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ÍNDICE CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 2 CAPÍTULO II REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA ................................ 3 CAPÍTULO III PRÁCTICAS DE LABORATORIO. 1 SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS ..................................................... 4 2 FLORA NORMAL.............................................................................................. 10 3 BIOFILMS. OBSERVACIÓN IN VIVO Y FORMACIÓN IN VITRO. ................... 15 4 GÉNERO STAPHYLOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN. ........... 19 5 GENERO STREPTOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN .............. 26 6 CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO. ............................................................. 37 7 UROCULTIVOS. ............................................................................................... 40 8 COPROCULTIVOS. .......................................................................................... 47 9 GENERO PSEUDOMONAS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN .................. 55 10TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN......................................................................... 61 11EXUDADOS GENITALES. OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES ............... 66 12CANDIDA ALBICANS. IDENTIFICACIÓN. ....................................................... 73 ANEXO 1. TABLA DE SEPARACIÓN Y ELIMINACIÓN DE RPBI

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 2010

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN. Los experimentos de este manual se han seleccionado para dar al estudiante

de Bacteriología Cínica el

conocimiento de las técnicas básicas

usadas en el laboratorio clínico. Estos ejercicios familiarizarán al estudiante con algunos microorganismos comunes así como

sus

características. Se

le

presentan también algunos procedimientos de rutina utilizados en el diagnostico de padecimientos infecciosos más comunes. Cabe hacer notar que con el contenido de este manual no se espera cubrir todas las técnicas que se llevan a cabo en un laboratorio de bacteriología clínica sino solo aquellas más comunes permitidos por los recursos e infraestructura de la facultad.

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 2010

CAPÍTULO II REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA. 1. El uso de bata con manga larga y hasta la rodilla es obligatoria para todo trabajo en el laboratorio. 2. El uso de guantes y cubre bocas es requerido para algunas prácticas y en todo caso se deberán usar de acuerdo a las instrucciones de uso provistas por el maestro. 3. Fumar, comer o tomar cualquier alimento, no está permitido en el laboratorio. 4. Mantenga sus dedos, lápices y papeles fuera de su boca (no corte el masking- tape con los dientes). 5. No deben aplicarse cosméticos dentro del laboratorio. 6. Las mesas de trabajo deben limpiarse antes y después de cada sesión con fenol al 5 %. 7. Todo residuo peligroso y no peligroso debe eliminarse en el lugar indicado de acuerdo a la tabla de RPBI (ver anexo). 8. No se debe lavar material sin antes preguntar al maestro. 9. Es indispensable lavarse las manos antes de salir del laboratorio. 10. Todos los cultivos deben marcarse como mínimo con: Número de equipo, Género y especie del microorganismo sembrado. 11. Los accidentes de laboratorio como son: quemaduras, cortadas o derramar un medio de cultivo inoculado deben reportase inmediatamente al maestro. De todos los errores posibles, no reportar cualquier accidente al maestro es el más serio.

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CAPÍTULO III. PRÁCTICAS 1

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

OBJETIVO: Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de realizar e interpretar la prueba de difusión en placa para evaluar la sensibilidad bacteriana in Vitro. GENERALIDADES: Los antimicrobianos para ser utilizados en la

terapia

necesitan ser sometidos a un antibiograma, por ello es preciso entender diversos conceptos como son: Concentración mínima inhibitoria (CMI), es la concentración más baja en la que un fármaco inhibe el crecimiento bacteriano visible. (Levinson, 2004) Concentración mínima bactericida (CMB) que será la concentración del fármaco que va a eliminar el microorganismo en un 99.9 %. (Levinson, 2004) Algunas de las características de los fármacos radican en que existen de forma natural, sintética ó semisintética, poseen eficacia antibacteriana, algunos producen toxicidad si están en exceso, y otros tienen actividad bactericida más que bacteriostática por lo siguiente: los bactericidas matan las bacterias que estén en fase activa,

fase de reposo y algunas veces inhiben el crecimiento

microbiano por lo tanto tienen una CMB igual ó similar a la Cuando

CMI.

son exclusivamente bacteriostáticos logran la destrucción bacteriana

finalmente con la ayuda de las defensas del hospedero por que tienen una CMB superior a la CMI. (Liébana, Allen y Janda, 2002) En el momento en que un microorganismo no es inhibido por el antibiótico es porque tiene la capacidad para modificar su estructura genética como una barrera para evitar el daño que le puedan causar, y lo hacen disminuyendo su permeabilidad celular para impedir que penetre el antibiótico, inactivan las enzimas (por ejemplo los Beta lactámicos) y a la vez fabrican otras que cambien la configuración molecular de el agresor, ó modifican el sitio de interacción de éste para que se pierda afinidad fármaco/bacteria. (Brooks, Butel y Morse., 2002)

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La metodología más utilizada para la valoración in vitro de los antimicrobianos es

Difusión en agar por el método de Kirby Bauer que

además de ser rápida es muy sencilla y específica, es aplicable a una amplia variedad de bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae y Pseudomonas sp, entre otras. Fundamento: Un disco de papel filtro que contiene una cantidad precuantificada de un fármaco se coloca en la superficie del medio, hace contacto con la humedad de éste y absorbe el agua, difundiendo en el agar formado un gradiente de concentración, después del periodo de incubación los discos aparecen rodeados por una zona clara, que es la potencia de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre

bacterias

en

crecimiento

y bacterias inhibidas se conoce como

concentración crítica y se aproxima a la CMI obtenida por métodos de dilución. (Picazo, 2000). La actividad in vitro puede variar por diversos factores de acuerdo a las siguientes tablas: CAUSAS DE LA VARIACIÓN

EFECTO OBSERVADO

Bajo inóculo

Agrandamiento general

Volumen insuficiente de medio de cultivo

inhibición.

de las

zonas

de

Sobrecarga del disco Alto inóculo Volumen excesivo del medio de cultivo

Disminución general de las zonas de inhibición.

Inactivación de la droga en los discos Discos vencidos Exceso de timina y timidina en el medio de Trimetroprim-sulfametoxazol: Disminución del cultivo. Se corrige con el agregado (5 % tamaño de la zona y/o aparición de colonias v/v) de sangre lisada de caballo, rica en internas. timina fosforilasa.

(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2004)

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 2010 CAUSAS DE LA VARIACIÓN Exceso

de

divalentes: Ca

contenido ++

y Mg

de

cationes

++

EFECTO OBSERVADO Tetraciclinas, quinolonas fluoradas, colistina o aminoglucósidos: Disminución de las zonas, especialmente

frente

a

Pseudomonas

aeruginosa. Escaso contenido de cationes divalentes

Aumento de las zonas de inhibición.

pH menor a 7.2

Aminoglucósidos, macrólidos: Disminución de las zonas de inhibición. Penicilinas y Tetraciclinas: Aumento de las

pH menor a 7.2

zonas de inhibición.

