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• Jaime Arturo Severiche Galaraga

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QUÍMICA BIOLÓGICA Trabajo Práctico Nº3: Metabolismo de carbohidratos Catabolismo de la glucosa en levaduras

Introducción La glucosa ocupa una posición central en el metabolismo de plantas, animales y algunos microorganismos. Los destinos principales de la glucosa son los siguientes: síntesis de heteropolisacáridos destinados al espacio extracelular (animales y plantas) o como constituyentes de paredes celulares de microorganismos, almacenamiento bajo la forma de homopolisacáridos y sacarosa, oxidación por la vía de las pentosas fosfato para obtener ribosa 5fosfato utilizada en la síntesis de nucleótidos y NADPH para biosíntesis reductiva y oxidación a un compuesto de tres carbonos, piruvato, vía glucólisis para proporcionar ATP e intermediarios metabólicos. Esta última es la principal vía catabólica de la glucosa en la mayoría de los organismos y tejidos, siendo la velocidad con que es consumida dependiente del nivel energético existente en la célula. La mayoría de las levaduras utilizan azúcares como principales fuentes de energía y carbono para su metabolismo a través de la vía glucolítica. Los azúcares no pueden atravesar libremente las membranas lipídicas, por lo cual el primer paso del catabolismo de estos carbohidratos tiene como objetivo el transporte de tales compuestos a través de la membrana plasmática. Este transporte es catalizado por sistemas específicos denominados permeasas. Algunos disacáridos no son transportados al interior de la célula por permeasas, sino que son hidrolizados en espacio periplásmico. La capacidad de hidrolizar tales compuestos depende de la especie de la levadura y de la naturaleza del azúcar. En anaerobiosis la glucosa que ingresa a la vía glucolítica permite obtener energía en estos microorganismos mediante la fermentación alcohólica, por acción sucesiva sobre el piruvato de la piruvato decarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. En aerobiosis, parte del piruvato es oxidado completamente a CO2 mediante la respiración celular. Sin embargo, una proporción de la glucosa que depende de la especie considerada sigue siendo metabolizada mediante fermentación láctica, aun en aerobiosis. Por razones históricas, Saccharomyces cerevisiae, ha dominado el panorama científico y ha sido considerada sinónimo de levadura. Sin embargo, S. cerevisiae es una entre las casi 800 especies descriptas. Por otro lado existen las denominadas levaduras no convencionales o no Saccharomyces cerevisiae. Un ejemplo de interés lo constituye Pichia pastoris. Esta especie es considerada un fermentador débil, debido a que durante su crecimiento aerobio una proporción menor del 30% de glucosa es fermentada, presentado así una

velocidad de respiración muy alta, comprendida entre 150-250 μmoles de O2·g células-1.min-1. Esta propiedad permite cultivar a estas levaduras a elevadas densidades celulares, pues no hay formación significativa de subproductos del metabolismo fermentativo que puedan inhibir la proliferación celular, tales como el etanol, y hace que sea un microorganismo muy utilizado en biotecnología, por ejemplo para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.

Acción de distintos efectores sobre el consumo de glucosa Podemos considerar que si un efector modifica algunos de los pasos o cambia el porcentaje de azúcar catabolizada a favor de la respiración o la fermentación, el balance energético de la célula podría cambiar y en consecuencia modificarse la velocidad a la cual es consumida la glucosa. En primer lugar, el aporte de O2 a un cultivo de levaduras creciendo en anaerobiosis, producirá una disminución de la velocidad de consumo de la glucosa, proceso que se denomina efecto Pasteur, debido a la inhibición principalmente de la fosfofructoquinasa por la eficiente producción de ATP que ocurre durante la respiración en comparación con la fermentación. Cuando, por otro lado, el cultivo es tratado con un inhibidor de la citocromo oxidasa, por ejemplo cianuro o azida, la velocidad de consumo en algunas levaduras se incrementa nuevamente por incrementarse el proceso fermentativo, como ocurre en S. cerevisiae. Por otro lado, otras levaduras como Pichia pastoris, presentan una vía respiratoria alternativa y son insensibles a la inhibición por cianuro. En efecto, esta respiración es mediada por una oxidasa alternativa que acepta electrones de la ubiquinona y los transfiere al oxígeno. Sin embargo, este paso no es acompañado por síntesis de ATP. Otra particularidad de algunas levaduras, entre las que se encuentra S. cerevisiae, es la presencia del efecto Crabtree. Este consiste en el cambio de metabolismo mixto fermentativo-respiratorio a puramente fermentativo cuando la concentración de glucosa externa supera 0.8 mM en presencia de O2. Se piensa que los elevados niveles de glucosa exceden la capacidad de reacción de la piruvato deshidrogenasa, generando un sobreflujo sobre la piruvato decarboxilasa y dirigiendo el metabolismo hacia la producción de etanol. Otra posible explicación es la represión de genes que codifican para enzimas respiratorias por glucosa. La mayoría de las especies de levadura, entre las que se encuentra Pichia pastoris, no presentan este efecto y por lo tanto la respiración no es afectada por los niveles de glucosa. En ausencia de anión fosfato la glucólisis se inhibe dado que este es necesario para la reacción de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Sin embargo, en ausencia del mismo la glucólisis puede proseguir si en el medio está presente el anión arseniato. Como este es química y estructuralmente semejante al fosfato, la mencionada enzima puede tomar al arseniato como parte de su reacción específica. Los compuestos orgánicos de arsénico son menos estables que sus análogos de fósforo. Por ejemplo, los acil-arseniatos se

