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• Catalina Gajardo

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Universidad del Bío-Bío - Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a la Biología

SESIÓN 1 “El  microscopio óptico”  I.‐ Introducción:  El  microscopio  es  un  instrumento  óptico  mecánico  destinado  a  examinar  objetos  muy pequeños, ampliando considerablemente su imagen.  Existen microscopios simples o  lupas  constituidos  por  una  sola  lente  convergente  y  microscopios  compuestos  (o  simplemente  microscopio)  formados  por  tres  sistemas  de  lentes  convergentes:  condensador, objetivo y ocular.  1611 

Kepler sugirió la manera de construir un microscopio compuesto 

1655 

Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas pequeñas  celdillas en los cortes de corcho a las que denominó "células". 

1674 

Leeuwenhoek informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años  más tarde observó por primera vez bacterias. 

1833 

Brown publicó sus observaciones microscópicas de las orquídeas, y describió  claramente el núcleo celular. 

1838 

Schleiden y Schwann propusieron la teoría celular, afirmando que la célula  nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y los animales. 

1857 

Kolliker describió las mitocondrias de las células musculares. 

1876 

Abbé analizó los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el  microscopio y mostró la manera de optimizar el diseño de los microscopios. 

1879 

Flemming describió con gran claridad el comportamiento de los cromosomas  durante la mitosis de las células animales 

1881 

Retzius describió muchos tejidos animales con una precisión que aún no ha  sido superada por ningún especialista en microscopía óptica. En las dos  décadas siguientes, tanto él como Cajal y otros histólogos, diseñaron  métodos de tinción y establecieron las bases de la anatomía microscópica. 

1882 

Koch utilizó colorantes de anilina para teñir microorganismos e identificó las  bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. En las dos décadas  siguientes, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur, identificaron los  agentes causantes de otras muchas enfermedades examinando al  microscopio preparaciones teñidas.  1 | M i c r o s c o p i o   ó p t i c o  

 

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1886 

Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abbé, que permitieron a  los especialistas en microscopía la resolución de estructuras situadas en los  límites teóricos de la luz visible. 

1898 

Golgi observó por primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando  células con nitrato de plata. 

1924 

Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica  autorradiográfica para localizar el polonio radiactivo en las muestras  biológicas. 

1930 

Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de contraste  interferencial. En 1932, Zernicke inventó el microscopio de contraste de  fases. Estos dos adelantos permitieron observar por primera vez células vivas  no teñidas en detalle. 

1941 

Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar  antígenos celulares. 

1952 

Nomarski ideó y patentó el sistema de contraste interferencial para el  microscopio óptico., que aún lleva su nombre. 

1981 

Allen e Inoué perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video‐ amplificada.  Tabla 1: Reseña histórica de la microscopia óptica (MO) 

  II.‐ Componentes del microscopio de Campo Claro u Óptico Corriente:  Existen dos factores importantes en microscopía y son: MAGNIFICACION y RESOLUCION.  MAGNIFICACION  (o  aumento)  se  define  como  las  veces  que  un  objeto  se  agranda  en  relación a su tamaño real.   RESOLUCION es una medida de la distancia mínima que existe entre dos puntos para ser  distinguidos  como  dos  puntos  separados.  Por  ejemplo,  lo  que  pareciera  ser  una  estrella  cuando se mira al cielo puede ser en realidad dos estrellas con ayuda de un telescopio. Por  lo tanto, el telescopio tiene mayor capacidad de resolución.  Sin  embargo,  así  como  el  ojo  humano  es  limitado,  el  poder  de  resolución  de  un  microscopio  o  telescopio  también  es  limitado.  Los  microscopios  pueden  diseñarse  para  magnificar  objetos  tanto  como  sea  posible,  pero  la  luz  del  microscopio  nunca  podrá  2 | M i c r o s c o p i o   ó p t i c o    