(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2004) Sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado el halo de inhibición puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en función del tipo de infección y de la especie considerada. (Picazo, 2000) Intermedio indica que el halo de inhibición traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (por ejemplo: orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual. También incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de interpretación en la categoría clínica. (Picazo, 2000) Resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las

concentraciones

habitualmente

alcanzadas

en

sangre/tejidos

del

correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada ha

usado

respuesta como

clínica

tratamiento

correspondiente antimicrobiano. (Picazo, 2000)

cuando se el

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Existen otras técnicas para determinar susceptibilidad como las pruebas de macro y microdiluciones (agar ó caldo), cada una de las cuales utilizan diluciones del antibiótico en el agar sobre la cepa problema y tras subcultivar se determinan cuantitativamente las concentraciones antes mencionadas. (Liébana et al. 2002) La prueba Epsilon ó E-Test tiene buena reproducibilidad, ya que después de inocular la bacteria e incubar, se formará una elipse en el agar por acción de una tira de uno o varios antibióticos y será el pico máximo de inhibición. Al realizar el nivel bactericida del suero el

método es similar al de

microdiluciones, sólo que las diluciones son del suero, aquí se valora el pico de actividad bactericida para Endocarditis.

Si

el

tratamiento

contra

utilizamos

un antibiograma

automatizado

es más rápido, pero es muy costoso, se utilizan microplacas con pozos en “U” que

permiten una lectura en forma visual de las pruebas bioquímicas

frente al panel de antibióticos. (Liébana et al. 2002, Picazo 2000) DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: Se realiza una técnica que permite obtener un halo de inhibición medible para determinar categorías de susceptibilidad que puede ser relacionada con las tablas a la CMI. MATERIAL: Material por equipo de 4:

Cepas para cada equipo:

6 placas de Agar Müller Hinton

1 tubo con E. coli

1 pinza para sensidiscos

1 tubo con S. aureus

2 mecheros

1 tubo con P. mirabilis

6 tubos con 2 ml de solución salina

Sensidiscos

estéril (con boca amplia para que

disponibles

entre un hisopo) 6 hisopos estériles

con

antibióticos

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METODOLOGÍA:  DIFUSIÓN EN AGAR (MÉTODO DE KIRBY BAUER) 1. Preparación del inóculo: Tomar 2 a 3 colonias aisladas y ajustar a una turbidez de 0.5 de la escala de MacFarland en solución salina estéril. Agitar durante 1520 segundos. 2. Tomar el inóculo con un hisopo estéril y eliminar el exceso del mismo rotando varias veces en la pared del tubo. Inocular en placas Müller-Hinton por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia del agar, se deja absorber el inóculo de 3 a 5 minutos. 3. Colocar los discos con pinza estéril presionando ligeramente sobre la superficie, colocarlos a no menos de 15 mm del borde de la placa, y evitar la superposición. Para placas de 150 mm no se emplearán más de 12 discos y para las de 100 mm no más de 6. 4. Incubar las placas de 16 a 18 hrs. a 35°C antes de que transcurran 15 minutos (Si el microorganismo es un estafilococo o un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la oxacilina y vancomicina) Interpretación: Leer el diámetro de las zonas de completa inhibición con una regla midiendo de un extremo a otro del halo pasando por el centro del disco. 1. En medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa. 2. En medios con sangre se miden sobre la superficie del agar. El tamaño de la zona es comparable con estándares para determinar sensibilidad de acuerdo al Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Si hay colonias dentro del halo de inhibición

pueden

ser

contaminaciones,

mutantes

resistentes,

poblaciones heterogéneas o cultivos mixtos y

conviene volver a realizar el ensayo. Regla general: No se consideran las colonias diminutas que aparecen en el halo de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida, excepto Staphylococcus vancomicina.

resistenes

a

oxacilina

ó

Enterococcus

resistentes

a

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RESULTADOS: Se llenará la

siguiente tabla de acuerdo a los

antibióticos

utilizados. Microorganismo: Antibiótico

Halo (mm)

Criterio (S,R,I)

AUTOEVALUACIÓN. Menciona porque razones un halo grande no implica forzosamente mayor sensibilidad al antibiótico probado. Explique por qué la Concentración Mínima Inhibitoria y la concentración letal mínima son iguales para antibióticos bactericidas y no para antibióticos bacteriostáticos. REFERENCIAS. Brooks, G.F., Butel J.S. y Morse S.A. (2002). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. México: Manual Moderno, CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. (2004). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility- Testing. Volumen 4. # 1 Levinson, W., (2004) Microbiología e inmunología médicas (8ª Edición) España: McGrawHill, Liébana, U. J., Allen, S.D., Janda M. W (2002). Microbiología oral (2ª Edición) España: McGrawHill. Picazo J. J (2000) Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Protocolos Clínicos. Métodos básicos para el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. Recuperado el 15 de julio de 2009 en http://www.seimc.org/

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FLORA NORMAL

OBJETIVO: El alumno aprenderá a reconocer los diferentes microorganismos existentes como flora normal de diversas regiones anatómicas. GENERALIDADES: La microflora normal es un término que se le da al conjunto de bacterias que pueden ser localizan en

residentes permanentes ó transitorias y

se

la superficie o interior de casi todas las zonas orgánicas del

hospedador sano en contacto con el exterior, y que en conjunto establecen un equilibrio. Si dicho equilibrio se rompe se desencadenan una serie de procesos perjudiciales. La flora normal generalmente se compone por bacterias y levaduras. (Liébana Allen y Janda, 2002; Prats, 2006) Cuando es residente ó autóctona, las bacterias se adaptan a su medio externo y si éste es adecuado permanecen por meses o años. En su fase de Transitoria ó transéunte, es eliminada después de un tiempo en que las condiciones le favorecieron, y ésta puede volver al ciclo de la primera cuando aparecen o desaparecen las condiciones del medio. (Liébana et al. 2002) Los miembros de la flora tienen baja virulencia es decir, baja patogenicidad pero sólo en su localización anatómica inicial, cuando abandonan ésta ocurre lo contrario. Tienen su origen desde el nacimiento, los primeros microorganismos aparecen desde el canal del parto a piel, fosas nasales, etc. (E. coli primera que se instala en el intestino del neonato),

es la

posteriormente otros

aparecen por factores exógenos como el estado nutricional y el ambiente externo, además de factores sustancias

inhibitorias,

endógenos

como

receptores

celulares

ó

en semanas queda establecida una microbiota casi

como en el adulto. (Nowrouzian, Hesselmar y Saalman 2003) En la práctica se conocerán miembros importantes de la microflora normal de algunas zonas anatómicas que difieren en número y tipo de acuerdo a su localización y que causan alteraciones cuando hay sobrecrecimiento de ellas, por ejemplo; causar

en

piel se encuentra

Staphylococcus epidermidis

(que puede

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infecciones en válvulas cardiacas ó prótesis), también cándida se encuentra en piel o

mucosas, sin embargo, si el medio ambiente dentro de la boca o la

garganta entra en desequilibrio, el hongo puede multiplicarse.

