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• Patricia Espinosa Abellan

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MICROBIOLOGÍA BLOQUE I: GENERALIDADES Y TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS TEMA 1: INTRODUCCIÓN HISTÓRICA Lo más característico de la Microbiología es que su objeto de estudio es invisible a simple vista. Denominamos microorganismo a todo ser vivo que a lo largo de su vida no sobrepasan los 1/10 mm de tamaño y que desarrolla un ciclo de vida completo e independiente.

La microbiología consta de 2 grandes bloques evolutivos: Bacteria Procariotas Arquea Microorganismos Eucariotas

EL DESCUBRIMIENTO DEL MUNDO MICROBIANO El avance de la Microbiología dependió de avances en diversos campos, entre ellos la física y el descubrimiento de la microscopía. En el año 1676, Antonie van Leeuwenhoek descubrió el mundo microbiano gracias a un microscopio simple, inventado por Zacharias Jansen, con lentes que él mismo tallaba; se le considera el padre de la Microbiología. Queda constancia de sus descubrimientos por las cartas que escribió a la Royal Society de Londres, en las que describía los microorganismos que iba descubriendo. El desarrollo de la Microbiología dependió de todo esto, pero también de otros, como la aclaración de la Teoría de la Generación Espontánea: se pensaba que los microorganismos procedían de la materia orgánica en descomposición. Era una teoría muy arraigada, apoyada por multitud de grandes personalidades como Aristóteles. Johann Van Helmontz (siglo XVII) apoyaba esta teoría basándose en experimentos que realizó, como el de dejar ropa sucia y trigo en un lugar determinado; al tiempo, la ropa y el trigo desaparecen y aparecen ratones, lo que él atribuyó a un proceso de organización de la materia para crear organismos nuevos. Confundió los efectos con las causas. En el siglo XVIII, John Needham preparó una sopa o extracto de carne y lo calentó, pensando que todos los microorganismos morían con la ebullición, y lo colocaba en un sitio cerrado con un tapón de corcho. Vio que aparecían microorganismos en el extracto y dedujo que procedían de la carne. Lazzaro Spallanzani hizo el mismo experimento, pero aisló el extracto herméticamente, y no aparecían microorganismos. Dedujo que los microorganismos que había en el experimento de Needham pasaban desde el exterior a través del corcho.

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Francesco Redi vio que si cogía un trozo de carne, lo hervía y lo dejaba pudrir en contacto con el aire, aparecían gusanos. Sin embargo, si lo tapaba, no. Si se dejaba al aire libre, las moscas dejaban huevos y entonces aparecían gusanos, y tapándolo las moscas no tenían acceso a la carne, por lo que desmintió la generación espontánea. Esta teoría tuvo una controversia que duró siglos. Los que estaban a favor pensaban que en el aire existía un “fluido vital” que producía la aparición espontánea de organismos. Franz Schulze puso los caldos expuestos al aire previamente en contacto con ácido, que eliminaba los microorganismos, y vio que no aparecían microorganismos en el caldo. Theodore Schwann consiguió el mismo resultado calentando el aire que entraba en contacto con la muestra. Los defensores de la teoría alegaban que el fluido vital era sensible al ácido y el calor. Un experimento clave para rechazar la teoría lo realizaron en el siglo XIX Georg Friedrich Schroeder y Theodor von Dusch: cogieron caldo, lo hirvieron y lo colocaron en un matraz cerrado con algodón estéril, por el cual entraba el aire, pero que retenía a los microorganismos, por lo que éstos no aparecían en el caldo. En el año 1861, Louis Pasteur definitivamente rechazó la teoría de la Generación Espontánea. En primer lugar realizó un experimento para demostrar la función del algodón para retener microorganismos: filtró el aire a través de un algodón y observó que habían quedado atrapados partículas semejantes a esporas de plantas, y que si se colocaba un trozo de este algodón en un medio estéril, se producía crecimiento microbiano. A continuación, introdujo soluciones de nutrientes en matraces y calentó los cuellos de éstos en una llama para darles distintas formas curvadas, manteniendo el extremo de los cuellos abiertos a la atmósfera. Luego hirvió las soluciones y las dejó enfriar. No se produjo crecimiento aunque el contenido de los matraces había estado expuesto al aire. Pasteur señaló que no se había producido crecimiento microbiano porque el polvo y los gérmenes habían quedado atrapados en las paredes de los cuellos curvados. Si se rompían los cuellos, comenzaba el crecimiento inmediatamente. Por aquel entonces se consideraba que la putrefacción era el origen de los microorganismos, cuando en realidad eran ellos los que originaban la descomposición. Muchas veces la suerte ha determinado las evidencias clave: muchos microorganismos no mueren durante la ebullición (son termoresistentes), y dio la casualidad de que, durante el experimento que realizó Pasteur, no había este tipo de organismos, o su experimento no habría funcionado. Todos estos experimentos demostraron que no existe la generación espontánea, o que al menos ésta no es posible en las condiciones actuales. Se fue viendo que existía una correlación entre el crecimiento de los microorganismos en el medio y los cambios químicos que se producían en éste. Se puso de manifiesto que los microorganismos eran la causa y no el efecto de estos cambios. Jöns Jacob Berzelius, Justus von Liebig y Friedrich Whöler, que pensaban que la materia era capaz de cambiar por sí misma. Cagniard-Latour, Theodore Schwann y Friedrich Kützing vieron que estos cambios, como el cambio de glucosa a alcohol, sólo se producían si había en el medio un tipo de microorganismos. Lo aclaró Pasteur, que era Químico pero apoyó a los Biólogos, y dedujo que sin microorganismos no había cambio, y que además debía ser un determinado tipo. Además hizo otra contribución, descubriendo la existencia de microorganismos anaerobios. Dedujo el por qué de todo esto: fisiológicamente, los microorganismos sacan energía de éstos procesos. Secundariamente, el hombre puede sacar provecho de los productos finales. Otra cuestión que se puso en marcha, una vez descubierto el papel de estos microorganismos sobre la materia orgánica, fue si también podían estar implicados en las enfermedades infecciosas y fuesen causa de transmisión.

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En el siglo XVI, Girolamo Fracastoro de Verona decía que veía gérmenes en el aire que pasaban de una persona a otra y que ésta era la causa de contagio de enfermedades pero nadie le hizo mucho caso porque la mayoría pensaba que las causas se debían a otros factores, como fuerzas sobrenaturales o desequilibrios de los fluidos corporales. Los médicos de aquella época comenzaron a introducir técnicas sanitarias incluso sin saber que los microorganismos eran la causa de las enfermedades infecciosas. En el siglo XIX, Oliver Wendell Holmes vio que muchas de las mujeres que daban a luz morían posteriormente. Comprobó que tomando medidas de higiene durante el parto, descendía el riesgo de mortandad y lo atribuyó a una contaminación aérea que provocaba contagio. Ignaz Phillip Semmelweis comprobó que introduciendo técnicas sanitarias durante operaciones quirúrgicas disminuía la probabilidad de contagio. Robert Lister desarrolló un método de cirugía aséptica: los instrumentos se esterilizaban con calor y se trataban los vendajes con fenol, que destruía las bacterias y evitaba las infecciones de las heridas. Hoy en día el fenol está en desuso ya que la mayor parte de bacterias es resistente a él. Robert Koch fue el primero en demostrar la relación entre Bacillus anthracis y carbunco. En 1876 enunció los conocidos como Postulados de Koch:

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El microorganismo causal debe estar presente en cada caso de enfermedad, pero ausente en los organismos sanos. Hay que aislar y desarrollar en cultivo puro al mismo organismo sospechoso. Al inocular el microorganismo aislado en un huésped sano, se debe desarrollar la misma enfermedad. El mismo microorganismo debe aislarse de nuevo a partir del huésped enfermo.

Casimir Joseph Davaine vio que en todas las lesiones de carbunco de animales y humanos había Bacillus anthracis, pero no sabía si era un efecto o una causa. Estos postulados fueron comprobados por Pasteur. Koch fundó la “Escuela de Microbiología” de Berlín, y Pasteur fundó el “Instituto Pasteur” en París, y la Microbiología empezó a ser una ciencia. Hay aún algunos casos en que la causa es un microorganismo pero no cumple los postulados, por ejemplo, los virus, que no se pueden aislar. Nacen así los Postulados de Rivers, que son los mismos que los de Koch, pero modificados para los virus. Hay bacterias que no cumplen los postulados de Koch, por ejemplo, Treponema pallidum, causante de la sífilis, que no puede aislarse porque no crece en medios biológicos artificiales; o Mycobacterium leprae, que provoca la lepra. Aunque no los cumplen, se sabe que son los causantes. Existía la idea equivocada de que los microorganismos podían cambiar de forma, ya que cuando una muestra se observaba durante varios días, aparecían distintas formas que los investigadores relacionaban con cambios de forma del mismo microorganismo, y así nació la Teoría del Pleomorfismo. Lo que en realidad sucedía es que unos microorganismos morían y aparecían otros nuevos que se aprovechaban de los productos de desecho de los anteriores, y así sucesivamente, se daba un proceso de sucesión microbiana. Carl von Linneo, en su Systema Naturae, clasificó a todos los microorganismos en un mismo grupo, llamado Chaos, ya que pensaba que, a causa del pleomorfismo no se podían clasificar. Más tarde se aclaró todo y se descubrió que no cambian de forma ya que presentan un genotipo que determina su forma. Definimos cultivo puro como aquel que contiene una sola clase de microorganismos, que teóricamente derivan sólo de uno, y por lo tanto son totalmente idénticos. Se ingeniaron muchos métodos para conseguirlo y separar unos microorganismos de otros, sobre todo en la Escuela de Berlín de Koch.

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Un discípulo de Koch, Schroeder, dejó media patata en el laboratorio, y al día siguiente vio que aparecían manchas y vio que eran conjuntos de microorganismos, y que en cada mancha aparecía sólo un tipo de microorganismo. Las manchas eran macropoblaciones sí visibles a simple vista y manipulables. Todo esto permitió rebatir la Teoría del Pleomorfismo, y contribuyó a desarrollar técnicas de cultivos puros, y también aparecen las placas de Petri. A finales del siglo XIX los investigadores se preguntaron si, a parte de la orgánica, los microorganismos eran capaces de transformar la materia inorgánica. Sergei Winogradsky descubrió la existencia de vida autótrofa; Martinus Beijerinck descubrió la fijación de nitrógeno atmosférico. A finales de siglo había una serie de enfermedades todavía con causa desconocida. Se sabía que el agente que lo causaba era capaz de atravesar todos los filtros bacterianos conocidos entonces, por lo que su tamaño era mucho menor que el de cualquier bacteria. A estos agentes se les llamó virus, y no son considerados organismos porque no presentan organización celular. Estos descubrimientos se deben a las observaciones de Dimitri Ivanowsky y Beijerinck. La primera observación fue en una enfermedad de plantas, la del mosaico del tabaco. No lograron ver los virus por microscopía óptica, pero intuían su existencia. A finales del siglo XIX ya estaba establecido el origen de las enfermedades infecciosas. Ivanowsky descubrió el primer virus: el TMV, o virus del mosaico del tabaco. Hizo extractos de una planta enferma del mosaico, y el sobrenadante lo coló por un filtro bacteriano que retenía a las bacterias. Si el líquido ya filtrado se inyectaba en una planta sana, ésta enfermaba. Propuso que probablemente existían agentes más pequeños que las bacterias, ya que superaban los filtros. Esto no demostraba que existiese un organismo vivo capaz de replicarse, ya que podría tratarse de una sustancia (lejía, toxinas, etc.). Hoy en día se considera que el primer descubridor de los virus fue Beijerinck. Pensó que tal vez se trataba de bacterias productoras de exotoxinas que serían filtrables, y que producirían la enfermedad, causando daño a distancia. Este sobrenadante, aunque se diluyera muchas veces, nunca perdía su capacidad patógena. Se llegó a la conclusión de que este principio infeccioso se reproducía y era mucho más pequeño que una célula. Se consideraron acelulares, por lo que no son considerados como organismos. Más tarde se descubrió que no sólo había virus vegetales sino también animales. Frederick Loeffler y Paul Frosch descubrieron, ya en el siglo XX, descubrieron el primer virus animal, el responsable de la fiebre aftosa o glosopeda. En 1916, Frederick W. Twort y Félix d’Herelle descubrieron virus bacterianos. A finales del siglo XX se describieron agentes más pequeños que los virus: en 1960, Theodor Diener descubrió los viroides (pequeños agentes patógenos subvirales constituidos por ácido nucleico solamente, RNA en general). Stanley Prusiner descubrió otros agentes más pequeños: los priones. · Virus: ácido nucleico + proteínas · Viroides: ácido nucleico. Afectan a plantas · Priones: no tiene ácido nucleico. Afectan a animales Muchos de estos descubrimientos iniciales se estudiaron porque las enfermedades que producían tenían impacto económico o en el hombre. Los microorganismos llamaron la atención por la capacidad destructiva o dañina que tenían. Había, por tanto, que buscar remedios. Esto dio origen a 2 líneas de investigación: la inmunización y la quimioterapia.

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- INMUNIZACIÓN – Se basa en la profilaxis o tratamiento preventivo. El inicio de estas prácticas es antiguo: se iniciaron con las observaciones de Edward Jenner. Observó que la viruela era una enfermedad tanto humana como vacuna. Se dio cuenta de que las personas que ordeñaban a las vacas afectadas de viruela no adquirían la viruela humana: de algún modo se hacían resistentes. Así sacó muestras de las heridas de la viruela vacuna y las inoculó en humanos sanos. Nacía de esta manera la primera vacuna, denominada así por Pasteur que lo hizo en honor a Jenner y sus estudios con las vacas. Actuaba contra enfermedades no sólo de origen viral, sino también de origen bacteriano, como el carbunco. La vacuna contra la rabia fue elaborada por Pasteur. La rabia es un virus que ataca al sistema nervioso, primero actuando sobre los músculos de la zona de la garganta. Se le llamaba “hidrofobia” porque los afectados, aunque tienen sed, no pueden beber agua porque no controlan la epiglotis. Una mujer llevó a su hijo, Joseph Leister, ante Pasteur cuando un perro con rabia le mordió. Pasteur le dijo que aún no había probado su vacuna contra la rabia, pero la madre accedió a que vacunase a su hijo y le salvó la vida. El chico quedó tan agradecido que trabajó para Pasteur el resto de su vida. Pasteur tuvo suerte: la rabia es la única enfermedad en la que se puede vacunar al paciente después de haberse infectado, porque el virus tarda mucho en llegar al sistema nervioso.

- QUIMIOTERAPIA – Sólo se aplica cuando ya se ha enfermado. Junto con la inmunización aumentó la esperanza de vida del hombre al doble. Partió de Paul Ehrlich, que, sugestionado por las ideas de Pasteur sobre la inmunización, pensó que podían existir sustancias químicas con toxicidad selectiva, capaces de dañar a las bacterias pero no a las células. Las llamaba “balas mágicas”. Ehrlich y Sahachiro Hata empezaron a probar sustancias dañinas para las bacterias de Treponema pallidum, que provoca la sífilis, pero que eran inofensivas para las células del cuerpo humano. Después de 605 ensayos encontraron la sustancia correcta, a la que llamaron “Salvarsan 606”, y que contenía pequeñas trazas de arsénico. Se disparó toda una línea de investigación. Pocos años después, Donald D. Woods descubrió las sulfamidas. Alexander Fleming, en 1926, estudiaba el Staphylococcus aureus cuando se dio cuenta de que su placa se había contaminado al caer una espora de Penicillium notatum, un hongo que secretaba alguna sustancia que impedía el crecimiento del estafilococo en sus alrededores. Fue en los años 40 cuando Ernst Chain y Howard Florey produjeron, por primera vez, la penicilina. Poco después, Selman Waksman descubrió la estreptomicina. Para que una sustancia sea considerada como un antibiótico, debe estar producido por un microorganismo. Las sulfamidas, por ejemplo, no son un antibiótico, sino simplemente un agente químico. Todos los microorganismos que forman antibióticos son esporulados. El hecho de que produzcan estas sustancias no les supone ninguna ventaja ecológica, ya que lo hacen de forma secundaria. Así comenzó la Era De Los Antibióticos. Los microorganismos son muy eficaces y eficientes, y por ello se hacen resistentes por el principio de Selección Natural. Es una selección mediada por los antibióticos. Siempre aparece algún microorganismo resistente por mutaciones. · Años 50: el 99,99% de Staphylococcus era sensible a la penicilina. · Hoy en día: el 100% de este microorganismo es resistente a la penicilina.

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· MICROBIOLOGÍA ACTUAL La Microbiología Actual estudia a los microorganismos y sus actividades, tanto patógenos como no patógenos. Comprende conocimientos de distintos campos: Ecología, Genética, Bioquímica, Morfología,… A su vez, la Microbiología se puede dividir en otros campos: - Bacteriología - Virología - Micología,… Existe una aplicación clínica para el control de bacterias y virus con impacto en humanos y animales. También hay una aplicación industrial, que saca provecho de las actividades de los microorganismos.

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TEMA 2: LOS MICROORGANISMOS EN LA ESCALA BIOLÓGICA Todos los organismos celulares participan de un componente químico común con 3 macromoléculas complejas: - DNA: moléculas capaces de replicarse y que son los depositarios de la información genética. - RNA: transmisor que permite la traducción en forma de proteínas. - Proteínas. Estas actividades químicas comunes que comparten forman en su conjunto lo que llamamos metabolismo. - Catabolismo: se obtiene poder reductor al formar sustancias simples a partir de sustancias complejas. - Anabolismo: formación de sustancias complejas a partir de sustancias simples. Kluyver fue el primero que enunció que todos los seres vivos presentan estas características: es el Concepto de Unidad Bioquímica. 1) 2) 3)

Bajo tiempo de replicación o generación. Tienen una estructura común: la célula. Diversidad de niveles de organización celular:

- Organismos unicelulares: más extendido en microorganismos. - Organismos pluricelulares: presente en gran parte de seres vivos superiores. 4) Organización cenocítica: presentan subunidades celulares no organizadas en membranas; no hay compartimentación celular. Es lo menos extendido. Como hemos visto anteriormente, los microorganismos no se pueden incluir en ningún grupo biológico conocido. La taxonomía está bien estabilizada, pero su encaje con el resto de organismos es dudosa. Charles Sedillot vio que era necesario crear un grupo aparte, y acuñó en 1878 el término “microbio”. Vio que la división del Mundo Vivo en 2 reinos, como ocurría a finales del siglo XIX, no podía ser mantenido. Los microorganismos precedieron a plantas y a animales en la Evolución, y por tanto no pueden ser clasificados con propiedades de estas 2 líneas. Un discípulo de Darwin, llamado Ernst Haeckel, creó el reino de los Protistas, que dividió en: - Protistas superiores: hongos, algas, protozoos. - Protistas inferiores: bacterias. Los Protistas formaron el tercer grupo dentro de la clasificación del Mundo Vivo. Tenían la característica común de tener una organización celular simple, es decir, no forman tejidos. Robert H. Whittaker propuso una clasificación consistente en 5 reinos. Carl Woese realizó una clasificación de 3 reinos, que es la más usada. Cuando se introdujeron técnicas moleculares, se realizaron análisis ribosomales, y se vio que había otra clasificación diferente posible, consistente en los siguientes dominios: - Eukarya Bacteria - Prokarya Archaea

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Gracias a los análisis de la unidad 16S ribosomal, en los años 50, por microscopía electrónica, se vio que había 2 claros modelos en la arquitectura interna de las células: - Células eucariotas: plantas, metazoos y protistas superiores. - Células procariotas: bacterias. Las diferencias estructurales se corresponden con las funcionales. La discontinuidad biológica más importante dio lugar a 2 filum con evolución paralela pero independiente: Eucariotas y Procariotas. Pero dentro de los procariotas también había 2 discontinuidades: Bacteria y Archaea. Se cree que primero aparecieron los Archaea: organismos anaerobios que han llegado hasta nuestros días y se encuentran sólo en ambientes extremos que recuerdan a la Tierra primitiva. Son los que comenzaron la evolución hacia los eucariotas.

DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS 1)

Organización del aparato genético:

- Los eucariotas lo tienen aislado o limitado por una membrana nuclear, de la cual carecen los procariotas. - El número de cromosomas en eucariotas es siempre mayor de 1, mientras que los procariotas tienen 1, que puede ser circular, y que se denomina genóforo. - Los eucariotas presentan histonas: proteínas básicas que forman parte de la estructura de sus cromosomas, y que procariotas no tienen. - Presencia de nucleolo solamente en eucariotas. - División celular regulada en eucariotas: se realiza siempre igual, por mitosis, que es un proceso regulado que no aparece en procariotas. - Sistemas de recombinación genética: los procariotas carecen de reproducción sexual (fusión de gametos). Nunca en procariotas se forman diploides completos, sólo parciales, por transferencia unidireccional de DNA. 2)

Estructura citoplasmática:

- Orgánulos eucariotas: presentan retículo endoplasmático, aparato de Golgi, mitocondrias, cloroplastos, lisosomas… Los procariotas carecen de orgánulos, aunque las mitocondrias y cloroplastos tienen origen procariótico. - Diferencias ribosomales: los ribosomas de eucariotas son 80S, y los de procariotas son 70S. Los eucariotas presentan ribosomas del tipo 70S en mitocondrias y cloroplastos. - Microtúbulos: presentes sólo en eucariotas. - Compartimentación: sólo se da en eucariotas. - Presencia de péptidoglucano (mureína): sólo se presenta en procariotas, formando parte de la pared celular, cuando la presentan. También aparece en algunas archaeas, de manera modificada, y se llama pseudopéptidoglucano. 3)

Atributos funcionales:

- En eucariotas aparecen procesos de fagocitosis, pinocitosis, fenómenos de secreción, digestión extracelular, endosimbiontes, movimiento ameboideo y corrientes citoplasmáticas; ausentes en procariotas.

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- Efecto diferencial de antibióticos: - Los β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas,…): no afectan a eucariotas pero sí a procariotas ya que actúan destruyendo la mureína. - Los poliénicos: son activos contra eucariotas pero no contra procariotas. - Ciclohexamida: detiene la síntesis de proteínas en ribosomas 80S, por lo que sólo afecta a eucariotas. - Tetraciclinas y aminoglucósidos: inhiben la traducción en procariotas.

β-lactámicos Poliénicos Ciclohexamida Tetraciclinas, aminoglucósidos…

Eucariotas + + -

Procariotas + +

Hay procariotas resistentes a β-lactámicos porque carecen de pared celular. Los mycoplasmas son un tipo de estos procariotas resistentes a β-lactámicos.

POSICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL PROCESO EVOLUTIVO Cuando se desmintió la Teoría de la Generación Espontánea, fue la época en la que Darwin publicó su “Origen de las Especies”. Se planteó la evolución histórica y se vio que los microorganismos tenían un origen mucho más antiguo: eran la base del origen de la vida. Se plantearon 2 teorías: - Teoría de la Panspermia: fue defendida por Remius. Defendía que la vida en el planeta tuvo un origen exógeno (meteoritos, etc.). Desplaza la resolución del origen de la vida a un origen remoto. - Teoría del Origen Endógeno: defiende que la vida comenzó en este planeta. Esta última implica que las condiciones de vida en el planeta no eran las de ahora. Se han sucedido numerosas fases geológicas, la primera de las cuales fue una época sin oxígeno y con mucho amoníaco, un ambiente muy reductor. Oparin apoyó la idea de que en esas condiciones antiguas se generara materia orgánica, base de la vida. Mediante estudios posteriores se vio que la formación del planeta ocurrió hace aproximadamente 4.500 ma, pero no se formó una corteza terrestre estable hasta hace 3.000 ma. En esa época se formaba materia orgánica que no se descomponía, ya que no había ni oxígeno ni microorganismos, y que iba acumulando, permitiendo la aparición de microorganismos. El hecho indudable es que hace 2.500 ma ya había vida microbiana. Existen fósiles del Precámbrico de microbios llamados estomatolitos. Éstos empezaron a generar oxígeno creando la primera atmósfera estable. Eran organismos anaerobios y vivían en condiciones extremas. Aún se observan estas características en Archaeas. El origen de los virus es más incierto. No han precedido a las células porque las necesitan para reproducirse, por lo que son posteriores a los procariotas.

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TEMA 3 : CULTIVO DE MICROORGANISMOS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS Todos los sistemas biológicos tienen en común que necesitan unos requerimientos nutricionales: se desarrollan sobre sustancias químicas que les permiten conseguir energía (mediante oxidaciones biológicas) y suministra sustancias para la biosíntesis (reducciones que generan ATP y poder reductor). Requieren la presencia de:

1) Fuente de energía: se empieza a versatilidad microbiana. Los microorganismos pueden utilizar como fuente de energía: - Luz: organismos fototrofos. - Oxidaciones químicas: organismos quimiotrofos. 2) Fuente de carbono: de 2 tipos: - Carbono inorgánico (CO2): organismos autótrofos. - Carbono orgánico: organismos heterótrofos. Los organismos quimiotrofos pueden obtener energía por oxidaciones de compuestos orgánicos (organismos quimioorganotrofos) o de compuestos inorgánicos (organismos quimiolitotrofos). Por ejemplo, los organismos quimiolitoautotrofos son organismos que no necesitan compuestos orgánicos.

3) Fuente de nitrógeno: de 2 tipos: - Nitrógeno atmosférico - Sales (nitratos) o sales amoniacales, aminoácidos, proteínas…

4) Fuente de sales inorgánicas: en organismos unicelulares son necesarios para mantener los equilibrios internos. Existen muchos tipos de sales, que pueden presentar: - Fósforo - Potasio - Sodio - Magnesio - Hierro - Calcio - Azufre Suministran otros elementos necesarios para microorganismos, y algunas los necesitan como requerimiento estructural. - Bacterias halófilas: sólo viven en ambientes con altas concentraciones salinas, superiores a las normales, como salinas, salmuelas,…

5) Fuentes de vitaminas: necesarias para algunas bacterias, pero no todas. Algunas las producen. - Escherichia coli: habita en el intestino humano, y allí produce la vitamina K. Los microorganismos que necesitan vitaminas suelen necesitar vitaminas del tipo B, sobre todo vitaminas B6 y B12. Requieren su presencia ya formada en el medio.

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6) Agua: siempre tiene que haber una cierta concentración de agua disponible, que a veces forma parte de compuestos pero es extraíble. Nosotros somos organismos quimioorganoheterótrofos. Cuando los microorganismos tienen los 6 requerimientos en el medio, se dedican a crecer, y lo hacen hasta que se acaba uno de ellos, al que llamamos “factor limitante”, y entonces deja de crecer. Si se le administra este factor limitante en pequeñas dosis, el microorganismo crecerá de manera proporcional a la cantidad administrada. El factor limitante, por tanto, determina el crecimiento poblacional microbiano. Lactobacillus se utiliza en valoraciones alimenticias de vitaminas. Necesita vitamina B6. Con una gráfica patrón, podemos determinar la concentración de vitaminas en un alimento en función del crecimiento de la problación. Analíticamente, esta técnica es tan exacta como cualquier máquina y no requiere tratamientos o aislamientos de vitaminas, porque aunque vaya mezclada esta vitamina con otras sustancias esenciales, al existir estas ya en el medio en exceso, el crecimiento se rige sólo por el factor limitante.

- CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS – Los medios de cultivo son el sustrato en el que se desarrollan los microorganismos en el laboratorio. Se clasifican por: - Composición química: - Cultivos sintéticos o definidos: composición química conocida exactamente y definidos cuantitativamente todos sus componentes. - Cultivos complejos o naturales: cuantitativamente se desconoce su composición, pero sí se sabe cualitativamente. - Estado físico: - Líquidos: exceso de agua, difusión libre de microorganismos - Sólidos: para aislar cultivos - Semisólidos El agar es una sustancia que se utiliza para solidificar las sustancias acuosas y que no modifica el medio. Es una sustancia orgánica procedente de un tipo de alga roja. 1% agar Líquido

1% agar Semisólido

Sólido

2% agar Antes del agar se utilizaba la gelatina, pero ésta sí es utilizada por microorganismos. Sin embargo, la presencia de agar puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos; se emplea entonces gel de sílice. Microorganismos inmóviles

Microorganismos móviles

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Siembra en vertical en medio semisólido - Disposición: - En placa - Tubo inclinado

medios sólidos

- Matraz - Tubo

medios líquidos

Independientemente de la composición química, física o de la disposición, los medios se dividen en función de su finalidad, pudiendo ser: - Enriquecidos: medio base al que se adiciona otro compuesto que facilita el crecimiento de un microorganismo concreto pero sin perjudicar a otros. Ejemplo: medio + suero; medio + sangre. - Selectivos: medio base al que se añade u omite alguna sustancia cuya adición o ausencia inhibe el crecimiento microbiano de unos tipos pero no de otros. Favorece el aislamiento. Ejemplo: medio + ácidos biliares; medio + nitrógeno. - Diferenciales: medio base que incorpora reactivos o sustancias que nos permiten distinguir tipos de microorganismos por sus propiedades fisiológicas. Por ejemplo, utilizando un medio base con un indicador de PH, podemos determinar si un microorganismo modifica el PH del medio, y nos indica que es un microorganismo que produce ácidos como consecuencia de su metabolismo, es decir, es un microorganismo fermentativo. Si el PH no varía, es un microorganismo que realiza respiración. Se puede crear un medio mezcla de 2 o de los 3, y son los más utilizados. Por ejemplo, el medio McConkey (medio base + ácidos biliares), que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram+ y facilita el crecimiento de las Gram-, es un medio selectivo, pero si además le incorporamos un indicador de PH, será también un medio diferencial. El medio McConkey tiene lactosa y ácidos biliares. Todos los microorganismos que crezcan en este medio serán microorganismos capaces de romper la lactosa en sus dos subunidades (galactosa y lactosa), es decir, presentan β-galactosidasa. La glucosa es su fuente de energía. Es un medio que aísla muy bien a las enterobacterias. Por lo tanto: Organismos resistentes a ác. biliares metabolismo respiratorio o fermentativo

McConkey

indicador de PH

Organismos con β-galactosidasa

En muchos casos, se pueden preparar los ingredientes por separado, se esterilizan y se añaden poco a poco o se venden ya fabricados y deshidratados; al añadirse agua ya tenemos el medio de cultivo.

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Hay ya medios especialmente diseñados para un crecimiento de una bacteria determinada.

1) Cultivos bacterianos: el 99,9% de las bacterias crecen en ellos. Otros, sin embargo, no lo hacen porque necesitan medios vivos: Treponema pallidum, etc… Los virus tampoco crecen en estos cultivos, ya que son parásitos celulares que necesitan células vivas.

2) Cultivos celulares: constan de una base de células vivas de animales o vegetales y se utilizan para el cultivo de virus. También pueden ser bacterias para estudiar virus bacteriófagos. - Medio Eagle: para células animales es el más común, con un 10% de suero bovino fetal, que permite el crecimiento de casi todos los virus

- MATERIAL DE CULTIVO a) Asa de siembra: asa con una prolongación metálica que termina en un círculo. Puede convertirse en un asa de picadura. Es buena porque por la tensión superficial nos permite coger gotas. b) Asa de Digraski o Drigalski: es importante para la siembra de medios líquidos. Consta de una varilla de vidrio con una especie de triángulo al final y permite extender el contenido de una gota por toda la placa. c) Pipeta Pasteur: útil para muestras líquidas. d) Matraz e) Tubos de ensayo f) … Los cultivos se llevan a cabo cerca de un mechero o llama: esteriliza el aire de alrededor de la llama y nos permite esterilizar el material.

- TIPOS DE SIEMBRA 1) Medio sólido: depende de cómo sea la muestra: - Muestra líquida: con el asa de siembra se recoge la muestra en forma de gota y se siembra por extensión. - Muestra sólida: con el asa de siembra se realiza una siembra por estría; se recorre toda la placa formando estrías, primero más juntas y cada vez más separadas. - Muestra semisólida: con el asa de siembra.

2) Vertido en placa: se prepara el medio y se añade la muestra antes de poner el medio en la placa, y así el microorganismo crece en la superficie y en las capas internas. - CULTIVO PURO En la naturaleza, las poblaciones bacterianas casi siempre se presentan en cultivos mixtos. En las enfermedades pueden ser cultivos puros, porque el microorganismo infeccioso puede eliminar a otro y ocupar órganos enteros. Es una población con sólo una clase de microorganismo que desciende de un microorganismo común. Permiten el análisis asilado de microorganismos.

1) Técnica por siembra en superficie: se realiza por siembra en estría o por Digraski. En la siembra por estría, al principio descargamos muchos microorganismos, pero conforme vamos avanzando puede caer un microorganismo aislado que formará una colonia pura de microorganismos. Para asegurarnos de que es puro, cogemos una muestra de esa colonia y la sembramos en otro medio, para ver si es puro o no.

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2) Técnica de vertido en placa: el microorganismo queda dispersado por todo el medio, por lo que quedarán aislados unos de los otros. 3) Técnica de enriquecimiento: no se utiliza un medio enriquecido, sino selectivo. Se basa en la aplicación a microescala, se favorece el crecimiento de un microorganismo pero el medio no permite el crecimiento de otros microorganismos. Es el tipo más eficaz de aislamiento de microorganismos. 4) Técnica de dilución seriada: sólo se emplea en medios líquidos. Es estadísticamente válido, pero a veces esta estadística no se cumple. Este método permitió a Lister realizar el aislamiento del primer microorganismo único: Streptococcus lactis. 5) Micromanipulador: dispositivo que se pone en conjunción con un microscopio, y consta de micropipetas y microagujas. Se puede apuntar a una célula determinada y aspirarla, para luego verterla en un medio de cultivo. Es muy sofisticado. Hay microorganismos con efectos beneficiosos también. El 98% es beneficioso, por lo que sólo un bajo porcentaje es patógeno.

PRINCIPIOS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Se llevan a cabo una vez que los microorganismos están ya aislados. Da lugar a colecciones de microorganismos patrón o microorganismos tipo, que se mantienen vivos. Hay que mantenerlos aislados, conservados y así ir coleccionándolos. CECT: Colección Española de Cultivos Tipo ATCC: American Type Cultives Colection Para mantenerlos vivos, podemos utilizar diversos mecanismos: a) Resiembras periódicas: por ejemplo, en tubos de agar inclinados. La resiembra consiste en coger un poco de una población e inocularlo en otro tubo.

b) Adicionar a los medios aceite mineral o parafina esterilizada: ayudan a retrasar la deshidratación. c) Conservación a bajas temperaturas: por ejemplo, en nitrógeno líquido (-196ºC); el inconveniente es que el agua intracelular se convierte en hielo que pueden causar cortes y dañar a la célula. Por ello se añade glicerol, DMSO (dimetilsulfóxido). Así se evita la formación de microcristales que pueden dañar la estructura celular.

d) Gliofilización: implica desecar rápidamente por sublimación las células que se mantienen congeladas en un medio de alto vacío. Así, le quitamos el agua a los microorganismos sin aplicar calor, y entran en un estado críptico latente. La presión atmosférica actúa como una especie de émbolo que empuja a las moléculas de agua, impidiendo su movimiento debido a la energía cinética de las moléculas. Los microorganismos recuperan su actividad biológica al añadir agua. Están en un estado llamado gliófilo: en este estado, los microorganismos se pueden conservar durante años, incluso décadas.

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TEMA 4: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Fue el desarrollo de la microscopía lo que permitió conocer un poco más sobre los organismos.

FUNDAMENTOS DE LA MICROSCOPÍA El ojo humano actúa como un instrumento óptico. Mediante la acomodación del ojo, nos da una idea del tamaño del objeto y la distancia que tiene. Existe una limitación: a partir de unos 25 cm de distancia, el ojo deja de acomodarse por mucho que se acerque el objeto. El ojo deja de ver un objeto de 0,1 mm a 25 cm de distancia; el ángulo de entrada sería de 1º, que sería el ángulo mínimo con el que tiene que entrar un objeto para que se forme la imagen en la retina. Este ángulo se va perdiendo también cuando se aleja mucho el objeto.

α

Por eso, definimos a los microorganismos como entidades vivas con un tamaño inferior a 0,1 mm durante su ciclo de vida. Los microscopios operan aumentándonos el ángulo de entrada de los objetos a estudiar. Éste es el principio básico de todo microscopio.

- CONCEPTOS DEL MICROSCOPIO 1. Magnificación o aumento: aumento del ángulo de entrada (α). Se obtiene mediante procedimientos ópticos. 2. Contraste: sólo podremos ver objetos cuando nos encontramos el objeto en un medio diferente. Se logra mediante procedimientos ópticos dependiendo del microscopio, o mediante tinciones para resaltar el objeto del medio. 3. Claridad o nitidez: viene definida por la longitud de onda de la luz que se utiliza y también por cuestiones ópticas. - Poder de resolución de un microscopio. - “Aumentos que logran que la lente objetivo” x “Aumentos que logra la lente ocular” = Magnificación o aumento. El poder de resolución que define la claridad, se define como la capacidad de resolver entre 2 puntos que se encuentran muy próximos.

λ

λ

PR = 2ΔΝ

PR = 2ηsenC

ΔΝ = apertura numérica. Es igual al índice de refracción entre la lente objetivo y el objeto a estudiar por el ángulo que forma el foco de luz con los rayos más divergentes. ΔΝ = ηsenC

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El aceite de inmersión hace aumentar el denominador PR, disminuyendo el valor de PR. Podemos ver 2 puntos que están separados entre sí por una distancia muy pequeña. Los podemos ver de forma clara y nítida. Si el PR es muy grande, la claridez y nitidez es muy poca. Si la longitud de onda disminuye, no llega a ser visible aunque aumente el PR. El aumento es una propiedad exclusiva de las lentes que forman el microscopio.

TIPOS DE MICROSCOPÍA Empleamos una λ=500nm (verde azulada) y una lente objetivo con 55º de semiángulo, y la observación la hacemos con aire (η=1) o utilizamos aceite de imersión (η=1,5), el PR será diferente. Con el aceite de inmersión, en este caso, veremos objetos con un PR de hasta 0,2µm.

- MICROSCOPÍA ÓPTICA – Utiliza una λ que entra dentro del espectro visible (400-700nm).

1) Microscopio de fondo claro: Es el más utilizado rutinariamente. El fondo es claro y la muestra a ver se contrasta mediante tinciones. Utiliza también aceite de inmersión para disminuir el PR. Está compuesto por un cuerpo o soporte de metal compacto, compuesto por una base y un brazo, donde se fija el resto de las partes. En la base hay una fuente de luz. En el brazo hay dos dispositivos giratorios para enfocar, de ajuste fino (micrométrico) y ajuste grueso (macrométrico), que pueden mover la platina o portaobjetos para enfocar la imagen. El condensador se monta dentro o por debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos.

2) Microscopio de fondo oscuro: Se ve todo oscuro menos lo que se quiere observar, que se ve claro. Se basa en el efecto Tyndall. Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de manera que no penetren en el objetivo rayos no reflejados y no refractados. Solamente la luz que haya sido reflejada o refractada por la muestra puede formar una imagen. De esta forma, el campo que rodea la muestra aparecerá negro, mientras que el objeto quedará iluminado intensamente. Para células vivas no teñidas.

3) Microspio de contraste de fases: Otra alternativa al microscopio de campo oscuro para la observación de células vivas no teñidas. Tiene un dispositivo óptico llamado Zernicke que logra el contraste haciendo pasar la luz por el objeto de manera que el microscopio transforma las variaciones de los índices de refracción y de la densidad celular, en variaciones de intensidad de luz fácilmente detectables. Existen otros 3 tipos de microscopía óptica más moderna que dan una imagen tridimensional: 4) Microscopio de interferencia o de contraste diferencial: Crea una imagen sobre la base de la detección de diferencias en los índices de refracción y el espesor de la muestra. Mediante unos prismas se generan 2 ondas de luz polarizada plana en ángulo recto una respecto de la otra. Una de ellas pasa a través de la muestra, mientras que la otra sirve de referencia y pasa por una zona clara. Tras atravesar la muestra, las 2 ondas se combinan e interfieren entre sí formando una imagen.

5) Microscopio de fuerza atómica: Se pone un sensor próximo a las fuerzas y detecta fuerzas atómicas repulsivas digitalizando un modelo de la imagen.

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6) Microscopio confocal: Utiliza un rayo láser que analiza la imagen en diferentes planos y luego nos da una imagen tridimensional. Con longitudes de onda más pequeña, existe la microscopía ultravioleta. 7) Microscopio ultravioleta: a) Microscopio de luz ultravioleta: no utiliza lentes de vidrio sino de cuarzo, ya que el vidrio no deja pasar la luz ultravioleta. Después actúan mecanismos accesorios de visualización. b) Microscopio de fluorescencia: expone un espécimen a luz ultravioleta y forma una imagen del objeto con la luz fluorescente emitida. La luz resultante pasa a través de un filtro de excitación que transmite sólo la longitud de onda deseada.

- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA – Se emplea haz de e- que actúan como un rayo de luz o fuente de radiación que puede enfocarse al igual que la luz de un microscopio óptico. Lo que observamos, a diferencia del microscopio óptico, no es la imagen directa sino una fotografía, que puede ser aumentada. Esta microscopía presenta mayor poder de resolución en cuanto a capacidad de nitidez, lo que permite estudiar con mayor detalle la morfología microbiana. 1) Microscopio electrónico de transmisión: Es un microscopio óptico invertido. El haz de e-, procedente de un filamento de tungsteno calentado se enfoca sobre la muestra con el condensador. Como los e- no pueden atravesar una lente de vidrio, se emplean electroimanes para concentrar ese chorro de e- sobre la muestra. La columna que contiene las lentes y la muestra deben estar en condiciones de vacío para obtener una imagen clara porque los e- se desvían al chocar con las moléculas de aire. La muestra dispersa los e- que pasan a su través, y este haz se enfoca con otro grupo de electroimanes para formar una imagen aumentada y visible sobre una pantalla flourescente. Limitaciones: sólo funciona a alto vacío, lo que implica que las muestras a realizar deben estar deshidratadas anteriormente para evitar la ebullición y evitar formas extrañas llamadas artefactos que no existen en la realidad, por lo que este tipo de microscopio no sirve para ver muestras vivas.

2) Microscopio electrónico de barrido o scanner: Se diferencia de otros microscopios electrónicos en que produce una imagen a partir de e- emitidos por la superficie de un objeto, en lugar de a partir de e- transmitidos. Realiza un escáner con un estrecho haz de e- en forma de prisma, de adelante hacia atrás sobre la muestra. Cuando el haz incide sobre una zona concreta de la muestra, los átomos de la superficie emiten una nube de e- que son atrapados por un detector especial. Inciden sobre un centelleador, causando la emisión por éste de centelleos de luz que un fotomultiplicador transforma en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal se envía a un tubo de rayos catódicos y se produce una imagen como en la pantalla de televisión, que puede verse y fotografiarse. Sólo permite ver superficies.

TINCIONES Aunque los microorganismos se pueden examinar directamente con un microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la resolución, acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro. Primero hay que fijar la muestra. La fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los microorganismos. Se realiza el frotis del

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objeto en un porta y se fija, lo que limita el movimiento Browniano de las partículas de suspensión e inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular. Para la tinción se emplean colorantes, que son compuestos orgánicos que presentan, desde el punto de vista funcional, 2 partes en sus moléculas: - Radicales cromatóforos: le dan color a la molécula y tienen grupos nitro (NO2) o grupos azo (N=N-). - Grupo auxocromo: son las zonas reactivas, que presentan grupos amino (NH3+), hidroxilo (OH) o carboxilo (COO-).

- CLASIFICACIÓN DE LOS TINTES POR SUS COMPUESTOS QUÍMICOS – a) Colorantes ácidos: El grupo auxocromo es un anión y su cromóforo será un ácido. Estos colorantes, debido a su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente (elementos celulares básicos). Ejemplo: eosina, fucsina, rojo congo, rosa de bengala…

b) Colorantes básicos: El grupo auxocromo es un catión, por lo que se van a unir a moléculas cargadas negativamente (elementos celulares ácidos). Ejemplo: azul de metileno, cristal violeta, safranina, verde malaquita… c) Colorantes neutros: Presenta un componente ácido y otro básico, o simplemente uno que no esté cargado. Ejemplo: negro Sudán, que se disuelve mejor en componentes lipídicos que en el agua.

- MECANISMOS DE TINCIÓN – Al teñir una célula se producen reacciones de intercambio iónico. Existen 3 tipos de tinciones en Microbiología: 1) Tinciones simples o directas: Utilizan un solo colorante y tiñe por igual a toda la bacteria. Los más utilizados son el azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina. 2) Tinciones negativas o indirectas: No son verdaderamente tinciones. Se tiñe todo el fondo pero no la bacteria. Ejemplo: tinción de Fleming, consistente en utilizar tinta china que se añade al medio haciéndolo opaco a la luz y no penetra en las bacterias. Equivaldría a la microscopía óptica de fondo oscuro. Existen microorganismos que al aplicárseles tinciones mueren por toxicidad. Para observar organismos vivos a veces hay que utilizar las tinciones negativas o indirectas. Por ejemplo, Treponema pallidum es difícil de observar en vivo con el fondo claro.

3) Tinciones diferenciales: Emplean siempre más de un colorante, y las células se tiñen de manera diferente dependiendo del tipo de microorganismo. Permite observar y establecer diferencias entre los microorganismos dependiendo de sus propiedades de tinción. Ejemplo: tinción de Gram, tinción de ácido alcohol resistente.

• TINCIÓN DE GRAM: 18

Fue desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, y es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción diferencial que divide a las bacterias en dos clases: Gram positivas y Gram negativas. Se basa en la naturaleza de la pared celular. En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con cristal de violeta durante 2 minutos. Se tira el exceso y se aplica una solución yodoyodurada o Lugol-Yodo (I2-IK) durante 1 minuto, se tira el exceso y se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo con safranina, se aclara con agua y se seca. Al darle cristal de violeta (CV) se forman complejos de este tinte en el interior de las células. Luego el Lugol-Yodo hace que se fije más la unión del CV con la célula, formando un complejo llamado CV-I, que es más insoluble en agua y en alcohol. Las células se decoloran dependiendo de su porosidad. En unos casos se extrae CV-I y en otros no. La decoloración de contraste (safranina) se utiliza para células a las que se ha extraído CV-I. Gram-

Cv y Lugol-Yodo

Aclarar con etanol-acetona

Gram+

Safranina y aclarado

Se distinguen 2 tipos de células: - Gram positivas: violetas - Gram negativas: rosas o rojas

- TINCIÓN DE ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE – Es otro método importante de tinción diferencial. Hay algunas bacterias difíciles de teñir, pero que una vez teñidos es difícil decolorarlos. Se trata de teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol (método de Ziehl-Neelsen). Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica, permaneciendo de color rojo. Este método se emplea para identificar Mycobacterium tuberculosis y M. leprae. Se diferencian 2 tipos de células: - Ziehl-Neelsen positivas: moradas, no se decoloran - Ziehl-Neelsen negativas: azules Todas las ZN+ son Gram+, pero no todas las Gram+ son ZN+. 4) Tinciones específicas o selectivas: Tiñen partes específicas de las células: - Tinción para flagelos - Tinción para paredes celulares: tinción de Wirtz para bacterias esporuladas. Una determinada tinción simple o directa es el azul de metileno o de Loeffler es también una tinción específica o selectiva. Hay unos componentes en procariotas que son los corpúsculos metacromáticos o gránulos de volutina o polifosfatos. Si hacemos que el azul de metileno entre dentro de

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las células, nos marcará en determinados puntos de la célula los acúmulos de polifosfatos. Una tinción simple se utiliza como específica en este caso.

TEMA 5: CONTROL MICROBIANO CONCEPTOS 1. Esterilización: cualquier proceso físico o químico que destruye o elimina todas las formas de vida, tanto células vegetativas como esporas. Un medio estéril, por tanto, es un medio desprovisto de vida. 2. Desinfección: cualquier proceso físico o químico que destruye o elimina microorganismos en desarrollo o células vegetativas, pero no esporas. 3. Antisepsia: prevención de una infección o sepsis mediante antisépticos, que son agentes químicos que se aplican sobre los tejidos vivos para prevenir una infección, destruyendo o inhibiendo el crecimiento de agentes patógenos. Por su modo de acción, estos métodos de control microbiano se pueden clasificar en: 1) Microbicidas: producen la muerte irreversible del microorganismo (agentes bactericidas, fungicidas,…). 2) Microbiostáticos: no mata al microbio sino que inhibe su crecimiento. Si lo quitamos del medio, el microorganismo puede volver a crecer (agentes bacteriostáticos, fungistáticos,…). Algunos pueden ser desinfectantes y/o esterilizantes, dependiendo del tiempo que se aplique, de la dosis y del tipo de célula (las células jóvenes son más sensibles que las viejas).

AGENTES ESTERILIZANTES Y/O DESINFECTANTES • AGENTES FÍSICOS - CALOR – Se puede aplicar de dos formas: - Calor húmedo: ejerce su efecto porque coagula las proteínas y las desnaturaliza. Es más efectivo que el seco, porque el aumento de la temperatura se transmite mejor a través del agua que del aire. - Calor seco: ejerce su efecto de oxidación de los constituyentes celulares. 1. Calor húmedo

a) Ebullición: consiste en someter un líquido a 100ºC. Es un proceso desinfectante porque los 100ºC no eliminan endosporas bacterianas. b) Autoclave: a diferencia de la ebullición, es esterilizante. Básicamente es una gran olla a presión con una resistencia en el fondo y una tapa que permite el cierre hermético. Al aplicar calor, el agua se calienta y pasa a estado de vapor. Ese vapor que se va acumulando hace que aumente la presión por encima de la atmosférica y se consigue un aumento de la temperatura de más de 100ºC. PV Ley de Boyle Mariotte: T 20

= cte

Al aumentar la presión, aumenta la temperatura. La presión aumenta en 1,1kg/cm2 (1 atm más que la atmósfera), lo que permite alcanzar una temperatura de 121ºC. Con esta temperatura ya se consigue eliminar las endosporas. Es un método esterilizante por corriente de vapor a elevada presión. Se utiliza para esterilizar material contaminado, ropa, material quirúrgico, catéteres, guantes de goma, soluciones salinas, medios de cultivo… cualquier material termoresistente. Un ciclo estándar de autoclave consiste en:

1,1 kg/cm2

121ºC durante 20 minutos

c) Tindalización o esterilización fraccionada: llamada así por John Tyndall. Es un método esterilizante consistente en aplicar 3 procesos de ebullición en 3 días consecutivos (1 por día): - 1er día: 100ºC – 30min. Se eliminan células vegetativas. Luego se deja reposar 24h a Tª ambiente. - 2º día: 100ºC – 30min. Elimina las células vegetativas que proceden de las esporas: el cambio radical de Tª puede ser un estímulo para que las esporas salgan de su estado de latencia. Se deja reposar otra vez. - 3er día: 100ºC – 30min. Por si queda alguna espora. d) Pasteurización: introducida por Pasteur. Es un método muy utilizado para evitar la contaminación en alimentos como la leche, el vino y la cerveza. Es un proceso de calentamiento suave para eliminar los posibles patógenos del hombre que se transmiten por estos alimentos, como los de la leche (Mycobacterium tuberculosis, que muere a 60ºC, o Coxiella burnetti, que aguanta temperaturas superiores). - Pasteurización lenta o LTH (Low Temperature Holding): 63ºC – 30min. - Pasteurización rápida o HTST (High Temperature Short Time): 72ºC – 15seg. - UHT (Ultra High Temperature): se somete a 140-150ºC durante 2-5seg. Es la leche uperisada. 2. Calor seco

a) Incineración: proceso que consiste en aplicar a la llama de un mechero lo que queramos esterilizar. Produce oxidación ultrarrápida que conduce a la muerte de los microorganismos. b) Horno Pasteur: consigue temperaturas bastante altas y una esterilización media (180ºC durante 2 horas). Se utiliza para material termorresistente como material de vidrio, tijeras, bisturí, objetos metálicos. El autoclave es más efectivo al ser más rápido, pero sus ventajas son el no corroer utensilios de cristal ni metálicos y puede utilizarse para esterilizar polvo, aceite y otros materiales diversos. - RADIACIONES – Bloquean la correcta síntesis del DNA. Su acción depende del tipo de radiación, el tiempo de exposición y la dosis empleada. Las que causan la muerte de microorganismos pueden ser de 2 tipos:

1. Radiaciones ionizantes Agente esterilizante que utiliza una λ muy corta (15nm) aunque la más efectiva es la comprendida entre 200-300nm.

