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Laboratorio de Toxicología

U N AM

DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL OBJETIVO ACADÉMICO

Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de acción mediante el cual un compuesto de

ÍA

,F

Q

origen natural ejerce efecto antioxidante.

G

PROBLEMA

LO

Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia química a través de la realización de las

C

O

pruebas de: 1. Inhibición de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superóxido, 3. Captura de

TO

XI

peróxido de hidrógeno y 4. Captura de radical hidroxilo.

ES

REACTIVOS

Solución amortiguadora de carbonatos*

Xantina oxidasa (XO)

Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)

SO

R

Xantina (Xan)

Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)

FE

Nitroazul de tetrazolio (NAT)

PR O

Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado (Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)

Vainillina

Ácido ferúlico

LE

Alopurinol

Ácido sulfúrico (H2SO4) Butil hidroxitolueno (BHT)

G IO

Naranja de xilenol (NX)

D

E

Ácido hexenóico

Peróxido de hidrógeno (H2O2)

,C

O

*Ver APÉNDICE II

R

MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS 1 gradilla para tubos Eppendorf 1 espátula de cromo níquel

1 micropipeta de 10-100 l

1 nave de pesado

1 celda para la región visible (desechable)

2 matraces aforados de 250 mL

1 celda para la región U.V. (cuarzo)

1 pipeta 1 mL

2 matraces aforados de 10 mL

1 pipeta 10 mL

BO

R

1 micropipeta de 100-1000 l

R

AD

O

12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL

2 vasos de precipitados de 25 mL PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

41

Laboratorio de Toxicología

EQUIPO Baño María

U N AM

Balanza analítica Espectrofotómetro

ÍA

,F

Q

DESARROLLO EXPERIMENTAL

G

A) Ensayo de inhibición de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa

O

LO

(Xan-XO)

XI

C

1. Los profesores indicarána cada equipo el antioxidante a evaluar.

TO

2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para antioxidante.

ES

3. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,

SO

R

siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

Tabla 1. Preparación de los tubos problema y control Control positivo ( L)

100 100

100 100

Blanco para antioxidante ( L) 100 100

,C

O

LE

900

600

800

500

-

-

100

100

1100 20 min

300 1100 20 min

1100 20 min

300 1100 20 min

E D

G IO

a. Xantina 1.5mM b. EDTA 0.115mM c. Solución amortiguadora de carbonatos 84 mM pH=10.19 d. Solución acuosa de antioxidante 650 M e. XO* VOLUMEN TOTAL f. Agitar e Incubar **

PR O

Reactivo

R

Control negativo ( L)

FE

Tubo

Antioxidante ( L) 100 100

AD

O

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.

BO

R

R

4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

42

Laboratorio de Toxicología

Tabla 2. Preparación de los tubos problema y control para BHT

a. Xantina 1.5mM b. EDTA 0.115mM c. Solución amortiguadora de carbonatos 84 mM pH=10.19 d. Metanol e. Solución de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650 M f. XO* VOLUMEN TOTAL g. Agitar e Incubar **

100 100

100 100

Blanco para BHT ( L) 100 100

850

550

800

50

50

-

-

-

1100 20 min

300 1100 20 min

BHT ( L) 100 100 500

G

ÍA

-

100

100

1100 20 min

300 1100 20 min

LO O C

XI

TO

Reactivo

U N AM

Control positivo ( L)

Q

Control negativo ( L)

,F

Tubo

R

ES

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.

SO

5. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,

FE

empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para

PR O

mayor comprensión, leer espectrofotométricamente el contenido de los tubos en el orden numérico

D

E

que se indica en la Tabla 3.

G IO

Tabla 3. Orden de lectura para la determinación de ácido úrico Orden de lectura

LE

1

Blanco Control negativo (-)

Control positivo (+) Blanco para antioxidante Antioxidante

4

AD

O

R

,C

O

2 3

Muestra a leer

BO

R

R

6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa el 100% de producción de ácido úrico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente fórmula. % inhibición de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

43

Laboratorio de Toxicología

A C+= absorbancia del control positivo

U N AM

7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.