Cuando esto

sucede, aparecen síntomas de la candidiasis también conocida como muguet ó candidiasis orofaríngea, el Staphylococcus aureus es menos frecuente en piel, y muy predominante en nariz, la flora de la boca y garganta la constituyen los Streptococcus del grupo viridans, el cólon tiene mayor número de flora normal porque posee tanto bacilos y cocos gram positivos como gram negativos, y fuera del cólon las más virulentas son: Escherichia coli y Enterococcus fecalis. (Levinson, 2004., Nowrouzian et al. 2003) “Es importante conocer la flora normal de éstas diversas regiones para posteriormente identificar si un microorganismo procedente de una muestra de un paciente es realmente el agente causal de alguna enfermedad” (Liébana et al. 2002) DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: Una vez obtenidas las muestras se realiza un aislamiento de bacterias procedentes de diversas regiones a estudiar en varios medios de cultivo, seguido de la observación microscópica directa por tinción, posteriormente se incuban los medios de cultivo para observar la

morfología

bacteriana correspondiente a lo visto en el microscopio. MATERIAL: Por equipo de 4 a) Morfotipos por región: Nariz, Faringe, Intestino, Piel. 1 equipo para tinción de Gram

2 abatelenguas estériles

(Puente de tinción y colorantes)

2 mecheros

2 microscopios

1 asa

8 Portaobjetos

4 tubos de solución salina estéril

4 hisopos estériles

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b) Microorganismos por región: Nariz, Faringe, Intestino, Piel. 4 placas de Agar de MacConkey

4 hisopos estériles

4 placas de Agar de Sal y Manitol

2 abatelenguas estériles

4 placas de Agar Sangre

2 mecheros

4 placas de Agar de Biggy

2 tubos de solución salina estéril

METODOLOGÍA: TOMA DE MUESTRAS. 

NASAL

1. Pasar el hisopo estéril a través de la nariz suavemente, hay que mantenerlo cerca del septum y suelo de la fosa. Rotar el hisopo y extraerlo. 2. Realizar un inóculo en un extremo de cada uno de los medios de cultivo y posteriormente en área estéril estriar masivamente cada medio. 3. Con otro hisopo se realiza un extendido directo para tinción de Gram, observar al microscopio. 4. Incubar las placas a 37ºC de acuerdo a la tabla 1 y observar. 

FARÍNGEA

1. Colocar al paciente sentado con la cabeza ligeramente hacia atrás, con la ayuda de un abatelenguas, se hace presión sobre la lengua, con el hisopo estéril tomar una muestra de la faringe posterior. (no tocar la mucosa oral, lengua o úvula). Realizar los pasos 2 a 4 anteriores.  PIEL 1. Tomar un hisopo estéril e introducirlo en un tubo con solución salina estéril, eliminar el exceso de éste, se elige una zona que no tenga mucho contacto con el exterior y tomar la muestra frotando varias veces el mismo sitio. Realizar los pasos 2 a 4 iniciales.  INTESTINO (HECES FECALES) 1. Con un hisopo estéril, tomar una pequeña cantidad de las heces, hacer una suspensión en el tubo con solución salina estéril, eliminar el exceso y realizar un inóculo en cada uno de los extremos de los diferentes medios, sembrar por

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estría masiva en área estéril. Realizar un frotis a partir de la suspensión del punto anterior, realizar tinción de Gram y observar. 2. Incubar las placas a 37ºC de acuerdo a la tabla 1 y observar. Interpretación: Se observará la morfología colonial de cada una de las regiones. Medios de cultivo utilizados y morfología colonial. Tabla 1 Medio de

Microorganismos que crecen y

Tiempo de

Cultivo

Características coloniales

Incubación

Agar

Enterobacterias, colonias rosas, lactosa (+).

24 horas

MacConkey

Enterobacterias,

colonias

transparentes

lactosa (-). Pseudomonas, colonias incoloras Lactosa (-). Agar

Sal

y Staphylococcus, colonias con halo amarillo,

Manitol

manitol +.

Agar Sangre

Streptococcus

alfa

hemolisis

y

beta

24 horas 24 horas

hemólisis. Alfa hemólisis: zona de color verde alrededor de las colonias.

Beta

hemólisis: zona de color amarillo claro alrededor de las colonias. Agar Biggy

Candida: Colonias lisas, cremosas o color

48 horas

café. AUTOEVALUACIÓN: Explica porqué los resultados del examen microscópico no coinciden totalmente con los aislamientos obtenidos en los medios de cultivo. ¿Hay concordancia entre los géneros bacterianos aislados como flora normal en esta práctica y los reportados en la literatura?, ¿Cuales son las excepciones?

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REFERENCIAS: Liébana, U. J., Allen, S.D., Janda M. W. (2002) Microbiología oral (2ª Edición) España: McGrawHill. Levinson, W., (2004) Microbiología e inmunología médicas (8ª Edición) España: McGrawHill, Nowrouzian F., Hesselmar B., Saalman R. y Escherichia

coli

in

Infants’

Intestinal

colaboradores (2003).

Microflora:

Colonization

Rate,

Strain Turnover, and Virulence Gene Carriage, Resumen objetivo elaborado por el comité de redacción científica de la sociedad iberoamericana de información científica en base al artículo original completo, publicado por la fuente editorial Recuperado 2009

del

18

de

en:

http://www.bago.com/BagoArg/Biblio/gastroweb198.htm. Prats G. (2006) Microbiología clínica. Madrid: Panamericana.

julio

de

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3

BIOFILMS. OBSERVACIÓN IN VIVO Y FORMACIÓN IN VITRO.

OBJETIVO: El alumno comprenderá el fenómeno de adherencia bacteriana y biofilms mediante la observación de adherencia in vivo

y la formación de un

biofilm in Vitro. GENERALIDADES: Biofilms es un fenómeno que presentan comunidades célulares procarióticas y/ ó eucarióticas de naturaleza heterogénea, que debido a las condiciones del medio al que van a colonizar, se presentan envueltas en una matríz de extrapolisacáridos, y juntas forman una biopelícula en una superficie, ya sea en el medio ambiente, tejidos blandos del ser humano (placa dental y tejido intestinal), ó en superficies lisas (prótesis, catéter). (Gamazo, López y Díaz 2005) 1.- La primera etapa para su formación es la absorción hacia la superficie, y la logran en cuestión de segundos por interacción de las fuerzas electrostáticas de Van der Wals, la cual puede ser reversible 2.- La segunda etapa es la adhesión, en la cual gracias a su composición química y estructural como el glucocálix y pilis, en minutos logran la unión a la superficie. 3.- En algunas horas ó días empieza el crecimiento y división bacteriana. 4.- Empiezan a formar la matríz que los mantendrá unidos por la producción de sustancias poliméricas extracelulares ó EPS, las cuales están compuestas de azúcares como N- acetil glucosamina, fructuosa, galactosa, etc. gracias a los que las bacterias pueden atrapar partículas orgánicas y precipitar. 5.- En su etapa final de Desarrollo hay atracción de otros colonizadores de diversidad biológica para formar ya el agente activo que será el biofilms, en horas ó meses, ya formada la biopelícula ésta sólo puede cambiar de forma y tamaño, mas no de composición porque ésta es irreversible. Dada su complejidad estructural, podrá tener acceso a nutrientes que el medio les proporcione. (Douthwright, Delisle y Eidemiller, 2000) En la presencia in vivo de el biofilms activo radica la importancia de la resistencia a algunos antimicrobianos, y su demostración in vitro ayuda a la comprensión de la complejidad estructural de éstos para la terapia. Gracias a que

las bacterias sufren cambios fenotípicos en el biofilm, presentan también una Págin a 15

