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• Medina Jhoreima

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GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Y MEDIOS UTILIZADOS Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Grampositivas).

CONDICIONESS GENERALES MICROORGANISMOS

PARA

EL

CULTIVO

DE

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc

Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones

mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. Luz ambiental La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. pH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. Temperatura Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios. Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante

.Staphylococcus aureus

Son cocos Gram positivos, aunque en cultivos viejos y células fagocitadas, pueden presentarse Gram negativo, no esporulado, móviles, de 0.8 a 1 micra de diámetro. Se divide en varios planos formando agrupaciones en forma de racimos en medios sólidos; en medios líquidos se pueden observar individuales o en pares y prefieren los ambientes aerobios mas que anaerobios. Poseen una enzima β – Lactamasa lo que les confiere resistencia a la penicilina y algunos de sus derivados. Las cepas de S. aureus que pertenecen al fagogrupo III. Al desarrollarse en un alimento. Pueden producir una toxina que es la causante de la intoxicación; esta toxina es estable al calor y no se destruye durante la cocción de alimentos a 100ºC/15 a 30 minutos, aunque el microorganismo si aparece a 60ºC/30 minuto, aproximadamente dependiendo de la cepa y la concentración. Las cepas perteneciente al fagogrupo II, en general son causante de las infecciones nosocomiales vehiculizadas por el personal medico, paramédico, y los implementos utilizados en las practicas diarias. La presencia de este microorganismo en la piel puede provenir de la piel, la garganta, la nariz de los manipuladores de los alimentos que actúan como portadores sanos, los materiales y equipos sucios, materia prima de origen animal contaminadas y en general por una falta de higiene en los procedimientos. Una alta concentración de dicho microorganismo en un alimento es buen indicador que la manipulación, el control sanitario y la temperatura de almacenamiento no han sido los correctos. El consumo de

alimentos principalmente lácteos, pastel rellenos de cremas, productos de carnes de res, aves, pescado, jamón y en especial en alimentos excesivamente manipulados y con deficiencia de higiene, pueden dar origen a la proliferación de S. aureus con la consecuente formación de toxinas. Causando Gastroenteritis conocida como: “intoxicación alimentaría por Estafilococo a intoxicación estafilocócica.”

PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBA

Staphylococcus aureus + Coagulasa libre + Coagulasa ligada + catalasa + Voges proskauer rojo de metilo Acido aeróbica y anaeróbicamente + a partir del manitol, glucosa, lactosa y maltosa Acido aeróbica y anaeróbicamente a partir de arabinosa, inositol, rafinosa, , ramnosa y xilosa + alfatoxina Endonucleasas resistentes al calor + (termonucleasa) + DNasa Requerimiento de biotina Reducción de nitratos Hidrólisis de esculina y almidón Hidrólisis de urea, arginina, acido + glutámico Descarboxilación de la lisina

PRUEBA DE COAGULASA La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas) producen esta enzima. Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeño con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación entre las 4 y 24 horas. Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). La técnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada. El mecanismo de acción de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de Ca2+.La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos.

FIG 1-2 parte izquierda negativo (no coagulación), parte derecha positivo (el contenido no cambia cuando el tubo no es invertido; completa coagulación)

PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer) Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: 1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio. 2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: 2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos (Fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol 2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario. La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0).Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico. Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración amarilla constituye una reacción negativa

FIG 3-4 la parte izquierda muestra la prueba de rojo de metilo sin inocular y sus respectivos resultados, la parte derecha muestra los reactivos utilizados en esta prueba.

En la izquierda se observa un tubo sin inocular, en el centro un tubo al cual se le agregaron los reactivos y su resultado es negativo para rojo de metilo y positivo para voges-proskauer, en el tubo de la derecha se observa un tubo el cual una vez agregado los reactivos su resultado es positivo para rojo de metilo pero negativo para voges-proskauer.

PRUEBA DE UREA El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia. La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea produciendo amoniaco, CO2 y agua. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio. Produciendo una alcanalización y un aumento de Ph del medio. La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio: amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Interpretación Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones positivas en 1-2 horas dando un color fucsia en el medio por viraje del indicador de Ph una prueba negativa presenta un color amarillo-anaranjado en el medio.

FIG 4-5 muestra los tubos de la prueba de urea donde se resalta positiva (color fucsia) para Staphylococcus aureus. En el tubo de la izquierda se observa sin inocular el medio, en el centro uno con resultado positivo, a la derecha se observa un tubo con resultado negativo para urea.

DESCARBOXILACION DE LA LISINA Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color original violeta. El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de descarboxilar la lisina, produciendo un cambio de color del púrpura de bromocresol. Sin embargo, esta descarboxilación sólo se puede hacer en un medio ligeramente ácido, que se consigue con la fermentación de glucosa, por ello esta prueba está limitada a los microorganismos capaces de utilizar la glucosa. Cuando el pH del medio baja, el indicador vira a amarillo. Al alcalinizar el medio debido a la descarboxilación de la lisina, el indicador (púrpura de bromocresol) vira a rojo púrpura. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan un

precipitado negro. Además pueden aparecer burbujas de gas, que pueden incluso desplazar el medio.

A B C FIG 6 muestra los tubos de la prueba de LIA donde podemos resaltar que para esta prueba Staphylococcus aureus es negativo.

A tubo sin inocular B resultado positivo C resultado negativo (Para Staphylococcus aureus)

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

FI G 7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos resultados para: sulfuro, indol y motilidad además de su color inicial, demostrándose que esta prueba es negativa para Staphylococcus aureus. En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra. La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

CITRATO DE SIMMONS Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

FIG 11-12 Y 13 se muestran los tubos con la prueba de citrato con sus respectivos resultados, además de su color inicial resaltándose que para esta prueba Staphylococcus aureus es negativo.

CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:   

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: 1. Método del portaobjetos (recomendado):     

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

HIDRÓLISIS DE LA GELATINA Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina. La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.

Interpretación:

Positiva Tubo inoculado: medio líquido Tubo de control: el medio se mantuvo sólido

FIG 14 En la parte izquierda muestra la reacción positiva en una placa que para Staphylococcus aureus es positiva y en la parte derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.

Negativo Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un tiempo adicional. Tubo de control: el medio se mantiene sólido

FIG 15 Parte izquierda muestra la reacción negativa en una placa, parte derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.

PRUEBA DE ARGININA Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en aminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol).

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

POSITIVO

NEGATIVO

HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA La excluyan contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Hay microorganismos que hidrolizan la esculina en esculetina y glucosa, la primera reacciona con sales de hierro originando un compuesto de color negro. Se realiza en tubos inclinados incubados durante 48 h. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

POSITIVO

NEGATIVO

TSI Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.

FIG 16 muestra la prueba en un tubo sin inocular con su respectivo color inicial K/A Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiarán a amarillo.

FIG 17 Y 18 muestra solo la fermentación de un azúcar: la glucosa por lo cual se lee como K (alcalino)/A (acido) en la parte izquierda se muestra un tubo con la presencia de gas. A/A Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán también el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiará a amarillo.

A/A(g) aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.

FIG 19 muestra como se presenta la fermentación de los tres azucares A (acido) / A (acido) con presencia de gas resaltemos que Staphylococcus aureus fermenta las tres azucares.

K/K Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.

K/A(H2S) aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sodio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.

Producción de gas Si el microorganismo es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o con el desprendimiento del tubo dejando una área clara. Si el microorganismo es anaerogénico, no hay producción de gas. Producción de ácido sulfhídrico: Si el microorganismo produce este acido, se manifestara por la presencia de un precipitado negro del sulfuro de hierro, en la parte profunda del tubo. Si el microorganismo no produce este acido, se manifestará por la ausencia de dicho precipitado

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae..

Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

PRUEBA RIBONUCLEASA (DNasa) Algunas bacterias como Staphylococcus aureus excretan nucleasas que hidrolizan el DNA. Esta prueba se realiza haciendo una estría gruesa en una placa de medio que contenga DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado formando zonas claras. Incubación de 18-24 horas a 37ºC

POSITIVO

NEGATIVO

FIG (DNasa S. aureus cuando esta inundado con 1N HCL)

MEDIOS DE CULTIVOS AGAR NUTRITIVO Estos medios nutritivos son adecuados para el cultivo de bacterias exigentes y, tras adición de sangre, fluido ascítico o suero, también sirven para el cultivo de Estreptococos, Pneumococos, bacterias erisipeloides y otros gérmenes. Se han utilizado así mismo para la determinación del número de gérmenes, para su aislamiento y enriquecimiento, así como en la preparación de medios de cultivo especiales como medios basales de alto valor. AGAR NUTRITIVO

Co lor Ini cia l

COMPOSICIÓN (gr/Lt) Peptona de carne Extracto de carne Agar – agar (Ausente en el caldo)

5.0 3.0 12.0

Color del agar: claras e incoloras hasta una tonalidad amarillenta

CALDO GIOLITTI CANTONI

http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/Giolitti_Cantoni_Broth_Base.p df Fundamento En el medio de cultivo, la tripteína, el extracto de carne y el extracto de levadura, constituyen la base nutritiva para el desarrollo de microorganismos. El piruvato de sodio y el manitol son estimulantes del desarrollo de estafilococos y ayudan a la detección de estos microorganismos presentes en la muestra, aún en pequeñas cantidades. El cloruro de litio inhibe el crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores de lactosa, mientras que otras bacterias Gram positivas, son inhibidas por el telurito y la glicina. Cubriendo la superficie del medio inoculado con una capa de agar o parafina estéril, se evita el crecimiento de micrococos.

La Federación Internacional de Lechería (IDF) y American Public Health Association (APHA), recomiendan el uso de este medio de cultivo para el enriquecimiento de S. aureus en el análisis de productos lácteos. También, fue recomendado por Mossel y col. para la detección de S. aureus en leche en polvo y otros alimentos para niños, así como para el análisis microbiológico de productos cárnicos y huevos deshidratados. Para la determinación del número de gérmenes según la técnica de NMP.

COMPOSICIÓN (gr/Lt) Peptona de caseína Extracto de carne Extracto de levaduras Cloruro de litio D (-) manitol Cloruro sódico Lisina Piruvato sódico

10.0 5.0 5.0 5.0 20.0 5.0 1.2 3.0

Aditivos: Telurito potásico 0.052 Selectivo: Cloruro de litio que inhibe los gérmenes Gram negativos y el telúrico que inhibe los positivos. Color del medio: claro y amarillento Forma de actuación El ennegrecimiento del caldo giolitti cantoni pone de manifiesto la presencia de estafilococos, ya que el crecimiento de estos microorganismos es favorecido por el piruvato y la glicina; es activado, sobre todo por una concentración elevada de manitol. Los contaminantes Gram negativos son inhibidos por el cloruro de litio y los Gram positivos son inhibidos por el telurio. Gracias a una cierta anaerobiosis, se logra inhibir el crecimiento de micrococos. El crecimiento de estafilococos se pone de manifiesto por una coloración negra debido a la reducción del telúrico a telurio.

Agar para la prueba de la DNAasa. Este es un medio selectivo para comprobar la actividad desoxirribonucleasa. Los microorganismos DNAasa positivos despolimerizan el DNA presente en el medio. La actividad enzimática se revela inundando la placa con una solución 0,1 N de HCl. Si la prueba es positiva se observan zonas transparentes alrededor de las colonias. Composición: Triptosa, Acido Cloruro sódico, Agar, Agua destilada,

20g desoxirribonucleico,

2g

5g 15g 1000 ml

Preparación: Disolver los componentes en un baño de agua caliente y ajustar el pH a 7.5. Dispensar en tubos y autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. AGAR DE SIMMONS CON CITRATO. Medio recomendado para la diferenciación e identificación de enterobacterias en base a la utilización de citrato como única fuente de carbono. Al medio se le añade azul de bromotimol y agar 1.5%. Los microorganismos capaces de utilizar el citrato crecen en el medio alcalinizándolo, virando el color desde verde (inicial) a azul oscuro en 24-48 horas. Composición: Sulfato magnésico, 0.2g Dihidrógeno fosfato de amonio, 1g Hidrógeno fosfato de dipotasio 1g Citrato sódico, 2g Cloruro sódico, 5g Agar, 15g Azul de bromotimol, 0.08g Agua destilada, 1000ml

Preparación: Disolver todos los componentes en un baño de agua caliente y ajustar el pH a 7. Dispensar en tubos y autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. Dejar enfriar los tubos en pendiente. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul. PRUEBA DE MANITOL SAL PARA Staphylococcus aureus Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. NaCl 7,5% le proporciona lo selectivo ya que sólo estos microorganismos osmotolerantes u osmófilos pueden multiplicarse en él. Manitol es el único azúcar fermentado por las cepas patógenas de este género bacteriano. La producción de ácidos proveniente de la fermentación del manitol es detectada por el viraje del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus epidermidis no fermenta el manitol, dará lugar a colonias pequeñas rodeadas de un halo púrpura.

FIG Agar manitol sal con rojo de fenol (reacción de manitol positivo colonias amarillas con zonas brillantes).

AGAR BAIRD-PARKER Modo de la acción Este medio contiene cloruro de litio y telurito para inhibición del crecimiento de la flora en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de Estafilococos. Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de Estafilococos muestran dos características diagnosticas por lipólisis y proteolisis. Se producen halos y anillos característicos debido a la reducción del telurito a telurio, se desarrolla una colonia negra. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito se presentan con notable parelismo con la coagulasa positividad, y por tanto pueden utilizarse como inducen de esta última. Composición típica (g/litro) ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

Peptona de caseína: 10.0 g/litro extracto de carne: 5.0 g/litro extracto de levadura: 1.0 g/litro piruvato de sodio:10.0 g/litro glicina: 12.0 g/litro cloruro de litio : 5.0 g/litro agar-agar: 15.0. g/litro

También puede ser agregado: Emulsión de la yema de huevo, telurito 50 ml; se procede, sulfametazina 0.05 g/Lt.

Empleo e interpretación Diluir convenientemente el material a investigar y extender. Incubación desde 24 hasta 48 horas a 37 ºC. Aspecto de colonias

microorganismos

Staphylococcus aureus

Son negras, brillantes, convexas 1-5 milímetros de diámetro con un estrecho, el borde blanco rodeadas por una zona clara 2-5 milímetros de ancho. Los anillos opacos dentro de las zonas claras aparecen solamente después de 48 horas de la incubación.

Staphylococcus epidermitis

Negras, lustrosas, forma irregular. Al cabo de 24 horas, presencias de zonas opacas alrededor de las colonias.

Micrococcus

Crecimiento ocasional, colonias muy pequeñas, pardas hasta negras ausencia de halos de clarificación.