8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;

,F

Q

secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el

G

ÍA

contenedor R1

LO

B) Ensayo de captura de radical superóxido (O2 -) empleando el sistema Xantina-Xantina

C

O

oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)

XI

1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.

TO

2. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla

ES

4, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

PR O

FE

SO

R

Tabla 4. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de radical superóxido (O2 -) Control Control Antioxidante Tubo negativo positivo Reactivo ( L) ( L) ( L) a. Xantina 1.5Mm 100 100 100

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

b. EDTA 0.115Mm c. Solución amortiguadora de carbonatos 84 mM pH=10.19 d. NAT 0.1 M e. Solución acuosa de antioxidante 650 M f. XO* VOLUMEN TOTAL g. Agitar e Incubar ** h. Cu(NO3)2 1.3 mM VOLUMEN TOTAL FINAL

100

100

100

600

300

200

300 1100 20 min 200 1300

300 300 1100 20 min 200 1300

300 100 300 1100 20 min 200 1300

BO

R

R

AD

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C.

3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

44

Laboratorio de Toxicología

Tabla 5. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de

U N AM

radical superóxido (O2 -) empleando BHT Control positivo ( L)

Antioxidante BHT ( L)

a. Xantina 1.5mM

100

100

100

b. EDTA 0.115mM c. Solución amortiguadora de carbonatos 84 mM pH=10.19 d. Metanol e. NAT 0.1 M f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650 M g. XO* VOLUMEN TOTAL h. Agitar e Incubar ** i. Cu(NO3)2 1.3 mM VOLUMEN TOTAL FINAL

100

100

550

250

50 300

50 300

,F ÍA G LO

O

C

200 300

-

100

300 1100 20 min 200 1300

300 1100 20 min 200 1300

TO

R

ES

1100 20 min 200 1300

100

XI

-

SO

Reactivo

Q

Control negativo ( L)

Tubo

PR O

FE

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. ¤ Los profesores indicarán el antioxidante a evaluar

4. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como

E

blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.

D

5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa

G IO

el 100% de formazán generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente fórmula.

R

,C

O

LE

% de captura del radical superóxido= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante A C+= absorbancia del control positivo

AD

O

6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como

R

R1.

BO

R

7. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada; secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R1.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

45

Laboratorio de Toxicología

C) Ensayo de Captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo ( -OH) empleando

U N AM

el método de FOX2 modificado. 1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2, control positivo -OH, Captura H2O2 y Captura -OH.

,F

Q

2. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adición indicado en la

LO

G

ÍA

columna titulada “reactivo”.

Captura -OH ( L)

XI

C

Captura H2O2 ( L)

TO

ES

PR O

FOX-MeOH FOX-Antioxidante Ácido hexenóico H2O H2O2* VOLUMEN TOTAL f. Agitar e Incubar **

R

900 100 1000 10 min

a. b. c. d. e.

Control positivo OH ( L) 900 40 40 20 1000 10 min

SO

Reactivo

FE

blanco ( L)

Tubo

Control positivo H2O2 ( L) 900 80 20 1000 10 min

O

Tabla 6. Preparación de los tubos problema y control

900 80 20 1000 10 min

900 40 40 20 1000 10 min

D

E

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C.

G IO

3. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como blanco el contenido del tubo etiquetado como blanco.

LE

4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control

,C

O

positivo de H2O2 representa el 100% del peróxido de hidrógeno adicionado al sistema y el tubo -

OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el

R

marcado como control positivo

AD

O

sistema.

BO

R

R

% de captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2] En donde: AM= absorbancia del tubo marcado como “Captura de H2O2” AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como “control positivo H2O2” % de captura de radical hidroxilo ( -OH) = 100 - [(AM) x100/A C+

En donde: AM = absorbancia del tubo marcado como “Captura de -OH” PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

-OH ]

46

Laboratorio de Toxicología

AC+

-OH =

absorbancia del tubo marcado como “control positivo

-

OH”

U N AM

5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R2.

