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• Max George Samame Gomez

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VI. FUNDAMENTO

En ciertos casos, cuando es preciso destacar alguna estructura celular o tisular, se pueden emplear ciertas sustancias colorantes inocuas para la vida de las células y que tampoco modifican la estructura ni interfieren con sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloración vital.

La coloración vital puede ser de dos tipos:

Coloración intravital. Consiste con la administración de colorantes vitales a través de las vías digestiva e intratraqueal, sanguínea, linfática, subcutánea o intraperitoneal para demostrar actividad fagocítica de ciertas células (macrófagos del pulmón o del tejido subcutáneo, células de Küpffer o las dendríticas fagocíticas de los órganos linfáticos) o calcular la cantidad de determinados organelos celulares como las mitocondrias. Las soluciones de uso más común son la tinta china, carmín de litio y azul de tripán (partículas que demuestran la capacidad fagocítica).

Coloración supravital. Se emplean colorantes que se aplican a células o porciones tisulares extraídas de organismos vivos. Este tipo de coloración demuestra de manera específica componentes celulares como mitocondrias con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresilo, las ramificaciones nerviosas con el azul de metilo o el DNA y RNA de las células con naranja de acridina (mediante el microscopio de fluorescencia).

Coloración o tinción

Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos están listos para colorearse, una vez realizado el procedimiento de la práctica 1. El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al lavarse con el líquido que disuelve el colorante no se decolora. Es una sustancia colorante la que puede transferir su color a otro cuerpo. Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración:

Teoría física. Presupone que la coloración es un proceso físico de adsorción. De acuerdo con esto, las partículas de las sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intercelulares e intracelulares en los que se mantienen adheridas en razón de la cohesión molecular. Por ejemplo, la coloración de las grasas o lípidos es una tinción puramente física, pues el Sudán III o el Sudán IV se absorben por la facilidad que tienen para disolverse es estas sustancias.

Teoría química. El colorante se une a la sustancia coloreable íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en los componentes celulares o tisulares, que se unen a los cromógenos básicos o ácidos de los colorantes, respectivamente. Así se forman sales insolubles. De acuerdo con esta teoría, los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno.

El enlace iónico o electrostático ocurre cuando el colorante y la sustancia a teñir desarrollan diferentes cargas eléctricas y entonces se atraen la una a la otra; por ejemplo, el citoplasma se colorea porque las proteínas citoplasmáticas poseen carga eléctrica (+) y las partículas del colorante tienen carga eléctrica (-).

Existen varios criterios para clasificar los colorantes: Por su origen, pueden ser naturales y artificiales (sintéticos). Los colorantes naturales proceden de:

1. Animales, como el carmín, que se extrae de la cochinilla. 2. Vegetales., como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de Campeche”.

En cambio, los colorantes artificiales o sintéticos son productos derivados de la destilación de la hulla o carbón. Genéricamente se conocen como colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales y sintéticos se clasifican en:

1. Ácidos. Son sales cuya parte básica en incolora y el componente ácido posee color. Así, en la colorante eosina o eosinato de sodio la propiedad colorante se debe al ácido eosínico y no a la base, el sodio. Los colorantes ácidos tienen carga eléctrica negativa, por lo tanto, la designación correcta sería la de colorantes aniónicos. Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan acidófilas y químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos. Son ejemplos de ellas la

eosina, amarillo de metanilo, fucsina ácida, ácido pícrico, verde rápido, naranja G, safranina, azul de anilina, y otros. 2. Básicos. Son sales que poseen la base coloreada y la porción ácida incolora. Por ejemplo, el azul de metileno, o clorhidrato de azul de metileno debe su propiedad colorante a la base azul de metileno y no al ácido clorhídrico, que es incoloro. Poseen una carga eléctrica positiva y por lo tanto son colorantes catiónicos. Se les conoce también como colorantes nucleares porque tienen afinidad por los ácidos nucleicos (DNA y RNA). Las sustancias teñidas por los colorantes básicos se denominan “basófilas” y están constituidas por componentes ácidos. Son ejemplos de ellas la hematoxilina, rojo nuclear, azul de metileno, tionina, azul de toluidina, fucsina básica, entre otros. 3. Neutros. Son sales en las que tanto la parte básica como la ácida proporcionan color; por ejemplo, el eosinato de azul de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad de teñir de una manera simultánea los componentes nucleares y los citoplasmáticos e incluso pueden emitir colores distintos a determinados componentes citoplasmáticos, como las granulaciones específicas de los granulocitos (cierto tipo de glóbulos blancos o leucocitos). Forman parte de las fórmulas colorantes para frotis de sangre, como los colorantes de Wright, May Grunwald, Giemsa, Leischman, y otros. 4.