descomponen rápidamente por hidrólisis en ausencia de catalizadores. Por lo tanto, el acil-arseniato que se forma en lugar del 1,3-bisfosfoglicerato pasará a 3-fosfoglicerato en ausencia de la fosfoglicerato quinasa y sin producción de ATP. Ello significa que el rendimiento energético de la glucólisis será inferior en presencia de arseniato por competencia con el fosfato y disminución en la producción de ATP. El ion fluoruro inhibe tanto la fermentación como la respiración. Esto es debido a la inhibición de la enolasa, enzima glucolítica que cataliza la deshidratación reversible de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato. La enzima contiene dos subunidades, cada una de las cuales presenta dos Mg2+.Uno induce un cambio conformacional en la enzima y el otro se une al complejo enzima sustrato induciendo la catálisis. El complejo enzima inhibidor se presenta según la estequiometría enolasa-Mg2F2Pi.

Objetivos Determinar la velocidad de consumo de glucosa en cultivos de Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris en distintas condiciones metabólicas.

Materiales Glucosa 200 mM Fosfato de Sodio 500 mM, pH 5,5 Fluoruro de Sodio 200 mM Buffer MES-NaOH 25 mM, pH 5,5 Azida de Sodio 50 mM Reactivo comercial para dosar glucosa (Wiener) Cultivos de S.cerevisiae y de P. pastoris. Baño de 30 ºC Microcentrífuga Pipetas automáticas Baño de hielo Gradillas Material descartable

Métodos Preparación de los cultivos de las levaduras Las levaduras (mantenidas a -80 °C) fueron crecidas 16 horas a 30 °C y 180 rpm en 5 mL de medio YPD (10 g.L-1 extracto levadura, 2 g.L-1 peptona de caseína y 2 g.L-1 glucosa). A continuación, las células fueron recuperadas por centrifugación y resuspendidas en un Erlenmeyer conteniendo 250 mL de medio YPD. Luego de 24 h de crecimiento a 30 °C, se adicionaron 80 mL de glicerol 80 % v/v, y el cultivo fue fraccionado y almacenado a -80 °C hasta su uso.

Lavado de las levaduras Para eliminar los contaminantes presentes en el medio de cultivo que puedan interferir en el análisis (como glucosa residual y glicerol), se procederá a la centrifugación del cultivo de levaduras y a su resuspensión en buffer. Por cada grupo de trabajo, se centrifugarán dos eppendorfs de P. pastoris y uno de S. serevisiae (conteniendo cada uno 1 mL del cultivo de levaduras) durante 5 min a 5000 rpm, se descartarán los sobrenadantes y cada pellet será resuspendido en 1 mL de buffer MES pH 5,5. Posteriormente, se mezclarán ambas muestras en un tubo eppendorf (para el caso de Pichia) y se realizará un segundo lavado. Se pesarán los pellets en un tubo previamente tarado y se llevarán a 0.2 ml finales con buffer MES. Dejar en hielo.