Bacillus

Pardo oscuras, mates presencia a veces de halos de clarificación al cabo de 48 horas.

Para las colonias representativas

Agar Baird-Parker (colonias negras con precipitado claro)

AGAR KRANEP MODO DE ACTUACION El litio, el rodanuro potásico inhibe toda la flora Gram negativa. La actidione (= cicloheximida) reprime a mohos y gérmenes esporulantes. El piruvato sódico tiene efectos estimulantes del crecimiento para los Estafilococos y activando su metabolismo, compensa el efecto de las sustancias inhibidoras. El manitol activa selectivamente a los Estafilococos, pues es utilizado casi exclusivamente por ellos. La adición de yema de huevo sirve para los Estafilococos y activando su metabolismo, compensa el efecto de las sustancias inhibidoras. El manitol activa selectivamente a los Estafilococos, pues es utilizado casi exclusivamente por ellos. La adición de yema de huevo sirve para la demostración de sus componentes, lo que se reconoce por la aparición de halos alrededor de las colonias. La reacción de la yema de huevo, como indicadora de la posible formación de plasma coagulasa no es concluyente, pero esta más aceptada la utilización aerobia del manitol. Composición ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

peptona de carne 10.0 g/Lt Piruvato sódico 8.2 g/Lt cloruro sódico 3.0 g/Lt hidrogenofosfato dipotásico 2.0 g/Lt tiocianato potasico 25.5 g/Lt cloruro de litio 5.1 g/Lt azida sódica 0.05 g/Lt actidione 0.041 g/Lt D(-) manitol 5.1 g/Lt agar- agar 13.5 g/Lt

Aditivo: emulsión de yema de huevo 100ml Empleo e interpretación: sembrar las placas en superficie .Incubación: hasta 48 horas a 37ºC

por estría

Colonias que degrada la yema de huevo: Estafilococos

FIG. Agar Kranep (precipitado alrededor de las colonias por la degradación de la yema de huevo)

AGAR BASE SANGRE Modo de la acción Este medio de cultivo representa una base nutriente rica, que proporciona las condiciones óptimas del crecimiento para todos los microorganismos relevantes. El valor de pH de 6.8 estabiliza los corpúsculos rojos de la sangre y favorece la formación de las zonas claras de la hemólisis (NORTON 1932). Fresco, desfibrinado de ovejas que la sangre es la más conveniente para determinar formas de la hemólisis. El agar de sangre hervido (“agar del chocolate”) es un medio de cultivo extremadamente rico y puede ser preparado calentando después de que se haya agregado la sangre. Si se va la base del medio de cultivo a ser utilizada sin sangre, el pH se debe, sin embargo, ajustar a 7.2 a 7.4 puesto que la mayoría de las colonias bacterianas aparecen algo anteriores y crecen mejores en un entorno levemente alcalino. Incubación: 24-48 horas a 37ºC

Composición típica (g/litro) ➢

Substrato nutriente (extracto y peptonas del corazón) 20.0;

➢

cloruro de sodio 5.0:

➢

agar-agar 15.0.

FIG Agar base sangre (positivo para S. aureus hemólisis ß después de 24 horas).

Empleo e interpretación Sembrar las placas en superficie.

Incubación: bajo condiciones óptimas casi siempre de 24 horas a 35°C. En condiciones aerobias (Cl.perfringens, en anaerobiosis) Estudio y determinación de las formas de hemólisis. Cepas Inóculo Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Bacillus cereus Listeria monocytogenes Clostridium perfringens

Hemolisis ß ß Alfa ß ß

AGAR VOGEL JOHNSON Modo de la acción El crecimiento de bacterias acompañantes es inhibido casi totalmente por el telurito, el cloruro de litio y una alta concentración de glicina. Los estafilococos pueden también ser inhibidos levemente, pero esto es compensado por la presencia del manitol y de la glicina. El manitol también sirve como un reactivo de diferenciación mientras que es degradado a ácido por la mayoría de los estafilococos patógenos; esta reacción es indicada por el rojo de fenol, que cambia su color a amarillo. Los estafilococos patógenos también reducen el telurito a telurio metálico, así se explica su color negro en las colonias. Composición típica (g/litro): ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

Peptona de la caseína 10.0; extracto de levadura 5.0; fosfato di-potasico de hidrógeno 5.0 ; Manitol D (-) 10.0; cloruro de litio 5.0; glicina 10.0; rojo de fenol 0.025; agar-agar 13.0.

Empleo e interpretación: Inocular las placas. Incubación: hasta 48 horas a una temperatura de 35°C (aerobio).Los estafilococos patógenos crecen generalmente en el plazo de las primeras 24 horas.

Aspecto de colonias

microorganismos

Pequeñas, color negro, rodeadas de zonas Staphylococcus aureus amarillas. Pequeñas, negras- gris, no están rodeadas Staphylococcus epidermitis ,y por zonas. otros

FIG S.aureus (colonias negras cambia el indicador de Ph a amarillo) AGAR CHAPMAN Para el aislamiento y la diferenciación de estafilococos en comestibles y de otros materiales según CHAPMAN (1946, 1948, 1952).

Modo de la acción Solamente los microorganismos que exhiben una alta tolerancia de la sal pueden crecer en este medio de cultivo; éstos incluyen a colonias de Staphylococcus, que pueden ser distinguidas en base de la degradación del manitol, de la gelatinolisis y de la producción del pigmento. SMUCKLER y APPLEMAN (1964) recomienda la adición del acido de sodio (65 mg/litro) para mejorar la inhibición de la especie bacilo. Composición típica (g/litro) ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

Peptona de caseína 10.0 extracto de levadura 2.5 fosfato di-potasico de hidrógeno 5.0 gelatina 30.0 lactosa 2.0 Manitol D (-) 10.0 cloruro de sodio 75.0 agar-agar 12.0

Empleo e interpretación Inocular las placas separando la muestra en la superficie del medio. Incubación: 48 horas a una temperatura de 35°C. Las colonias que forman pigmentos son de color amarillo, incoloras de color blanco a oro. La formación del ácido del manitol es indicada por un cambio del color a amarillo, cuando las gotas de una solución de 0.04% azul de bromo timol se aplican a los sitios donde se encuentran las colonias. Las colonias individuales deben primero ser quitadas con un lazo del platino. Según STONE (1935), la gelatinolisis es un indicador de la toxicidad y es demostrado por el aspecto de zonas claras alrededor de las colonias cerca de 10 minutos después de aplicar gotas de una solución saturada del sulfato del amonio o de una solución ácida el 20% sulfosalicilico.

FIG Agar CHAPMAN (Crecimiento de Staphylococcus tolerantes de sal).

AGAR AZIDA SANGRE (base) Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Estreptococcus y Staphylococcus, a partir de posiciones, aguas residuales, productos alimenticios u otros materiales objetos de investigación. Puede utilizarse con o sin adición de sangre.

FORMA DE ACTUACIÓN Este medio de cultivo dispone de una excelente y abundante base nutritiva, que permite incluso el crecimiento de microorganismos exigentes, la azida inhibe a la flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram positiva se desarrolla más o menos indemne. El proteus crece, por supuesto pero como colonias definidas sin agrupación. La adición de sangre al medio de cultivo facilita la interpretación de las formas de hemólisis.

COMPOSICIÓN gr/Lt Triptosa 10.0 Extracto de carne 3.0 Cloruro sódico 5.0 Adicionalmente: sangre desfibrinada 50ml

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El material a investigar se extiende sobre la superficie del medio de cultivo. Incubación. Hasta tres días a 37ºC. Las colonias se someten a estudios para su identificación. Compruébense los halos de hemólisis producidos.

AGAR MOSSEL Para el enriquecimiento selectivo de todos las Enterobacterias, a partir de alimentos y otros materiales de investigación. COMPOSICIÓN Peptona de carne 10.0 Extracto de carne 1.0 D – Manitol 10.0 Cloruro de sodio 10.0 Rojo de fenol 0.025 Agar – agar 12.0 Suplemento 100ml de solución de yema de huevo (20%) Sulfato de polimixina B (0.1%) 1ml Selectivo: Sulfato de polimixina β Diferencial: Manitol, yema de huevo, rojo de fenol Color del agar: Guayaba Forma de actuación Bacillus cereus es manitol (-), el contenido del manitol posibilita la separación de la biota manitol (+), que se manifiesta por viraje del rojo fenol. La selectividad se debe a la resistencia del microorganismo a las

concentraciones de polimixina, inhibiendo la biota acompañante. B. cereus forma Lectinasa. Productos de degradación de lecitina (yema de huevo) se acumulan alrededor de las colonias formando un precipitado blanco. Colonias características: Colonias rojas – rosadas con un halo de precipitado blanco, efecto de que es manitol (-) y produce la lecitinaza que degrada la lecitina (presente en la yema de huevo). La presencia de colonias amarillas indican microorganismos manitol (+), por lo que se produce viraje del medio esto no corresponde a B. cereus.

FIG Bacillus cereus colonias rugosas, secas de color rosado y rodeadas de precipitado blanco medio selectivo y diferencial, permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis

Clostridium perfringens

Son bacilos Gram positivos anaerobios, esporulados pueden estar en cadenas, parejas o individuales, pertenecen a la Bacillaceae caracterizado por su forma de bastón, con un tamaño promedio de 0.9 a 0.3 - 3 a 9 micras, con espora ovales, subterminales no deformante y resistente al calor, son anaerobios estrictos aunque pueden crecer en presencias de niveles bajos de oxigeno pueden ser aerobios tolerantes y manejan una temperatura de crecimiento: óptima 37ºC (mésofilo), temperatura mínima 10 a 20ºC y una temperatura máxima de 55ºC. Estos microorganismos son encapsulados cuando se encuentran en heridas, inmóviles. Pero se puede desarrollar en condiciones de dióxido de carbono y nitrógeno, potencian en la presencia de sales biliares y cloruro de sodio al 2% y en presencia de cloruro de sodio al 5% se inhiben, su pH óptimo 5.9 pero pueden crecer entre 5.5 – 8.0 la disponibilidad de agua requerida es de AW 0.94 limitadas sus esporas termoresistentes crecen a temperatura superior a 37ºC y aun AW mayor de 0.64. Presenta una entero toxina termolábil (destruye a 60ºC por 10 minutos), son Quimio organotrofos (se alimenta de sustancias químicas u orgánicas) y pueden producir una infección alimentaría. Se encuentran distribuidos en toda la naturaleza y el tracto intestinal de humanos y animales como el ganado vacuno y porcino, todos sanos. Se clasifican en cinco tipos (A - E), dependiendo de la clase de toxinas que producen.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Acido de la glucosa Ácido sulfhídrico Licuefacción de la gelatina Manosa Maltosa Lectinasa Proteólisis DNasa Lactosa Nitratos Indol Lipasa Digestión de caseína Manitol Cátalasa Motilidad Ramnosa Ureasa Almidón Hemólisis

+ + + + + + + + + +/d d d Doble zona

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

Positivo

Negativo

DNasa Algunas bacterias excretan nucleasas que hidrolizan el DNA. Se hace una estría gruesa en una placa de medio que contenga DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

KLIGLER Y TSI Se utiliza este medio en la diferenciación de enterobacterias. En el mismo medio se pueden determinar la fermentación y utilización de los hidratos de carbono, la producción de sulfhídrico y la producción de gas. El primer medio (Kligler) contiene glucosa y lactosa, el segundo además contiene sacarosa. Se preparan en tubos poco inclinados y con bastante medio, inoculándolos por picadura en el centro del medio y realizando además una estría recta al salir sobre la superficie inclinada del medio. La producción de ácido de glucosa se pone de manifiesto en el fondo del tubo por viraje del indicador a amarillo, la de la lactosa en la superficie inclinada por viraje al mismo color, la producción de gas a partir de glucosa por aparición de burbujas que agrietan el medio y la de sulfhídrico por la aparición de un precipitado negro debido a las sales de hierro presentes.

Ácido de la glucosa (+)

PRODUCCION DE SULFHIDRICO Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.

La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS. Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato de metionina y sulfato ferroso.

Ácido sulfhídrico (+)

HEMOLISIS DE LA SANGRE Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes. Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba.

Fig. Muestra la hemólisis total de Clostridium perfringens

PRUEBA DE UREA El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia. La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea produciendo amoniaco, CO2 y agua. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio. Produciendo una alcanalización y un aumento de Ph del medio. La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio: amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Interpretación Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones positivas en 1-2 horas dando un color fucsia en el medio por viraje del indicador de Ph una prueba negativa presenta un color amarillo-anaranjado en el medio.

UREASA (+) UREASA (-) Fig. Muestra la prueba de la ureasa que da como resultado para Clostridium perfringens +/-.

Reducción de Nitrato a Nitrito: Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. El nitrato puede ser reducido a nitrito. Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanaftilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rosa-rojo.

Reducción de Nitrato hasta Nitrógeno gaseoso: Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido más que hasta nitrito produciéndose nitrógeno gas. Si al añadir zinc en polvo no aparece color rojo es que no queda nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación).

POSITIVO

NEGATIVO

HIDRÓLISIS DE LA GELATINA La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

FIG 7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos resultados para: sulfuro, indol y motilidad además de su color inicial, demostrándose que esta prueba es positiva para Clostridium prefingers.

En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra. La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

LECTINASA Algunos microorganismos producen lecitinasa que actúa sobre la lecitina. Se utiliza el agar yema de huevo, se inocula e incuba a 35-37°C en anaerobiosis durante 48 h. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.

INDOL Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol. La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se detecta añadiendo Pdimetilaminobenzaldehído.

PROTEOLISIS La hidrólisis de las proteínas lácticas por acción microbiana se acompaña en general de la producción de un sabor amargo producido por algunos polipéptidos. Las alteraciones producidas por los microorganismos proteolíticos son:  proteólisis ácida en la que tienen lugar simultáneamente la proteólisis y la producción de ácido,  proteólisis con acidez mínima e incluso con alcalinidad,  leche “cortada“ producida por enzimas bacterianas del tipo de la renina en una etapa inicial de la proteólisis, y proteólisis lenta por endoenzimas

La proteólisis ácida puede estar producida por diversas especies del género Micrococcus, algunos de los cuales se hallan en la ubre de la vaca. Uno de los estreptococos intestinales, el S. faecalis es un organismo ácido láctico muy proteolítico. Como los demás Enterococos es termodúrico y capaz por tanto de producir proteólisis en la leche pasteurizada. Los esporos de las cepas proteolíticas de algunas especies de bacillus fermentadores de la lactosa, como el B. cereus, sobreviven a la pasteurización, e incluso a tratamientos térmicos más drásticos, produciendo luego proteólisis ácida. Entre las especies de los géneros Micrococcus, Pseudomonas, proteus, Achromobacter, Flavobacterium y Serratia hay gérmenes muy proteolíticos Obsérvese que estas especies desarrollan a temperaturas bajas por lo que son capaces de producir proteólisis y amargor aún en leche refrigerada. La proteólisis lenta carece de importancia en la leche en circunstancias normales, pero la posee cundo las bacterias disponen de una cantidad considerable de tiempo.

CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:   

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

2. Método del portaobjetos (recomendado )

 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

 Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Fig. Muestra la prueba de catalasa que para Clostridium perfringens es negativa.

MEDIOS DE CULTIVOS SPS Sulfito – polimixina – sulfatiaxina de Clostridium perfringens en alimentos de todo tipo. Composición Peptona de caseína 15.0 Extracto de levadura 10.0 Citrato de hierro III 0.5 Polimixina β sulfato 0.01 Sulfadiazina sódica 0.12 Agar-agar 13.9 Selectivo: polimixina y sulfadiacina Diferencial: sulfito y citrato férrico Color del agar: claro y amarillento Forma de actuación El sulfito es reducido a sulfuro por Clostridios, reaccionando con citrato férrico, dando una coloración negra (colonias).Otros microorganismos reductores de sulfitos son notablemente inhibidos por la polimixina y la sulfadiacina (sulfa-pirimidina). El pequeño contenido en sulfito permite el crecimiento incluso de los Clostridios sensibles al, formándose suficiente ennegrecimiento de las colonias.Colonias características: negras, sin halo dentro del agar.

CALDO DIFERENCIAL PARA Clostridios (DRCM) Caldo diferencial para Clostridios. Para la enumeración de gérmenes, según la técnica de NMP, de Clostridios totales en alimentos y otros materiales. Composición Peptona de caseína 5.0 Peptona de carne 5.0 Extracto de carne 8.0 Extracto de levadura 1.0 Almidón 1.0 D (+) glucosa 1.0 L- cloruro de cisteina 0.5 Acetato sódico 5.0 Disulfito sódico 0.4 Citrato de amino y hierro (III) 0.5 Resazurina, sal sódica 0.02 Selectivo: polimixina Color del medio: claro parduzco

Forma de actuación: La resazurina como indicador redox, sirve para el control de anaerobiosis. Los Clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que como sulfato de hierro, ennegrece al medio de cultivo. Dado que estas bacterias forman también sulfuro, se produce en primer lugar a liberación al material a cultivar de forma vegetativas, mediante el correcto tratamiento previo, y luego se produce al estudio de esporulantes anaerobios. Mediante la adicción de polimixina al medio VRCM, se puede impedir el crecimiento de la mayoría de los gérmenes más esporulados.

Control de calidad del medio de cultivo Cepas de ensayo Escherichia coli Bacillus cereus Pseudomonas aeruginosa Clostridium bifermentans Clostridium perfringens Clostridium perfringens Clo0stridium septicum

crecimiento Bueno Moderado Ligero

ennegrecimiento -

Bueno

+

bueno

+

Bueno

+

bueno

+

AGAR PARA ANAEROBIOS seg. BREWER Para el cultivo de Clostridios y otros microorganismos anaerobios, según BREWER. FORMA DE ACTUACIÓN Este medio de cultivo contiene una serie de sustancias reductoras que garantizan una anaerobiosis suficiente QUASTEL y STEPHENSON, AUBERTIN y col. El azul de metileno sirve como indicador redox cuya decoloración es señal de anaerobiosis efectiva. COMPOSICIÓN Peptona de caseína 10.0 Peptona de harina de soja 5.0 Extracto de levadura 5.0 L – cistina 0.4 D (+) glucosa 10.0

Cloruro sódico 5.0 Tioglicolato sódico 2.0 Sulfoxilato – formaldehído sódico 1.0 Azul de metileno 0.002 Agar – agar 12.6

EMPLEO E INTERPRETACIÓN Sembrar al medio de cultivo por estría o por los procedimientos de fusión y vertido en placas. Para la comprobación de formadores de esporas, elevar la temperatura de la mezcla a 80 – 100ºC. Incubación bajo condiciones optimas, en la atmósfera lo mas anaeróbica posible.

AGAR SULFITO- HIERRO (BASE) Para la demostración y enumeración de Clostridios en carnes y productos cárnicos. Forma de actuación Las formas vegetativas son eliminadas mediante un breve calentamiento del material objeto de investigación, en tanto que las esporas bacterianas sobreviven y germinan. El sulfito presente en el medio de cultivo es reducido a sulfuro por los elementos H2S positivos y forma con el hierro negro, el cual tiñe de color negro las correspondientes colonias y alternativamente, de color pardo las H2S positivas débiles. En medio anaerobio y bajo estas condiciones, los Clostridios crecen como colonias negras.

COMPOSICIÓN (g/litro) Peptona de caseína 15.0;

Empleo e interpretación

Preparación de la muestra: de acuerdo con las recomendaciones de la ISO, homogeneizar la muestra desmenuzada se homogeniza con 9 partes de solución diluyente estéril (peptona de caseína el 0.1%, cloruro de cisteina 0.05%, cloruro sódico 0.85%). Se distribuyen porciones de 50 ml en matraces de 100ml y se colocan durante 1 minuto en un baño maría a 80ºC. A continuación, se enfrían rápidamente con agua fría. El material se extiende en capa delgada sobre la superficie de dos placas por cada ensayo. Una de las placas se incuba en condiciones aerobias y la otra en condiciones anaerobias, ambas a 30 ºC durante 2 días. Se deduce que existen Clostridios mésofilos cuando: a) solamente las placas cultivadas en condiciones anaerobias demuestran el ennegrecimiento y b) Sobre estas placas es negativo el ensayo de Bactident Catalasa.

catalasa, realizado con

Formación del gas: el cultivo es catalasa-positive. Ninguna formación del gas: el cultivo es catalasa-negativa.

-

AGAR TSC Para el aislamiento y enumeración de formas vegetativas, así como de formas esporuladas, de Clostridium perfringens en alimentos, material clínico de investigación y otros. Por su formulación este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de la internacional Organization for Strapdardization (ISO) (1978), a la APHA para el análisis de alimentos y la norma DIN 10165 para el análisis de carnes y productos cárnicos.

Forma de actuación Una base de alto valor nutritivo ofrece a los Clostridios las mejores posibilidades de desarrollo. El sulfito y el hierro ejercen un marcaje en las colonias formadoras de ácido sulfhídrico produciendo ennegrecimiento. El Agar TSC, la cicloserina inhibe la flora acompañante y provoca al mismo tiempo la formación de colonias mas pequeñas, produciendo ennegrecimiento difuso y por ello perturbante alrededor de las colonias de Clostridium perfringens. El agar SFP contiene polimixina y Conamicina como inhibidoras selectivos para inhibir los organismos reacompañamiento. Este medio de cultivo posee una selectividad algo mejor que el agar TSC. Composición (g/litro) Triptosa 15.0 Peptona de harina de soja 5.0 Extracto de levadura 5.0 Bisulfito sódico 1.0 Citrato de amonio y hierro (III) 1.0 Agar-agar 15.0 Aditivos: cicloserina 0.5, o bien polimixina 0.003, canamicina 0.012

Empleo e interpretación Estos medios de cultivo se siembran por estría, en superficie. Incubación 1824 horas a 37ºC, en medio anaerobio. El Clostridium perfringens crece como colonias negras. Deberán realizarse investigaciones para la identificación. Al emplear el suplemento Fluorocult agar TSC la temperatura de incubación es de 44ºC. Clostridium perfringens crece en forma de colonias negras. Deberán seguir análisis a efectos de identificación. Control de calidad del medio de cultivo Cepas de ensayo Clostridium perfringens ATCC 10543 Clostridium perfringens ATCC 13124 Clostridium tetani Clostridium navyi Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bacillus cereus ATCC 11778

crecimiento Bueno

Colonias negras fluorescencia + +

Bueno

+

+

Bueno

-

-

moderado/bueno -

-

moderado/bueno -

-

Ligero

-

-

ligero

-

-

Clostridium perfringens, Clostridium tetany

Clostridium

perfringens, Clostridium tetany

MEDIO DE CULTIVO TIOGLICOLATO Forma de actuación Las sustancias reductoras, tioglicolato, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. Debido a sus grupos sulfhídricos, se inactivan los compuestos de arsénico, mercurio y de otros metales pesados.

Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigación de materiales que contengan metales pesados o conservantes en cuya composición participan dichos metales pesados. La elevada viscosidad del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxigeno. El eventual aumento del contenido en oxigeno se pone de manifiesto por un viraje a rojo del indicador redox Resazurina sódica. Composición (g/litro) Peptona de caseína 15.0 Extracto de levadura 5.0 D(+)- glucosa 5.5 L (+) císteina 0.5 Cloruro sódico 2.5 Tioglicolato sódico 0.5 Rezasurina sódica (ausente en el caldo) 0.001 Agar – agar (ausente en el caldo) 0.75

Empleo e interpretación El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de cultivo. A continuación, puede superponerse una capa de aproximadamente 1cm de altura de parafina líquida estéril o de agar agua. Incubación: varios días a temperatura óptima Los gérmenes anaerobios crecen en la parte inferior del tubo de cultivo.

Control de calidad del medio de cultivo Cepas de ensayo Staphylococcus aureus ATCC 6538-P Bacillus subtilis ATCC 6633 Clostridium sporogenes ATCC 19404 Bacteroides vulgatus ATCC 8482 Candida albicans ATCC 2091 Candida albicans ATCC 10231

Crecimiento bueno bueno bueno (anaerobio) bueno (anaerobio) bueno bueno

Agar TSN (Agar selectivo para Clostridium perfringens MARSHAL) Forma de actuación El agar TSN está concebido para aprovechar la elevada tolerancia del Clostridium perfringens frente a la neamicina, la polimixina y el sulfito, su calidad fuertemente reductora del sulfito y su crecimiento óptimo a 46ºC . El crecimiento de otros Clostridios reductores del sulfito y el resto de la flora acompañante son inhibidos casi completamente. Añadiendo tioglicolato pueden mejorase y estabilizarse las condiciones de anaerobiosis. Composición (g/litro) Peptona de caseína 15.0 Extracto de levadura 10.0 Sulfito sódico 1.0 Citrato de hierro (III) 0.5 Polimixina –B sulfato 0.02

Neamicina sulfato 0.05 Agar-agar 13.5 Empleo e interpretación Este medio de cultivo se siembra, casi siempre por el procedimiento de mezclado en tubos o placas de petri o, mas raramente, por extensión en superficie. Cuando se utilizo en placas se recomienda añadir la solución de tioglicolato anteriormente mencionada. Incubación: anaerobiamente, en lo posible a 46ºC y no más de 8 horas. El Clostridium perfringens forma colonias. La visualización de las placas debe realizarse inmediatamente después de ser abiertas, ya que más tarde palidecen las colonias a causa de la oxidación del sulfuro de hierro. Control de calidad del medio de cultivo Cepas de ensayo Crecimiento Clostridium perfringens bueno/muy bueno ATCC 10543 Clostridium perfringens bueno/muy bueno ATCC 13124 Clostridium tetani ATCC moderado 19406 moderado Clostridium novyi 1795 Escherichia coli ATCC 25922 ningunos Pseudomonas aeruginosa ningunos ATCC 27853 moderado/bueno Proteus mirabilis ATCC 14273 CALDO DE CARNE COCIDA

Colonias negras + + -

colonias pardas

Forma de actuación Según TAROZZI y HIBLER, las partículas o fragmentos sólidos de tejidos, presentes en el medio de cultivo fluido, proporcionan a los microorganismos anaerobios unas condiciones favorables para su desarrollo, gracias al efecto reductor de los grupos SH de las proteínas musculares. Puesto que las

proteínas desnaturalizadas empleo de carne cocida.

son de más fácil acceso, resulta

ventajoso el

Composición Corazón de buey 30.0 Proteosa-peptona 20.0 D (+) glucosa 20. Cloruro sódico 5.0 Empleo e interpretación Este caldo debe ser utilizado inmediatamente después de su preparación y enfriamiento. Si esto no fuera posible, deberá hervirse brevemente para desalojar el oxigeno disuelto. Posteriormente evitar una reagitación. La siembra deberá efectuarse en la zona más próxima posible a los fragmentos de tejido. Para el cultivo de anaerobios estrictos, se recubre el caldo con Agar – agua o con parafina. Los Clostridios cultivadas bajo condiciones anaerobias, pueden dividirse en dos grupos: Sacarolitico: producen rápidamente ácido y gas sin digestión de la carne. Proteolitico: Degradación de las proteínas hasta aminoácidos, de los cuales precipita la tirosina como cristales filamentosos blancos. Para el aislamiento e identificación de gérmenes es necesario hacer resiembras en medios de cultivo sólidos, para anaerobios.

FIG: La capa de aceite mineral estéril permite que la superficie del caldo con carne molida de corazón de vaca quede totalmente cubierta para impedir la difusión de O2 al medio. Antes de inocular es conveniente hervir el medio durante 10 min. para liberar el O2

Bacillus cereus

Son bacilos Gram positivos, móviles, esporulados, son menos resistentes que la de Clostridium perfringens ya que se destruyen a 100ºC en 5 a 30 minutos, estas pueden ser: centrales, subterminales, elípticas, pertenece a la familia Bacillaceae. Anaerobio facultativo, mesófilo, (37ºC) pueden crecer a una temperatura entre 5ºC – 10ºC y 48ºC a 55ºC, aunque su temperatura óptima es de 30 a 35ºC, un AW es 0.45 y aun pH de 4.5 a 9.3. Son sensibles a la nicina y ácido sórbico (ácido para conservas), resiste a concentraciones de sal hasta 7.5ºC , se inactiva a 65ºC por 5 minutos.

Durante se esporulación producen sustancias con actividad antibiótica y elaboran durante la fase logarítmica una toxina termoresistente durante la germinación de sus esporas otras termolábil que originan toxinas termoresistente y durante la germinación de sus esporas otra termolábil que originan dos síndrome a patologías distinta relacionadas con alimentos, síndrome emético y el diarreico respectivamente. Es causante de intoxicación alimentaría a través de alimentos contaminados. Alimentos implicados Cereales, arroz, natillas, y salsa para tallarines, cremas, leche en polvos, productos deshidratados, especias entre otros.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Hidrólisis de gelatina Hidrólisis de almidón Reducción de nitritos Lecitinasa Arabinosa Indol Manitol Descomposición L-tirosina VP

+ + + + + + +

HISROLISIS DE LA CASEINA La capacidad para hidrolizar la caseína se determinó según Collins y col. (1989). Para ello los microorganismos se desarrollan en un medio que contiene caseína y que consta de dos fracciones: 1. TSA (20 g en 250 mL de agua destilada). 2. Leche descremada (10 g de en 250 mL de agua destilada). Cada fracción se esteriliza por separado. Concretamente la solución de caseína conviene esterilizarla a 115 ºC durante 30 min. Luego se dejan enfriar hasta 45 ºC, se mezclan y se reparte el medio en placas Petri. Las cepas se siembran mediante una estría central gruesa y la lectura de la prueba se realiza observando la aparición de un halo transparente alrededor del crecimiento bacteriano, cuando la bacteria es capaz de hidrolizar la caseína. El periodo de incubación para las cepas objeto de estudio ha sido de 5 d a 15 ºC.