Indiferentes. No forman sales. Son compuestos no iónicos incapaces de producir la disociación electrolítica. Son insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos como el alcohol y también en las grasas o lípidos y, aunque poseen color, en realidad, es sentido estricto, no son colorantes.

Sobre la base de su solubilidad en las grasas, estas sustancias se emplean para demostrar la presencia de grasas en células y tejidos, pues tiñen selectivamente los lípidos. Son ejemplos de ellas el Sudán negro, Sudán III, Sudán IV y rojo oleoso.

Existe una serie de procedimientos por intermedio de los cuales células y tejidos se tiñen por lo colorantes. De acuerdo con ellos, las coloraciones se clasifican en:

1. Coloración directa o sustantiva: se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos se ponen en contacto con la solución colorante. El resultado indica una verdadera afinidad entre tejido y colorante. Ejemplo: la tinción de los núcleos por el azul de metileno. 2. Coloración indirecta o adjetiva: para que se lleve a efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo de sustancias intermediarias que faciliten la adherencia del colorante a las estructuras tisulares. La sustancia intermediaria utilizada se denomina “laca”. La mayoría de las soluciones colorantes de hematoxilina requiere un mordiente para que el colorante tenga efecto. 3. Coloración progresiva: se refiere a la marcha misma de la coloración y consiste en que los tejidos se ponen en contacto con la solución colorante para que, conforme transcurre el tiempo de coloración, el tejido, de manera progresiva, alcance la intensidad de tinción deseada. En dicho momento se detiene la coloración mediante lavado y eliminación del colorante sobrante.

4. Coloración regresiva: en este caso los tejidos se sobrecolorean con la solución de coloración para someterlos después a la acción de una sustancia denominada diferenciador, cuya función consiste en extraer parte del colorante. Mediante la observación al microscopio, el proceso de diferenciación se detiene cuando los componentes celulares o tisulares a colorear alcanzan la tinción deseada. 5. Coloración simple: se denomina así al procedimiento de coloración en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina. 6. Coloración compuesta o combinada: es la aplicación de varios colorantes a una muestra de tejido u órgano con objeto de destacar mediante colores diferentes estructuras específicas que forman parte de ella. Según esta clasificación, la coloración puede ser a su vez: Simultánea: cuando en una misma solución de coloración se mezclan varios colorantes. En este caso los tejidos reciben la tinción en el mismo momento. Ejemplos: las soluciones colorantes de algunos tricrómicos como el de van Gieson (fucsina ácida y ácido pícrico) el de Mallory (azul de anilina y naranja G) o el de Shor (verde brillante, fucsina ácida y naranja G). Sucesiva: esta coloración consiste en aplicar a los tejidos soluciones sucesivas de varios colorantes con la finalidad de que ciertos componentes se tiñan con algunos de ellos. El ejemplo más ilustrativo es la coloración de hematoxilina y eosina (HyE), en la que los núcleos se tiñen primero con la hematoxilina y después la eosina se encarga de colorear el citoplasma.

7. Coloración ortocromática: se conoce así a la acción de coloración que ejerce un colorante al teñir una determinada estructura con su propio color. La gran mayoría de los colorantes produce coloración ortocromática. 8. Coloración metacromática: es una reacción de coloración en la que un colorante, además de proporcionar su propio color a una estructura celular o tisular, también tiñe de distinto color otras estructuras. La tionina y el azul de toluidina colorean de azul los núcleos y otras estructuras basófilas, pero, al mismo tiempo, ciertos componentes tisulares como la mucina, la matriz cartilaginosa o el ácido hialurónico se colorean de violeta o rosado. 9. Coloración pancromática: se produce por la actividad de tinción de los colorantes neutros. En este caso, tanto la porción básica como la ácida de estos colorantes ejerce su acción de tintura, pero además ciertos componentes celulares se tiñen de colores diferentes a los originales y adquieren tonalidades que resultan de la mezcla de ellos. El ejemplo más claro de esta acción de coloración se produce cuando se tiñen frotis de sangre. El empleo de las soluciones colorantes de Wright, May Grunwald, Giemsa o Leischman da lugar a que las plaquetas y los leucocitos (granulocitos y mononucleares) muestran granulaciones específicas e inespecíficas fácilmente diferenciables por esta capacidad pancromática del colorante.

