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Cristhian Rincón López

15 de febrero de 2012

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUÍMICA FARMECÉUTICA BIOLÓGICA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR PRÁCTICA No. 1 USO Y CUIDADO DE UN MICROSCOPIO

OBJETIVO:  Conocer la importancia del microscopio en el campo de la Biología Celular, así como las partes que lo integran, uso y cuidado del mismo.

INTRODUCCIÓN: En su afán de llegan siempre más lejos en la investigación de la naturaleza de lo que los límites de sus órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar. Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Se contaban así las bases de las modernas ciencias biológicas que hasta bien entrada la edad moderna se habían fundado en las observaciones directas. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían.

FUNDAMENTO: Un microscopio es un dispositivo encargado de hacer visibles objetos muy pequeños. El microscopio compuesto consta de dos lentes (o sistemas de lentes) llamados objetivo y ocular. El objetivo es un sistema de focal pequeña que forma una imagen real e invertida del objeto (situado cerca de su foco) próxima al foco del ocular. Éste se encarga de formar una imagen virtual de la anterior ampliada y situada en un punto en el que el ojo tenga fácil acomodación (a 25cm o más). Laboratorio de Bilogía Celular 1

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Dada la reducida dimensión del objeto, se hace imperioso el recolectar la mayor cantidad de luz del mismo, utilizando sistemas de concentración de la energía luminosa sobre el objeto y diseñando sistemas que aprovechen al máximo la luz procedente del objeto.

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Los microscopios se pueden clasificar desde un punto de vista muy sencillo en: Simples y Compuestos. Un microscopio simple es aquel que utiliza un solo lente de aumento. Es el microscopio más básico. El ejemplo más clásico es la lupa. El microscopio óptico estándar utiliza dos sistemas de lentes alineados. El objeto por observar se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formación de una imagen virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder dióptrico del lente y cuanto más alejado esté el punto próximo de la visión nítida del sujeto. El holandés Antoni van Leeuwenhoek construyó microscopios muy eficaces basados en una sola lente. Esos microscopios no padecían las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y producían una ampliación de hasta 300 veces; gracias a ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez las bacterias. Un microscopio compuesto es un microscopio óptico que tiene más de un lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: 

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El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar. El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz. El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

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GENERALIDADES: Descripción del microscopio compuesto: SISTEMA DE SOPORTE: La parte mecánica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación; además, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.  

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El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo: llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinación del tubo para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. El tubo: tiene forma cilíndrica. El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. El tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación. El tornillo micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. La platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje óptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Las pinzas: son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la platina. El revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, lo que se nota por el ruido de un piñón que lo fija.

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SISTEMA ÓPTICO: El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego amplía. 

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El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado. Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión. o Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. o El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

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SISTEMA DE ILUMINACIÓN: Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos: 

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Fuente de iluminación: se trata clásicamente de una lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones más modernas con leds. Por delante de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el diámetro de la parte de la preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación produciendo luces parásitas. El espejo: necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos más modernos no poseen espejos sino una lámpara que cumple la misma función que el espejo. Condensador: está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia. Diafragma: el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico.

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MANIPULACIÓN DE UN MICROSCOPIO: 1. El banco y la mesa deberán encontrarse a una altura que le permita al observador el uso del microscopio en posición vertical y de manera confortable. 2. Encender la fuente de iluminación. 3. Montar la preparación que se desea observar. 4. Separar los binoculares ajustándolos a su propia distancia interpupilar. 5. Enfocar entre el ojo derecho y el izquierdo. Los tubos porta oculares son susceptibles de ajuste, esto se logra enfocando primero la imagen con el objetivo de menor aumento, usando los tornillos macro y micrométrico. 6. Acomode el objetivo seco débil (10 x) en el revólver, de manera tal que sea éste el que apunte al preparado. 7. Busque con el espejo la máxima iluminación. En este momento, fijarse si el diafragma está abierto (muchos casos de falla en la iluminación se deben a un diafragma cerrado). 8. Acomode el preparado en la platina, con el cubreobjetos mirando hacia arriba. En este momento se torna FUNDAMENTAL ubicar el cubreobjetos mirando hacia el objetivo, pues el primer gran error se comete en este punto, cuando fácilmente se puede enfocar con el objetivo seco débil, pero se torna imposible su enfoque con el objetivo seco fuerte cuando el cubreobjetos queda mirando hacia abajo. 9. Mirando desde un costado del microscopio, descienda el objetivo con el tornillo macrométrico (en sentido horario) hasta su tope inferior, o hasta apoyarlo levemente sobre el preparado. Normalmente los microscopios convencionales poseen un tope que impide su descenso por debajo de cierta marca. Sin embargo, puede darse el caso que tal tope no exista. Por eso se vuelve fundamental observar el descenso desde un costado, a fin de evitar la rotura del preparado (hecho muy común en la práctica histológica). 10. Acomode el vidrio de tal manera que el preparado quede a la altura del objetivo. Para ello se valdrán de los tornillos presentes en la platina, que le permitirán mover al preparado en dos planos: vertical y horizontal. El objetivo seco débil nos permite ver la visión panorámica del preparado. Es decir, los tejidos, su ubicación, y sus relaciones.