SIM En el medio de SIM se mide la motilidad de las bacterias, es positiva cuando se existe turbidez en el medio pero negativo, cuando se observa la penetración del inóculo.

GELATINASA

Permite medir la presencia de gelatinasa. Si luego de cierto tiempo de refrigeración, la gelatina sigue en estado líquido, es indicativo de que la prueba resultó positiva y por tanto la bacteria tiene gelatinasa al licuar el medio.En este caso, el B. subtilis no posee la enzima gelatinasa, y por ende, el medio se solidificó en refrigeración. PRUEBA DE GLUCOSA Y SALICINA

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

CATALASA La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es útil para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva

La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno (3%) sobre colonias en medio que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima. OXIDASA La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de transporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar Pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo) Se utiliza como reactivo p-fenilendiamina al 1% en agua, que se coloca en un papel de filtro, posteriormente, con un asa que no sea de hierro (daría falsos positivos), se coge una colonia de 24 h y se extiende sobre el papel mojado. Es positiva cuando aparece un color azul en la zona de depósito de la bacteria.

INDOL Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se detecta añadiendo p-dimetilaminobenzaldehído.

MOTILIDAD La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase. Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases. La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación. VOGES-PROSKAUER Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a cabo la fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosapeptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa forman acetoína en el medio. Se añade alfanaftol y creatina en medio alcalino. La acetoína se convierte en diacetilo con la aparición de un color rojo.

POSITIVO

NEGATIVO

Producción de sulfhídrico Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido formar un

precipitado negro de FeS. Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato de metionina y sulfato ferroso.

NEGATIVO

REDUCCIÓN DE NITRATO A NITRITO: Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. El nitrato puede ser reducido a nitrito. Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanaftilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rosa-rojo.

REDUCCIÓN DE NITRATO HASTA NITRÓGENO GASEOSO: Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido más que hasta nitrito produciéndose nitrógeno gas. Si al añadir zinc en polvo no aparece color rojo es que no queda nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación).

HEMOLISIS Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes. Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba.

MEDIOS AGAR MOSSEL Para el enriquecimiento selectivo de todos las Enterobacterias, a partir de alimentos y otros materiales de investigación. COMPOSICIÓN Peptona de carne 10.0 Extracto de carne 1.0 D – Manitol 10.0 Cloruro de sodio 10.0 Rojo de fenol 0.025 Agar – agar 12.0 Suplemento 100ml de solución de yema de huevo (20%) Sulfato de polimixina B (0.1%) 1ml Selectivo: Sulfato de polimixina β Diferencial: Manitol, yema de huevo, rojo de fenol Color del agar: Guayaba Forma de actuación Bacillus cereus es manitol (-), el contenido del manitol posibilita la separación de la biota manitol (+), que se manifiesta por viraje del rojo fenol. La selectividad se debe a la resistencia del microorganismo a las concentraciones de polimixina, inhibiendo la biota acompañante. B. cereus forma Lectinasa. Productos de degradación de lecitina (yema de huevo) se acumulan alrededor de las colonias formando un precipitado blanco.

Colonias características: Colonias rojas – rosadas con un halo de precipitado blanco, efecto de que es manitol (-) y produce la lecitinaza que degrada la lecitina (presente en la yema de huevo). La presencia de colonias amarillas indican microorganismos manitol (+), por lo que se produce viraje del medio esto no corresponde a B. cereus.

(Bacillus cereus, Staphylococcus aureus)

ASBC AGAR SELECTIVO PARA Bacillus cereus Para el aislamiento y enumeración de B. cereus en alimentos COMPOSICIÓN Peptona 1.0 Cloruro de sodio 2.0 Sulfato de magnesio 0.1 Fosfato de sodio hidrógeno 2.5 Fosfato hidrógeno potásico 0.25 Azul de bromo timol 0.12 Piruvato de sodio 10.0 Agar – agar 14.0 Suplemento: Polimixina β (50.000unid), emulsión de yema de huevo (20%), 25ml.

Selectivo: Sulfato de polimixina β Diferencial: Manitol, yema de huevo, azul de bromotimol Color del agar: verde debido al azul de bromotimol

Forma de actuación La hidrólisis de la lecitina por la acción de la lecitinaza se manifiesta por el halo que se produce alrededor de las colonias. B. cereus es manitol (-) por lo que no se produce viraje en el medio. Colonias características: Azules cremosas y con halo traslucido o blanco alrededor de las colonias.

AGAR PEPTONA- CASEÍNA DE LA DEXTROSA Medio propuesto por WILLIAMS (1936) para la identificación y la enumeración del bacilo especie, especialmente de las bacterias “amargas e insípidas” (TANNER 1944), en comestibles. Este medio se conforma con las recomendaciones del NCA (asociación nacional 1954, 1956 de los conserveros), y el APHA (1992) para los alimentos que examinan.

Forma de actuación Las colonias bacterianas, que metabolizan la dextrosa para formar el ácido, hacen cambiar a púrpura el indicador de bromocresol en sus alrededores cambian a color amarillo. Composición típica (g/litro) Peptona de la caseína 10.0; D (+) glucosa 5.0 Púrpura de bromocresol 0.04; Agar-agar12.0.

BACILLUS CEREUS SELECTIVO AGAR Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en alimentos.

FUNDAMENTO Bacillus cereus, ha sido implicado en toxoinfecciones alimentarías, particularmente asociado al consumo de arroz contaminado, y también en algunos procesos infecciosos en seres humanos y animales. En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%), y la adición de piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejora el aislamiento y esporulación de esta bacteria. Para verificar la utilización del manitol, se usa un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio es selectivo, por el agregado del suplemento para Bacillus cereus (código B03-606-32) con el que se obtiene una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio.

COMPOSICIÓN gr/Lt Fórmula (en gramos por litro) Peptona de carne 1.0 Manitol 10.0 Cloruro de sodio 2.0 Sulfato de magnesio 0.1 Fosfato disódico 2.5 Fosfato monopotásico 0.25 Azul de bromotimol 0.12 Piruvato de sodio 10.0 Agar 14.0

SIEMBRA Homogeneizar 10 g de la muestra de alimento en 90 ml de agua peptonada 0.1%. Efectuar diluciones y sembrar 0.1 ml sobre la superficie del medio de cultivo.

INCUBACIÓN En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

EMPLEO E INTERPRETACIÓN

Microorganismos

Crecimiento Bueno

Bacillus cereus ATCC 10876 Staphylococcus aureus ATCC Bueno 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Bacillus subtilis ATCC 6633

Bueno

El diagnóstico primario se basa en la morfología y color de la colonia, en la precipitación de la lecitina hidrolizada y en la falta de utilización del manitol por Bacillus cereus. Las colonias típicas de B. cereus son crenadas, filamentosas de aproximadamente 5 mm de diámetro a las 24 horas de incubación, y tienen un color turquesa (peacock blue) rodeado por un precipitado de hidrólisis de yema de huevo. A las 48 horas de incubación presentan el color con centro grisáceo. Estos hallazgos diferencian B. cereus de B. subtilis y B. licheniformis, pero pueden no diferenciar B. cereus de otras especies de Bacillus, tales como B.

thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, y en estos casos, será necesario realizar mas ensayos para su identificación Otros microorganismos que crecen bien en el medio son: Staphylococcus aureus, Serratia marcescens y Proteus vulgaris, los cuales se diferencian de B. cereus por la forma de la colonia, el color, y porque producen una reacción de aclaramiento sobre la yema de huevo, a diferencia del precipitado que produce B. cereus. Bacillus megaterium y Bacillus coagulans son completamente inhibidos en este medio de cultivo. Se recomienda la realización de un examen microscópico para evaluar la presencia de glóbulos de lípidos en las células vegetativas, debido a que es una prueba rápida y confirmatoria de B. cereus. Características Medio preparado: verde manzana

del

medio:

BACTERIAS COLIFORMES

Los microorganismos coliformes son los más reconocidos indicadores de contaminación fecal. Se incluyen métodos de placa profunda, número más probable, filtración en membrana y en métodos con Fluorocult (LMX). Bacilos cortos Gram negativos, pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, las principales especies son: Escherichia coli y Enterobacteraerogenes. Existen mas 20 especies; son aerobios o anaerobios facultativos, fermentan lactosa con producción de gas. Entre las coliformes capaces de crecer a 44.5 – 45ºC, lo cual las diferencian de las demás coliformes. Tienen la capacidad para crecer en sustratos muy distintos y usar energía de hidratos de carbono y componentes orgánicos como fuente de N2, Sintetizan la mayoría de las vitaminas que necesitan crecer en un intervalo emperatura amplia, inferiores a 10ºC – 46ºC y producen ácido y gas a partir de azúcar.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Indol Rojo de metilo V/P Citrato Motilidad H2S Oxidasa Catalasa Glucosa/gas Manitol Sacarosa Nitratos Gelatina Sorbitol Lactosa

+ + + + +/+ D + + +

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

FIG 7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos resultados para: sulfuro, indol y motilidad además de su color inicial, demostrándose que esta prueba es positiva para E. coli. En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra. La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

VOGES-PROSKAUER Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a cabo la fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosapeptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa forman acetoína en el medio. Se añade alfanaftol y creatina en medio alcalino. La acetoína se convierte en diacetilo con la aparición de un color rojo.

POSITIVO

NEGATIVO

Producción de sulfhídrico Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS. Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato de metionina y sulfato ferroso.

NEGATIVO

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:   

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: 3. Método del portaobjetos (recomendado):     

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer) Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: 1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio. 2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: 2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos (Fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol 2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario. La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0).Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico. Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración amarilla constituye una reacción negativa

FIG 3-4 la parte izquierda muestra la prueba de rojo de metilo sin inocular y sus respectivos resultados, la parte derecha muestra los reactivos utilizados en esta prueba. En la izquierda se observa un tubo sin inocular, en el centro un tubo al cual se le agregaron los reactivos y su resultado es negativo para rojo de metilo y positivo para voges-proskauer, en el tubo de la derecha se observa un tubo el cual una vez agregado los reactivos su resultado es positivo para rojo de metilo pero negativo para voges-proskauer. CITRATO DE SIMMONS Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

FIG muestra la prueba de citrato con su respectivo resultado, que para E. coli es positiva.

TSI Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.

FIG 16 muestra la prueba en un tubo sin inocular con su respectivo color inicial

K/A Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por

neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiarán a amarillo.

FIG 17 Y 18 muestra solo la fermentación de un azúcar: la glucosa por lo cual se lee como K (alcalino)/A (acido) en la parte izquierda se muestra un tubo con la presencia de gas. Producción de gas Si el microorganismo es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o con el desprendimiento del tubo dejando una área clara. Si el microorganismo es anaerogénico, no hay producción de gas.

PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae.

Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

MEDIOS DE CULTIVOS CALDO DE BRILLA (verde brillante – bilis - lactosa) Para el enriquecimiento selectivo y numeración de E. coli en aguas, leches, alimentos y otros materiales mediante la determinación del titulo, a según la técnica de NMP. COMPOSICIÓN Peptona 10.0 Lactosa 10.0 Bilis de buey desecada Verde brillante 0.0133

20.0

Selectivo: Bilis y verde brillante, inhiben Gram (+) Diferencial: Lactosa y campana de Durham Color del caldo: verde claro (traslucido)

Forma de actuación La bilis y el verde brillante inhiben en crecimiento de flora acompañante. La fermentación de la lactosa con formación de gas, es un indicador de la presencia de Escherichia coli, en las campanas. Las restantes coliformes también crecen pero generalmente sin formación de gas (presuntivo).

AGAR EMB Eosina – azul de metileno – Lactosa – Sacarosa Selectivo para la demostración y aislamiento de Entero bacteriáceas patógenas. COMPOSICIÓN Peptona 10.0 Hidrogeno fosfato dipotásico Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Eosina amarillenta 0.4 Azul de metileno 0.07 Agar – agar 13.5

2.0

Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno Diferencial: Lactosa y sacarosa Indicado: Azul de metileno Color del agar: Rojo Forma de actuación: La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los colorantes.

Colonias características: Salmonella sp

Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-)

Shigella sp

Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-)

Escherichia coli

Verdes y brillantes Lactosa (+) Sacarosa (+)

FIG Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentación de azúcares Escherichia coli produce un color verde metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida característico para esta prueba positiva

CALDO FLUOROCULT FORMA DE ACTUACIÓN El contenido en laurel sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de la flora acompañante. La detección de la presencia de E. coli se efectúa mediante fluorescencia al iluminar con luz UV. Para confirmar el ensayo se utilizan como indicadores a formación de gas debido a la fermentación de la lactosa y el ensayo del indol positivo.

COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 25.0 Lactosa 5.0 Cloruro sódico 5.0 Laurilsulfato, sal sódica 0.1 Hidrogenofosfato dipotásico 2.75 Hidrogenofosfato potásico 2.75 L – triptófano 1.0 4 – metilbeliferil – β – D- glucorónido

0.1

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El empleo y evaluación se efectúa en la forma habitual. Inocular los tubos. Para 1ml de inoculo utilizar como mínimo 10ml de caldo e incubar a 37ºC durante 10 – 24 horas o según los procedimientos preescritos. La fluorescencia se provoca mediante una lámpara UV. Las colonias que muestran fluorescencia azul claro corresponde a los de E. coli para la confirmación del diagnostico colocar sobre el cultivo una capa de aproximadamente 5mm de altura con reactivo de Kovac’s. Una coloración roja cereza en la capa del reactivo de 1 a 2 minutos indica la presencia de E .coli. El gas formado en el tubo de Durham indica la presencia de E. coli y/u otras bacteria coliformes.