Montaje. Concluido el proceso de tinción de los cortes, éstos se deben colocar en condiciones de protección para poderlos utilizar muchas veces sin que se deterioren. Para alcanzar tales propósitos se recurre al último procedimiento, que es el montaje.

Este procedimiento supone la colocación encima del corte coloreado y diáfano de una gota de una sustancia adherente, diluida casi siempre en xilol (resina natural como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas cuyos índices de refracción son similares a los del vidrio) y sobre ellos una laminilla cubreobjetos, con cuidado de no dejar burbujas de aire dentro de la resina. A continuación, se deja que el xilol se evapore y la resina adquiera solidez suficiente para ello; las láminas se colocan en una platina caliente (45 a 50º) durante 24 a 48 horas, tiempo suficiente para que estén listas y puedan observarse. Sangre La tinción de Wright La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre, contiene eosina y azul de metileno; por esto es clasificada como una tinción policrómica, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula. (Jacqueline H. Carr, 2010, pág. 5) “El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno (…) empleando como solvente alcohol metílico.” (López Jácome, y otros, 2014, pág. 5) Composición Eosina-azul de metileno según Wright Metanol

2,5 g/L 1L

Los colorantes policromatófilos son mezclas de compuestos básicos como el azul de metileno y ácidos como la eosina. La tinción dependerá de la afinidad ácido – base que tengan las diferentes estructuras celulares. Los componentes ácidos, como el núcleo se tiñen con el colorante básico, por lo que reciben el nombre de basófilos mientras que los componentes básicos se tiñen con el colorante ácido (eosinófilos). Algunas estructuras celulares se tiñen con ambos colorantes y se conocen como neutrófilos. (Vidal Saucedo & Gurrola, pág. 16) Tabla 1 Tinción policromatófila

Colorante

Carácter de la estructura celular

Tipo

Color

que tiñe

celular

Ácido

Básico

Eosinófilos Rojo

Básico

Ácido

Basófilos

Ácido y básico

Neutro

Neutrófilos Violeta

Azul

El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente morado, se basa en la interacción molecular entre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de la coloración depende del contenido de azur B y de la relación con la eosina amarilla. (López Jácome, y otros, 2014) El resultado de la tinción puede ser influido por diferentes factores, como el valor del pH de los colorantes y de la solución amortiguadora. El buffer que se agrega debe ser fosfato de sodio 0.05M o agua destilada vieja. (Rodak, 2005)

(…) la tinción se fundamenta en la relación de las características ácidobase, y la variación de estos factores podría cambiar las características tintoriales de la muestra a teñir al verse favorecida por características más ácidas o básicas. (López Jácome, y otros, 2014, pág. 5) Levadura En el caso de la levadura no se usó ningún tipo de colorante específico, simplemente se procedió a diluir con agua destilada en un tubo de ensayo, y después del frotis respectivo se llevó al microscopio. Yogurt y vinagre Estructura y morfología de las bacterias Las bacterias son vegetales unicelulares pertenecientes a los procariotas: seres caracterizados por presentar pared celular, ribosomas del tipo 70S y carecer de verdadero núcleo, poseen una formación nuclear sin membrana. La célula bacteriana presenta unas estructuras constantes: pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma y material nuclear, y otras estructuras externas facultativas: fimbrias o Pili, flagelos y cápsula, Al microscopio, la forma de las bacterias difiere de unas especies a otras, pero resulta poco variada. En realidad, solamente pueden diferenciarse tres formas fundamentales: estérica (cocos), cilíndrica recta (bacilos) y cilíndrica curvada (espirilos). Examen microscópico de las bacterias La mayoría de las bacterias pueden visualizarse al microscopio óptico, bien directamente o tras tinción con colorantes apropiados. El examen microscópico se

practica con fines diagnósticos sobre los productos patológicos o sobre los cultivos de los mismos.

Preparación del frotis para tinción Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa del frotis antes de proceder a la tinción en sí. Los pasos que hay que seguir, escalonadamente, son: extensión, desecación y fijación. Su correcta ejecución es decisiva para la calidad de las tinciones.

