando ocurre esto, se dice que la reacción ha alcanzado la velocidad máxima. (Fuentes, Castiñeiras y Queraltó, 2000). Al observar nuestra curva nos da como resultado una hipérbola donde a un cierto valor de concentración del sustrato se observa que la velocidad de reacción es constante, en este punto es donde se dice que se ha alcanzado la velocidad máxima el resultado de esta hipérbola se da desarrollando el modelo matemático de Michaelis y Menten. El efecto de la temperatura observado en el cuadro 6, donde se observa que la temperatura a la cual se obtiene mayor producto es a 50° C al igual que con el pH las enzimas poseen una temperatura óptima especifica donde alcanzan una actividad máxima Esto se debe a que al aumentar la temperatura aumenta el movimiento de las moléculas y por tanto aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el E, en cambio cuando se produce un brusco descenso de la actividad es cuando se alcanza una temperatura crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. (Curtis. Barnes. Schnek y Massarini, 2008). La curva obtenida al igual que en pH fue en forma de campana donde el punto máximo corresponde a la temperatura óptima de la ureasa que fue de 50° C.

Graficas 0.5 mL de urea

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250 μmol de urea 12 μmol de urea 1 mmol 0.012 mmol urea = = =0.0012 M 1 mL de urea 1000 μmol 10 mL

1 mL de urea

250 μmol de urea 250 μmol de urea 1 mmol 0.25 mmol urea = = =0.025 M 1 mL de urea 1000 μmol 10 mL

2 mL de urea

250 μmol de urea 500 μmol de urea 1 mmol 0.5 mmol urea = = =0.05 M 1mL de urea 1000 μmol 10 mL

5 mL de urea

250 μmol de urea 1250 μmol de urea 1 mmol 1.25 mmol urea = = =0.125 M 1mL de urea 1000 μmol 10 mL

7.5 mL de urea

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250 μmol de urea 1875 μmol de urea 1 mmol 1.875 mmol urea = = =0.1875 M 1mL de urea 1000 μmol 10 mL

Concentración del sustrato [s] mmol/mL x 0.0012 0.025 0.05 0.125 0.1875 Concentración del sustrato [s] mmol/mL x 0.0012 0.025 0.05 0.125 0.1875

VTC

µmol de urea hidrolizada y

-

-

VTC

µmol de urea hidrolizada y

0.8 1.7 2.5 3.8 2.7

40 85 125 190 135

Efecto de la [S] en actividad enzimática de la ures

Velocidad de reacción (µmol de urea hidrolizada)

[S] (mmol/mL)

Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012

Inversa de µmol de urea hidrolizada Y 40

Velocidad enzimática con respecto a la [S]

40 20 8

85 125 190 135

1 0.1875

Al aplicar regresión lineal se obtiene

y=−0.118 x +136.398

Donde según la ecuación de Lineweaver-Burk:

1 Km 1 1 = + v Vmax [S] Vmax

Y= la inversa de la velocidad X= la inversa de concentración del sustrato -0.118= El cociente de la Km y la velocidad máxima. 136.398= Es la inversa de la velocidad máxima Al aplicar esta ecuación se obtienen los siguientes datos y la siguiente gráfica

Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012 40 20 8

1 0.1875

Inversa de velocidad con regresión lineal (1/µmol) Y 38.0647 131.678 134.038 135.454 135.7687

Grafico de Lineweaver-Burk que expresa la Km y Vmax. 160 140 120 100

Relación de las inversas de la velocidad con respecto a la del sustrato

80 1/v (1/micromol )

60 40 20 0 200 0

600 400

1000 800

1/[S] (1/mmol/mL)