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resolver  detalles  más  finos  que  0.2  μm,  el  tamaño  de  una  pequeña  bacteria  o  de  una  mitocondria.  Esta  resolución  no  se  puede  mejorar,  está  limitada  por  la  LONGITUD  DE  ONDA DE LA LUZ VISIBLE usada para iluminar el espécimen. Los microscopios de luz sólo  pueden magnificar objetos efectivamente hasta 1500 veces, más magnificación implicaría  que  el  objeto  se  viera  borroso.  Lo  que  se  ha  ido  mejorando  en  microscopía  de  luz  es  el  CONTRASTE de aquellos objetos que puedan ser resueltos por el microscopio en uso.  La  mayoría  de  las  estructuras  subcelulares,  u  organelos,  son  muy  pequeños  para  ser  resueltos  con  el  microscopio  de  luz.  La  biología  celular  avanzó  rápidamente  desde  la  década del 50 con la introducción del microscopio electrónico. En vez de usar luz visible, el  MICROSCOPIO  ELECTRONICO  enfoca  un  haz  de  electrones  a  través  del  espécimen.  Microscopios  electrónicos  modernos  pueden  alcanzar  una  resolución  de  aproximadamente  0.2  nanómetros  (nm),  mil  veces  mejor  que  el  microscopio  de  luz.  Los  biólogos usan el término ULTRAESTRUCTURA CELULAR para referirse a la anatomía celular  resuelta por un microscopio electrónico. Una foto obtenida con un microscopio de luz a  veces se llama FOTOMICROGRAFIA, y una foto que resulte del microscopio electrónico se  llama  MICROGRAFIA  ELECTRONICA  DE  TRANSMISION  o  de  BARRIDO  según  sea  el  microscopio electrónico que se use.   Existen  dos  tipos  de  microscopio  electrónico:  el  MICROSCOPIO  ELECTRONICO  DE  TRANSMISION (TEM) y el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM). El TEM dirige  un haz de electrones a través de una sección muy delgada del espécimen, similar a lo que  sucede en un microscopio de luz. Sin embargo, en vez de usar lentes de vidrios, los cuales  son  opacos  a  los  electrones,  el  TEM  usa  electroimanes.  Los  electroimanes  actúan  como  lentes  que  enfocan  y  magnifican  la  imagen  cambiando  la  dirección  de  los  electrones  cargados. La imagen últimamente se enfoca en una pantalla para examinarla o en un film  fotográfico para tener un registro permanente. Para aumentar el contraste en la imagen,  secciones  muy  delgadas  del  espécimen  se  tiñen  con  átomos  pesados  de  metales,  los  cuales se adhieren a ciertos lugares en las células.  Los biólogos celulares usan el TEM principalmente para estudiar la ultraestructura interna  de las células. El SEM es especialmente útil para el estudio detallado de la superficie del  espécimen.  El  haz  de  electrones  cubre  (o  barre)  la  superficie  de  la  muestra,  la  cual  generalmente está recubierta con una pequeña lámina de oro. El haz de electrones excita  electrones sobre la superficie de la muestra, y estos electrones secundarios se colectan y  se  enfocan  en  una  pantalla,  formando  una  imagen  de  la  topografía  del  espécimen.  Un  atributo importante del SEM es su gran profundidad de penetración, la cual resulta en una  imagen tridimensional. 