-

Extensión

Consiste en formar una fina película de la muestra sobre un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado (conservado en alcohol). La deposición de la muestra debe ocupar aproximadamente una superficie de 1 cm2. Conviene rotular el portaobjetos y el área donde se va a disponer la muestra, para situar los microorganismos en evitación de un posible desvanecimiento del frotis. Los portaobjetos suelen flamearse antes de su uso para eliminar los restos de grasa y suciedad. -

Desecación

Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando el frotis bajo una lámpara, un chorro de aire caliente o sobre el calor suave de la llama de un mechero, pero tomando precauciones para no forzar el proceso de secado.

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Fijación:

Esta operación pretende que los microorganismos se adhieran al portaobjetos por coagulación de sus proteínas plasmáticas mediante calor. Se realiza pasando el portaobjetos por la llama de un mechero dos o tres veces, evitando el calentamiento excesivo que provocaría artificios en la coloración. También se puede fijar cubriendo la preparación con alcohol metílico o etílico, dejando en contacto dos o tres minutos, eliminando después el exceso o inflamando el resto; las muestras con contenido celular se dejan secar simplemente para preservar las estructuras hísticas. Es importante que el portaobjetos esté totalmente frío antes de comenzar la coloración, para evitar la precipitación de los colorantes con el calor.

Tinción diferencial de Gram La coloración de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciación morfológica y taxonómica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos según retengan o no el colorante de base usado en la tinción, que es el violeta de genciana o el cristal violeta: -

Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teñido uniformemente de color azul o violeta.

-

Las bacterias gramnegativos se tiñen de rojo por el colorante usado como contrastador (fuchina, safranina).

La diferencia entre unas y otras radica en la composición química de la pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram negativos es más delgada y presenta un

contenido lipídico diez veces mayor que el de las Gram positivas, lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante en el citoplasma. Las técnicas de tinción varían según los autores; cada laboratorio elige la que le ofrece mejores resultados. El examen de un frotis coloreado por la técnica de Gram ofrece información inmediata sobre la naturaleza de la muestra, a veces muy valiosa para la elección de una actitud terapéutica inicial. Su uso está particularmente indicado para orientar las técnicas de cultivo y como primer paso para la identificación bacteriana. En ocasiones, cuando el paciente ha recibido tratamiento antimicrobiano previo, la tinción de Gram proporciona resultados que no ofrecerán los cultivos. Por estas razones, nunca se debe prescindir de su realización, salvo en determinado tipo de muestras.

I. INTRODUCCION

La célula eucariota es más compleja que la célula procariota y contiene, a diferencia de esta última, núcleo celular. Los organismos más simples como lo son los protozoarios es tan constituidos de una sola célula eucariota mientras que los más complejos o multicelulares están formados por un gran número de células eucariotas que se hallan organizadas en tejidos, órganos y sistemas Uno de los principales problemas de la microscopía es que la mayor parte de las células son casi invisibles directamente al microscopio mediante la refracción de la luz, esto porque las células no presentan demasiados elementos que impidan el paso de los rayos luminosos (pues están constituidas casi en un 70% da agua); es por ello la importancia de utilizar colorantes para hacer posible su observación. La tinción se efectúa con dos propósitos: tratar de posibilitar el estudio morfológico y estructural, sin que se pueda obtener mayor información sobre la naturaleza química de la estructura observada y de acuerdo al tipo de tinción identificar un determinado tipo de molécula o sustancia. Una de las características de las tinciones es que casi nucas pueden usarse en células vivas, pues por lo general son tóxicas, o no penetran la membrana plasmática; por ejemplo, la tinción de Feulgen y Sudan III (tinción de lípidos) requiere de la hidrólisis del tejido en ácido antes de aplicar el pigmento. La mayoría de estos colorantes son de naturaleza orgánica y aromática, Y se clasifican en dos tipos: ácidos y básicos; aunque algunos autores consideran un tercer grupo, lo neutros, que resultarían de la combinación de un ácido y un básico dando así tinciones polícromas.

II. OBJETIVOS 1. Observar y caracterizar células eucariotas de tipo vegetal (epidermis de cebolla y mucosa bucal). 2. Observar y caracterizar células eucariotas de tipo animal (epitelio bucal, tejido adiposo y sangre) 3. Reconocer los distintos tipos de bacterias según se tiñan o no con la Tinción Gram.