Fluorocult caldo LMX Forma de actuación Gracias a la modificación del caldo LMX descrito en 1989 por MANAFI y KNEFEL se pudo aumentar claramente la conversión de sustrato. Esto, de una sensibilidad mejorada, lleva sobretodo a una clara reducción del tiempo de identificación, 24 horas generalmente. Debido a la alta calidad alimenticia y al tampón de fosfatos contenido garantiza un rápido crecimiento de coliformes. El contenido en laurilsulfato inhibe en gran medida el crecimiento de bacterias gram positivas. La identificación simultanea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la adición de del sustrato crómogeno 5- bromo-4-cloro-3-indol-β-D-1tiogalactopiranósido (IPTG) actúa como sustancia intensificadora en la síntesis enzimática y aumenta el contenido de la actividad de β-Dgalactosidasa. El sustrato fluorógeno 4- metillumbeliferil- β-D glucorónido (MUG) es escindido por la enzima β-D glucorónidasa altamente específico para E. coli . El contenido de triptófano mejora la reacción del indol para la confirmación adicional de E. coli y aumenta con ello la sensibilidad de identificación en combinación con la reacción X-GAL y la reacción MUG. COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 5.0 Cloruro sódico 5.0 Sorbita 1.0 Triptófano 1.0 Hidrógenofosfato dipotásico 2.7 Dihidrógenofosfato potásico 2.o Laurilsulfato, sal sódica 0.1 5-bromo-4cloro-3-indoli- β-D-galactopiranósido (X-GAL) 0.08 4-metilumbeliferil- β-D-glucorónido (MUG) 10.05 L-isopropil- β-D-L-tiogalactopiranósido 0.1

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El empleo se rige los correspondientes métodos de investigación para agua y alimentos. Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 8 horas a 35-37ºC.

E. coli la lectura de la fluorescencia tiene lugar mediante un alambra UV. Una fluorescencia azul claro en el cultivo indica E. coli (reacción MUG).

E.coli

Salmonella enteritidis, E.coli, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae

AGAR CHROMOCULT Composición Peptona: Cloruro sódico: Dihidrogenofosfato potásico: Hidrogenofosfato dipotásico: Piruvato sódico: Triptófano:

3gr 5gr 1.7g 3.0g 1.0gr 1.0gr

Agar – agar: Laurel sulfato sódico Mezcla de cromógenos

12.0gr 0.1gr 0.2gr

Forma de actuación Gracias a la acción conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de fosfatos, se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños subletables. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacteria Gram (+) sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de coliformes. La identificación simultanea de coliformes totales y E.coli se hace posible por la nueva combinación de patente solicitada de dos sustratos cromógenos. El sustrato Salmo– GAL como x- glucoronido, las colonias se tiñen de verdeazul oscuro y debido a ello son fáciles de diferenciar de los restantes coliformes. Que se presentan de color rojo. En los tubos del caldo LMX se obtuvieron colores azul (cromógeno) debido a que la enzima de los coliformes β – D - galactosidasa reacciono con el x-Gal (5 – bromo, 4 – cloro, 3 – indolin, β- D - galactopiranoside) dando el color característico (verde-azulado). En los tubos de caldo de fluorogeno llamado MUG (4 – metilumbiliferil - β- D glucoronido) que reacciona con la enzima característica del 94% de las especies de Escherichia coli la β- - D – glucoronidasa dando un compuesto fluorescente color azul a rayos U.V.

E.coli, Citrobacter freunii, Salmonella enteritidis

AGAR MAC CONKEY Medio de cultivo utilizado en la investigación de organismos coliformes. Fundamento Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras. Fórmula (por litro) Lactosa. 10,0 g Peptona 3,0 g Sales Biliares 1,5 g Peptona de Gelatina 17,0 g Rojo Neutro 0,03 g Sodio Cloruro 5,0 g Violeta Cristal 0,001 g Agar 13,5 g PH final: 7, 1 ±0, 2

FIG Agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a los microorganismos que fermentan lactosa). Colonias grandes con halo y rojas

AGAR-GELATINA DEV Para la determinación del número total de gérmenes y para la investigación, en aguas, de gérmenes que licuan la gelatina, según los métodos de unificación alemanes y las disposiciones sobre las aguas potables en (1986). COMPOSICIÓN (gr/Lt) Peptona de carne 10.0 Extracto de carne 10.0 Cloruro sódico 5.0 Gelatina 10.0 Agar – agar 15.0 EMPLEO E INTERPRETACIÓN Según los métodos de unificación alemanes el caldo se siembra por el procedimiento de vertido en placa y se incuba durante 44 +/- 4 horas a 20 +/2ºC. Los cultivos se recubren con solución saturada de sulfato amònico. De esta forma aparecen halos de aclaramiento alrededor de las colonias que licuan la gelatina.

Salmonella sp y Shigella sp

Shigella sp

Es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas, inmóviles, pero animados de animados de movimientos pendulares (oscilación) in situ. Son Gram negativos, aerobios – anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan la lisina. No fermenta la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No creen en el medio cianuro potásico su actividad bioquímica es muy reducida. Su temperatura óptima de crecimiento es de 35ºC +/-2ºC. Crecen en medios ordinarios y resisten la acción bacteriostática. Tienen un periodo de incubación 7 – 656 horas.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Manitol Glucosa Sacarosa Gelatina H2S Latosa Lisina Descarboxilasa

+ + -

PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

HIDRÓLISIS DE LA GELATINA Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina. La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.

Interpretación: Negativo Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un tiempo adicional. Tubo de control: el medio se mantiene sólido

FIG 15 Parte izquierda muestra la reacción negativa en una placa, parte derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.

DESCARBOXILACION DE LA LISINA Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color original violeta. El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de descarboxilar la lisina, produciendo un cambio de color del púrpura de bromocresol. Sin embargo, esta descarboxilación sólo se puede hacer en un medio ligeramente ácido, que se consigue con la fermentación de glucosa, por ello esta prueba está limitada a los microorganismos capaces de utilizar la glucosa. Cuando el pH del medio baja, el indicador vira a amarillo. Al alcalinizar el medio debido a la descarboxilación de la lisina, el indicador (púrpura de bromocresol) vira a rojo púrpura. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan un precipitado negro. Además pueden aparecer burbujas de gas, que pueden incluso desplazar el medio.

A B C FIG 6 muestra los tubos de la prueba de LIA donde podemos resaltar que para esta prueba Shiguella es negativo.

A tubo sin inocular B resultado positivo C resultado negativo (Para Shiguella)

Salmonella sp

Bacilo Gram negativo, anaerobio, móvil mediante flagelos perítricos aunque existen mutantes inmóviles, sus colonias presentan un diámetro de 2 a 3 mm, no esporulado, fermenta la glucosa con formación de gas, no fermentadores de lactosa. Estas especies reducen los nitratos a nitritos, crecen a una temperatura óptima de 37ºC y no resistente crecimiento a 5ºC y son destruidos a mas de 60ºC/5minutos, son considerados bacterias invasivas, pero solamente superan la barrera mucosa y linfáticas, invadiendo el torrente sanguíneo; la productora de fiebre lipoidea y excepcionalmente otros serotipos ocasionan un septicemia y en los casos mas extremos el paciente entra en shock. Son sensibles a la sal, presentan resistencia a algunos antibióticos, por su endotoxina; además resisten alcoholes y son quimiorganótrofos. Alimentos implicados: cárnicos y derivados, algunos productos de charcutería, carnes de aves y derivados, huevos y ovo productos, leche y derivados.

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Manitol Nitratos Glucosa Citrato Sulfuro Lisina Catalasa V/P Lactosa Triptosa Ureasa Sacarosa Oxidasa TSI

+ + + + + + + -

Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del medio amarilla (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento, generalmente con formación de gas. PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega

directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

CITRATO DE SIMMONS Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

FIG muestra la prueba de citrato con su respectivo resultado, que para Shiguella positiva. CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:   

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: 4. Método del portaobjetos (recomendado):    

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.



Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

MEDIOS DE CULTIVOS AGAR BISMUTO SULFITO (B.S) Selectivo para el aislamiento y diferenciación de Salmonella sp a partir de material clínico y otros clases. COMPOSICIÓN Extracto de carne Peptona de carne D (+)-glucosa Hidrogeno fosfato disódico Sulfato ferrosos Verde brillante Indicador bismuto-sulfito Agar – agar

5.0 10.0 5.0 4.0 0.3 0.025 8.0 15.0

Selectivo: Verde brillante y bismuto Diferencial: sulfuro de hierro y bismuto sulfito Color del agar: Crema Forma de actuación El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente los gérmenes de acompañamiento. Las colonias de Salmonella sp H2S (+) presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. El brillo metálico alrededor de las colonias se debe a la reducción de los iones bismuto a bismuto metálico. Colonias características: Shigella sp: centro negro, borde claro, precipitado negro, brillo metálico alrededor de las colonias. Coliformes: pequeñas, verdes hasta pardas, a veces mucosas.

FIG colonias marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de la colonia (S.typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimiento del medio.

El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol que actúa como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta un color rojo intenso la flora acompañante Gram positiva, así como Salmonella thypi y Shiguella resulta muy reprimidas por la presencia de verde brillante. Para la inhibición en grupo de Proteus, recomienda ADAM la adición de 0.2% sodio de desoxicolato, al medio de cultivo. COMPOSICIÓN (gr/Lt) Peptona de carne 7.0 Cloruro sódico 5.0 Lactosa 15.0 Rojo de fenol 0.04 Verde brillante 0.005 Agar- agar 13.0

EMPLEO E INTERPRETACIÓN En medio de cultivo se siembra masivamente en superficie con material objeto de investigación directamente, o a partir de un cultivo de enriquecimiento, incubación de 18-24 horas a 37ºC.

Colonias Microorganismo Rosa pálido, transparentes con halo Lactosa- Negativa: Salmonella y rojo. ocasionalmente Proteus, Citrobacter. Verde- amarillenta, opacas con halo Lactosa positiva: verde amarillento E. coli, Enterobacter, klebsiella, con buen crecimiento. De lo contrario notable inhibición

AGAR BPL (VERDE BRILLANTE) Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Salmonella en heces, orina, carnes, leche y otros materiales objetos de investigación, según KAUFFMANN. FORMA DE ACTUACIÓN El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol que actúa como indicador de eh. En medio alcalino presenta color rojo intenso. La flora acompañante Gram positiva, así como Salmonella typhi y Shigella resulta muy reprimidos por la presencia del verde brillante. Para la inhibición en el grupo de Proteus la adición de 0.2% de sodio desoxicolato al medio de cultivo. COMPOSICIÓN gr/Lt

Peptona de carne 7.0 Cloruro sódico 5.0 Lactosa 15.0

Rojo de fenol 0.04 Verde brillante 0.005 Agar – agar 13.0 COLIONIAS

MICROORGANISMOS

Rosa pálido, trasparentes con halo Lactosa – negativos: rojo. Salmonella, ocasionalmente Proteus y citrobacter. Verde – amarillentas, opacas con halo Lactosa – positivo: verde –amarillento. E. coli, Enterobacter, Klebsiella con buen crecimiento. De lo contrario notable inhibición.

Pequeñas, incoloras, rosadas ó fucsias, transparentes u opacas, sobre el Medio coloreado de rosado a rojo.

AGAR DESOXICOLATO- CITRATO: FORMA DE ACTUACIÓN La composición de este medio de cultivo y su forma de actuar corresponde ampliamente con las del agar Desoxicolato citrato según LEISSON. El

contenido en sacarosa posibilita, además, la diferenciación de colonias de Salmonella, Shigella y Arizona lactosa y sacarosa negativa, frente a la flora lactosa – negativa pero sacarosa positiva, que como por ejemplo la de Proteus vulgaris , Serratia y otros. Por la adición de la sacarosa el agar DCLS posee frente al agar LEISSON la ventaja de excluir resultados falsos – positivos en la búsqueda de Enterobacteriaceas patógenas. COMPOSICIÓN (gr/Lt) Peptona de carne 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa Sacarosa Citrato sódico 2 – hidrato Tiósulfato de sodio Desoxicolato sódico Citrato de amonio y hierro (III) Rojo neutro 0.02 Agar – agar 13.0

10.0 10.0 6.0 4.0 3.0 1.0

EMPLEO E INTERPRETACIÓN COLONIAS

MOCROORGANISMOS

Incoloras

Salmonella, Shigella (eventualmente, las colonias de Shigella sonnei se presentan de color rosa pálido), Morganella Reltgerella y otros.

Incoloras negruzco

con

el

centro Proteus mirabilis, algunas Salmonella y otros.

Parduscas

Pseudomonas

Rojas, pequeñas, planas

Escherichia coli, Serratia y otros

Rosa con el centro rojo, Enterobacter, klebsiella y otros. mucosas

Rojas, con el centro negruzco

Proteus vulgaris

Pequeñas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con el centro negro. AGAR S.S (SALMONELLA - SHIGELLA)

FIG Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Está compuesto por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirán ácidos y cambiará el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azúcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias sulfatoreductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro. Para el aislamiento de Salmonella sp, Shigella sp a partir de heces, alimentos y otros materiales objetos de investigación.

COMPOSICIÓN Peptona Lactosa Bilis de Buey desecado Citrato sódico Tíosulfato sódico Citrato de amonio y hierro (III)

10.0 10.0 8.5 10.0 8.5 1.0

Verde brillante 0.0003 Rojo neutro 0.025 Selectivo: Verde brillante, Bilis de Buey, Tiosulfato de sodio y citrato Diferencial: Tiosulafato, iones de hierro y lactosa. Indicador: Rojo neutro Color del agar: Claras y parduscas Forma de actuación: El brillante y la Bilis de Buey y la elevada concentración de tiosulfato y de citrato inhiben considerablemente la biota acompañante. Con tiosulfato y los iones de hierro se pone en manifiesto la formación de sulfuro, para las colonias H2S (+). Las colonias de coliformes quedan señaladas para la degradación de lactosa y producción de ácido demostrado por el viraje del indicador (rojo neutro). Colonias características: Salmonella sp. Traslucidas y centro negro Lactosa (-) sulfuro (+) Shigella sp.

