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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDARIZADO

Código:

A01-V01

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DETERMINACION DE METANOL EN SANGRE. METODO ESPECTROFOTOMETRICO DIRECTO/ METODO DE WILLIAMS, L.A.; Linn, R.A. y Zak, B. Página 1 de 7

DETERMINACION DE METANOL EN SANGRE. METODO ESPECTROFOTOMETRICO DIRECTO/METODO DE WILLIAMS, L.A.; Linn, R.A. y Zak, B. ELABORADO POR: ZULY KELY ZAMBRANO INGA.

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Analista

Dr. Alfonso Apesteguia Director

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1.- OBJETIVO: Determinar metanol en sangre, mediante la cuantificación de metanal por espectrofotometría Directa. 2.- ALCANCE: El método es aplicado y desarrollado en el CICOTOX. 3.- RESPONSABILIDAD: Es responsable el personal que realiza los analisis en el CICOTOX. 4.- DEFINICIONES: Reactivo controlado: Sustancia química denominado dentro de la ley peruana como “Insumos químicos y productos fiscalizados, maquinarias y equipos utilizados para la elaboración de drogas ilícitas” según D.S N.-348-2015-EF. La cuales estan controladas por ser sustancias químicas que intervienen en la fabricación de drogas ilícitas. Su utilización debe ser anotada en el F28-V01-KARDEX DE REACTIVOS CONTROLADOS. 5.- FUNDAMENTO: El metanol presente en la sangre es oxidado a metanal por el permanganato de potasio en un medio acido. El metanal generado reacciona con el ácido cromotrópico (cromóforo) en medio acido formando un compuesto de color purpura este podrá ser detectado a la longitud de onda de 570 nm. En el espectrofotómetro UV-Vis. 6.- SEGURIDAD Y CONDICIONES AMBIENTALES  Uso de equipos de protección personal, guantes de nitrilo, mascarilla N-95, gorro, mandil y botas (descartables).  Uso de equipos de protección colectiva: cabina de seguridad clase 1.  Los remanentes de muestras después de los ensayos son retirados o eliminados en condiciones de seguridad del laboratorio.  Todo material contaminado se debe colocar en contenedores de bioseguridad para su posterior eliminación.  Las muestras biológicas deben considerarse potencialmente infecciosos y manipularlos con mucha precaución. ELABORADO POR: ZULY KELY ZAMBRANO INGA.

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7. MATERIALES Y REACTIVOS 7.1.1. MATERIALES, APARATOS Y EQUIPOS. - Balanza, capacidad de 0,01g. - Baño María 20-900C. - Espectrofotómetro UV/Vis. - Matraces aforados, 100ml. Y 10ml. - Pipeta 5ml. - Micropipeta, 100-1000ul. - Vasos precipitados, 100ml. 7.1.2. DROGAS:      

Acido sulfúrico p.a. Acido tricloroacético p.a. Permanganato de potasio p.a. Bisulfito de sodio p.a. Ácido cromotrópico p.a. Alcohol metílico p.a. 7.1.3. REACTIVOS

- Solución acuosa saturada de bisulfito de sodio (preparación reciente) - Solución acuosa de Ácido sulfúrico al 10% (V/V) - Solución Madre de Metanol de 0,79mg/ml. - Solución acuosa de Ácido cromotrópico al 0.5% (de preparación reciente) - Solución acuosa sulfúrica de tricloroacético al 10% - Solución acuosa de Permanganato de potasio al 5 %. ELABORADO POR: ZULY KELY ZAMBRANO INGA.