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El  microscopio  electrónico  revela  muchos  organelos,  imposible  de  resolver  con  el  microscopio  de  luz.  Sin  embargo,  el  microscopio  de  luz  ofrece  muchas  ventajas,  especialmente  para  el  estudio  de  células  vivas.  Una  desventaja  del  microscopio  electrónico es que los métodos químicos y físicos usados para preparar el espécimen no  sólo mata células, sino que también introduce artefactos, estructuras físicas que se ven en  la micrografía que no existen en la célula viva.  En  este  laboratorio  usaremos  el  microscopio  compuesto.  Las  principales  partes  de  un  microscopio compuesto son:  Sistema Mecánico  a. Pié: es la base de sustentación.  b. Columna: región articulada del pié.  c. Platina: plataforma horizontal que sustenta al espécimen o preparación.  d. Tubo: lleva en su extremo superior la lente ocular y en el inferior el objetivo.  e. Revólver o tambor: pieza giratoria que lleva los objetivos.  f.  Tornillos  de  focalización:  al  rotarlos  cambian  el  enfoque  del  microscopio,  lo  cual  lo  logran  variando  la  distancia  entre  el  objetivo  y  la  platina.  Existen  dos  movimientos,  macrométrico (enfoque aproximado y grueso), micrométrico (enfoque de precisión).    Sistema de iluminación  a. Fuente luminosa: puede ser natural o artificial. Si es natural se utiliza un espejo de cara  plana. Si es artificial puede o no haber espejo, si hay espejo se utiliza por el lado cóncavo.  b.  Condensador:  dispositivo  formado  por  un  sistema  de  lentes  que  concentra  los  rayos  luminosos  en  el  espécimen.  Su  mayor  utilidad  la  presta  cuando  se  encuentra  a  una  distancia de ~2 cm del espécimen. Ubique el mejor punto por ensayo y error.   c. Diafragma: está ubicado en el condensador y sirve para regular la cantidad de luz que  llega a la preparación. Su diámetro se puede variar por medio de una placa horizontal que  se cierra o abre a voluntad del operador.  d. Anillo porta filtro: generalmente se utiliza un filtro de color verde pues así descansa más  la  vista.  La  longitud  de  onda  modificada  con el uso  del  filtro  influye en  la  resolución  del  microscopio (ver “resolución” más adelante).    Sistema de amplificación  a. Lentes oculares: son sistemas ópticos ubicados en la parte superior del tubo, próximo al  ojo del observador. Los oculares están formados por dos lentes planas, convexas, simples  o  compuestas  separadas  por  un  diafragma  interno.  El  lente  inferior  se  llama  lente  de  campo, su propósito no es aumentar la imagen sino recoger la mayor cantidad de rayos  divergentes que vienen del objetivo. Este tiene su foco en el diafragma y ahí la imagen es  4 | M i c r o s c o p i o   ó p t i c o    

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aumentada por la parte superior. Los oculares más usados tienen un aumento de 6X, 8X,  10X, 16X, 20X.  b.  Lentes  objetivos:  sistemas  de  lentes  acomodadas  en  el  revólver.  En  el  objetivo  está  inscrita la magnificación y la apertura numérica.                        Figura 1: Esquema de un microscopio óptico (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993)

III.‐ Principios físicos implicados en la función de aumento del objeto en el microscopio  óptico.  El ojo humano sólo puede resolver estructuras de aproximadamente 0,1 mm (100  µm).  La mayoría de las células son de dimensiones muchísimo menores, y requieren de  todo el poder resolutivo del microscopio óptico para poder ser estudiadas.  El término poder de resolución (PR) expresa la capacidad de un sistema óptico de  discriminar detalles muy finos, de distinguir o resolver dos puntos muy cercanos entre sí.   El PR es inversamente proporcional al límite de resolución (d), que es la menor distancia  que  debe  existir  entre  dos  puntos  para  que  puedan  ser  individualizados  como  unidades  separadas.      PR = 1 / d 

   

 

 

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  Si  consideramos  dos  objetos  luminosos  muy  pequeños  e  igualmente  brillantes,  cada uno nos proporciona una imagen, que no es puntual, sino un disco central brillante  rodeado  de  uno  o  varios  anillos  difusos  de  luz,  llamados  “discos  de  Airy”.    Si  acercamos  estos  dos  puntos,  llega  un  momento  en  el  cual  se  sobreponen.    El  punto  exacto  de  sobreposición depende de varios factores, entre ellos la agudeza visual del observador.  Se  ha  propuesto  que  los  discos  de  Airy  se  resuelven  como  unidades  separadas  cuando  la  distancia entre los centros es superior al radio del primer anillo oscuro de difracción.  La  difracción  óptica  se  debe  a  la  interferencia  entre  ondas  que  han  viajado  por  caminos  levemente  diferentes,  a  través  de  un  sistema  óptico.    Existe  una  fórmula,  la  ecuación  de  Abbé  que  expresa  matemáticamente  la  magnitud  del  efecto  de  difracción  y  establece el límite de resolución de cualquier sistema óptico.  Dos puntos se resuelven, si  los centros de los discos de Airy están en una distancia igual o mayor que d.     