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a) Luz ultravioleta: ejerce su efecto provocando errores en la duplicación del DNA. Es bastante letal, pero no atraviesa eficazmente el cristal, las películas de suciedad, el agua ni otras sustancias, por lo que se utiliza para descontaminar superficies, como habitaciones.

- FILTRACIÓN – No afecta a la viabilidad del microorganismo: no destruye los microorganismos, sino que simplemente los retira o separa físicamente del medio. Existen numerosos tipos de filtros: 1. Filtros de membrana Son filtros circulares de membranas porosas de acetato de celulosa o nitrato de celulosa. Tienen unos poros de unos 0,22µm de diámetro que permiten el paso de la solución pero no de células vegetativas, aunque no de virus. Es una “esterilización”. Se han de utilizar equipos de filtración, como el consistente en un matraz con una abertura lateral o Kitasato, conectado a una bomba de vacío. Hay un embudo sobre el que se pone el filtro, que a su vez se posa sobre otro embudo. Se utiliza para soluciones o medios termolábiles. Como aplicación adicional se puede utilizar este filtro para desarrollar colonias y hacer un recuento de las células que había en un medio determinado. Es muy utilizado para el análisis microbiano de aguas. 2. Filtros HEPA Son filtros de alta eficacia de retención de partículas del aire.

• AGENTES QUÍMICOS Se dividen en: - Esterilizantes - Desinfectantes y antisépticos 1. Esterilizantes a) Gases: emplea gases como el óxido de etileno y la β-propiolactona. Ejercen su acción porque producen alquilaciones en proteínas, es decir, la sustitución de grupos H en proteínas, alterando la estructura y funcionalidad de esas proteínas). El óxido de etileno tiene mayor poder de penetración que la β-propiolactona y se utiliza para esterilizar material ya empaquetado. b) Aldehídos: los más utilizados son el formaldehído y el glutaraldehído. Ejercen su acción porque se combinan con los ácidos nucléicos y las proteínas, inactivándolos. También posee efecto esporicida. Se utilizan para descontaminar edificios. 2. Desinfectantes y antisépticos a) Inorgánicos: - Metales pesados: Hg (mercromina), Ag, Zn (fungicida), arsénico, Cu (sulfato de cobre para las piscinas). - Ácidos y álcalis: actúan alterando la permeabilidad celular y coagulando proteínas. El más usado es la sosa (NaOH), pero está limitado por su alto poder corrosivo. - Compuestos oxidantes: como el peróxido de hidrógeno (H2O2) o agua oxigenada. Actúa oxidando compuestos de las membranas celulares y enzimas, y diluída se utiliza como antiséptico. - Halógenos: como el cloro y el yodo. Son fuertementes oxidantes. El cloro (utilizado como cloro, cloro gas o hipoclorito sódico (lejía)) se combina con el agua dando óxido atómico, que actúa oxidando proteínas.

Cl + H2O HClO

HCl + HClO HCl + O

22

El yodo (usado como tintura de yodo, yodóforos) tiene un efecto desinfectante mediante la inactivación de proteçinas y enzimas. Al aumentar su concentración, también tiene efecto esporicida.

b) Orgánicos: - Alcoholes: efecto bactericida y fungicida. Actúan desnaturalizando proteínas, disolviendo los lípidos de membrana y como agentes deshidratantes. Cuanto más larga es su cadena carbonada, más efecto bactericida, menos solubles en agua y menos efecto como agentes antimicrobiano presenta. - Fenol y compuestos fenólicos: el fenol fue el primer antiséptico y desinfectante de uso generalizado. Hoy en día se usa poco ya que es muy tóxico. los compuestos fenólicos alteran proteínas y la permeabilidad de la membrana plasmática. Los más usados son el hexaclorofeno, ortofenilfenol, ortocresol. - Colorantes: también tienen efecto antimicrobiano. - Colorantes derivados de la acridina: como el naranja de acridina, que interfiere en la correcta síntesis de DNA. -Colorantes derivados del trifenilmetano: como el cristal violeta, violeta de genciano, verde malaquita,… bloquean la correcta síntesis del peptidoglicano de la pared bacteriana. Efecto mayoritario contra las bacterias Gram+. - Detergentes: ejercen su acción porque lesionan la membrana plasmática de las células desordenando la disposición de proteínas y fosfolípidos de membrana. Tienen una amplia utilidad como desinfectantes y son efectivos contra la mayoría de las bacterias pero no contra las esporas. Los detergentes con más capacidad desinfectante son: - Detergentes catiónicos - Compuestos del amonio cuaternario: tienen en su estructura un nitrógeno cargado positivamente. Por ejemplo, el cloruro de benzalconio.

COEFICIENTE FENÓLICO (CF) Es un parámetro que se calcula para cada uno de los desinfectantes con el que se mide la efectividad de ellos en comparación con la del fenol. Se utiliza el fenol por ser el primer desinfectante que se usó. CF = 1 CF < 1 CF > 1

el desinfectante tiene la misma efectividad que el fenol es más efectivo que el fenol es menos efectivo que el fenol

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BLOQUE II : ESTRUCTURA Y FUNCIÓN EN LOS MICROORGANISMOS TEMA 6: MORFOLOGÍA EXTERNA DE LA CÉLULA PROCARIOTA TAMAÑO DE LOS PROCARIOTAS Las medidas utilizadas son el nanómetro (nm) y la micra (µm). El diámetro de las células procariotas es normalmente inferior a 2µm. El tamaño es un parámetro determinado genéticamente y condicionado por los factores ambientales. Ejemplos de bacterias y sus tamaños: - Bacillus megaterium: 1,5 x 4 µm. Es de las bacterias más grandes. - Oscillatoria: 8 x 50 µm. Es una cianobacteria. - Epulopiscium: puede alcanzar longitudes de 500µm (0,5mm). Se descubrió en 1993. - Thiomargarita: alcanza hasta 700µm de diámetro. Se descubrió en 1999. - Streptococcus pnemoniae: 0,8µm de diámetro. - Haemophillus influenzae: 0,25 x 1,2 µm. - Micoplasmas: 0,2µm. - Nanobacterias o ultramicrobacterias: 0,05µm. Consecuencias de tener un tamaño pequeño:

1. Se necesita usar un microscopio para observar la muestra. 2. Si se quiere extraer una conclusión acerca de una característica, hay que estudiar poblaciones del mismo tipo de bacteria. 3. Las bacterias en una solución dispersan la luz (efecto Tyndall) y confieren turbidez a los medios. 4. Aumentan la viscosidad de los medios en los que habitan. 5. Presentan una alta relación superficie/volumen (s/v), ya que, a mayor relación, más puntos de contacto con el medio presentan, y por tanto mayor capacidad de captar nutrientes y desecharlos, lo que les confiere además una mayor tasa de crecimiento.

R=1

R=2

s

/v = 3

4Πr2 3 s /v = = 3 4/3Πr Π

s

/v = 1,5

MORFOLOGÍA DE PROCARIOTAS Existen distintos tipos de morfologías:

1. Coco: células de forma esférica

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2. Bacilo: forma cilíndrica o de bastoncillos con extremos de diferente manera (puntiagudos, redondeados, cuadrados,…). 3. Bacilococo o cocobacilo: bacterias no tan alargadas como los bacilos ni tan esféricas como los cocos. Aún así siguen siendo más anchas que largas. 4. Espirilo: morfología en espiral o helicoidal, pudiendo presentar una o más vueltas de hélice. A su vez se dividen en: a) Espirilo: célula helicoidal rígida b) Espiroqueta: célula helicoidal flexible 5. Vibrios: células con morfología similar a una coma o a un bacilo curvado, asemejándose a una media vuelta de hélice. Existen otras morfologías diferentes, como células filamentosas, alargadas, que forman prolongaciones (tallos o pedúnculos).

- AGRUPACIONES DE CÉLULAS La mayoría de los procariotas se dividen asexualmente por fisión binaria. Se forma un tabique transversal y se separan las 2 células. Hay agrupaciones de células características: 1. Cocos

• Diplococos: son asociaciones de parejas de cocos. Se produce cuando los tabiques de división son en un solo plano y paralelos. Ej: Neisseria. • Estreptococos: los tabiques de división son en un solo plano y paralelos entre sí. Ej: Streptococcus. • Tétradas: los tabiques de división son paralelos o perpendiculares entre sí dando lugar a agrupaciones en tétradas o múltiplos de 4. Ej: Pediococcus. • Sarcinas: los tabiques de división aparecen en las 3 dimensiones del espacio, formando paquetes cúbicos. Ej: Sarcina. • Estafilococos: son agrupaciones de cocos irregulares. Los tabiques de división aparecen en cualquier dirección. Aspecto de racimo. Ej: Staphylococcus. Estreptococos Tétradas Coco

Diplococos

Sarcinas

Estafilococos 2. Bacilos

• • •

Estreptobacilos: cadena de bacilos. Ej: Bacillus. En empalizada En forma de V, de L o formas más peculiares.

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Estreptobacilus En empalizada Bacilo Otras formas - RELACIÓN ENTRE FORMA Y MODO DE VIDA – La relación superficie/volumen es mayor en bacilos y cocos, y aún mayor en bacterias filamentosas. Sin embargo, los cocos suelen ser más resistentes que los bacilos. La mayor relación superficie/volumen se presenta en una bacteria, la bacteria de Walsby, que es cuadrada, y que se descubrió en una charca salina.

- FENÓMENO DE MULTICELULARIDAD – La mayoría de los microorganismos son unicelulares. No obstante, algunas forman grupos de bacterias, como: - Cianobacterias: son bacterias Gram-. - Actinomicetes: son bacterias Gram+.

ESTRUCTURAS EXTERNAS Son: - Cápsula - Pared celular - Membrana plasmática - Fimbrias - Protoplastos - Flagelos

· LA CÁPSULA Es una capa de naturaleza viscosa o mucilaginosa que presentan algunos procariotas externamente a la pared celular. No es indispensable para la vida del microorganismo. Las cápsulas bacterianas pueden estar asociadas en mayor o menor grado a la pared celular, clasificándose así en: - Integrales: asociadas a la pared celular - Periféricas: asociadas débilmente a la pared celular En base a su consistencia, las cápsulas pueden ser: - Rígidas: gran consistencia - Flexibles: baja consistencia La denominación de cápsula se utiliza para aquellas capas integrales y rígidas. Sin embargo, las periféricas y flexibles se denominan capas mucilaginosas. Algunos autores les llaman cápsulas a las dos. La cápsula se puede poner de manifiesto por tinción negativa (tinta china).

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- COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA – Las cápsulas pueden tener naturaleza: Polipeptídica: son poco comunes. Es un polímero formado por el aminoácido glutámico. Se presentan, por ejemplo, en Bacillus anthracis. 2. Polisacarídica: son las más comunes. Se las conoce como glicocálix. A su vez se diferencia en: a) Fabricadas con gasto de energía interno por parte de la célula o de origen interno: son cápsulas constituidas por polisacáridos sintetizados directamente por la célula. b) Fabricadas sin gasto directo de energía o de origen externo: la bacteria sintetiza la cápsula a partir de sustancias que encuentra en el medio que la rodea.

1.

GDPGal …

GTP

ATP

ADP-

UTP

UDP- glc gal …

Estos compuestos se transportan fuera por un líquido isoprenoide y se van formando los distintos tipos de cápsulas.

• •

Acetobacter xylinum: presenta una cápsula de celulosa compuesta por unidades de glucosa β(1-4). Agrobacterium tumefaciens: unidades de glucosa β(1-2), que es un tipo de enlace exclusivo de esta bacteria. • Escherichia coli: forma dímeros, produciendo ácidos colánicos. • Pseudomonas sp: utiliza polisacáridos derivados de la glucosa, llamados ácidos poliurónidos. • Streptococcus pneumoniae: presenta una cápsula mixta, compuesta por muchos polisacáridos diferentes con muchos tipos de enlaces, todos derivados de la glucosa.

- CÁPSULAS SIN GASTO DE ENERGÍA – Se sintetizan dependiendo de la naturaleza del medio, de si hay sustancias para sintetizarlas.

• Leuconostoc mesenteroides: su cápsula se utiliza como agente espesante en la industria agroalimentaria. Para formarla, necesita sacarosa, que debe estar presente exógenamente en el medio. Una enzima, la invertasa, separa la sacarosa en glucosa y fructosa, y la bacteria utiliza uno de los dos como fuente de carbono y con el otro forma la cápsula, dependiendo de la cepa que sea. Parte de la energía que obtiene al romper este enlace lo utiliza para pegar el monosacárido que no usa como fuente de carbono a una molécula de sacarosa. Sac-frc-frc-frc-frc-(frc)n Sac-glc-glc-glc-glc-(glc)n

forma un compuesto llamado levano

forma un compuesto llamado dextrano

Las cápsulas en general presentan numerosas funciones: 1. Receptores virales: la cápsula es el lugar donde los virus se pegan por una adhesión específica. Hay reconocimiento específico, determinado muchas veces por la naturaleza de la cápsula. 2. Propiedades de adherencia 3. Produce protección frente al sistema inmune 4. Produce mayor capacidad de invasión: por ejemplo, Streptococcus pnemoniae pasa desapercibido con la cápsula por el sistema inmune, pero es detectado sin ella.

27

5. En algunos casos, actúan como antígenos de sustancias dañinas. Los antígenos situados en la cápsula son antígenos V. · LA PARED CELULAR Da forma a la bacteria. Les da la capacidad de vivir en medios donde varía la presión osmótica. La membrana sí es susceptible a los cambios osmóticos, ya que al estar reforzada, impide la lisis. En 1952, Salton se dio cuenta de que si se analizaban las paredes de las células desde el punto de vista de la composición química, todas encajaban en 2 bloques:

1) 50-80% peptidoglicano Polisacáridos Ácidos teicoicos Proteínas (pueden no aparecer)

2) 1-10% peptidoglicano Proteínas y fosfolípidos Lipoproteínas (LPP) Lipopolisacáridos (LPS) Se vio entonces que la pared celular se podía clasificar en 2 tipos:

a) Gram+ : pared celular homogénea, gruesa, con mucho peptidoglicano donde aparecen polisacáridos y ácidos teicoicos que las distinguen. b) Gram- : lámina muy fina de peptidoglicano que forma una capa rígida. Las proteínas y los fosfolípidos forman una membrana externa. Después el LPP va a anclar la membrana externa a la capa rígida, y el componente más externo es el LPS. El peptidoglicano define a las células como procariotas. Todas las células con peptidoglicano son procariotas, aunque no todas las células procariotas tienen peptidoglicano. - Micoplasmas: son bacterias sin pared celular, y por lo tanto, sin peptidoglicano. - Arqueas: presentan pseudopeptidoglicano.

- EL PEPTIDOGLICANO – El peptidoglicano o mureína es un gran polímero compuesto por muchas subunidades idénticas. Es una especie de celulosa, pero realmente es el precursor de ésta porque apareció antes. El peptidoglicano es un heteropolímero que contiene 2 derivados de azúcar: - N-acetilglucosamina (NAG) - Ácido N-acetilmurámico (NAM): derivado del NAG El esqueleto de este polímero está constituido por residuos alternantes de NAG y NAM. CH2OH

CH2OH

O H

OH

OH H

O H

H

OH

OH

NH-CO-CH3

COOH

28

H NH-CO-CH3

NAG CH2OH

NAM

CH2OH

O

CH2OH

O

β(1-4)

H

β(1-4)

O

OH

H

O

NHCOCH3

O

COOH

…

NHCOCH3

H

NHCOCH3

El grupo COOH del NAM es muy reactivo y puede formar enlaces con aminoácidos, que en procariotas pueden ser del tipo L y D.

NAG – NAM – NAG – NAM – NAG – NAM L-ala D-glut Ác. mesodiaminopimélico D-ala (tiene un COOH terminal que puede unirse a otra cadena tetrapeptídica por un puente peptídico, o directamente al ácido diaminopimélico de la otra cadena)

Las cadenas de subunidades de peptidoglicano están entrecruzadas por sus péptidos. A menudo, el grupo carboxilo de la D-alanina terminal de una mureína está conectado directamente al grupo amino del ácido diaminopimélico de una mureína de otra cadena paralela, pero en otras ocasiones se puede emplear en su lugar un interpuente peptídico.

- PARED CELULAR DE GRAM POSITIVAS – Normalmente, la gruesa pared celular de las bacterias Gram+ está constituida principalmente por peptidoglicano, cuyas mureínas a veces están entrelazadas por puentes peptídicos. Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicoicos, que son polímeros que se intercalan entre el peptidoglicano y la membrana. Algunos se unen a la membrana estableciendo enlaces con ella; a éstos se les llaman ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos pueden ser:

a) Glicerolteicoicos: derivados del glicerol. Distintas moléculas de glicerol se unen entre sí por puentes difosfato entre el C1 de un glicerol y el C3 de otro glicerol.

CH2 CHOH

O

CH2OH

O

CH2OH

P

CHOH

OH

O

CH2

b) Ribitolteicoicos: derivados del ribitol. 2 moléctulas de ribitol se unen entre sí mediante un enlace

difosfato entre el C1 y C5. Los grupos libres forman enlaces de tipo glicosídico con aminoácidos. Los ácidos teicoicos de las Gram+ se diferencian también por los grupos OH que tienen libres.

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Todo esto constituye una estructura cementante. Los ácidos teicoicos también actúan como antígenos que el sistema inmune de vertebrados reconoce como extraño.

- PARED CELULAR DE GRAM NEGATIVAS – La pared celular de las Gram- es más compleja que la de Gram+. Presenta poca cantidad de peptidoglicano pero mucha de LPS y LPP. La estructura de la pared celular consta de varios estratos.

1. Membrana externa: situada por fuera de la capa fina de peptidoglicano y compuesta por numerosas proteínas y fosfolípidos. 2. Capa rígida: fina capa de peptidoglicano. Está fuertemente unida a la membrana externa por LPP, que son moléculas que tienen una porción proteica y otra lipídica. La parte proteica presenta un COOH terminal que puede formar enlaces covalentes con la capa rígida; la parte lipídica se mete entre los fosfolípidos de membrana. Los LPP actúan como un enganche estructural entre ambas capas, además de conferirle impermebilidad a la pared celular por tener permeabilidad selectiva. 3. Espacio periplásmico 4. Membrana plasmática La capa rígida presenta una serie de discontinuidades que permite que se establezcan uniones entre la membrana externa y la membrana plasmática, que se denominan uniones de Bayer. No son estructuras estáticas, sino que aparecen y desaparecen, dependiendo de las discontinuidades y de las interacciones entre ambas membranas. La causa por la que pierden el CV es porque éste sale por las uniones de Bayer o por las discontinuidades de la capa rígida. La membrana externa tiene proteínas como las porinas u Omp (Outer Membrane Proteins o proteínas de la membrana externa). Estas proteínas son trímeros formados por 3 unidades idénticas que se asocian dejando un poro en el centro que se cierra o abre en función del contacto con las distintas sustancias. Por ejemplo, la OmpC permite el paso de antibióticos. Modificando las porinas, las bacterias pueden hacerse resistentes a antibióticos. Gram+: realizan mucho gasto de energía porque secretan enzimas al exterior para luego recoger lo que éstas digieren, pero a lo mejor no recogen nada porque no hay nada en el medio. Gram-: realizan menos gasto de energía porque tienen transportadores específicos, y las enzimas esperan en el protoplasma. Otro componente son los lipopolisacáridos (LPS), moléculas complejas que consta de una parte lipídica y parte de carbohidratos. - La parte basal es la lipídica, llamada lípido A o LipA, que contiene ácidos grasos y liposamina. - Ésta se continúa con una zona llamada región R, que es constante en todas las bacterias, con azúcares de 7 carbonos o heptosas y oxiazúcares. - Después hay una porción distal o antígeno O formado por una serie de azúcares que se repiten y que varían según la especie. Este LPS se ancla en la membrana externa por la zona LipA y el resto de la molécula (antígeno O y región R) salen al exterior. El sistema inmune de vertebrados reconoce el antígeno O como extraño, y es además tóxico, produciendo fiebre porque actúa sobre los centros termorreguladores de la temperatura. Una enzima, la transpeptidasa, realiza enlaces entre 2 aminoácidos (transpeptidización). Algunos antibióticos β-lactámicos (como la penicilina) inhiben la transpeptidización; las bacterias siguen con su pared celular pero no la tienen organizada a nivel de la membrana citoplasmática: se inhibe la formación de

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enlaces pero no los rompe. Las bacterias mueren si están en fase de crecimiento, porque si los enlaces están ya hechos no se ven afectados. Para atacar a las células ya crecidas hay enzimas, como la lisoenzima descubierta por Fleming, presente en la clara de huevo, en las lágrimas y la saliva. Actúa rompiendo los enlaces β(1-4) peptidoglicano entre NAM y NAG, en células en crecimiento y ya crecidas.

Sin lisozima Lisozima + MgSO4 1M

Protoplasto

Lisis

Esferoplasto

• Protoplastos: células a las que por tratamiento con lisozimas se les ha quitado la pared celular. Es una forma que se obtiene en el laboratorio y está totalmente desprovista de la pared celular. Adquieren una forma esférica para obtener una mayor relación superficie-volumen. • Esferoplastos: los que se consiguen en el laboratorio se denominan formas L. las formas naturales se producen por bacterias que viven en presencia de lisozimas o enzimas similares, en un medio estabilizado osmóticamente. Queda parte de la pared celular. Si dejamos las formas L crecer en un medio sin lisozimas, se regeneran totalmente.

31

TEMA 7: MORFOLOGÍA EXTERNA (II) LOS FLAGELOS La mayoría de las bacterias móviles se desplazan mediante flagelos, que son estructuras huecas que actúan como apéndices locomotores y para los que existen tinciones específicas. Las células pueden presentarlos o no, y si los presentan pueden hacerlo de forma diversa que, además, es un carácter taxonómico.

Polar

Subpolar

Lofotrica

Anfitrica

Peritrica

Para comprobar si un microorganismos tiene flagelos, se puede hacer mediante siembra en picadura en un medio semisólido o con tinciones. Guepardo: desplaza la longitud de su cuerpo 25 veces por segundo. Bdellovibrio: desplaza su cuerpo 60 veces por segundo, gracias a un flagelo polar envainado que mueve la pared celular también. Es el microorganismo más rápido. Los flagelos está compuesto por 3 partes: Filamento o flagelo externo: la parte más larga y expuesta que se extiende desde la superficie celular hasta la punta. Es un cilindro rígido y hueco constituido por una proteína sencilla, denominada flagelina. Esta proteína se dispone siguiendo una estructura helicoidal cuya vuelta de hélice es específica, y su peso molecular también varía entre especies. 2. Cuerpo basal: no contiene flagelina. 3. Curva o gancho: segmento curvado y corto, que une el filamento al cuerpo basal y actúa como acoplamiento flexible. El gancho y el cuerpo basal son diferentes estructuralmente al filamento. El gancho, ligeramente más ancho que el filamento, está formado por diferentes subunidades de proteínas. El cuerpo basal es la parte más compleja de un flagelo, y presenta 2 ó 4 anillos unidos por un vástago central.

1.

32

•

Gram+: presentan 2 anillos S y M, uno interno en comunicación con la membrana plasmática y otro externo, unido probablemente a la capa de peptidoglicano. • Gram-: presentan 4 anillos, S, M, L y P. Estos últimos se insertan en la capa rígida y la membrana externa. Membrana externa

L Peptidoglicano

S M

P S M

Membrana plasmática

Gram + Los anillos S y M son comunes a ambos tipos de bacterias.

Gram -

Alrededor del anillo interno M y anclado en la membrana citoplasmática hay un par de proteínas denominadas Mot, que gobiernan realmente el motor flagelar provocando la rotación del filamento. Existe finalmente un conjunto de proteínas demoninadas Fli que actúan como un conmutador del motor invirtiendo la rotación del flagelo en respuesta a señales intracelulares. Todo esto se realiza con gasto de ATP. El movimiento flagelar es, a veces, necesario para su supervivencia, por ejemplo para salir de ambientes desfavorables.

• Pseudomonas: microorganismo típicamente aerobio que produce ATP en presencia de oxígeno por fosforilación oxidativa. Cuando falta oxígeno en el medio, utiliza un proceso alternativo de obtención de energía mediante el uso de L-arginina por la vía de la arginina hidrolasa, hidrolizando la arginina en citrulina y amoniaco. L-arg

Citrulina + NH3 Carbamil-P + Ornitina ADP + P ATP

CO2 + NH3 Las bacterias se pueden mover por otros mecanismos diferentes a la rotación flagelar. Las espiroquetas y las bacterias helicoidales se desplazan mediante movimientos de flexión y giro producidos por un filamento axial o axostilo. Este filamento tiene origen lofotrico y anfitrico. El número de filamentos que componen el filamento axial siempre es doble en el centro respecto a los extremos, y es un carácter taxonómico. Estos filamentos son de flagelina. Otros microorganismos, como las cianobacterias, se mueven sobre superficies por un movimiento que no depende de los flagelos.

PILI Y FIMBRIA Presentes en todas las bacterias, tengan o no flagelación. Son estructuras rectas, huecas. Las unidades estructurales son las pilinas, que son proteínas específicas de cada tipo de bacterias. Las pilinas forman los pilis o fimbrias que sirven para la sujeción y fenómenos de adhesión, intercambios de DNA por conjugación, también absorción de bacteriófagos, emisión de plásmidos… Las pilinas que se van incorporando al flagelo se encuentran en el extremo. Se ha observado por experimentos de pulso y caza, marcando el compuesto radiactivamente: se vio que las pilinas crecen distalmente.

MEMBRANA CELULAR

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Es el único sistema interno que existe en las células procariotas. El modelo de mosaico fluido es compartido por las células procariotas. Las membranas bacterianas se diferencian normalmente de las de eucariotas en que carecen de esteroles, como el colesterol. En las membranas se sitúan permeasas, enzimas biosintéticas y también todos los mecanismos que generan ATP. Aunque el citoplasma bacteriano no contiene orgánulos membranosos complejos como mitocondrias o cloroplastos, se pueden observar varias clases de estructuras membranosas. Una común es el mesosoma, que son invaginaciones de la membrana plasmática con el fin de aumentar la superficie de la membrana, formándose vesículas, túbulos o lamelas. A veces sirve de anclaje del DNA en la replicación del genóforo.

TEMA 8 : MORFOLOGÍA INTERNA DE LA CÉLULA PROCARIÓTICA MATRIZ CITOPLASMÁTICA Es la sustancia situada entre la membrana plasmática y el nucleoide. Está compuesta fundamentalmente por agua (casi 70%). La de las células procariotas, a diferencia de la de eucariotas, carece de orgánulos limitados por una membrana unitaria. El interior es granulado por la presencia de ribosomas, que son del tipo 70S. Los ribosomas 70S tienen dos subunidades: 50S y 30S, que están compuestas de proteínas y de RNA.

50S 30S

RNA 23S + 35 proteínas RNA 5S RNA 16S + ±21 proteínas

Muchas de estas proteínas van a ser diana de muchos antibióticos. El RNA ribosomal de la subunidad 30S se utiliza como marcador biológico para hacer análisis cuantitativos y de relaciones entre bacterias.

- ESTRUCTURAS CARACTERÍSTICAS 1.

Inclusiones de reserva: a) Reservas orgánicas no nitrogenadas: como los acúmulos de glucógeno y almidón. Son unidades de glucosa unidas por un enlace α(1-4). b) Reservas orgánicas no nitrogenadas que sólo se encuentran en procariotas y no en eucariotas: como las reservas de poli-β-OH-butirato. α β CH3 – CH – CH2 – COOH

OH Se puede unir una molécula de β-OH-butirato con otro por enlaces éster, y así formar grandes polímeros. Estos acúmulos se pueden ver por microscopía electrónica.

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Lo acumulan en forma de acúmulos no solubles en el interior celular, así no varía la presión osmótica, y también evita que se cambie mucho la carga interna manteniendo el PH. c) Reservas orgánicas nitrogenadas: son específicas de procariotas y específicamente de cianobacterias. Se denominan corpúsculos de cianoficina, y se trata de un acúmulo de arginina y aspártico. Es un dímero que se repite muchas veces. Es una proteína única presente en cianobacterias y no se sintetiza en los ribosomas. Esta proteína tiene función de reserva y estructural. d) Gránulos de volutina o corpúsculos metacromáticos: se tiñen con colorantes básicos y son acúmulos insolubles. Son polímeros lineales de ortofosfato unidos linealmente. Acumula el ATP en forma de polifosfatos actuando como reserva energética de enlaces de alta energía.

(P)n + ATP

(P)n+1 + ADP

Este mecanismo no está presente en eucariotas. e) Reservas de azufre: suelen presentarse en microorganismos fototrofos.

CO2 + H20

C6 + O2

Es una fotosíntesis anoxigénica, en la cual no se desprende oxígeno sino azufre. Utilizan compuestos reducidos de azufre en lugar de una molécula de agua.

CO2 + H2S

C6 + S

Son inclusiones de desecho que corresponden a este azufre, que a veces se almacena fuera o dentro de las células. Es un carácter sistemático. f) Sideróforos: acumulación de metales. Dentro de ellos, están los magnetosomas, donde se acumulan óxidos de hierro, especialmente magnetita. - Aquaspirillum magnetotacticum: se comporta como una brújula. Le sirve a la bacteria como mecanismo de orientación. También existen orgánulos procarióticos limitados por membranas esencialmente proteicas.

1.

Vacuolas gaseosas: Formadas por dos tipos de proteínas, Gup C y Gup A. Esta membrana proteica delimita un espacio, una especie de vacoulas que encierran gases. La presencia de estos gases va a regular el nivel de flotación de las células. Su movimiento no depende de los flagelos. Aparecen en microorganismos relacionados con ambientes acuáticos. Se presentan en microorganismos fototrofos o quimiotrofos, pero siempre acuáticos.

Oscillatoria thiopedia Ancalomicrobium thothrix

fototrofo quimiotrofos

2.

Clorosomas o vesículas fotosintéticas: Se descubrieron en el género Chlorobium. Son estructuras internalizadas y se piensa que son invaginaciones de la membrana que han perdido la porción lipídica y se han independizado. En ellas se depositan los pigmentos fotosintéticos de este grupo de bacterias. En bacterias fototrofas verdes o no purpúreas; también las clorobacteráceas presentan este tipo de estructuras. 3. Carboxisomas o cuerpos poliédricos: En todos los microorganismos autótrofos, bien sean fotoautótrofos (cianobacterias) o quimioautótrofos.

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Son estructuras poligonales, de aspecto granulas y rodeados por una membrana estrictamente proteica. Presentan en su interior la Rubisco (ribulosa difosfato carboxilasa). Cataliza la primera reacción del Ciclo de Calvin fijando una molécula de CO2. 4. DNA bacteriano: El interior de la célula presenta una zona difusa que corresponde al nucleoplasma, el cual contiene el genóforo bacteriano, compuesto de DNA circular normalmente y que carece de membrana. - Borrelia burgdorferi: fue la primera bacteria en la que se descubrió que el DNA no era circular sino lineal. - Las bacterias del género Streptomyces también presentan DNA lineal. - Las demás bacterias tienen el DNA circular formando el genóforo.

DNA circular DNA lineal

2 horquillas de replicación 1 horquilla de replicación

5. Plásmidos: Son formaciones genéticas extragenofóricas. Existen de diversos tipos, con funciones diferentes, y algunas características de las células vienen determinadas por la presencia o ausencia de estos plásmidos. Algunas bacterias son resistentes a antibióticos por la presencia de plásmidos, otras son patógenas porque el plásmido produce las toxinas (lo que produce la aparición de una cepa patógena y otra no patógena de la misma bacteria). - ENDOSPORAS BACTERIANAS Y FORMACIONES CRISTALINASLas endosporas se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas de tan sólo algunos géneros como Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces,… Estos microorganismos son fácilmente aislables en la naturaleza mediante la aplicación de un choque térmico, que mata a todas las células vegetativas. Estas estructuras son extraordinariamente resistentes a situaciones estresantes ambientales, como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación. De hecho, algunas esporas han permanecido viables miles de años, y se han recuperado especies ya extintas del interior de insectos fosilizados en ámbar. En el ambiente, las endosporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los nutrientes son escasos. Son, además, un índice taxonómico. En Bacillus: •

Esporas centrales

•

Esporas terminales

•

Esporas subterminales

36

Se puede provocar o no la expansión de la pared celular Las bacterias que forman endosporas sólo lo hacen en el periodo estacionario, es decir, cuando ya no crecen más. Existen distintas fases o estadíos: 1. Fase I: La célula duplica el DNA y se forma una especie de eje central en el centro de la célula. 2. Fase II: Sin que se rompa la pared, la membrana citoplasmática se invagina como si fuese a formar un septo central pero no lo forma. 3. Fase III: Las invaginaciones de la membrana contactan formando un septo, formándose la proespora. 4. Fase IV: Depende de cómo sea la bacteria y la disposición final de la espora. Una de las dos partes de la célula comienza a englobas a la otra, que se deshidrata mientras la primera va avanzando sobre ella. Durante esta fase se empiezan a segregar materiales que son:

a) Pared celular: típicamente Gram +. b) Córtex: situado sobre la pared celular, de composición similar a la pared celular pero carece de tetrapéptidos. c) Cutícula: capa estrictamente proteica formada por un aminoácido, la cisteína. d) Exosporio: superpuesto a todo. Puede presentarse o no, dependiendo de la taxonomía. Son restos de la membrana de la célula lisada que quedan adheridos a la espora. 5. Fase V: Una vez formada la espora, la célula vegetativa se lisa por secreción de lisozimas y la espora se libera y queda en el medio hasta que las condiciones vuelvan a ser favorables. Con un choque térmico volverá a germinar

I

V

II

IV

III Cutícula Córtex

37

Pared celular Exosporio

Estas formas son muy resistentes a factores físicos y químicos, gracias a sus envolturas pero también a compuestos que sólo aparecen en esporas: el ácido dipicolínico. Normalmente se encuentra formando a dipicolinato cálcico, que es exclusivo de procariotas en su forma esporulada y les proporciona características de termoestabilidad y refractibilidad. El ácido dipicolínico deriva del ácido aspártico.

Asp Semialdehído aspártico Piruvato Ácido Dihidropicolínico CÉLULAS NORMALES

CÉLULAS EN ESPORULACIÓN

mDAP

Ácido Dipicolínico

Lys

Dipicolinato Cálcico

HOOC

N

COOH

Ácido dipicolínico

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Nt

Lisis

metabolismo primario

t metabolismo secundario Crecimiento bacteriano Nº de esporas

La resistencia al calor es paralela al número de esporas, al aumento de ácido dipicolínico y al aumento de la refractibilidad. Los microorganismos lo hacen como método de supervivencia. No hay aumento del número de microorganismos. Durante el período de metabolismo secundario se producen compuestos reguladores del proceso de esporulación, como los antibióticos. Los microorganismos que producen antibióticos ya no crecen, sino que comienzan la esporulación, así que los antibióticos no suponen una ventaja ecológica. Todos los microorganismos que sintetizan antibióticos son formadores de esporas, tanto exosporas como endosporas. Existen numerosas diferencias entre la célula vegetativa y las esporas:

1) La estructura de las capas: las esporas tienen una pared celular tipo Gram +, exosporio, córtex y cutícula. 2) Concentración de calcio: es superior en esporas. 3) Concentración de ácido dipicolínico: mayor en esporas. 4) Índice de refracción: mayor en esporas. 5) Recursos de reserva: las esporas consumen todos sus productos de reserva durante la esporulación. 6) Actividad enzimática: es nula en esporas, y alta en células vegetativas. 7) Resistencia: mucho superior en esporas. 8) Concentración de agua: en las esporas es prácticamente 0. 9) El paso de célula vegetativa a espora: (esporulación) siempre forma unas estructuras llamativas denominadas proteínas paraesporales o cuerpos cristalinos, que son tóxicas para larvas de insectos. Los compuestos producidos por Bacillus thuringiensis son utilizados en agricultura.

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TEMA 9: EL CRECIMIENTO BACTERIANO - DEFINICIÓN – El crecimiento se puede definir de 2 maneras diferentes: -

Aumento de la capacidad, de los componentes químicos y de las estructuras de una célula. Aumento del número de células. Conocido como “crecimiento poblacional”.

-

El crecimiento de una población unicelular ocurre de manera exponencial: 2 – 4 – 8 – 16 – 32 – 64 … Ocurre además a una velocidad de división o generación más cortos que existen. Hay células que se dividen en unos 8 minutos Nt

logNt

Crecimiento exponencial

Relación lineal

MÉTODOS PARA DETERMINAR EL NÚMERO DE CÉLULAS EN UN MOMENTO DETERMINADO Existen 3 procesos: 1. Contaje celular 2. Determinación de la masa celular 3. Determinación de actividades bioquímicas celulares

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- CONTAJE CELULAR – 1. Contaje microscópico directo: Se basa en la determinación de células totales, tanto vivas como muertas, mediante la utilización de cámaras cuenta-glóbulos como la de Thoma o Neubauer. Se componen de portaobjetos de vidrio que presentan una depresión donde colocamos la muestra, y sobre ella el cubreobjetos. La depresión tiene 0,1mm de profundidad y 1mm de lado. En total hay 16 cuadrados en el portaobjetos. Mirando por el microscopio observamos una disposición de las bacterias en los 16 cuadrados. Podemos contar el número de bacterias de cada uno de los 16 cuadrados o realizar una media. 1mm x 0,1mm = 0,1mm3 = 10-4 cm3 = 10-4 ml El volúmen de muestra que entra en el depósito una vez que lo raseamos con el cubre es de 10 -4 ml.

__

X · 16 · 10-4 ml = x · 1,6 · 10-5 céls/ml · d X = 1 cuadrado D = dilución (si se ha hecho)

2. Contaje mediante contadores Coulter: Existe un pequeño orificio donde se aplica un campo eléctrico, y la corriente que va pasando se registra en un ordenador. Cada vez que pasa una célula aumenta la resistencia al paso de la corriente. Esta interrupción se registra, se procesa y nos da el número de células de la muestra. Este método tampoco diferencia entre células vivas o muertas. 3. Contaje en placa: Utilizada para contar el número de células vivas. Se realiza primero una siembra por extensión de una determinada cantidad de muestra, y vemos el número de colonias que aparecen. Este número de colonias será un reflejo del número que había antes. El contaje en placas de colonias muestra una vez más cómo se pueden utilizar las placas de medio con fines microbiológicos. 4. Determinación de colonias: Para determinar la concentración de bacterias en grandes cantidades de líquido (por ejemplo, 1000 litros de agua). Si cogemos como muestra una pequeña cantidad, por ejemplo 0,1mm, si la suspensión está muy diluída puede que no haya ninguna bacteria, y pensemos que en el resto tampoco hay ninguna. Para esto hay que concentrar la muestra, por ejemplo filtrando con membranas bacteriológicas. Éstas retienen las bacterias, que se van concentrando. La membrana se siembra entera en un medio, y las bacterias desarrollarán colonias encima de la membrana. 5. Técnica del número más probable (NMP) - DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR 1. Turbidometría: a) Fotometría: se utiliza el fotómetro. Entre un foco receptor de la luz y un receptor de esa luz, si colocamos un tubo con una suspensión podemos estudiar la luz que dispersa. Si el tubo contiene agua, la célula fotoeléctrica recogerá una intensidad de luz igual que al principio. Si el tubo contiene bacterias en dispersión, llegará una intensidad (I) de luz menor que la inicial. Este aparato mide la cantidad de luz no dispersada, que es inversamente proporcional a la cantidad de células que hay.

41

b) Nefelometría: se utiliza el nefelómetro. Las células fotoeléctricas están dispuestas de tal manera que recogen la luz dispersada, midiendo su intensidad.

a)

b)

D.O. (Densidad Óptica a una λ determinada)

Recta de calibración

[C] Esta gráfica nos sirve para cada vez que coloquemos un tubo en el fotómetro o en el nefelómetro. Construimos rectas patrones y ya no nos hace falta contar el número de células si sabemos la densidad óptica. 2. Determinación del peso seco: Se basa en coger una membrana bacteriológica y filtrar la muestra. Pesamos la membrana en seco antes de filtrar, y tras filtrar la muestra desecamos la membrana a peso constante, ya que la membrana retiene microorganismos y agua, y el agua debe ser eliminada. Peso de la membrana desecación

t Peso de la membrana sin filtrar Peso de la membrana después de filtrar Masa microbiana 3. Determinación de un constituyente celular:

42

Por ejemplo, la cantidad de nitrógeno total, DNA… Si esta cantidad aumenta, significa que aumenta la masa celular. 4. Determinación de las actividades bioquímicas celulares: A elevadas concentraciones de los microorganismos, aumenta el consumo de oxígeno. Si la cantidad de bacterias aumenta, también lo hará la cantidad de sustancias de desecho. Por lo tanto, estas actividades son proporcionales a la masa celular. Ejemplo: en algunas industrias determinadas realizan la “prueba de la reductasa”. Se usa Azul de Metileno: si se trata de un medio anaerobio se volverá blanco, pero su es aerobio será más azul. El hecho de que cambie de color nos ayuda a saber la masa celular ya que la leche contiene oxígeno disuelto. Si añadimos una concentración determinada del colorante a la leche, y calculamos el tiempo que tarda de pasar de azul a blanco, podemos determinar el “tiempo de reductasa” [microorganismos] [microorganismos]

tiempo de reductasa rápido tiempo de reductasa lento

Se puede utilizar esto como índice de crecimiento microbiano. Al determinar el peso de una masa microbiana, y sabiendo el número de células que hay, podemos saber el cuánto pesa un microorganismo solo. Independientemente de cómo midamos el crecimiento microbiano, podemos estudiar su evolución inoculando un medio líquido. Trofofase

Idiofase

Nº céls (N)

lisis

Lac

Log

Estacionaria

t

· CULTIVOS ASINCRÓNICOS Y SINCRÓNICOS En la industria a veces nos interesan los microorganismos en su fase exponencial o Log. Para conseguirlo podemos realiza 2 métodos:

1. Cultivo asincrónico o discontínuo : se trata de aprovechar al microorganismo en esta fase, y cuando pase a otra entonces empezar otra vez otro cultivo.

43

A

B

C

A = exceso de medio B = equilibrio C = déficit de medio

2.

Cultivo continuo: se puede conseguir mediante 2 técnicas: a) Quimiostato b) Turbidostato No vamos a diferenciar entre los 2. Si queremos mantener al microorganismo en fase exponencial, podemos poner un dispositivo óptico para medir la densidad óptica. Si le acoplamos un sistema que nos abra una válvula con medio de cultivo nuevo, cuando alcance una densidad óptica determinada, se abrirá y caerá una gota porque está nivelado. Al caer medio nuevo, la densidad óptica baja porque el medio se diluye. Al crecer las células, vuelve a subir la densidad óptica. Es un crecimiento exponencial continuo. Densidad óptica = K·N K = nº Si una industria está interesada en un producto, como el ácido cítrico, tiene que conseguir un cultivo continuo, apartar las células y así obtener el ácido cítrico. A nivel industrial, el cultivo continuo es muy importante. Volumen constante Cultivo continuo

Concentración celular constante

Hasta ahora hemos visto el crecimiento a nivel poblacional pero no nos ayuda a estudiar el individual. Todas las células no crecen igual, hay asincronía: todas se dividen pero no al mismo tiempo. Si lográramos que todas se dividiesen a la vez, actuarían como una gran célula, y estudiando una población es como si estudiásemos una sola célula. El cultivo continuo permite tener una población en fase exponencial pero asincrónica. El ciclo de los procariotas se divide en unas fases según los procesos que realizan con el DNA: Célula hija

G1 D

S

G1 D

G2

S G2

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G0

• • •

• •

•

G1 (fase gap) S : fase de síntesis de DNA. Se inicia con un cromosoma bacteriano y termina con 2. G2 División o citoquinesis G0 : la célula no se divide Hay un crecimiento asincrónico: algunas células estarán en G1, otras estarán en S,…

Para conseguir un crecimiento sincrónico, debemos estudiar la fase exponencial:

LogN

t g En la gráfica podemos ver que las células se dividen como en pulsos. Cada paso de la escalera en la gráfica es un paso de generación. Los cultivos sincrónicos no duran mucho: tarde o temprano aparecerá asincronía. Un cultivo asincrónico es una suma de muchos cultivos sincrónicos, cada uno en una fase. El efecto sumatorio de esa sincronía es lo que nos da la línea recta. Para obtener un cultivo sincrónico tenemos 2 técnicas diferentes: 1) Mecanismos de inducción 2) Mecanismos de selección - MECANISMOS DE INDUCCIÓN Consiste en manipular las condiciones ambientales.

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a) Cuando un procariota se está dividiendo, se dan numerosos procesos bioquímicos dependientes de elementos del medio. Si le quitamos uno, podemos detener al procariota en una fase determinada. Por ejemplo, si quitamos del medio un elemento necesario para la síntesis de DNA (fase S), tarde o temprano todas las células estarán bloqueadas en el mismo punto. b) Otro método es manipulando la temperatura: algunas fases son termosensibles. Si una fase se debe realizar a una temperatura determinada, y la modificamos, todas las células se quedarán paradas porque no podrán realizar esa fase. c) También podemos añadir un factor limitante cuando tenemos a todas las células en G0 porque hayamos bloqueado una fase: entonces todas las células comenzarán a crecer al mismo tiempo. - MECANISMOS DE SELECCIÓN – Consisten en separar a las células físicamente y sembrar sólo aquellas que se encuentren en la misma fase. a) Técnica de Helmstetter-Cumings (Baby Machine): se basa en que si cogemos células que están creciendo asincrónicamente y las hacemos pasar por una membrana con un tamaño de poro más pequeño de lo normal, las células que se están dividiendo quedarán retenidas en el poro, mientras que las hijas caerán sobre una bandeja que tenemos bajo la membrana. Esta bandeja tiene un sensor que recoge cada 2 segundos las células hijas que han caído, y así tenemos una cierta cantidad de células en la misma fase. b) Técnica de Mitchinson: se basa en que a lo largo del ciclo celular, según las fases por las que pasen, las células sufren cambios de densidad. Se centrifuga en sustratos no metabolizables las células de un cultivo discontinuo o asincrónico. Obtenemos así distintas bandas con distintas densidades. Sembrando cada banda obtendremos muchos cultivos sincrónicos diferentes.

5%

60%

5%

60%

60% 5%

5%

60%

60%

la ya habrá 5%. La 5%

Si ponemos las células en el tubo, bajarán hasta que encuentren su misma densidad.

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La 1ª gota será de 60% de sacarosa; 60% porque bajado una gota de última ya será del

Nos permite obtener, a partir de un cultivo asincrónico exponencial, un cultivo sincrónico para cada fase del ciclo (una fase por banda). Este tubo que presenta bandas de gradiente continuo o discontinuo (es mejor el de gradiente continuo) tarda horas en homogeneizarse.

TEMA 10 : FACTORES AMBIENTALES Y CRECIMIENTO La actividad y el crecimiento de los microorganismos está condicionado por los factores ambientales: se desarrollan en las condiciones físicas y químicas del ambiente que les rodea. Así, el ambiente determina la distribución y abundancia de los microorganismos. Conociendo ésto podremos saber cómo controlarlos. TEMPERATURA · TEMPERATURAS CARDINALES DISTINTIVAS Afecta al crecimiento y la supervivencia de microorganismos. Afecta a la velocidad de las reacciones enzimáticas y ésto afecta a la velocidad de desarrollo: al aumentar la temperatura, aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas y también el crecimiento. Existe una temperatura a partir de la cual se ve afectada la velocidad y la supervivencia, porque si la temperatura es muy alta, las proteínas y ácidos nucleicos se desnaturalizan y las estructuras pueden sufrir daños irreversibles. Para cada especie microbiana existen 3 tipos de temperaturas: 1. Temperatura máxima: por encima de la cual no hay crecimiento. A partir de esta temperatura la membrana se colapsa, las proteínas se desnaturalizan e incluso se puede llegar a la lisis celular. No suele estar muy lejos o ser muy superior de la temperatura óptima. 2. Temperatura óptima: aquella en la cual la velocidad de crecimiento es máxima. 3. Temperatura mínima: por debajo de la cual no hay crecimiento. Las membranas se gelifican, pierden fluidez y el transporte a través de la membrana se ralentiza o cesa. Es la causa principal que impide el crecimiento microbiano.

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Para cada microorganismo existe un rango. La amplitud de este rango varía. Así, diferenciamos entre organismos: a) Estenotermos: presentan un intervalo de temperaturas relativamente pequeño o estrecho. b) Euritermos: presentan un intervalo amplio. En relación con su temperatura óptima, establecemos la siguiente clasificación: 1. Criófilos o psicrófilos: microorganismos capaces de crecer a 0ºC. Su temperatura mínima es inferior a 0ºC. Ésto es independiente de que su temperatura óptima esté en una zona templada. a) Psicrófilos obligados: su temperatura óptima es ≤ 15ºC, y su temperatura máxima ronda los 20ºC. b) Psicrófilos facultativos: también llamados psicrotrofos o psicrotolerantes. Su temperatura óptima es de 20-25ºC, y pueden crecer por encima de los 20ºC. Ambos tienen en común que su temperatura mínima siempre va a ser menor de 20ºC. Los psicrófilos poseen encimas que funcionan mejor a bajas temperaturas y que se inactivan a temperaturas superiores a 30 ó 40ºC. las membranas celulares tienen una mayor concentración de ácidos grasos poliinsaturados. El grado de saturación de los ácidos grasos determina la fluidez de la membrana: Mayor saturación Menor fluidez membrana Menor saturación Mayor fluidez membrana su crecimiento.