Q

6. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;

,F

secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

SO

R

ES

TO

XI

C

O

LO

G

ÍA

contenedor R2.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

47

Laboratorio de Toxicología

CUESTIONARIO

U N AM

1. Reporte sus resultados en la Tabla 1 Tabla 1. Resultados por equipo Absorbancia de la muestra

Porcentaje

Control

antioxidante: ________________

de actividad antioxidante*

ÍA

positivo (C+)

G

Inhibición XO -

LO

Captura O2

Q

Absorbancia

,F

Prueba

C

O

Captura H2O2

TO

XI

Captura -OH

ES

*Calcular el porcentaje de inhibición de XO o Captura de O2 -, H2O2 o -OH según sea el caso de acuerdo a las ecuaciones presentadas en cada una de las secciones.

SO

R

2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 ¿Cuál es el mecanismo de acción de la muestra de antioxidante que analizó? Justifique su respuesta.

FE

________________________________________________________________________________

PR O

________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

G IO

D

E

________________________________________________________________________________

LE

3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y -OH. ¿A qué proceso o

O

procesos atribuye la diferencia?

,C

________________________________________________________________________________

AD

O

R

________________________________________________________________________________

BO

R

R

4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

48

Laboratorio de Toxicología

U N AM

5. Recopile los resultados grupales y repórtelos en la Tabla 2. Tabla 2. Resultados grupales % de Captura

de la XO

O2

-

-

H2O2

OH

Q

% de inhibición

Antioxidante

,F

Equipo

ÍA

1

G

2

LO

3

C

O

4

XI

5

TO

6

ES

7

R

8

SO

9

PR O

FE

10

6. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?

D

E

___________________________________________________________________________________

G IO

7. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2•-?

O

LE

___________________________________________________________________________________

,C

8. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?

AD

O

R

___________________________________________________________________________________

R

9. ¿A qué atribuye este último hallazgo?

BO

R

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

49

Laboratorio de Toxicología

10.

¿Cuál de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical -OH?

11.

U N AM

________________________________________________________________________________ ¿Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuiría a disminuir el estrés

,F

Q

oxidante? Justifique su respuesta.

ÍA

________________________________________________________________________________

G

________________________________________________________________________________

LO

________________________________________________________________________________

TO

XI

C

O

________________________________________________________________________________

ES

BIBLIOGRAFÍA

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

SO

R

Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia básica de los tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill, México, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doull’s Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw Hill, Interamericana 2001. Jiang, Z.Y., Hunt, J.V., Wolff, S. P. (1991). Ferrous Ion Oxidation in the Presence of Xylenol Orange for Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202, 384-389. Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma Hydroperoxide Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409. Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tuñón, M.ª J. (2002). Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. XVII, 271 278. Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149 160. Södergren, E., Nourooz-Zadeh, J., Berglund, L., Vessby, B. (1998) Re-evaluation of the ferrous oxidation in xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J. Biochem. Biophys. Methods 37 137-146. Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 87 97. Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 995 1022. World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 1632.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

50

Laboratorio de Toxicología

APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

U N AM

1. Definición del proceso de estrés oxidante. 2. Concepto de radical libre y especies reactivas. 3. Concepto de antioxidante y ejemplos.

,F

Q

4. Reacción de Fenton.

ÍA

5. Concepto de peroxidación de lípidos.

G

6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en función del procedimiento

LO

experimental, prestar particular atención a las tablas 2 y 5.

C

O

7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o complete lo solicitado en

FE

SO

R

ES

TO

XI

los incisos 7a-7c

PR O

Xantina Oxidasa (XO) Ácido úrico =

D

E

Xantina

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

O2

H2O2 +

nm

O2˙

Reducción 2e 2e Azul de tetrazolio (NBT)

Formazán = nm

7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies químicas que se determinan espectrofotométricamente en las pruebas de inhibición de la Xantina Oxidasa y de captura del radical superóxido, respectivamente.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

51

Laboratorio de Toxicología

7b. Propósito de la adición secuencial de: xantina, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos

U N AM

pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibición de la Xantina Oxidasa y de captura de radical superóxido.

,F

Q

7c. Identificar las especies reactivas de oxígeno, indicando si son radicales o no.