Traslucidas sin centro negro Lactosa (-) sulfuro (-)

Escherichia coli

Rojas a rosadas sin precipitado Lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR V.R.B (Violeta Cristal – Rojo Neutro - Bilis)

Medio selectivo para la determinación de bacterias coliformes, inclusive la E. coli a partir de aguas, productos lácteos, carnes, helados y otros alimentos. COMPOSICIÓN Peptona de carne 7.0 Extracto de levadura 3.0 Cloruro sódico 5.0 Lactosa 10.0 Rojo neutro 0.03

Mezcla de sales biliares Violeta cristal 0.002 Agar – agar 13.0

1.5

Selectivo: Cristal violeta y sales biliares Diferencial: Lactosa Indicador: Rojo neutro Color del agar: Claro y rojo parduzco Forma de actuación: El cristal violeta y sales biliares inhiben biota Gram positiva. La degradación de lactosa a ácido se manifiesta por viraje del indicador del pH y precipitación de sales biliares. Colonias características Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) E.coli rojas con precipitado lactosa (+)

AGAR Mc Conkey Agar selectivo para el aislamiento de salmonella sp, shigella sp y bacterias coliformes, a partir de heces, orina, alimento, aguas residuales, entre otras. Composición Peptona de caseína 17.0 Peptona de carne 3.0 Cloruro sódico 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 1.5 Rojo neutro 0.03 Violeta cristal 0.01 Agar-agar 13.5 Selectivo: cristal violeta y sales biliares

Diferencial: lactosa Indicador: rojo neutro Color del agar: claros y rojo parduzco Forma de actuación El cristal violeta y sales biliares inhiben biota gram (+). La degradación de lactosa se manifiesta por viraje a rojo del indicador de ph, sirve para comprobar la degradación de dicho azúcar. Colonias características Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) E.coli rojas con precipitado lactosa (+)

FIG agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a los microorganismos que fermentan lactosa) colonias incoloras, transparente.

AGAR HEKTOEN Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, inclusive shigella sp a partir de los más diversos materiales, tales como: heces, alimentos y otros. Composición Peptona 15.0 Cloruro sódico 5.0 Extracto de levadura 3.0 Sacarosa 14.0 Lactosa 14.0 Salicina 2.0 Bisulfato sódico 5.0 Citrato de amonio y hierro (III) 1.5 Mezcla de sales biliares 2.0 Azul de bromotimol 0.05 Fucsina acida 0.08 Agar-agar 13.5 Selectivo: sales biliares Diferencial: bisulfato, sales de hierro, fucsina ácida y lactosa. Indicador: azul de bromotimol Color del agar: azul verdoso claro Forma de actuación Las colonias lactosa (-) muestra una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa (-) por el viraje a rojo – anaranjado. La combinación de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloración negra de las colonias sulfuro (+) Salmonella sp. Las sales biliares inhiben la biota acompañante. Colonias características Salmonella sp sulfuros (-)

verdes con o sin precipitado negro en el centro lactosa (+)

Shigella sp verdes, húmedas, planas y trasparentes lactosa (+) sulfuros (-) E.coli rojas- anaranjadas con halo de precipitado lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR XLD (xilosa –lisina-desoxicolato) Para el aislamiento y diferenciación de enterobacterias especialmente de Salmonella sp y shigella sp .

patógenas,

Composición Extracto de levadura 3.0 Cloruro sódico 5.0 D (+) xilosa 3.5 Lactosa 7.5 Sacarosa 7.5 L (+) lisina 5.0 Desoxicolato sódico 2.5 Tiosulfato sodio 6.8 Citrato de amonio y hierro (III) 0.8 Agar-agar 13.5

Selectivo: tíosulfato, desoxicolato de sodio y sales biliares Diferencial: Tíosulfato, sales de hierro, Xilosa, Lisina, Lactosa. Indicador: Rojo de fenol. Color del agar: Rojo claro.

Forma de actuación La degradación a acido de xilosa, lactosa y sacarosa vira el medio amarillo. El tiosulfato y sales de hierro revelan la formación de H2S. La descarboxilación de lisina (Producción de cadaverina) se reconoce por la presencia de un color rojo púrpura, por aumento del pH alrededor de la colonia. Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversas matices de color del indicador de pH, o a un viraje de a Amarillo a Rojo en el transcurso de una incubación mas prolongada. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil. Colonias características Salmonella sp Traslucidas con precipitado negro. Lactosa (-) Sulfuros (+)

Shigella sp Traslucidas en contraste con el medio. Lactosa (-) Sulfuros (-) E. coli Amarillas, con zonas amarillas alrededor opacas, halo de precipitación. Lactosa (+) Sulfuros (-)

AGAR RAMBACH Medio de cultivo para diagnostico diferencial para identificación de Salmonella sp en muestras clínicas. Composición Peptona 8.0 Cloruro sódico 5.0 Desoxicolato sódico 1.0 Mezcla cromógena 1.5 Propilenglicol 10.5 Agar-agar 15.0 Selectivo: desoxicolato sódico Diferencial: prolenglicol Color del agar: guayaba Forma de actuación El desoxicolato inhibe biota gram (+). Las Salmonellas sp forman acido a partir del propilenglicol y en combinación con el indicador de pH producen colonias rojas características. Para diferenciar las colonias coliformes con las de Salmonella sp hay un compuesto cromógeno, que indica la separación de B-Galactosidasa, características para los coliformes totales.

Colonias características Salmonella sp Rojas Shigella sp Incoloro-amarillento E. coli Verde azulado AGAR EMB

Eosina – azul de metileno – Lactosa – Sacarosa Selectivo para la demostración y aislamiento de Entero bacteriáceas patógenas. COMPOSICIÓN Peptona 10.0 Hidrogeno fosfato dipotásico Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Eosina amarillenta 0.4 Azul de metileno 0.07 Agar – agar 13.5

2.0

Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno Diferencial: Lactosa y sacarosa Indicado: Azul de metileno Color del agar: Rojo

Forma de actuación:

La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los colorantes. Colonias características: Salmonella sp

Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-)

Shigella sp

Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-)

Escherichia coli

Verdes y brillantes Lactosa (+) Sacarosa (+)

CALDO RAPPAPORT SELECTIVO)

(CALDO

DE

ENRIQUECIMIENTO

Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp, con excepción de S. Typhi a partir de material de investigación de origen fecal. Composición Peptona de caseína 5.0 Cloruro sódico 8.0 Hidrogeno fosfato di potásico 0.8 Cloruro de magnesio 40.0 Verde malaquita 0.12 Selectivo: verde de malaquita, cloruro de magnesio Diferencial: tetrationato y amarillo de metacromo Color del caldo: azul.

Forma de actuación

El verde de malaquita y el cloruro de magnesio inhiben notablemente la biota intestinal normal, en tanto que la mayoría de Salmonellas se multiplican sin obstáculos. Por regla general, únicamente S. Typhi y Shigellas resultan inhibidos también por el verde de malaquita. Por este motivo no es adecuado este medio de cultivo para el enriquecimiento de estos agentes patógenos.

CALDO SELENITO (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO) Para el enriquecimiento de Salmonellas a partir de heces, alimentos y otros materiales. Composición Peptona de caseína 5.0 L (-) cistina 0.01 Lactosa 4.0 Fosfato sódico 2.0 Hidrogenocelenito sódico 4.0 Color del caldo: claro y ligeramente amarillento Forma de actuación El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y Enterococos en las primeras 6-12 horas siguientes al inicio de la incubación. Después el efecto inhibidor disminuye lentamente. Por el contrario Salmonella sp, Proteus sp, Pseudomonas sp no son inhibidas.

CALDO DE ENRIQUECIMIENTO TETRATIONATE Para el enriquecimiento selectivo de Salmonellas, a partir de diversos materiales de investigación. Composición Peptona de caseína 2.5 Peptona de carne 2.5 Mezcla de sales biliares 1.0 Carbonato calcico

Tiosulfato sódico 30.0 Aditivo: yoduro potásico 5.0 Yodo 6.0 Eventualmente verde brillante 0.01 Forma de actuación El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhiben a coliformes y otras bacterias acompañantes. En cambio, todas las bacterias reductoras de tetrationate, como por ejemplo: Salmonella sp y Proteus sp pueden multiplicarse mas o menos sin obstáculo. El ácido procedente de la reducción del tetrationato es neutralizado por carbonato calcio. Las sales biliares inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia no obligatoria en el intestino. La adición del verde brillante sirve, sobre todo para inhibir a la biota gram (+). Dado que le medio de cultivo con verde brillante posee un efecto inhibidor muy intenso, resulta ventajoso a veces suprimir la adición de verde brillante a fin de obtener un rendimiento satisfactorio de Salmonellas.

Agar NUTRITIVO Medio nutritivo universal para el cultivo de microorganismos poco exigentes. Composición Peptona de carne 5.0 Extracto de carne 3.0 Agar-agar 12.0 Color del medio: claro e incoloro hasta una tonalidad amarillento.

AGAR LEIFSON Para el crecimiento de Salmonella y Shigella según LEIFSON. FORMA DE ACTUACIÓN Este medio de cultivo contiene concentraciones tan altas de desoxicolato y citrato, que la flora Gram positiva queda totalmente reprimida e inhibidos más o menos intensamente los coliformes. Las Salmonella crecen sin obstáculos; algunas Shigella son ligeramente inhibidas

La degradación de la lactosa da lugar a una acidificación a los al rededores de las correspondientes colonias y produce un viraje al indicador de pH rojo neutro. Estas colonias están casi siempre rodeadas de un halo turbio de acido desoxicólico precipitado. Las colonias de microorganismos lactosa – negativos son incoloras. La reducción del tiosulfato a sulfuro se muestra en forma de sulfuro de hierro negro.

COMPOSICIÓN gr/Lt Extracto de carne 5.0 Peptona de carne 5.0 Lactosa 10.0 Tiosulfato sódico 5.4 Citrato de amonio Y hierro (III) 1.0 Citrato sódico 6.0 Sodio desoxicolato 3.0 Rojo neutro 0.02 Agar – agar 12.0

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El medio de cultivo se siembra por extensión con el material de muestra o a partir de un cultivo de enriquecimiento.

Vibrio parahaemolytico y Vibrio cholerae

Los vibrios son agentes de infección en muchas partes del mundo. Como el cólera y enfermedad de tipo colérico provocadas por Vibrio cholerae así como infecciones provocadas por V. parahaemolyticus familia Bacillaceae. Vibrio parahaemolyticus es un bacilo corto de tamaño (1.5 – 2.5 micrómetros por 0.5 micrómetros), curvado, Gram positivo, móvil por un solo flagelo polar. Es anaerobio facultativo y algo halófilo, ya que cuando mejor crece es en presencia de 3 – 6 % de NaCl. Crece en un rango de temperaturas entre 8 44ºC, siendo la óptima la de 37ºC, otra propiedad poco corriente de este Vibrio y otros parecidos es su preferencia por las condiciones alcalinas y algunas cepas exhiben su crecimiento óptimo a un pH de hasta 9.0. Es termosensible y se destruye fácilmente a temperaturas de 50ºC. Los síntomas de la intoxicación alimentaría por V. parahaemolyticus generalmente se presentan 10-18 horas después de ingerido al alimento contaminado, si bien se han señalado periodos de incubación que variaban entre 2 a 48 horas. Los síntomas principales son náuseas, vomito, dolor bdominal y diarrea. La tasa de motilidad es baja y no se han señalado portadores del microorganismo. Este microorganismo se encuentra exclusivamente en ambientes marinos. Vibrio cholerae también conocido como V. comma, es una bacilo curvado, Gram negativo, parecido a V. parahaemolyticus. se periodo de incubación de 6-8 horas a 2-3 días y la enfermedad se caracteriza por una grave inflamación en el tracto intestinal la que origina una carga casi continua de heces liquidas

(agua de arroz) que contiene sangre y mucosidad. Como consecuencia de esta pérdida de líquido el enfermo se deshidrata gravemente y puede morir si no se le suministra líquido, generalmente el cólera es una infección espasmódica transmitida por contacto persona-persona, pero se presenta particularmente la epidemia donde el agua se halla contaminada con efluentes cloacales. Cuando se ha incriminado a los alimentos, generalmente se ha debido a su contacto con el agua en la que crecieron, al consumir crudos o defectuosamente cocidos originaran brotes de la enfermedad, también han estado implicado ensaladas, frutas y hortalizas lavadas en aguas contaminadas.

PRUEBAS BIOQUIMICAS V. cholerae Lactosa Oxidas Lía TSI Sacarosa H2S Manitol Ornitina descarboxilasa VP Fermentación de sacarosa Motilidad Indol Reducción de nitritos Esculina

+ + k/a + + + + + + + -

Vibrio parahemolitico Lactosa Oxidasa LIA TSI Sacarosa H2S Manitol Ornitina descarboxilasa VP Fermentación de sacarosa Motilidad Indol Reducción de nitritos Esculina

+ + k/a + + + + -

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

OXIDASA Esta sirve para demostrar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa en preparaciones de de microorganismos. Interpretación de resultados: Positiva: el color de la tira vira a azul debido ala oxidación del compuesto adicionado por el azul de indofenol. Negativa: el color de la tira de papel no vira.

CATALASA Sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Interpretación: Positiva: formación inmediata de burbujas bien visible (desprendiendo de O2). Negativa: no hay formación de burbuja (no hay producción de O2)

DESCARBOXILACION DE LA LISINA Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina

descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color original violeta. El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de descarboxilar la lisina, produciendo un cambio de color del púrpura de bromocresol. Sin embargo, esta descarboxilación sólo se puede hacer en un medio ligeramente ácido, que se consigue con la fermentación de glucosa, por ello esta prueba está limitada a los microorganismos capaces de utilizar la glucosa. Cuando el pH del medio baja, el indicador vira a amarillo. Al alcalinizar el medio debido a la descarboxilación de la lisina, el indicador (púrpura de bromocresol) vira a rojo púrpura. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan un precipitado negro. Además pueden aparecer burbujas de gas, que pueden incluso desplazar el medio.

A B C FIG 6 muestra los tubos de la prueba de LIA donde podemos resaltar que para esta prueba Vibrio positivo..

A tubo sin inocular B resultado positivo C resultado negativo (Para Shiguella)

TSI Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.

FIG 16 muestra la prueba en un tubo sin inocular con su respectivo color inicial K/A Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiarán a amarillo.

FIG 17 Y 18 muestra solo la fermentación de un azúcar: la glucosa por lo cual se lee como K (alcalino)/A (acido) en la parte izquierda se muestra un tubo con la presencia de gas.

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra. La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

MEDIOS DE CULTIVOS TCBS (Tiosulfato – Citrato – Bilis - Sacarosa) Para el aislamiento y cultivo selectivo de V.cholerae y otros Vibrios enteropatógenos. COMPOSICION Peptona de caseína 5.0 Peptona de carne 5.0 Extracto de levadura 5.0 Citrato sódico 10.0 Tiosulfato sódico 10.0 Bilis de Buey desecado 5.0 Colato sódico 3.0 Sacarosa 20.0 Cloruro sódico 10.0 Citrato de hierro (III) 10.0 Azul de bromotimol 0.04 Azul de timol 0.04 Agar – agar 14.0 Selectivo: Tiosulfato, citrato. pH alcalino (8.6) inhibe Gram negativas. Bilis y colato inhiben Gram positivas. Diferencial: sacarosa Color del agar: Verde azulado Indicador azul timol: coloración azulosa Azul de bromocresol: coloración verdosa Forma de actuación: Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las Entero bacteriáceas. Las Bilis de Buey y el colato inhiben sobre todo a los Enterococos. Solamente algunas cepas de Proteus sp sacarosa- positiva pueden formar colonias amarillas semejantes a los vibriones. El indicador mixto azul de timol-azul de bromotimol presenta un claro viraje a amarillo por la formación de ácido, incluso en medio fuertemente alcalino.