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constante fuente de inóculo porque son capaces de formar émbolos que diseminen hacia vía sanguínea y permitan la colonización de otros patógenos hasta finalmente llegar a

estado de sepsis. Como ejemplo en infecciones

intrahospitalarias tenemos la presencia de un microorganismo muy virulento como lo es

Staphylococcus epidermidis, en punta de catéter intravascular y otros

como Enterococcus sp,

S.aureus, y el más común, causante del 30 % de

muertes por infecciones nosocomiales, Pseudomonas aeruginosa asociado con neumonías, infecciones del tracto urinario, y en un 60 % en heridas de quemados (Gamazo, et al. 2005; Van Delden e Iglewski 1998) DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: El primer día se realiza una observación microscópica de células de descamación procedentes de un raspado de la mucosa oral para demostrar la adherencia bacteriana a las células, siguiendo con la demostración de la formación de un biofilms similar a la placa dental a partir de una muestra de saliva que se observará microscópicamente. MATERIAL: Día 1

Fecha Observación de biofilms. Por alumno:

Por equipo de 4:

1 abatelenguas estéril

Equipo para tinción de Gram

2 portaobjetos

1 microscopio 1 gotero con aceite de inmersión Formación de placa dental in Vitro. Por alumno:

1 tubo 15x 150 estéril 1 pipeta estéril de 1 ml 1 tubo 25x150 con 10 ml de caldo de Soya y Tripticaseina suplementado con 5% de sacarosa y 0.2% de extracto de levadura con un portaobjeto adentro. Mechero

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Día 2

Fecha Por alumno:

Mechero 2 portaobjetos Pinzas de disección Reactivos para tinción de Gram Tubos 25x150 inoculados en la clase anterior

METODOLOGÍA:  OBSERVACIÓN DE ADHERENCIA EN CÉLULAS BUCALES 1. Raspar la parte interna de la mejilla con un abatelenguas y depositar la muestra cuidadosamente en el centro del portaobjetos. 2. Dejar secar la preparación y teñir con tinción de Gram. 3. Observar en objetivo de inmersión. Interpretación: La adherencia de bacterias solas ó formando microcolonias, se observa sobre las células epiteliales.  FORMACIÓN DE PLACA DENTAL IN VITRO 1. En un tubo estéril recolectar saliva de cada alumno. Dejar el tubo en reposo unos minutos para que las burbujas de aire desaparezcan. 2. Inocular el tubo 25x150 (que tiene un cubreobjetos en su interior) con 1 ml de saliva utilizando una pipeta estéril. Incubar a 37 ºC por 72 horas.  Después de la formación del biofilm in vitro: 1. Vaciar el caldo del tubo en el matraz para desechos provisto por el maestro para el grupo. 2. Con unas pinzas sacar el cubreobjetos y dejar secar al aire libre. 3. Realizar tinción de Gram sosteniendo el cubreobjetos con las pinzas y cuidando de no perder cual es el lado en que se hizo la tinción. 4. Pegar con lápiz adhesivo el cubreobjetos en el centro de un portaobjetos limpio y observar en objetivo de inmersión.

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 2010

Interpretación. Se observan los microorganismos principalmente Streptococcus formando una capa bastante homogénea sobre el cubreobjetos. AUTOEVALUACIÓN: ¿Cuáles serían dos ejemplos de infecciones bacterianas relacionadas con la formación de biofilms? ¿Además de los procesos infecciosos, en que otras áreas de la ciencia son importantes los biofilms?, mencione un ejemplo para cada caso que refiera. REFERENCIAS: Gamazo C., López G., Díaz R., (2005) Manual práctico de Microbiología (3ª edición) Barcelona, España: Masson. Douthwright J., Delisle, G., Eidemiller B., (2000) American Society for Microbiology. On-Line Biofilms Laboratory Manual. A Manual of Biofilm related exercises. Recuperado

el

21 de septiembre

de

2009.Disponible en: http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jel5/biofilms/ Van Delden, C & Iglewski H. B. (1998). Centers for Disease Control and Prevention.

Emerging

Pseudomonas

infectious

aeruginosa

diseases.

Cell-to-Cell

Infections.

http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol4no4/vandelden.htm

Signaling

Disponible

and en:

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4

GÉNERO STAPHYLOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN.

OBJETIVO: El alumno conocerá las características más importantes del género Staphylococcus así como la diferenciación de las especies más significativas en el área clínica. GENERALIDADES: 1. Características del género: Son Microorganismos inmóviles, carecen de flagelos y no forman esporas, presentan una forma esférica, agrupados en forma de “racimo de uvas”, miden de 0.5 a 1 um, clasificados como Gram positivos y no presentan endosporas. Es un fuerte productor de catalasa, la cual los diferencia de los Streptococcus. Como la mayoría de los Gram positivos son oxidasa negativa. (Murray, Rosethal y Kobayashi; 2002) 2. Especies de importancia clínica: Aunque existen más de 30 especies y 17 subespecies del género que difieren en virulencia y características bioquímicas, los microorganismos que S. epidermidis enfermedades

y

S.

sistémicas,

más se aíslan son saprophyticus. infecciones

Staphylococcus aureus,

Tienen en

amplio

piel,

tejidos,

espectro

en

huesos

etc.

Staphylococcus aureus es el más patógeno y la causa más frecuente de bacteremia además de ser la única especie en

humanos que

produce

la enzima coagulasa. Sus factores estructurales de virulencia más importantes son la presencia de cápsula y péptidoglucano (Murray et al. 2002) 3. Algunos de los principales medios para su aislamiento son los siguientes:

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Tabla 1. Medios de cultivo para Staphylococcus.

MEDIO DE

COMPONENTE QUE

CULTIVO

COMPONENTE QUE

LOS HACE

LOS HACE

SELECTIVOS

DIFERENCIAL

CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

Colonias medianas, blancas, cremosas con AGAR SANGRE

brillo. Colonias amarillo dorado. Pueden presentar hemólisis beta

SAL Y

Cloruro de sodio al 7.5

MANITOL

Rojo de fenol y Manitol

%

Colonias amarillas o blancas con halo amarillo, manitol (+) Colonias blancas ó amarillas rodeadas de una zona sin

cambio

de color ó rojo

más intenso, manitol (-) VOGEL

Telurito potásico

Telurito potásico (Se

JOHNSON

reduce a Teluro de

CON TELURITO POTÁSICO

AL

1%

Cloruro de litio y

Colonias pequeñas de color negro con halo amarillo Manitol (+)

potasio) Colonias pequeñas color gris a negro sin

Glicina

Rojo de fenol y Manitol

cambio de color ó rojo más intenso Manitol (-)

Las pruebas bioquímicas claves para la identificación son las siguientes: Coagulasa en tubo: Es la prueba para separar a los Staphylococcus coagulasa positiva como S. aureus de los coagulasa negativa que incluye principalmente a S. epidermidis y

S. saprophyticus

pero son más de 30 especies, en ésta

técnica se visualiza la capacidad de la bacteria de coagular el plasma, por la acción de la enzima fibrinógeno

coagulasa

que

al

entrar

en

contacto

con

el

activa la coagulación del plasma, detectada visiblemente como un

coágulo. (Prats, 2006) Prueba de la DNAsa: Permite

diferenciar bacterias que poseen la enzima

desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. Su fundamento se basa en la detección de la enzima termoestable capaz de despolimelizar enlaces fosfodiéster del DNA. La hidrólisis del DNA se detecta mediante la formación de un halo

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alrededor del crecimiento y es una prueba que se correlaciona perfectamente con la coagulasa por lo tanto sirve para identificar al S.aureus. (MacFaddin, 2003) Susceptibilidad a la novobiocina: Esta prueba sirve para identificar a S. saprophyticus y se basa en determinar la sensibilidad ó resistencia a la novobiocina (disco de 5 epidermidis (Sensible), y

microgramos) con lo cual se diferencian S. aureus (Sensible), de S.