ÍA

8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos

LO

G

9a-9c

XI

C

O

Método de FOX2 modificado Naranja de Xilenol (NX) FeIII NX + OH˙ + OH ( =560 nm)

ES

FeIII

TO

H2O2 FeII

LOOH

FeIII + OH˙ + OH

NX

FeIII NX ( =560 nm)

D

E

FeII

PR O

FE

SO

R

+L (Ácido hexenóico)

O

R

,C

O

LE

G IO

NX = Naranja de Xilenol FeIII NX = Complejo colorido de hierro III y Naranja de Xilenol L= Lípido = Ácido hexenóico LOOH = Lípido hidroperóxido producto de la peroxidación de lípidos en presencia de OH˙

AD

9a. Propósito de la adición de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo de FOX2.

BO

R

R

9b. Propósito de la adición de H2O2. 9c. Propósito de la adición de ácido hexenóico en los tubos de captura de radical OH -.

9d. Identifique la reacción de Fenton en el diagrama

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

52

Laboratorio de Toxicología

U N AM

APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS Nota: Las soluciones 17 y 18 se deben preparar al inicio de cada sesión. Todo el material de vidrio para preparar los antioxidantes deberá ser enjuagado previamente con EDTA. Se recomienda que

,F

Q

cada equipo prepare las soluciones acuosas o metanólicas del antioxidante que el profesor les haya

G

ÍA

asignado a evaluar.

LO

Xantina 1.5 mM

O

Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solución

TO

XI

C

amortiguadora de carbonatos.

ES

Solución amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2

R

Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y

FE

SO

aforar a 250 mL.

PR O

Nitroazul de tetrazolio 0.1 M

Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solución en un

D

E

frasco ámbar en el refrigerador.

G IO

EDTA 0.1 mM

,C

Xantina oxidasa

O

LE

Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.

AD

O

R

La enzima se preparará durante la sesión de laboratorio de acuerdo a la indicación de los profesores.

R

Nitrato de cobre 1.3 mM (Cu(NO3)2)

BO

R

Pesar 12.2 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 50 mL con agua destilada. Solución acuosa de vainillina 0.65 mM Pesar 1 mg de vainillina y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

53

Laboratorio de Toxicología

Solución acuosa de ácido ferúlico 650 M

U N AM

Pesar 1.3 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2 Solución acuosa de Alopurinol 650 M

ÍA

,F

Q

Pesar 2.2 mg de alopurinol y aforar a 25 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2

G

Solución de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650 M

LO

Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solución

TO

XI

C

O

amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solución acuosa de H2O2 250 M

ES

Tomar 0.1 mL de una solución de peróxido de hidrógeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada;

PR O

Solución metanólica de vainillina 4.4 mM

FE

SO

R

de esta solución tomar 17 L y aforar a 10 mL con agua destilada.

E

Pesar 6.7mg de vainillina y aforar a 10 mL con MeOH

D

Solución metanólica de Ácido ferúlico 4.4 mM

LE

G IO

Pesar 8.5 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con MeOH

O

Solución metanólica de Alopurinol 4.4 mM

R

,C

Pesar 6.0 mg de Alopurinol y aforar a 10 mL con MeOH

AD

O

Solución metanólica de BHT 4.4 mM

BO

R

R

Pesar 9.7mg de BHT y aforar a 10 mL con MeOH Reactivo de FOX2 Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O y disolver en H2O destilada, agregar 695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

54

Laboratorio de Toxicología

Solución FOX-MeOH

U N AM

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de MeOH

,F

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de la solución metanólica de antioxidante

Q

Solución FOX-Antioxidante

G

ÍA

correspondiente.

LO

Solución acuosa de ácido hexenóico 500 M

O

Pesar 6.6 mg de ácido hexenóico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solución 5 mL y

ES

TO

XI

C

aforar a 10 mL con agua destilada.

R

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

SO

R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de

PR O

formazán, ácido úrico, H2O2, metanol.