Concentración del sustrato [s] mmol/mL X 0.0012 0.025 0.05 0.125 0.1875

VTC

µmol de urea hidrolizada y

0.5 1.2 1.6 1.9 2.1

25 60 80 95 105

Efecto de [S] en actividad enzimática de ureasa

Velocidad de reacción (µmol

[S] mmol/mL

Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012 40 20 8

1 0.1875

Inversa de 1/µmol de urea hidrolizada Y 25 60 80 95 105

Al realizar regresión lineal se obtiene.

y=−0.0752 x+86.6422 Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012 40 20 8

Inversa de velocidad con regresión lineal (1/µmol) Y 23.9755 83.6342 85.1382 86.0406

de urea hidrolizada)

Velocidad enzimática con respecto a la [S]

1 0.1875

86.2411

Valores Y 100 90 80 70 60

Valores Y

50 40 30 20 10 0 0

100

200

Concentración del sustrato [s] mmol/mL x 0.0012 0.025 0.05 0.125 0.1875

300

400

500

600

700

VTC

µmol de urea hidrolizada y

0.7 2.5 1.0 2.3 -

35 125 50 115 -

800

900

Efecto de la [S] en la activiad enzimática de ureasa

Velocidad d recacción (µmol de urea hidrolizada)

[S] mmol/mL

Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012

Inversa de µmol de urea hidrolizada Y 35

40 125 20 50 8 115 Al hacer regresión lineal se obtiene=

y=−0.0753+98.2144 Inversa de [s] mL/mmol X

1 0.0012 40 20 8

Inversa de velocidad con regresión lineal (1/µmol) Y 35.4644 95.2024 96.7084 97.612

Velocidad enzimática con respecto a la [S]

Valores Y 120 100 80 Valores Y 60 40 20 0 0

100

200

Concentración del sustrato [s] mmol/mL x 0.0012 0.025 0.05 0.125 0.1875

300

400

500

600

700

VTC

µmol de urea hidrolizada y

-

-

800

900

Conclusiones: Se puedo observar durante la titulación el cambio del indicador de amarillo a rojo-rosa y se obtuvieron los siguientes resultados como los mejores: En el efecto a causea del tiempo fue de 20 y 30 minutos se llega a la máxima velocidad, ya que la velocidad de reacción desciende con el tiempo. Durante el uso y la medición del efecto de la enzima con efecto del pH óptimo de la ureasa es de 7.2 ya que se llega a la máxima velocidad. Para el caso de la concentración de sustrato, el mejor volumen fue el de 3.5 (tubo 4) ya que si se mantiene constante la concentración del E, la velocidad de la reacción aumenta exponencialmente al incrementarse la concentración del sustrato. Esto es debido a que el enzima está saturada por el sustrato; es

decir, todas las moléculas del enzima están unidas al sustrato formando el complejo E-S. Al expresar los resultados de forma grafica el resultado es una hipérbola donde se observa que la velocidad de reacción es constante, en este punto es donde se dice que se ha alcanzado la velocidad máxima el resultado de esta hipérbola se da desarrollando el modelo matemático de Michaelis y Menten. Sobre el efecto de la temperatura se observa que la máxima velocidad es a 50°C ya que aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el E Por ende se puede concluir que estos factores son cruciales para que la enzima pueda llevar a cabo la degradación de manera rápida, eficiente y seguir conservando su actividad biológica.

Bibliografía: J.G. Morris, 2001, Fisicoquímica para biólogos, 2da edición, Editorial reverte, Barcelona, España, pág. 277-278. Campbell y Reece, 2007, Biología, Séptima Panamericana, Madrid, España, pág. 152.

edición,

Editorial

Medica

Macfaddin, 2003, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3era edición, Editorial medica Panamericana, Buenos Aires, Argentina, pág. 398. Fuentes, Castiñeiras y Queraltó, 2000, Bioquímica clínica y Patología molecular volumen 1, Segunda edición, Editorial Reverte, Barcelona, España, pág. 448. Curtis, Barnes, Schnek y Massarini, 2008, Biología, Séptima Edición, Editorial Medica Panamericana, Madrid, España, pág. 87.