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7.1.4. PREPARACION DE LOS REACTIVOS: o Preparación de la solución de Ácido Cromotrópico al 0,05%, se pesa 5g. de ácido cromotrópico y afora a 100ml.; con H2O(D) en un matraz aforado. o Preparación de la solución de Acido tricloroacético al 10%, se pesa 10g. y se afora a 100ml.; con H2O(D). o Preparación de la solución de Bisulfito de sodio al 10%, se pesa 10g.de NaHSO3 y se afora a 100ml.; con H2O(D). o Preparación de la solución de Permanganato de Potasio al 5%, se pesa 5g. de KMnO4 y se afora a 50ml.; con H2O(D). o Preparación de la Solución de ácido sulfúrico al 10% v/v, se toma 10ml. H2SO4 (c) y se afora a 100ml.; con H2O(D). o Tomar 1ml. De metanol puro y llevar a 1 lt. Con acido sulfúrico al 10% V/V. Conservar en recipiente bien cerrado, en heladera (4OC). o Solución hija de metanol de 0.079 mg/ml. o Tomar 10ml. De la solución madre y llevar a 100ml. Con acido sulfúrico al 10% V/V. Conservar en recipiente bien cerrado, en heladera (4OC). o Vaselina-parafina en la proporción apta para ser utilizada según la temperatura. o Soluciones testigo de alcohol metílico para la curva de calibración:

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TABLA 01. Proceso de preparación de estándares. ESTANDAR

Vol. Sol. Hija

Aforar con H2SO4 al 10%v/v

Vol. final

Masa (ug)

St. 1

0.1 ml.

0.9 ml.

1ml

7,9

St. 2

0.2 ml.

0.8 ml.

1ml

15,8

St. 3

0.3 ml.

0.7 ml.

1ml

23,7

St. 4

0.5 ml.

0.5 ml.

1ml

39,5

St. 5

0.7 ml.

0.3 ml.

1ml

55,3

St. 6

1.0 ml.

-

1ml

79.0

8.- PROCEDIMIENTO:  A 0.5ml de sangre o suero agregar 9.5ml. de solución acuosa sulfúrica tricloroacético, centrifugar x 5” a 2000-3000 r.p.m. Se trabaja con el sobrenadante.  Reacción de color; Se procesa paralelamente un blanco de reactivos y un blanco de muestras.  Proseguir de la siguiente manera, en tubos de ensayo:

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Reactivos

Blanco Reactivo

Blanco muestra

Muestra

Testigo

H2SO4 al 10%v/v

1ml.

-

-

0.5ml.

Vol. Sol. Hija

-

-

-

0.5ml.

Vol. Sobrenadante

-

1ml.

1ml.

-

KMnO4 5% P/V

0.1 ml.

0.1 ml.

0.1 ml.

0.1 ml.

MEZCLAR. DEJAR EN REPOSO X 5“ NaHSO3 hasta decoloración total (1 gota) del sol. Sat.

c.s.

c.s.

c.s.

c.s.

Ac. cromotrópico

0.2ml

0.2ml

0.2ml

0.2ml

Colocar en baño de hielo y agregar lentamente. 6 ml.

H2SO4 concentrado

6 ml.

6 ml.

6 ml.

Llevar a BM: 60-100oC durante 5”. Enfriar y leer a 570 nm.

9.- CALCULOS: Interpolar el valor de absorbancia obtenido en la curva de calibración, la cual esta graficada como Absorbancia en función de Masa (en ug). Luego hacer el calculo para expresar el resultado en g/l. MeOH (g/l) = masa (ug) x 0.02

10.- SENSIBILIDAD: 0.030 g/l.

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11.- INTERFERENCIAS: Heparina, EDTA. Formalina, Metenamida. El efecto deshidratante del H2SO4 concentrado, puede producir formaldehido a partir de compuestos orgánicos apropiados, con lo cual se obtendrá un falso positivo. Por esta razón, pacientes con severa acidosis pueden dar positiva la reacción. Otros compuestos que reaccionan con el ácido cromotrópico: el gliceraldehido, furfural, arabinosa, fructosa y sucrosa dan una coloración amarrilla. Grandes concentraciones de furfural dan un color rojizo. 12.- INTERPRETACION: Valores Normales: no dosable Una concentración superior a 0,8g/l de metanol indica severidad de la intoxicación y riesgo de muerte para el paciente. 13.- REFERENCIAS R.J. Flanagan; R.A. Braithwaite; S.S. Brown; B. Widdop and F.A. de Wolff “Basic Analytical Toxicology”; 2007- Argentina. F28-V01-KARDEX DE REACTIVOS CONTROLADOS.

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