FE

tetrazolio, ácido ferúlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio, R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, ácido hexenóico, H2O, H2O2,

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

vainillina, alopurinol, butil hidroxitolueno, ácido ferúlico metanol.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

55

Laboratorio de Toxicología

U N AM

DETERMINACIÓN DE MUTÁGENOS AMBIENTALES A TRAVÉS DE LA PRUEBA DE AMES. OBJETIVO ACADÉMICO

Determinar la presencia de compuestos mutagénicos en muestras de interés o de impacto ambiental

ÍA

,F

Q

empleando la prueba de Ames

G

PROBLEMA

LO

Que el alumno obtenga a partir de muestras de interés ambiental, la fracción que contiene los

C

O

compuestos de naturaleza orgánica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones

TO

XI

contienen compuestos con potencial mutagénico.

ES

MATERIAL BIOLÓGICO.

R

Cultivo nutritivo de 16 horas a 37°C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores

SO

genéticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutación en rfa),

PR O

E

frecuencia de reversión espontanea.

FE

presencia del plásmido R (resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutación en uvrB) y

D

MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO

LE

G IO

Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes:

O

a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plástica limpia 20 colillas de cigarro a las que

R

,C

deberán retirar el papel envolvente y conservar únicamente el algodoncillo del filtro.

O

b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodón el hollín remanente en el escape de para tener acceso hasta el lugar en donde el hollín se acumula.

BO

R

R

AD

un autobús y guardarlo en una bolsa plástica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

56

Laboratorio de Toxicología

Extracción

U N AM

MATERIAL POR EQUIPO (6 personas).

Prueba de Ames

Anillo metálico

1

Agitador “vortex”

1

Embudo de cola corta

1

Mechero Bunsen

1

Embudo de separación

1

Mechero Fisher

1

Matraz de bola de 100 mL

1

Micropipeta 10-100 L

1

Probeta de 100 mL

1

Micropipeta 100-1000 L

1

Vaso de precipitados de 100 mL

4

Pipetas graduadas 2 mL estériles

1

Vidrio de reloj

8

Puntas desechables estériles para

TO

XI

C

O

LO

G

ÍA

,F

Q

1

1

Vaso de precipitados de 100 mL

1

Parrilla de calentamiento Tubos

de

ensayo

de

plástico

FE

10

R

Pedazos de papel filtro 7x7cm

SO

2

ES

micropipetas (6 amarillas + 1 azul)

Material para el conteo: Plumón indeleble de punto fino

1

Lámpara

1

Lupa

1

Pinzas para tubos de ensayo

1

Termómetro

E

1

PR O

desechables de 5 mL estériles

1

Bolsa de plástico para residuos

10

Cajas Petri con medio mínimo E de Vogel-Bonner

2

O

1

Tubo Eppendorf

1

Unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm)

BO

R

R

AD

Tubos de ensayo 16x150 mm con 15 mL de agar de superficie

R

,C

O

LE

G IO

D

Hielo

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

57

Laboratorio de Toxicología

REACTIVOS

U N AM

Extracción Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) Diclorometano (CH2Cl2)

ÍA

,F

Q

Dimetilsulfóxido (DMSO)

G

Prueba de Ames

LO

Hipoclorito de sodio

O

Solución L-histidina 0.5mM / biotina 0.5 mM

XI

C

Mezcla fracción S9:

TO

Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4

ES

Solución de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Glucosa 6-fosfato

FE

Medio mínimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)

SO

R

NADP+

PR O

Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150mm)

D

E

EQUIPO

G IO

Incubadora Refrigerador

R

,C

O

Lámparas

LE

Rotaevaporador

AD

O

DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIÓN NOTA 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y seguridad deben

BO

R

R

verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes, cubrebocas y lentes de seguridad. NOTA 2. Colocar las cajas de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner en la incubadora a 37°C al inicio de la clase.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

58

Laboratorio de Toxicología

EXTRACCIÓN DE MUTÁGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES. Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente 5 x 5 cm de longitud de acuerdo a la

U N AM

1.

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

SO

R

ES

TO

XI

C

O

LO

G

ÍA

,F

Q

Figura 1.

BO

R

2.

Figura 1. Elaboración de sobre doble de papel filtro.

Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitados de 250 mL, añadir 100 mL de CH2Cl2, tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30 minutos. (No agitar durante ese tiempo).

3.

Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitados.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

59

Laboratorio de Toxicología

4.

Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel periódico en la campana de extracción. Al

U N AM

finalizar la sesión los responsables de seguridad e higiene deberán colocarlos en una bolsa de plástico, cerrar y etiquetar como R1. 5.

Adicionar al disolvente de extracción del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la

,F

Q

presencia de agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a través de algodón y Reconstituir el residuo final con 500 µL de DMSO.

LO

G

6.

ÍA

concentrar in vacuo.

O

PRUEBA DE AMES.

XI

C

NOTA 3. Antes de montar el área de trabajo es importante asegurarse que ya NO haya disolventes

TO

orgánicos en las mesas.

Sanitizar el área de trabajo limpiando con jabón e hipoclorito de sodio.

2.

Enseguida sanitizar con etanol al 70%.

3.

Adecuar el área de trabajo a un ambiente estéril de acuerdo a la Figura 2.

Figura 2. Área de trabajo ordenada y sanitizada.

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

SO

R

ES

1.

4.

En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaución los 15 mL de agar de superficie contenido en el tubo de ensayo para evitar proyecciones y pérdidas de reactivo.

5.

Añadir 1.5 mL de solución L-Histidina/Biotina.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

60

Laboratorio de Toxicología

Mantener la mezcla anterior a 45°C en baño maría como indica la Figura 2.

7.

Los encargados de seguridad prepararán para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo a las

U N AM

6.

instrucciones del APÉNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les proporcionará en tubos Eppendorf 1.3 mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deberá

,F

Q

mantenerse todo el tiempo en baño de hielo.

ÍA

NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo más rápido posible para evitar riesgos de

G

contaminación.

Tomar uno o dos tubos de ensaye de plástico estériles, según el tratamiento que se esté

LO

8.

O

realizando, quitarles la tapa por presión sin tocar los bordes y añadir a cada tubo 2 mL de agar

XI

C

de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45°C como los muestra la Figura

TO

2.

Realizar sólo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 según el equipo correspondiente,

ES

9.

R

comenzando por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del área de

FE

10.

SO

INDICADO.

D

E

PR O

trabajo y etiquetada como R2.

O

R

,C

O

LE

G IO

Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A Reversión Tratamientos Control negativo espontánea (por duplicado) CÓDIGO CRE1 RE2 Reactivo 1.- Agar de superficie* 2mL 2 mL 2 mL

S/S91

S/S92

2 mL

2 mL

-

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

3.- Mutágeno ambiental

-

-

-

25 L

25 L

AD

2.- Cultivo bacteriano

BO

R

R

Sin S9 (por duplicado)

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

61

Laboratorio de Toxicología

Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B Control negativo Sólo mutágeno Tratamientos fracción S9 (por duplicado)

U N AM

(por duplicado)

Reactivo 1.- Agar de superficie*

M1

M2

C/S91

C/S92

2 mL

2 mL

2 mL

2 mL

2 mL

2.- Cultivo bacteriano

100 L

-

-

100 µL

-

25 L

25 L

25 L

25 L

500 L

-

-

500 µL

500 µL

,F

ÍA

100 µL

TO

XI

C

*Mantener siempre a 45°C en baño maría **Mantener siempre en hielo.

Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa según el código indicado en

ES

11.

G

4.- Mezcla S9**

LO

3.- Mutágeno ambiental

Q

C-S9

O

CÓDIGO

Con S9

R

las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el número de grupo y equipo. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador “vortex”.

13.

Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner

FE

SO

12.

14.

PR O

correspondiente.

Desechar los tubos de plástico en la bolsa de residuos colocada en un costado del área de trabajo

E

y etiquetada como R2.

Distribuir cuidadosa y homogéneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.

16.

Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.

17.

Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.

O

LE

G IO

D

15.

,C

NOTA 5: Recordar en todo momento que se está trabajando con compuestos con posible actividad

O

R

mutagénica y con un cultivo bacteriano que no es inócuo. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.

19.

Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera

BO

R

R

AD

18.