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11. Una vez puesto el preparado en el eje del objetivo, con el tornillo macrométrico comience a alejar el objetivo seco débil del preparado (deberán moverlo en sentido antihorario), buscando ver una imagen cada vez más nítida, hasta pasarse del punto de enfoque. Vuelvan hacia el máximo punto de enfoque con el tornillo macrométrico.

12. Utilice el tornillo micrométrico para dar el enfoque fino. El objetivo seco fuerte nos permite ver detalles de una célula, o la conformación celular de una estructura. Podremos observar la forma y tamaño de células o grupo de ellas.

13. Una vez conseguido el enfoque correcto, RECORRA TODO EL PREPARADO, a fin de ir reconociendo imágenes que le sean familiares. 14. Mueva el revólver a fin de acomodar el objetivo seco fuerte (40x). En este momento solamente se podrá utilizar para enfoque el tornillo micrométrico. El uso del tornillo macrométrico podrá llevar a la ruptura del preparado histológico. Observe las estructuras con más aumento. 15. Vuelva al objetivo seco débil y retire el preparado. Tome otro preparado y vuelva a empezar.

ABERTURA NUMÉRICA La A. N. de un objetivo está impresa en el objetivo junto con otras especificaciones del objetivo. Esta puede variar desde 0.04 para objetivos de bajo aumento hasta 1.3 o 1.4 para objetivos apocromáticos de altos aumentos para uso con aceite de inmersión. La A. N. de un objetivo se define por: A. N. = I.R. sen θ Donde I.R., es el índice de refracción del medio, por ejemplo, aire, agua, o aceite, y θ es la mitad del ángulo del máximo cono de luz que sale o entra al objetivo. Incrementar el índice de refracción del medio entre el lente frontal del objetivo y la muestra da como resultado una mayor A. N. efectiva de trabajo. Los objetivos están disponibles para agua (IR = 1.33), glicerina (IR = 1.47) y aceite de inmersión

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(IR = 1.51) aun cuando algunos de estos objetivos, especialmente los antiguos. generalmente no son intercambiables sin incurrir en artefactos de imagen. Un objetivo con gran A. N. colecta más luz, brinda una imagen más brillantes y es capaz de definir detalles más finos (por ejemplo, tienen un mayor poder de resolución) comparado con un objetivo con menor A. N. La relación entre imagen e intensidad está dada por: A. N. 4/AT2 Donde AT son los Aumentos Totales CUIDADOS PARA UN MICROSCOPIO 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO 1. Lavar las lentes con alcohol. 2. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con a l g u n a o t r a sustancia. Laboratorio de Bilogía Celular 9

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3. Usar papel ordinario para limpiar las lentes. 4. Poner los dedos sobre las lentes . 5 . L i m p i a r e l s o p o r t e o l a p l a t i n a c o n x i l o l . 6.Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeñas y/o utiliza papel seda.7 . D e j a r e l m i c r o s c o p i o s i n o c u l a r e s . 8.Guardar el microscopio con aceite de inmersión en el objetivo. 9. Transportar el microscopio con una sola mano. OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS •Microscopio de Contraste de Fases. Su sistema está compuesto por lente ocular, anillo de fases, lente del objetivo, lente del condensador y diafragma anular. Tiene una amplificación de 1,000 a 2,000 nm. Permite observar estructuras muy difíciles de distinguir. No requiere de una tinción. •Microscopio de Fluorescencia. Se compone de un primer filtro de corte o filtro de excitación, espejo dicroico, segundo filtro de corte o filtro de emisión, fuente de iluminación y condensador. Se observan m u e s t r a s t e ñ i d a s , inmunofluorescencia directa o indirecta. •Microscopio de Interferencia. Es un instrumento que permite la medida de la masa de regiones pequeñas y transparentes de células vivas, obteniéndose datos de t i p o cualitativo y cuantitativo. Sus componentes son a n a l i z a d o r rotable, un cuarto de longitud de onda, objetivo de interferencia, condensador, polarizador y filtro de interferencia. •Microscopio Electrónico de Barrido. Está compuesto por un cañón de electrones (ánodo, cátodo y electroimán), sistema de barrido y de lentes. Su resolución depende de la cantidad de electrones emitidos, contando así con un límite de resolución. Tiene una amplificación de 100,000 a 200,000 veces y una alta resolución en 3D. •Microscopio Electrónico de Transmisión. Está compuesto por cañón electrónico, c o n d e n s a d o r , cámara de muestra, lente objetiva, i n t e r m e d i a , p r o y e c t o r , pantalla fluorescente y cámara fotográfica). Utiliza electrones con una longitud de onda de Proporciona un aumento de las células de 100, 000 aproximadamente