Menor funcionalidad a bajas Tª Mayor funcionalidad a bajas Tª

Las bajas temperaturas no matan a los microorganismos ya que son bacteriostáticos: sólo se inhibe

Ejemplos de bacterias psicrófilas: · Listeria monocytogenes · Pseudomonas 2. Mesófilas Comprenden a la mayoría de microorganismos. Su temperatura óptima oscila entre 25-40ºC, y crecen a temperaturas intermedias. Ejemplos:

· Escherichia coli

3. Termófilas Son generalmente arqueas y bacterias. Crecen a altas temperaturas, superiores a 55ºC. Su temperatura óptima es mayor de 45ºC. Entre los termófilos podemos diferenciar: a) Estenotermófilos: no pueden crecer a temperaturas menores de 37ºC. Presentan una baja capacidad adaptativa, por lo que sus nichos ecológicos son muy estrictos. b) Euritermófilos: pueden crecer a temperaturas mayores de 37ºC, y presentan un rango más amplio. Ejemplos:

· Bacillus coagulans · Bacillus stearothermophilus · Thermoactinomyces

Habitan en ambientes expuestos al sol, sobre medios oscuros, sobre materiales en fermentación, fuentes termales, etc. 4. Hipertermófilos o termófilos extremos

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Su temperatura óptima supera los 65-80ºC. Pueden vivir a temperaturas superiores a 100ºC, por lo que resisten la ebullición. Viven en geisers, fuentes hidrotermales, zonas abisales,… algunos de estos microorganismos son arqueas. Ejemplos:

·Thermococcus ·Pyrodictium Ambas son arqueas.

Los estudios que se han realizado sobre la distribución de los microorganismos dependiendo de la temperatura han demostrado que los procariotas sobreviven mejor que los eucariotas, y dentro de los procariotas, los más resistentes son los no fotosintéticos. PRESIÓN OSMÓTICA Hay microorganismos que resisten la escasez de agua, como los microorganismos esporulados. Pero también hay formas vegetativas que viven en estas condiciones. Los microorganismos más pequeños son más importantes que los grandes: los cocos son más resistentes que los bacilos, y las Gram+ son más resistentes que los Gram-. Las características estructurales determinan el modo o medio de transmisión. Un microorganismo que se transmite por el aire lo hará porque si estructura se lo permite. · Streptococcus pneumoniae: es un coco Gram+ que se transmite por el aire. · Treponema pallidum: causa la sífilis. Es una espiroqueta muy sensible a la falta de agua y no transmite por el aire, sino por contacto directo. Llamamos gliofilización a la congelación por sublimación. Hay que tener en cuenta la presión osmótica. La gliofilización no permite el crecimiento porque se elimina el agua. Por ejemplo, en los alimentos que se salazonan, al salar el alimento aumentamos la presión osmótica, por lo que baja el agua y no crecen microorganismos. En las mermeladas, el medio es hipertónico y los microorganismos tienden a hacerlo hipotónico perdiendo agua. A efectos prácticos, una disolución hipertónica con una alta concentración de solutos puede equipararse a un medio seco. En ambos casos la disponibilidad de agua es mínima, aumenta la presión osmótica y se tiende a extraer el agua celular. Muchos microorganismos no pueden tolerar el descenso de la actividad o disponibilidad de agua (aw) y mueren. Otros sí resisten este descenso: 1. Halófilos Son capaces de vivir en ambientes con elevadas concentraciones de sales. a) Halotolerantes: pueden soportar una cierta reducción en la aw ambiental (es decir, un aumento de la concentración de solutos). Ejemplo: · Staphylococcus aureus

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b) Halófilos moderados: son generalmente organismos marinos. Ejemplo: · Vibrio fischeri c) Halófilos extremos: son capaces de crecer en ambientes con elevadísimas concentraciones de sales. Requieren un 15-30% de NaCl para su crecimiento óptimo. Ejemplo: · Halobacterium salinarium: es una arquea bacilar halófila extrema con un alto requerimiento de NaCl. Presenta forma bacilar cuando la concentración de sales es alta. Si baja, puede adquirir forma de coco, y si sigue bajando termina por lisarse. Necesita la presencia de Na en el medio para mantener su pared celular. No tiene peptidoglicano, sino microproteínas, y su pared está mantenida por enlaces iónicos y Na. En general los halofilos requieren Na en el medio, pero la cantidad de este elemento puede reducirse hasta la mitad si añadimos al medio otros iones como el Mg. 2. Osmófilos Son microorganismos que pueden vivir en ambientes con altas concentraciones de azúcar. Ejemplos (hongos): · Penicillium · Sacharomyces balii

3. Xerófilos “Xeros” en griego significa “ambiente seco”. Estos microorganismos utilizan un soluto compatible como el glicerol. Llamamos soluto compatible a aquel que no interfiere en la bioquímica celular y que se acumula en el citoplasma para controlar la actividad del agua. Son muy solubles en agua. Por ejemplo: sacarosa, polialcoholes, halosa, aminoácidos y derivados, etc. También puede utilizarse el ión Na. Estos solutos pueden ser sintetizados por el microorganismo o tomarlos del exterior y concentrarlos (K, betaína,…). PRESIÓN HIDROSTÁTICA El agua ejerce un efecto derivado de su propio peso. Los microorganismos se clasifican según la presión hidrostática en 3 categorías: 1. Barotolerantes Capaces de vivir en presiones elevadas, de entre 1-500 atm, aunque crecen mejor a presiones bajas e incluso las atmosféricas. Ejemplos: · Cepas de Escherichia Coli · Cepas de Pseudomonas 2. Barófilos

50

Crecen mejor a presiones elevadas. También pueden crecer a 1atm. La presión óptima estaría entre 400-500atm. Ejemplo: · Thermococcus barophilus 3. Barófilos extremos o estrictos Crecen a muy elevadas presiones. No pueden crecer a presiones inferiores a 400atm, y su presión óptima ronda las 700-800atm (grandes profundidades). Ejemplo: · Pseudomona bathecetes: requiere una presión de 1000atm. PH Los microorganismos se pueden agrupar según su PH óptimo en: 1. Acidófilos Hongos y levaduras. Necesitan un PH de 1-5,5. Ejemplo: · Thiobacillus thiooxidans: necesita un PH inferior a 2. Oxida sulfuros y azufre, sulfúrico.

produciendo

ácido

2. Neutrófilos Comprenden la gran mayoría de las bacterias y algas eucariotas. Viven en PH de 5,5-8,5. 3. Basófilos Por ejemplo, las cianobacterias. El PH ejerce su efecto sobre los microorganismos pero también sobre los posibles nutrientes que hay en el medio. por ejemplo: Coco Gram+ que habita en un medio con ácido acético. Dependiendo del PH estará: - PH ácido: ácido acético metabolizable - PH neutro o básico: ácido acético en forma de acetato, que quizás no pueda entrar dentro de la célula porque los ácidos teicoicos se lo impiden. La propia actividad de los microorganismos puede cambiar el PH del medio: un microorganismo que produce ácidos provocará la bajada del PH del medio; un microorganismo capaz de metabolizar compuestos nitrogenados liberará iones de amonio que harán que suba el PH exterior; si el microorganismo consume compuestos ácidos del medio, éste se neutralizará. - SOLUCIONES TAMPONADAS (BUFFER) – Se utilizan para mantener el PH del medio. - Peptonas y aminoácidos

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- Sales de fosfato: tienen la ventaja de que, además de taponar los medios de la mayoría de las bacterias, aportan fósforo. POTENCIAL ÓXIDO-REDUCCIÓN (ε’O) El ε’o es una medida de la capacidad de una sustancia para ceder electrones, y se expresa en voltios. A elevados ε’o o potenciales redox, menor capacidad de ceder electrones y menos energética es; así, a menores ε’o o potenciales redox, mayor capacidad para ceder electrones y más energética es. Ejemplo: un valor de +0,08v se considera alto respecto a -0,5v Las sustancias reductoras (capaces de ceder electrones) tienen valores de ε’o bajos y son sustancias energéticas. Las sustancias oxidantes (capaces de aceptar electrones) tienen valores mayores de ε’o y son sustancias menos energéticas. El aceptor final de electrones del metabolismo es generalmente el oxígeno, pero en los microorganismos este aceptor terminal no siempre es el oxígeno. RELACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CON EL OXÍGENO Los microorganismos, dependiendo de su requerimiento en oxígeno, se clasifican en: a) Aerobios: requieren y dependen del oxígeno, que actúa como aceptor final de electrones. Suponen el 21% del total de microorganismos. - Aerobio obligado: completamente dependiente del O2 atmosférico para crecer. - Microaerófilo: requiere niveles de O2 por debajo de 2-10% para crecer, y es dañado por el O2 atmosférico (20%).

b)

Anaerobios: - Anaerobio facultativo: no requiere O2 para crecer, pero crece mejor en su presencia. - Anaerobio aerotolerante: crece igualmente bien en presencia como en ausencia de O2. - Anaerobio obligado: no tolera el O2 y muere en su presencia.

El rendimiento energético es diferente en la fermentación que en la respiración. La fuente de energía o de N que utiliza el microorganismo va a determinar el requerimiento de O2. Sólo van a ser microaerófilos cuando utilicen el H como fuente de energía y poder reductor. La hidrogenasa es lábil en presencia de O2. - CULTIVO DE MICROORGANISMOS SEGÚN EL REQUERIMIENTO DE O2 Los microorganismos aerobios se cultivan en un medio sólido, en placas de Petri y por siembra en superficie. En un medio líquido, se siembran en condiciones especiales de forma que se incluya O2 en el medio. Los microorganismos anaerobios se siembran:

a.

En medios especiales anaerobios que contienen agentes reductores como el tioglicolato y la cisteína, que van a eliminar el O2 disuelto presente en el medio. Estos microorganismos no crecerán en la superficie. A veces se añade un colorante indicador de la actividad redox como la resazorina, que es de color rosa cuando se oxida e incolora cuando se reduce. Una buena indicación de que no haya O2 es que sea incolora.

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b.

En cámaras o sistemas anaerobios, donde se retira el aire por una bomba de vacío y el O2 residual se elimina con nitrógeno gas. A veces incluso se añade CO 2 si el microorganismo lo necesita para crecer.

c.

Jarra de GasPak: utilizado para un número reducido de placas. El ambiente de la jarra se hace anaerobio utilizando una lámina generadora de gas (CO2 y H2). El oxígeno se elimina de la cámara, al combinarse con hidrógeno para formar agua, reacción catalizada por un catalizador que contiene pastillas de paladio. Una tira indicadora anaerobia de azul de metileno pierde el color en ausencia de O2. Este sistema también se puede llevar a cabo con una bolsa de plástico. Si se trabaja con organismos anaerobios, se utiliza una cabina especial anóxica que lleva guantes incorporados y permite trabajar desde el exterior. - DEFENSAS MICROBIANAS ANTE EL O2 El O2 puede aceptar electrones y reducirse parcialmente. Los electrones de sus órbitas exteriores no están apareados. Hay constituyentes celulares como las quinonas o las proteínas FeS que pueden promover la reducción incompleta del O2 que conduce a formas tóxicas del O2, como: a. Anión superóxido O2·- : tiene un electrón desapareado. b. Peróxido de hidrógeno (H2O2) c. Radical hidroxilo (OH) Estos productos de reducción del O2 son extremadamente tóxicos y tienen un gran poder de oxidación que destruye rápidamente los componentes celulares. Los microorganismos que viven en presencia de O2 deben defenderse del O2·-. Para ello, los microorganismos aerobios obligados y aerobios facultativos contienen normalmente la enzima superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa, que catalizan la destrucción de los radicales superóxido y peróxido de hidrógeno respectivamente. La peroxidasa también puede utilizarse para eliminar el peróxido de hidrógeno. 2 O2·- + 2H+ 2 H2O2 H2O2 + NADH + H+

SOD

Catalasa Peroxidasa

O2 + H2O2 2 H2O + O2 2 H2O + NAD+

Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de catalasa, pero no acumulan el peróxido de hidrógeno porque utilizan las peroxidasas. Se forma agua pero no se libera oxígeno. Puede utilizarse el NADH.

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TEMA 11 : ENERGÉTICA DE LOS MICROORGANISMOS QUIMIOTROFOS La actividad que mantiene la vida del organismo implica muchas reacciones bioquímicas complejas. Muchas reacciones que se dan en las bacterias son comunes de organismos procariotas y eucariotas. También hay reacciones exclusivas de bacterias. Definimos metabolismo como el conjunto total de reacciones químicas que se dan en la célula, y que son posibles gracias al flujo de energía y a la participación de enzimas. El metabolismo puede dividirse globalmente en dos partes fundamentales: 1. Catabolismo: moléculas grandes y complejas son descompuestas en moléculas más pequeñas y sencillas, liberándose energía en el proceso. 2. Anabolismo: síntesis de moléculas complejas a partir de moléculas más sencillas con consumo de energía. El ATP es una molécula de alta energía. La separación de su fosfato terminal se produce con un ΔG muy negativo. ATP + H2O

ADP + Pi + energía

El ATP es una moneda de energía, ya que permite el acoplamiento entre la energía derivada de las reacciones catabólicas y la que requieren las reacciones anabólicas.

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La composición química de la célula viva está en constante cambio. El flujo equilibrado de moléculas químicas y energía es lo que mantiene la vida en la célula. Sólo una parte de la energía liberada en las reacciones catabólicas resulta útil para las reacciones de biosíntesis. Otra parte se pierde al ambiente en forma de calor: la energía térmica no es utilizable. Por tanto, existe una continua necesidad de un aporte exógeno de energía. En función de la energía podemos clasificar a los microorganismos: 1. Fototrofos: emplean la luz como fuente de energía. 2. Quimiotrofos: utilizan la oxidación de compuestos químicos. a. Quimiolitotrofos: utilizan la oxidación de compuestos inorgánicos. b. Quimioorganotrofos: utilizan la oxidación de compuestos orgánicos. QUIMIOORGANOTROFOS · PROCESOS REDOX Es un intercambio de electrones entre compuestos: un compuesto cede electrones (se oxida) y otro los acepta (se reduce). Esta capacidad de ceder o aceptar viene determinada por el potencial redox. Como fuente de energía y poder reductor, un quimioorganotrofo puede utilizar un compuesto A, pero debe estar reducido. Este compuesto orgánico se va a oxidar y va a ceder electrones a un compuesto B en un solo paso o en varios. Esta oxidación siempre va acompañada de una reducción. Este acoplamiento de reacciones se denomina proceso redox. El par redox con un potencial más bajo va a ceder electrones al par redox con un potencial más alto. En esta transferencia de electrones se libera energía. Los H+ van a ir al unísono. Cuando se oxida una sustancia, los H+ liberados son transferidos por coenzimas. Las dos coenzimas más utilizadas son el NAD y el NADP, en sus formas oxidadas y reducidas. Las células tomas nutrientes que les sirven como fuente de energía. Los transforman desde compuestos altamente reducidos a compuestos oxidados. La glucosa puede ser utilizada para conseguir energía, oxidándola hasta conseguir CO2 y H2O. La célula acopla la energía liberada por la oxidación de la glucosa a la generación de ATP. Hay microorganismos que en vez de glucosa utilizan etanol, pero proporciona menos energía. La transferencia del poder reductor generado durante el metabolismo se puede hacer de tres formas: 1) Fermentación: El sustrato va a dar lugar a dos compuestos derivados del original: uno que acepta electrones y otro que los dona. Es un proceso redox interno, no hay un aceptor final de electrones. Un derivado de lo que se fermenta actúa como donador y el otro como aceptor. 2) Respiración aeróbica: El O2 se transforma en H2O. 3) Respiración anaeróbica: El aceptor final es distinto al O2. Puede ser orgánico o inorgánico. Hay una diferente clave a la hora de generar energía: - En la fermentación, un grupo fosfato se añade a un intermediario y se va a transferir al generar ATP. Es una fosforilación a nivel de sustrato.

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ADP

para

- En la respiración también hay fosforilación a nivel de sustrato. La membrana está activada energéticamente. Parte de esa energía se pierde para formar ATP a partir de ADP, mediante la fosforilación oxidativa. · FERMENTACIÓN Es un proceso productor de energía en el cual un sustrato energético es oxidado sin un aceptor externo de electrones. Habitualmente, moléculas inorgánicas sirven como donadoras y aceptoras de electrones. Es una oxidación parcial, donde los productos finales todavía contienen energía y pueden ser utilizados por otros organismos. Es, además, un proceso redox interno en el que los productos derivados de la fuente de energía actúan, unos como donadores y otros como aceptores de electrones. Es un proceso metabólico que libera energía a partir de un azúcar u otra molécula orgánica, que no requiere oxígeno ni una CTE. No significa que a veces no ocurra en presencia de oxígeno. Es un mecanismo anaeróbico, en el sentido de que no requiere oxígeno, de producción de energía no implicado en la CTE. Dependiendo del tipo de fermentación, el piruvato se transformará en un producto o en otro. Estos productos a su vez dependen de las condiciones ambientales y del producto inicial. Los microorganismos degradan los azúcares a piruvato y otros productos intermediarios mediante 3 vías: I.Vía glucolítica o de Embden-Meyerhof II.Vía de las pentosas fosfato III.Vía de Entner-Doudoroff Previamente a la rotura propia de la glucosa, en cualquiera de las 3 vías, la glucosa se fosforila pasando a Glc-6P. La entrada de la glucosa a las células procariotas suele ser un proceso de transporte por translocación de grupo. En eucariotas puede entrar mediante transporte activo o difusión facilitada. - VÍA DE EMBDEN-MEYERHOF O VÍA GLUCOLÍTICA – Es indudablemente la vía más común de la degradación de la glucosa a piruvato. La vía en conjunto puede dividirse en 2 fases: 1. En la etapa inicial de 6 carbonos, la glucosa es se transforma en gliceraldehído-3P. En la etapa inicial no se produce energía; de hecho, se consumen 2 moléculas de ATP. 2. Consiste en la oxidación del gliceraldehído-3P a piruvato. Se produce NADH y ATP, este último por una fosforilación a nivel de sustrato, debido a que la fosforilación de ADP está acoplada a la degradación exergónica de una molécula de sustrato de alta energía. Por cada glucosa se obtienen 2 moléculas de gliceraldehído-3P. 1 Glucosa

2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH

Las otras vías tienen en común la transformación de la glucosa hasta gluconato. - VÍA DE ENTNER-DOUDOROFF -

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Comienza con la formación de Glc-6P y 6-fosfogluconato. Se produce: 1 Glucosa

1 ATP + 1 NADH + 1 NADPH + 2 Piruvato

- VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO – Supone una serie de interconversiones de azúcares catalizados por transcetolasas y transaldolasas. Debemos partir de 3 moléculas de Glc-3P, sabiendo que 2 de ellas continúan en el ciclo. Los pasos desde gliceraldehído-3P hasta piruvato son iguales al resto de las vías. 1 Glucosa

1 Piruvato + 3 CO2 + 1 ATP + 6 NADPH + 1 NADH 1 Glc

2 ATP (14)

Oxidación completa de la Glc ADP + Pi = ATP

686 Kcal

≈ 7,3 Kcal/mol

14 · (100/686) ≈ 2% - TIPOS DE FERMENTACIÓN -

1. 2. 3.

Fermentación alcohólica: el producto mayoritario es el etanol. Levaduras, Zymomonas. Fermentación propiónica: el producto mayoritario es el propionato. Propionibacterium. Fermentación butanodiólica: el producto mayoritario es el 2,3-butanodiol. Enterobacter, Serratia, Bacillus. 4. Fermentación ácido mixta: los productos finales son mayoritariamente ácidos. Da lugar a la excreción de etanol y de una mezcla compleja de ácidos, en particular, los ácidos acético, láctico, succínico y fórmico. Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus. 5. Fermentación butírica: los productos mayoritarios son el acetato, isopropanol, butanol, butirato. Clostridium. 6. Fermentación láctica: se produce mayoritariamente lactato. Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus. En algunas fermentaciones se puede generar algo más de ATP a partir de ADP, pero siempre por fosforilación a nivel de sustrato. Además de etanol, también se producen productos ácidos y muchos producen gases (CO2 y H). · RESPIRACIÓN AERÓBICA Es un proceso de obtención de energía en forma de ATP en la que los compuestos químicos son oxidados y el aceptor final de electrones es el oxígeno. Se obtiene ATP por fosforilación oxidativa, además de por fosforilación a nivel de sustrato. Es un proceso de oxidación completa en el que se ceden los electrones al O2, el cual se oxida a H2O. El piruvato se convierte en acetil-CoA incorporándose al Ciclo de Krebs. Los coenzimas reducidos en este ciclo cederán los electrones a una CTE cuyo aceptor final es el O2, que se reduce a H2O. La salida de algún intermediario necesita de reacciones anapleróticas que aseguran la continuidad del ciclo.

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Reacciones anapleróticas: Glioxilato

Acetil-CoA

Piruvato + CO2 + ATP + H2O PEP + CO2 + H2O

Malato Acetil-CoA + ADP + Pi Acetil-CoA + Pi

Los coenzimas reducidos ceden los electrones a la CTE, a transportadores que tienen un potencial bajo que pasa a alto. En la transferencia de electrones a lo largo de la CTE se va a obtener energía. Hay 4 complejos enzimáticos: I.NADH Dhasa II.Succinado Dhasa III.Citocromo b-c1 IV.Citocromo oxidasa Cada complejo enzimático acopla la energía liberada por la transferencia de electrones a lo largo de la CTE. Con los H+ se produce una separación a medida que se transfieren los electrones. Parte de la energía se atrapa en forma de ATP por fosforilación oxidativa. Se forma un gradiente de H+, una separación de cargas, que se disipa por una ATPasa de membrana que emplea este gradiente de H+ para sintetizar ATP. El NADH es impermeable a las mitocondrias: necesita sistemas de lanzadera de equivalentes de reducción. En eucariotas, en la CTE, 1 NADH produce alrededor de 2,5 moléculas de ATP. En procariotas, la producción aeróbica de ATP puede ser aún menor ya que las cadenas son diferentes, dependiendo de las condiciones ambientales. · RELACIÓN ENTRE FERMENTACIÓN Y RESPIRACIÓN ANAEROBIA (EFECTO PASTEUR) La producción de ATP aeróbica es más eficiente que la anaeróbica. El efecto Pasteur se observa en anaerobios facultativos con metabolismo respiro-fermentativo, como presentan muchas levaduras. Este efecto describe un fenómeno regulador que confiere una ventaja, ya que en presencia de oxígeno consumen menos glucosa para obtener energía que en condiciones anóxicas. En ausencia de oxígeno, estos microorganismos fermentan la glucosa mediante la glicolisis. Uno de los intermediarios de la glicolisis es el gliceraldehído 3-fosfato (GA3P). La fermentación es un proceso de óxido-reducción interna. En condiciones óxicas, el microorganismo desreprime los citocromos que van a aceptar los electrones del NADH2, que se reoxida y y se obtiene agua. · ¿Cómo afecta el cambio de metabolismo al consumo de glucosa? En la fermentación, baja el PH por la producción de ácidos. 1 Glucosa

FERMENTACIÓN

2 ATP

1 Glucosa

RESPIRACIÓN AEROBIA

38 ATP (≈19 veces mayor)

58

Para lograr la misma energía, se consume 19 veces más en ausencia de oxígeno que en presencia del mismo. En relación con la cantidad de glucosa, para una misma concentración de glucosa, se consigue un mayor número de células en presencia que en ausencia de oxígeno. A nivel bioquímico, ¿qué provoca el cambio de un nivel a otro? Por una parte, el número de equivalentes de reducción, cuando se pasa de condiciones anóxicas a óxicas, se reduce. El NADH2 no va a estar disponible para reducir el acetaldehído a etanol. Por otra parte, la relación ATP/ADP aumenta del paso de condiciones anóxicas a óxicas. Este aumento hace que se produzca una bajada en la actividad de una enzima (PFK) que es clave. Es un punto irreversible. Está inhibido por el ATP y el citrato (intermediario del ciclo de Krebs). Si hay mucha cantidad de ATP y citrato significa que se va a conseguir mucha energía y no hace falta que se aumente la velocidad de la glicolisis. En el paso de condiciones óxicas a anóxicas se produce una inactivación parcial de la enzima que provoca una ralentización de la glicolisis. · RESPIRACIÓN ANAERÓBICA Se diferencia en el aceptor final. La realidad indica que la cadena de transporte de electrones no se parece a la aeróbica. El microorganismo que realiza la respiración anaeróbica utiliza el mismo compuesto orgánico, la glucosa. El aceptor final puede ser orgánico o inorgánico, pero nunca oxígeno. La respiración anaeróbica no es tan eficaz en cuanto a síntesis de ATP. Los aceptores terminales de electrones poseen un potencial redox menos positivo. ε’O (O2/H2O) = + 0,82 V La producción de energía está relacionada con la diferencia entre los potenciales del donador y del aceptor. A mayor diferencia, mayor producción de energía. ε’O (NAD+/NADH · H+) = -0,32 V Se puede conseguir mayor cantidad de ATP que en la fermentación pero menos que en la respiración aerobia. Algunos microorganismos son anaerobios estrictos. Otros no lo son y pueden alternarla con la respiración aeróbica. Otros pueden, dependiendo de las condiciones ambientales, llevar a cabo: O2

Respiración aeróbica

Aceptores alternativos al O2 (NO3,…) Condiciones anóxicas y ausencia de aceptores de e- para sus cadenas electrónicas

Respiración anaeróbica Fermentación

- ACEPTOR DE ELECTRONES El aceptor de electrones puede ser orgánico o inorgánico.

59

1) Inorgánicos: a. No3: ε’O = 0,43 V. Se reduce a NO2. La utilización de NO3 como aceptor final es una desasimilación o un

uso desasimilativo, y es lo que se denomina desnitrificación. La reducción de NO3 a NO2 no es eficaz para producir energía porque se requiere gran cantidad de NO3 para el crecimiento. NO3 + 2e- + 2H+

NO-2 + H+

Tóxico El microorganismo trata de eliminar el nitrito y llevarlo hasta nitrógeno gas, que escapa a la atmósfera. Cada molécula de NO2 admite 5 electrones. 2NO3 + 10e- + 12H+

N2 + 6H2O

Ejemplos de bacterias desnitrificantes: Pseudomonas denitrificans, Spirillum itersonii, algunas especies del género Bacillus.

b. SO4-2: se trata de bacterias sulfatoreductoras (anaerobias estrictas). Oxidan el SO4-2 , y los electrones

van a parar al sulfato, que se reduce a sulfídrico (H2S). si en el ambiente hay hierro se forma FeS, que precipita. Ejemplos de bacterias sulfatoreductoras: Desulfovibrio.

Estas bacterias, al oxidar estos compuestos, pueden llegar a oxidarlos hasta acetato, CO2 u otros compuestos. El propio CO2 o el acetato pueden ser utilizados por otros microorganismos, como las arqueas metanogénicas. Ejemplo de arquea metanogénica: Methanobacterium. Otras pueden utilizar el azufre y reducirlo a H2S. Ejemplo: Thermoprocteus, Desulfuromonas. 2) Orgánicos: a. Fumarato: Puede ser reducido hasta succinato. Lo realizan bacterias anaerobias facultativas, como Escherichia coli. Otros microorganismos lo llevan a cabo siendo siempre fermentadores, como Bacteroides, Clostridium o Streptococcus fecalis. Un problema que presentan estos organismos fermentadores es que obtienen mucho poder reductor, y para solucionarlo acoplan la reducción de fumarato para poder disponer otra vez de NAD+. La reducción no va asociada a una cadena de transporte electrónica. b. Glicina: No se considera respiración anaeróbica porque lo llevan a cabo algunos Clostridios y es una parte de lo que denominamos “Reacción de Stickland” o fermentación de pares de aminoácidos. c. TMAO: Es reducido hasta TMA por bacterias anaeróbicas facultativas, y emplean el O2 del TMAO como alternativa al O2. Estas bacterias, sin luz ni oxígeno, utilizan el óxido de TMA. Este TMAO es un soluto en funciones de excreción de exceso de nitrógeno en peces, y llega a suponer un 1-5% del peso seco de los peces. Está ausente en las especies de agua dulce y terrestres. Es responsable en gran parte del olor a “mar” ya que la TMA presenta un olor fuerte característico.

d. DMSO: Se reduce a DMS. El DMSO es un producto natural de medios acuáticos y el DMS presenta un fuerte olor y sabor a picante. Lo utilizan Escherichia coli, Campylobacter y bacterias rojas.

60

BIOLUMINISCENCIA Es un tipo de quimioluminiscencia o de generación de luz mediante reacciones químicas. La transferencia de electrones permite la emisión de luz. En moluscos, crustáceos, insectos,… la emisión de luz se debe a bacterias simbióticas, como Vibrios (Vibrio fischeri, Vibrio harveyi) y Fotobacterias (Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi, Photobacterium Nostoi). Sólo se produce bioluminiscencia en presencia de oxígeno. Los microorganismos la consiguen desviando electrones de la cadena de transporte de electrones y de la síntesis de ATP. Para ello necesitan una enzima especial, la luciferasa, y un aldehído alifático de cadena larga de más de 8 carbonos, la luciferina. También participa el oxígeno y un mononucleótido de flavina (FMN). La luciferasa se activa cuando el FMNH2 se oxida. La luciferasa pasa a un estado activo y cuando vuelve a su estado fundamental, irradia luz con una λ ≈ 490 nm. La bioluminiscencia se activa cuando se corta la cadena de transporte de electrones. Si aplicamos un compuesto como el cianuro, ésta se activa. - SÍNTESIS DE LUCIFERASA – Es una síntesis regulada, ya que es costosa desde el punto de vista energético. Está regulada por mecanismos de autoinducción: las bacterias producen una sustancia específica que es un autoinductor llamada “lactona de homoserina acilada” (AHL). Ésta se va acumulando en el medio, y entra en las bacterias cuando se alcanza un nivel crítico. Es entonces cuando se induce la luciferasa. Sólo se produce luz si la densidad de población es lo suficientemente alta para que se acumule AHL. Esto se denomina “sensibilidad o percepción del Cuorum”. Se produce una respuesta fijada genéticamente cuando la densidad de población alcanza un nivel crítico. Existen diversos mecanismos de sensibilidad al Cuorum que regulan estos procesos: a) Secreción de ciertas sustancias viscosas: como los biofilms, que permite la adhesión bacteria-bacteria y bacteria-sustrato. b) Producción de exotoxinas por Staphilococcus aureus.

61

TEMA 12 : FOTOSÍNTESIS La mayoría de los organismos fototrofos y litotrofos son autótrofos. Fototrofos Quimiolitotrofos

Fuente de energía: luz Fuente de energía: compuestos orgánicos

FOTOSÍNTESIS La realizan los microorganismos fototrofos. Siempre asociamos la fotosíntesis a las plantas superiores, pero debemos saber que más de la mitad de la fotosíntesis del planeta la realizan los microorganismos. Es un mecanismo que consigue captar la energía luminosa en energía química. Eso permite la fijación del CO 2 para conseguir compuestos orgánicos. Se compone de 2 fases:

1)

Luminosa: requiere la presencia de luz, y se genera ATP y poder reductor en forma de NADPH, que van a ser utilizados en la fase oscura donde el CO2 se fija en compuestos inorgánicos. 2) Oscura: no requiere luz, y funciona siempre que haya NADPH y ATP disponibles. Existen 2 tipos de fotosíntesis:

62

1)

Oxigénica: es típica de plantas superiores, algas eucariotas y cianobacterias. La fuente de poder reductor es el agua. se reduce el NADP a NADPH gracias a la fotolisis del agua, y como producto se desprende oxígeno. Este compuesto reductor sólo puede obtenerse en presencia de luz. 2) Anoxigénica: es típica de bacterias rojas, bacterias verdes y heliobacterias, por lo que se le denomina “fotosíntesis bacteriana”. La fuente de poder reductor no es el agua, sino el azufre, sulfhídrico… no se desprende oxígeno como producto. La generación de poder reductor no va asociada a la presencia de luz. PIGMENTOS Captan energía luminosa.

a)

Clorofilas: es el pigmento que aparece en la fotosíntesis oxigénica. Emite luz verde ya que absorbe la luz roja y azul.

b)

Bacterioclorofilas: presenta un espectro de absorción diferente, con una máxima de absorción en longitudes de onda más largas (> 700-800 nm). Esto supone una mejor adaptación de estas bacterias a sus nichos ecológicos. Ambos pigmentos son similares: son porfirinas con núcleos tetrapirrólicos (4 anillos pirrólicos) que contienen en el interior un ión metálico (Mg+2). Tienen también una cadena carbonada de unos 20 átomos de carbono que puede ser de fitilo o de geranil-geranilo. La clorofila a y la bacterioclorofila a se diferencian en los sustituyentes pero la estructura principal es igual. Estos pigmentos se localizan: a) Clorofilas: - Plantas superiores: la clorofila se localiza en las membranas de los tilacoides. - Cianobacterias: se sitúan en los “tilacoides”, que son un sistema de membranas multilaminares llamadas así por su analogía con los tilacoides de las plantas. Se presentan de forma concéntrica en la periferia del citoplasma. b) Bacterioclorofilas: - Bacterias rojas: se localizan es un sistema de membranas que se forma por la invaginación de la membrana citoplasmática. A veces forman láminas (lamelas) o tubos (vesículas), todo ello continuo con la membrana citoplasmática. - Bacterias verdes: se sitúan en un sistema de membranas formadas en parte por la membrana citoplasmática y en parte por los clorosomas (vesículas elipsoidales que contienen los pigmentos fotosinténticos y que están fijadas a la membrana plasmática pero que no se continúa con ella. - Heliobacterias: se presentan en la membrana citoplasmática. PIGMENTOS ACCESORIOS Son otro tipo de pigmentos que también absorben energía luminosa. Aunque la clorofila no puede absorber la energía luminosa de manera eficaz en el espectro comprendido entre el azul-verde y el amarillo (aproximadamente entre 470-630 nm), los pigmentos accesorios absorben la luz en esta región y transfieren la energía captada a la clorofila. Así consiguen que la fotosíntesis sea eficaz en un espectro más amplio de longitudes de onda. Los pigmentos accesorios son:

63

- CAROTENOIDES – Son largas cadenas isoprenoides con enlaces dobles conjugados en cuyos extremos se sitúan ciclohexenos. Absorben en la zona azul del espectro (450-550 nm). Son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos. Se presenta en mismo número que las clorofilas. Estos pigmentos captan y trasmiten la energía lumínica pero no participan directamente en las reacciones de fotofosforilación. Los carotenoides son: a) Carotenos: son hidrocarburos isoprenoides. - Fucoxantina: es característica de algas pardas. - β-caroteno: es característico de algas en general. b) Xantófilas: contienen oxígenos en los anillos terminales. - Clorobacteno: se presenta en bacterias verdes. - Licopeno: abunda en bacterias rojas. - Espiriloxantina. - FICOBILIPROTEÍNAS Son cromoproteínas solubles en agua que contienen tetrapirroles lineales llamados ficobilinas, que están conjugadas con proteínas. Ficobiliproteína = ficobilina + proteína Las ficobiliproteínas están formando agregados de elevado peso molecular que se denominan ficobilisomas, que se localizan en las membranas tilacoidales. El contenido celular de ficobilisomas aumenta cuando disminuye la intensidad luminosa; ésto es un proceso de compensación. No están presentes en plantas; sólo se encuentran en algas rojas eucariotas y cianobacterias. Hay diferentes tipos de ficobiliproteínas: a) Ficoeritrina: es un pigmento rojo característico de algas rojas y que tiene su máximo de absorción comprendido entre 550-560 nm, que corresponde a la zona azul. b) Ficocianina: es un pigmento azul típico de cianobacterias, con un máximo de absorción de entre 620-640 nm. - Ficocianobilina: es la ficocianina de la ficobiliproteína. Los pigmentos accesorios proporcionan numerosas ventajas a los microorganismos: 1. Amplían el rango de longitud de onda que pueden absorber, ya que absorben en el rango de 470-630 nm, en el cual no absorben los pigmentos principales pero sí los accesorios. 2. Transfieren energía a la clorofila o bacterioclorofila, por lo que hacen máz eficaz la fotosíntesis en un espectro más amplio. 3. Aumentan la velocidad de captación de luz por ser un número alto de moléculas. 4. Los carotenoides son agentes fotoprotectores que protegen a los microorganismos de la fotooxidación que produce la luz sola intensa, la cual puede dañar seriamente el aparato fotosintético. El absorber la luz dañina es una ventaja para los microorganismos que viven en presencia de luz. ESTRUCTURA GENERAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO El aparato fotosintético es el aparato fotoquímico responsable de la fotosíntesis, o unidad funcional y estructural encargada de convertir la energía solar en energía química.

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Se compone de 3 partes: 1. Complejo antena (CA): Constituído por los pigmentos antena (200-300 moléculas de clorofila o bacterioclorofila junto a pigmentos accesorios). Estos pigmentos son los responsables de absorber la luz de determinadas longitudes de onda, que es un factor que determina el hábitat de los microorganismos, y canalizarla al centro de reacción o fotosistema. 2. Centro de reacción (CR): En él se encuentra la clorofila o bacterioclorofila del denominado “par especial”, que es el que se va a fotoactivar en presencia de luz: se oxida y dona electrones a una primera molécula que es el aceptor primario de electrones (I) y está estrechamente relacionado con el fotosistema. El aceptor primario puede ser una feofitina o una bacteriofeofitina. Feofitina ≈ clorofila, pero en vez de Mg+2 tiene un par de átomos de H+ 3. Cadena de transporte de electrones (CTE): El primer transportador de electrones de la cadena (Z) recibe los electrones del aceptor primario (I). Z puede ser una quinona o una ferrosulfoproteína. eeLuz PI P*I P+IP+I e Z ZEl fotosistema oxidado (P+) necesita un electrón para poder volver al estado fundamental, y puede proceder de la CTE o del exterior. El término de “reacciones luminosas” es algo inadecuado: la única reacción que precisa la luz es la inicial (PI a P*I). FOTOSÍNTESIS ANOXIGÉNICA O BACTERIANA Presenta un solo fotosistema y emplea bacterioclorofila. No utiliza agua, por lo que no desprende oxígeno. Se realiza exclusivamente en condiciones anóxicas. La realizan bacterias rojas, bacterias verdes y heliobacterias. La bacterioclorofila se oxida cuando llegan fotones de luz roja o infrarroja. Se encarga positivamente y los electrones pasan a la CTE. Esto les permite sintetizar ATP, ya que aprovechan la potencia fotomotriz gracias a las ATPasas de membrana. Como este proceso se desencadena por la luz, se denomina fotofosforilación. Los electrones viajan de los potenciales más electronegativos a los más electropositivos. - BACTERIAS ROJAS – El centro de reacción se denomina P870 y contiene 4 moléculas de bacterioclorofila, 2 de las cuales constituyen el “par especial”, y 2 moléculas de bacteriofeofitina (I). Absorben una longitud de onda de 870 nm. En el estado basal presenta un potencial de 0,5 V. Tras la excitación de la luz, P870 pasa a P870 excitado (P*870), que presenta un potencial de unos -0,8 V. La excitación tarda 3 billonésimas de segundo.

65

Cada electrón viaja a la bacteriofitina (I) reduciéndola, y luego llega a una quinona. La bacteriofeofitina es capaz, en su estado reducido, de reducir a la quinona. No hay una sola quinona, sino que hay un pull de quinonas. La primera quinona (que sería Z) cede 2 electrones. Desde la quinona los electrones se van a transportar en la membrana a través de una serie de citocromos (citocromo b/c1 y FeS). Este proceso tarda una milésima de segundo. Los electrones pasan al citocromo c2, que es periplasmático, y es el intermediario del transporte de electrones: devuelve los electrones al fotosistema P870. La disposición de estos electrones en la membrana permite la síntesis de ATP. A la vez que pasan los electrones por esta cadena circular se traslocan protones al periplasma. La síntesis es el resultado de la formación de una fuerza fotomotriz producida por el gradiente de electrones y la actividad de una ATPasa de membrana que acopla la formación de ese gradiente con la formación de ATP. Por lo tanto, por cada electrón que pasa a la CTE, pasan 2 H+ al periplasma. El proceso se denomina “fotofosforilación cíclica” porque los electrones circulan en un círculo cerrado. Se parece algo a la respiración en cuanto a que el flujo de electrones en la membrana crea una fuerza fotomotriz que permite la producción de ATP, pero aquí no hay entrada de electrones, sino que éstos viajan por una ruta cerrada. - BACTERIAS VERDES DEL AZUFRE Tanto el centro de reacción como el mecanismo de fotosíntesis son parecidos a los de las bacterias rojas. Tanto las bacterias verdes del azufre como las heliobacterias comparten ciertos mecanismos primarios que las hacen más parecidas entre ellas y las diferencian de las bacterias rojas. Presentan bacterioclorofilas: - Bacterias verdes: su centro de reacción se denomina P840 que presenta Cla. - Heliobacterias: el centro de reacción es el P798 que tiene Clg. En ambos casos se aprecian formas de Cla: Cla en bacterias verdes e hidroxiCla en heliobacterias. En las dos situaciones, una proteína, la FeS, actúa como Z, con un potencial de -0,6 V. En el caso de las bacterias rojas, el equivalente es la quinona, con un potencial de -0,15 V. Además, otro elemento importante es la ferredoxina (Fd), también presente en microorganismos con fotosíntesis anoxigénica.

• Obtención de ATP: Lo obtienen del mismo modo que las bacterias rojas: por fotofosforilación cíclica. • Obtención de poder reductor: Utilizan NADPH como poder reductor. La fuente primaria de este poder reductor pueden ser compuestos orgánicos (lactato, malato, succinato…) o inorgánicos (S, H, SH2…). Durante este crecimiento autotrófico, oxidan al donador externo de electrones, reduciendo el NADP a NADPH. Hay que tener en cuenta los potenciales redox de los donadores para saber por qué en algunos casos estas bacterias realizan un transporte inverso de electrones y en otros no. - TRANSPORTE DE ELECTRONES – Existen 3 métodos de transferir electrones desde los donadores al NADP:

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1)

Transferencia directa desde el compuesto altamente reducido al NADP. Por ejemplo, el H (-0,41 V) reduce directamente al NADP. El poder reductor lo obtienen de forma independiente al fotosistema.

2)

En bacterias rojas, cuando crecen utilizando compuestos orgánicos como donadores externos o compuestos reducidos del S con potenciales más altos que el del par NADP/NADPH, directamente no pueden reducir al NADP. Los electrones de ese depósito o pull de quinonas son forzados a moverse de forma inversa, en contra de gradiente electroquímico para reducir al NADP. Los electrones que salen del ciclo para reducir al NADP son sustituidos por los electrones que proceden de los donadores externos. Se necesita un transporte de electrones inverso; el fotosistema aporta la fuerza fotomotriz para generar el transporte inverso de electrones.

3)

Las bacterias verdes del azufre y las heliobacterias presentan un transporte de electrones que permite reducir el NADP aunque empleen donadores externos con potenciales más altos que el del par NADP/NADPH. En ambos casos, la cadena de transporte de electrones se produce entre la bacterioclorofila del centro de reacción al primer transportador de electrones, la proteína hierro-azufre (FeS), que es lo suficientemente electronegativa como para reducir a la ferredoxina y es, por tanto, más reductora que la quinona, que actúa en bacterias rojas. La ferredoXina puede reducir directamente al NADP a NADPH, sin que haga falta transporte inverso de electrones. Todo depende del potencial ε’O : ε’O (Z) < ε’O (NADP/NADPH)

Transporte normal de electrones

ε’O (Z) > ε’O (NADP/NADPH)

Transporte inverso de electrones

Las bacterias verdes del azufre y las heliobacterias, aunque emplean distintas clorofilas, son parecidas en cuanto al mecanismo primario de fotosíntesis. La ferredoxina reducida en las bacterias verdes del azufre no solamente reduce directamente al NADP sino que también participa en la fijación del CO2. Siguen el ciclo de TCA inverso. En las bacterias que no son del azufre (por ejemplo, Chloroflexus), el Z presenta un potencial que impide la reducción directa del NADP: necesita un transporte inverso de electrones como las bacterias rojas. Las bacterias del azufre son fototrofos obligados. Las bacterias que no son del azufre tienen un metabolismo más flexible: pueden respirar, fermentar,… En otras, el O2 inhibe la formación de bacterioclorofila de modo que no podrán sintetizar en condiciones anóxicas. Cuando utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono, cuando fotosintetizan, no en presencia de oxígeno, se les pueden considerar fotoheterótrofas. La fotosíntesis es incompatible con oxígeno. FOTOSÍNTESIS OXIGÉNICA Se emplea la Cla y utilizan agua como donador de electrones, y se desprende oxígeno. La realizan plantas, algas eucariotas y cianobacterias.

67

Existen 2 fotosistemas: 1. Fotosistema I (PSI) llamado P700: capta la luz infrarroja. 2. Fotosistema II (PSII) llamado P680: capta la luz roja. Llegan 2 fotones a la antena o centro de reacción del PSII. La antena transfiere la energía luminosa a la Cla del par especial del PSII y ésta pasa a un estado excitado. Entonces se comporta como un reductor fuerte y puede reducir a la feofitina (I), y queda oxidada. En su estado basal, P680 tiene un ε’O = 1 V; cuando llega el electrón, ε’O = - 0,8 V. El electrón que pasa a la feofitina es repuesto por el que cede el agua. Desde la feofitina, los 2 electrones pasan a la quinona, después a la plastoquinona y después a un complejo de citocromos (Citb6, FeS y CitF). De este complejo, pasan a la plastocianina, que contiene cobre, y pasan finalmente al P700. Para que P700 sea capaz de captar electrones, tiene que estar oxidado. Esto sucede siempre y cuando la antena del PSI haya absorbido la luz adecuada, pasando de un potencial de 0,5 V a un potencial de – 1,4 V. Entonces será capaz de captar electrones. e-

P*700

A o FeS

e-

FeS

e-

Fd

Via cíclica

e-

2 caminos

Via no cíclica

- VIA NO CÍCLICA La ferredoxina reduce al NADP a NADPH y se oxida, pudiendo seguir aceptando electrones. Los electrones salen del sistema. Se requiere la participación del PSII para reponer electrones. Se forma NADPH y los protones proceden del agua. Se sintetiza ATP: las ATPasas de la membrana tilacoidal van a aprovechar la fuerza protomotriz del intercambio de electrones entre la plastoquinona y el complejo Citbf. A esta síntesis de ATP se denomina fotofosforilación no cíclica. Está impulsada por la luz. La trayectoria del flujo de electrones tiene forma de Z tumbada. Se desprende oxígeno a partir de la fotolisis del agua: entonces parte de los protones se destinan a reducir el NADP y parte a mantener el gradiente de protones del espacio tilacoidal. El agua se necesita por último para reducir al PSI: se produce NADPH gracias a los electrones que cede el P700. La reposición de esos electrones la realiza el agua de forma indirecta. El agua es un reductor muy débil: los electrones liberados de la fotolisis reducen primero al P680 y esos electrones procedentes del P680 pasan por la cadena de electrones y van a pasar al P700. Así, se produce una reducción directa de P680 e indirecta de P700. - VIA CÍCLICA – Cuando hay suficiente NADPH, los electrones son devueltos al sistema a través de un citocromo, el Citb583, que capta los electrones de la ferredoxina y los pasa a la plastoquinona. En esta vía no se forma NADPH, se sintetiza ATP. No se desprende oxígeno y sólo interviene un fotosistema. Normalmente los fotosistemas actúan juntos, de forma coordinada. Sin embargo, en algas y cianobacterias, bajo ciertas circunstancias, son capaces de realizar fotofosforilación cíclica utilizando sólo el PSI. Sería una fotosíntesis anoxigénica llevada a cabo por fototrofos oxigénicos, ya que hacen falta condiciones anóxicas y una

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sustancia reductora (un sulfuro o H, por ejemplo). En las algas el reductor no es normalmente el H, ya que sintetizan hidrogenasa y oxidan el H para poder reducir el NADP a NADPH. QUIMILITOTROFÍA Los organismos quimiolitotrofos utilizan compuestos inorgánicos como fuente de energía. Los donadores de electrones son los mismos compuestos inorgánicos. A diferencia de los autótrofos, se trata de NADH y no de NADPH. El aceptor final es el oxígeno: es una oxidación aeróbica. No hablamos de “respiración” ya que es un término exclusivo de quimiorganolitotrofos. Muchos son autótrofos. Diferenciamos distintos grupos, dependiendo de los donadores de electrones. - OXIDANTES DEL HIDRÓGENO Oxidan el H aeróbicamente. Estas bacterias pertenecen a diferentes grupos de bacterias. Son bacterias microaerófilas y autótrofas facultativas. Algunas de estas bacterias, como algunas cepas de Escherichia Coli, son mixotrofas (quimiolitoheterotrofas), es decir, su fuente de energía es un compuesto inorgánico (el H) y la fuente de carbono es orgánica (no pueden fijar CO2).

Estas bacterias poseen enzimas hidrogenasas, que pueden ser: a) Hidrogenasa particulada: se encuentra en la membrana y es la más común. Aparece en el género Nocardia. b) Hidrogenasa soluble: aparece en Pseudomonas y Paracoccus. Hay bacterias que presentan ambos tipos, como el género Alcaligenes. La hidrogenasa es sensible a altas concentraciones de oxígeno; por eso, estas bacterias suelen ser microaerófilas. Esta enzima cataliza la reacción inicial del hidrógeno. Los protones y electrones resultantes son transferidos a una quinona o a una NAD+, a la que reduce. Posteriormente, y en ambos casos, pasan a una CTE y finalmente reducen el O2 a H2O. Se genera entonces poder reductor y ATP. El ATP se sintetiza por el paso de electrones por la CTE, lo cual genera un gradiente de electrones que es utilizado por las ATPasas de membrana para producir ATP. Los átomos de hidrógeno se transfieren a una quinona, luego a la CTE y finalmente reduce el O2 a H2O. El O2 no actúa como una fuente de poder reductor directa. El NADH se consigue por un transporte inverso de electrones, con gasto de ATP. Los microorganismos con hidrogenasas particuladas presentan un crecimiento más lento que los que tienen ambos tipos, ya que en estos últimos, la hidrogenasa soluble está implicada en la obtención de poder reductor, mientras que la particulada se utiliza para generar ATP.