20.

invertida a la incubadora a 37°C por 48 horas. Una vez terminado el tiempo de incubación, guardar las cajas de Petri invertidas en el refrigerador a 4°C.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

62

Laboratorio de Toxicología

DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIÓN Antes de comenzar el conteo de colonias, verificar que el crecimiento sea homogéneo, es decir,

U N AM

21.

que las colonias tengan las mismas características, de lo contrario informar al profesor para

Contar el número de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lámpara y

LO

23.

G

cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.

,F

Identificar si existe algún tipo de contaminación por hongos u otras bacterias. En caso de que las

ÍA

22.

Q

recibir instrucciones.

C

O

una lupa, marcándolas con un plumón indeleble de punto fino. Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos.

25.

Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva,

ES

TO

XI

24.

R

colocarlas en la bolsa roja para RPBI y etiquetarlas como R4

SO

NOTA 6. Se considera un resultado positivo cuando el número de revertantes inducidas es igual o

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

superior al doble del número de colonias revertantes espontáneas.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

63

CUESTIONARIO 1. Anote el número de revertantes encontradas en la Tabla 3 Tabla 3. Resultados con la cepa TA98 Muestra:

Repetición

1

ÍA G LO O C XI TO ES R

5

Sólo mutágeno

SO

4

Con fracción S9

FE

3

Sin fracción S9

,F

1 2 Promedio 1 2 Promedio 1 2 Promedio 1 2 Promedio 1 2 Promedio

2

Reversión espontánea

Q

Equipo

Control negativo fracción S9

Control negativo

U N AM

Laboratorio de Toxicología

PR O

2. ¿En cuál de las muestras evaluadas, el número de revertantes inducidas es igual o superior al doble del número de colonias revertantes espontáneas?

G IO

D

E

___________________________________________________________________________________ 3. ¿Considera que logró identificar la presencia de mutágenos en la muestra ambiental evaluada?

LE

___________________________________________________________________________________

,C

O

___________________________________________________________________________________

R

___________________________________________________________________________________

O

4. ¿Qué tipo de mutaciones provocan?

BO

R

R

AD

___________________________________________________________________________________ 5. ¿Cómo influye la biotransformación en estos procesos? ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 6. ¿Qué características de solubilidad poseen los xenobióticos presentes en la muestra evaluada? PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

64

Laboratorio de Toxicología

U N AM

___________________________________________________________________________________ 7. ¿Qué importancia tiene la concentración de los mutágenos en la muestra con respecto a la confiabilidad de la prueba?

,F

Q

___________________________________________________________________________________

ÍA

___________________________________________________________________________________

G

___________________________________________________________________________________

BO

R

R

AD

O

R

,C

O

LE

G IO

D

E

PR O

FE

SO

R

ES

TO

XI

C

O

LO

___________________________________________________________________________________

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

65

Laboratorio de Toxicología

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

XI

C

O

LO

G

ÍA

,F

Q

U N AM

Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113 (1980)173-215. Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de métodos para la identificación de mutágenos y carcinógenos químicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México, 1980. Págs. 31-50. Calderón-Segura, M. E., Gómez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., AmadorMuñoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 7–17. Villalobos-Pietrini, R., Hernández-Mena, L., Amador-Muñoz, O., Munive-Colín, Z., Bravo-Cabrera, J. L., Gómez-Arroy, S., Frías-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramírez-Pulido, J., Ortiz-Muñiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007) 192–204.

TO

APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

ES

1. Concepto de contaminación atmosférica.

SO

R

2. Posibles compuestos mutagénicos existentes en las muestras seleccionadas. 3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.

PR O

5. Fundamento de la prueba de Ames.

FE

4. Características generales de solubilidad de dichos compuestos. 6. Concepto de revertante espontánea.

D

E

7. Características generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames

G IO

y especialmente la cepa TA 98.

LE

8. Utilidad del agar de superficie.

O

9. Importancia del baño de temperatura a 45°C.

,C

10. Finalidad de colocar en el medio una solución que contenga histidina y biotina.

R

11. Características de la fracción S9 y su utilidad.

AD

O

12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo. laboratorio.