III. MATERIALES Biológico

No biológico

 Lugol

 Microscopio óptico

 Alcohol absoluto

 Cubeta de tinción

 Hematoxilina

 Frasco lavador

 Formol

 Mechero de alcohol

 Sudan III

 Lanceta estéril

 Cebolla

 Hisopos

 Tocino

 Láminas portaobjeto y cubreobjetos

 Agua estancada en frasco oscuro

 Materiales de disección: tijera, pinza,

 Levadura de pan

estilete

 Acetona

 Gotero

 Safranina o fucsina

 Bisturí u hoja de afeitar

 Violeta de genciana  Aceite de inmersión

IV. PROCEDIMIENTO 1. Observación de células vegetales: Las células de la epidermis de las hojas internas del bulbo de la cebolla, son de forma alargada y bastante grande, La pared celular celulósica se destaca muy clara teñida por un colorante. Los núcleos son grandes y muy visibles. En el citoplasma se distinguen algunas vacuolas grandes débilmente coloreadas. Pasos a seguir: 

Separe una de las capas del bulbo de la cebolla. Con ayuda de una pinza desprenda la membrana epidérmica que cubre la parte interna de la cebolla y extiéndala en el portaobjetos.



Utilizando un bisturí obtenga una porción de medio centímetro cuadrado, cúbrala con una gota de Lugol, coloque cuidadosamente el cubre objeto y observe en el microscopio



Visualizar y reconocer las partes de la Célula Vegetal

2. Observación de organismos unicelulares 

Colocar una gota de agua estancada sobre una porta objeto y cubrir con una laminilla



Observar con el objetivo de menor aumento



Ajustar el micrómetro para incrementar contraste



Observar las diferentes formas y tamaños que pueda haber movimiento de los organismos unicelulares

3. Observación de levaduras de pan



En un tubo de ensayo diluir un trocito de levadura de pan con agua destilada



Observar en el microscopio con el objetivo de mayor aumento



Ajustar micrómetro para incrementar el contraste de dicha muestra



Observar las formas y tamaños de los organismos

4. Observación de células animales (sarro dental)



Se utilizó el azul de metileno, el cual tiñe intensamente el núcleo y con menos color el citoplasma de las células; suele ser granuloso



El primer paso sería obtener la mucosidad de la cavidad bucal, la cual es extraída con un hisopo



Depositar la mucosidad extraída en el centro de la lámina portaobjetos y extender con un frotis



Agregar unas gotitas de Azul de metileno y esperas 3 minutos.



Eliminar el exceso de colorante con agua y luego colocar un portaobjetos



Observar dicha muestra a menor aumento y localizar células asociadas y dobladas



Luego con el lente de mayor aumento y reconocer componentes celulares

5. Observación de células animales (tejido adiposo) (tocino) 

El sudan III es el compuesto que tiñe los lípidos de color rojo intenso.



n el tejido adiposo, que contiene gran cantidad de grasas, se observan los adipocitos teñidos por el Sudan III



Con ayuda del bisturí cortar una fina capa de grasa de tocino



Colocarla en un portaobjetos y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar durante 4 minutos.



Lavara la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudan III. Dejar actuar aproximadamente 5 minutos.



Volver a lavar la preparación con agua y cubrirla con un portaobjetos.



Observar en el microscopio

6. Observación de células animales (sangre)



En el microscopio lo que se lograra observar serán Glóbulos Rojos, Hematíes o Eritrocitos Teñidos de color rojo por a eosina.



Glóbulos Blancos o Leucocitos se identifican fácilmente por presencia del núcleo que es teñido de morado por la Hematoxilina.



EL primer paso es obtener la muestra de sangre del dedo de un compañero, realizar la punción y obtener las pocas gotas de sangre

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Tomar las gotas de sangre y hacer un frotis en el portaobjeto



Colocar el frotis extendido (seco), sobre una base plana en posición horizontal



Visualizar los diferentes componentes de la sangre

Bibliografía Jacqueline H. Carr, B. F. (2010). Atlas de hematologia clinica (Tercera ed.). Buenos Aires: Panamericana. López Jácome, L., Hernández Duran, M., Colín Castro, C., Ortega Peña, S., Cerón Gonzáles, G., & Franco Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad Medigraphic, III(1), 10-18. Rodak, B. F. (2005). Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas (Segunda ed.). Buenos Aires: Panamericana. Vidal Saucedo, F., & Gurrola, T. A. (s.f.). Introducción al Análisis Clínico / Manual de prácticas. Mexico D.F: Escuela Nacional Preparatoria, UNAM.