69

- OXIDANTES DEL AZUFRE No todas estas bacterias son aerobias estrictas: en ocasiones sustituyen el O2 por nitratos como aceptor final (por ejemplo, Thiobacillus denitrificans). Estas bacterias utilizan como fuente de poder reductor y de energía el azufre o sus derivados (S-2, S0, S2O3-2…) aunque hay algunos que pueden utilizar hierro en su estado Fe+2 (por ejemplo, Thiobacillus ferrooxidans) Dentro de este tipo, hay bacterias autótrofas obligadas (que sólo fijan el CO 2) y otras autótrofas facultativas (no fijan el CO2 en presencia de fuentes de carbono orgánicas). Dependiendo del tipo de microorganismo, cogen S -2, S0 o S2O3-2 y lo convierten en SO3-2. Los electrones pasan a una CTE, donde se genera ATP, hasta llegar a una molécula de O2 a la que reducen formando H2O. - OXIDANTES DEL HIERRO Oxidan Fe+2 a Fe+3. Son microorganismos (por ejemplo, Thiobacillus ferrooxidans) que viven en suelos ácidos, ya que estos suelos evitan la oxidación espontánea de Fe+2 a Fe+3, que se produce en suelos normales. En este grupo también hay arqueas, como Sulfolobus, que es una arquea termoacidófila, aerobia estricta y quimiolitotrofa facultativa.

- NITROSOFICANTES / NITRIFICANTES -

a) b)

Nitrosoficantes: transforman NH3 a NO2-. Por ejemplo, Nitrosomas. Nitrificantes: transforman el NO2- a NO3-. Por ejemplo, Nitrobacter.

Son bacterias aerobias estrictas y la mayoría son también autótrofas obligadas. Dentro de las nitrificantes hay algunas que son autótrofas facultativas. - CARBÓXIDOBACTERIAS O BACTERIAS CARBOXIDOTRÓFICAS – Oxidan el CO a CO2. Están desperdigadas en diferentes taxones, como Pseudomonas, Azotobacter o Alcaligenes. Todas son además oxidantes del hidrogeno, aunque no todas las oxidantes del nitrógeno son carbóxidobacterias. CICLO DE CALVIN La mayoría de litotrofos fijan el CO2, ya sean autótrofos facultativos u obligados. Tanto el ATP como el NAD(P)H son utilizados en la fijación del CO2, y la mayoría de las bacterias lo realizan por el Ciclo de Calvin. Es lo más habitual pero no es el único. En procariotas, el CO2 se fija en los carboxisomas. Dentro del Ciclo de Calvin encontramos 3 fases: 1)

Fijación:

70

Es la etapa inicial, donde el CO2 se fija en la ribulosa-1,5-bifosfato, proceso llevado a cabo por la enzima Rubisco. Partimos de 6 CO2 y 6 ribulosa-1,5-bifosfato, para formar 12 moléculas de 3fosfoglicerato. 2) Reducción: Es el proceso por el cual se forman 12 moléculas de gliceraldeído-3P. De estas 12 moléculas, tan sólo 2 salen para ser utilizadas en la síntesis de glucosa o similares, mientras que las 10 restantes siguen en el ciclo.

3)

Regeneración del aceptor de CO2.

En resumen, el proceso total puede resumirse como: 6 CO2 + 12 NADPH + 18 ATP

C6H1206 + 18 NADP+ + 18 ADP

No todas las bacterias lo hacen así:

-

Las bacterias verdes del azufre: fijan el CO2 por el ciclo TCA inverso, que es similar al de Krebs. La ferredoxina es un elemento clave en este ciclo. Las bacterias verdes no del azufre: fijan el CO2 en la vía del hidroxipropionato. Un intermediario de este ciclo es el hidroxipropionil-CoA.

TEMA 13 : UTILIZACIÓN DE LA ENERGÍA EN PROCESOS ESPECIALES MECANISMOS DE PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE Tanto si se trata de un medio natural como de un medio artificial, la concentración de nutrientes intracelular es siempre mayor que la extracelular. Incluso mucho de esos solutos internos son diferentes a los solutos externos. Esta diferencia de concentraciones es creada y mantenida por la membrana plasmática y las proteínas asociadas a ella. La membrana plasmática es permeable a pequeños compuestos no polares, como el agua, y a compuestos solubles en fases hidrófobas; es impermeable a iones, moléculas cargadas y moléculas grandes, que precisarán de la intervención de proteínas asociadas o insertas en la membrana plasmática para poder atravesarla. En el caso de las bacterias Gram- encontramos: 1) Membrana citoplasmática 2) Membrana externa: también participa en la regulación del paso de nutrientes y solutos. Es semipermeable. El modo de regulación es diferente al de la membrana plasmática. 3) Periplasma: la composición de solutos es diferente tanto a la composición de solutos interna de la célula como a la externa. DIFUSIÓN PASIVA O SIMPLE

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Es el mecanismo más sencillo de transporte y no requiere gasto de energía. El flujo neto de solutos que se transporta se lleva a cabo por la existencia de un gradiente de concentración: el transporte se realiza a favor de gradiente de concentración. Con este transporte se aproximan las concentraciones intra y extracelulares. La velocidad de este transporte es directamente proporcional a la diferencia de concentración: a mayor diferencia, mayor velocidad. A diferencia del resto de mecanismos de transporte, éste es inespecífico, es decir, que sólo actúa para aquellas sustancias para las que la célula es permeable inespecíficamente (por toda su superficie, sin existir zonas donde se favorezca más o menos este transporte). Mediante esta difusión simple se transporta: - Agua - Gases: N2, O2, CO2,… - Nutrientes: atraviesan la membrana externa de las Gram- por difusión simple. DIFUSIÓN FACILITADA También se realiza sin gasto alguno de energía y permite la difusión de solutos para los que la membrana es impermeable. El flujo de sustancias también es a favor de gradiente de concentración. La difusión facilitada es específica. La membrana es permeable sólo por determinados puntos, donde se sitúan las permeasas o Carrier Proteins, y es allí por donde las sustancias pasan. La presencia en la membrana o la síntesis de estas permeasas es inducida por la presencia previa en el medio de la sustancia a transportar. La permeasa se une al soluto, formándose un complejo en la superficie externa de la membrana, que al rato se disocia mientras la permeasa deposita a la sustancia transportada en el citoplasma. Es un transporte de naturaleza enzimática, por lo que es más rápido que la difusión pasiva. Además, muestra una especificidad de sustrato. La velocidad de flujo de ese sustrato va a tender a un límite a medida que aumenta la concentración del sustrato. La velocidad del flujo de esa sustancia responde a una cinética típica de una reacción enzimática catalizada por una enzima Michaeliana. [S]exterior Ventrada = Ventrada máxima · Kmentrada + [S]exterior [S]interior Vsalida = Vsalida máxima ·

Kmsalida + [S]interior

Hay saturación: se obtiene la velocidad máxima en concentraciones saturables. Es un proceso reversible, pero la célula metaboliza los nutrientes rápidamente, por lo que la permeasa no tiene tiempo de sacarlos al exterior, y así se favorece el transporte. Esta difusión facilitada es más común en eucariotas que en procariotas. En eucariotas entran azúcares con este transporte, mientras que los procariotas lo utilizan para transportar glicerol. Los procariotas transporta azúcares por transporte activo o por translocación de grupo. TRANSPORTE ACTIVO - TRANSPORTADOR DE TIPO ABC -

72

El transporte activo gasta energía para transportar nutrientes en aquellos microorganismos cuyas fuentes de nutrientes son escasas. Pueden encontrarse en el interior celular concentraciones del orden de 100 ó 1000 veces mayores. El transporte activo tiene capacidad de almacenar sustancias en contra de gradiente. Se requiere un transportador proteico que puede saturarse, pero necesita el aporte de energía metabólica. En presencia de inhibidores metabólicos que bloquean la producción de energía se observa que se inhibe el transporte activo pero no la difusión facilitada. El transporte activo se puede realizar de 2 maneras: 1. Utilizando ATP o similares: Se utiliza energía de la hidrólisis de ATP para realizar el transporte de la sustancia en contra de gradiente. Son transportadores denominados ABC (ATP Binding Cassette). En bacterias Gram- existen las proteínas de unión o Binding Proteins, que se encuentran en el periplasma y que se unen con facilidad a los sustratos a los que van a transportar. Actúan junto con proteínas de transporte de la membrana o transmembranales. Al unirse al sustrato a transportar, se produce un aumento en la concentración del soluto en el periplasma, aumentando la concentración efectiva de esa sustancia. La proteína se encarga de transportarla al interior celular. Las Binding Proteins aumentan la velocidad del transporte. Las sustancias que se transportan en E. Coli son: azúcares (maltosa, arabinosa, galactosa, ribosa…) y aminoácidos (leucina, glutámico, histidina…). También aparece este transporte en Gram+, pero las Binding Proteins son exclusivas de Gram-. En Gram+ este transporte no se conoce mucho. Hay unas proteínas equivalentes en función a las Binding Proteins, que se encuentran unidas a los lípidos de la cara externa del citoplasma. 2. A expensas de un gradiente de concentración: Es más común. Es un gradiente de protones o de sodio. En muchos casos, la energía liberada por el microorganismo se utiliza para establecer un aumento del gradiente de protones a través de una membrana, situando una mayor concentración fuera que dentro. Una vez establecido ese gradiente de protones puede ser aprovechado para la incorporación de otras sustancias al interior celular. Las proteínas transportadoras de este transporte deben tener sitios específicos para las sustancias a transportar y otros para unir los protones y el sodio. A medida que esa sustancia se transporta, el gradiente se irá reduciendo. Siempre se está regenerando esta fuerza protomotriz, que continuamente se está produciendo. Las proteínas de membrana responsables de este transporte no actúan conjuntamente con las Bindings Proteins. Se transportan sustancias como la lactosa. Existen 3 tipos dependiendo el modo de transporte: 1. Uniporte: Sólo interviene una sustancia. Los uniportadores transportan una sustancia a través de la membrana, ya sea para su entrada o para su salida. Este transporte está dirigido por un gradiente de electrones. Se transporta por ejemplo potasio, que aprovecha la diferencia de cargas de la membrana. 2.

Antiporte:

73

Es el transporte simultáneo de 2 moléculas en sentidos opuestos por un antiportador. Esta diferencia de cargas a los lados de la membrana pueden permitir un antiporte electroneutro (1 Na+ y 1 H+) o un antiporte electrogénico (1 soluto sin carga y 1 H+). 3. Simporte: Es el transporte simultáneo de 2 sustancia en el mismo sentido; uno va a favor de gradiente y otro se transporta con ella. También puede ser electroneutro (1 anión con 1 protón) o electrogénico (1 sin carga con 1 protón). Para transportar una determinada molécula no hay un solo mecanismo de transporte. En E. Coli hay 5 sistemas de transporte diferentes para la galactosa, 3 para la leucina o el glutámico, 2 para el potasio,… La diversidad proporciona una ventaja ante posibles cambios ambientales, garantizando así el transporte. TRANSLOCACIÓN DE GRUPO Hay algunas sustancias que al entrar en la célula se modifican convirtiéndose en una sustancia impermeable para la célula. Esto permite que la célula mantenga una alta concentración de esa sustancia modificada en el interior a expensas de la sustancia no modificada del exterior. Realmente, al ser simultáneo con el transporte, no se establece un gradiente de concentración porque son sustancias diferentes. Es un mecanismo conservador desde el punto de vista del gasto de energía (gasta menos) porque normalmente las sustancias, al entrar en la célula, se fosforilan, gastando energía (1 ATP para transportarla + 1 ATP para fosforilarla), mientras que el proceso de modificación sólo gasta un ATP. Esta translocación de grupo es específica de procariotas, y es típica de enterobacterias y otras bacterias fermentadoras. El sistema más usado es el mecanismo de las fosfotransferasas. Se transporta:

a)

Glucosa: consta de una enzima (EI) y de una proteína (HPr); ninguno de los dos son específicos para la glucosa. Después hay otras 3 enzimas (2A, 2B y 2C), que son específicos para cada tipo de azúcar a transportar. La síntesis de estas enzimas está inducida por la presencia de la sustancia a transportar. 2A

2B Libre

Asociada a la membrana

2C Inserta en la membrana

El fósforo llega a la glucosa a través de estas enzimas y procedentes del PEP.

b)

Ácidos grasos: se pueden transportar y a la vez tener unido el CoA, necesario para la utilización de estos ácidos grasos. El sistema Acetil-CoA-sintetasa interviene en la entrada de ácidos grasos, introduciéndolos en la forma activada.

c)

Bases nitrogenadas: pueden entrar y ser convertidas por un sistema denominado Fosforibosintransferasa, que cataliza el transporte y la unión de ciertas bases a fosforibosilpirofosfato, que entran en forma de nucleótido. Algunas bacterias pueden incorporar ciertas bases como adenina, guanina, xantina, lipoxantina y uracilo al interior en forma de nucleótidos.

74

d)

Proteínas: hay proteínas que se transportan fuera de la célula . Las proteínas requieren un transporte especial, por translocasas. FIJACIÓN DE NITRÓGENO - MECANISMO Y DISTRIBUCIÓN DEL PROCESO Se limita a procariotas. El nitrógeno deber ser reducido hasta amoniaco antes de su incorporación. La fijación del nitrógeno la realizan las Nitrogenasas o Complejos Nitrogenasas, que se caracterizan por su extrema sensibilidad al oxígeno, en cuya presencia se inactivan irreversiblemente, y requieren energía en forma de ATP. Esto no significa que no se pueda fijar nitrógeno en el caso de los microorganismos aeróbicos, pero éstos han desarrollado mecanismos que permiten aislar a las nitrogenasas de la acción del oxígeno. Los mecanismos para fijar nitrógeno en presencia de oxígeno son: 1) Estructuras celulares específicas o heterocistos: en cianobacterias. 2) Rhizobium: bacteria que induce en el simbionte la leghemoglobina, que protege del oxígeno a estas enzimas fijadoras de nitrógeno. 3) Fijadores libres (no simbióticos) que además son aerobios estrictos (como es el caso de Azotobacter): la nitrogenasa es resistente porque se protege mediante la formación de complejos por un mecanismo de protección conformacional (forman complejos con una proteína determinada). Presentan una tasa respiratoria muy elevada, ya que metabolizan rápidamente el oxígeno para evitar su contacto con la nitrogenasa. La fijación de nitrógeno no está asociada a un tipo de microorganismo concreto. - SISTEMA NITROGENASA – Participan 2 proteínas:

1.

Componente 2, ferroproteína o reductasa de la nitrogenasa:

Tiene un peso molecular de 64000 Da. Se le denomina ferroproteína porque tiene 4 átomos de Fe por cada molécula. 2.

Componente 1, moliptoferroproteína o dinitrogenasa:

Tiene un peso molecular de 220000 Da. El hierro y el molibdeno forman parte de un cofactor que ocupa el centro activo del componente, donde sucede la reducción real del nitrógeno a NH 3+. Por cada átomo de Mo tiene 7 de hierro y 9 de azufre unidos a un homocitrato. Existen 2 copias de este cofactor por cada molécula de nitrogenasa. 7 Fe + 9 S/1 Mo + homocitrato - MECANISMO DE ACCIÓN Para fijar nitrógeno se necesita poder reductor y ATP. El ATP se canaliza por un sistema de transporte de electrones, que pueden ser transferidos por una ferredoxina o por una flavodoxina, ambas proteínas FeS.

75

Los electrones pasan al Componente 2, lo que sucede paralelo a una hidrólisis masiva de ATP. Por cada nitrogenasa reducida se hidrolizan 16 ATP. Al unirse todo el ATP al Componente 2, se reduce el potencial redox. Esto lo capacita para reducir al Componente 1, y es aquí donde realmente se produce la reducción de hidrógeno a NH3+, el cual se incorpora a distintos componentes de la célula (especialmente a los ácidos orgánicos). Es un proceso secuencial: el nitrógeno se convierte en HN y NH2 antes de pasar a NH3+. La reducción del nitrógeno molecular a amonio es bastante exergónica. Es un proceso costoso y requiere gran gasto de ATP. Se necesita: N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP

2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

El ATP procede de la fermentación, respiración, fotosíntesis, etc, dependiendo del microorganismo. Las cantidades necesarias de ATP y poder reductor son tan importantes que sólo se manifiestan en los estados de rendimiento energético del crecimiento. Si en el ambiente hay NH3+ disponible, no se fija nitrógeno. La nitrogenasa es poco específica a nivel de sustrato. Hay otros compuestos que pueden ser reducidos por la nitrogenasa (azida, cianuro, NO, nitrilo,…). Para poder medir su actividad se emplea como sustrato el acetileno. Las reacciones que realiza la nitrogenasa sí son específicas. Acetileno

2e- 2H+

HC≡CH

Etileno H2C≡CH2

- HIDROGENASA – En todos los microorganismos fijadores de nitrógeno hay también una hidrogenasa ligada a la membrana. Existe la posibilidad de que tenga una función protectora del sistema nitrogenasa, que es sensible al oxígeno. El oxígeno que se forma podría utilizarse para formar agua. - REGULACIÓN DE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO La nitrogenasa es sintetizada en aquellas condiciones en las que es necesaria para el crecimiento, es decir, cuando la célula carezca de una fuente utilizable de nitrógeno. Los iones amonio, que es la forma habitual de encontrar el nitrógeno, reprimen la síntesis de nitrogenasa. La actividad de la enzima ya presente también puede verse reducida en presencia de amonio en algunas bacterias. Hay al menos 3 rutas de fijación de amoniaco:

1.

Mediante la formación del aminoácido alanina en una reacción de aminación reductora catalizada por la alanina deshidrogenasa. Piruvato + NH4+ + NAD(P)H + H+

L-alanina + NAD(P)+ + H2O

2.

Sistema glutamato-deshidrogenasa: se utiliza en condiciones de elevadas concentraciones de amonio. El amoniaco reacciona con el ɑ-cetoglutarato y se forma glutarato. Se consume NAD(P)H y se forma, además del glutarato, agua. Estos aminoácidos se pueden sintetizar a partir del glutamato y otros ɑ-cetoácidos. Participan transaminasas. ɑ-cetoglutarato + NH4+ + NAD(P)H + H+

Glutamato + NAD(P)+ + H2O

76

3.

Sistema glutamina-sintetasa – glutamato sintasa: en condiciones de bajas cantidades de amonio. Se produce glutamato. Es la ruta principal, tiene gran afinidad por los iones amonio y determina que la concentración de estos iones sea baja en la célula ya que en seguida los incorpora en la ruta. También participan transaminasas. Cuando, de repente, aumenta la concentración de amonio en el medio, se produce una inactivación de la glutamina-sintetasa. Así, se evita el gasto inútil de ATP que realiza esta ruta, y en este caso operaría el sistema glutamato-deshidrogenasa. La capacidad de fijar nitrógeno se puede transferir entre bacterias mediante contacto directo, por conjugación. Este hecho, y el que los genes nif, responsables de la fijación de nitrógeno, se sitúen en plásmidos, hacen que se pueda transferir esta capacidad entre bacterias, e incluso de bacterias a organismos eucariotas. Pero, además de la nitrogenasa, existen más requerimientos para la fijación de nitrógeno, como un sistema de ferroproteínas y de protección de la nitrogenasa. SÍNTESIS DE PEPTIDOGLICANO Es un proceso que consta de 3 fases: 1. Síntesis de peptidoglicano propiamente dicha en el citoplasma: las unidades repetitivas del peptidoglicano se sintetizan unidas a UDP. 2. Las unidades se transfieren a un lípido transportador que facilita su transporte a la membrana.

3.

En la cara externa de la membrana se polimerizan, dando lugar a peptidoglicano mediante una serie de enzimas presentes en la cara externa de la membrana. El peptidoglicano forma una red bidimensional que rodea a las células en forma de saco. Su síntesis requiere que esas unidades se enlacen en 2 dimensiones:

1)

Una de ellas enlazando NAG-NAM mediantes enlaces β(1-4)

2)

Otra dimensión mediante la unión de una cadena con otra por un enlace peptídico entre el carboxilo del último aminoácido con el grupo amino de un diaminoácido situado en la posición 3 de la otra cadena. Sin embargo, no siempre sucede esto, y hay cadenas que no van enlazadas. La composición química del peptidoglicano es típica de bacterias. En arqueas aparece el pseudopeptidoglicano. Entre bacterias, el peptidoglicano se diferencia en la frecuencia de los enlaces y en la composición de las cadenas peptídicas. - FASE 1 En el citoplasma, lo primero que ocurre es una fosforilación, produciéndose fructosa-6-fosfato o glucosa-6fosfato. Después, se produce una aminación: la fructosa-6P o la glucosa-6P pasan a glucosamina-6P con adición de glutamina. Mediante aporte de CoA se forma N-acetilglucosamina-6P, que pasa a N-acetilglucosamina-1P y finalmente, con gasto de UTP, pasa a UDP-N-acetilglucosamina (UDP-NAG). Ésta reacciona en un proceso de reducción al PEP, formándose UDP-NAM. A continuación se van incorporando los diferentes aminoácidos. En el citoplasma se sintetiza como un pentapéptido (5 aminoácidos) con 2 alaninas terminales en vez de una. Así, se forma UDP-NAM-pentapéptido. Éste debe atravesar la membrana, pero ésta es impermeable a moléculas energéticas.

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Un lípido, el bactoprenol, lo transporta por la membrana. El bactoprenol es un lípido isoprenoide de 55 carbonos que está fosforilado. Interactúa con el UDP-NAM-pentapéptido, uniéndose al NAM por un enlace fosfodiéster, produciéndose entonces una liberación de UMP al citoplasma. La forma bactoprenol-pentapéptido reacciona con UDP-NAG, y el NAG se incorpora. En esta forma se transporta y se libera el bactoprenol. Las cadenas se unen por enlaces peptídicos por las enzimas transaminasas. A veces la transpeptidación no es directa y se realiza a través de puentes interpeptídicos de pentaglicina (Ejemplo: Staphylococcus aureus). Las enzimas autolisinas realizan cortes en puntos concretos, y van cortando las uniones que conectan zonas ya existentes de cadena e insertando nuevas unidades, permitiendo así el crecimiento de la célula, hasta que llega un momento en que se tabica. Existen numerosos agentes antimicrobianos que afectan a la síntesis de peptidoglicano. Algunos de estos agentes son:

a)

Fosfomicina o fosfonomicina: es un análogo estructural del PEP que bloquea la formación del UDP-NAM, que procede del UDP-NAG. Está producida por un actinomiceto: Streptomyces fradiae.

b)

D-cicloserina: es un análogo estructural y funcional de la D-alanina. Actúa haciendo que el peptidoglicano forme una malla inestable que al final provoca la lisis osmótica. La produce Streptomyces orchidaceus. Presenta un bajo índice terapéutico porque es muy tóxico a nivel del sistema nervioso central. Normalmente sólo se utiliza para casos extremos de tuberculosis.

c)

Bacitracina: péptido cíclico que presenta un anillo de tiazolina. Bloquea el paso de desfosforilación del bactoprenol-pirofosfato a bactoprenol-P. Se utiliza de forma tópica en quemaduras, laceraciones… aunque también es tóxico. Lo producen Bacillus subtilis o B. licheniformis.

d)

Vancomicina: es un antibacteriano de amplio espectro y también es tóxico. Se utiliza en casos de infecciones de estafilococos resistentes. La produce Streptomyces orientalis.

e)

Ristocetina: es parecida a la vancomicina. Ambos son glucopéptidos que actúan formando un complejo con el extremo de D-alanil-D-alanina, bloqueando el entrecruzamiento de péptidos en la pared celular. Producida por Nocardia lurida.

f)

Lisozima: no es un antibiótico. Actúa escindiendo el peptidoglicano a nivel de las uniones β(1-4), debilitando la pared celular y provocando lisis osmótica. Aparece en secreciones animales, y es la primera línea de defensa de éstos frente a infecciones bacterianas.

g)

β-lactámicos:

- Penicilinas: estructura análoga al extremo D-alanil-D-alanina. - Cefalosporinas: inhiben la transpeptidación. Producen lisis osmótica. Para que estos antibióticos actúen hace falta que haya crecimiento bacteriano, para que se esté sintetizando el peptidoglicano. Si están en estado estacionario, no hacen nada.

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BLOQUE III: TAXONOMÍA Y ECOLOGÍA MICROBIANA TEMA 14 : CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS La taxonomía se define como la ciencia de la clasificación biológica. Consta de 3 partes:

1)

Clasificación: organización de los organismos en grupos o taxones, en función de sus semejanzas o parentesco evolutivo.

2)

Nomenclatura: se encarga de la asignación de nombres a los taxones, de acuerdo con una serie de normas establecidas. Nos permite disponer de un lenguaje científico internacional.

3)

Identificación: es el lado práctico de la taxonomía. Nos permite determinar que microorganismo pertenece a un determinado taxón ya conocido. La sistemática se emplea para referirse a la taxonomía. Es el estudio científico de los organismos, cuyo objetivo principal es agruparlos taxonómica. Abarca disciplinas como la Ecología, Fisiología, Bioquímica, Biología Molecular, Epidemiología,… LUGAR DE LOS MICROORGANISMOS Han existido a lo largo de la Historia diversos sistemas de clasificación. 2 de ellos son:

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I.Clasificación de 5 reinos: propuesta por Robert Whittaker en 1969, está totalmente desfasada. Considera a los procariotas como antecesores de los eucariotas. Monera: bacterias Protista: protozoos, algas (unicelulares o pluricelulares no diferenciadas en tejidos) Animalia: consiguen nutrientes mediante su ingestión Plantae: consiguen nutrientes por fotosíntesis Fungi: consiguen nutrientes por absorción de materia orgánica

II.Clasificación de 3 reinos: descrita por Carl R. Woese en 1990. Basado en estudios del RNA ribosómico 16S. Considera que los procariotas, a pesar de ser distintos en apariencia, presentaban distintas características entre ellos. Ha demostrado que hasta aquel momento se había sobrevalorado la importancia evolutiva de metazoos. La mayor diversidad biológica se daba en procariotas. Eukarya Prokarya

Bacteria Archaea

Tal eran las diferencias entre los propios procariotas que en vez de reinos pasaron a llamarse dominios: eukarya, bacteria y archaea. Dentro de ellos, a su vez, podían haber más reinos. - Imperios: sinónimo de dominio que fue aceptado en 1995. - En 1996 Pace definió un nuevo reino dentro de arqueas. · EVOLUCIÓN Y DIVERSIDAD MICROBIANAS Se ha calculado que la Tierra tiene unos 4600 ma. de antigüedad. Se han descubierto fósiles procariotas de unos 3500-3800 ma. en estromatolitos y rocas sedimentarias. Los estromatolitos son rocas estratificadas formadas por la incorporación de sedimentos minerales en comunidades microbianas laminadas. Los modernos están formados por cianobacterias, por lo que se supone que algunos estromatolitos fosilizados se formaron de forma similar. El agua líquida apareció hace 3800 ma. Los microorganismos eran procariotas fototrofos anaeróbicos. La fotosíntesis oxigénica se desarrolló más tarde, hace unos 2500-3000 ma. La diversidad de microorganismos aumentó a medida que el oxígeno se hizo más abundante. Parece probable que los eucariotas modernos se originaron por procariotas: los fósiles más antiguos son restos de procariotas, mientras que los fósiles de eucariotas son más recientes. Se piensa que los eucariotas aparecieron hace unos 1500-1400 ma. Existen varias teorías sobre la aparición de eucariotas:

1.

Hipótesis: los núcleos, mitocondrias y cloroplastos se originaron por invaginación de la membrana plasmática, generando orgánulos de doble membrana con material genético, y a partir de ahí sufrieron especialización. El proceso de cambio de los orgánulos es muy lento y por eso conservan caracteres de los procariotas. Los orgánulos de eucariotas son muy similares a los procariotas.

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2.

Teoría de la endosimbiosis: es la más aceptada. Las células eucariotas evolucionaron a partir de células procariotas que vivieron unas dentro de otras. Estudios de secuenciación molecular de los RNA ribosómicos aportaron pruebas que demuestran la semejanza entre orgánulos eucariotas y procariotas (pequeñas unidades de DNA circular covalentemente cerrado, típico de procariotas, ribosomas tipo procariota, secuencias de RNA ribosómico muy parecidas a las de bacterias, etc.). A partir del antecesor universal, denominado progenonte, se diferenciaron las bacterias, arqueas y procariotas. Una bacteria aeróbica se alojó en el citoplasma de un eucariota primitivo aportándole energía a cambio de un ambiente estable y protegido, asegurándole un aporte de nutrientes. Sería el precursor de las actuales mitocondrias. - ORIGEN DE LOS CLOROPLASTOS – Se produjo por la adquisición por endosimbiosis de un organismo fototrofo oxigénico, que liberó al eucariota primitivo del requerimiento de compuestos orgánicos para conseguir energía. El endosimbionte perdió autonomía al cederle parte de su material genético al núcleo primitivo. Tras la incorporación de endosimbiontes, se produjo una explosión de diversidad en eucariotas, hace unos 1500-1400 ma. Desde entonces hasta ahora, se ha producido un desarrollo y evolución de los metazoos mayor (han evolucionado más y conseguido mayor éxito evolutivo). Los cloroplastos parece ser que se originaron de predecesores de proclorofitos y cianobacterias. - ORIGEN DE LAS MITOCONDRIAS – Parece ser que surgieron de un grupo de bacterias antecesoras de Agrobacterium, Rhizobium o Rickettsia. Éstas viven intracelularmente. Es origen de este eucariota primitivo o urcarionte es confuso; no se sabe si evolucionó directamente del progenonte o tuvo un antecesor del tipo arquea. Las semejanzas bioquímicas entre eucariotas y arqueas hacen más creíble la segunda hipótesis. - ORIGEN DEL NÚCLEO – Se explica por el aumento de tamaño del genoma. Hizo que no fuera posible su replicación como una sola molécula, y se fragmentó en cromosomas, y todo se rodeó de una membrana. Toda la vida compartía un antecesor universal, según se deduce de estudios de secuenciación de RNA ribosomal y otras macromoléculas. La vida tomó 2 caminos: uno fue el dominio bacteria y otro el dominio arquea y eukarya. Arqueas y eucariotas están más próximos filogenéticamente entre ellos que con las bacterias. Después formaron 2 linajes independientes: arquea (menos evolucionado) y eukarya (más evolucionado). Las arqueas están más cerca de la raíz porque muchos organismos de este grupo viven en ambientes extremos y podrían representar “reliquias” evolutivas de las primeras formas de vida en la Tierra. Los organismos actuales dentro de arqueas son más similares a los que se supone que fueron los primitivos; son los que han cambiado menos. NOMENCLATURA

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La clasificación implica la necesidad de una nomenclatura científica porque los nombres comunes o vulgares son dudosos por su duplicidad. Carl von Linné o Linneo (s. XVIII) fue un botánico sueco que estableció el sistema binomial: a cada organismo se le da 2 nombres: - Nombre genérico o género - Nombre específico o especie (suele ser un adjetivo) Los nombres proceden del latín o del griego, o si no se latinizan añadiendo un sufijo adecuado. En ocasiones se puede abreviar el nombre genérico cuando ya se ha escrito previamente. JERARQUÍA TAXONÓMICA La clasificación implica agrupar a los individuos en taxones. La clasificación de microorganismos se rige por una jerarquía taxonómica. Se establecen subdivisiones, rangos o niveles. Especie

Género

Familia

Orden

Clase

Phylum

Dominios o Reinos

Los nombres de cada nivel suelen tener sufijos específicos: Familia Orden

- ceae - ales

Esta jerarquía taxonómica se basa en características filogenéticas. Cada especie de un grupo retiene características del antepasado. La dificultad de clasificar a los microorganismos viene dada porque la mayor parte de la información procede de fósiles, y la mayoría de microorganismos no fosiliza con facilidad. La falta de evidencias fósiles hace que la filogenia se base en otros datos: estudios de hibridación de ácidos nucleicos (en eucariotas concuerdan bastante bien con el registro fósil). En procariotas, algunos taxones se utilizan más que otros: el más utilizado es el de la familia. La especie es el taxón básico. El término especie entre los procariotas es diferente que con organismos superiores. En organismos superiores es un grupo de individuos con capacidad de cruzarse entre sí. En procariotas, sin embargo, se conoce como el grupo de cepas con un elevado grado de semejanza fenotípica, diferenciable de otro grupo de células. Esto no quiere decir que todas las células de una especie sean idénticas: tienen un cierto grado de diversidad genotípica interna. Es cuestión de los taxónomos determinar qué grado de diversidad genotípica puede ser admitida dentro de una misma especie. No se ha aceptado universalmente, aunque se ha propuesto, que 2 procariotas pertenezcan a la misma especie si sus RNA ribosomales 16S tienen un 97% o más de secuencias idénticas. Eso implica que su porcentaje G+T sea similar y presenten un grado de hibridación del DNA mayor del 97%. Una estirpe o cepa es una población clonal, formada por descendientes de una misma célula, pero no se descarta una divergencia a partir de la original. Se deben identificar las capas con números, epítetos… Un clon es una población de células genéticamente idénticas y descendientes de una misma célula. - PROCARIOTAS -

82

La taxonomía es bastante complicada. Hay un comité internacional de taxonomía bacteriana que establece normas para adjudicarles nombres a bacterias y adjudicarlas a un taxón. “International Committee of Systematic Bacteriology” (ICSB) “International Code of Nomenclature of Bacteria” (Revista donde se publican las normas que rigen a los procariotas) Si se aísla un microorganismo y se considera que es diferente a otros, hay que decidir si es lo suficientemente distinto para establecer una nueva especie o un nuevo género. Tiene que ser aceptado por la comunidad científica: para lograr una atribución taxonómica formal hay que dar un cultivo puro a una colección de cultivos tipo, y se conserva como patrón de referencia. Se debe publicar una descripción de las características y los datos de clasificación. Además se debe proponer un nombre, y todo esto se publica en una revista: “International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology” (IJSEM) Una vez publicada, se puede incluir en el “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”, que es el tratado oficial de sistemática de procariotas. Hay 2 tipos de manuales Bergey: - Manual de determinación: desde 1923. Es estrictamente fenético. - Manual de sistemática: emplea un sistema fenético, pero también aspectos que revelan parentescos evolutivos. TAXONOMÍA CLÁSICA - CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, ESTRUCTURALES, FISIOLÓGICAS, METABÓLICAS Y ECOLÓGICAS – 1.

Morfotipos

La morfología da información pero difícil de utilizar para la clasificación. Permite establecer morfotipos dentro de una misma especie. Al microscopio hay pocas diferencias entre organismos que, aunque sean totalmente diferentes, tienen una morfología similar. Sirve de ayuda la presencia de ciertas estructuras (endosporas, flagelos,…) y las tinciones diferenciales (Gram, Ziehl-Neelsen,…). Pero a veces estas tinciones no se pueden aplicar o presentan utilidad limitada, como en Mycoplasmas o Arqueas. 2.

Biotipos

Mediante pruebas bioquímicas, que son útiles para poder separar géneros o especies a veces estrechamente relacionados. Es muy importante la utilización de medios selectivos, diferenciales y sistemas de detección rápida: por ejemplo, el uso o no de un determinado azúcar puede ser un carácter taxonómico (el uso de lactosa en enterobacterias como: Escherichia coli y Enterobacter (lac+) y en Salmonella y Shigella (lac-)). Se establecen biotipos: cepas que aparecen dentro de una especie por características bioquímicas y fisiológicas. Se establecen dentro de una misma especie, dependiendo de sus características bioquímicas. 3.

Serotipos

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Se realizan pruebas serológicas: estudio de respuestas inmunológicas detectadas en el suero. Los microorganismos son antigénicos, y si se disponen de soluciones de anticuerpos, podemos determinar un microorganismo por la reacción antígeno-anticuerpo. Se puede tratar un microorganismo con un anticuerpo y ver si se produce reacción. Pueden realizarse pruebas de aglutinación.

+ antisuero A (-)

+ antisuero B (+)

+ antisuero C (-)

Se produce aglutinación Si un mismo anticuerpo reacciona con distintas cepas o especies, permite estudiar la posible relación entre ellas. Las pruebas serológicas permiten establecer serotipos. 4.

Fagotipos

Pruebas de tipificación con fagos o pruebas de fagotipia. Consiste en ensayos donde se determina a qué fago es sensible una determinada bacteria. Se emplea básicamente para la identificación porque los fagos suelen infectar a miembros de una determinada especie o cepa (existe alta especificidad). Es una placa se siembra uniformemente una bacteria. En una cuadrícula se pone, en cada cuadro, un fago determinado. Se observan calvas o halos de lisis.

TAXONOMÍA MOLECULAR Y GENÉTICA Pruebas que permiten la clasificación y/o identificación. Estas pruebas son: a)

Secuenciación de aminoácidos:

Es importante porque da mucha información. La secuencia de aminoácidos de una proteína determinada es un reflejo de la secuencia de bases del gen que la codifica. Cuanto más separados evolutivamente estén 2 organismos, más posibilidades de mutaciones hay en el DNA, y por tanto, más posibilidades de que haya diferencias. Se pueden comparar secuencias de aminoácidos de 2 organismos distintos para comparar semejanzas filogenéticas. Sólo se puede utilizar en grupos de organismos que comparten una proteína en común. Ejemplo: comparación de secuencias del citocromo c. b)

Análisis de proteínas:

Se comparan los patrones de todas las proteínas existentes en las células de 2 organismos distintos. Se obtiene mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (PAGE). Todas las proteínas se disuelven en un determinado detergente, se ponen en el gel, se aplica una corriente eléctrica. Las proteínas van a ir migrando según el tamaño y carga. Se tiñe el gel y se comparan. Sirve para la clasificación. También sirve para identificar, siempre y cuando se disponga de bases de datos de referencia para compararlos.

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También tiene sus dificultades, ya que a veces las proteínas no se separan bien unas de otras por tener la misma carga o tamaño. En este caso se realiza una electroforesis bidimensional, donde el gel se somete a 2 electroforesis perpendiculares: una las separa por cargas y la otra por tamaño. Primero se coloca la muestra con un tampón de PH especial que establece un gradiente de PH y las proteínas migran en ese gel según su punto isoeléctrico. Colocamos ese gel sobre otro mayor y sometemos a electroforesis perpendicular a la primera, que va a separar por tamaños. Hay que anular las diferencias de cargas mediante detergentes. c)

Determinación de la composición de bases de los ácidos nucleicos:

Se puede realizar mediante: - Hidrolizando DNA y analizando las bases mediante HPLC (High Perfomance Liquid Cromatography) o “cromatografía líquida de alta resolución”. - Calculando el porcentaje G+C. Se puede realizar mediante un gradiente diferencial de ClCs. La densidad del DNA aumenta de forma lineal con el contenido en G+C. En el DNA hay 2 cadenas: el DNA con aumento del porcentaje G+C tiene más puentes de hidrógeno que uno con el porcentaje más bajo. Las cadenas con mayor porcentaje tendrán también una mayor temperatura de fusión. La fusión de DNA se puede seguir por espectrofotometría. La absorbancia aumenta a medida que se van separando las cadenas. Comparando el porcentaje G+C se pueden sugerir diferencias evolutivas entre especies. El porcentaje es muy variable, sobre todo en procariotas. Los fenotipos similares con un porcentaje G+C parecido indican parentesco. Pero puede ser que organismos con porcentaje similar tengan secuencias de DNA muy diferentes: se necesitan datos complementarios. El porcentaje G+C permite confirmar datos de otras pruebas: si se determina por criterios fenotípicos que 2 organismos están relacionados pero el porcentaje G+C es muy diferente, entonces es que no se parecen tanto. d)

Secuenciación del RNA ribosomal 16S:

Se pueden comparar los patrones de restricción utilizando una enzima o enzimas de restricción. Los fragmentos de restricción obtenidos se someten a electroforesis, obteniendo patrones de restricción, y los comparamos. Podemos tratar de determinar la secuencia de bases de un gen concreto mediante el uso de distintas enzimas de restricción, lo que proporciona mucha información para la clasificación. Primero hay que seleccionar el gen a comparar. Se ha utilizado mucho el gen del RNA ribosómico 16S. para que un gen pueda ser usado como “cronómetro” debe: - Estar distribuido universalmente. - Realizar una función homóloga. El gen del RNA ribosomal 16S está distribuido por todos los organismos y su estructura está sometida a unos requerimientos muy precisos: requiere una estructura secundaria determinada para funcionar, y cualquier modificación la hace no funcional. Esto permite comparar organismos muy separados en la evolución, porque este gen cambia un poco. 30S

16S

RNAr 70S

≈ 1500 nucleótidos 5S

≈ 120 nucleótidos

50S

85

23S

≈ 2900 nucleótidos

Las subunidades 16S y 23S contienen varias regiones que están muy bien conservadas. Esto es útil porque permite hacer un alineamiento de secuencias, pero al mismo tiempo tiene la suficiente variabilidad de bases en el resto de regiones para establecer diferencias. La subunidad 5S también se utiliza pero su bajo tamaño limita su funcionalidad. Se puede realizar de forma directa, utilizando la transcriptasa inversa, por el método de secuenciación de Sanger o por PCR. Transcritasa inversa Métodos

Forma directa

Sanger

PCR Una vez identificados, los comparamos. La subunidad 16S se puede emplear para clasificar pero también para identificar bacterias por la técnica del ribotipado. No implica la secuenciación, es rápida y específica. Requiere ser marcada la sonda del RNA ribosomal. El RNA se somete a enzimas de restricción y posteriormente se analiza con una sonda de RNA ribosomal. Se crea un modelo de restricción, que es único para cada organismo. El RNA ribosomal se amplifica con PCR, se trata con enzimas y se aplica una sonda para crear un modelo de restricción. El perfil o patrón de restricción generado se digitaliza y compara con otros de la base de datos. Sólo se hace cuando se sospecha qué microorganismo tenemos. e)

Fusión e hibridación de ácidos nucleicos:

Al calentar el DNA de 2 microorganismos, las 2 cadenas se van a separar en 2 cadenas simples. Si se dejan enfriar y se mezclan, si hay alguna similitud podrán hibridar. Se puede determinar el grado de semejanza de 2 microorganismos dependiendo del grado de hibridación. Si la hibridación es total, se trata del mismo microorganismo. A mayor grado de hibridación, mayor relación. También puede hacerse con el RNA de uno y el DNA de otro. Este tipo de pruebas permiten además la identificación rápida de algunas bacterias de las que se hayan desarrollado sondas (fragmentos de DNA específicos de un organismo) adecuadas. Primero, el DNA de una bacteria se fragmenta con enzimas de restricción. Se selecciona un trozo, se clona, se obtienen cientos de fragmentos, se marcan con isótopos radiactivos o con fluorescencia y ya tenemos hecha la sonda. Las bacterias se recolectan en un filtro donde se produce la liberación del DNA por lisis celular. Juntamos ambos y vemos si hay hibridación. f)

Recombinación genética:

Se puede hacer por: - Transformación - Conjugación - Transducción

86

Para identificar a Neisseria gonorrhoeae, tomamos su DNA de esta bacteria. Necesitamos un auxótrofo de Neisseria gonorrhoeae para prolina. Mezclamos el DNA del supuesto Neisseria gonorrhoeae y una suspensión celular de Neisseria gonorrhoeae pro- y las colocamos en medio mínimo.

TAXONOMÍA NUMÉRICA También llamada “Taxonomía andasoniana” por Michael Adanson (s. XVIII). Creía que si se observaban los organismos y se les numeraban los caracteres, dándoles a todos el mismo valor y sin importar su relevancia, se podría identificar a los microorganismos con exactitud. La finalidad es expresar en términos numéricos las semejanzas entre organismos, en función de los caracteres compartidos en relación con los caracteres estudiados. - COEFICIENTE DE SEMEJANZA, Sj, COEFICIENTE DE JACCARD – Nº de caracteres comunes + ambos (+,+) Sj (%) =

x 100 Nº de caracteres presentes al menos en uno de ellos (+,+), (+,-), (-,+)

Se realizan pruebas en parejas. El porcentaje queda reducido a un solo valor. El coeficiente de semejanza indica las coincidencias positivas, mientras que el coeficiente de coincidencia indica las coincidencias tanto positivas como negativas. - COEFICIENTE DE COINCIDENCIA, Ss, Ssm, COEFICIENTE DE EMPAREJAMIENTO SIMPLE – Nº de caracteres comunes (+,+) + (-,-)

87

Ss (%) =

x 100 Todos los caracteres examinados (+,+), (+,-), (-,+), (-,-)

Si se compara un número grande de organismos, hay que hacerlo por parejas, lo que es un trabajo costoso y largo. Ahora se emplean ordenadores, que permiten crear agrupamientos y dendogramas para representar las relaciones de estos organismos de forma gráfica. En la gráfica: - Nivel de relación de especies: a partir del 80-82% de semejanza, se trata de la misma especie. - Nivel de relación de género: a partir del 55%. Se establece un coeficiente para determinar si 2 organismos son la misma especie o género. Cada autor usa un porcentaje diferente. TEMA 15 : ESPIROQUETAS Y OTRAS BACTERIAS HELICOIDALES Y CURVADAS BERGEY. VOLUMEN I. SECCIÓN 1: Comprende bacterias Gram- quimioheterotrofas y móviles (flagelo). ESPIROQUETAS -

Constituyen el orden Spirochaetales. Se dividen por fisión binaria. Son aerobias, anaerobias o microaerófilas. Hábitat variable: acuático, terrestre, materia orgánica en descomposición, parásitos animales.

- MORFOLOGÍA – Son helicoidales. La espiral puede ser más o menos laxa y son bastante largos. Presentan un cuerpo o protoplasma cilíndrico, que está rodeado de peptidoglicano y es rígido y helicoidal. Por fuera se encuentra la vaina externa como envoltura o membrana externa. Tiene 3 capas y es bastante flexible. Son bacterias muy móviles por la presencia de 2 filamentos axiales formados por fibrillas axiales o flagelos periplásmicos o endoflagelos, en número variable, de 2 a 1 vuelta

vibriales helicoidales

- Movimiento: flagelos polares generalmente en penachos (lofotricas en muchos casos) en ambos poros celulares. - Tienden a ser microaerófilos. GÉNEROS: •

SPIRILLUM:

- Spririllum volutans: bacteria helicoidal, 1,6-60 μm de largo, microaerófila, flagelos lofotricos normalmente en ambos extremos celulares. “Volutans” hace referencia a que poseen gránulos de polifosfato o de volutina. • AQUASPIRILLUM: - Alrededor de 20 especies - Aerófilas y microaerófilas - Hábitat: aguas continentales. - Aquaspirillum magnetotacticum: tiene de 5-40 partículas de magnetita que forman una cadena dentro de la bacteria, y le sirven para alinearse según las líneas geomagnéticas N-S.

90

• OCEANOSPIRILLUM: - Aerobia marina - Hay 10 especies • AZOSPIRILLUM: - Género terrestre - “azo” significa “azote”, que en francés se traduce como “nitrógeno”. - Azospirillum lipofirum: fijadora de nitrógeno. Establece una relación simbiótica con las raíces de muchas plantas (gramíneas, tropicales… pero nunca leguminosas). Es una bacteria bastante estudiada porque se inocula en las plantas para favorecer el crecimiento. • CAMPYLOBACTER: - Microaerófilo pero tendiendo a la anaerobiosis. - Flagelación monotrica polar. - 2 especies conocidas: - Campylobacter fetus: provoca abortos en animales domésticos. - Campylobacter jejuni: produce enteritis transmitida por alimentos. - Se aislaron con más frecuencia que otros géneros causantes de trastornos gastrointestinales. • HELICOBACTER: - Microaerófilo - 1-6 flagelos en un solo polo - Helicobacter pilori: se asocia con úlceras pilóricas e incluso como causa de cáncer de estómago. Se transmite por agua y alimentos contaminados y en ocasiones ha causado brotes epidemiológicos. Coloniza la mucosa y provoca inflamación. • BDELLOVIBRIO: - Morfología vibrioide - Aerobia estricta - Forma de coma, 1,4 μm largo - Flagelo envainado (la vaina es una prolongación de la pared celular) - Son microorganismos presentes en agua, suelos,… - Atacan a otras bacterias (entéricas, fotosintéticas, Rhizobium, Azotobacter, Escherichia,… pero generalmente Gram-). Una misma especie de Bdellovibrio es capaz de utilizar a una gran variedad de Gram- como presas. - Bdellovibrio bacteriovorus: vida libre, luego resulta atraída por quimiotaxis por otra célula. Choca con ella y desplaza a la presa. Modifica la membrana externa de la presa por la acción de enzimas hidrolíticas, pierde el flagelo, atraviesa la pared celular, se acomoda en el periplasma y constituye una estructura como de esfera llamada Bdelloplasto (esta parte del ciclo dura 15-20 min). Inhibe la síntesis de RNA, DNA, proteínas… Rompe la membrana citoplasmática. Comienza la síntesis de su DNA, se alarga en el bdelloplasto y posteriormente se fragmentará (dura 40-60 minutos). El número de bdellovibrios varía dependiendo del tipo de presa. Esta fisión múltiple es bastante infrecuente en procariotas. Una vez fragmentadas, desarrollan el flagelo, provocan lisis bacteriana y se liberan. El ciclo entero puede durar 2-4 horas. No son parásitas sino depredadores de

91

bacterias (digieren el contenido celular). Junto con protozoos y bacteriófagos constituyen un modo de control del crecimiento bacteriano en medios naturales. Los bdellovibrios son fáciles de detectar y aislar: sobre un césped de presa, se inocula, se incuba y una vez desarrollado se inocula una suspensión de agua o suelo. Aparecen calvas o halos (distintas a los de los fagos) si hay bdellovibrios. Fagos: necesitan bacterias vivas en desarrollo Bdellovibrios: necesitan bacterias vivas con o sin crecimiento A través de las calvas aislamos bdellovibrios. También sufren ataques de fagos (bdellofagos) generalmente líticos y con DNA de una cadena. Hay más bacterias depredadoras, pero quizá el modo de ataque y desarrollo en el periplasma es único en bdellovibrios. Otras depredadoras como Vampirovibrio ataca a algas (Chlorela), y desde fuera “chupa” el contenido del alga, y no presenta flagelo envainado. - Bdellovibrio starrii. Comparten estilo de vida: movimiento rápido, gran velocidad (70-100 veces su longitud por segundo = 0,5 metros por hora). Es capaz de reproducirse en el interior de bacterias (en el periplasma) y las devora. Si no hay bacterias presa, hace otro ciclo vital totalmente diferente. BACTERIAS GRAM-, CURVADAS, INMÓVILES O RARAMENTE MÓVILES - Mayoritariamente son acuáticas y no patógenas. - Morfología rara (circular, forma de S, C, O…). FAMILIA SPIROCHAETASOMACEAE GÉNEROS: •

SPIROSOMA:

- Forma curvada o de anillo con curvatura completa - Quimioheterotrofas, aeróbica, acuática, ampliamente distribuida, inmóvil (aunque presentan vacuolas de gas para favorecer la flotación). •

MICROCYCLUS

92

TEMA 16: BACILOS Y COCOS GRAM NEGATIVOS AERÓBICOS.

−

Si son móviles es debido a la presencia de flagelos.

− Hábitat: industrial.

variado (suelo, agua, patógenos). Microorganismos de interés clínico, ambiental e

−

Bacterias en general quimioheterotrofas, excepto la familia Halobacteriaceae, que puede ser fotoheterótrofa en condiciones anaerobias.