Mezcla de incubación Se ensayará el consumo de glucosa por S.cerevisiae y P. pastoris bajo cuatro condiciones diferentes: basales, en presencia de fluoruro de sodio y en presencia de dos concentraciones distintas de azida sódica. Los volúmenes están expresados en microlitros. (S ó P)

(S ó P) F

(S ó P) A

(S ó P) A+

Glucosa 0.2 M

50

50

50

50

Fosfato 0.5 M

20

20

20

20

NaF 0.2 M

__________

__________

_________

__________

NaN3 0.05 M

__________

__________

20

60

Levaduras (S ó P)

200

200

200

200

MES 0.25 M, pH 5.5

730

530

710

670

Cada tubo será colocado en hielo, y en cada uno se colocarán las soluciones descriptas en la tabla, agregando por último las levaduras. Las muestras se homogeneizarán y de cada uno de los tubos se tomarán alícuotas de 150 l y se colocarán en eppendorf debidamente rotulados para cada condición para los distintos tiempos de incubación. Por ejemplo, para Saccharomyces incubados en presencia de fluoruro, los tubos quedarán rotulados de la siguiente manera: SF0, SF7.5, SF15, SF30 y SF60. Posteriormente, estos tubos se colocarán en un baño a 30 °C, y luego de 7.5, 15, 30 y 60 minutos de incubación, se tomarán alícuotas de 150 l de cada uno de los tubos y se centrifugarán durante 1 minuto a máxima velocidad y se separarán 50 l de los sobrenadantes para ser procesados a posteriori. El tubo correspondiente a tiempo cero se procesará de la misma manera salvo que no se colocará en el baño de 30 ºC.

Cuantificación de la glucosa presente mediante el método de la glucosa oxidasa - peroxidasa Para cuantificar la glucosa remanente en los sobrenadantes, se rotularán nuevos tubos eppendorf y se añadirá a cada uno de ellos 990 l de reactivo más 10 l de sobrenadante. Se procesará un blanco y 10 l de estándar cuya concentración es de 5.56 mM. Los tubos se incubarán durante 20 minutos a 30 °C y luego se leerá la absorbancia a 505 nm contra el blanco de reacción. El fundamento de la reacción es el siguiente: GOD

glucosa + O2 + H2O

ácido glucónico + H2O2 POD

2 H2O2 + 4-AF + 4-OH-BZ

4-AF: 4-aminofenazona 4-OH-BZ: 4-hidroxibenzoato GOD: glucosa oxidasa POD: peroxidasa

quinonimina roja

Análisis de los resultados Transformar las absorbancias medidas a 505 nm en moles de glucosa y graficar los moles de glucosa remanentes en función del tiempo, para cada condición y especie de levadura. Mostrar en un gráfico para Saccharomyces y en otro para Pichia las curvas para las cuatro condiciones elegidas. Expresar los resultados en moles de glucosa consumida. min-1. g-1 de levaduras. Explicar los resultados obtenidos en cada uno de los casos en base a sus conocimientos sobre el metabolismo de la glucosa en estos microorganismos.

Cuestionario de orientación 1) De acuerdo a la teoría, en cuál de todas las condiciones se esperaría observar la mayor velocidad de consumo de glucosa en cada especie de levadura con que se trabajó? Fundamentar ¿Coincide con los resultados obtenidos? 2) ¿Qué condición produjo la menor velocidad de consumo? ¿Cuál sería el fundamento teórico del resultado obtenido? 7

3) Se prepararon varios tubos de ensayo que contenían 1 ml de levaduras (2.10 células/ml) + 1 ml de una solución reguladora + 3 ml de una solución de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se pusieron a incubar a 30°C con los agregados (1 ml en total) que se detallan en la columna A de la tabla y se tomó una alícuota de 1 ml de la mezcla, se centrifugó y a 0,5 ml de sobrenadante se lo hizo reaccionar por el método de la glucosa oxidasa, obteniéndose los valores de concentración de glucosa que se indican en la columna B de la tabla. A los 30 min. se repitió la operación (los datos obtenidos figuran en la columna C). Una con flechas los datos de la columna C a los de la columna A según lo esperado para el consumo de azúcar en cada condición. Determine en cada caso la velocidad de consumo de glucosa en µmol/min. A AGUA Pi 50 mM Pi + NaN3 Pi + NaF ARSENIATO 50 mM Pi + ARSENIATO ARSENIATO + NaN3 SACAROSA + Pi SACAROSA

B

2.5 mM

C 2,5 mM 2,5 mM 1 mM 2,5 mM 0,32 mM 0,625 mM 1,5 mM 1,5 mM 0,90 mM

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