  d = 0,61 x 

 

    

  Donde: d = límite de resolución   

0,61 = constante, cuyo valor teórico depende de las condiciones del sistema,  Influyendo coherencia de la luz, criterio de visibilidad y naturaleza del objeto.  Delta = longitud de onda.  AN = abertura numérica.  n = índice de refracción del medio.  sen alfa = semi ángulo de abertura. 

La abertura numérica es función del ángulo del cono de luz que emerge del objeto,  y  que  es  captado  por  la  lente  objetiva.    La  AN  se  define  matemáticamente  como  la  resultante  de  la  multiplicación  del  seno  de  la  mitad  del  ángulo  de  abertura  de  la  lente  (alfa) por el índice de refracción del medio a través del cual pasa la luz (n).   

  AN = n x sen  

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  Como el seno de alfa no puede ser mayor que 1, y el aire tiene un n = 1, se utilizan  objetivos de inmersión que emplean medios de mayor índice de refracción (n =1,5), con el  objeto de aumentar la abertura numérica.  La figura 2 se ha dividido en dos mitades.  La  mitad  derecha  de  muestra  que  en  lentes  de  AN  baja,  los  índices  de  refracción  del  portaobjetos, cubreobjetos y del aire provocan un desvío de la luz incidente.  Al colocar un  medio de mayor índice de refracción, como el aceite de inmersión, entre el cubreobjeto y  la lente frontal, se neutraliza el efecto de la refracción de luz, obteniéndose una imagen  de mayor nitidez.   

        Figura 2: Ángulos de abertura del portaobjeto y de la lente (tomado de Spotorno y  Hoecker, 1993)     

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El  límite  de  resolución  es  directamente  proporcional  a  la  longitud  de  onda,  e  inversamente  proporcional  a  la  abertura  numérica  de  la  lente  objetiva.    Si  se  desea  aumentar  el  poder  de  resolución  y  obtener  mayor  información,  existen  dos  cambios:  aumentar la apertura numérica o disminuir la longitud de onda.  En relación a la primera  posibilidad existen limitaciones, incluso mejorando el diseño de las lentes.  Por esta razón  el  esfuerzo  de  los  investigadores  de  principios  del  siglo  XX,  se  centró  en  la  segunda  alternativa.  Si  calculamos,  aplicando  la  fórmula  de  Abbé,  vemos  que  utilizando  como  fuente  luminosa la longitud de onda de 20,52 um (520 nm) y una AN de 1,5, se alcanza un limita  de resolución de 0,2 um (200 nm).  Es decir, el microscopio óptico está limitado a resolver  sólo partículas mayores que la mitad de la longitud de onda de la luz visible.  Sin embargo, es necesario recordar que ninguna lente es capaz de formar un punto  imagen  perfecto  de  una  fuente  puntual,  debido  a  las  llamadas  “aberraciones  de  las  lentes”.  Las  principales  aberraciones  producidas  son:  aberración  esférica,  cromática,  astigmatismo, coma, distorsión, curvatura de campo.  1.‐  Aberración esférica: este defecto se debe a la incapacidad de la lente de concentrar  todos los rayos que la atraviesan en un foco común.  Los rayos incidentes más próximos al  eje,  luego  de  refractarse,  se  cortan  en  un  punto  más  distante  que  los  rayos  periféricos,  produciéndose una imagen poco nítida.  2.‐ Aberración cromática: surge porque los ayos que componen la luz blanca se refractan  diferencialmente,  de  acuerdo  a  la  longitud  de  onda.    Así,  los  de  menor  longitud  se  refractan más que los de mayor longitud de onda, dando puntos focales diferentes.  3.‐  Astigmatismo:  este  defecto  se  debe  a  la  imposibilidad  práctica  de  construir  lentes  perfectamente  simétricas.    Todas  las  lentes  tienen  una  distancia  focal  en  una  dirección  que es levemente diferente a la distancia focal en otra dirección, produciendo diferentes  focos.  4.‐ Coma: es una aberración que ocurre en imágenes de objetos localizados lateralmente  al eje óptico del lente, produciendo un alargamiento de la imagen.  Así, la imagen de un  punto toma el aspecto de una coma.  5.‐  Distorsión:  es  una  aberración  que  modifica  la  forma  de  las  imágenes,  ya  que  las  imágenes formadas por los rayos periféricos están en un plano diferente que las formadas  por los rayos axiales. 