−

Generalmente son aerobios estrictos, excepto ciertas especies, como Pseudomonas (denitrificantes) o Halobacteriaceae (que presentan metabolismo fotoheterótrofo en condiciones de anaerobiosis). −

Obtención de ATP por fosforilación oxidativa en la CTE.

−

No fermentan. Lo normal es que respiren, excepto el género Gluconobacter que sólo obtiene ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

93

− Rutas metabólicas especiales para oxidar compuestos atípicos. Todas ellas convergen en el ciclo de Krebs.

−

Habitualmente usan la ruta de Entner-Doudoroff (Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium). Gluconobacter usa la ruta de las pentosas-fosfato y no tiene ni ciclo de Krebs ni CTE.

FAMILIA PSEUDOMONADACEAE

GÉNEROS • −

PSEUDOMONAS

Bacilos con flagelación polar.

−

Producen pigmentos hidrosolubles que excretan al medio: P. aeruginosa y otras producen un pigmento verde-amarillento que produce fluorescencia bajo la radiación ultravioleta. − Hábitat variado: desde el suelo a otros ambientes naturales.

−

En condiciones apropiadas, en hospedadores debilitados con las defensas bajas, puede infectar heridas, quemaduras, tracto urinario,… produciendo incluso meningitis.

−

Generalmente son parásitos oportunistas.

−

Muchas especies son psicrófilas y proporcionan sabores, colores y olores a ciertos alimentos refrigerados en mal estado.

−

Utilizan como fuente de carbono pesticidas, tolueno, alcanfor y derivados del petróleo, gracias a que presentan enzimas que degradan esos componentes poco corrientes. Esto causa problemas en hospitales o lugares donde se producen medicamentos, porque crecen en adhesivos, jabones o compuestos con carbonos cuaternarios usados en antisépticos.

−

Muchos de los microorganismos de este género son resistentes a la mayoría de antibióticos de uso común, aunque hay antibióticos a los que son sensibles. Esta resistencia está relacionada con el tamaño pequeño de las porinas de su pared celular y a genes que confieren resistencia debido a plásmidos R.

−

Suelen producir bacteriocinas, proteínas de elevado peso molecular que afectan a especies cercanas a las que las producen, llamadas piscinas, que están codificadas por plásmidos bacteriocinogénicos.

−

Generalmente aerobias, aunque pueden sustituir el oxígeno por nitratos como aceptor final de la CTE. Aunque algunos utilizan el nitrógeno como aceptor final de electrones (P. denitrificans), estos microorganismos son los responsables de la pérdida de nitrógeno útil. •

ZOOGLEA

94

−

Morfología bacilar y flagelación polar.

−

Es importante para el tratamiento aerobio de aguas residuales porque oxida grandes cantidades de materia orgánica del efluente (líquido del tratamiento secundario) hasta CO2 y agua.

•

XANTHOMONAS −

Importancia comercial: incluye especies que se cultivan porque su cápsula contiene goma xantano, que se usa como espesante para alimentos y pinturas. -X. campestris.

FAMILIA AZOTOBACTERACEAE

GÉNEROS •

AZOTOBACTER

−

Bacterias bacilares, grandes, casi ovales y con un tamaño parecido a las levaduras.

−

No están aislados, sino que van en parejas o cadenas.

−

Es bastante frecuente el pleomorfismo y la flagelación peritrica. Pueden ser móviles por este tipo de flagelación o inmóviles.

−

Fijadores de nitrógeno libre en el suelo. No excluye que puedan crecer en sustratos con nitrógeno, urea, amoníaco… aunque este último reprime la fijación.

−

Presenta la tasa respiratoria más alta de todos los microorganismos, debido a la protección de la nitrogenasa con respecto al oxígeno. Se mantiene la concentración de oxígeno muy baja (respiran rápido) para que no entre en contacto la nitrogenasa con el oxígeno y así evitar su inactivación.

−

Forma cistes: formas de resistencia con respiración casi inapreciable, resistentes a la radiación ultravioleta, radiaciones ionizantes, desecación, desintegración mecánica y calor (aunque no resisten tanto a este último como las endosporas). No están totalmente latentes, porque ante la presencia de fuentes de energía exógenas, éstas son rápidamente oxidadas. •

AZOMONAS

−

No forma cistes.

−

Generalmente acuático y siempre móvil por flagelación peritrica.

95

FAMILIA RHIZOBIACEAE - FIJACIÓN DE NITRÓGENO Presentan un sistema Nitrogenasa, que presenta 2 componentes: una proteína FeS y una MoFe. Este sistema es sensible al oxígeno y tiene que protegerse, por lo que no se libera al citosol. Estos organismos crecen en simbiosis en el interior de las células del nódulo de la raíz de las legumbres como bacteroides fijadores de nitrógeno, y son totalmente dependientes de la planta para fijar el nitrógeno, ya que la planta regula la concentración de oxígeno y a la vez suministra nutrientes como fumarato, succinato, malato,… que son donadores de electrones indispensables para obtener el ATP, necesario para fijar el nitrógeno. La bacteria, a su vez, le suministra a la planta el nitrógeno asimilado. La bacteria convierte el nitrógeno atmosférico en amoníaco, que es el primer producto estable y que puede ser utilizado por la planta en forma de glutamina, por la acción de la glutamina-sintasa. Además de glutamina, se sintetizan otros aminoácidos, amidas y ureidos (alantoina y ácido alantoico). Los genes Nor en bacterias no se encuentran en el cromosoma sino en los plásmidos Sym. A veces también se encuentran situados en los genes Nif, responsables del proceso de fijación de nitrógeno. Estos plásmidos Sym contienen los genes responsables de la especificidad de una cepa bacteriana respecto a una especie vegetal. La especificidad no se refiere exactamente a una cepa con una planta, pero podemos hablar de una elevada especificidad debido principalmente a los factores Nor. Los Nor tienen una estructura formada por unidades de NAG repetidas n veces con radicales diferentes (R1 y R2) que son los que confieren la especificidad.

−

Se pueden establecer grupos de inoculación cruzada: son grupos de cepas que pueden infectar a determinadas especies de leguminosas. Esta capacidad se puede transferir entre cepas. GÉNEROS •

AGROBACTERIUM

Bacilos con flagelación peritrica y que son citopatógenos de dicotiledóneas.

− Hay 4 especies: -

Agrobacterium rhizogenes: da lugar a “raíces pilosas”, que son masas tumorales o malignas en las raíces, debido a la presencia en la bacteria del plásmido Ri. Agrobacterium radiobacter: avirulenta. Agrobacterium rubi Agrobacterium tumefaciens: va a dar lugar a tumores en forma de agallas llamados “agallas de corona”, producidos en bacterias que presentan el plásmido Ti. El microorganismo transfiere el plásmido Ti (Tumor Induction), el cual contiene información genética de la bacteria, al material genético de la planta, específicamente a un cromosoma determinado. Una vez inducida la condición tumoral, la presencia de esta bacteria es innecesaria.

96

El proceso se desarrolla en una serie de etapas:

1)

Etapa de infección: reconocimiento y adherencia.

Las células de A. tumefaciens se adhieren a las heridas de las plantas, ya que estas heridas producen la liberación de compuestos fenólicos que las bacterias reconocen y que a la vez permiten la adherencia de ésta a la planta. El receptor de la planta es del tipo pectinas, y en la bacteria es un tipo de polisacárido que contiene β-glucanos y que forma parte del LPS de la pared celular. Tras ese reconocimiento, la bacteria sintetiza microfibrillas de celulosa para ayudarse a anclarse a la planta, formando unos grandes agregados bacterianos en la pared celular que facilitan la colonización.

2)

Etapa de procesado del fragmento de T-DNA del plásmido Ti.

El plásmido Ti es bastante grande (≈200Kb), mientras que la región T-DNA comprende unas 10Kb. El fragmento de T-DNA es el que se transfiere al cromosoma vegetal. Dentro de esta región encontramos: - ONC (oncogenes): codifican enzimas que intervienen en la producción citohormonas, que estimulan la división celular y forman el tumor. • OPS (opinas): son genes que llevan la información genética para sintetizar actúan de fuente nutritiva para las bacterias invasoras.

de opinas,

que

El plásmido Ti contiene: - Región VIR (“virulencia”): son genes que se inducen por moléculas señal de la planta. - Genes de transferencia (que codifican el puente conjugativo). - Genes responsables de la degradación de opinas, para su posterior uso por la bacteria. - Genes del sistema de doble componente.

3)

Sistema regulador de doble componente.

Ciertos genes del plásmido Ti controlan la formación del tumor mediante un sistema regulador de doble componente, que estimula la formación de un puente conjugativo y la escisión del T-DNA. El TDNA se moviliza gracias a los genes de transferencia, que permiten la integración del T-DNA en el núcleo de la planta. - VirA: quinasa que actúa a manera de sensor. Las sustancias fenólicas estimulan su producción. Fosforila otro producto del gen VirG usando ATP. - VirD: endonucleasa que corta en una zona justo al lado de lo que se va a transferir (T-DNA). - VirE: proteína de unión que se une a un lado de la cadena. Una vez cortado el T-DNA se une al fragmento y lo transporta a la célula vegetal. - VirB: forma el puente entre la bacteria y la célula vegetal para que se integre el T-DNA.

4)

Integración de T-DNA en el genoma.

97

5)

Génesis de tumores y producción de opinas.

El T-DNA codifica hormonas para la planta que inducen la división de las células de la misma, produciendo un tumor. Tanto la bacteria como todos los procesos que lleva a cabo, han sido muy estudiados por su capacidad como vector en biotecnología de plantas. Así se han creado plantas transgénicas resistentes a determinados herbicidas.

FAMILIA METHYLOCOCCACEAE

−

Son microorganismos metófilos (obtienen carbono y poder reductor de compuestos con un solo carbono). Sin embargo pueden utilizar compuestos de 2 o más carbonos siempre que los carbonos no estén directamente unidos.

− Metanotrofos: la familia Methylococcaceae forma parte de este grupo. C1 + CH4 (utilizan compuestos de 1 carbono, y entre ellos el CH4). Son de 2 clases:

− Estrictos. − Facultativos: además de C1 y CH4 utilizan otros compuestos, como la glucosa. − Metilotrofos: utilizan compuestos C1 pero no CH4. − Estrictos: Methylophilus (único hasta ahora descrito). − Facultativos: grupo que abarca a muchos microorganismos, como Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus, bacterias nitrificantes,…

El compuesto más abundante en la naturaleza de todos éstos es el CH4. Puede proceder de depósitos de carbono, petróleo o producido en grandes cantidades por arqueas metanogénicas que viven en condiciones anóxicas. El metanol también es abundante y puede proceder de rotura de pectinas, proteínas muy abundantes en las paredes vegetales. Las metilaminas aparecen en tejidos animales y vegetales. La familia Methylococcaceae utiliza metanol y formaldehido. •

Bacterias metanotrofas:

− Aeróbicas: viven en condiciones óxicas adyacentes a ambientes anóxicos donde se genera carbono. Algunas cepas son microaerófilas y pueden fijar N.

− Cat+ / Ox+

− Ciclo de Krebs: algunas lo tienen completo y otras incompleto.

98

− Poseen una alta concentración de esteroles, que son raros en procariotas, y les suponen un compuesto esencial en el complejo de membrana.

− Catabolismo: oxidación del metano al CO2. SMMO (Metano-monooxigenasa soluble): es más rara. Requiere oxígeno y emplea NADH. No es común a todos los metanotrofos. PMMO (metano-monooxigenasa particulada): es más común y no utiliza NADH. MDH (metanol-Dhasa) FDH (fórmico-Dhasa) FADH (formaldehido-Dhasa)

−

No existe producción neta de NADH. Se genera por transporte inverso de electrones, por lo que hay un descenso de rendimiento en el crecimiento del microorganismo. Es bastante habitual entre los Quimiolitotrofos.

−

Oxidan el metano, etanol o formaldehido en la ruta. En compuestos de más de un carbono, siempre los productos finales son el formaldehido (que oxida al CO2) o el CH4. Los metanotrofos se subdividen en 2 grupos, según la asimilación del carbono:

1. Grupo 1: ruta de la ribulosa monofosfato. Comienza con la ribulosa-5P. Se fija formaldehido dando una molécula de 6 carbonos, la hexulosa6P, mediante la enzima hexulosa-6P-sintasa. La hexulosa-6P, por una isomerasa, se convierte en Frc-6P, que da 2 moléculas de GA3P, una de las cuales se escapa del ciclo y se utiliza como punto de partida de la biosíntesis de compuestos orgánicos. Estas enzimas son exclusivas de este grupo de organismos.

2. Grupo 2: ruta de la serina. Es una ruta compleja. Se asimila formaldehido y CO2 en proporciones 2:1. Los metilotrofos facultativos también pueden llevar a cabo la asimilación de formaldehido a través de esta ruta. Uno de los intermediarios es la serina. Partimos de glioxilato, y a él se incorpora el grupo amino en forma de amoniaco, convirtiéndose en glicina. Ésta se convertirá en serina, la cual es el punto donde se asimila el formaldehido. La serina se convierte en hidroxipiruvato liberando el grupo amino. Luego se reduce a glicerato, y por incorporación de ATP se convierte en 2-PGA, parte del cuál puede salir del ciclo y parte se convierte en PEP. El PEP se convierte en oxalacetato mediante la incorporación de CO2. El oxalacetato pasa a malato, a malil-6CoA, que se escinde en acetil-CoA y glioxilato. Parte del acetil-CoA puede también ser utilizado para la biosíntesis.

99

Los metanotrofos, cuando crecen en presencia de metano, presentan una serie de membranas complejas:

− −

Grupo 1: a manera de vesículas o discos de forma compacta. Grupo 2: en forma de laminillas periféricas.

La fijación del nitrógeno la realizan todos los metanotrofos del grupo 2, y sólo unos pocos del grupo 1. Ejemplos:

− −

Grupo 1: Methylococcus, Methylobacter, Methylomonas. Grupo 2: Methylocystis, Methylosinus, Methylobacterium.

−

Metanotrofos estrictos: Methylococcus, Methylomonas, Methylocystis, Methylosinus.

FAMILIA ACETOBACTERACEAE

− −

Bacterias del ácido acético: gran interés industrial. Efectúan una oxidación incompleta de azúcares y de alcoholes dando los correspondientes ácidos orgánicos. Cuando emplean etanol, van a producir acético. − Tolerancia elevada a las condiciones de acidez. Crecen a PH inferior a 5. − Géneros: − Acetobacter − Gluconobacter

−

Ambos son bacilos y pueden ser móviles o inmóviles; en el caso de ser móviles, Acetobacter tiene flagelación peritrica o ausente y Gluconobacter polar o ausente.

−

Capacidad oxidativa: ninguno sigue la ruta de Etner-Doudoroff, pero sí llevan a cabo la ruta de las pentosas-fosfato, aunque modificada. Gluconobacter llega a un punto en el que no puede seguir oxidando cuando llega a acetato. Sin embargo, Acetobacter sí que puede, y lo oxida hasta CO2 y H2O.

−

Carecen de PirDhasa, por lo que no pueden llevar a cabo el paso de Pir a Acetil-CoA.

∙ PP

Pir

Acetaldehído (+CO2) CTE

TCA

100

Acetato (Gluconobacter) Acetil-CoA

∙ Ruta no fosforilativa:

− −

Gluconato (a partir de Glc) Cetoácidos derivados del gluconato (a partir de Glc) Gluconobacter: suboxidante

Acetobacter: superoxidante

−

Estas bacterias son fáciles de aislar de zumos de frutas, sidra, vino… y se emplean en la fabricación del vinagre. Usan normalmente el etanol, y en presencia de oxígeno, lo convierten en vinagre. − Ese etanol puede proceder de una fermentación de azúcares previa realizada, por ejemplo, de levaduras. Ese etanol pasa a acetaldehído y de aquí a acetato. Los electrones van a parar a una CTE. − Este tipo de organismos son también problemáticos para la industria alimentaria, causando que ciertos alcoholes se acetifiquen (se agrian).

−

Son bacterias aeróbicas, por lo que esto sólo lo llevan a cabo en presencia de oxígeno.

−

Estos microorganismos también pueden efectuar una oxidación incompleta como es el caso de azúcares. Esta propiedad de suboxidación es aprovechada para la fabricación del ácido ascórbico (vit C). se forma a partir de sorbosa, que es difícil de sintetizar químicamente, pero que se obtiene fácilmente por métodos microbiológicos. La sorbosa se obtiene a partir de bacterias del ácido acético que oxidan el sorbitol a sorbosa. Es un proceso de bioconversión.

−

Otra propiedad importante de las bacterias del ácido acético es su capacidad de sintetizar celulosa, pero se trata de una celulosa pura, no mezclada con pectinas, hemicelulosa o lignina. En vez de depositarla en la pared celular, en el caso de estas bacterias, la celulosa se forma como una matriz externa de la pared celular. Se trata de una maraña de microfibrillas de celulosa. Esta celulosa se emplea como espesante.

−

Cuando crecen en un matraz o Erlen-Meyer sin agitación, se ve que originan una película de celulosa donde van a estar estas bacterias. Crecen donde hay oxígeno, es decir, en la superficie del líquido. FAMILIA LEGIONELLACEAE GÉNEROS • −

LEGIONELLA

Gran importancia clínica.

101

−

Puede vivir dentro de los fagocitos, que son células de defensa de los organismos. Legionella inhibe la fusión del fagosoma con el lisosoma para formar el fagolisosoma. −

Forma bacilar, a veces filamentosa.

−

Móviles por flagelación polar o subpolar, dependiendo de la especie.

−

Hay 6 especies, y todas están directa o indirectamente implicadas como causa de neumonía en el hombre.

•

Legionella pneumophila: Fue aislado siendo la causa de una neumonía que más tarde se denominó legionelosis. El nombre se debe a que en 1976 murieron por causa de legionelosis miembros de la legión americana. Tardaron en averiguar la causa de aquel brote de neumonía porque intentaban cultivar el agente en medios convencionales. Finalmente lo identificaron al darse cuenta de que no crece en medios de cultivo habituales y que tiene mala tinción. Se aislaron a partir de cobayas infectadas con tejido procedente de pacientes infectados. Ya existen medios especiales de crecimiento para este microorganismo. Es una enfermedad que se trata con antibióticos.

−

Hábitat: aguas naturales, pero normalmente en el interior de amebas, a las que emplea a modo de fagocitos naturales. Coloniza ambientes como tuberías de suministro de sistemas de refrigeración.

−

Legionella secuestra el fagosoma y lo dirige al RE, donde la bacteria prolifera, ya que es un orgánulo rico en nutrientes. FAMILIA NEISSERIACEAE GÉNEROS •

NEISSERIA

−

Son diplococos inmóviles que, en algunos casos, presentan cápsula polisacarídica, lo que les confiere virulencia. A menudo presentan fimbrias, que les ayudan a colonizar las membranas mucosas.

−

Aerobias estrictas y sólo crecen a temperatura corporal.

−

Existen algo más de 11 especies, no todas patógenas.

−

Son habitantes normales de la nasofaringe.

−

Las patógenas más importantes son:

− N. gonorrhoeae: causante de la gonorrea. − N. meningitidis: responsable de algunos casos de meningitis bacteriana.

•

MORAXELLA

102

−

Bacteria ovoidal, entre coco y bacilo. Puede formar cadenas cortas o parejas.

−

Inmóvil, algunas presentan cápsulas polisacarídicas y también pueden presentar fimbrias, pero en este caso no hace a ninguna especie especialmente virulenta.

−

Se les considera inmunodeprimidos.

patógenos

oportunistas

porque

aparecen

en

organismos

• M. lacunata: produce conjuntivitis.

ʘ

BRUCELLA

−

Cocobacilos inmóviles de gran interés clínico.

−

Pueden sobrevivir a la fagocitosis y permanecer latentes meses e incluso años dentro de los fagocitos.

−

Incluye 6 especies, parásitas obligadas de mamíferos. Todas causan la llamada “brucelosis”, “fiebre de Malta” o “fiebres ondulantes”. 4 de estas especies pueden causar enfermedades en el hombre:

ʘ

B. abortus: Provoca abortos en el ganado vacuno. Puede ser transmitida a través de la leche o derivados. Causa un tipo de enfermedad “benigna” en el hombre. Es la más común en EEUU.

ʘ

B. melitensis: Aparece en el reservorio de camellos, cabras… Es la más frecuente en el resto del mundo. Puede causar incapacidad y la muerte.

ʘ

B. suis: Afecta al ganado porcino. Se puede transmitir por contacto y también puede ser mortal.

ʘ

B. canis: Transmitida por el contacto con perros. Causa una enfermedad de tipo benigno en el hombre.

ʘ

BORDETELLA

−

También llamado “bacilo de Bordet y Gengon”.

−

Bacilo pequeño e inmóvil.

103

−

Las estirpes virulentas tienen cápsulas y las avirulentas no.

−

La especie más conocida es:

•

B. pertussis: Especie encapsulada que causa la tos ferina en el hombre. Provoca abscesos virulentos de tos que conllevan a una falta de oxígeno, produciendo inspiraciones jadeantes. No resiste la fagocitosis, aunque otras especies sí pueden.

ʘ

FRANCISELLA −

Bacilos pequeños e inmóviles, sin forma definida.

−

Es Gram – pero se tiñe mal con la safranina, lo que produce una tinción Gram débil.

−

Las estirpes virulentas presentan cápsula.

−

Es nutricionalmente exigente: requiere medios complejos.

−

Puede sobrevivir a la fagocitosis.

F. tularensis: Produce tularemia, zoonosis propia de roedores y lagomorfos. La sintomatología depende de la vía de adquisición (abrasiones en la piel, picaduras, ingestión, inhalación,…). Provoca la inflamación de los ganglios linfáticos, pus, neumonía, laringitis,… Resiste a bajas temperaturas, inferiores a 0ºC. se encuentra en el suelo, agua, plantas… Junto con Bacillus anthracis y Yersinia pestis constituyen el Grupo A (alto potencial de uso como arma biológica contra grandes cantidades de población)

TEMA 17: BACILOS GRAM NEGATIVOS ANAERÓBICOS FACULTATIVOS

Se agrupan en 3 familias: 1. Enterobacteriaceae 2. Vibrionaceae 3. Pasteurellaceae −

Grupo importante desde el punto de vista clínico.

−

Todas las familias son ɣ-proteobacterias, Cat+.

−

En condiciones anóxicas fermentan sólo carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y polialcoholes). Hay una excepción: Erwinia puede fermentar polisacáridos y otros compuestos más complejos, para lo que necesita sintetizar enzimas especiales, causa de que puedan dañar estructuras vegetales.

104

−

Requerimientos nutricionales mínimos: hay excepciones:

− Proteus, Shigella y Erwinia necesitan ácido fórmico. − Salmonella requiere triptófano (S. typhi). − Photobacterium requiere metionina. −

Acumulan glucógeno, excepto Photobacterium que acumula poli-β-hidroxibutirato.

−

El uso de determinados disacáridos tiene características sistemáticas:

− Escherichia y Enterobacter: son lactosa +. − Salmonella, Shigella y Proteus: son lactosa -. −

Shigella presenta especies o cepas que contienen enzimas (β-galactosidasas) para la utilización de la lactosa, pero no las utilizan.

−

Glucolisis: realizan la ruta de Embden-Meyerhoff.

Presentan una peculiaridad bioquímica que no se da en otras fermentaciones bacterianas, y es que el Pir se escinde de tal manera que da acetil-CoA y ácido fórmico. El fórmico es un producto final mayoritario, pero no siempre se acumula porque algunas bacterias poseen un sistema enzimático hidrogenoliasa-fórmico que transforma el fórmico en CO2 y H2, que se produce en cantidades equimoleculares, pero el H2 es insoluble en agua y el CO2 es soluble en forma de carbonatos o bicarbonatos. La campana de Durham es un tubo de vidrio donde se introduce gas, y al cabo del tiempo vemos acumulación de gas en su interior. El hecho de que se produzca H2 no es exclusivo, ya que también se produce en bacterias endosporuladas como Clostridium o Bacillus, pero no se produce de igual manera: los endosporulados no producen fórmico directamente, sino que producen acetil-CoA, CO2 y H2.

Realizan distintos tipos de fermentación: 1)

Fermentación ácido-mixta

Da como productos el etanol y 4 ácidos: láctico, fórmico, acético y succínico. Se producen más productos ácidos que neutros (4:1). Se produce CO2 y H2 en cantidades equimoleculares (1:1) a partir del ácido fórmico. La producción de gas no es algo exclusivo. La realizan: Escherichia, Proteus, Salmonella (mayoría de especies), Shigella, Yersinia, Vibrio (mayoría de especies)… Se detecta por la prueba de Rojo de Metilo. 2)

Fermentación butanodiólica

105

Da como producto final el 2,3-butanodiol principalmente. No produce tantos ácidos como la fermentación ácido-mixta. Siempre se produce CO2 pero no siempre H2, por lo que la concentración de CO2 siempre será mayor. La realizan: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Aeromonas, Photobacterium,… La acetoína es un intermediario de la fermentación butanodiólica que se detecta por la prueba de VogesProskauer.

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

−

Familia de enterobacterias.

−

Pueden ser móviles (siempre por flagelación peritrica) o inmóviles.

−

Presentan fimbrias, que pueden ser del tipo I (les permite unirse a superficies mucosas) o del tipo II (pilis sexuales, capaces de transmitir información genética; muchas veces supone la transferencia de resistencia a antibióticos).

−

Producen bacteriocinas, que permiten mantener el equilibrio ecológico entre las bacterias del intestino. Afectan a otras especies o géneros próximos.

−

Pruebas bioquímicas de aislamiento e identificación: − Medio McConkey − Pruebas IMVic − Pruebas API Son importantes para determinar contaminación alimenticia (Salmonella) o para detectar una posible contaminación de origen fecal del agua (por colorimetría).

− Prueba de la oxidasa: carácter sistemático. Diferencia familias: − Enterobacteriaceae: oxidasa + (presentan citocromo c) − Vibrionaceae: oxidasa – (no presentan citocromo c) − Pruebas serológicas: para la identificación de antígenos de la superficie. − Hábitat: en el tracto intestinal, sin causar daños. − Patógenas:

− − − −

Salmonella typhi: causa fiebres tifoideas. Shigella dysenteriae: causa disentería o shigellosis. Yersinia pestis: causa la peste bubónica. Erwinia: es citopatógena.

106

−

Patógenas oportunistas: causan enfermedades en individuos inmunodeprimidos.

− Proteus (algunas especies). − Enterobacter − Serratia

GÉNEROS

ʘ

ESCHERICHIA

−

Forma de cocobacilo.

−

Móvil (flagelación peritrica) o inmóvil.

−

Fermentación ácido-mixta: produce gas.

−

Indol +.

−

La especie más conocida es E. Coli: produce colicinas. Es muy común como comensal en el tracto intestinal de organismos homeotermos, donde produce vitamina K. − No es patógeno aunque puede causar infecciones en el tracto urinario, y ciertas cepas pueden producir diarreas.

−

Cepas: − − − − −

Enteropatógenas Enterohemorrágicas Enteroinvasivas Enterotoxígena Enteroagregante

ʘ E. Coli es un indicador de contaminación fecal. El problema es no es E. Coli, sino que con la contaminación fecal hay más organismos patógenos, e incluso virus.

ʘ

PROTEUS

−

Bacilos muy móviles por flagelos peritricos.

−

Fermentación ácido-mixta: producen gas.

−

Peculiaridad: se puede extender muy rápidamente por la superficie del agar, fenómeno conocido como “dispersión”. Esta dispersión se produce en olas dispersivas separadas por periodos de crecimiento, lo que crea sobre la placa patrones de crecimiento zonal o migración concéntrica.

107

− Hábitat: suelo, restos animales en descomposición, intestino de hombre y otros animales, estiércol, aguas contaminadas.

−

Patógeno oportunista: infecciones del tracto urinario y diarreas.

−

Invasor secundario de heridas, causando sobreinfección. • •

P. vulgaris P. mirabilis

ʘ

SALMONELLA

−

Bacilos normalmente móviles (flagelación peritrica).

−

A menudo presentan cápsula.

−

Realizan fermentación ácido-mixta; producen normalmente gas.

−

Son citrato +.

−

También producen sulfhídrico.

− Hábitat: tracto intestinal de hombre, ganado vacuno, animales de granja,… En condiciones insalubres contamina alimentos.

−

Son patógenos potenciales.

ʘ

S. typhi: provoca las fiebres tifoideas, y se adquiere por la ingestión de alimento o agua contaminados por heces de seres humanos o animales infectados. Existe una vacuna para individuos de alto riesgo.

−

La salmonelosis es una enfermedad gastrointestinal menos grave que la fiebre tifoidea.

−

Los miembros del género Salmonella no deberían considerarse de especies distintas: hay más de 2000 serotipos distintos, que a su vez se subdividen en biotipos. Por lo tanto, es más preciso hablar de serotipos que de especies.

−

La especificidad antígeno-anticuerpo es alta y en ellas participan los antígenos O (de la parte polisacarídica de la membrana externa), K (proteínas capsulares) y H (flagelares). Dependiendo de estos antígenos se establecen los distintos serotipos. Estos antígenos están disponibles comercialmente para determinar el serotipo de un individuo infectado.

108

ʘ

SHIGELLA

−

Bacilos inmóviles.

−

Realizan fermentación ácido-mixta; no producen gas.

−

4 especies.

ʘ S. dysenteriae: produce disentería bacilar. ʘ −

YERSINIA

Cocobacilo de pequeño tamaño.

−

La mayoría de especies no son móviles a temperatura corporal. Si la temperatura es menor de 30ºC, forman flagelos peritricos.

−

Realizan fermentación ácido-mixta: no producen gas.

•

Y. pestis: siempre es inmóvil. Es la causante de la peste bubónica (bubón = ganglios linfáticos inflamados). Se transmite a través de las pulgas de roedores.

ʘ

ENTEROBACTER

−

Bacilos cortos.

−

Móviles (flagelación peritrica).

−

Realizan fermentación butanodiólica; producen gas.

−

La mayoría de las especies licuan la gelatina.

−

Hábitats diversos: suelo, agua, superficies animales, interior animales…

ʘ ʘ

E. aerogenes: especie prototipo de este género. E. cloacae

Ambas producen infecciones del tracto urinario y respiratorio. Son patógenos oportunistas.

ʘ

KLEBSIELLA

109

−

Bacilos inmóviles.

−

Presentan cápsula.

−

Pueden estar aislados o formando parejas, cadenas cortas,…

−

Llevan a cabo fermentación butanodiólica con producción de gas.

−

Forman grandes colonias de consistencia mucosa en medios sólidos.

−

Tienen la propiedad única dentro del grupo de enterobacterias de fijar nitrógeno en condiciones anóxicas.

♦

K. pneumoniae: es el principal causante de la septicemia patógena en pediatría, enfermedad asociada a la presencia en la sangre de un microorganismo patógeno o toxinas. Puede causar neumonía. Afecta a individuos con alcoholismo crónico o enfermedades del tracto respiratorio.

ʘ

SERRATIA

−

Bacilos móviles con flagelación peritrica.

−

Forman colonias coloreadas (rojizas, rosadas,…)

−

Realizan fermentación butanodiólica; no producen gas.

−

No son patógenas aunque pueden aparecer en el intestino de insectos, vertebrados,… No muy ocasionalmente pueden encontrarse en el intestino humano.

−

Otras especies son patógenos oportunistas:

♦

S. marcescens: provoca infecciones urinarias o respiratorias. Se ha encontrado en catéteres, soluciones presumiblemente estériles. Producen prodigiosinas (pigmentos con estructura derivada del anillo pirrólico tripirrol lineal a los que se les debe sucesos calificados como milagros en la edad media). No hay pruebas de que este pigmento esté implicado en la transformación de energía, y su función es desconocida.

ʘ −

ERWINIA

Flagelación peritrica.

110

−

Fermentación butanodiólica; no producen gas.

−

Relacionados con plantas; la mayoría son responsables de la putrefacción de las plantas.

−

Muchos de ellos son fitopatógenos.

−

Otros son saprófitos (constituyentes de la biota epífica):

ʘ ʘ

E. anylovora: causa necrosis en el peral y otras plantas relacionadas.

E. carotovora: destruye los residuos de reserva de las plantas mediante enzimas peptidolíticos.

ʘ

E. herbicola: produce pigmentos amarillentos que aparecen en las hojas de plantas aparentemente sanas.

FAMILIA VIBRIONACEAE

−

Todos son móviles por flagelación monotrica o anfitrica.

−

La fermentación que llevan a cabo es variable, dependiendo de la especie e incluso de la cepa.

−

Todos son oxidasa +.

−

Viven en ambientes acuáticos (continentales o marinos).

−

Géneros: − Vibrio − Aeromonas − Photobacterium

GÉNEROS

ʘ

VIBRIO

−

Bacilos ligeramente curvados.

−

Fermentación ácido-mixta.

−

Flagelos polares envainados.

111

−

Algunas especies son bioluminiscentes (V. harveyi, V. fischeri)

−

Algunos son patógenos:

V. cholerae: causante del cólera. Produce una neuroaminidasa que rompe el epitelio cementante del tracto intestinal y una exotoxina (colerágeno), que es una exo- y enterotoxina. Es uno de los pocos Gram – productores de exotoxinas. Un individuo con cólera va perdiendo líquidos y electrolitos por una alteración de la permeabilidad de la pared intestinal, lo que provoca espasmos, diarrea, vómitos, fiebre, e incluso la muerte, por el aumento de la concentración de proteínas que hay en el organismo, debido a la deshidratación. V. parahaemolyticus: provoca gastroenteritis leves. Vive en aguas marinas costeras,… Afecta al hombre por ingestión de marisco crudo o poco cocido.

ʘ

AEROMONAS

−

Cocobacilos con flagelación polar.

−

Realizan fermentación ácido-mixta o butanodiólica, dependiendo de la cepa.

−

Viven en medios de agua dulce.

−

Existen 4 especies, 2 de las cuales son:

A. hydrophila: puede ser patógeno de ranas o del hombre. A. salmonicida: produce enfermedades en salmones y otros peces.

ʘ

PHOTOBACTERIUM

−

Bacilo móvil: de 1 a 3 flagelos no envainados.

−

Dependiendo de la cepa, realizan fermentación butanodiólica o ácido-mixta.

−

Hábitat marino.

−

3 especies, algún miembro de las cuales viven en simbiosis con peces y producen bioluminiscencia: − P. fosforeum − P. leiognathi − P. angustum FAMILIA PASTEURELLACEAE

112

−

Bacilos pequeños e inmóviles.

−

Fermentación ácido-mixta sin producción de gas.

−

Suelen ser oxidasa +.

−

Son patógenos de vertebrados.

−

2 géneros: − Pasteurella − Haemophilus

GÉNEROS

ʘ

PASTEURELLA

−

Da nombre a la familia.

−

Cepas pleomórficas, sin forma fija.

−

Son patógenos de animales domésticos (cólera aviar, neumonía), animales de corral, ganado vacuno,… P. multocida: tiene numerosos biotipos. Uno de los biotipos causa el cólera aviar.

ʘ

HAEMOPHILUS

−

Requerimiento de sangre en su medio de cultivo, ya que el grupo hemo de la sangre se presenta en partes importantes de la CTE.

−

Morfología diversa: bacilos filamentosos, forma bacilar,… pleomorfismo.

−

Parásitos obligados en las superficies mucosas.

−

Varias especies:

H. influenzae: se creyó en principio responsable de la gripe. Puede afectar a niños pequeños, provocando meningitis, artritis, endocarditis, pericarditis, neumonía,…

113

TEMA 18: BACILOS GRAM CURVADOS Y HELICOIDALES.

−

NEGATIVOS

ANAERÓBICOS

RECTOS,

Básicamente es la familia Bacteroidaceae.

FAMILIA BACTEROIDACEAE

−

Bacilos rectos, curvados o helicoidales.

−

Fermentadores.

ʘ

BACTEROIDES

−

Bacilos inmóviles, más o menos alargados.

GÉNEROS

−

Fermentadores: propiónico.

utilizan la ruta del succinato o propionato para dar al final ácido

− Hábitat: rumen de rumiantes y tracto intestinal del hombre, aunque también la cavidad oral, tracto respiratorio superior… Fuera de los animales, aparece en sedimentos.

−

Se han descrito enfermedades abdominales y pélvicas causadas por Bacteroides: a partir de una herida punzante o una intervención quirúrgica puede causar peritonitis.

ʘ

FUSOBACTERIUM

−

Bacilos muy alargados, estrechos y con extremos puntiagudos. Fermentador de aminoácidos o azúcares.

− −

Hábitat: tracto intestinal, rumen de rumiantes, boca (en las encías, causando abscesos dentales), tracto respiratorio.

114

−

Tienen como característica que presentan lantionina, que es un diaminoácido, en el peptidoglucano.

ʘ

BACTERIAS CON REDUCCIÓN DESASIMILATORIA DE SULFATOS O DE AZUFRE

−

Utilizan sulfatos o azufre como aceptores finales de electrones en la CTE para obtener energía.

−

Realizan respiración anaeróbica.

−

Hay una bacteria que lleva a cabo esta reducción desasimilatoria de sulfatos pero que no pertenece a este grupo: Desulfotomaculum.

−

Son Gram -, quimioheterotrofas, anaerobias estrictas.

−

Utilizan compuestos orgánicos como donadores de electrones.

−

Utilizan formas oxidadas del azufre como aceptores finales de electrones para formar sulfhídricos o sulfuros. SO4-2

S-2 (H2O)

S

0

−

Producen al año del orden de un millón de toneladas de H2S, causante del color negro de fangos por la producción de sulfuros metálicos.

−

Son bacterias sulfatoreductoras de gran importancia ecológica.

−

Son miembros terminales de la cadena alimentaria anaeróbica.

− Viven en el tracto intestinal de animales y del hombre, en el rumen de rumiantes, sedimentos anóxicos con alto contenido en materia orgánica (fondos de pantanos, fondos de lagos, suelos de plataformas oceánicas,…).

−

La acumulación de sulfuros provoca la formación de una capa de bacterias verdes y rojas del azufre, que utilizan ese H2S, siempre a una cierta profundidad donde les llegue la luz. Realizan el ciclo anaeróbico del S.

−

Hábitat: zonas costeras (zonas inhabilitadas por el olor y el efecto tóxico de los sulfuros). La producción de H2S en los suelos encharcados puede matar animales, plantas y otros organismos.

115

Los sulfuros pueden combinarse con el hierro de los citocromos u otros componentes celulares que contengan hierro y provocar daños. − Pueden provocar pérdidas económicas porque pueden acelerar la corrosión de tuberías con hierro, sistemas de calefacción,…

Existen 2 tipos, en base al metabolismo (utilización o no de acetato): 1.

Tipo I:

− Desulfovibrio: bacilo curvado, flagelación polar. − Desulfomonas: bacilo alargado e inmóvil que vive en el intestino de mamíferos. 2.

Tipo II:

− Desulfococcus: formas móviles e inmóviles. − Desulfobacter: bacilo algo curvado, que puede ser inmóvil o móvil por flagelación polar. − Desulfuromonas: bacilo con flagelación polar que reduce azufre. Cuando estas bacterias disponen de sulfato y de hidrógeno, algunas pueden crecer de forma similar a los Quimiolitotrofos pero siempre guardando las distancias, porque viven en ausencia de oxígeno. En estas condiciones, algunas especies pueden vivir autotróficamente usando el CO2 como única fuente de carbono mediante la vía del acetil-CoA, que puede funcionar en un sentido o en sentido inverso. Hay también bacterias sulfatoreductoras que crecen como mixotrofas. La mayoría son quimioorganoheterotrofas (utilizan como donadores de electrones y fuente de carbono los productos de la fermentación de otras bacterias como lactato, malato…). No son fermentadores. Estos donadores se transformarán en piruvato, que se oxida hasta acetato. En función de utilizar o no el acetato:

−

Tipo I: no pueden oxidar el acetato y lo excretan como producto final. Será utilizado por bacterias del mismo ambiente, que lo oxidarán a CO2, el cual será utilizado por otras bacterias para formar metano. − Tipo II: son capaces de crecer sobre acetato y lo oxidan hasta CO2. La mayoría son marinas. Normalmente el CTA es el principal medio de oxidación del acetato en los microorganismos, pero no en éstos. En estas bacterias, este CTA no funciona como tal oxidando el acetato. Se conocen 2 vías para oxidarlo:

a)

Vía del acetil-CoA o de Ljunddahl- Wood: es el utilizado por la mayoría. Emplea como enzima clave la CO-Dhasa. Sobre ella reaccionan el H y el CO2. El grupo CH3 se incorpora a esta enzima y se forma acetil-CoA que pasa a acetato.

b)

Ciclo del ácido cítrico modificado (CAC): se utilizan la mayor parte de enzimas del CTA pero tienen una enzima que permite la reacción del acetato con el succinil-CoA para dar acetilCoA y succinato. La citrato-liasa permite la síntesis de ATP por fosforilación a nivel de sustrato acoplando el acetil-CoA al citrato. E

116

Este ATP adicional hace posible el crecimiento de estas bacterias en hábitats con el acetato como única fuente de carbono. - BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS -

Forman sulfuros. La oxidación de sulfato requiere 8 electrones y se realiza en distintas etapas. 1.

Reducción desasimilatoria del sulfato:

El ión sulfato (SO4-2) es estable y debe ser activado con ATP antes de ser reducido. El enzima que permite este paso es la ATP-sulfurilasa (APS). Se forma adenosina-fosfosulfato, que se reduce a sulfito con liberación de ADP. 2.

Se añade otro sulfato al APS y se forma fosfoadenosinafosfosulfato (PAPS).

Hay organismos que son capaces de reducir el sulfito pero no son capaces de llevar a cabo la primera parte porque carecen del sistema APS, es decir, reducen el sulfito a sulfhídrico pero no el sulfato a sulfito.

SO

3 SO

-2 2

-2 3

S3O

2e-

2eS2O3-2

-2 6

2e-

S-2

(Sulfito) SO3-2

SO3-2

Los electrones llegan por una cadena de citocromos que realizan un transporte de citocromos, transportando los electrones desde la fuente de energía hasta el fósforo del APS y al sulfito. El transportador principal o uno de los principales es periplasmático y muy electronegativo. Es el Citc3, que es especial de estas bacterias. el Citc3 acepta electrones de una hidrogenasa periplasmática y los transfiere a un complejo proteico periplasmático pero asociado a la membrana llamado HmC. Los electrones son transportados a través de la membrana hasta una FeS citoplasmática que los conduce a la ATPasa y reductasas. Las bacterias del tipo I tienen, además, un Citb especial. En estas bacterias el ciclo del hidrógeno es importante porque el hidrógeno tiene una función clave en el metabolismo. Procede del medio o generado por los donadores orgánicos de electrones como el lactato. Pueden pasar 2 cosas:

1)

Si hay sulfato disponible, el hidrógeno es oxidado por una hidrogenasa relacionada con el Citc3, que transfiere electrones al interior y permite la reducción de los sulfatos. Cuando el hidrógeno se oxida, los protones se quedan fuera de la membrana, lo que crea una fuerza protomotriz que permite la síntesis de ATP. El resultado es conocido como “Ciclo del H”, y es especialmente importante en bacterias que no pueden utilizar el acetato.

117

2)

Si no hay sulfato disponible, el hidrógeno es transferido entre especies, de bacterias sulfatoreductoras a ser utilizado por bacterias metanogénicas. Las bacterias dependerán de una fosforilación a nivel de sustrato.

ʘ

COCOS GRAM NEGATIVOS ANAERÓBICOS

Están todos incluidos en una familia: Veillonellaceae.

FAMILIA VEILLONELLACEAE

−

Anaerobias estrictas.

−

Forma de coco (aislados, en parejas, cadenas, racimos…).

−

Inmóviles.

−

No forman endosporas.

GÉNEROS

ʘ

VEILLONELLA

−

Fermentan lactato, malato… ácidos orgánicos en general.

−

Uno de los productos mayoritarios es el propionato.

−

Son los anaerobios más abundantes en la boca y tracto intestinal de animales (hombre incluido).

V. parvula: predomina en la placa dental.

118

TEMA 19: RICKETTSIAS Y CHLAMYDIAS

Parásitos intracelulares. Se confundieron con virus, pero a diferencia de ellos: −

DNA y RNA.

−

Ribosomas.

−

Pared celular: Rickettsias con peptidoglucano; Chlamydias sin peptidoglucano.

−

Integridad celular que no pierden durante la multiplicación: se dividen por fisión binaria.

−

Sintetizan macromoléculas.

−

Son parásitos intracelulares obligados, a excepción del género Bartonella (anteriormente denominado Kochalimaea), que está de hecho fuera del orden Rickettsiales. −

Viven y se multiplican sólo dentro de organismos celulares. En ésto se asemejan a los virus.

−

Tanto por aspectos morfológicos como bioquímicos, se clasifican como bacterias.

−

Sólo pueden ser cultivados sobre tejidos vivos, excepto Bartonella.

−

Síntesis de ATP: Rickettsia puede sintetizarlo mientras que Chlamydia puede sintetizarlo potencialmente pero no lo hace. El ATP lo pueden tomar ambas del hospedador en una reacción de intercambio de ADP (que sale de la bacteria) por ATP (del hospedador).

ʘ

ORDEN RICKETTSIALES

Antes Bartonella se encontraba en este orden por criterios fenotípicos, pero tienen poca base filogenética, así que ahora se agrupa dentro de Rhizobiales, aunque los géneros Rickettsia, Coxiella y Bartonella se explican juntos.

−

Son patógenos de animales, incluido el hombre.

− −

Morfología variada: tamaño pequeño, bacilos, cocos, pleomorfos. 2 μm de longitud como máximo.

Rickettsia posee una membrana permeable especial, que hace que su desecación sea muy acusada y no puedan resistir las condiciones externas. Esto explica la necesidad del empleo de vectores para su propagación (el vector llega a la sangre del infectado, y luego se infecta con picaduras o heces a otro): pulgas, piojos, garrapatas,…

119

Coxiella puede ser transmitida por garrapatas, por alimentos o por el aire (aerosoles, estornudos), sin necesidad de un vector. Es resistente porque produce una forma similar a una endospora que explica su resistencia a ciertas temperaturas (por ejemplo, a la pasteurización rápida). La entrada de Rickettsia y Coxiella a células del hospedador es un proceso activo, ya que ambas partes deben estar vivas y activas. Penetran en la célula activadora por un proceso de fagocitosis inducida. Entran incluso en células que normalmente no son fagocíticas, como las células endoteliales del sistema muscular. Entran sin romper las membranas, formando una vacuola que se va a fundir en el citoplasma. Se divide por fisión binaria, sobre todo en el citoplasma, aunque algunas pueden pasar al núcleo y dividirse allí. Hay diferencias entre Rickettsia y Coxiella:

−

Rickettsia puede escapar del fagosoma degradando la membrana fagosómica por unas lipasas, a la vez que se está formando, por lo que no constituye una fase intermedia. − Coxiella permanece en el fagosoma, y posteriormente ese fagosoma se funde con el lisosoma, lo que es necesario para activar a Coxiella, y su metabolismo se hace más rápido. Al fusionarse ambos disminuye el PH, permitiéndole a Coxiella la transferencia de nutrientes al interior. La célula hospedadora puede reventar en el caso de Rickettsia, liberando a los individuos, o liberarse en vacuolas, produciendo una lisis focal. El hospedador, se lise o no, sufre daños derivados de la toxicidad de la pared de Rickettsia. Coxiella, en cualquiera de los casos, produce lisis. Las Rickettsias son respiratorias y prefieren oxidar compuestos intermediarios del CTA. La capacidad para respirar compuestos como el glutamato les proporciona la energía de mantenimiento y la de crecimiento. Por eso son parásitas. Tienen una capacidad biosintética limitada: la mayoría de los nutrientes los toman de la célula hospedadora, como el CoA. Tienen, además, un sistema de intercambio de adenilato: intercambian ADP endógeno por ATP exógeno: gran parte de la energía necesaria la toman del metabolismo y de la fosforilación oxidativa del hospedador. Al desarrollarse en el interior del hospedador, son resistentes a determinados antibióticos, aunque pueden tratarse con tetraciclinas y cloranfetamol. El género Rickettsia está dentro del orden Rickettsiales, que, a su vez, está dentro de las αproteobacterias. Bartonella está dentro del orden Rhizobiales, también α-proteobacterias. Dentro de las α-proteobacterias hay bastantes analogías: se estudia si Rickettsia se dio a partir de bacterias asociadas a plantas que evolucionaron para asociarse a animales. Coxiella es un miembro del orden Legionellaes. Pertenece al grupo de las ɣ-proteobacterias. la semejanza en forma de vida que presenta Coxiella con Rickettsia y Bartonella se debe más bien a convergencia evolutiva.

FAMILIA RICKETTSIA

−

No utiliza ácidos orgánicos, glucosa ni otros azúcares. Sólo respira ácido glutámico y glutamina, que introduce en el ciclo de Krebs, y el poder reductor generado pasa a la CTE para sintetizar ATP. Esto le proporciona energía de mantenimiento.

120

−

Produce distintos tipos de tifus:

R. rickettsii: provoca la “fiebre manchada de las montañas rocosas”. Se llama así en honor a Howard Taylor Ricketts (1871-1910), que estudió las características de esta enfermedad, y que a pesar de utilizar técnicas cuidadosas, murió de tifus. Crece en el citoplasma y también en el núcleo. La garrapata americana es el primer vector, y como segundo vector o reservorio está el conejo y similares. Puede pasar de generación a generación de garrapatas a través de sus huevos por transmisión transovárica. Es la única Rickettsia que hace esto. La “fiebre manchada de las montañas rocosas” se caracteriza por un inicio repentino de cefalea, escalofríos, aumento de fiebre, exantema cutáneo de color rojizo. Aparece en tobillos y muñecas normalmente, y se extiende al tronco. Si no tiene tratamiento, destruye los vasos sanguíneos de los órganos. R. prowazekii: provoca el “tifus epidémico o exantemático”, de distribución mundial. Lo estudió Stanislav von Prowazek (1875-1912), investigador checoslovaco que murió por este tifus. El vector es el piojo humano. Utiliza de reservorio las ardillas voladoras. Existe tratamiento (tetraciclinas,…) y vacunas para personas con riesgo. R. typhi (R. mooseri): agente etiológico del “tifus endémico o murino”. El nombre se le dio en honor al investigador que diferenció a R. mooseri de R. prowazekii, llamado Hermann Mooser (1892-1971). El vector es la pulga de rata, y el reservorio son los roedores. Puede permanecer indefinidamente en la rata, pero si la pulga contacta con el hombre, entonces la transmite. Es una enfermedad bastante extendida, aunque más bien focal (Etiopía, Malasia, CentroAmérica…). Cuando una pulga chupa la sangre de una persona, las heces contaminan la picadura, y si están atestadas de R. typhi entonces provocan infección. La tasa mortalidad es 5%).

−

Son saprófitos.

−

Hábitat: piel de mamíferos; hábitat secundario: suelo, agua, productos cárnicos,… M. luteus M. roseus

ʘ

STAPHYLOCOCCUS

−

Forman racimos o grupos irregulares.