S.

saprophyticcus

(Resistente). (Murray et al. 2002) DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: 1ª parte. Se inoculan las cepas conocidas en cada uno de los medios provistos, después de incubar se observa y compara las características en el crecimiento de cada uno de los medios sembrados completando la tabla 2 con la morfología observada, posteriormente se realiza la tinción de Gram de las colonias aisladas para observar y comparar la morfología. 2ª Parte. Se montan pruebas de identificación de

acuerdo a las técnicas

descritas y se anotan los resultados en la tabla 3 para discutirlos en grupo. MATERIAL: (Por equipo de 4) 1ª PARTE 3 placas de agar de Vogel-Johnson

1 puente de tinción

(agregar antes de vaciar Telurito

1 tubo de S. aureus

Potásico al 1 %)

1 tubo de S. epidermidis

3 placas de de Agar Sangre

1 tubo de S. saprophyticus Equipo

3 placas de Agar de Sal y Manitol

para tinción de Gram Microscopio

2 mecheros

(checar con el maestro si se usara

3 portaobjetos

en esta o la próxima

2 asas bacteriológicas

sesión)

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2ª PARTE. Tubo 0.5 de la escala de Macfarland

Discos de Novobiocina (5 ug)

2 tubos 13x100 (rosca) estériles

1 pinzas de disección

3 tubos con caldo manitol y rojo de

2 portaobjetos

fenol adicionados de 7.5% de NaCl.

2 tubos con sol. Salina estéril

1 placa de agar para Dnasa con 0.1g

2 hisopos

por litro de Verde de Metilo.

1 pipeta de 1 ml estéril

1 placa de Agar de Muller Hinton

1 gradilla

1 asa bacteriológica

2 microscopios y aceite de inmersión 2 mecheros

METODOLOGÍA: 

AISLAMIENTO

1.- Sembrar a partir de las cepas proporcionadas por estría cruzada una placa de cada medio para cada especie de microorganismo. 2.- Incubar 48 horas a 35-37°C 3.- Observar y anotar los resultados en la tabla 2 

TINCIÓN DE GRAM

Efectuar una tinción de Gram de cada especie y comparar su morfología y agrupación microscópica.  COAGULASA EN PORTAOBJETOS Preparar una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en solución salina estéril. Colocar una gota de la suspensión y una gota de plasma humano o de conejo sobre un

portaobjetos, mezclar suavemente con

el asa y después por rotación. Interpretación. Positivo: Aglutinación macroscópica entre 5 a 20 segundos. La prueba es Negativa si la aglutinación no ocurre dentro de los 3 a 4 minutos. NOTA: La prueba de la coagulasa en portaobjetos detecta sólo coagulasa unida a los Staphylococcus por lo que es un procedimiento presuntivo (10-20%

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de los S, aureus dan resultado negativo) y todo resultado retardado (arriba de 20 segundos) o negativo debe ser confirmado por la prueba en tubo.  COAGULASA EN TUBO 1. Hacer un pool de plasma citratado y pipetear con pipeta estéril 0.5 ml en un tubo de 13 x 100. 2. Tomar una asada de una ó varias colonia aisladas y mezclar suavemente el tubo. 3. Incubar a 35ºC 4 a 6 horas (ir observando cada 30 minutos) inclinándolo suavemente. Interpretación: Positivo: Coágulo completo ó parcial. Negativo: La suspensión permanece homogénea.  PRUEBA DE LA DNAsa 1. Elegir una colonia característica de Staphylococcus, inocular en forma de estría en una placa de agar para DNAsa con verde de metilo. 2. Incubar 18 horas a 35 °C y observar Interpretación:

Positivo: Halo transparente alrededor de la siembra (DNA hidrolizado). El tamaño de la zona es proporcional a la DNAsa producida. Negativo: Sin cambios en el color del medio. Precipitado nebuloso alrededor del medio debido a las sales precipitadas (DNA no hidrolizado).

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 SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA 1. Preparar una suspensión de cada cepa y ajustar de acuerdo al tubo 0.5 de Macfarland e inocular con un hisopo en agar de Müller Hinton por estría masiva en forma vertical, horizontal

y diagonal, con la pinza flameada

colocar los discos con 5 µg de Novobiocina. 2. Incubar de 16 a 18 hrs. a 35 ° C y observar. Interpretación: Halo < a 16 mm (S. saprophyticcus), Halo > a 16 mm (otros Staphylococcus) RESULTADOS: Tabla 2 Morfología colonial. Cepa

Agar Sangre

Sal y Manitol

Vogel johnson

S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Tabla 3 Pruebas de Identificación. S. aureus Agrupación microscópica Manitol y rojo de fenol

Coagulasa DNasa Novobiocina

S. epidermidis

S. saprophyticus

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AUTOEVALUACIÓN: ¿Cuáles serían las pruebas mínimas que recomendaría para lograr identificar la mayoría de las especies de Staphylococcus de importancia clínica? Mencione dos o tres especies de Staphylococcus coagulasa negativa diferentes de S.epidermidis que se aíslen de procesos infecciosos nosocomiales: REFERENCIAS: MacFaddin, J. F. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica (3ª edición) Madrid, España: Panamericana. Murray, P. R; Rosethal K. S y Kobayashi G. S. (2002) Microbiología médica. (4ª edición) Madrid, España: Mosby. Prats G. (2006) Microbiología clínica. Madrid: Panamericana.

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5

GENERO STREPTOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

OBJETIVO: El alumno conocerá las especies más importantes del género Streptococcus y Enterococcus así como su identificación. GENERALIDADES: 1. Características

del

género.

Los

Streptococcus

son

cocos

Gram

positivos anaerobios facultativos inmóviles, que se agrupan en cadenas cortas o largas, no forman esporas, además fermentan hidratos de carbono.