Indicador: vira de azul verdoso a amarillo para sacarosa.

Colonias características: Vibrio cholerae: planas, de 2 a 3 mm de diámetro, amarillas Vibrio parahaemolyticus: pequeñas con centro verde-azulado

AGAR DCLS (Agar-desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa) Agar selectivo para el aislamiento y diferenciación de Enterobacteriáceas patógenas y vibriones patógenos Forma de actuación La composición de este medio y su forma de actuar corresponden ampliamente con las de agar- desoxicolato citrato según LEIFSON. El contenido en sacarosa posibilita además, la diferenciación en colonias de Salmonellas Shigella y Arizona lactosa y sacarosa-negativa, frente a la flora lactosa-positiva, como por ejemplo, las de Proteus vulgaris, Serratia y otros. Por la adición de sacarosa, el agar DCLS posee frente al agar LEIFSON la ventaja de excluir resultados falsos positivos en la búsqueda de Enterobacteriáceas patógenas.

Composición (g/Lt) Peptona de carne 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Citrato sódico 2-hidrato 6.0 Tiosulfato de sodio 4.0 Desoxicolato sódico 3.0 Citrato de amonio y hierro (III) 1.0 Rojo neutro 0.02 Agar – agar 13.0 EMPLEO E INTERPRETACIÓN Sembrar en superficies en placas previamente secadas. Incubación de 24 a 37ºC. COLONIAS

MICROORGANSIMOS

incoloras

Salmonella, Shigella, Morganella, Reltgerella, y otros.

Incoloras con centro negruzco

Proteus mirabilis, Salmonella y otros.

Parduscas

Pseudomonas

Rojas, pequeñas, planas

Escherichia coli, Serratia y otros.

algunas

Rosa, con el centro rojo, pequeñas, Enterobacter, klebsiella y otros. mucosas. Rojas, con el centro negruzco Proteus vulgaris

AGAR SANGRE

Para la realización de hemocultivos COMPOSICIÓN Sustrato nutritivo Extracto de corazón y peptona Cloruro sódico Agar – agar

Forma de actuación: Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a todos los organismos presentes. El valor de el pH de 6.8; es especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para la formación de halos hemolíticos claros para la determinación de las formas de las hemólisis.

Listeria sp

Son bacilos Gram positivos, móvil, no esporulado, anaerobio facultativo. Este microorganismo es ubicuo y esta bien difundido en el medio ambiente donde puede sobrevivir durante largo tiempo. Esta característica puede ser debido a numerosos factores, quizás el más importante es su capacidad para multiplicarse relativamente rápidos a temperaturas de refrigeración (el limite inferior de crecimiento es aproximadamente de 0ºC). Este microorganismo también sobrevive a la congelación y deshidratación y es menos sensible al tratamiento térmico que Salmonella sp o Campylobacter sp. Todavía se discute la cuestión de la termo resistencia, especialmente en la pasteurización de la leche. Debe recordarse que la pasterización no es un método de esterilización, si no un modo de destruir ciertos microorganismos patógenos y alterantes. La mayoría de los estudios han concluido que aunque los valores – D (tiempo requerido para lograr una reducción decimal en el numero de viables en unas condiciones dadas) son mayores que los presentan la mayoría de las bacterias productoras de intoxicaciones alimentarías mas comunes, la combinación temperatura/tiempo adoptada rutinariamente en la pasterización HTST (temperatura alta durante tiempo corto), que es insuficiente para

inactivar Listeria monocytogenes cuando se halla en altos recuentos en la muestra. Sien embargo es poco probable encontrar tales recuentos en la practica, ya que son pocos los animales de una explotación lechera que excretarían dicho microorganismo y además estos se diluirían intensamente al llegar a la central. Además de cierta tolerancia a las condiciones ácidas, resiste presiones osmóticas relativamente elevadas, como ilustra su capacidad de crecer en un 10% de NaCl. Se halla en heces animales y humanas (aunque existe una variación considerable en las proporciones de aislamiento), y por consiguiente también en las aguas residuales; también se le ha aislado en el suelo, en los fangos, en las aguas superficiales, en la vegetación y en el ensilado. Alimentos implicados: carne cruda de vacuno, carne cruda de cerdo, salchichas frescas de cerdo, carne de pollo, leche cruda, leche pasteurizad, quesos no pasteurizados, quesos pasteurizados, helados, productos de origen marino congelados, ensaladas preenvasadas, verduras frescas (ensalada), patatas.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Hidrólisis de caseína Hidrólisis de gelatina Hidrólisis de esculina Hidrólisis de hipulata Urea Oxidasa Rojo de metilo Voges proskauer Citrato Indol Nitrato Glucosa Maltosa Salicina Motilidad Amigdalina Celabiosa Manosa H2S Xilosa Manitol Lactosa Arabinosa

+ + ++ + + + + + + + + + sin gas +

HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA La excluyan contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Hay microorganismos que hidrolizan la esculina en esculetina y glucosa, la primera reacciona con sales de hierro originando un compuesto de color negro. Se realiza en tubos inclinados incubados durante 48 h.

Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

POSITIVO

NEGATIVO

HIDRÓLISIS DE LA GELATINA Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina. La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.

Interpretación:

Positiva Tubo inoculado: medio líquido Tubo de control: el medio se mantuvo sólido

FIG 14 En la parte izquierda muestra la reacción positiva en una placa que para Staphylococcus aureus es positiva y en la parte derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.

Negativo Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un tiempo adicional. Tubo de control: el medio se mantiene sólido

FIG 15 Parte izquierda muestra la reacción negativa en una placa, parte derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra. La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

PRUEBA DE UREA El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia.

La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea produciendo amoniaco, CO2 y agua. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio. Produciendo una alcanalización y un aumento de Ph del medio. La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio: amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Interpretación Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones positivas en 1-2 horas dando un color fucsia en el medio por viraje del indicador de Ph una prueba negativa presenta un color amarillo-anaranjado en el medio.

PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol

movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

MEDIOS DE CULTIVOS AGAR PALCAM agar selectivo para Listeria sp Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de Listeria sp en muestras de origen clínico y biológico casi como en alimentos y muestras de origen ambiental fuertemente contaminados.

COMPOSICION Peptona 23.0 Almidón 1.0 Cloruro sódico 5.0 Agar – agar 13.0 (agar Columba); D (-) Manitol 13.0 Citrato de amonio y hierro (III) 0.5 Esculina 0.8 Glucosa 0.5 Cloruro de litio 15.0 Rojo de fenol 0.08 Selectivo: Cloruro de litio, ceftaziadina, polimixina B y clorhidrato de acrilflavina. Diferencial: Esculina, iones de hierro, Manitol Indicador: Rojo de fenol Color del agar: Rojizo Forma de actuación: La hidrólisis de la esculina forma escletina que se une con compuestos de hierro del medio formando un complejo verde – negro. Colonias características: Verde oliva con halos negros alrededor a razón de hidrólisis de la esculina.

OXFORD Agar selectivo para Listeria sp Agar selectivo para el aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes COMPOSICIÓN Peptona 500ml Cloruro de sodio Agar – agar (Agar columbia) 19.05 Esculina 0.5 Citrato de amonio y hierro (III) 0.25 Cloruro de litio 705 Selectivo: el cloruro de litio, acriflavina, sulfato de calistina, cefotetano, cicloexamida, fosfomicida. Diferencial: esculina

Forma de actuación: Listeria monocytogenes disgrega la esculina presente en el medio de cultivo dando esculetina conformación iones de hierro (III), que producen compuestos negros que tiñen de negro las colonias. El cloruro de litio, acriflavina, sulfato de cefotetano, cicloexamida, fosfomicida, estos compuestos inhiben la biota acompañante e indeseable.

AGAR SANGRE Para la realización de hemocultivos Composición Sustrato nutritivo (extracto de corazón y peptona) Cloruro sódico Agar- agar Aditivo: sangre 50-80 ml Forma de actuación: Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a todos los organismos presentes. El valor de ph de 6.8; es especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para la formación de halos hemolíticos claros para la determinación de las formas de hemólisis.

AGAR CASO Medio de cultivo universal para microorganismos poco exigentes. Este medio tiene los componentes necesarios para proporcionarle al microorganismo condiciones óptimas para su crecimiento. Peptona de Caseína Peptona de soymeal NaCl

15.0 5.0 5.0

g g g

Agar Agua destilada

15.0 1000.0

g ml

Enterococcus y Streptococcus spp

Los géneros Streptococcus y Enterococcus están formados por bacterias esféricas u ovoides que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporos, catalasas negativas, inmóviles y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales. La infección estreptocóccica es una de las más frecuentes, siendo algunos de los cuadros más importantes relacionados con el género: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumonía, meningitis, infección del tracto urinario, abdominal o cutánea. Las infecciones más frecuentemente asociadas con el género Enterococcus son endocarditis, las infecciones urinarias y la colonización/sobreinfección de enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente cefalosporinas.

Enterococcus sp y Streptococcus sp Bilis – esculina sorbitol Manitol Lactosa Almidón Catalasa Tipo de hemolisis

+ + + + Alfa, beta y gamma

PRUEBA DEL MANITOL Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

TIPOS DE HEMOLISIS

CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:   

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: 5. Método del portaobjetos (recomendado):   

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

 

Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

POSITIVO

NEGATIVO

HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA La excluyan contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Hay microorganismos que hidrolizan la esculina en esculetina y glucosa, la primera reacciona con sales de hierro originando un compuesto de color negro. Se realiza en tubos inclinados incubados durante 48 h. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

POSITIVO

NEGATIVO

AGAR KF Forma de actuación La maltosa y la lactosa se utilizan por la mayoría de los Enterococos, con formación de ácido y por lo tanto favorecen su crecimiento en tanto que las especies indeseables de gérmenes resultan ampliamente inhibidas por la azida sódica, la formación de ácido se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador púrpura de bromocresol. Los Enterococos reducen el TTC dando una formación y aparecen por lo tanto, como colonias rojas. Composición g/Lt Proteosa- peptona Extracto de levadura Cloruro sódico Glicerofosfato sódico Maltosa Lactosa Azida sódica Púrpura de bromocresol Agar-agar

10,0 10,0 5,0 10,0 20,0 1,0 0,4 0,15 15,0

Aditivo: 2, 3, 5 trifeniltetrazoliocloruto 0,1 Empleo e interpretación Se recomienda la técnica de fijación por membrana, si se supone que el número es pequeño, o bién el método de enumeración en placa, si se calcula que el número y conteo es grande el filtro de membranas sembrado, se coloca sobre la superficie del agar. Incubación de 48 horas a 37ºC

COLONIAS MICROORGANISMOS Siempre buen crecimiento Enterococcus,(Str.Faecalis, colonias rojas con halo Str.zymogenes), amarillo Str.mitis,Str.bovinis,Str.equinus,Str. Salivarius y otros. Casi siempre crecimiento Lactiplantarum, pesionococcus, cerevisiae escaso sin viraje de color y otros

CALDO-TRIPTOSA Para el enriquecimiento, y cultivo Estreptococos, Pneumococos, Meningococos, Listerias, Pasteurellas y otros microorganismos patógenos. Los medios de cultivo con triptosa han sido recomendados también por HAUSLER y KOONTZ (1970) en los Diagnostic Procedures. Forma de actuación La adición de Violeta cristal sirve para la inhibición de la flora gram-positiva (HAUSLER y KOONTZ 1970).Aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de cerebro (GRAY y col. 1948). Preparación de un Agar selectivo para Listeria por adición de telurito potásico (GRAY y col. 1950). El Agar Triptosa también constituye una excelente base para la preparación de Agar Sangre. Composición (g/litro) Triptosa 20,0; D (+)-glucosa 1,0; Cloruro sódico 5,0; Tiamina dicloruro 0,005. Empleo e interpretación El preenriquecimiento con Caldo triptosa debe llevarse a cabo solamente si se espera un pequeño número de bacterias patógenas. La incubación de microorganismos anaerobios debe efectuarse en cada caso hasta 5 días a 35º C en una atmósfera con el 10% de dióxido de carbono. Para el cultivo de otros microorganismos se utilizan Agar triptosa o Caldo-triptosa. Las incubaciones han de realizarse en lo posible bajo condiciones óptimas. El Caldo-triptosacitrato puede utilizarse para la preparación de hemocultivos. 2 a 5 ml de sangre del paciente, fresco, se mezclan con 20 ml de Caldo. Apariencia de las Colonias Microorganismos: De color rosa pálido, opacas, de superficie rugosa, grandes. Estreptococos.

Cepas de ensayo

Crecimiento

Streptococcus pyogenes

Bueno/muy bueno

Streptococcus pneumoniae

Bueno/muy bueno

Pasteurella multocida

moderado/bueno

Listeria monocytogenes

Bueno/muy bueno

Shigella flexneri

Bueno/muy bueno

Escherichia coli

Bueno/muy bueno

PRUEBA DE CAMP PARA Streptococcus beta hemolíticos Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una proteína difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-hemólisis de Staphylococcus aureus. S. aureus (sembrado desde la parte superior hasta la parte inferior de la placa) produce esfingomielinasa C que se puede unir a las membranas de Los eritrocitos. Cuando son expuestas al factor CAMP del grupo B, las células sufren hemólisis.

PRUEBA DE BILIS ESCULINA PARA Streptococcus hemolíticos

gamma-

Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram (+) catalasa negativos. En la prueba positiva, el tubo torna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina. Enterococcus faecalis es la antigua categoría taxonómica para Streptococcus faecalis.

ANTIBIOGRAMA CON OPTOQUINA PARA Streptococcus alfahemolíticos

Permite diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible a optoquina (etilhidroxicupreína, Taxo P) de otras especies de Streptococcus alfahemolíticos, en especial del grupo Viridans que son resistentes.

ANTIBIOGRAMA CON BACITRACINA PARA Streptococcus betahemolíticos

AGAR AZIDA SANGRE (base) Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Estreptococcus y Staphylococcus, a partir de posiciones, aguas residuales, productos alimenticios u otros materiales objetos de investigación. Puede utilizarse con o sin adición de sangre.