−

Son inmóviles.

−

Anaerobios facultativos.

−

Realizan fermentación láctica en condiciones anóxicas.

−

Algunos de los miembros de este género pertenecen a la microbiota de la piel.

− −

Otros son patógenos potenciales, causantes de infecciones e intoxicaciones alimentarias. El ser coco y Gram + les confiere potencial patogenicidad porque les permite vivir en condiciones de baja humedad y alta concentración salina. Esto también le sucede a Micrococcus. − Pueden estar en las secreciones nasales, piel, alimentos con baja humedad y/o alta presión osmótica (condiciones que tienden a inhibir el crecimiento de la mayoría de los microorganismos), como la carne curada.

131

−

La capacidad para vivir en altas concentraciones salinas permite su fácil aislamiento: por ejemplo, en un medio rico con agar, concentración salina del 7% y condiciones óxicas, la mayoría de las colonias predominantes serán cocos Gram + . − Producen pigmentos, que actúan como fotoprotectores. S. epidermis: forma no patógena, no pigmentada, que vive en la piel y en la mucosa. S. aureus: forma patógena y pigmentada. Presenta pigmentos carotenoides, que le proporciona un color amarillo-dorado característico, y que parecen estar implicados, además de la fotoprotección, en la defensa frente a la fagocitosis: los fagocitos emplean formas tóxicas del oxígeno para destruir a las bacterias ingeridas, oxidando sus elementos celulares. Los carotenoides secuestran el oxígeno en su estado triplete. Está asociado a situaciones patógenas: infecciones cutáneas (acné, granos, forúnculos, impétigo). Gracias a este microorganismo, Fleming descubrió la penicilina. Es un patógeno nosocomial. Puede presentar resistencia múltiple a antibióticos, resistencia condicionada por plásmidos. Su patogenicidad está producida por exotoxinas:

−

Hemolisinas: rompen la membrana del glóbulo rojo, debilitando las defensas y facilitando la disponibilidad del hierro para los microorganismos. Normalmente son βhemolisinas.

−

Leucocidinas: destruyen a los leucocitos (incluidos los fagocitos), por lo que disminuyen la capacidad de resistencia de la célula hospedadora. La mayoría de los microorganismos que producen leucocidinas son piógenos, es decir, que producen pus (acúmulo de fagocitos muertos que se depositan cerca del foco de infección y que dan lugar a la aparición de forúnculos y abscesos).

−

Hialuronidasa: hidroliza el ácido hialurónico, que es un compuesto esencial intercelular que actúa como cemento. Abre caminos entre los tejidos.

−

Coagulasa: S. aureus es coagulasa+, por lo que coagula el fibrinógeno del plasma y lo transforma en fibrina, lo que lleva a la formación de coágulos alrededor de los microorganismos que actúan como barreras, haciéndolos más inaccesibles a las defensas de la célula hospedadora.

−

Fibrinolisina: produce la lisis de la fibrina. Se une al plasminógeno y activa la formación de plasmina, que disuelve la fibrina de los coágulos. Les permite salir de esa zona coagulada.

−

Toxinas exfoliantes: provocan la descamación de la piel, ocasionando el “síndrome de la piel escardada”.

−

Enzimas hidrolíticos: implicados en procesos de inflamación.

−

Enterotoxina: presente en algunos casos de intoxicaciones alimentarias.

−

TSST (Toxina Responsable del Shock Tóxico): es una infección grave relacionada con el uso de tampones vaginales.

132

Algunas de estas toxinas (hemolisinas, coagulasas, fibrinolisina, enterotoxinas,…) y carotenoides se transmiten mediante plásmidos. S. epidermidis y S. aureus se diferencian por la prueba de la coagulasa: S. epidermidis es coagulasa –, mientras que S. aureus es coagulasa +.

Las diferencias entre Micrococcus y Staphylococcus:

−

Staphylococcus produce exotoxinas que le otorgan la capacidad de ser patógeno del hombre y otros animales, pudiendo causar graves infecciones.

−

Mediante la prueba OF podemos distinguir microorganismos por su necesidad de oxígeno: Micrococcus sólo crece en el tubo O; Staphylococcus crece y produce ácidos en ambos tubos.

−

Micrococcus se compone de especies con un alto %G-C (66-73%), mientras que Staphylococcus presenta un menor %G-C (30-39%).

−

Micrococcus es Cat+, mientras que Staphylococcus es Cat-.

FAMILIA II: DEINOCOCCACEAE

GÉNERO

ʘ

DEINOCOCCUS

−

Cocos inmóviles, que forman parejas o tétradas.

−

Está, filogenéticamente, separado o único.

−

La pared celular presenta una estructura compleja de varias capas.

−

Presentan carotenoides de color rojo o rosa.

−

Siempre respiran; nunca fermentan.

−

Son Cat+.

−

Son muy resistentes a la desecación, mutágenos, radiación ultravioleta. D. radiodurans: es muy resistente a la radiación ultravioleta, desecación, mutágenos… ya que poseen un mecanismo de reparación del DNA muy potente.

133

OTROS GÉNEROS

1. 2. 3. 4.

Streptococcus. Leuconostoc. Rediococcus. Aerococcus.

−

Son anaerobios aerotolerantes: fermentan.

nunca respiran;

aún en presencia de oxígeno, siempre

−

Se pueden aislar adicionando azida sódica u otro veneno de la respiración en condiciones aeróbicas.

−

Streptococcus y Leuconostoc forman cadenas (se dividen en 1 plano); Aerococcus forman tétradas (se dividen en 2 planos).

Rediococcus y

−

Streptococcus y Rediococcus son homofermentadores; Leuconostoc y Aerococcus son heterofermentadores. Los heterofermentadores carecen de la aldolasa, que en la glucolisis:

Glc

Frc-1,6-bifosfato

Aldolasa

GA3P DHAP

Como no pueden realizar esta ruta, siguen la vía de la fosfocetolasa. Si somos capaces de detectar CO2, será un microorganismo heterofermentador. Si tenemos un cultivo de un microorganismo homo- y heterofermentador, los homofermentadores crecerán más, presentarán mayor biomasa. GÉNEROS

ʘ

STREPTOCOCCUS

−

5 grupos, dentro de los cuales se han establecido los “Grupos Inmunológicos de Lancefield”, en base a la presencia de carbohidratos antígeno específico. I.Grupo pyogenes:

− Especie principal: S. pyogenes. − Patógenos del hombre y otros animales.

134

− Presentan cápsula, lo que dificulta la fagocitosis. − Proteína M o antígeno M: son proyecciones pilosas de la pared celular que les proporciona

resistencia a la fagocitosis. La estructura antigénica de la Proteína M es similar a la de un antígeno presente en tejidos humanos, por lo que cuando un organismo tiene una infección con este microorganismo y produce anticuerpos, éstos puede reaccionar contra el propio organismo, ocasionando una reacción inflamatoria destructiva.

− Producen 2 β-hemolisinas: − −

ELO (estreptolisina O): se inactiva frente a oxígeno y rompe esteroles. ELS (estreptolisina S): es estable frente a oxígeno y rompe otros lípidos de membrana.

− También producen leucocidinas, hialuronidasas, fibrinolisina (llamada estreptoquinasa), y la toxina eritrogénica, responsable del cuadro clínico característico de la escarlatina.

− Son la causa del 50% de los casos de anginas. Es necesario el tratamiento terapéutico con

antibióticos, pudiendo provocar, si no se trata, enfermedades tardías como glomerulonefritis postestreptocócicas o fiebres reumáticas. Es una enfermedad provocada por la toxina que produce un fago atemperado. Se trata de una exotoxina muy potente que lesiona los capilares subcutáneos ocasionando vasodilatación y exantema. La glomerulonefritis aguda post-estreptocócica o de Bright es consecuencia de una hipersensibilidad del tipo III. Se debe al depósito en los glomérulos de concentraciones antígenoanticuerpo y acumulación de proteína M. Afecta a riñones, corazón, sangre y proteínas de la orina.

− Afectan al tracto respiratorio. − También pueden provocar infecciones sistémicas fulminantes caracterizadas porque afectan al tejido subcutáneo.

− Existen 2 tipos de “exotoxinas pirógenas estreptocócicas” (spe): a) Spe A: actúa como súper-antígeno, estimulando la producción de cantidades masivas de citocinas por los linfocitos. Dañan las células endoteliales de los vasos sanguíneos, lo que provoca una pérdida importante de líquido y la muerte de los tejidos por falta de oxígeno. b) Spe B: es una proteasa de cisteína que actúa hidrolizando proteínas. Provoca la muerte en el 30% de los casos. II.Grupo viridans:

− Especie principal: S. viridans. − Son estreptococos orales y α-hemolíticos. −Pertenecen a este grupo otros estreptococos como: S. mutans

135

S. salivarius

III.Grupo faecalis:

− Especie principal: S. faecalis (= Enterococcus faecalis). − Pueden ser α-hemolíticos, β-hemolíticos, ɣ-hemolíticos o no hemolíticos. − Son anaerobios aerotolerantes, pero pueden crecer a altas concentraciones de NaCl (hasta 6,5%). − En presencia de azida sódica no mueren, ya que respiran en estas condiciones, como un anaerobio facultativo.

− Hábitat: tracto intestinal y urinario. − Pueden ser utilizados como indicadores de contaminación fecal. Las pruebas se denominan “estreptometrías”. IV.Grupo lactis:

− Especie principal: S. lactis (= Lactococcus lactis). −No son ni hemolíticos ni patógenos.

− Hábitat: plantas y derivados lácteos. S. cremaris V.Grupo pneumoniae:

− Especie principal: S. pneumoniae (= Diplococcus pneumoniae). − Constituyen el género Diplococcus. − Se disponen en parejas y están encapsulados. − También se conocen como “neumococos”. − Son α-hemolíticos y producen una toxina llamada “toxina neumolisina”. − Pueden producir otitis, sinusitis, neumonía estreptocócica (enfermedad endógena producida a partir de la propia microbiota de las vías respiratorias) y meningitis bacteriana.

136

ʘ −

BACILOS Y COCOS GRAM POSITIVOS FORMADORES DE ENDOSPORAS

Pueden presentar un estado de vida latente o criptobiosis mediante la formación de esporas.

− Los grupos aquí englobados tienen en común el hábitat, pero guardan poca relación en otros aspectos.

−

Hábitat: suelo.

−

Los patógenos suelen producir exotoxinas que invaden el cuerpo, a excepción de Bacillus anthracis, que es un microorganismo inmóvil pero que invade masivamente el cuerpo del hospedador produciendo bacteremia (proceso por el cual las bacterias invaden el torrente sanguíneo). Incluso estas especies patógenas son organismos del suelo, saprófitos, pero que pueden infectar al hospedador por la producción de toxinas.

−

La esporulación va acompañada de la síntesis de sustancias antimicrobianas de bajo PM, y realmente se desconoce la función de estos antibióticos durante la esporulación.

AEROBIOS NO ESTRICTOS GÉNEROS

ʘ

SPOROLACTOBACILLUS

−

Similar a Lactobacillus, pero endosporulado.

−

Cat+.

−

Homofermentador: produce ácido láctico.

ʘ

SPOROSARCINA

−

Forma agrupaciones de cocos en paquetes cúbicos de 8.

−

Forman esporas.

−

Sólo hay 2 especies: S. ureal: similar metabólica y fisiológicamente a Bacillus pausterii.

137

ʘ

BACILLUS

−

Cat+ / Ox+.

−

Termófilos o mesófilos: los termófilos pueden crecer a 65ºC en su forma vegetativa.

−

Peptidoglicano: presencia o ausencia del puente interpeptídico. B. thermophilus B. stearothermophilus: pared oval y gruesa. B. acidocaldarius: termófilo y acidófilo. Forma oval y pared fina. I.Grupo I

−

Espora oval de pared delgada, de diámetro menor que el de la célula y posición central.

−

No tienen puentes interpeptídicos.

−

2 tipos:

1) No acumulan pβHB y la célula vegetativa tiene una anchura < 0,8μm: B. subtilis B. licheniformis: anaerobio facultativo. También produce glicerol. Es el único Bacillus que es desnitrificante y puede sustituir el oxígeno por nitrato en la respiración como aceptor final. Ambos son productores de antibióticos y también producen bacitracina.

2) Acumulan pβHB y la célula vegetativa tiene una anchura > 1μm. B. anthracis B. thuringiensis: produce una proteína o cuerpo paraesporal que es tóxica para insectos. Hay una relación entre la morfología y la actividad:

− − −

Forma bipiramidal: cepas activas frente a lepidópteros. Forma esférica: cepas que afectan a algunos mosquitos. Forma irregular: cepas no tóxicas.

138

En contacto con el contenido alcalino del digestivo del insecto, se fragmenta y se libera en forma de unidades de protoxina de unos 250KDa, que se van a convertir en la toxina activa de 68KDa por acción de una proteasa que produce rotura proteolítica. En su forma activa es capaz de unirse a células del intestino del insecto y forma unos poros hexagonales que producen la salida de ATP, entrada de agua y salida masiva de líquido a la hemolinfa del insecto. El insecto morirá por inanición. La enfermedad es esencialmente una infección por la toxina, que se hace activa dentro del insecto. Se denominan comercialmente “toxinas Bt”. Mediante ingeniería genética se han podido modificar regiones que dan resistencia al hospedador y se han podido introducir en plantas transgénicas. Se hacen preparaciones de esporas como insecticidas biológicos. Esta aplicación tiene gran interés para el control biológico de plagas. B. popillae B. megaterium B. cereus

II.Grupo II

−

Espora oval de perfil estrellado, diámetro mayor al de la célula y posición central o terminal.

−

No forman puentes interpeptídicos. B. macerans: espora en posición terminal. B. polymyxa: espora en posición terminal. Produce antibióticos.

Ambos son anaerobios facultativos con fermentación butanodiólica. Fijan nitrógeno en condiciones anóxicas.

III.Grupo III

−

Espora esférica en posición terminal.

−

El tercer aminoácido del peptidoglicano es una L-Lys y el peptidoglicano presenta puentes interpeptídicos.

−

Bacilos aerobios estrictos que respiran aminoácidos y ácidos orgánicos, pero no carbohidratos.

−

2 especies importantes: B. sphaericus

139

B. pasteurii: es ureolítico: hidroliza la urea gracias a la ureasa hasta amoniaco y CO2. Un medio que contenga urea y a este microorganismo va a convertirse en un medio muy alcalino, ya que se produce amoniaco. Es el microorganismo con la mayor capacidad ureolítica de todas las bacterias, lo que le condiciona una ventaja ecológica. ANAEROBIOS ESTRICTOS

−

Viven en ambientes anóxicos en su forma vegetativa, ya que en la forma de espora pueden estar en ambientes óxicos.

GÉNEROS

ʘ

DESULFOTOMACULUM

−

Muy parecido a Desulfovibrio.

−

Capaz de reducir sulfatos, pero no respira, sólo fermenta.

− Elimina el exceso de equivalentes de reducción de productos de fermentación mediante la reducción de sulfatos.

−

Genera ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

−

No es una bacteria sulfatoreductora porque no respira.

ʘ

CLOSTRIDIUM

− Bacilo anaerobio estricto. − Cat- / Ox-. −

Hábitat: suelo.

− Puede estar en estado vegetativo o de espora (ambientes anóxicos y óxicos). − Sólo fermenta, pero posee una muy variada capacidad fermentativa. Puede utilizar diversos sustratos. Atendiendo a esto, se establecen 5 grupos: 1.

Fermentadores de carbohidratos:

140

1.1.

Producen butirato: a) Fermentación aceto-butírica: Se basa en la conversión de azúcares (Glc) hasta Pir por la vía de Embden-Meyerhoff. Este Pir se oxida a acetil-CoA y CO2, y también se produce hidrógeno. El exceso de electrones se utiliza para producir compuestos más reducidos como butirato e hidrógeno. La producción de hidrógeno se realiza para mantener el equilibrio redox. Pir

H2O

2 e-

2 H+

Fd ox 2 e-

Hidrogenasa

H2

Fd red Además de producir butirato producen acetato, que permite la síntesis de ATP por fosforilación a nivel de sustrato. Es una ruta que puede ser cíclica. Parte del acetato reacciona con el butiril-CoA para dar acetil-CoA. C. lactoacetophilum b) Fermentación acetona-butanol: A veces se producen compuestos adicionales neutros, como la acetona y el butanol. Entonces se denomina fermentación acetona-butanol. Esta formación de compuestos adicionales neutros sucede como consecuencia de un descenso en el PH. Como productos iniciales tenemos butirato y acetato, pero cesa la acumulación de ácidos, y se acumulan estos productos neutros, que se producen por la reducción de butirato e hidrógeno formados en los últimos estadíos. Estos compuestos adicionales neutros se producen gracias al hidrógeno, que sirve para reducir el NAD a NADH. 2. Fermentadores de aminoácidos +/- proteínas: Llevan a cabo una putrefacción o descomposición microbiana de la materia orgánica que hace referencia fundamentalmente a proteínas. Es muy frecuente que la fermentación la hagan por pares de aminoácidos, denominándose entonces “reacción de Stickland”. Uno de los aminoácidos se oxida y el otro se reduce. Sólo los aminoácidos Trp y Tyr pueden realizar ambas funciones. Esta reacción permite que los aminoácidos puedan ser utilizados como fuente de energía. Un ejemplo es el caso de la fermentación acoplada de la Ala y Gly: estos aminoácidos no pueden ser fermentados individualmente por el resto de los Clostridium. Como consecuencia de esta reacción:

141

Ala + 2 Gly 3 NH3 + 3 CH3COOH + CO2 1 mol ATP / 3 mol aas catabolizados La Ala es desaminada oxidativamente hasta Pir, el cual se transforma finalmente en acetato. El NADH utilizado en la transferencia y reducción de la Gly hasta acetato procede de la oxidación de Ala. C. botulinum: lleva a cabo la reacción de Stickland. C. histolyticum C. tetani

Reacción de Stickland y, además, fermentan aas específicos individuales

3. Fermentadores de carbohidratos o aminoácidos: Fermentan aminoácidos en ausencia de carbohidratos. Convierten normalmente los carbohidratos en ácido butírico. Muchos que fermentan aminoácidos son proteolíticos, y producen una amplia gama de proteasas. La proteólisis es un paso preliminar para conseguir los aminoácidos a partir de las proteínas. No todos los Clostridium que fermentan aminoácidos son proteolíticos. 4. Fermentadores de compuestos con un anillo nitrogenado (bases púricas, pirimidínicas…). 5. Fermentadores de etanol a ácidos grasos: Producen butirato fermentado una mezcla de etanol y acetato. C. kluyveri: en presencia de acetato y etanol produce butirato y gas.

- CLOSTRIDIUM PATÓGENOS C. botulinum: causante del botulismo (intoxicación alimentaria grave). Produce la exotoxina botulínica. Se une a la sinapsis de neuronas motores, reduciendo la liberación de acetilcolina presináptica periférica. Puede causar la muerte por insuficiencia cardíaca o respiratoria. Produce la “parálisis flácida”, que evita que el músculo se contraiga. C. perfringens: causa la gangrena gaseosa en el 80% de los casos (el otro 20% lo producen otras especies de Clostridium). Es una enfermedad necrotizante de los músculos (mionecrosis) por una serie de enzimas que destruyen tejidos. Cuando las toxinas generadas por este tipo de microorganismos se ingieren, pueden causar también una intoxicación alimentaria, pero que es menos grave que la causada por C. botulinum.

142

C. tetani: causa el tétanos, por una neurotoxina denominada tetanopasmina, se trata de una endopeptidasa que escinde una proteína de la membrana de las vesículas presinápticas. Impiden la exocitosis y la liberación de algunos neurotransmisores como la glicina, actuando en las neuronas inhibidoras en el caso de las neuronas motoras de la médula espinal. Ocurre una estimulación incontrolada de los músculos esqueléticos llamada “parálisis espástica”. Produce, además, una segunda toxina, la tetanolisina, que contribuye a la destrucción tisular. Tanto la gangrena gaseosa como el tétanos se adquieren por heridas en condiciones anóxicas. Es la toxina, no el microorganismo, lo que invade el organismo.

TEMA 21: BACILOS ENDOSPORAS

GRAM

ʘ

CON MORFOLOGÍA REGULAR

ʘ

LACTOBACILLUS

POSITIVOS

NO

FORMADORES

DE

GÉNEROS

−

Anaerobio aerotolerante.

−

Siempre fermentan, y siempre carbohidratos. Nunca respiran, por lo que no tienen CTE. Como consecuencia producen fundamentalmente ácido láctico.

−

Cat- / Ox- / Peroxidasa+.

−

Son la versión bacilar de Streptococcus lacti.

−

Obtienen poco ATP y crecen lentamente.

−

Forman pequeñas colonias blancas: no poseen ni pigmentos, ni citocromos ni carotenoides.

−

Son fácilmente distinguibles, pulverizando la placa con CaCO3, que es de color blanquecino. Se disuelve el CaCO3 por el ácido láctico, dando lactato cálcico, que es translúcido, y aparecerá en forma de halo alrededor de las colonias.

−

Son muy tolerantes a los ácidos (PH≈4-5). El PH es un factor selectivo, ya que elimina competidores en un medio rico en nutrientes.

143

−

Se encuentran en plantas, ciertos alimentos y bebidas preparadas (vino, cerveza,…) donde pueden llegar a producir grados de acidez no deseados. También aparecen en la leche debido a las vacas y/o materia comida por ellas.

−

Junto con los estreptococos lácteos son importantes en la producción de productos lácteos.

−

2 tipos: a) Homofermentadores:

Vía de Embder-Meyer

Glc

2 Pir

2 lac (+ 2 ATP)

b) Heterofermentadores:

Ruta de fosfocetolasa

Glc

Ru5P

1 lac + 1 etanol + 1 CO2 (+ 1 ATP)

Para diferenciar entre un homofermentador y un heterofermentador, debemos detectar la producción de CO2. L. bulgaris L. plantarum L. casei L. brevis L. acidophilus: presente en la boca, nariz y vagina.

•

LISTERIA

−

Bacilo corto, móvil a 25ºC pero inmóvil a temperatura corporal por inactivación de los flagelos.

−

Anaerobias / Aerobias facultativas (fermentación láctica).

−

Cat+ / Ox-. L. monocytogenes: patógeno intracelular β-hemolítico que produce la listeriosis, enfermedad que no tiene una manifestación concreta (se parece a la gripe, neumonía, fiebres tifoideas,…) y puede

144

provocar meningitis, septicemia,… Afecta al hombre y otros animales. En embarazadas provoca infecciones uterinas que acaban en abortos en el 30% de los casos y daños fetales. Puede ser ingerido por productos alimentarios infectados. Tiene distintos factores virulentos: −

Producción de fosfolipasas. − Proteína activadora de la actina. − Listeriolisina (LLO): toxina hemolítica y citolítica que se fija al colesterol y que se secreta a PH ácido y cuando la concentración de hierro es baja, condiciones que se dan en los fagosomas. Sobreviven a la fagocitosis y a bajas temperaturas (hasta 4ºC). no sólo entra a las células fagocíticas, sino que también entra a las no fagocíticas, como las células parenquimales, por fagocitosis inducida o endocitosis. Se adhiere a receptores de la D-galactosa, se forma una vacuola y lisa esa vacuola mediante la LLO. Permanece entonces en el citoplasma, donde se replica y se desplaza por un tipo de movilidad muy interesante: secuestra componentes celulares y forma colas de actina (por las proteínas activadoras de la actina), lo que les permite desplazarse. Tiene un mecanismo de polimerización de la actina similar a la de la célula hospedadora. Pasan de una célula a otra sin ponerse apenas en contacto con el medio exterior, por lo que para combatirla se precisa inmunidad mediada por células.

ʘ

CON MORFOLOGÍA IRREGULAR

−

Engloba a bacterias corineformes o corinebacterias.

−

Son bacterias pleomórficas: en relación con la edad del cultivo.

−

Son bacterias Gram+ con elevado %G+C.

−

Inmóviles.

−

Aerobias / Anaerobias facultativas / Anaerobias tolerantes / Anaerobias estrictas / Microaerófilas.

GÉNEROS

ʘ

CORYNEBACTERIUM

−

Anaerobias facultativas (fermentación propiónica).

−

Cat+.

−

Producen ácidos micólicos, presentes en la pared celular (tinción ácido-alcohol resistente).

145

−

El tipo de división celular es característica de este género: al dividirse, las células hijas sufren un movimiento de desgarro o chasquido que las coloca en posición angular a las células hijas, una junto a la otra. Una vez que ya se ha formado el septo, la capa interna se invagina formando el septo, dividiendo a las 2 células, pero sigue engrosándose y somete a tensión a la capa externa, que continúa manteniendo juntas a las células. Se rompe por un punto, por lo que la célula se curva al lado opuesto al punto de ruptura. Se llama “división angular o crepitante”. Las células se mantienen en ángulo durante un tiempo y unidas por la capa externa.

−

Especies patógenas: C. diphtheriae: también conocido como “bacilo de Klebs-Löeffler”. Produce la difteria. Para aislar a esta especie, se utiliza un medio que contiene agar-cistina-TeO2K (telurito potásico). Éste último inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias de la nasofaringe, pero no de ésta. El telurito potásico se transforma en teluro, que da un color metálico. La exotoxina diftérica está codificada por el fago β, que contiene el gen “tox”, responsable de la producción de la exotoxina. Las cepas virulentas producen la exotoxina cuando llegan al estado lisogénico, ya que es el paso a este estado lo que activa la virulencia. La exotoxina entra en la célula hospedadora y actúa inactivando el EFII. La expresión del gen “tox” depende del estado fisiológico de la bacteria, sobre todo del contenido de hierro (a altas concentraciones férricas se impide la producción de la exotoxina). Una vez producida la exotoxina, el microorganismo se queda en la boca, produciendo inflamación y un exudado llamado “pseudomembrana diftérica”, que bloquea el paso de aire por los conductos respiratorios. Existen 3 biotipos, dependiendo de la potencia de la exotoxina: POTENCIA GRAVIS

INTERMEDIUS

MITIS

Colonias más grandes, color gris oscuro y superficie de las colonias rugosa.

Colonias más pequeñas, color gris oscuro y forma de las colonias puntiforme.

Colonias más pequeñas aún, color negro brillante y de aspecto convexo.

C. bovis: afecta a animales. C. equis: afecta a animales. C. betae: afecta a la remolacha.

−

Especies no patógenas: C. pseudodihtheriticum: presente en las mucosas del tracto respiratorio superior. C. xerosis: aparece en boca, piel y nariz. C. glutamicum: se utiliza en procesos industriales para producir ácido glutámico (aditivo alimentario).

146

ʘ

ARTHROBACTER

−

Hábitat: suelo. Es un agente mineralizante de la materia orgánica en el suelo.

−

Aerobio estricto.

−

Dimórfico: en la fase estacionaria tiene forma de coco, pero cuando está creciendo, al final, presenta forma bacilar.

−

División angular: puede formar ramificaciones irregulares. Cuando escasean los nutrientes, se divide sucesivamente o se produce fragmentación múltiple, pasando a la forma estacionaria.

ʘ

PROPIONIBACTERIUM

−

Pleomórfico.

−

Similar a Corynebacterium.

−

Se refirió a las Propionibacterium y a Bifidobacterium como corinebacterias aerobias, pero Propionibacterium es anaerobio aerotolerante y suele vivir en condiciones de baja concentración de oxígeno. − Aparece en productos lácteos (se aisló por primera vez del queso suizo, en el cual ayuda a su curación), tracto genital, intestinal, rumen y piel. P. acnes: relacionado con el acné vulgar. La actividad hormonal estimula la producción excesiva de sebo; las glándulas sebáceas forman lípidos que pueden ser degradados parcialmente por enzimas de algunas bacterias, como P. acnes, que producen lipasas, y producen, a partir de esos lípidos, ácidos grasos, que son irritantes, atraviesan la piel y producen inflamación localizada.

−

Fermenta azúcares: produce propionato, CO2 (en mayor o menor medida), acetato… Puede producir succinato dependiendo del contenido en CO2.

Glc

EM

Pir + NADH

Va a ser reoxidado como parte de un ciclo donde se forma propionato.

El Pir acepta un grupo carboxilo del metil-maleonil-CoA por una reacción de transcarboxilación. Se forma oxalacetato y propionil-CoA; este último reacciona con el succinato y le transfiere su CoA, formándose propionilCoA, que se isomeriza a metil-maleonil-CoA. La reoxidación del NADH se lleva a cabo en 2 puntos del ciclo.

147

Partiendo de lactato: 3 lac

3 Pir + 2 propionato + 1 acetato + CO2

El lactato se oxida hasta Pir. Parte del Pir se oxida y parte se reduce. La parte del Pir que se oxida lo hace hasta acetil-CoA y CO2. Desde acetil-CoA hasta acetato se forma ATP. Se equilibra con la producción reductora del propionato. Pir Oxidación

Reducción

Acetato

Propionato

Lactobacillus homofermentativo, junto con Streptococcus y Propionibacterium, forman el queso suizo. En la cuajada (previa al queso) producen ácido láctico a partir de la glucosa. Las propionibacterias se desarrollan muy rápidamente aquí porque fermentan el lactato produciendo acetato y propionato (que dan el aroma característico al queso) y CO2 (cuya acumulación forma los agujeros del queso). Pueden producir succinato dependiendo del contenido de CO2 en el medio de cultivo. Su formación ocurre por una carboxilación del PEP, que origina oxalacetato, el cual, de forma secundaria, pasa a succinato. Es una vía independiente a la de formación de propionato y acetato.

ʘ

BIFIDOBACTERIUM

−

Anaerobios obligados / Anaerobios aerotolerantes (algunas especies o cepas, soportan el oxígeno siempre y cuando haya CO2).

−

Extremos algo espatulados o bifurcados.

−

Inmóvil. B. bifidum: constituye la fracción mayoritaria de la microbiota intestinal del recién nacido que es alimentado con lactancia materna. También aparece en menor medida en adultos, principalmente en el intestino y la boca. Tienen requerimientos nutricionales complejos: necesitan aminoazúcares (NAG, NAM,…) que están de forma normal en la leche. Si se les priva de aminoazúcares, se forman ramificaciones que le dan aspecto de micelio rudimentario. Otras especies: aparecen en insectos o en el agua.

148

−

Son bacterias parecidas a las del ácido láctico: a partir de un azúcar producen lactato, que no es el resultado de una fermentación homo o heteroláctica.

−

No producen CO2. 2 Glc

ʘ

ACTINOMYCES

−

Anaerobio aerotolerante.

−

Ramificaciones transitorias.

− Hábitat: intestino,…

−

3 acetato + 2 lactato + 5 ATP

aparece en los hombres y animales, en la boca, garganta, tracto genital femenino,

Fermentativo: fermenta azúcares. A. israelii: principal agente biológico de actinomicosis facial, torácica o abdominal. También puede provocar endocarditis, cervicitis,…

ʘ

MICOBACTERIAS

−

Bacilos inmóviles.

−

Aparición ocasional de crecimiento filamentoso.

−

Apariencia de micelio que aparece en la fase estacionaria y se fragmenta cuando entra en la fase de crecimiento activo.

−

Aerobios.

−

Paredes celulares con aumento de la concentración de lípidos, que les proporcionan consistencia y aspecto céreo a las colonias. En medios líquidos son responsables de que aparezcan formando grumos. Reducen su permeabilidad, aumenta la resistencia a antisépticos, desinfectantes,… El aumento del tamaño de ácidos micólicos aumenta su resistencia.

−

Ácidos micólicos: 3 hidroxiácidos grasos biramificados de cadena bastante larga en micobacterias (60-90 carbonos).

−

Presentan otros lípidos complejos.

−

Son difíciles de teñir, por su alto contenido en lípidos en la pared celular. Son ácido-alcohol resistentes. Se tiñen por la tinción de Ziehl-Nielssen.

149

Las bacterias nocardiformes también tienen ácidos micólicos. Antes, las micobacterias se agrupaban con las nocardiformes.

−

Especies no patógenas: son de crecimiento rápido. M. phlei M. fortuitum M. smegmatis

−

Especies patógenas: son de crecimiento lento. M. leprae: produce la lepra o “enfermedad de Hansen”. M. tuberculosis: también conocido como “Bacilo de Koch”. Produce la tuberculosis.

TEMA 22: BACTERIAS FOTOTROFAS

−

Son Gram-, salvo algunas excepciones.

−

En función de la fotosíntesis, se pueden como clasificar como:

a) Fototrofos anoxigénicos: − −

−

Bacterias rojas o púrpuras. Bacterias verdes. Bacterias de afiliación incierta.

b) Fototrofos oxigénicos: pueden llevar a cabo fotosíntesis anoxigénica bajo determinadas condiciones.

−

Cianobacterias.

−

Algunas bacterias fototrofas (rojas y verdes no del azufre) pueden vivir en la oscuridad. Poseen un metabolismo fotoheterotrofo pero pueden ser fotoautotrofas o quimioheterotrofas facultativas. En

150

la oscuridad, siempre y cuando estén en condiciones microaerófilas, pueden actuar como quimioheterotrofas y unas pocas como quimioautotrofas. Algunas especies pueden incluso fermentar.

−

La mayoría de bacterias fototrofas son fotoautotrofas (fijan CO2), para lo que tienen que gastar ATP y poder reductor. La fijación de CO2 no es igual: unas usan el ciclo de Calvin (bacterias rojas y cianobacterias), otras (bacterias verdes del azufre) usan el ciclo TCA inverso, y otras (bacterias verdes no del azufre) usan la vía del hidroxipropionato. 1.

Ciclo de Calvin:

−Se produce en el estroma de los cloroplastos, en individuos autótrofos. −Consta de 3 fases:

1) Carboxilación: fijación del CO2 por la enzima Rubisco. 2)

Reducción: de 3 PGA a GA3P.

3) Regeneración del aceptor de CO2: a partir de 12 GA3P, sólo 2 salen del ciclo para generar hexosas por una serie de reacciones. −

Balance: elevado gasto de ATP y poder reductor.

2.

Ciclo TCA inverso:

− Lo realizan las bacterias verdes del azufre, que son las únicas bacterias autótrofas que realizan esta ruta. También la realiza Sulfolobus, que es una arquea. − Es un ciclo reductor. 3 CO2 + 12 H + 5 ATP

Triosa-fosfato

Podrían fijarse 4 CO2 por cada vuelta. − Son 2 reacciones desfavorables que la llevan a cabo enzimas unidas a la ferredoxina reducida: son 2 carboxilaciones reductoras. 3.

Vía hidroxipropionato:

− − −

La realizan las bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus,…). Uno de los intermediarios es el hidroxipropionil-CoA. Glioxilato.

ʘ

BACTERIAS FOTOTROFAS ANOXIGÉNICAS

151

−

Las bacterias rojas y verdes no pueden llevar a cabo la fotolisis del agua, tienen que obtener poder reductor a partir de un compuesto reducido (sulfuros, compuestos reducidos del azufre, hidrógeno,…).

−

Pueden crecer fototróficamente sólo en condiciones anóxicas porque sus pigmentos fotosintéticos no actúan en condiciones óxicas.

−

En condiciones microaerófilas, algunas bacterias rojas pueden emplear estos donadores de electrones para soportar un metabolismo quimiolitotrofo.

−

Fundamentalmente las bacterias no del azufre son las que tienen mayor diversidad metabólica.

−

Formas unicelulares normalmente.

−

Cuando son móviles es por la presencia de flagelos; a veces presentan también vacuolas de gas.

−

Sólo presentan un fotosistema.

BACTERIAS ROJAS

−

Rojo es el color que presentan casi todas. Depende del contenido en carotenoides.

−

Presentan poli-β-hidroxibutirato como sustancia de reserva.

−

Como pigmentos mayoritarios contienen BCla o BClb.

−

Pueden fijar nitrógeno en condiciones anóxicas.

BACTERIAS ROJAS DEL AZUFRE

−

También llamadas “bacterias cromatiáceas”.

−

En el Bergey, están incluidas en las ɣ-proteobacterias.

−

Presentan metabolismo fotoautotrófico.

−

Como poder reductor utilizan compuestos reducidos de azufre o hidrógeno.

−

A veces realizan un TCA inverso para reducir NADP a NADPH (para reducir CO2).

− La oxidación del sulfhídrico para donar electrones al TCA inverso acumula azufre como glóbulos refringentes en el interior celular. Es transitoria porque ese azufre va a pasar a sulfato.

152

− Hábitat: aguas ricas en sulfuros por la acción de bacterias sulfatoreductoras que reducen los sulfatos a sulfuros. Generan el ciclo anaerobio del azufre en condiciones anóxicas.

−

Inmóviles / Móviles (flagelos polares).

−

Algunas pueden presentar vacuolas de gas:

− Sin vacuolas de gas: Chromatium Thiospirillum Thiocapsa Thiosarcina − Con vacuolas de gas: Lamprocystis: cocos móviles. Thiodictyon: bacilos aislados o en mallas irregulares. Thiopedia: cocos que forman placas planas bastante regulares.

BACTERIAS ROJAS NO DEL AZUFRE

−

También llamadas rodospiriláceas (Rhodospirillum).

− Filogenéticamente incluidas en las α-proteobacterias. − Presentan metabolismo fotoheterótrofo:

en presencia de luz y condiciones anóxicas, pueden usar compuestos orgánicos como donadores de electrones para la fotosíntesis.

−

Su metabolismo es flexible.

−

Cuando no utilizan compuestos orgánicos (condiciones autotróficas) usan el ciclo de Calvin para fijar CO2.

−

Algunas son desnitrificantes: respiración anaeróbica, donde emplean nitrato como aceptor final de electrones en lugar de oxígeno. Pueden ser desnitrificantes y a la vez fijar nitrógeno.

−

Móviles (flagelos polares o peritricos). Rhodospirillum rubrum: flagelación polar. Fisión binaria. Rhodobacter: fisión binaria. Rhodopseudomonas: flagelación polar. Gemación.

153

Rhodomicrobium: gemación. Forma ovoidea y flagelación peritrica. En el extremo de una hifa tienen una yema. Es una morfología similar a la de Hifomicrobium. Rhodoferax: anaerobia facultativa. Fija ácidos orgánicos, malato, Pir… acompañado de una reducción de hierro (hierro como aceptor final de electrones). Tiene de curioso que es capaz de transferir los electrones generados directamente a un electrodo mientras se nutre de esos azúcares. La eficacia de la conversión energética de los ácidos orgánicos para producir energía eléctrica es de más del 80%.

BACTERIAS VERDES

BACTERIAS VERDES DEL AZUFRE − −

Dependen del contenido de carotenoides. La mayoría de las bacterias verdes lo son del azufre.

−

Presentan clorosomas: estructuras ovaladas con membrana que las hacen independientes.

−

Los pigmentos mayoritarios son: en la membrana, la BCla; en los clorosomas, la CBlc, d y e.

−

Fijan nitrógeno en condiciones anóxicas.

−

Son también denominadas “clorobiáceas” siendo el género representativo Chlorobium.

−

Las bacterias verdes se encuentran en los “géneros de las ramas más profundas del dominio Bacterium” en el Bergey.

−

Metabolismo fotoautótrofo obligado.

−

La fuente de poder reductor son compuestos reducidos del azufre o, a veces, el hidrógeno. Oxidan el sulfhídrico o sulfuro y depositan el azufre extracelularmente.

− Sin vacuolas de gas: en fondos de los estanques o lagos poco profundos para recibir la luz, lodos ricos en sulfhídrico,… Son bacterias pequeñas e inmóviles.

Chlorobium: bacilo curvado que pueden formar cadenas cortas. Prosthecochloris: forma ovoide. También forma cadenas cortas.

− Con vacuolas de gas: Pelodictyon: forma redes.

154

BACTERIAS VERDES NO DEL AZUFRE

−

Llamadas “cloroflexadas” debido a Chloroflexus.

−

También pertenecen a los “géneros de las ramas más profundas del dominio Bacterium” en el Bergey.

−

Metabolismo fotoheterótrofo: en condiciones anóxicas con luz, utilizan compuestos orgánicos como donadores de electrones.

−

Metabolismo flexible: también pueden presentar metabolismo fotoautotrofo facultativo (fijan el CO2 y el hidrógeno como donador de electrones). Algunas pueden ser quimioheterótrofas facultativas.

−

Se parecen en el metabolismo diverso a las bacterias rojas no del azufre.

−

También presentan clorosomas.

−

BCLc o BCLd.

−

En autotrofía, llevan a cabo el ciclo del hidroxipropionato.

GÉNEROS

ʘ

CHLOROFLEXUS

−

Termófilo.

−

Requerimientos nutricionales complejos.

−

Forma filamentosa.

−

Movimiento por deslizamiento.

ʘ

HELIOTHRIX

−

rRNA 16S similar a Chloroflexus.

−

Forma filamentosa y deslizante.

−

Se considera una rareza porque solo tiene BCla y no tienen clorosomas.

155

GÉNEROS DE AFILIACIÓN INCIERTA

GÉNEROS

ʘ

HELIOBACTERIAS

−

Son Gram+.

−

Parecidas a Clostridium: pertenecen a la misma clase, mismo orden y distinta familia.

−

Se tiñen mal por su bajo contenido en peptidoglucano.

−

El género Heliobacterium forma endosporas.

−

Metabolismo fotoheterotrofo estricto y siempre viven en condiciones anóxicas.

−

Pigmentos: presentan un tipo de BCl que se llama Bclg, que es similar a la Bcla. La BClg no se encuentra en los clorosomas ni en las membranas celulares, sino en la membrana citoplasmática.

−

Fijan nitrógeno.

−

Anaerobias estrictas.

−

Hábitat: extremas).

−

zonas tropicales (arrozales, donde las condiciones de temperatura y humedad son

Movimiento por desplazamiento o flagelos, dependiendo de la especie.

♦ ♦ ♦

Heliobacterium: todos son bacilos, algunos deslizantes y otros con flagelos. Heliobacillus: flagelos peritricos. Heliophilum: bacilos con flagelos polares pero que se mueven en grupos.

ʘ

ERYTHROBACTER

−

Pertenece al grupo de α-proteobacterias, pero realiza fotosíntesis anoxigénica, aunque vive en presencia de oxígeno. − Otras bacterias similares a ésta forman parte de los “tapetes microbianos”: se trata de bacterias fotoheterotrofas anóxicas aeróbicas que ocupan pequeños nichos ecológicos ricos en nutrientes, y se pensó que su metabolismo principal era quimioheterotrofos, pero en realidad son

156

fotoheterotrofos, aunque no se sabe si es posible que fijen CO 2. Constituyen más del 8% de las comunidades bacterianas en los océanos abiertos.

−

Son Gram-.

−

Color rojo-anaranjado por la presencia de carotenoides.

−

Fisión binaria.

−

Cat+ / Ox+.

−

Hábitats marinos.

−

Algunos autores todavía dicen que son quimioheterotrofos, que respiran y que curiosamente tienen BCla. Cada día más se sabe que son fotoheterotrofos aeróbicos anoxigénicos, ya que, cuando se les iluminan, dejan de respirar. No crecen anaeróbicamente con luz ni quimiolitrotróficamente con oxígeno. Tienen una regulación opuesta a las bacterias rojas típicas. La biosíntesis de Bcla y carotenoides está estimulada por oxígeno. Es incapaz de tener un crecimiento anoxigénico anaerobio. - HÁBITATS DE LAS BACTERIAS CON FOTOSÍNTESIS ANOXIGÉNICA −

Muchas restricciones ecológicas.

−

Son marinos.

−

En general viven en ausencia de oxígeno y en presencia de compuestos reducidos, orgánicos e inorgánicos, distintos del agua, para llevar a cabo la fotosíntesis.

−

Tipos de hábitats:

1)

Balsas poco profundas, laguna costera… con alto contenido en hidrógeno, H2S, CO2. No hay oxígeno en el fondo pero llega la luz. La parte superior está cubierta por organismos fototrofos oxigénicos (cianobacterias, algas,…) que captan la luz roja y azul, así que deben captar luz a diferentes λ (captan la luz no aprovechada por organismos de fotosíntesis oxigénica: la BCl capta la luz infrarroja).

2)

Lagos meromícticos: tienen una escasa circulación vertical, estratificados casi permanentemente, con escasa corriente. En el fondo hay agua más densa, con alto contenido en sal. El desarrollo de las bacterias rojas y verdes, especialmente del azufre, puede producirse durante todo el año. También aparecen en lagos holomícticos, donde la estratificación es estacional por las diferentes temperaturas del año. La actividad fotosintética es lo suficientemente elevada para constituir una auténtica fuente de materia orgánica en este lago. Puede ser más intensa que en capas superiores, donde hay algas. Es más normal la presencia de estas bacterias en balsas o estanques que en grandes masas de agua, donde hay más corrientes y cambios de estratificación.

157

Las bacterias rojas y verdes se sitúan en la franja o zona donde termina la franja o zona aeróbica, cuando empieza la alta concentración de sulfuros y sulfhídricos. A esta profundidad sólo llega una λ≈450nm (verdeazulada), por lo que captan la luz por los carotenoides, que captan la luz que llega muy filtrada a esta profundidad.

ʘ

BACTERIAS FOTOTROFAS OXIGÉNICAS

ʘ

CIANOBACTERIAS

GÉNEROS

−

Anteriormente conocidas como “cianofíceas”.

−

Color verde-azulado debido a la presencia de la ficocianina (λmáx = 700nm). También pueden presentar ficoeritrina (λmáx = 500nm). Ambos son pigmentos accesorios. Existe un fenómeno de absorción cromática: si la bacteria crece en presencia de luz verde, su contenido en ficoeritrina será mayor que el de ficocianina.

−

Presentan PSI y PSII; la Cla se encuentra en los tilacoides.

−

En condiciones anóxicas, algunas pueden llevar a cabo la fotosíntesis anoxigénica facultativa (sólo usan el PSI) y obtienen ATP por fosforilación. El poder reductor lo obtienen de los sulfuros (el sulfhídrico pasa a azufre; ese sulfhídrico es un potente inhibidor del PSII). El azufre lo depositan fuera de la bacteria.

−

Existe una relación entre las bacterias fotosintéticas y las algas: las algas también, en condiciones anóxicas, emplean sólo el PSI, pero éstas obtienen el poder reductor del hidrógeno.

−

Realizan el ciclo TCA inverso; la ruta de las pentosas-fosfato juega un papel esencial en la concentración de carbohidratos. − La fotoheterotrofía es rara: es una característica casi reducida a los organismos con fotosíntesis anoxigénica.

−

Fijan CO2 por el ciclo de Calvin.

−

Algunas pueden crecer lentamente sin luz como quimioheterotrofas.

−

Otros, en vez de utilizar el agua, pueden oxidar sulfuros y llevar a cabo fotosíntesis anoxigénica.

−

Son formas unicelulares o filamentosas: si son filamentos se les denomina “tricomas”, que están en contacto por una amplia zona a otras células.

−

Móviles (no por flagelos); pueden presentar capas mucilaginosas que les permiten deslizarse. Las cianobacterias marinas poseen vacuolas de gas para la flotación.

158

−

Hábitat: muy variado (agua dulce, salada, termófilas, terrestres,…). Entre las que viven en el suelo algunas son endosimbiontes (Anabaena azollae) de un helecho llamado Azolla. En el sureste asiático se suelen hacer crecer en las zonas de cultivo de arroz, para que Azolla produzca nitrógeno. − − Fisión binaria, fisión múltiple, fragmentación (sólo en bacterias filamentosas, las cuales forman hormogonios, que son tricomas más pequeños y finos que se separan del resto por deslizamiento), gemación,…

−

Las formas de resistencia que presentan algunas formas filamentosas se denominan acinetos: son estructuras inmóviles, resistentes a la sequía, oscuridad, con pared gruesa que se rompe cuando existen condiciones favorables.

−

Las cianobacterias son los únicos microorganismos capaces de fijar oxígeno (fotosíntesis oxigénica) y a la vez capaces de fijar nitrógeno. Las cianobacterias fijadoras de nitrógeno son filamentosas, tienen heterocistes (células redondeadas que se distribuyen de forma regular a lo largo del filamento o en los extremos y que presentan una alta concentración de glucolípidos en la pared para disminuir la difusión del oxígeno). Los heterocistes no se forman cuando los microorganismos viven en presencia de nitrógeno en el medio, sino cuando no hay; es entonces cuando sintetizan una capa gruesa, se desechan las ficobilinas y el PSII, lo que implica que no funcione la fotosíntesis oxigénica. Entonces sintetizan nitrogenasa y se forman conexiones polares especializadas entre los heterocistes y las células vegetativas normales que están a su lado.

−

El heterociste presenta un bajo contenido en ficobilinas, no presenta el PSII y, además, tampoco presenta la enzima Rubisco, por lo que no puede fijar ni CO2 ni producir O2. Tiene un PSI funcional y puede sintetizar ATP, pero va a depender de las células vegetativas para obtener el poder reductor. Los heterocistes proporcionan productos de la fijación del nitrógeno, como glutamina y amoniaco. Si no hay heterocistes, no se puede fijar nitrógeno a la misma vez que se realiza la fotosíntesis oxigénica. Algunas formas filamentosas no tienen heterocistes y pueden fijar nitrógeno, siempre y cuando lleven a cabo fotosíntesis anoxigénica.

−

Las cianobacterias utilizan como materia de reserva carbonada el glucógeno. Algunas presentan cianoficina, que es un polímero sencillo de aspártico y arginina, que puede constituir hasta el 10% de la masa celular. Se trata de un producto de reserva nitrogenada muy común en cianobacterias. Durante periodos de oscuridad, esta cianoficina puede servir también como fuente de energía, ya que la arginina del polímero puede ser hidrolizada transformándose en ornitina, CO2, NH3 y ATP. Se lleva a cabo por la enzima arginina-dihidrolasa. Las ficobilinas también sirven como fuente nitrogenada. Pueden constituir el 10% de masa celular.

−

5 géneros:

GÉNEROS

ʘ −

OSCILLATORIA

Bacterias filamentosas sin heterocistes.

159

−

Fijan nitrógeno: esta fijación se produce en unas células del centro del filamento que no tienen actividad del PSII, evitando la producción de oxígeno.

ʘ −

Bacterias filamentosas con heterocistes y acinetos, pero sin hormogonios.

ʘ −

ANABAENA

NOSTOC

Bacterias filamentosas con heterocistes, acinetos y hormogonios.

ʘ

GLOEOTHECE

−

Bacteria que forma una especie de vaina que engloba a varias células.

−

No posee heterocistes.

−

Puede fijar nitrógeno: para ello sintetiza la nitrogenasa, sólo en periodos de oscuridad, ya que con luz se degrada la nitrogenasa y no fija nitrógeno.

ʘ

SYNECHOCOCCUS

−

Una de las bacterias fototrofas más importantes del medio marino. Se calcula que hasta el 25% de la producción primaria del ambiente marino típico se debe a ella.

TEMA 23: BACTERIAS QUIMIOLITOTRÓFICAS AERÓBICAS −

Bacterias Gram -.