S.

pneumoniae y algunas cepas de grupo viridans requieren de niveles elevados de dióxido de carbono (5%) para crecer, son catalasa negativos y pueden producir uno de los tres tipos de hemólisis: Hemólisis alfa: Zona de lisis parcial de eritrocitos presentes en el Agar Sangre de carnero que se observara como una zona verdosa o grisácea alrededor de la colonia. Hemólisis beta: Zona de lisis total de eritrocitos presentes en el Agar Sangre de carnero que se observara como una zona transparente alrededor de la colonia. Hemólisis gamma: En este caso se llama hemólisis aunque realmente no existe una zona de hemólisis alrededor de la colonia. (Forbes y Sahm 2004). 2. Se clasifican serológicamente de acuerdo al polisacárido C presente en su pared en grupos de Lancefield de los cuales los más importantes son

los

grupos A, B, C,D, F y G. Dentro del grupo D hasta 1984 estuvieron incluidos los Enterococcus pero ahora se clasifican como un género aparte aunque se siguen

estudiando

junto

con

los

Streptococcus.

(Facklam,

1974;

Murray, Rosethal y Kobayashi, 2006) 3. Especies de importancia clínica. Algunos forman parte de la flora normal humana colonizando

las diversas

mucosas, otros

se relacionan con

importantes patologías en el humano como son faringitis, fiebre reumática, infecciones urinarias choque

y

síndrome

de

tóxico entre las más importantes. Los

patógenos más frecuentes son: S. pyogenes (grupo A), S. agalactiae (grupo B),

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S. bovis (grupo D), S. pneumoniae (no agrupado serológicamente) y dentro de los Enterococcus, aunque actualmente existen 29 especies, la que se aísla con mayor frecuencia es E. faecalis. (Murray et al. 2006) 4. Medio de cultivo para su aislamiento: CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS Alfa hemolíticos. Colonias pequeñas de color blanco grisáceo mucoides, rodeadas de una zona de color verde. AGAR

SANGRE

CARNERO (5%)

DE

Beta hemolíticos. Colonias grandes ó pequeñas de color grisáceo rodeadas de una zona

blanco

grande ó estrecha de medio

transparente. No hemolíticos (gamma hemolíticos) Colonias grandes de color blanco ó transparente, sin cambios en el medio de cultivo.

5. Identificación. Si aislamos el género Streptococcus nos basamos primero en el tipo de hemólisis que producen: alfa, beta ó ninguna y en la determinación de características fisiológicas (sensibilidad a Bacitracina, factor CAMP, hidrólisis de la esculina en medio con bilis, tolerancia al NaCl 6.5%) y serológicas. (Macfaddin, 2003). Para beta hemolíticos: Susceptibilidad a la Bacitracina: Esta es una prueba que nos sirve para diferenciar a los estreptococos beta hemolíticos del grupo A (S. pyogenes) que presentan una alta sensibilidad a la Bacitracina presentando un halo cuando se utiliza un disco de 0.04 Unidades del antibiótico. (Macfaddin 2003) Prueba de CAMP: Se utiliza una cepa de Staphylococcus aureus productora de Beta lisina (por ejemplo S.aureus ATCC 25923) que se estría en forma perpendicular a la cepa de Streptococcus beta hemolítico que queremos identificar ( más o menos 3 a 4 mm de distancia entre ambas) a las 24 horas en aerobiosis, se observará la lisis de los eritrocitos en las estrías perpendiculares en

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forma de punta de flecha (característica de S. agalactiae, Beta hemolítico del grupo B de Lancefield, como productor de factor CAMP). (Murray et al 2006) Para alfa hemolíticos: Bilis esculina: Se utiliza

un medio que en su composición tiene sales

biliares que ayudan a inhibir la flora que pueda interferir en la confirmación del género y especie. Es una prueba presuntiva para identificar el

grupo D y los

Enterococcus, cuando hidrolizan la esculina producen glucosa y esculetina, que reacciona con fierro formando un compuesto color negro.

(Koneman, 1998;

MacFaddin, 2003).

Tolerancia al cloruro de sodio: Ésta prueba se observa la capacidad que tienen las bacterias de tolerar una alta

concentración de NaCl y presentar

crecimiento (turbidez) solamente ó crecimiento y fermentación de la glucosa (vire del indicador de pH) condición que distingue (junto con la bilis esculina) a los Enterococcus de los demás cocos Gram positivos catalasa negativos, en ésta prueba se inoculan en el medio Todd Hewitt que contiene cloruro de sodio al 6.5 % y se observa la reacción mediante el viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol. (MacFaddin, 2003). Susceptibilidad a la Optoquina (Clorhidrato de Etilhidrocupreina): En una placa de Agar Sangre, después de la estría masiva de la bacteria en cuestión se pone en contacto un disco de 5 µg de Optoquina y se incuba a 37°C por 18 a 24 horas, ésta prueba ayuda a diferenciar el S. pneumoniae (sensible) de los demás alfa hemolíticos. (MacFaddin, 2003) Solubilidad en bilis: En ésta prueba se observa la solubilidad que caracteriza a los neumococos, a los que se adiciona Desoxicolato de Sodio al 2 %

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a la cepa problema y después de incubar se observa la desaparición de la turbidez que indica una reacción positiva. (Koneman 2004; MacFaddin, 2003). DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: Se proporcionaran dos cepas problema clasificadas solo en base al tipo de hemólisis para su identificación durante la práctica. 1ª PARTE. Aislamiento. Se emplearan dos métodos de aislamiento específicos para Streptococcus que nos sirven para determinar el tipo de hemólisis, aislamiento por estría cruzada con incisión y placa vaciada. 2ª PARTE. Identificación. En base a las hemólisis determinadas se efectuaran las pruebas fisiológicas que se describen más adelante (especificas para alfa o beta hemolíticos). En esta parte se proporcionaran cepas identificadas que servirán de comparación para la identificación de las cepas problema. MATERIAL: 1ª PARTE Por equipo de 4: 10 tubos con aprox. 20 ml. de Agar

2 pipetas de 1 ml estériles.

de Soya y Tripticaseina para vaciar.

1 tubo con un Streptococcus alfa

10 cajas de Petri estériles vacías.

hemolítico (si especificar la especie).

10.5 ml

1

de sangre

de carnero

tubo

con

Streptococcus

beta

desfibrinada estéril.

hemolítico (si especificar la especie).

4 tubos con 2 ml de solución salina

1 asa bacteriológica, fenol y algodón.

estéril. 2 mecheros Para el grupo: Baño María a 45°C

Tubos con capacidad mínima de 15

2 pipetas de 10 ml estériles.

ml, estériles tapón de rosca en número igual al número de equipos.

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2ª PARTE Por equipo de 4: 3 tubos de agar bilis esculina.

Portaobjetos.

3

Gotero con H2O2.

tubos de caldo de Todd Hewitt

adicionado de 63 gr/lt de NaCl y 1 ml

Equipo para tinción de Gram.

de púrpura de bromocresol (1.6 gr

1 puente de tinción.

del indicador en 100 ml de etanol al

2 microscopios.

95%

1 pinza para sensidiscos.

para preparar la sol. que se

adiciona al medio).

Discos

2 tubos con 1 ml de solución salina

identificación de Strep.grupo A.

estéril.

Discos de Optoquina.

2 tubos estériles de 13 x 100 (Rosca)

2 placas de Agar Sangre.

1 tubo con 1.5 ml de Desoxicolato de

1

Sodio al 2 %.

pneumoniae.

1 tubo con Enterococcus

1 tubo con Streptococcus bovis.

faecalis. Mecheros.