FORMA DE ACTUACIÓN Este medio de cultivo dispone de una excelente y abundante base nutritiva, que permite incluso el crecimiento de microorganismos exigentes, la azida inhibe a la flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram positiva se desarrolla más o menos indemne. El proteus crece, por supuesto pero como colonias definidas sin agrupación. La adición de sangre al medio de cultivo facilita la interpretación de las formas de hemólisis. COMPOSICIÓN gr/Lt Triptosa 10.0 Extracto de carne 3.0

Cloruro sódico 5.0 EMPLEO E INTERPRETACIÓN El material a investigar se extiende sobre la superficie del medio de cultivo. Incubación. Hasta tres días a 37ºC. Las colonias se someten a estudios para su identificación. Compruébense los halos de hemólisis producidos.

FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS, UTILIZADAS. PRUEBAS BIOQUIMICAS Conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. Entre otros aspectos se analiza la acción de la bacteria sobre los hidratos de carbono (que fuente de carbono utilizan, en que condiciones, como lo utiliza, que productos se obtienen), la liberación de exoenzimas, metabolitos y toxinas al medio de cultivo; además de la motilidad entre otros. A partir del conocimiento del metabolismo. Las pruebas bioquímicas nos permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio. Esta identificación debe hacerse a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). A demás se debe tener en cuenta que las características metabólicas de los microorganismos pueden variar en función de distintos factores; de manera que para realizar una caracterización confiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inoculo, reactivo, Incubación, y el tiempo de lectura) y utilizar mas de una prueba en cada caso. La elección de las mismas se hará en base ala familia en estudio, lo cual ira determinado en curso del aislamiento. Algunas pruebas bioquímicas más utilizadas: OXIDASA Esta sirve para demostrar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa en preparaciones de de microorganismos. Interpretación de resultados: Positiva: el color de la tira vira a azul debido ala oxidación del compuesto adicionado por el azul de indofenol. Negativa: el color de la tira de papel no vira. CATALASA Sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Interpretación: Positiva: formación inmediata de burbujas bien visible (desprendiendo de O2).

Negativa: no hay formación de burbuja (no hay producción de O2)

LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina. Interpretación: Positiva Tubo inoculado: medio líquido Tubo de control: el medio se mantuvo sólido Negativo Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un tiempo adicional. Tubo de control: el medio se mantiene sólido

REDUCCIÓN DE NITRATOS Permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre. Interpretación: Fase I Positiva: color rosado a rojo intenso por que el nitrato ha sido reducido a nitrito por el organismo. Negativa: no se observa cambio de color. Fase II Positiva: no se observa cambio de color por la ausencia de nitrato en el medio, esto indica que el microorganismo redujo el nitrato a nitrito y luego redujo nuevamente el nitrito. Negativo: color rosado a rojo intenso, por presencia de nitrato que no ha sido reducido por el microorganismo. El zinc redujo el nitrato a nitrito.

KLIGLIER

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar, un hidrato de carbono especifico incorporado al medio de crecimiento básico así como la producción de gas y acido sulfhídrico. Interpretación: La utilización de hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos, capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando, productos que alcalinizan el medio. Al interpretar analizar los siguientes aspectos. Utilización del hidrato de carbono: Si el microorganismo en estudio solo fermenta la glucosa Superficie: reacción alcalina, color rojo. Profundidad: reacción ácida, color amarillo. Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa Superficie: reacción alcalina, color rojo Profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento, ni cambio de color, si el microorganismo es facultativo, reacción alcalina, color rojo. Si el microorganismo no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla Superficie: reacción ácida a tiempos cortos, y luego alcalina, color rojo Profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color Producción de gas Si el microorganismo es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o con el desprendimiento del tubo dejando una área clara. Si el microorganismo es anaerogenico, no hay producción de gas. Producción de ácido sulfhídrico: Si el microorganismo produce este acido, se manifestara por la presencia de un precipitado negro del sulfuro de hierro, en la parte profunda del tubo. Si el microorganismo no produce este acido, se manifestará por la ausencia de dicho precipitado.

TSI Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.

K/A Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiarán a amarillo.

A/A Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán también el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiará a amarillo.

K/K Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.

A/A(g) aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.

K/A(H2S) aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sódio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio, de una enzima capaz de hidrolizar el almidón. Positiva: halos de degradación (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobre el fondo azul. Negativa: ausencia de halos; coloración azul alrededor de las colonias (presencia de complejo Yodo-Almidón) LIA Determinar la capacidad de un microorganismo para descarboxilar la lisina. Interpretación: Positivo: el medio vira a un violeta mas intenso Negativo: el medio permanece igual IMVIC Son cuatro pruebas (Indol, RM, V/P, CITRATO) INDOL Mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de una molécula de triptófano. Interpretación Positiva: un anillo cereza en la superficie del medio en la capa alcohólica (corresponde a la fermentación del compuesto quinonico coloreado derivado del indol) Negativa: no aparece el anillo (no hay indol en el medio)

INVESTIGACION DE LA PRODUCCION DE ACETIL METIL CARBINOL (V/P) Y ÁCIDOS (RM) Con estas dos pruebas se estudia el tipo de fermentación (butelinglicolica o acido mixta) realiza el microorganismo en estudio. RM: Sirve para comprobar la capacidad de que tiene un organismo para producir y mantener establecidos productos terminales ácidos de la fermentación (acido-mixta) de la glucosa.

Interpretación: RM Positivo: el cultivo es lo suficientemente acido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH= 4.4), en la superficie del medio. Negativo: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio.

V/P: A través de esta se comprueba la capacidad de un microorganismo para formar un producto final neutro, el acetilcarbinol (acetoina) a partir de la fermentación (butilenglicolica) de la glucosa. Interpretación: V/P: Positivo: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia acetoina) Negativo: sin cambio de color (amarillo) en superficie del medio.

CITRATO Se usa para determinar la capacidad del microorganismo para utilizar el citrato como única fuente de carbono. Interpretación: Positiva: hay crecimiento (turbidez)+ cambio del medio de verde a azul oscuro. Negativo: ausencia de crecimiento. + o vira el medio, (verde).

PRUEBA DE HEMOLISINAS La hemólisis es un fenómeno que se observa cuando algunas cepas se siembran en Agar Sangra causadas por enzimas llamadas hemolisinas. La hemólisis puede ser alfa o beta o no presentarse (hemólisis gama). Alfa hemólisis: Producen una hemólisis incompleta (una hemólisis parcial) sobre el agar sangra, observándose una coloración de verde a marrón por la salida de los iones potasio de los glóbulos rojos.

Beta hemólisis: Producen una destrucción completa de los glóbulos rojos (hemólisis total); mostrando una zona clara que rodea la colonia con un diámetro de dos a cuatro veces el tamaño de la colonia. Gama hemolíticos: No presentan hemólisis alrededor de las colonias. PRUEBA DE CAMP Su nombre se origina de las iniciales de Chrestie, Atkins y Munch-Peterson, quienes informaron el fenómeno observado por primera vez en 1994. El factor de CAMP, es un factor extracelular producidos por los Streptococcus del grupo B, que aumenta la actividad hemolítica de la beta lisina estafilocócica del S. aureus. Esto lleva a observar un aumento de la actividad hemolítica cuando en cultivo se encuentra presentes estas dos especies, básicamente es la demostración de del sinergismo de dos hemolisinas: Staphylococcus aureus y otra la beta hemolisina producida por Streptococcus spp, en estudio, para ello, se siembra una línea sobre la superficie de una caja de agar sangre una cepa de Staphylococcus aureus y perpendicular a ella y (sin tocarla) se siembra en línea continua el Streptococcus sp en estudio, se incuba por 24 horas a 37ºC; el fenómeno CAMP, consiste en una zona en forma de flecha de una clara hemólisis beta, el cual se observa mejor en sangre de carnero y debe realizarse en ambiente aerobio, ya que otros Streptococcus sp pueden dar reacciones positivas en ausencia de oxigeno.

PRUEBA DE COAGULASA La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protombina capaz de trasformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de coagulo visible en un sistema analítico adecuado. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en partes iguales con una pequeña cantidad de o plasmas de tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación de manera similar a cuando se añade trombina. El 100% de las cepas de S. aureus tienen la capacidad de producir esta enzima que coagula el plasma humano y el de algunos mamíferos.

Se han descrito dos formas bacteriana y coagulasa libre.

de coagulasa: coagulasa unida a la pared

INTERPRETACIÓN: La inmediata formación de grumos indica la presencia de la enzima coagulasa. Causas de error: la presencia debe leerse antes de 24 horas, porque hay algunas cepas de S. aureus que producen fibrinolisinas que pueden destruir el coagulo formado. PRUEBA DE UREASA La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea produciendo amoniaco, CO2 y agua. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio. Produciendo una alcanalización y un aumento de Ph del medio. La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio: amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Interpretación Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones positivas en 1-2 horas dando un color fucsia en el medio por viraje del indicador de Ph una prueba negativa presenta un color amarillo-anaranjado en el medio.

En el tubo de la izquierda se observa sin inocular el medio, en el centro uno con resultado negativo, ala derecha se observa un tubo con resultado positivo para urea. PRUEBA DE DNasa Microorganismos productores de desoxiribononucleasa hidrolizan el DNasa presente en el medio de cultivo, característica que ayuda ala identificación de microorganismos. Técnicas 02Sembrar a partir de un cultivo joven realizando un cuadrado de los organismos a prueba según la grafica incubar por 18 -24 horas a 37 ºC. Interpretación A las 24 horas adicionar 1ml de ACDI clorhídrico 1N, en medio ácido el DNA se precipita, por lo tanto si presenta hidrólisis del DNA contenido en el medio este se observara como un halo claro alrededor del crecimiento. Reporte el Dnasa positivo o negativo según presente zona clara alrededor del crecimiento.

CATALASA La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es útil para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva). La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno (3%) sobre colonias en medio que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima. Medio MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer) Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en 2 fases:

1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio 2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: 2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos (Fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol 2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario. La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico.

En la izquierda se observa un tubo sin inocular, en el centro un tubo al cual se le agregaron los reactivos y su resultado es negativo para rojo de metilo y positivo para voges-proskauer, en e tubo de la derecha se observa un tubo el cual una vez agregado los reactivos su resultado es positivo para rojo de metilo pero negativo para voges-proskauer. Prueba SIM (sulfuro indol motilidad)

En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce H2S, tomando así el medio una coloración negra.

La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene pdimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba. LIA El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de descarboxilar la lisina, produciendo un cambio de color del púrpura de bromocresol. Sin embargo, esta descarboxilación sólo se puede hacer en un medio ligeramente ácido, que se consigue con la fermentación de glucosa, por ello esta prueba está limitada a los microorganismos capaces de utilizar la glucosa. Cuando el pH del medio aja, el indicador vira a amarillo. Al alcalinizar el medio debido a la descarboxilación de la lisina, el indicador (púrpura de bromocresol) vira a rojo púrpura. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan un precipitado negro. Además pueden aparecer burbujas de gas, que pueden incluso desplazar el medio.

En el tubo de la izquierda se muestra un tubo sin inocular y el cual seria una prueba negativa para lisina, en el tubo de la derecha se muestra un tubo con resultado positivo.

Medio con citrato de Simmons

Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.

AGAR La palabra "agar" proviene etimológicamente de la lengua Malaya y viene a representar el alga roja del género Euchema. El agar es una sustancia colodial seca que se extrae de diferentes especies de algas rojas particularmente de la clase Gellidium, Gracilaria, Pterocladia y Anthopeltis. Dependiendo de la calidad y de sus aplicaciones el agar se divide en dos tipos: industrial y bacteriológico. El incremento de uso de agar para aplicaciones industriales como comidas (carnes y vegetales enlatadas, dulces, pasteles, helados, etc) ha sido enorme debido a sus propiedades como agente dispersador, estabilizante, espesante y agente gelificante. Debido a sus numerosas ventajas el agar sustituye a la pectina. Ya que es una gelatina de origen animal porque tiene aproximadamente ocho veces más de poder gelificante que la gelatina animal.

PEPTONAS El término "peptona" se emplea para definir un producto soluble en agua que se obtiene por hidrólisis particularmente de una proteína o varias proteínas. Este material contiene una mezcla de aminoácidos libres, péptidos y proteosas que se mantienen en la solución después de calentarlas a 100º C. La presencia de metales alcalinos o fosfatos puede causar la precipitación de la peptona a un pH neutral. Por ésta razón las peptonas producidas a un pH neutro se deben de utilizar para las fórmulas de los medios. Existe una gran variedad de peptonas dependiendo de los requisitos de crecimiento de los organismos para ciertos aminoácidos y péptidos. En general las proteínas empleadas en la producción de peptonas son de dos tipos, proteínas animales (caseína, gelatina, carne) y proteínas vegetales (soy yo). Las peptonas se obtienen a través de varios tipos de procesos de digestión como ácido, alcalino y enzimático. La hidrólisis rompe todas las proteínas y péptidos y produce sólo aminoácidos libres. Al mismo tiempo destruye algunos aminoácidos importantes como triptófano. Las peptonas pueden ser usadas para las bacterias como fuente de energía permitiendo la producción de proteínas de H2S, indol, aminos, etc. En la preparación de medios de cultivo uno debe emplear el tipo de peptona que proporciona las características adecuadas para la prueba. Por ejemplo en la prueba de indol se debe emplear una peptona rica en triptonal (peptona de caseína). Es importante recordar que aparte de los aminoácidos presentes las peptonas contienen otros constituyentes que pueden

estimular el crecimiento de ácidos nucleicos, minerales, vitaminas y ocasionalmente carbohidratos como es el caso de la peptona de soy yo. MEDIO DE CUTIVO Definición de medio de cultivo: substrato óptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variará dependiendo del tipo de microorganismo. Componentes de los medios de cultivo:  Agua  Extracto de levadura: fuente rica en vitaminas B; también contiene nitrógeno orgánico y compuestos de carbono. Peptonas: es el producto que resulta de la digestión de materiales proteicos. Constituye una fuente principal de nitrógeno orgánico; contiene también algunas vitaminas, y a veces carbohidratos  Distinguimos dos tipos, dependiendo del tipo de digestión que hayan sufrido: Hidrólisis química (ácida o alcalina) Hidrólisis enzimática.  Infusiones y extractos: contienen las sustancias solubles en agua de tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales). Mientras que un caldo se obtiene por ebullición de los tejidos, una infusión implica un "colado" del líquido obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.  Agentes solidificantes: permiten solidificar un medio previamente líquido. Pueden ser de:  agar-agar (a partir de 10-14 g/l es un medio de cultivo sólido; para valores inferiores, medios semisólidos).  gel de sílice  geles

BIBLIOGRAFIA

 http://www.iib.unsam.edu.ar/IIBINTECH/html/docencia/Microbiologia/aislamiento.pdf  Manual De La Merk  www.telmeds.org.com 