−

Obtienen el ATP mediante fosforilación oxidativa de compuestos inorgánicos y emplean el oxígeno como aceptor final de electrones.

160

−

Algunos son anaerobios facultativos, pudiendo emplear compuestos orgánicos.

− Como poder reductor utilizan compuestos inorgánicos, aunque los anaerobios facultativos utilizan orgánicos.

− −

Como fuente de carbono utilizan CO2 atmosférico, fijando el carbono por el ciclo de Calvin. Hay también mixotrofos que siempre requieren una fuente orgánica de carbono, ya que no pueden fijar CO2.

−

Atendiendo al donador de electrones inorgánico para la producción de energía a partir de su oxidación, diferenciamos:

1)

Bacterias nitrificantes:

Pueden crecer quimiolitotróficamente a expensas de compuestos reducidos del nitrógeno. En la naturaleza no existen organismos capaces de llevar a cabo el paso directo de amoniaco a nitrato.

a)

Nitrosificantes: oxidantes de NH3 o productoras de nitrito (oxidan el amoniaco a nitrito). b) Nitrificantes: oxidantes de nitrito o productoras de nitrato (oxidan el nitrito a nitrato). Ambos grupos se encuentran en suelo y agua. Están ampliamente distribuidas, pero no en grandes cantidades. Si hay una gran cantidad de amoniaco en el medio, sí hay abundancia. También aparecen en otros tipos de ambientes, como en la interfase aeróbica-anaeróbica de lagos estratificados.

ʘ

BACTERIAS NITROSOFICANTES

Crecen a PH básico. La oxidación del amoniaco requiere la presencia de O2 en una primera etapa catalizada por la amoniacomonooxigenasa (AMO), situada en la membrana. Además, se requieren protones procedentes del NADH. El primer producto es la hidroxilamina. En esta primera fase no se produce energía. La hidroxilamina pasa al periplasma donde se oxida a nitrito, paso catalizado por la hidroxilamina-oxidasa-reductasa (HAO). Como consecuencia de esta oxidación, se liberan 4 electrones que pasan al citocromo c periplasmático. 2 electrones pasan a la vía ubiquinona, y en la membrana reducen el O2 a H2O. Los otros 2 electroes restantes viajan a la oxidasa terminal a través de otro citocromo c situado en la membrana, y este transporte de electrones va a permitir la síntesis de ATP gracias al gradiente protónico que se crea, aunque se genera poca cantidad de ATP.

161

Obtienen el poder reductor a partir de compuestos inorgánicos por un transporte inverso de electrones con gasto de ATP. El ε’o de nitrito a amoniaco es muy alto para reducir el NAD+ a NADH. Las bacterias oxidantes de amoniaco tienen semejanza con las bacterias oxidantes del metano, ya que tienen sistemas de membrana internos.

♦ ♦ ♦ ♦ ♦

ʘ

Nitrosococcus Nitrobacter Nitrosomonas: bacilo. Nitrosolobus: forma lobular. Nitrosospira: espiral muy compacta.

BACTERIAS NITRIFICANTES

Oxidan el nitrito a nitrato, provocando acidificación, ya que producen ácido nítrico. Pero, en general, la producción de nitrato es más importante a PH alcalino o neutro. Esta oxidación de nitrito a nitrato se realiza en una sola etapa catalizada por la nitrito-óxido-reductasa (NOR). Los electrones pasan, en primer lugar, a través de una cadena corta a un citocromo c para luego llegar a un citocromo terminal (Cyt aa3), que reduce el O2 a H2O. Se genera un ATP por cada nitrito que se reduce a nitrato. El poder reductor generado se obtiene por transporte inverso de electrones, gastando ATP. El ε’o del par nitrito-nitrato es muy elevado y no puede reducir directamente el NAD+ a NADH. Tienen muy poca cantidad de energía, que se manifiesta en un bajo rendimiento en el crecimiento (se dividen sólo una vez cada día). Parece que la mayor parte de estas bacterias pueden crecer también de forma quimioheterótrofa.

♦ ♦ ♦

Nitrobacter Nitrococcus Nitrospira

- ANAMOX Es el proceso por el cual se produce la oxidación anóxica del amoniaco. Es una oxidación altamente exergónica y está ligada al metabolismo energético de los organismos que lo realizan.

162

Implica la oxidación de NH4+ con nitrito como aceptor de electrones. El NH4+ cede los electrones al nitrito, que los acepta dando lugar a nitrógeno gas.

♦

Brocadia anammoxidans: es un ejemplo de bacteria que realiza ANAMOX. Es una bacteria autótrofa y no pertenece a los grupos de bacterias que hemos visto: está separada filogenéticamente. Pertenece al filum de un género llamado Planctomyces, que da nombre al reino Planctomicetes. Estas bacterias carecen de peptidoglucano y presentan unos compartimentos rodeados de membrana en el interior celular, en los que se encuentra una estructura análoga al núcleo de células eucariotas. Esta bacteria tiene un compartimento principal denominado anamoxosoma, donde se produce la reacción ANAMOX. Este nitrito de la reacción procede de la oxidación de amoniaco de las bacterias nitrosoficantes. Tanto bacterias nitrosoficantes como las que realizan la reacción ANAMOX viven en aguas residuales (ricas en amoniaco). En estos ambientes se encuentran partículas en suspensión con zonas óxicas y anóxicas.

ʘ

BACTERIAS OXIDADORAS DEL AZUFRE

−

También conocidas como “bacterias incoloras del azufre” para distinguirlas de las bacterias verdes y rojas del azufre.

−

Son quimiolitotrofas: la capacidad de crecer quimiolitotróficamente a expensas de compuestos reducidos del azufre también es compartido por arqueas como Sulfolobus.

−

Hábitat: suelos y aguas de PH ácidos. Presentan extremada tolerancia al ácido.

−

Usan compuestos reducidos del azufre (sulfuros, tiosulfatos, azufre,…) como fuente de energía y poder reductor. Otros utilizan hierro como donador de electrones. Las que son quimiolitotrofas facultativas pueden utilizar también compuestos orgánicos.

−

Pueden fijar el CO2 por el ciclo de Calvin. Las hay facultativas, utilizando azúcares, por lo que no siguen el ciclo de Calvin.

−

No todas las bacterias oxidadoras del azufre son aerobias estrictas: facultativas.

algunas son anaerobias

♦

Thibacillus: bacilo con flagelación polar. Cuando forma azufre a partir de tiosulfato, lo deposita fuera de la célula.

♦ ♦

Thibacillus ferrooxidans: oxida tanto hierro como azufre. Thiobacillus denitrificans: utiliza nitrato como aceptor final de electrones.

163

♦

Thiomicrospira: bacilo pequeño con flagelación anfitrica. Deposita azufre fuera de la célula y es un quimiolitotrofo estricto.

♦

Thiospira:

espirilo grande con flagelación anfitrica que acumula azufre dentro de la

célula. Dependiendo del tipo de microorganismo, pueden utilizar un compuesto u otro reducido del azufre. Tiosulfato

S2O3-2

Sulfuro

S2

Sulfito

SO3-2

El sulfuro es oxidado hasta sulfito mediante la sulfuro oxidasa. El sulfito puede oxidarse a sulfato de dos formas para producir ATP:

1)

Mediante la sulfito-oxidasa: permite la liberación de 2 electrones, que se transfieren a una CTE para obtener ATP por fosforilación oxidativa. Esta vía metabólica se presenta en todas las bacterias de este grupo.

2)

El sulfito reacciona con AMP en una primera etapa, donde se liberan 2 electrones y se forma adenosín-fosfosulfato (APS). Es una reacción catalizada por la APS-reductasa. Estos 2 electrones liberados van a la CTE y se forma ATP por fosforilación oxidativa. Estos electrones son transferidos al oxígeno a través de un sistema de citocromos. También se obtiene ATP por fosforilación a nivel de sustrato a través del adenosín-fosfosulfato. Esta vía solo se ha detectado en pocas especies del género Thiobacillus. El tiosulfato se rompe en sulfito y azufre elemental. El sulfito pasa a sulfato con síntesis de ATP. El otro átomo de azufre del tiosulfato se convierte en azufre elemental insoluble, pero que, a su vez, puede ser oxidado cuando la concentración de tiosulfato es muy baja o inexistente. Tanto sulfuros como azufre elemental pueden reaccionar con grupos sulfhidrilos celulares, como los del glutatión. Estos complejos pueden ser también oxidados para convertirse en sulfito. En cualquier caso, al producirse protones, se reduce el PH del medio, incluso por debajo de 1, debido al sulfhídrico. Los electrones generados en la oxidación pasan a una CTE. Van entrando por distintos puntos dependiendo del ε’o del compuesto que cede los electrones. Estos electrones llegan al oxígeno, que se va a reducir a agua. También se produce la síntesis de ATP por ATPasas de membrana. Para fijar CO2 hace falta ATP y poder reductor. El NADH se obtiene por transporte inverso de electrones. El CO2 se fija por el ciclo de Calvin.

164

ʘ

BACTERIAS OXIDADORAS DEL HIDRÓGENO

−

No constituyen un grupo taxonómico.

−

Pueden ser Gram+ o Gram-.

−

La única que es oxidadora del hidrógeno obligada es Hydrogenobacter: se trata de un bacilo alargado, que puede ser móvil o inmóvil.

♦ ♦ ♦

Hydrogenobacter thermophilus: inmóvil. H. subterraneus: móvil. H. acidophilus: móvil.

−

Todas las demás son mixotrofas o autótrofas facultativas.

−

Si utilizan CO2, lo hacen por el ciclo de Calvin.

−

Probablemente cambian su metabolismo para garantizar sus requerimientos nutricionales. La concentración de hidrógeno no muy elevada en ambientes con oxígeno.

−

Se trata de bacterias que viven en ambientes óxicos: el hidrógeno procederá de ambientes anóxicos próximos o ambientes aeróbicos. También por esto, en cuanto a requerimiento de oxígeno, la gran mayoría son microaerófilas.

−

Poseen una hidrogenasa capaz de captar el H2 del ambiente y oxidarlo hasta H+ y electrones. Suele tener níquel como factor metálico, y es sensible a altas concentraciones de oxígeno.

−

Algunas también fijan nitrógeno (nitrogenasas).

La mayoría poseen una hidrogenasa particulada en la membrana, como es el caso de ciertas cepas de Pseudomonas (P. carboxydovorans). Está acoplada a una CTE y los electrones van a pasar a una quinona y una serie de citocromos hasta llegar al oxígeno, que se reduce a agua. Se obtiene ATP por fosforilación oxidativa. Necesitan un transporte inverso de electrones para obtener poder reductor. Cepas de Alcaligenes, como A. eutrophus, además de tener hidrogenasas particuladas, también presentan una hidrogenasa soluble en el citoplasma, que le permite reducir el NAD+ a NADH. Este NADH va a ser utilizado en el ciclo de Calvin para fijar CO2 o se reoxida para desviar los electrones desde el NAD+ hasta la CTE y así obtener ATP. Hay cepas de Nocardia que sólo presentan hidrogenasas solubles. Si las 2 hidrogenasas de un microorganismo realizan la misma reacción, esto aporta una ventaja. Una explicación se basa en las actividades diferenciales de estas 2 enzimas cuando la concentración de hidrógeno varía:

165

−

Si la PpH2 es baja: la hidrogenasa soluble no funciona en el sentido correcto. En esta situación no se puede reducir el NAD+ a NADH. El crecimiento va a depender de la hidrogenasa particulada, que produce los electrones para la síntesis de ATP y la reducción del NADH por transporte inverso de electrones.

−

Si la PpH2 es alta: se evita el grasto de energía que supone la formación de NADH por transporte inverso de electrones. Utilizan la hidrogenasa soluble, que es una adaptación específica al crecimiento a elevadas PpH2.

ʘ −

BACTERIAS OXIDADORAS DEL HIERRO

También pueden oxidar Mn, y muchas de ellas incluso azufre.

−

Oxidan Fe+2 (ferroso) a Fe+3 (férrico): es una reacción que suministra poca cantidad de energía, por lo que necesitan utilizar grandes cantidades de hierro. El Fe +3 en el agua forma precipitados que son muy insolubles.

−

La mayoría son acidófilas estrictas. A PH neutro, en ambientes con oxígeno, el Fe+2 espontáneamente se oxida a Fe+3, forma que no puede ser utilizada. A PH ácido, que es donde viven, el Fe+2 sí es estable frente a la oxidación química.

−

El hierro tiene un ε’o altísimo: obtiene muy poca energía. El potencial es muy alto y, por tanto, la cadena es muy corta hasta el oxígeno. Es necesario el transporte inverso de electrones para obtener poder reductor. Se sugiere que para obtener ATP utilizan incluso el gradiente de protones preexistente en el medio.

♦

Thiobacillus ferrooxidans: CTE muy corta. Tiene una proteína periplasmática que contiene cobre llamada rusticianina.

♦ ♦ ♦

ʘ −

Siderocapsa: cocos en agrupaciones con forma de tétrada. Siderococcus Ochrobium: bacilo con 2 flagelos de distinta longitud.

BACTERIAS CARBOXIDOTRÓFICAS

También llamadas “carboxidobacterias”.

−

Son capaces de oxidar CO a CO2. En esta oxidación participa la CO-Dhasa, que contiene molibdeno.

166

−

Presentan un crecimiento quimiolitotrófico, utilizando CO como fuente de carbono y energía.

−

Pueden ser Gram- o Gram+.

−

En realidad algunas son bacterias del hidrógeno que pueden crecer también sobre CO como fuente de energía, cediendo los electrones a una CTE empleada en la síntesis de ATP.

−

El consumo de CO por estas bacterias es importante desde el punto de vista ecológico. Aunque se genera mucho CO por la actividad humana, el nivel apenas ha variado gracias a la proliferación de estas bacterias, que son el principal sumidero de CO de la naturaleza.

−

Son facultativas.

♦ ♦ ♦ ʘ

Pseudomonas carboxidovorans Alcaligenes carboxydus Bacillus schlegelii

BACTERIAS MAGNETOTÁCTICAS

− −

Son Gram-, acuáticas, microaerófilas y muy diversas en morfología y metabolismo. Presentan la peculiaridad de que su movimiento (flagelar) y su dirección están influidas por el campo geomagnético.

♦

Aquaspirillum magnetotacticum (Magnetospirillum magnetotacticum): es una bacteria quimioheterotrofa que utiliza el oxígeno como aceptor final de electrones, y a veces incluso el nitrato. Es microaerófila y presenta flagelación lofotrica. Tienen la capacidad de transformar el Fe+3 extracelular en el mineral magnesita (Fe3O4). Entonces forma unas partículas llamadas magnetosomas en el citoplasma, de 5-40 partículas. En un campo magnético, orienta su eje longitudinal según la línea N-S. La magnetotaxis es considerada como una respuesta primitiva de comportamiento. Los fenómenos magnéticos se han estudiado utilizando estas bacterias como modelos de organismos superiores.

167

TEMA 24: BACTERIAS GEMANTES Y/O CON APÉNDICES −

Gram-.

−

Quimioheterotrofas.

−

Sobre todo marinas.

Tienen de peculiar que poseen prosteca, que es un tipo de apéndice. Se trata de una extrusión citoplasmática acompañada de pared celular. Si presenta función reproductora se denomina hifa (Hyphomicrobium). En el extremo de esa hifa se forma una yema, se produce un tabique transversal y se forma otra hifa. En otros casos, está relacionada con la absorción de nutrientes. Aumenta la superficie celular y, por tanto, la capacidad para captar nutrientes (Caulobacter). Se unen formando estructuras en forma de roseta gracias a una especie de botón de anclaje que tienen en el extremo, o se sujetan a un sustrato inerte. Generalmente habitan en ambientes oligotróficos. En otros casos, se trata de prostecas cortas, que aumentan la relación s/v, por lo cual aumentan también la capacidad de flotación para las bacterias acuáticas.

♦ ♦

Stella: plana, similar a una estrella. Prostecomicrobium: más esférica. También forma yemas, que salen del cuerpo.

Existen algunas bacterias con prosteca, como Caulobacter y Asticcacaulis que no geman. Tienen un ciclo vital con división desigual o asimétrico, que da lugar a 2 tipos de células distintas:

− Una inmóvil con prosteca: puede dividirse. − Una móvil, flagelada y sin prosteca: es nadadora. No puede dividirse hasta que no pierde el flagelo y desarrolla la prosteca.

El tamaño de la prosteca está relacionado con las condiciones ambientales: es corta en ambientes con bajas concentraciones de nitrógeno y forma pedúnculos largos a bajas concentraciones de fósforo. Muchas tienen discos o botones de anclaje en el extremo o en otra parte. Forman un material adhesivo que les permite adherirse a sustratos sólidos, entre sí o a la pared celular de otros microorganismos.

ʘ

BACTERIAS CON PROSTECA

168

- GEMANTES Pueden formar yemas en el extremo de la prosteca.

−

Hyphomicrobium: metilotrofa facultativa. Crece mejor con compuestos de un carbono que con aminoácidos o azúcares.

− Hyphomonas. − Pedomicrobium. − Stella. − Prosthecomicrobium. − Ancalomicrobium: forma de ancla. Puede tener más de 2 prostecas.

- NO GEMANTES Se dividen por fisión binaria desigual.

−

Caulobacter: forma de bacilo más o menos vibroide. Forma el disco adhesivo en el extremo de la prosteca.

−

Asticcacaulis: bacilo con disco adhesivo, pero no en el extremo de la prosteca.

ʘ

BACTERIAS SIN PROSTECA

A veces forman un tallo o pedúnculo no celular. Son estructuras filamentosas no vivas, producidas por una secreción continua de materiales polisacarídicos en una zona concreta de la superficie.

- GEMANTES -

−

Plantomyces: bacteria que forma un tallo constituido por fibrillas más o menos rectas. Tiene forma de pera, globular, con flagelación subpolar. Ese gran pedúnculo tiene un disco adhesivo en su extremo. No tiene peptidoglucano y su pared celular es de tipo S. Esta bacteria tiene una compartimentalización interna bastante desarrollada, particular y diferente al resto de procariotas.

169

−

Pasteuria: no tiene tallo. Carece de peptidoglicano, pero presenta una glucoproteína rica en glutámico. - NO GEMANTES -

−

Gallionella: tiene tallo. Presenta filamentos helicoidales (3-40) que están terminados con un botón de anclaje. Este tallo presenta incrustaciones de hidróxido férrico coloidal. Es una bacteria quimiolitotrofa facultativa que obtiene energía de la oxidación de hierro y manganeso. Fija el CO2 por el ciclo de Calvin. Habita en ambientes ricos en hierro, y se asocia muchas veces a bacterias envainadas. Son ambientes con PH neutro, en el cual el hierro, en presencia de oxígeno, se oxida espontáneamente. En las interfases aeróbica-anaeróbica vamos a encontrar a esta bacteria junto a bacterias envainadas. En aguas a PH ácido serán reemplazadas por Thiobacillus (bacteria acidófila estricta).

En general, este grupo de bacterias está relacionado filogenéticamente con bacterias rojas no del azufre, excepto Plantomyces y Pasteuria. Caulobacter e Hyphomicrobium pertenecen al grupo de las α-proteobacterias.

ʘ −

BACTERIAS ENVAINADAS

Bacterias quimioheterotrofas Gram-.

Inicialmente, cuando comenzó su estudio, se pensó que eran bacterias quimiolitotrofas, pero no acoplan la reacción de oxidación de compuestos inorgánicos para obtener energía. Llevan a cabo reacciones catalizadas por ciertas proteínas de la vaina que conducen al depósito de óxidos metálicos encima o dentro de la vaina.

− −

Aerobias: sin embargo, habitan en la interfase aerobia-anaerobia. Acuáticas: crecen formando cadenas de células encerradas en vainas tubulares, constituidas por proteínas, lípidos, polisacáridos. No presentan peptidoglicano en la vaina. En la fase de crecimiento activo forman cadenas envueltas por una vaina, pero cuando hay déficit nutricional (fase estacionaria) salen de las vainas pasando a formas unicelulares (bacilos móviles por penachos de flagelos en posición subpolar). Cuando hay alimento, pierden el flagelo y forman cadenas tras unirse a un objeto sólido.

♦ ♦

Sphaerotilus natans: vive en aguas muy contaminadas.

Leptothrix: habitante de agua dulce no contaminada, pero rica en minerales, con alto contenido en hierro o manganeso. Son β-proteobacterias.

170

ʘ

BACTERIAS DESLIZANTES NO FOTOSINTÉTICAS

−

Bacterias Gram- quimioheterotrofas.

−

Aeróbicas.

−

Algunas son, desde el punto de vista morfológico, similares a las cianobacterias. En muchas ocasiones se las considera como homólogas no fotosintéticas.

−

Se mueven por deslizamiento, característica bastante extendida entre las bacterias Gram-, aunque hay algunas Gram+ pero son muchas menos. El deslizamiento no es igual en todos los casos:

− Rotación sobre el eje axial (girando). − Reptación: manteniendo sólo un lado de la célula en contacto con la superficie. En general, el deslizamiento es mucho más lento que el movimiento flagelar: la velocidad con el deslizamiento es absolutamente dependiente de la longitud de la célula (a mayor longitud, mayor velocidad). Se han postulado varias hipótesis sobre el mecanismo que permite este deslizamiento, y se ha concluido que existen al menos 2 mecanismos implicados:

1.

Mecanismo presente en Cytophaga:

Consiste en un deslizamiento por 2 juegos de partículas de naturaleza proteica, uno de los cuales está situado en la membrana citoplasmática y el otro en la membrana externa. Ambos juegos están engarzados entre sí, probablemente a nivel del peptidoglucano. Estas proteínas de la membrana citoplasmática se mueven a expensas de un potencial de membrana o bien de un gasto directo de ATP.

2.

Mecanismo presente en Myxococcus:

Es un deslizamiento por la secreción de una sustancia química mucosa a través de unos poros especiales de la superficie celular que afectan a las fuerzas de tensión superficial entre la célula y la superficie sólida. - NO FRUTESCENTES −

No forman cuerpos fructíferos.

−

Son acuáticos, aunque algunas actúan como comensales viviendo en las mucosas.

−

3 órdenes, una familia y otros géneros, dependiendo del contenido en %G+C:

171

ORDEN I: CYTOPHAGALES FAMILIA CYTOPHAGACEAE

−

La mayoría son formas unicelulares, a excepción de Saprospira que es filamentosa.

−

%G+C = 30-50.

−

Ocasionalmente presentan pigmentos del tipo carotenoide, responsables del color de las colonias.

−

Presentan propiedades nutricionales importantes: pueden hidrolizar y crecer a expensas de diversos polisacáridos (quitina, agar, celulosa).

−

Hábitat: agua, suelo.

♦

Cytophaga: bacilo bastante largo y delgado que produce enzimas que degradan compuestos como la celulosa, agar o quitina. Estas enzimas están unidas a la pared celular, no son secretadas al exterior. Se adhieren a la fibra de celulosa. Hay especies que son patógenas de peces y otras son patógenas de Flexibacter.

♦

Sporocytophaga: junto con Cytophaga son los principales responsables de la degradación de celulosa en ambientes óxicos. Producen microcistes, que son formas de resistencia.

♦

Flexibacter: bacilos estrechos y delgados, que se encuentran aislados o formando cadenas cortas. Muchas especies son parásitas de peces de agua dulce.

♦

Saprospira: bacteria filamentosa helicoidal.

ORDEN II: LYSOBACTERALES FAMILIA LYSOBACTERIACEAE

−

%G+C = 69-71.

♦

Lysobacter: produce enzimas líticas extracelulares capaces de degradar el peptidoglucano de otras bacterias. Es considerado, además, alguicida y responsable de la destrucción de cianobacterias en las poblaciones naturales.

ORDEN III: BEGGIATOLES

172

FAMILIA BEGGIATOACEAE

−

%G+C = 40-55.

−

Formas filamentosas cilíndricas que oxidan sulfuros y forman depósitos intracelulares de azufre.

−

Hábitat: ambientes ricos en sulfuros (aguas polucionadas, residuales).

♦

Beggiatoa: forma filamentos cilíndricos y anchos. Cilindros formados por células estrechamente unidas extremo con extremo. Se flexionan y se retuercen estos filamentos formando como mechones. Es mixotrofa, pero algunas cepas son quimiolitoautotrofas (algunas pueden fijar CO2). Se pueden encontrar en las raíces de algunas plantas como en arroz, que se cultiva en fangos. Oxidan sulfuros y, a cambio, la bacteria se beneficia de la baja PpO 2 que la planta tiene en esa zona de la raíz. Es una relación mutualista.

♦

Thioploca: bacteria filamentosa, constituida por células que forman filamentos largos rodeados por una vaina.

♦

Thiothrix: bacteria filamentosa. Formas filamentosas rodeadas también de vaina que se agrupan formando rosetas. De los extremos de estas estructuras se pueden liberar gonidios (formas de dispersión). Es una bacteria mixotrofa que vive en ambientes ricos en sulfuros, en sistemas de tratamiento de fangos residuales y en corrientes de agua ricas en azufre. Requieren sulfuros y compuestos orgánicos como fuente de carbono. El azufre lo depositan en forma de glóbulos en el interior de la célula. OTROS FAMILIA SIMONSIELLACEAE

−

Formas filamentosas planas.

♦

Simonsiella: vive en aguas o suelos muy húmedos. También aparece como comensal en la cavidad oral del hombre y otros animales. OTROS GÉNEROS −

Son géneros que no encajan en los grupos anteriores.

♦

Vitreoscilla: bacterias filamentosas cilíndricas, más o menos rectas.

173

♦

Leucothrix: bacterias filamentosas cilíndricas más o menos rectas. No tienen color y forman filamentos inmóviles, que no se deslizan: sin embargo, sí lo hacen los gonidios. Habita en el mar, es epífito de algas marinas. Se puede considerar como la versión quimioheterotrofa de Thiothrix. Se unen a los sustratos mediante un disco adhesivo fijador, formando un conjunto en forma de roseta. Se dividen por fragmentación. Liberan de los extremos de los filamentos unas células que se redondean, y que son las que entran en contacto con alguna superficie y las que presentan movilidad por deslizamiento. Los gonidios son formas de dispersión. Cuando aumenta el número de gonidios, éstos se agregan por atracción mutua, lo que permite que comiencen a sintetizar el disco fijador y a adherirse a una superficie para constituir las estructuras con forma de roseta. La filogenia de las bacterias deslizantes no fotosintéticas no frutescentes es muy diversa. Son ɣproteobacterias.

ʘ

BACTERIAS DESLIZANTES FORMADORAS DE CUERPOS FRUCTÍFEROS

−

Constituyen el orden Myxococcales, formado por bacterias quimioheterotrofas aerobias, Gram-, con un %G+C cercano al 70%.

−

Bacterias terrestres: presentes en suelos de todo el mundo (bosque tropical, tundra ártica,…). Son más abundantes en las zonas cálidas.

−

Ciclo de vida muy notable: procariotas.

para algunos autores es el ciclo de vida más complejo en los

−

La capacidad de deslizamiento la tienen las células vegetativas, que son bacilos alargados muy flexibles. Dejan un rastro de limo o material mucoso.

−

El ciclo vegetativo dura mientras tengan la fuente nutritiva, que pueden obtener mediante lisis de otras bacterias.

−

Se dividen por fisión binaria.

−

Forman colonias planas, que se van extendiendo con irregularidades en el contorno. La parte externa está formada por las células de las bacterias que se van deslizando sobre el sustrato, dejando el rastro de limo. Las que van detrás lo aprovechan para desplazarse. −

El deslizamiento es bastante coordinado.

−

Presentan cuerpos fructíferos:

− Es un proceso de esporulación iniciado cuando se agotan los nutrientes. Es un proceso de diferenciación bastante complejo, desencadenado por 5 señales distintas.

174

− El cuerpo fructífero puede ser pedunculado. Son formas de esporulación, de células inactivas, llamadas mixosporas, que son consecuencia de la transformación de células vegetativas. Son exosporas de resistencia alta, aunque no tanto como las endosporas. − La forma, tamaño, color,… de las mixosporas es variable.

− Microcistos: mixosporas capsuladas. − Cisto: varias mixosporas rodeadas por una pared. Son pluricelulares. − Tanto la formación de microcistos como de cistos tiene carácter sistemático. − Bajo determinadas condiciones, las mixosporas pueden germinar y formar colonias de nuevas células vegetativas deslizantes.

− La formación de cuerpos fructíferos puede ser ventajosa porque estos microorganismos

obtienen nutrientes por secreción de enzimas hidrolíticas, y luego tienen que absorber el resultado de esta lisis. Un grupo de células puede secretar mayor concentración de enzimas, lo que les permite degradar más fácilmente cualquier presa.

− Las células vegetativas pueden convertirse en mixosporas sin pasar por la etapa de cuerpo fructífero mediada por ciertos inductores químicos.

−

Metabolismo respiratorio: quimioheterotrofas. Los productos de digestión son péptidos pequeños. La mayoría utiliza aminoácidos.

−

Las colonias suelen tener color por la presencia de carotenoides, principalmente glucosídicos, que les proporcionan fotoprotección.

−

Existen 2 grupos de Mixococcales:

a) Bacteriolíticas: Myxococcus (M. xanthus). Aparecen en suelos, heces de animales,… b) Celulolíticas:

Polyangium

(hexosas).

Aparecen

sobre

la

materia

vegetal

en

descomposición.

−

Por las diferencias morfológicas de la célula vegetativa, la forma de las mixosporas y la estructura de los cuerpos fructíferos, se establecen 4 familias:

− Familia I: Mixococcaceae. − Mixosporas redondeadas, esféricas u ovales. − Pedúnculo no siempre presente, dependiendo de la especie. − Familia II: Archangiaceae. − Mixosporas con forma de bastoncillos. −No forman tallos.

175

− Familia III: Cystobacteraceae. −No siempre forman pedúnculos. − Forman cistos.

− Familia IV: Polyangiaceae. −No tienen pedúnculo. − Mixosporas ovales o con forma de bastoncillos. − Son celulolíticas, degradan la celulosa y el agar.

♦ Nannocystis:

es excepcional porque carece de carotenoides glucosídicos típicos, y es una bacteria muy frecuente en el suelo. Como muchos actinomicetos, producen geosminas, que es un producto aromático con fuerte olor terroso, responsable del olor a “tierra mojada”.

−

Las 3 primeras familias tienen células vegetativas en forma de bacilos delgados y fusiformes; la familia IV presenta células vegetativas en forma de bacilos gruesos con extremos redondeados.

−

Desde el punto de vista filogenético, las mixobacterias pertenecen al grupo de las δproteobacterias.

176

TEMA 25: ARCHAEA

−

Constituyen una división distinta de los procariotas: la división cuarta o de los Mendosicutes.

−

Presentan una enorme heterogeneidad genética, que se manifiesta en los bajos valores en los coeficientes de semejanza.

−

Presentan una considerable antigüedad: escasa variabilidad a lo largo del tiempo de evolución. Es a lo que deben el nombre de Arqueas.

−

Según el Bergey se establecen 5 grupos de Arqueas:

I. II. III. IV. V.

Arqueas Arqueas Arqueas Arqueas Arqueas

metanogénicas. sulfatoreductoras. halófilas extremas. sin pared celular. termófilas extremas metabolizantes de azufre.

♦

Nanoarchaea: se descubrió en el 2002. Mide 0,4 μ de diámetro y viven pegados a la superficie de una arquea denominada Ignicoccus por una relación simbiótica. Resulta peculiar por sus ribosomas, ya que son diferentes al de bacterias, arqueas y procariotas, pero son más similares a las de arqueas. Características generales a todas las arqueas:

177

1.

Hábitat: todo tipo (terrestres, acuáticas,…) pero sobre todo en ambientes extremos. Podemos calificarlos como extremófilos. Algunos son simbiontes.

2.

Requerimiento de oxígeno: pueden ser aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos.

3.

Fuente de carbono y energía: quimioheterotrofos facultativos.

pueden ser quimioheterotrofos, quimiolitotrofos o

4.

Temperatura óptima de crecimiento: son mesófilas o termófilas. Muchas de ellas son termófilas (viven a temperaturas superiores a 100º).

5.

Lípidos: presentan una característica exclusiva de arqueas, ya que están formados por unidades de isoprenil-glicerol unidas por enlaces éter (lo normal en bacterias y eucariotas son glicerolípidos unidos por enlaces éster a ácidos grasos). El átomo central de carbono de la molécula de glicerol es esteroisoméricamente D en eucariotas y bacterias pero L en arqueas. Las cadenas R o laterales pueden ser en arqueas:

− −

Diéter: los más habituales tienen 20 carbonos. A esta cadena se le llama fitano. Tetraéter: tienen 40 átomos de carbono y a la cadena se le conoce como bifitano.

La presencia de lípidos isoprenil-glicerol con enlace éter puede ser origen de prevalencia en ambientes extremos, ya que el enlace éter es mucho más estable químicamente que el éster.

6.

Biosíntesis de lípidos: sintetizan una baja cantidad de ácidos grasos pero una alta cantidad de hidrocarburos en comparación con bacterias y eucariotas.

7.

Envueltas: las arqueas metanogénicas muestran gran diversidad de envueltas o paredes celulares. Algunas, como las arqueas metanogénicas halófilas extremas y todas las termófilas extremas, presentan unas simples capas superficiales de naturaleza proteica o lipoproteica:

−

Capa S (capa paracristalina de simetría hexagonal): no es exclusiva de arqueas pero está presente en algunas arqueas metanogénicas (Methanospirillum y Methanothrix). Son microorganismos que forman largas cadenas de células con espacios entre célula y célula y que está rodeada por una vaina.

−

Envuelta celular rígida: constituida en unos casos por un heteropolisacárido (Methanosarcina, Halococcus) y en otros casos por un análogo al peptidoglucano, la pseudomureína o pseudopeptidoglucano, presente en el orden Methanobacteriales, dentro de las arqueas metanogénicas. Es un polímero de NAG y NAG-calosaminurónico unidos por un enlace β(1-3), que es resistente a la lisozima. Todos los aminoácidos de las cadenas tetrapeptídicas son del tipo L. La falta de peptidoglucano no es algo que nos sorprende ni está restringida a las arqueas, ya que también se da en Pasteuria y Thermomicrobium roseum.

−

El rRNA diferencia en dominios a arqueas, bacterias y eucariotas: las secuencias 5S, 16S y 23S son distintas en arqueas a las de bacterias y eucariotas. Los trabajos de secuenciación de la subunidad 16S, iniciados por Woese en los años 80, fueron los que demostraron la separación filogenética con las bacterias. Por aquel entonces se denominaban eubacterias.

178

−

El tRNA también es diferente. La diferencia reside principalmente en el brazo T: donde las bacterias tienen ribotimidina, las arqueas tienen pseudouridina o 1-metil-pseudouridina. Otros nucleótidos minoritarios de los tRNA de arqueas tienen características de eucariotas: el 1-metiladenosina, presente en eucariotas y arqueas pero no en bacterias.

−

Síntesis proteica: el tRNA iniciador en eucariotas, el metionil-tRNA, es igual que en arqueas, pero en bacterias es distinto. Similitudes entre eucariotas y arqueas:

− EFII: es igual en arqueas y eucariotas. − tRNA: coinciden algunos genes en eucariotas y arqueas. − Secuencias de aminoácidos de algunas proteínas ribosomales. −

Complejidad de las RNA-polimerasas: en las arqueas son enzimas multiméricas complejas similares a las de eucariotas. Las RNA-polimerasas de bacterias son αα2-ββ, mientras que en arqueas hay varios tipos de RNA-polimerasas y su estructura es más compleja que la de las bacterias. En las arqueas metanogénicas y halófilas, las RNA-polimerasas tienen 8 polipéptidos (5 de gran tamaño y 3 más pequeños), mientras que en arqueas hipertermófilas es más compleja aún, y se compone de, al menos, 10 polipéptidos distintos. En eucariotas, la principal RNA-polimerasa contiene de 10-12 polipéptidos, y sus tamaños relativos se parecen bastante con los de arqueas hipertermófilas. El antibiótico rifampicina interfiere de manera específica con la subunidad β de la RNA-polimerasa de bacterias, inhibiendo el crecimiento de bacterias. Es tal el parecido en la maquinaria de traducción de eucariotas y arqueas que se han podido “fabricar” ribosomas híbridos (semejanza estructural y semejanza funcional).

− −

Un híbrido con una unidad 50S de una arquea y una 40S de una levadura es funcional. Un híbrido con una subunidad 50S de E. coli y una 40S de una levadura no es funcional.

ʘ

ARQUEAS METANOGÉNICAS

−

Determinado grupo de arqueas que, como consecuencia de su metabolismo, generan metano.

−

Son anaerobias estrictas.

−

El metano se produce en la mayoría de ambientes anóxicos carentes de sulfatos, como por ejemplo:

− Digestores de aguas residuales: en plantas purificadas de agua, el metano se obtiene como un subproducto. − Tracto digestivo de animales: aparecen en enormes cantidades en las termitas. − Sedimentos anóxicos: charcas y lagunas con abundante material orgánico en descomposición.

− En la naturaleza, la producción de metano a partir de sustancias orgánicas complejas es el último

eslabón de una cadena trófica que implica a muchos organismos distintos. El desarrollo de las arqueas metanogénicas se limitan a que existan compuestos que puedan utilizar para generar metano (H y CO2 a

179

la vez, acetato, metanol, formaldehido, fórmico,…). A pesar de que la producción de metano está muy extendida, no son tantos los compuestos que pueden ser utilizados para formar metano. La metanogénesis es un proceso que depende de estos pocos compuestos de carbono, que a su vez deben ser producidos por otros organismos a partir de materia orgánica compleja. - DIVERSIDAD DE ARQUEAS METANOGÉNICAS -

−

Existen 5 órdenes atendiendo al rRNA 16S.

−

Son muy variados morfológicamente: cocos, espirilos, bacilos,… que, generalmente, están aislados pero también pueden formar agregaciones como sarcinas. −

Estructura diversa.

- FORMACIÓN DE METANO -

−

Fuente de carbono: es CO2 básicamente. Lo utilizan autotróficamente pero algunos catabolizan diversos compuestos de un carbono (formol, metaldehído,…) además del CO2. Algunos necesitan un aporte exógeno de compuestos orgánicos como el acetato.

−

Fuente de poder reductor: es, básicamente, el hidrógeno, aunque pueden ser otros (fórmico, CO, Fe0,…).

−

Sustratos para generar metano: el principal es el CO 2, aunque no es el único. Hay 3 clases de sustratos metanogénicos:

− Sustratos del tipo CO2: como el propio CO2, CO y el fórmico (HCOOH). − Sustratos con grupos metilo: metanol, metilamina. − Acetato: a partir del cual se genera metano (“reacción acetotrófica”). Sólo lo realizan 2 géneros de arqueas: − −

Methanosarcina Methanothrix

Es un proceso importante desde el punto de vista ecológico, ya que se produce en medios donde no existe competencia excesiva de acetato entre los metanogénicos y los organismos reductores del sulfato. Aunque se han identificado muy pocos acetotrófilos, se calcula que aproximadamente 2/3 del metano generado en la metanogénesis a partir de fangos activados procede del acetato y sólo 1/3 procede del CO2 + H2.

−

Las arqueas metanogénicas son especiales también respecto a los coenzimas que utilizan, que son exclusivas de este grupo de procariotas y esenciales en la generación de metano y energía. Estos coenzimas están presentes en mayores concentraciones que otros coenzimas. Tipos de coenzimas:

180

1.

Portadores de C1:

a)

Metanofurano (MF): contiene un anillo furanósico, que transporta los restos formilo (HCO) desde el CO2 hasta el siguiente coenzima, que es la metanopterina.

b)

Metanopterina o tetrahidrometanopterina (MP): estructura similar a la del ácido fólico. Presenta fluorescencia azul brillante tras absorber luz a 342nm. es el coenzima que actúa en el mayor número de reacciones de la metilreductasa.

c)

Coenzima M (CoM): la forma activa es el 2-mecaptoetanosulfónico o ditiodietanosulfónico. Es más pequeño y la estructura es más simple. Presenta una enorme especificidad en la reacción de la metilreductasa. Es un coenzima muy ácido y presenta una elevada concentración de azufre para su tamaño molecular. Es el portador del grupo metilo e interviene en el paso final. Existe un análogo: el bromoetanosulfónico, análogo estructural y potente inhibidor del CoM. Inhibe el crecimiento de arqueas metanogénicas. Como el CoM es exclusivo de estos organismos, el bromoetanosulfónico se utiliza para inhibir específicamente la metanogénesis en estudios de degradación anóxica.

d)

Coenzima F430 (CoF430): presenta una estructura tetrapirrólica con un níquel. Es un coenzima amarillo, soluble y absorbe luz a 430 nm pero no produce fluorescencia. No es estrictamente un transportador C1 pero cumple un papel importante en el paso final, ya que es un cofactor del sistema metilreductasa, que es el último paso.

2.

Coenzimas que intervienen en las reacciones de oxidación-reducción (donadores de electrones):

a)

Coenzima F420 (CoF420): es un derivado de la flavina, con una estructura similar al flavínmononucleótido (FMN). La forma oxidada absorbe luz a 420 nm y presenta fluorescencia azulverdosa. Cuando pasa a la forma reducida pierde el color. Presenta, además, otras funciones.

b)

Coenzima 7-mecaptoheptanoiltreoninafosfato (CoB): tiene una estructura similar al ácido pantoténico, que es parte del CoA. El CoB interviene, al igual que el CoM, en el último paso, en el sistema metilreductasa. La ruta general de la formación de metano está mediada por distintos pasos en los cuales intervienen las coenzimas anteriormente dichas. El metanofurano activa el CO2, reduciéndolo hasta formilmetanofurano. El resto formilo que se ha unido al metanofurano va a ser transferido a la metanopterina. Este resto formilo va a ser deshidratado y reducido en 3 etapas*.

Etapa 1 HCO

Etapa 2 ≡ CH

Etapa 3 = CH2

181

- CH3

Los electrones los dona el CoF420. El resto metilo pasa de la metanopterina al CoM. El metil-CoM, con su resto metilo, se reduce finalmente a metano por acción de la metilreductasa. Es el último paso, en el que participa el CoF430 y el CoB. Además de metano, se forma un heterodisulfuro, constituido por el CoM y el CoB. Tanto uno como otro quedarán finalmente libres y regenerados. Será el hidrógeno quien ceda los electrones para que se rompa ese heterodisulfuro. * En las fotocopias sólo aparecen 2 etapas. - BIOSÍNTESIS La fijación de CO2 es una autotrofía. El CO2 es una fuente de metano y carbono, y se convierte en compuestos orgánicos por la vía de la acetilCoA. Las arqueas metanogénicas utilizan la vía del acetilCoA acoplándola a la vía de formación de metano. Integran estas 2 vías porque comparten intermediarios. Tanto la vía de metanogénesis como la biosintética tienen o producen restos metilo: para la biosíntesis obtienen los restos metilo para producir acetato a partir de la vía metanogénica. La metilmetanopterina le va a ceder este resto metilo a la vía biosintética, a través de una enzima corrinoide (Cor), que contiene un anillo de corrina, similar al de porfirina pero con un cobalto en el centro. Cor va a transferir el resto metilo a la CO-Dhasa, que, previamente, ha reducido el CO2 a CO. Probablemente acoplan ambas vías para ahorrar energía. - OBTENCIÓN DE ENERGÍA La última parte de la ruta metanogénica es la que va a permitir la obtención de energía. CO2 + H2

CH4 + 2 H2O

En condiciones naturales, la concentración de hidrógeno es muy baja (ΔGo = -30). Esto implica que se forma poco ATP (sólo 1 ATP por cada CO2 que se reduce a CH4), pero se forma más porque el último paso de la ruta metanogénica es un paso de conservación de energía. El heterodisulfuro (CoM + CoB) se tiene que reducir, y los electrones proceden del F420 (red), procedente, normalmente, del hidrógeno. Esta reacción de reducción del heterodisulfuro está catalizada por la heterodisulfuro-reductasa; es una reacción exergónica, porque está asociada a una expulsión de protones a través de la membrana.

182

La metanofenacina (MPH) es un transportador de electrones de la membrana que capta los electrones del F420 y se los cede al heterodisulfuro, que, finalmente, se los cede a la heterodisulfuro-reductasa. La formación de metano dentro de la célula va a actuar a manera de sumidero de protones. Esto permitirá la formación de una fuerza protomotriz que favorece la formación de ATP. Si se interrumpe la formación de metano, estas arqueas pueden seguir viviendo, ya que la formación de metano no es indispensable para formar ATP. Parece ser que todas las arqueas metanogénicas son universalmente capaces de utilizar el azufre como aceptor final de electrones (“Reacción del azufre”). Cuando crecen en presencia de azufre, muchos cesan virtualmente la producción de metano, pero otros no. Cuando crecen en presencia de compuestos con restos metilo, además de actuar la bomba de protones, actúa también una bomba de sodio en la membrana, que es necesaria para la carboxilación del metanofurano en la metanogénesis. - HÁBITAT Están localizadas al final de una cadena trófica en los ambientes anaerobios, donde los compuestos pueden proceder tanto del metabolismo de microorganismos anaerobios como de la degradación de la biomasa de organismos aerobios y anaerobios que llegan a esos ambientes. La producción de metano requiere la participación de muchos microorganismos anaerobios, capaces de degradar celulosa, hemicelulosa, lignina,… a CO2, acetato, etc. que ya pueden ser utilizados por las arqueas metanogénicas. En plantas de tratamiento de aguas residuales y pozos resulta rentable la producción de metano y la obtención del gas natural. El paso limitante a la hora de formar metano en estos ambientes no es la falta de CO2, ya que es muy abundante tanto en los carbonatos como disuelto en agua. Tan pronto haya hidrógeno en el ambiente pueden prosperar las arqueas metanogénicas, siempre que no haya sulfatos, ya que entonces crecerían las bacterias sulfatoreductoras. El metano es un gas escasamente soluble en agua, por lo que no se disuelve y se escapa del ambiente anóxico. Parte de este metano biogénico escapa a la atmósfera, donde es oxidado fotoquímicamente hasta CO2, con un valor de vida media de 3-6 años. El resto del metano no llega a la atmósfera, porque, conforme vaya subiendo la columna de agua, va a pasar a un ambiente aerobio, y será rápidamente utilizado por organismos metanotrofos. La interfase aerobiaanaerobia es una zona de gran concentración de microorganismos. La metanogénesis tiene un lado positivo y otro negativo:

−

−

Positivo: es de gran importancia económica, porque el metano es un combustible de quemado limpio y una fuente de energía muy buena. Gran parte del gas natural es metano. Por unidad de energía producida es la energía más limpia y menos contaminante. Negativo:

− Ocasiona un problema ecológico importante: el cambio climático y el calentamiento global. El

metano, cuando es irradiado por la luz infrarroja, actúa como un gas invernadero. La concentración de metano ha ido aumentando en los últimos años.

183

− Los metanógenos pueden oxidar el Feo para generar metano y obtener energía, por lo que pueden

ocasionar corrosión en materiales enterrados o sumergidos en condiciones anaeróbicas (tuberías, …).

ʘ

ARQUEAS HALÓFILAS EXTREMAS

−

Aerobias y quimioheterotrofas. Algunas cepas del género Halobacterium también pueden crecer en condiciones anóxicas fermentando o llevando a cabo respiración anaeróbica. Normalmente llevan a cabo respiración aeróbica empleando habitualmente aminoácidos y ácidos orgánicos, aunque también pueden emplear azúcares.

−

En el Bergey, aparecen en la sección IV.

−

Viven en ambientes hipersalinos (salinas, lagos salados, salmueras,…). Las manchas en el pescado seco y las pieles tratadas con sal se deben a ellos. −

No son patógenos.

−

Son responsables del color rojo o púrpura-rojizo de las salinas.

−

No son los únicos que viven en ambientes hipersalinos:

♦ ♦

Dunaliella: alga fototrofa oxigénica, casi el único que puede encontrarse en este ambiente. Ectothiorhodospira: bacteria roja que predomina en lagos muy alcalinos.

En ambientes hipersalinos abundan también los sulfatos: habrá bacterias sulfatoreductoras (producen sulfuros, que permiten que puedan desarrollarse bacterias del azufre). No viven plantas pero viven animales como Arthemia salina, moscas de la salmuera,… y microorganismos procariotas a parte de arqueas, como bacterias halófilas (Halobacteroides, Haloanaerobium,…). - MORFOLOGÍA Presentan una morfología variada, que puede ser:

− Formas inmóviles (Halococcus). − Bacilos móviles con un flagelo polar (Halobacterium).

184

−

Requerimientos nutricionales: necesitan 1,5-2,5M de NaCl como mínimo. La concentración óptima oscila entre 3-4M. Requieren una alta concentración de sodio y magnesio, que es muy alta comparada con otros microorganismos (0,025M). Además, la concentración de sales interna es mayor que la externa, y de distinta composición. Estos organismos no es que toleren altas concentraciones de NaCl, sino que la necesitan, ya que sus componentes celulares lo requieren. Sus enzimas requieren altas concentraciones de potasio, y son enzimas muy ácidas. En resumen, requieren:

− −

Altas concentraciones de potasio intracelular y de sodio extracelular. Que la concentración de potasio intracelular sea mayor que la de sodio extracelular.

Además, el sodio no puede ser sustituido por otro similar. La pared de Halobacterium necesita sodio, y si no lo obtiene, la pared puede romperse. Contiene glucoproteínas, que presentan altas concentraciones de aminoácidos ácidos. Las cargas negativas de estos aminoácidos ácidos resultan de algún modo estabilizados por el sodio. Los solutos compatibles contrarestan la tendencia de la célula a perder agua. La bacteria los sintetizan y se acumulan sin modificar el metabolismo celular.

♦

Halobacterium: presentan una organización genómica bastante peculiar, que se compone de una alta proporción de DNA repetido, plásmidos grandes que contienen del orden del 25-30% de todo el material genético de la arquea. El %G+C del plásmido (57-60%) es distinto al del DNA cromosómico (6668%). Vive en medios que para otras células serían altamente estresantes, y no generan solutos compatibles. Evita la pérdida de agua bombeando potasio del exterior al interior, con gasto de energía. Emplean un ión inorgánico a modo de soluto compatible. La mayoría presenta metabolismo respiratorio estricto, pero algunas cepas, como H. salinarium, pueden generar ATP por una fotofosforilación diferente, pero que no deja de ser fotofosforilación. Carecen de clorofilas y bacterioclorofilas. En condiciones de escasa aireación, sintetizan e insertan en la membrana una cromoproteína llamada bacteriorodopsina, que es capaz de captar la luz. Características de la bacteriorodopsina:

−

Semejanza estructural y funcional con la rodopsina (pigmento del ojo de animales).

−

Se compone de 248 aminoácidos que forman 7 cadenas α que se disponen formando un poro al atravesar la membrana.

−

Presenta una parte proteica y un cromóforo.

−

Contiene un carotenoide de 20 átomos de carbono denominado retinal, que es la parte responsable de absorber luz y catalizar el paso de electrones por la membrana.