1 tubo con Streptococcus pyogenes.

de

tubo

Bacitracina

con

para

Streptococcus

1 tubo con Streptococcus agalactiae. METODOLOGÍA: 1ª PARTE.  AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN DE HEMÓLISIS 1. Preparar 6 placas de Agar Sangre agregando 1 ml de sangre de carnero a cada uno de los seis tubos de Agar de Soya a 45 °C, vaciar y dejar solidificar. Distribuir como sigue: Siembra por estría con incisión: 2 para alfa hemolíticos y 2 para beta hemolíticos. Conservar 2 placas para pruebas de identificación. 2. Siembra por estría cruzada con incisión. Se hace un inóculo primario en un extremo de la placa, posteriormente se realizan las

estrías cruzadas,

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finalmente se hacen incisiones con el asa en las diferentes zonas de la placa de acuerdo a la figura. Incubar 24 horas a 35 °C.

Estrías

Siembra inicial

Incisiones

3. Método de placa vaciada (2 placas para alfa hemolíticos y 2 para beta hemolíticos) Diluir una asada del inóculo en aproximadamente 2 ml de solución salina estéril, mezclar bien. Pasar

una

asada

del

inoculo

diluido

al

medio

fundido

a

una

temperatura homogénea de 42-45°C aproximadamente agregar 1 ml de sangre de carnero desfibrinada, mezclar bien y rápidamente vaciar en una caja de Petri estéril. Una vez que solidifica incubar en atmósfera normal la placa por 18-24 horas a 37°C. 4. Observar y anotar los resultados en la tabla 2 Estrías 2ª PARTE. Hacer una tinción de Gram para S.pyogenes, Enterococcus faecalis y S.pneumoniae, compare la morfología, haga un dibujo de cada microorganismo. Realizar las pruebas indicadas en la siguiente tabla:

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BACITRA CINA

CAMP

BILIS

NaCl

ESCULINA

6.5%

OPTOQUINA

SOLUBILIDAD EN BILIS

S. pneumoniae S. bovis S. pyogenes S. agalactiae Enterococcus faecalis Cepa

problema

(beta hemolítica)

Cepa

problema

(alfa hemolítica)

Para beta hemolíticos realizar las siguientes pruebas:  SUSCEPTIBILIDAD A LA BACITRACINA 1. Tomar 3 a 4 colonias aisladas de la cepa beta hemolítica, colocar un inóculo inicial y hacer una estría masiva en ¼ de la placa de agar sangre de carnero, colocar con pinza flameada el disco diferencial de Bacitracina (0.04 unidades) presionando ligeramente el agar, incubar

24 horas a 37° C en atmósfera

normal. Interpretación: Cualquier halo de inhibición sin hemólisis es Sensible: Presuntivo de Streptococcus del grupo A (S. pyogenes). Sin halo de inhibición con crecimiento en la orilla del disco, es Resistente.

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 FACTOR CAMP 1. Utilizar el extremo de la estría de la prueba anterior

y poner una estría de

Staphylococcus aureus (productor de lisina beta) en el centro a una distancia de 3 a 4 mm. Incubar 24 horas a 37°C

en

atmósfera normal. Interpretación: Positivo: Zona de hemólisis en punta

de

flecha

Streptococcus del Negativo:

Sin

en

la

grupo

hemólisis

estría

problema

(S.

agalactiae)

B

Streptococcus

de

otro grupo no B. NOTA: Los Streptococcus beta hemolíticos con resultados negativos en las 2 pruebas anteriores se consideran como: No pertenecientes a los grupos A ni B. Para alfa hemolíticos realizar las siguientes pruebas:  PRUEBA DE BILIS ESCULINA 1. Sembrar con asa estéril la cepa problema por estría en agar inclinado, incubar 24 horas a 37 ° C y observar. Interpretación: Positivo: Hidrolizado de color negro (Grupo D ó enterococo). Negativo: No neumococo).

hidrolizado



de

color

amarillo

(grupo

Viridans

o

TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO (6.5 %)

1. Inocular un tubo con caldo de Todd-Hewitt con 6.5% de NaCl y Púrpura de Bromocresol como indicador con una asada de la cepa e

incubar 24 horas a

35°C. Interpretación: Positivo: Turbidez con ó sin cambio del indicador de pH a amarillo (Enterococcus). Negativo: El tubo permanece claro (Streptococcus del grupo D, S. bovis ó del grupo viridans).

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 SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA (Clorhidrato de Etilhidrocupreína) 1. Tomar 3 a 4 colonias aisladas de la cepa beta hemolítica, colocar un inóculo inicial y hacer una estría masiva en ¼ de la placa de Agar Sangre de carnero. 2. Colocar con pinza flameada el disco de Optoquina de 5 µg en el centro presionando ligeramente el agar, incubar 24 horas a 37°C. Interpretación:

Halo

de

inhibición

≥

16

mm

es

presuntivo

de

Streptococcus pneumoniae. Sin halo de inhibición: Otros Streptococcus alfa hemolíticos ó Enterococcus.  SOLUBILIDAD EN BILIS 1. Preparar desoxicolato de sodio al 2 %. 2. Montar 2 tubos: Problema y Control. Suspender la bacteria en 1 ml. de sol. salina ajustada a 0.5 de Macfarland en cada tubo. Adicionar al problema 0.5 ml de Desoxicolato de Sodio al 2% y al control 0.5 ml de sol. salina estéril. Incubar 2 horas a 37ºC. Interpretación: (Comparar con el control negativo). Positivo: Tubo claro con bacterias disueltas o solubilizadas (S. pneumoniae) Negativo: Tubo sin cambio con bacterias no solubles (S. bovis).

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RESULTADOS: Tabla 2 Resultados de pruebas de identificación. Tipo de

Bacitra

hemólisis

cina

CAMP

Bilis

NaCl 6.5

Esculina

%

Optoquina

Solubilidad en bilis

S. pneumoniae

S. bovis

S. pyogenes

S. agalactiae

Enterococcus faecalis Cepa problema (beta hemolítica) Cepa problema (alfa hemolítica)

AUTOEVALUACIÓN: Explique porqué es importante definir el tipo de hemólisis antes de proceder a realizar las pruebas presuntivas de grupo de Streptococcus. Mencione tres razones por las que se utiliza Agar Sangre de Carnero al 5 % y no sangre humana en las placas para aislar Streptococcus. REFERENCIAS: Facklam, R. R., (1974) Manual de procedimientos. Aislamiento e identificación de Streptococcus. Centers for Disease Control. Atlanta, Georgia: Public health service.

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 2010

Forbes, B & Sahm, D. (2004) Diagnóstico microbiológico. (11ª Edición). Buenos aires, Argentina: Médica panamericana. Koneman, E. W., (2004) Diagnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. Buenos aires, Argentina: Panamericana. MacFaddin, J. F. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. (3ª edición). Madrid, España: Panamericana. Murray, P. R; Rosethal K. S., Kobayashi G. S. (2006) Microbiología médica. (4ª. Edición) Madrid, España: Mosby.

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6

CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO.