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 6.‐ Curvatura de campo: se produce en imágenes de mayor aumento, las cuales tienden a  ser  curvas,  lo  que  perjudica  su  calidad  e  impide  que  todo  el  campo  se  observe  en  foco  simultáneamente.  IV.‐ Formación de la imagen en el microscopio óptico  La lente objetiva forma una imagen real, invertida y aumentada del objeto.  Esta  imagen  intermedia  actúa  como  objeto  para  el  lente  ocular,  y  se  encuentra  situada  de  manera tal, que la imagen formada por el objetivo cae en la distancia focal (la distancia  focal es la distancia que existe entre el foco principal de la lente y su centro geométrico).   De  esta  forma,  el  ocular  proporciona  una  imagen  final  que  es  virtual  (dada  por  la  proyección de los rayos), de mayor tamaño e invertida con respecto al objeto.   

  Figura 3: Formación de la imagen en el microscopio óptico (tomado de Spotorno y  Hoecker, 1993).  OBJETIVOS  a) Distinguir las partes del microscopio.  b) Familiarizarse con el uso del microscopio.  Actividades del Alumno:    En esta actividad usted tendrá ocasión de utilizar el microscopio óptico facilitado por  el  profesor  para  observar  tres  preparados.  Usted  deberá  observar  con  los  aumentos  lupa  (4x), menor (10x) y mayor (40x) un preparado que contiene una letra recortada al igual que  la  segunda  preparación  de  hilos  entrecruzados  de  colores.    Además,  para  tener  la  oportunidad de aprender a ocupar el lente inmersión (100x), usted observará un frotis de  bacilos. 

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  1.‐ Observación de: Letra      Material      Método      Tinción      Forma 

: cuadrado de papel de periódico  : corte directo  : sin tinción  : .................................................. 

  Observaciones: ..…......................................  ..........................................................................  ..........................................................................  ..........................................................................  ‐ Enfoque la preparación con aumento menor y ubique una zona en donde se encuentre  una letra.  ‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe el preparado  ‐ Haga el esquema correspondiente en el círculo adjunto de lo observado en aumento  mediano  Pregunta:  1.‐ Si la muestra se mueve con el carro hacia adelante, hacia donde se mueve la imagen?¿y  si  se  mueve  de  izquierda  a  derecha?.  Señale  las  propiedades  de  la  imagen  a  la  que  corresponde este fenómeno  ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...........................................................................................................................................   

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  2.‐ Observación de: hilos entrecruzados de colores      Material      Método      Tinción      Forma 

: hilo de cocer con color  : pegado directo  : textil  : .................................................. 

  Observaciones: ..…......................................  ..........................................................................  ..........................................................................  ..........................................................................    ‐ Enfoque la preparación con aumento menor y ubique una zona en donde los hilos estén  sobrepuestos.  ‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe que es lo que va pasando con la imagen que se  forma, en cuanto si puede ver texturas, tamaños, otros hilos, etc.  ‐  Haga  el  esquema  correspondiente  en  el  círculo  adjunto  de  lo  observado  en  aumento  mediano  Pregunta:  1.‐ Qué poderes del microscopio aumentan y cuáles disminuyen?. Señale además el ejemplo  de lo observado.  ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................. 

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Bibliografía:     -

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12 | M i c r o s c o p i o   ó p t i c o