−

La membrana es de color púrpura en condiciones de baja aireación debido al retinal; en condiciones normales es de color anaranjado.

185

−

El último aminoácido es la Lys. El grupo amino –ε es el que va a reaccionar con el grupo amino del retinal.

−

La bacteriorodopsina absorbe la luz y el retinal pasa de trans a cis. A la vez que hace eso, se transfiere un protón fuera de la membrana y vuelve a la forma trans, que es la configuración estable. La salida de protones provoca un acúmulo de protones fuera de la membrana, hasta que la membrana está lo suficientemente cargada como para dirigir la síntesis de ATP por una ATPasa de membrana. Aunque pueden generar ATP cuando las condiciones de aireación son escasas, no crecen, porque necesitan oxígeno para formar el retinal, pero les permite mantenerse vivos. La PpO2 suele ser menor de 0,2 mg/l en aguas salinas. Esta fosforilación también es responsable de la salida de sodio fuera de la célula, ya que es un sistema antiporte que permite la salida de sodio mientras que entra potasio. La entrada de aminoácidos a la célula está dirigida por la luz indirectamente porque el aporte de aminoácidos tiene lugar por la incorporación de sodio mediante un sistema simporte. Debe retirarse a la vez sodio del interior. La membrana púrpura se emplea, al ser fotocrómica y reutilizable, para el almacenamiento holográfico de información. Halobacterium tiene 4 rodopsinas:

a)

Bacteriorodopsina: impulsa la salida de protones para sintetizar ATP.

b)

Halorodopsina: utiliza la luz para transportar cloro al interior. El potasio debe estar equilibrado con el cloro.

−

c)

Fotoreceptor de luz roja que le sirve para situarse a un nivel adecuado de luz.

d)

Fotoreceptor de luz azul.

ʘ

ARQUEAS TERMOACIDÓFILAS

Todas son termófilas pero no todas acidófilas.

186

TEMA 26: ACTINOMICETOS

−

Bacterias Gram+ y quimioheterotrofas.

−

Morfología filamentosa: ramificado. −

tienden a formar hifas y micelios. Presentan un crecimiento

“Myces” = hongo.

−

Los menos evolucionados tienen un desarrollo micelial incompleto, presente sólo en el crecimiento activo. Los más evolucionados presentan 2 tipos de micelio:

− Micelio de sustrato (rizoides). − Micelio fuera del sustrato (aéreos). −

Si presentan esporas, éstas se sitúan en el extremo de los micelios aéreos.

−

En un corte transversal de una colonia, podemos ver al mismo tiempo las distintas fases de esporulación:

− Centro: zona de inicio de la colonia, donde existe una privación de nutrientes y esporas maduras. − A medida que nos alejamos del centro: distintas fases de maduración de esporas. − Superficie: nutrientes, esporas.

187

−

La mayoría son inmóviles: si hay movimiento, se limita a las esporas flageladas (zoosporas).

−

Pared celular: existe una enorme variedad, más de 60 tipos distintos de paredes celulares dependiendo del tercer aminoácido, presencia o ausencia de puentes interpeptídicos, azúcares,… El tipo de pared tiene carácter sistemático.

−

%G+C: margen reducido (63-78%). Los que se encuentran cerca del 78% tienen el %G+C más alto conocido entre las bacterias.

−

Reproducción asexual: por crecimiento apical de las hifas mediante esporas asexuales.

− Conidiosporas. − Esporangiosporas. −

La esporulación se produce por formación de tabiques. La esporulación está asociada a condiciones de privación de nutrientes. −

No son muy resistentes a la temperatura pero sí a la desecación.

−

Son típicos microorganismos de vida libre en el suelo en general.

−

Participan en la mineralización de la materia orgánica.

−

Algunos son patógenos de animales o plantas.

−

Producción de antibióticos: son bacterias de gran importancia industrial por ser los mayores productores de antibióticos junto con Bacillus y hongos eucariotas.

−

Se dividen en 8 secciones (sólo vamos a ver 4).

ʘ

SECCIÓN I: ACTINOMICETOS NOCARDIFORMES

−

También aparecen en la sección XVII.

−

Producen conidiosporas.

−

El género más conocido es Nocardia.

GÉNEROS

ʘ

NOCARDIA

188

−

Morfología similar a Actinomyces, pero se diferencian en que Nocardia es aerobia y Actinomyces es anaerobia aerotolerante.

−

Micelio aéreo reducido / Micelio de sustrato fragmentable (utilizado en la reproducción).

−

Pared celular: Micobacterias.

poseen ácidos micólicos (50-60C), más cortos que los que presentan las

−

Utilizan una gran variedad de átomos de carbono y ceras.

−

Cat+

−

Hábitat: la mayoría son saprófitos de vida libre, que aparecen en el suelo y en el agua. Otros son patógenos oportunistas (Nocardia asteroides) que causan en hombres y animales nocardiosis (sintomatología variada, porque puede afectar a distintos órganos, aunque la más común es la nocardiosis pulmonar, que es difícil de tratar, y desde los pulmones pasa al cerebro, piel, articulaciones, corazón,…).

ʘ −

SECCIÓN II: ACTINOMICETOS CON ESPORANGIOS MULTILOCULARES

Géneros: − Geodermatophillus − Dermatophillus − Frankia

−

Presentan sólo micelio de sustrato.

−

Forman esporas a partir de una masa de células que se dividen al azar, formándose racimos de esporas. −

cat+.

−

Aerobios, aunque Dermatophillus y Frankia tienden a ser microaerófilos.

−

Se diferencian a nivel de la velocidad de crecimiento.

Geodermatophillus

Dermatophillus + velocidad de crecimiento

189

Frankia

GÉNEROS

ʘ

GEODERMATOPHILLUS

−

Fase filamentosa escasa, muy rudimentaria.

−

El tallo completo es casi todo esporangio.

−

Presenta zoosporas con penachos de flagelos polares.

ʘ

DERMATOPHILLUS

−

Formación filamentosa de moderada a extensa.

−

Las hifas se convierten también casi por completo en esporangios multiloculares.

−

Presenta zoosporas.

ʘ

FRANKIA

−

Filamentación muy extensa, con hinchamientos que pueden aparecer en distintas zonas y que finalmente pueden liberarse como esporas inmóviles.

−

Hábitat: en raíces de plantas no leguminosas, formando nódulos (intra o extracelulares) capaces de fijar nitrógeno (por ejemplo, en el Almus,…). Existe una relación “especie de Almus – especie de Frankia”. El proceso de fijación de nitrógeno es similar al de Rhizobium. La nitrogenasa es también sensible al oxígeno y se protege en vesículas o zonas hinchadas de las plantas.

ʘ −

SECCIÓN III: ACTINOPLANETOS

Géneros: − Actinoplanes − Micromonospora

−

aéreo.

Micelio a menudo pigmentado, ramificado y tabicado, que no se segmenta, y escaso micelio

− Hábitat: suelo (muchos tipos de suelo diferentes), agua dulce, marina, degradación de materia orgánica,…

190

GÉNEROS

ʘ

ACTINOPLANES

−

Presenta esporangios que surgen del micelio de sustrato y se forman por un crecimiento y enrollamiento del micelio. Son zoosporas.

−

Aerobios estrictos.

ʘ

MICROMONOSPORA

−

Se encuentra en este apartado porque su rRNA 16S es similar al de Actinoplanes y otros géneros, pero no tiene el mismo desarrollo. −

No tienen esporangios.

−

Aerobios estrictos, excepto alguna cepa que es anaerobia y fermenta celulosa.

ʘ

SECCIÓN IV: ESTREPTOMICETOS

− El género principal es Streptomyces.

GÉNEROS

ʘ

STREPTOMYCES

−

Más de 500 especies, todas muy relacionadas (%G+C oscila entre 69-73%).

−

Morfología: micelio aéreo y de sustrato no fragmentable.

− Filamentos de diámetro de 0,5-1 μ, longitud indefinida y que a menudo carecen de paredes celulares transversales.

−

Crecimiento: a partir de extremos de los filamentos. Suelen ir acompañados por ramificación. Forman colonias muy compactas, enroscadas y muy pegadas al sustrato. Los filamentos aéreos se denominan esporóforos, y se proyectan por encima de la superficie de la colonia.

191

−

Esporas inmóviles que se sitúan en los extremos de las hifas aéreas (conidiosporas). Se producen por la formación de tabiques en los esporóforos multinucleados. La forma de las esporas (lisa, con pelos, verrugosa… ) y su disposición son caracteres sistemáticos. Las esporas suelen estar pigmentadas, dando color a la colonia. Otras veces el color de la colonia se debe al color de los micelios.

−

El aspecto compacto y el color de la colonia hacen que sea fácil identificarlas.

−

Nutricionalmente, son microorganismos muy adaptables, con pocos requerimientos. Emplean muchos compuestos (aromáticos, aminoácidos, azúcares,…) incluso otros compuestos difícilmente utilizables por otros microorganismos (caucho, queratina, peptina, taninos, lignina, látex,…), para lo que tienen enzimas especiales que degradan estos compuestos.

−

Son aerobios estrictos.

−

El crecimiento en cultivo líquido se estimula por una aireación forzada. Sólo veremos esporulación si no se agita el medio, o si el medio es sólido.

−

Salvo excepciones, no son patógenos.

♦ ♦

Streptomyces scabies: produce la “roña de la patata”.

S. somaliensis: en el hombre, produce una enfermedad llamada “actinomicetoma”, que es una enfermedad cutánea que conduce a la formación de abscesos, infecciones, descalificación ósea,… si no se trata.

♦

S. albus: se ha aislado en pacientes con diversas dolencias y puede ser patógeno.

−

Hábitat: viven principalmente en suelos alcalinos y neutros, que son más favorables para su desarrollo que los suelos ácidos. El olor terroso de los suelos se debe a metabolitos denominados geosminas, producidos entre otros por actinomicetos. Las geosminas son compuestos que forman anillos no saturados de carbono, oxígeno y nitrógeno. − Aislar estos microorganismos es fácil: se diluye una muestra de suelo con agua estéril, se pone en un medio y se incuba a 25ºC durante una semana. - PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Aproximadamente el 75% de los antibióticos conocidos son producidos por actinomicetos, y especialmente por el género Streptomyces. Las colonias adyacentes a estas bacterias suelen morir por estos antibióticos. Se llevan a cabo numerosos estudios por su importancia médica. Se han encontrado miles de sustancias con efecto antibiótico (se descubren unas 300 al año). La mayoría no son útiles porque no son selectivamente tóxicas y afectan a organismos vivos. Sólo se utilizan unas 50 de todas las que se han descubierto. Algunos microorganismos producen varios antibióticos distintos, que pueden no tener relación química entre ellos.

♦

S. griseus: gran productor de antibióticos, que produce al menos 40 tipos diferentes.

192

Un cambio nutricional puede causar un cambio en la naturaleza del antibiótico producido. Son resistentes a sus propios antibióticos, pero pueden ser sensibles a los producidos por otros Streptomyces. Se han encontrado varias especies que contienen plásmidos lineales de unas 500 pb, que contienen a veces genes responsables de la biosíntesis de antibióticos. El desarrollo de cepas resistentes obliga a la búsqueda de otros antibióticos. A pesar del enorme trabajo de investigación, y de que la industria farmacológica es una industria millonaria, se conoce muy poco sobre las razones ecológicas de la producción de antibióticos en Streptomyces. La producción de antibióticos está relacionada con la esporulación, y podría darse para inhibir el crecimiento de otros microorganismos que compiten por los nutrientes. Los antibióticos son metabolitos secundarios que sólo se producen en fase estacionaria.

BLOQUE IV. INTRODUCCIÓN A LA VIROLOGÍA TEMA 27: CARACTERES GENERALES DE LOS VIRUS Los virus no son ni organismos ni microorganismos, ya que no tienen ni organización ni estructura celular. Son entidades biológicas; microproteínas con cierta capacidad replicativa pero que dependen de células. En el siglo XIX, el concepto de virus se aplicaba a bacterias y, en general, a todo lo que causase enfermedades. Más tarde se descubrirían por primera vez por Ivanowsky y se estudiarían mejor por Beijerinck. Los llamaron “virus filtrables”, aunque hoy en día se sabe que todos los virus son filtrables. En 1892, Ivanowsky incluyó la existencia de virus estudiando la enfermedad del mosaico del tabaco. Vio que se podía transmitir esta enfermedad por los extractos biológicos de una planta a otra, incluso después de

193

filtrarlo para eliminar bacterias. Dedujo que existía un agente filtrable responsable de la enfermedad. Ahora sabemos que también podría haber sido causa de exotoxinas. Beijerinck repitió esos experimentos y demostró que si fuesen exotoxinas y cogiese una planta enferma e inoculase sus extractos filtrados a otra planta, si volviésemos a filtrar exudados a plantas sucesivas, se produciría la infección pero cada vez con menos potencia, ya que la concentración de la exotoxina iría disminuyendo. En el caso de los virus, la potencia va aumentando porque el virus se va replicando. Es a Beijerinck y no a Ivanowsky a quien se debe el descubrimiento de los virus. Éste los denominó como “flujo biológico vivo”, ahora llamados “virus”. En 1915, Twort y d’Herelle vieron que estos agentes también producían daños en las bacterias (bacteriófagos). En 1898, Loeffler y Frosch descubrieron el virus de la fiebre aftosa o glosopeda, que afecta a animales domésticos. Todos estos estudios pusieron en evidencia que la presencia de virus está asociada a enfermedades, por lo que los virus son siempre patógenos, ya que necesitan a la célula para replicarse.

ʘ

CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS

Los virus son los elementos genéticos más distribuidos en la naturaleza. Son entidades con gran éxito biológico. Presentan un ciclo de vida con 2 fases: 1.

Extracelular:

Donde es una partícula inerte con capacidad infecciosa (virión). Se compone de:

− −

Protección proteica o cápsida proteica. Ácido nucleico viral. − Envoltura con lípidos y proteínas (puede estar presente o no).

Juntas forman la nucleocápsida

La cápsida proteica está formada por capsómeros. 2.

Fase de provirus o profago:

Cuando el virión entra en la célula, ya se denomina provirus (células) o profago (bacterias). Sintetizan los capsómeros para comenzar su replicación. Tanto la replicación, transcripción como la traducción la realizan a expensas de la célula. Son parásitos obligados y, por tanto, patógenos.

194

Los virus son peculiares también por la estructura de su cápsida. En las células siempre existe más de un tipo de ácido nucleico, pero los virus sólo tienen una clase, DNA o RNA, pero nunca ambos a la vez, y siempre tienen capacidad genética (el RNA en células nunca tiene información genética). Teniendo sólo una clase de material genético, existen muchas posibilidades de virus:

a) b) c) d)

DNA monocatenario (D/1): parvovirus, microvirus,… DNA bicaternario (D/2): herpesvirus, adenovirus,… RNA monocatenario (R/1): picornavirus, mixovirus,… RNA bicatenario (R/2): reovirus, orbivirus,…

La singularidad de los virus respecto a su genoma llega más lejos, porque independientemente de la naturaleza del material genético, puede estar formando una estructura circular o lineal, o incluso los dos a la vez:

♦

Virus λ: DNA bicatenario que en la fase de virión es lineal y en la de provirus es circular.

También se puede presentar como una molécula única, o como segmentos o pequeños “cromosomas”:

♦ ♦

Mixovirus: RNA unicatenario segmentado. Adenovirus: DNA bicatenario formando una molécula única.

- MICROCÁPSIDA Generalmente son cubiertas protectoras de naturaleza proteica que protegen el genoma de las nucleasas. Existen 2 tipos básicos (todos los demás son variaciones):

1)

Helicoidales: estructura proteica que, formando un helicoide, envuelve a todo el genoma.

2)

Icosaédricas: formado por 2 bases pentagonales invertidas que se cierran por caras triangulares. Cumple el teorema de Euler: C+V=A+2 Los capsómeros de los vértices se denominan hexámeros y el resto se llaman pentámeros. Para cerrar tridimensionalmente un espacio, la estructura más pequeña y sencilla es el hexaedro. El otro extremo es la esfera, pero requiere muchos elementos de pequeño tamaño. El icosaedro está intermedio. Tiene ventajas de ambos. Si los capsómeros son muy grandes, necesitan un mayor genoma para traducirse, y si fuesen muy pequeños, tendrían que traducirlo muchas veces, lo que aumentaría la frecuencia de las mutaciones. Existen variedades:

195

a)

Simetría mixta: tienen elementos de simetría helicoidal y simetría icosaédrica.

b)

Simetría compleja: no es ni helicoidal, ni icosaédrica ni mixta. A veces es un indicador de asimetría. Independientemente de la simetría y de la composición y disposición espacial, pueden o no presentar envuelta. Muchos virus animales presentan envoltura, que adquieren normalmente de la célula de la que se han replicado y suele derivar de la membrana citoplasmática, porque la arrastra al salir de la célula. En otros casos deriva del RE, aparato de Golgi o membrana nuclear, dependiendo de dónde se replique el virus. Es un carácter diferencial. Hersey y Chase descubrieron que siempre hay 2 constantes:

1)

La presencia de ácido nucleico.

2)

La presencia de una cápsida como elemento protector.

Para ello marcaron una cápsida con S35, el cual vieron que se quedaba fuera de la célula, y el ácido nucleico con P32, el cual entraba dentro. Esto no se puede generalizar ya que a veces también introducen la cápsida. Si el virus presenta DNA bicatenario, la célula lo va a replicar ya que también tienen DNA bicatenario, y por lo tanto, presentan los mecanismos para replicarlo. Por la similitud con el mecanismo celular, estos virus aseguran su replicación. Los virus con DNA monocatenario o RNA bi o monocatenario tienen que introducir su cápsida, porque, además de ser capsómeros estructurales, lo son también enzimáticos y participan en su replicación. La cápsida, por una serie de modificaciones activas dentro de la célula, activa sus capsómeros, que son polimerasas que replican el material genético.

−

DNA bicatenario: la replicación la lleva a cabo la célula.

−

RNA bi- o monocatenario o DNA monocatenario: pueden necesitar replicación y/o traducción (que puede o no depender de la célula) y transcripción (siempre depende de la célula). El RNA monocatenario puede ser reconocido por la célula como mRNA y replicarlo. Si no lo reconoce como mRNA es entonces cuando los virus tienen que introducir su cápsida obligatoriamente. En algunos casos, sólo el ácido nucleico del virus es infeccioso. En otros casos no lo es si no entran con la cápsida.

−

RNA bi- o monocatenario: no es infeccioso por sí solo.

−

DNA bicatenario: sí es infeccioso por sí solo. Las DNA polimerasas de las células no diferencian el DNA viral del suyo propio, por lo que lo replican y crean mensajeros, que se traducirán y formarán proteínas específicas del virus.

−

DNA monocatenario: entra en la célula, y los sistemas de reparación celular lo “reparan” haciendo una copia de él para convertirlo en bicatenario, y entonces lo replica.

196

Casper y Klug vieron que los virus adoptan una posición intermedia: nunca son esféricos. Un icosaedro con n número de lados, que ha dividido sus caras en 3 partes, parece esférica. Las fases de virión y provirus/profago presentan una fase de infección, que se compone de:

1)

Etapa de adhesión o adsorción superficial: proceso físico de contacto de superficies que implica el contacto de los receptores con el capsómero.

2)

Etapa de absorción: el virus entra dentro de la célula.

Baltimore y Temin ganaron el premio Nobel por descubrir la esencia de los virus, que es conseguir que la célula cree mRNA. Clasificaron a los virus por clases:

1.

Clase I: virus con D/2. Es infectivo por sí mismo menos en el caso de los poxvirus, cuyo DNA se queda en el citoplasma, por lo que tiene también que introducir la cápsida.

2.

Clase II: virus con D/1.

3.

Clase III: virus con R/2.

4.

Clase IV: virus con R/1. Este genoma tiene un triplete de iniciación (polaridad +), que actúa por sí solo como mRNA. Sólo necesita entrar en el genoma para que se produzca el ciclo infectivo.

5.

Clase V: virus con R/1. Este genoma no actúa como mensajero. Tiene la imagen especular del triplete de iniciación (polaridad -). Tienen una transcriptasa en la cápsida.

6.

Clase VI: virus con R/1. La aclaró Temin. El genoma tiene polaridad de mRNA, pero en vez de emplear su genoma para transcribirse en el citoplasma, se va al núcleo, donde convierten su genoma en D /2. Utiliza una transcriptasa inversa (DNA polimerasa dependiente de R/1) o retrotranscriptasa. - DIFERENCIAS ENTRE VIRUS Y ORGANISMOS -

− −

Autocapacidad de reproducción. La síntesis de materia que forma los virus es independiente (se realiza en distintos sitios y a distintos tiempos en la célula), mientras que la síntesis de los componentes celulares es integral. − Los virus son parásitos intracelulares obligatorios. Son incapaces de crecer en cultivos. En general, se entiende como un sistema vivo aquel que toma cosas del medio y sintetiza productos con ellos, que es sensible al medio y lo modifica, relacionándose con él, y que se puede reproducir autónomamente. En cierto modo, los virus pueden hacer esto pero no se replican autónomamente. Es imposible que los virus precedan a las células evolutivamente, porque dependen de ellas. Pueden haber existido nucleoproteínas autoreplicativas antes que las células, pero en ningún caso virus. - NOMENCLATURA Según el tipo de hospedador, existen:

197

− − −

Virus bacterianos. Virus animales. Virus vegetales.

La nomenclatura binomial no se aplica en virus. Se designan por letras y/o números que dan información sobre el virus. Un comité especial sugirió que los virus se describiesen como criptogramas virales, que dan información sobre el virus y sirve para designarlos. Es una información codificada de los virus, que consta de 4 términos, todos cocientes.

1.

Naturaleza del genoma y cadenas que tiene el virus: R/2, R/1, D/2…

2.

El numerador indica los millones de Daltons que pesa su genoma y el denominador representa el porcentaje que supone el peso de su genoma con respecto al pero total de la partícula.

3.

Indica la morfología del virus. A veces coincide con la morfología de la cápsida, pero siempre se refiere a la morfología de la partícula viral en su conjunto. − S = icosaédrico. − E = elongado, helicoidal. − X = complejo o mixto.

4.

El numerador indica el rango de hospedadores: − − − −

B = bacterias. V = vertebrados. I = invertebrados. S = plantas con semillas.

El denominador indica el vector de transmisión, en el caso de que lo use: − − − −

O = contagio directo. Fu = transmisión por hongos. Di = dípteros. Ac = ácaros.

- DIVERSIDAD VIRAL Se caracterizan a nivel poblacional por una curva de crecimiento, que se diferencia de la bacteriana. Se denominan “curvas de multiplicación de un solo paso”, porque se pretende sincronizar el cultivo en un proceso de un solo paso. A mayor número de virus, mayor posibilidades de infectar a una célula. nº de virus nº de células

198

= moi (multiplicidad de infección)

Moi determina la probabilidad con la que se van a infectar las células. A una determinada moi, unos virus empezarán la infección antes que otros. Cuando infectamos un nº de células con un nº determinado de virus, la infección comienza con una adhesión superficial que precede a la absorción. Es un proceso al azar: no todas empiezan el principio de multiplicación al mismo tiempo. Se pretende sincronizar el cultivo, ya que no todos los virus hacen lo mismo al mismo tiempo. Las curvas de multiplicación de un paso consisten en: 1) Infectamos a las células y las dejamos un tiempo corto (10-30 segundos). Añadimos anticuerpos contra el virus, que secuestra los que quedan libres, y así evitamos infecciones posteriores. De esta manera, todo lo que está infectado lo está sincrónicamente. 2) Tras 10 segundos, filtramos y nos quedamos con las células que han precipitado, que son las que están infectadas sincrónicamente. La curva de crecimiento viral no es asimilable a la bacteriana. [N] moi

t

periodo de latencia Rendimiento viral pe

pai

periodo de liberación t

199

[virus] total

[virus] extracelulares

Si infectamos con una moi = 1, y hacemos una curva de multiplicación de un paso, vemos que la velocidad de infección a tiempos muy cortos baja muchísimo, y según vamos sacando muestras a diferentes tiempos, va subiendo hasta que sobrepasa moi y se estabiliza.

− − − −

pai = “periodo de acumulación intracelular” o tiempo que tarda el virus en salir fuera. pe = “periodo de eclipse” o tiempo que se tarda en volver a las condiciones moi iniciales. Periodo de latencia = pai + pe. Periodo de liberación = desde el pai hasta que se alcanza el rendimiento viral.

El valor que se alcanza cuando la curva de desarrollo vital de virus extracelulares e intracelulares se iguala sobre las ordenadas se denomina “rendimiento viral”.

TEMA 28: VIRUS BACTERIANOS

ʘ

/2

D

Son los más diversificados, pertenecen a la clase II y fueron los primeros que se descubrieron.

200

ʘ

CORTICOVIRUS /2 : 5/12 : S/S : B/O

D

♦ ʘ

PM2: afecta a Pseudomonas marina. Presenta 2 cápsidas proteicas.

MIOVIRUS /2 :

D

/45 : X/X : B/O

100

−

Genoma de mayor tamaño que el de los corticovirus.

−

“Mio” = músculo contráctil. Su vaina o cuello es contráctil.

♦ ♦ ♦ ʘ

T2, T3, T4… : son virus que afectan a enterobacterias. SP50: afecta a Bacillus. HM3: afecta a Clostridium.

PEDOVIRUS O PODOVIRUS /2 : 50/50 : X/X : B/O

D

−

Son virus que tienen una cola o pie muy corto, también contráctil.

−

No presentan ni fibras ni espículas.

−

Son menos complejos que los miovirus.

ʘ

STYLOVIRUS /2 : 60/50 : X/X : B/O

D

201

−

Cuello no contráctil y largo.

−

Carecen de envoltura.

♦

Fago λ: virus atenuado que puede establecer lisogenia con las células, introduciendo su genoma lineal en la célula, el cual se circulariza en la fase profago y se inserta en la célula.

ʘ ʘ

/1

D

INOVIRUS /1 : 2/12 : E/E : B/O

D

−

“Ino” = filamento. Aspecto elongado.

♦ ♦ ʘ

fd M13

MICROVIRUS /1 : 2/26 : S/S : B/O

D

−

Son menos complejos que los Inovirus.

−

Son icosaedros perfectos.

♦

ɸx174: primer DNA con actividad biológica que se sintetizó in vitro. Afecta a E. Coli.

ʘ

/1

R

202

ʘ

LEVIVIRUS /1 : 1/35 : S/S : B/O

R

−

“Levi” = ligero.

−

Son muy simples, pequeños e icosaédricos perfectos.

−

Necesitan transcriptasa viral porque su genoma es antimensajero.

♦ ♦

Qβ: afecta a E. Coli. R17: afecta a E. Coli.

TEMA 29: VIRUS ANIMALES

203

Ambos grupos (DNA y RNA) están muy diversificados.

ʘ ʘ

/1

D

PARVOVIRUS O PICORDNAVIRUS /1 : 1/35 : S/S : V/O

D

−

“Parvo” = pequeño.

−

Virus poco complejos, que pesan poco y forman una estructura icosaédrica perfecta.

♦ ʘ ʘ

Virus del moquillo canino.

/2

D

PAPOVAVIRUS /2 : 4/1O : S/S : V/O

D

♦ ♦ ♦

Virus del papiloma. Virus del polioma. Virus vacuolantes (SV40,…).

Papiloma

ʘ

Polioma

Vacuolantes

ADENOVIRUS

204

= Papovavirus

/2 : 25/13 : S/S : V/O

D

−

DNA lineal.

−

Son fácilmente distinguibles porque presentan fibras de pentón, que son proyecciones proteicas que aparecen en los vértices y que terminan en unas proteínas globulares denominadas pentones. Estas fibras se pueden romper por una proteasa específica llamada bromelina, que rompe los pentones y provoca que el virus deje de ser infectivo. Son los puntos de adhesión específica entre virus y células.

ʘ

−

Afectan a aves, simios, humanos.

−

Provocan síndromes intestinales y respiratorios; otros incluso son tumorales.

HERPESVIRUS /2 : 90/7 : S/S(e) : V/O

D

−

Presentan una envoltura que adquieren de la membrana nuclear.

−

Muchos producen tumores.

−

Afectan a anfibios, aves y humanos.

♦ ♦ ♦ ♦ ♦

Virus tipo 2: provoca el calcinoma cervical. Virus de Lucké: afecta a ranas. Virus de la enfermedad de Mareck: afecta a aves. Virus EB (Epstein y Barr): produce la mononucleosis infecciosa o linfoma de Burkitt.

Virus de la varicela: cuando afecta a un individuo por primera vez origina la varicela, pero en infecciones posteriores origina el herpes zóster.

ʘ

IRIDOVIRUS /2 :

D

/15 : S/S(e)* :

140

/O

V,I

−

A veces presenta una envoltura de origen citoplasmático.

−

Afecta a insectos y vertebrados.

205

−

Provoca la “fiebre porcina africana” de los cerdos.

−

No es un virus tumoral.

−

Son los únicos virus con D/2 que se reproducen en el citoplasma, junto con los poxvirus. Necesitan transcriptasa viral.

♦ ʘ

Virus FV3 (Frog Virus 3): afecta a ranas.

POXVIRUS /2 :

D

/6 : X/X : V/O,Di

180

−

Tamaño grande: a veces incluso pueden verse al microscopio óptico.

−

Morfología compleja (no mixta).

−

Toda la cápsida entra en la célula.

−

Se dividen en subgrupos:

a)

Ortopoxvirus:

♦

Virus de la viruela: afecta a humanos y vacas. Las células infectadas presentan corpúsculos de Paschen-Guarnieri, que es el DNA de la progenie.

b)

Avipoxvirus: afecta a aves.

c)

Capripoxvirus: afecta a cabras.

d)

Leporipoxvirus: afecta a conejos, liebres,… provocando mixomatosis, que a veces es también un tipo de tumor.

e)

ʘ

Entomopoxvirus: afecta a insectos.

HEPADNAVIRUS /2

D

−

Causante de la hepatitis B.

206

ʘ ʘ

/1

R

PICORNAVIRUS /1 : 2/30 : S/S : V/O

R

−

Están ampliamente distribuidos por la naturaleza.

−

Tamaño muy pequeño.

−

Existen 3 tipos:

a)

Enterovirus: normalmente afectan al sistema digestivo y son estables a PH ácidos.

♦ ♦ b)

Poliovirus: causante de la poliomelitis. Virus de la hepatitis A.

Rhinovirus: pueden entrar por las vías respiratorias. No son estables a PH ácido.

♦

Virus de la fiebre aftosa o glosopeda.

c)

Calicivirus: unos son estables a PH ácido y otros no. Este grupo lo componen los virus que no se clasifican serológicamente en los otros 2 grupos anteriores.

♦ ʘ

Virus del exantema porcino.

TOGAVIRUS /1 : 4/6 : S/S(e) :

R

V,I

/O,Di,Ac

−

“Toga” = envoltura.

−

Los más importantes se transmiten por dípteros y ácaros.

207

−

Antes se denominaban arbovirus porque se pensaban que todos estaban transmitidos por artrópodos (“arthropod-borne viruses” = arbovirus), pero actualmente se sabe que no es verdad.

−

Existen diversos subgrupos dependiendo de los antígenos que comparten:

a)

Alfavirus:

♦ Virus de la encefalitis equina. b)

Flavivirus:

♦ Virus de la fiebre amarilla: transmitida por un mosquito. ♦ Virus de la hepatitis C: se replica específicamente en el hígado. c)

Rubelavirus:

♦ Rubeola:

vacuna que se administra con la Triple Vírica. Cuando se adquiere en la edad previa a la pubertad no ocasiona serios problemas pero tiene un especial tropismo por tejidos que se dividen rápidamente, como los fetos, por lo que es peligroso para mujeres embarazadas. Si una mujer embarazada tiene la rubeola, como es un virus teratogénico, provocará malformaciones fetales. La vacuna contiene el virus atenuado. La embarazada no se debe vacunar porque el virus atenuado también es teratogénico, aunque menos.

d)

Pestivirus:

♦ Virus del cólera porcino. ʘ

ORTOMIXOVIRUS /1 : ∑5/1 : E/S(e) : V/O

R

−

En algunos libros los agrupan junto a los paramixovirus en un solo grupo llamado Mixovirus.

−

Genoma fragmentado en bloques o módulos. En el caso del virus de la gripe humana son 7 fragmentos. −

Presenta envuelta citoplasmática.

♦ ♦

Virus HIN5: gripe aviar. Virus de la gripe humana.

208

ʘ

PARAMIXOVIRUS /1 : 7/1 : E/S(e) : V/O

R

−

Presentan genoma continuo y envuelta citoplasmática.

RT viral Genoma (7-8 módulos)

Mensajeros (7-8 módulos)

Neuraminidasa Hemaglutinina … Capsómeros Replicasa

Las neuroaminidasas y las hemaglutininas las envía el virus a la membrana citoplasmática de la célula infectada. Se replica el RNA en 7 trozos y salen de la célula una especie de gemaciones por la zona de la membrana donde está la neuroaminidasa y la hemaglutinina. Tiene una membrana citoplasmática como una envoltura que deriva de la membrana celular pero con elementos del virus (hemaglutinina y neuraminidasa).

− −

Hemaglutinina: reconocen a los glóbulos rojos y los aglutinan. Neuraminidasa: corta restos de ácidos siálicos de las glucoproteínas.

La interacción de la neuraminidasa con los ácidos siálicos es el punto inicial de la infección. Son también los antígenos mayoritarios de estos virus. Mutan con mucha frecuencia estos antígenos por la poca fidelidad de copia de las enzimas implicadas en la replicación y transcripción del RNA viral. Esto se denomina “deriva antigénica”, y es la causa por la que la gripe varía cada año. Son antigénicamente muy poco estables. Estos virus tienen otra peculiaridad porque como su genoma es fragmentado y existe el proceso de deriva genética, se dan “saltos antigénicos”, es decir, que los virus pueden intercambiar módulos con otros virus, provocando la aparición de nuevos virus. Si un módulo que reconoce receptores humanos pasa a un virus animal, puede infectar a humanos. Se originan virus recombinantes, que pueden originar pandemias (epidemias a nivel mundial, no localizadas).

209

♦

Virus de la gripe aviar (N1H5): N1 = neuraminidasa tipo 1 y H5 = hematoglutinina tipo 5. Si cambian estos 2, pueden afectar a humanos. La última gripe asiática se produjo por recombinación de un mixovirus de cerdo y uno humano. Esto no ocurre con los paramixovirus porque no pueden realizar intercambio genético al no presentar módulos. Son genéticamente más estables.

♦ ♦ ♦

Virus del sarampión: es un paramixovirus. Sólo se pasa una vez en la vida. Paperas o parotiditis. Enfermedad de New Castle (NDV): afecta a aves.

Rubéola Triple Vírica

Paperas Sarampión

Trivalente Vírica

ʘ

Poliomelitis (3 serotipos de poliovirus que pueden originar la poliomelitis)

CORONAVIRUS /1 : 9/10 : E/S(e) : V/O

R

−

Aspecto esférico de la partícula global.

−

A diferencia de los mixovirus, su genoma tiene polaridad de mensajero, por lo que necesita transcriptasa viral.

−

Son virus respiratorios.

− −

La envoltura deriva del RE: geman en el RE y adquieren de ahí su envoltura. De una manera análoga a los mixovirus, insertan elementos estructurales de lo que luego será su estructura para luego recogerlos. Son los peplómeros, que los ponen en el RE y luego los rescatan al adquirir la envoltura. El aspecto de coronas de los peplómeros les dio el nombra de coronavirus.

210

♦ ♦ ʘ

Virus de la bronquitis infecciosa de las gallinas. Virus de Sars (Severe Acute Respirating Syndrome) o neumonía asiática.

ARENAVIRUS /1 : ∑ : S/(e) :

R

V

−

Virus de roedores, con poca importancia en los humanos.

−

Presentan un genoma fragmentado.

−

Tienen RT.

−

Son los únicos virus con ribosomas: cuando la célula se lisa y engloban a la cápsida, engloban también a los ribosomas. Les da aspecto granulado al microscopio. Son ribosomas no funcionales pero estructuralmente forman parte del virión.

ʘ

BUNYAMWERAVIRUS /1 : ∑ :

R

−

/Di,Ac

V,I

Nunca se transmiten por contacto directo.

− Geman en el aparato de Golgi, por lo que su envoltura procede de este orgánulo.

ʘ

LEUKOVIRUS /1 : 6/2 : S/S(e) : V/O

R

−

Se denominan de diferente manera: retrovirus, oncornavirus o leukovirus.

−

Todos los virus tumorales que infectan a animales se encuentran en esta familia.

−

Su envoltura procede de la membrana citoplasmática.

−

RT: tienen polaridad de mensajero pero no van al núcleo, sino que se convierte en DNA y generan

−

Son virus oncogénicos con RNA.

RNA.

211

−

Existen 3 subfamilias:

a)

Subfamilia de los Oncornavirus: virus de las leucemias, sarcomas, tumores mamarios,… tienen alta homología con los fragmentos del propio genoma humano.

b)

Subfamilia de los Spumavirus: virus que, cuando infectan a una célula, ésta forma sincitios con las de al lado. Se encuentran en el reservorio de animales domésticos y en el ganado.

c)

Subfamilia de los Lentivirus:

♦ ♦

Enfermedad de Visna en las ovejas.

Virus del SIDA (VIH). El periodo de incubación puede durar hasta 10 años. Bloquean y rompen los linfocitos. El virus elimina el sistema inmune. Estos enfermos mueren por enfermedades secundarias oportunistas. La causa mayor de muerte en pacientes con SIDA es un hongo, Candida albicans, que forma parte de nuestra flora normal. Los enfermos de SIDA no controlan la población de este hongo, que invade el cuerpo y se convierten en patógenos.

- FAMILIAS CON REPRESENTANTES TANTO ANIMALES COMO VEGETALES -

ʘ

RHABDOVIRUS /1 : 4/2 : E/U(e) :

R

V,I,S

/O,Di,Ac

−

Morfología peculiar: aunque la cápsida tiene morfología helicoidal, la partícula global tiene morfología baliforme. La nucleocápsida es helicoidal pero flexible. −

Geman en la membrana plasmática.

♦

Virus de la rabia: se transmite por contacto directo. Su reservorio natural son las zorras. Se transmite a otros cánidos y de ahí a los humanos.

ʘ

REOVIRUS /2 :

R

/15 : S/S :

∑15

212

V,S

/O

ʘ

ORBIVIRUS /2 :

R

/20 : S/S :

∑15

/Di,Ac

V,I,S

−

Tanto Reovirus como Orbivirus a veces se clasifican en una familia llamada Diplornavirus, porque tienen R/2. −

Genoma fragmentado en 10 fragmentos.

−

Los Reovirus tienen doble cápsida: una icosaédrica dentro de otra más grande.

♦

Virus del enanismo del arroz.

TEMA 30: VIRUS VEGETALES

Existen más de 30 familias reconocidas. Explotan los genomas con RNA y más los de RNA monocatenarios. Los RNA bicatenarios se reducen a los Reovirus.

ʘ

/1

D

−

Son relativamente pocos.

−

La familia más importante es la de Geminivirus.

−

Tienen DNA monocatenario y circular. Se asocian las cápsulas por pares.

♦

Virus del estriago del maíz.

ʘ

/2

D

213

−

La familia más importante es la de Caulimovirus; representativo es el que produce el mosaico de la coliflor.

−

Virus con simetría icosaédrica.

−

Son transmitidos por áfidos.

ʘ

R

1)

Sistema multiparticulado:

− −

Simetría icosaédrica. Simetría helicoidal.

2)

Sistema monoparticulado:

− − −

Simetría icosaédrica. Simetría helicoidal. Simetría helicoidal con envoltura.

dentro de esta familia, el virus más

/1

- SISTEMA MULTIPARTICULADO El genoma se encuentra englobado en distintos tipos de partículas. El conjunto de estos diferentes tipos de partículas forman el genoma infectivo. a)

Simetría icosaédrica:

ʘ

Familia Bromovirus

−

Transmitidos por coleópteros.

−

Infectan al género Bromus.

−

Genoma dividido en 4 fragmentos.

♦ 1. 2. 3. 4.

BMV: virus del mosaico en el género Bromus. Tiene 4 fragmentos genómicos: 1,1 KDa. 1 KDa 0,75 KDa. 0,28 KDa.

214

Uno de estos módulos codifica para los capsómeros de la cápsida, que es icosaédrica. Todas las cápsulas son iguales. El fragmento mayoritario se encapsida en un tipo de partícula. Los 2 fragmentos más pequeños en otros tipo de partícula, y el fragmento restante en otra. Las cápsidas son idénticas pero las partículas son distintas porque cada una contiene un fragmento genómico distinto. Esto origina que la población de Bromovirus se distinga en 3 tipos de partículas:

− − −

Heavy: 1,1 KDa. Medium: 0,75 KDa + 0,28 KDa. Light: 1 KDa.

El concepto de virión hace referencia al conjunto de los 3 tipos de partículas. Si se infecta una célula con una sola partícula de forma aislada, no se produce la replicación. Estos virus utilizan los vectores de transmisión para asegurar su ciclo:

−

Transferidos por áfidos: Cucumovirus. Es el virus del mosaico del pepino. Tiene 4 fragmentos de ácidos nucleicos y 3 tipos de partículas virales.

−

Transmitidos por nematodos: Nepovirus. Virus vegetales que tienen 2 segmentos genómicos y 2 tipos de partículas. Produce el entrenudo corto de la vid.

−

Transmitidos por infección mecánica: Ilarvirus. Constan de 4 bloques de ácidos nucleicos y 3 tipos de partículas. Provocan lesiones circulares grandes en rosáceas. b)

Simetría helicoidal:

−

Transmitidos por contacto directo: Hordeivirus. Afectan al genoma Hordeum (cebada). Tiene 3 fragmentos genómicos y 3 tipos de partículas.

- SISTEMA MONOPARTICULADO a)

♦ ♦ ♦ b)

Simetría icosaédrica: Tymovirus: transmitidos por coleópteros. Provocan el mosaico amarillo. Luteovirus: transmitidos por áfidos. Provocan amarilleo en muchas gramíneas. Tombosvirus: se transmiten por contacto directo. Provocan el enanismo en el tomate.

Simetría helicoidal:

215

− Transmitidos por áfidos:

♦

Carlavirus: el primer virus descubierto de esta familia. Provoca una enfermedad en los claveles.

♦

Closterovirus: remolacha,…

produce la tristeza del naranjo, clorosis del manzano, amarillez en la

♦

Potyvirus: el primer virus que se descubrió en esta familia fue el virus X, que afecta a las patatas. El segundo que se descubrió también afecta a las patatas y lo llamaron virus Y. Son virus que producen el mosaico de la remolacha, enfermedad de la patata, degeneración del ajo, mosaico de la caña de azúcar y maíz, anillado negro de la col, raquitismo amarillo de las cebollas, … −Transmitidos por contacto directo:

♦ ♦ c)

Potexvirus: es el virus X. Tobamovirus: por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco (TMV).

Simetría helicoidal y con envoltura:

Virus que producen las manchas bronceadas en el tomate.

ʘ

VIROIDES

No son virus: son agentes con RNA monocatenario, el cual es especial ya que tiene un aumento de la complementariedad interna, por lo que el genoma adapta una conformación especial, en forma de horquillas. Constan exclusivamente de un RNA que no está encapsulado. Se trata de un mRNA infeccioso de bajo peso molecular, que nunca llega a 1 millón de Daltons. Estos RNA se replican autónomamente por sí mismos. Los viroides se designan por los acrónimos del nombre de la enfermedad que produce, terminando con una “V” seguida de una “d”.

♦ ♦

PST Vd: provoca en los tubérculos de las patatas una especie de husos o fibras. CE Vd: provoca la exocortis de los cítricos.

216

Los viroides no tienen cápsula ni codifican para ello. Su patogenicidad para las plantas se debe a las propiedades de su genoma, no de sus proteínas, ya que no codifican ninguna proteína. La RNA polimerasa II, que en las células es dependiente de DNA, tiene una actividad lateral que en presencia de viroides es capaz de replicarlos en modo de “círculo rodante”. El daño no lo produce ninguna proteína, sino su replicación, porque secuestra la ARN polimerasa II y entonces priva a las células infectadas de la acción normal de la ARP polimerasa II, provocando una diferenciación anormal de las células. Además, interviene con el DNA genómico actuando como moléculas reguladoras represoras en el núcleo, bloqueando partes del genoma. También interfiere en la maduración del mRNA celular, es decir, en su procesamiento. La acción de estos 3 actos es lo que provoca la patogenicidad celular. Se debe directamente al genoma, y no a su expresión. Los viroides no proceden de virus degenerados sin envoltura. Se cree que proceden de la semicircularización de intrones celulares, actuando como agentes patógenos. Los viroides son resistentes a las ribonucleasas.

ʘ

PRIONES

Agentes infecciosos que tienen proteínas, pero no ácidos nucleicos. Se replican siendo proteínas y producen infección careciendo de ácidos nucleicos. Desde el punto de vista estructural, son sólo proteínas. En los años 50-60 se les consideraban virus lentos y se les llamaba virinos. Están relacionados con enfermedades neurodegenerativas, como la encefalopatía espongiforme, que ocasiona la lisis de las neuronas, provocando oquedades en el cerebro. El término prión lo introdujo Prusiner. Son proteínas infecciosas, que no tienen ni DNA ni RNA. Están extendidos en animales. La encefalopatía más común es la que afecta a ovejas y cabras, denominada “scrapie” o “prurito lumbar”, porque origina escozor en la espalda. Se conoce desde hace siglos y la incidencia de esta enfermedad aumenta con la edad, lo que indica que el periodo de incubación es alto. Se llegó a erradicar en Australia mediante el sacrificio de ovejas infectadas. La encefalopatía espongiforme bovina se detectó en Inglaterra. Se cree que su origen se debe a alimentar a las vacas con restos mortales de ovejas con “scrapie”, lo que ocasionó la manifestación del prión en vacas. En humanos existen 4 variedades priónicas, todas variedades neurodegenerativas: −Kuru o “risa mortal”. −Enfermedad de Creutofeldt-Jakob. −Síndrome de Gerssman-Strausler. −Síndrome del insomnio fatal. Se sospecha que el Parkinson, esclerosis,… se sospecha que también son priónicas.

217

- KURU O “RISA MORTAL” Es la primera enfermedad priónica que se descubrió en humanos, alrededor de 1850. Se detectó sólo entre los aborígenes de Nueva Guinea, en miembros de la tribu Fore, que estaba aislada. En más de 100 pueblos se advirtió que había muchos individuos que tenían una enfermedad caracterizada por ataxia (pérdida de coordinación) y demencia. Se vio que todos los enfermos habían participado en algún rito caníbal consistente en comerse los sesos de los difuntos, y sólo participaban los hombres, por lo que sólo se daban en el género masculino. Al abolirse esta práctica, desapareció la enfermedad, lo que indicaba que el agente era lento y se encontraba en aquellos que participaban en estos ritos. El difunto también había manifestado en vida los síntomas. Hoy en día ya casi está erradicada. - ENFERMEDAD DE CREUTIFELDT-JAKOB Se produce un caso por millón al año. Se conoce como “demencia senil”. Aparece en los últimos años de vida y puede ser tanto hereditaria como infecciosa. Se cree que el Kuru deriva de este síndrome. - SÍNDROME DE GERSSMAN-STRAUSLER Los daños más notables ocurren en el cerebelo. El periodo de manifestación de la enfermedad es mayor que la de Creutifeldt-Jakob, por lo que aparece aún en personas más mayores.

- SÍNDROME DEL INSOMNIO FATAL La causa no es el insomnio. Es un efecto más que una causa de la infección.

Características de los priones: − Los priones no tienen forma, excepto la correspondiente a una disposición tridimensional proteica.

−

Son glucoproteinas.

−

Se asocian entre sí formando placas amiloides, visibles en neuronas afectadas por priones.

−

No contienen nada de ácidos nucleicos.

218

− El prión que origina el scrapie es una proteína de 30 Kb. Se conoce su secuencia, cómo se glucosida,…

−

La esencia es preguntarse cuál es el origen de estas proteínas: hoy en día se ha podido aclarar. Se aisló por primera vez un prión, se secuenció, se usó como sonda. Se vio que en el hombre en concreto hay una zona del brazo corto del cromosoma 20 que codifica para priones. −

El DNA de aves también codifica con esta sonda. Las levaduras también codifican priones.

− Todas las células codifican genes que codifican a los priones. La mera codificación de los priones no es la causa de la enfermedad, ya que además de expresarse, traducirse y transcribirse, debe ocurrir algo para que los productos génicos se conviertan en algo dañino. Estas moléculas tienen 2 isoformas:

a)

PrPc: forma inocua, normal de la célula. Forma de proteína priónica. Proteína con esqueleto proteico en cuyo centro hay 4 regiones con estructura terciaria de cadenas α.

b)

PrPsc: proteína priónica scrapie. Tiene la misma secuencia inicial pero la zona central difiere en algo (un aminoácido quizás) que hace que su estructura terciaria sea planal β. La PrPsc puede ocasionar mutaciones en la isoforma normal, que induce el cambio de las cadenas α a la estructura planal β. Se adquiere por: − Herencia genética. − Mutaciones puntuales. − Adquisición de un prión, que al contacto con la forma normal le induce un cambio que la vuelve priónica. Es una forma de reproducción: una proteína priónica que entra convierte a la normal en proteínas patogénicas (PrPsc). El prión se multiplica y, por tanto, es infeccioso. Se propagan al entrar en contacto con moléculas priónicas normales, induciendo la configuración a PrPsc. Es un proceso muy lento y ocurre en el SNC, especialmente en el cerebro. Tarda a veces decenios en el hombre. Cuando se producen muchas se forman las placas amiloides. La deposición neuronal de las placas amiloides ocasionan las oquedades por la lisis de las neuronas. La estrategia de los priones no tiene precedentes en ninguna otra entidad biológica. Una característica inquietante es la capacidad de transmisión, saltando incluso barreras entre especies. Se ha visto que esto es posible sólo bajo determinadas circunstancias. La posibilidad de adquirir la enfermedad por ingesta de vacas cocinadas es bastante improbable. Son agentes termoestables pero es difícil ya que existen normas sanitarias que evitan poner en el mercado animales con síntomas, y cuando más similar sea una proteína priónica, más fácil es su salto entre especies. Lo malo de los priones es que no inducen la formación de anticuerpos, porque el agente patógeno deriva de una forma normal de las células, y el organismo la reconoce como propia. No hay vacunas ni defensas inmunológicas ante las enfermedades por priones.

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Frente a los priones estamos desarmados: el uso de fármacos están orientados a estabilizar las hélices α intentando evitar su conversión a β. También se ha sugerido eliminar el gen que codifica a PrPc. parece que, de hecho, en animales superiores, la eliminación no supone ningún problema en el individuo adulto, pero se cree que este gen es importante en la etapa fetal, por lo que no es muy útil esta técnica.

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