OBJETIVO: Conocer el proceso del cultivo de exudado faríngeo para el diagnostico de faringitis. GENERALIDADES: La faringitis es una enfermedad transitoria

que inicia con o

sin

sintomatología y a lo largo del evento post recuperación se vuelve recurrente si el tratamiento no ha sido oportuno y adecuado. El causante es principalmente el Streptococcus pyogenes (beta hemolítico del grupo A de Lancefield) en un 35 % de las infecciones bacterianas y los virus son causantes del 75 % de la enfermedades en ésta región anatómica. (Facklam, 1974) Además de faringitis como infección local, algunos microorganismos ocasionan diversas patologías, cuando es diseminada origina sepsis bacteriana, y cuando es secuela post-infección estreptocócica el S. pyogenes causa glomerulonefritis aguda y fiebre reumática. Otras bacterias que pueden causar infección faríngea con menor frecuencia son los Streptococcus beta hemolíticos del grupo B, del grupo C y del grupo G de Lancefield además de Archanobacterium haemolyticum. (Facklam, 1974; Levinson 2006). DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA: Tomar la muestra de aislar

en

exudado faríngeo y

Agar Sangre (utilizar placa vaciada cuando sea necesario)

posteriormente

realizar

pruebas

bioquímicas

para

identificar

Streptococcus considerados patógenos. MATERIAL: 1ª y 2ª PARTE. Por equipo de 4: 4 placas de Agar Sangre

1 mechero

4 hisopos estériles

1 asa

4 abatelenguas estériles

2 tubos de Agar de Soya y

Gotero con H2O2

Tripticaseina inclinados.

2 portaobjetos

los

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METODOLOGÍA:  TOMA DE MUESTRA PARA EXUDADO FARÍNGEO 1. Preparar nuestro material estéril y placas sin humedad. 2. Sentado el paciente en posición cómoda, llevar la cabeza ligeramente hacia atrás, con un abatelenguas estéril presionar la lengua e introducir un hisopo estéril tomando de la parte posterior de la garganta (tomar de las manchas blancas) sin tocar lengua y mejilla. 3. Inmediatamente sembrar en Agar Sangre de Carnero (5%). Incubar 24 horas a 37°C. (ver técnicas de aislamiento por estría y profundidad y placa vaciada práctica anterior). NOTA: Se puede utilizar el medio de transporte de Stuart ó de Amies para muestras tomadas en periodo de 2 a 24 horas. 4. Observar la morfología: Si es beta hemolítico: aislar la colonia en Agar de Soya y Tripticaseina para practicar la catalasa en portaobjetos. 5. Si resulta negativa referirse a la práctica de Streptococcus para su identificación. Si sólo se aislan colonias alfa hemolíticas se considera un resultado negativo. Forma de reportar: Positivo: Mencionar grupo de Lancefield, el género y especie. Negativo: No se observan microorganismos patógenos.

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RESULTADOS: Exudado

Tipo de

Pruebas realizadas y

Grupo de

Hemólisis

resultados

Lancefied

1

2

3

4

AUTOEVALUACIÓN: Mencione las especies de Streptococcus beta hemolíticos que se deben reportar en un cultivo de exudado faríngeo. Explique por qué los Streptococcus alfa hemolíticos y no hemolíticos no se deben reportar en un cultivo de exudado faríngeo. REFERENCIAS: Batista D. N., Bordes B. A., Díez G. O., et al. (2003) Protocolos Clínicos. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología clínica, Infección de las vías respiratorias superior. Recuperado del 20 de Agosto de 2009: en www.seimc.org/documentos/protocolos/clinicos/proto3.htm. Facklam R. R., (1974). Manual de procedimientos. Aislamiento e identificación de Streptococcus. Atlanta, Georgia; Public health service. Center for Disease Control. Levinson, W., (2004) Microbiología e inmunología médicas (8ª Edición) España; Editorial McGrawHill.

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7

UROCULTIVOS.

OBJETIVO: Conocer la metodología adecuada para la siembra, identificación e interpretación del urocultivo y su utilidad en el diagnostico de infecciones de vías urinarias (IVU). GENERALIDADES: Las infecciones de vías urinarias son una de las causas más frecuentes de visita al médico, entre los conceptos más importantes a tener en cuenta tenemos: Bacteriuria: Es un proceso que puede ser sintomático o asintomático que refiere a la presencia de bacterias en la orina. Cistitis: Es un síndrome localizado en vejiga cuyos signos son dolor suprapúvico, disuria, frecuencia y urgencia en la micción. Pielonefritis: Proceso bacteriano patológico del parénquima renal, con signos de poliuria, fiebre de 38.5 °C, náuseas, disuria y dolor en la región lumbar. Prostatitis: Enfermedad bacteriana localizada en la glándula prostática que puede presentarse

espontáneamente

ó

después

de

una

uretritis,

se

caracteriza por urgencia, frecuencia y disuria. (Clarridge, Pezzlo y Vosti 1987) Epidemiología de las IVU. Dependiendo del sexo y la edad es la incidencia de la enfermedad así como la sintomatología, el 1er. lugar de prevalencia lo ocupa el sexo femenino, ya que son más predisponentes a tener IVU recurrente por la ocupación anatómica de la uretra (es más ancha más corta que la del hombre) además de la cercanía con la zona urogenital e intestinal (que varía con la edad y el estado de salud), por lo tanto la proporción en que se infectan en adultos es de 30 por cada hombre, se puede presentar a cualquier edad y se ha observado una mayor incidencia en padecimientos asociados a condiciones como el Embarazo y Diabetes Mellitus. (Ortíz, 1985; Sánchez y Tay 2003)

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En el sexo masculino a mayor edad, mayor incidencia, debido a que en adultos mayores y ancianos hay más riesgo de desarrollar enfermedades en la próstata. (Ortíz, 1985) Tabla 1. Prevalencia de de IVU. Grupos de riesgo

Prevalencia

Hombres

Niños y jóvenes: 0.05 % 60 a 63 años: 10 a 15 % ≥ 81 años: 42 %

Por sexo

Mujeres

Niñas y jóvenes < 19 años: 1 % 20-29 años: 3 hasta 3.5 %, 30-34 años: 4 % ≥ 35 años: 6 % 60 años ó más: 10 a 15 %

Embarazo

Primigestas: 2 %

Condiciones

Secundigestas: 2.5 %

fisiológicas

Multigestas ( ≥ 7 ): 6 % Embarazo asociado a

40 %

Pielonefritis Diabetes Mellitus

Mujeres: 18.8 %

Hipertensión arterial

26 a 68 %

Condiciones patológicas

asociada a Pielonefritis Condiciones

Pacientes hospitalizados,

Hombres: 12 %

secundarias

prequirúrgicos, con sonda

Mujeres: 30 %

uretral, vesical.

(Ortíz ,1985)

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Tabla 2. Bacterias más frecuentes causantes de IVU. % de Infecciones detectadas Pacientes ambulatorios

Pacientes hospitalizados

infecciones

infecciones

Área general

Terapia

Iniciales

recurrentes

E. coli

90

69

42

24

Proteus mirabilis

5

8

6

2

Klebsiella-

1

6

13

16

Enterococcus

1

3

15

23

Staphylococcus

1

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