lente lente (placa 0.5 Å. veces

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CONCLUSIONES: Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como una lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda imagen real, sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada más allá del objetivo. Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se dice que la imagen es virtual.

CUESTIONARIO: 1) ¿Cuál es la diferencia entre un microscopio simple y uno compuesto? Un microscopio simple es aquel que solo utiliza un lente de aumento; el ejemplo más clásico es la lupa. Un microscopio compuesto es un microscopio que tiene más de un lente. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. 2) ¿Qué importancia tiene el uso del microscopio en la Biología Celular? Nos permite ver estructuras muy pequeñas, las cuales no son detectables a simple vista, eso es muy importante porque muchas veces las funciones de algunas estructuras como las proteínas dependen de su conformación molecular, y el microscopio electrónico te permite comprender esta organización. 3) ¿Por qué es necesario utilizar aceite de inmersión al utilizar el objetivo del mismo nombre? El aceite de inmersión para microscopía tiene aproximadamente el mismo índice de refracción que el vidrio. Mediante el aceite de inmersión se elimina casi completamente la desviación de los rayos de luz y se aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos de los microscopios.

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4) ¿Qué significa resolución, poder de resolución y amplificación, asim i s m o d e q u é f a c t o r e s d e p e n d e c a d a u n o d e e l l o s ? P r e s e n t a t u s respuestas a manera de tabla. Resolución Definición

Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro.

Depende

Depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles.

Poder de resolución Es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la capacidad para percibir detalles. En el MO es de 0,2 micras o 200 nm. Principalmente de la apertura numérica de la lente y de la longitud de onda de la luz utilizada. Podemos decir que es un valor determinado, entre otras cosas, por el diámetro de la lente.

Amplificación Es el producto de número de aumento del objetivo por los del ocular. Amplificaciones útiles: x1000 a x2000.

Está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento.

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5) Realiza una tabla comparativa de todos los tipos de m i c r o s c o p i o s incluyendo: fuente de iluminación, condensador, longitud de onda, tipo de tinción, resolución, amplificación, tipo de lentes, etc. Microscopio óptico Características: Permite aumentos desde 25 a 1500veces El poder de resolución es de 0,2 μm La muestra es atravesada por la luz Las lentes son de vidrio Los cortes son muy finos y se obtienen con un microtomo

Microscopio electrónico Características: Permite aumentos superiores a 10.000, 200.000 y excepcionalmente 500.00 El poder de resolución es de unos 3 a 10 Å La muestra es atravesada por un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno Las “lentes” son campos magnéticos Los cortes son ultra finos y se obtienen con un ultramicrotomo La imagen se genera sobre una pantalla fluorescente

Ventajas: Se pueden observar células vivas Se pueden ver células enteras

Ventajas: Se puede ver la ultraestructura de la célula en los cortes de los orgánulos

Inconvenientes: Los análisis no pueden ser muy detallados y profundos

Inconvenientes: No permite observar células vivas No se pueden realizar visiones de conjunto

Unidades de medida: El micrómetro o micrón (μm)

Unidades de medida: La unidad oficial es el nanómetro (nm) per es más empleada el angstrom (Å)

BIBLIOGRAFÍA: 1. Bernis, M. 1998. Atlas de Microscopía. México D.F. Segunda edición. Editorial Fernando Aldape Barrera. Págs. 95-107 2. Coll, J. 2000. Experimentos con el microscopio. México D.F. Primera edición. Ediciones Omega S.A. Págs. 63-65 3.López, C. 1987.Microscopia en el laboratorio. Xalapa. Facultad de Bioanálisis, U. V. Págs. 10-21 4. Nachtigall, W. 2002. Microscopía. Materiales. Instrumental. Métodos. México D.F. Segunda edición. Editorial Omega. Págs. 8-13 5. Vovides, A. 2000. Microscopía óptica: para las ciencias biológicas. Chiapas. Universidad de Ciencias y Artes del Estado de Chiapas. Págs. 14-19. Laboratorio de Bilogía Celular 13