BO

R

R

13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados óptimos de la prueba en el

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

66

Laboratorio de Toxicología

U N AM

APÉNCIDE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS. a) Sales de Vogel-Bonner 50X.

K2HPO4 anhídro

500 g

NaHPO4·4 H2O

175 g

,F

100 g

ÍA

Ácido cítrico·H2O

G

10 g

LO

MgSO4·7 H2O

Q

En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden:

XI

C

O

Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

TO

b) Bacto-agar

ES

En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar más 500 mL de agua destilada. Esterilizar en

Dilución de las sales Vogel-Bonner 50x

FE

c)

SO

R

autoclave el material a anterior 121°C durante 15 minutos

PR O

En un matraz de 1 L colocar 20mL de las sales de Vogel-Bonner 50x más 500 mL de agua destilada.

E

Esterilizar en autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos Solución de glucosa al 40% p/v

D

d)

G IO

En un matraz de 125 mL colocar 20 g de glucosa más 50 mL de agua destilada. Esterilizar en

O

LE

autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos Cajas Petri con Medio mínimo E de Vogel-Bonner

,C

e)

O

R

En un matraz de 2 L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121 °C por 15 minutos, añadir los 500

AD

mL de bacto-agar, 500 mL de la dilución de las sales Vogel-Bonner y 50 mL de solución de glucosa al

R

40% p/v, mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma

BO

R

hasta cubrir la base (aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar aproximadamente 33 cajas.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

67

Laboratorio de Toxicología

f)

Solución Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM

U N AM

Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento, aforar a 100 mL. Esterilizar por filtación o autoclave. Almacenar a 4°C en oscuridad.

Q

Agar de Superficie

,F

g)

ÍA

Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la

G

mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodón, esterilizar en autoclave y almacenar a

C

TO

XI

h) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solución A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada.

O

LO

temperatura ambiente

Solución B. Disolver 2.76g de NaH2PO4·H2O en 100 mL de agua destilada.

ES

Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solución A y 19 mL de la Solución B. Almacenar a

SO

R

4°C. Esterilizar la solución final en autoclave.

Solución de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M

FE

i)

PR O

Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar

Mezcla fracción S9

G IO

j)

D

E

en autoclave y almacenar a 4°C.

Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estériles de 16 x 150 mm y descongelar previamente

LE

la fracción S9 en baño de agua con hielos (4°C). Tomar las alícuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar

,C

O

siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera

R

para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para

BO

R

R

AD

O

poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

68

Laboratorio de Toxicología

Tabla 4. Alícuotas para preparar la mezcla S9

6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Glucosa-6-fosfato* NADP+* S9

7.2 mL 0.16 mL 0.0104 g 0.024 g 0.8 mL

G

ÍA

0.0013 g 0.0030 g 100 L

U N AM

mLde mezcla S9 recomendada para

Q

Para 1 mL de Para 8 mezcla S9 (Cantidad un grupo) 0.9 mL Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 0.02 mL 7.4 Solución de Cloruros: MgCl2

,F

Reactivos

LO

*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos Eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P

C

O

y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera

TO

XI

desechables.

ES

En un tubo estéril de 16x 150mm, añadir el amortiguador de fosfatos y la solución de cloruros, mezclar

R

en vortex, tomar una alícuota de 500 L(con micropipeta) y añadirla en el tubo Eppendorf que contiene

SO

a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el

FE

vortex. Tomar nuevamente otra alícuota de 0.5 mL y añadirla al tubo Eppendorf que contiene el

PR O

NADP+ para disolverlo, agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fracción S9 y tomar la alícuota correspondiente para añadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y

D

E

filtrar utilizando una unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm), obteniendo el filtrado en otro tubo de

G IO

16x150mm ESTÉRIL. Alicuotar 1.3 mL de la mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

,C

O

LE

NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.

R

R1: Sobre doble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.

O

R2: puntas para micropipeta y tubos de plástico.

AD

R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos

BO

R

R

aromáticos policíclicos y otros compuestos mutagénicos. R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepa TA98.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA

69