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Manual de Laboratorio de Bacteriología

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA ................................................................... 2 UNIDAD I ASPECTOS ADMINISTRATIVOS Y LEGISLATIVOS RELACIONADOS CON EL LABORATORIO CLÍNICO ............................................................................................................................................... 3 PRÁCTICA NO. 1 .............................................................................................................................. 3 “MEDIDAS DE SEGURIDAD Y MANEJO DE RPBI” ........................................................................... 3 UNIDAD II ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA DE LAS BACTERIAS .................................................................. 7 PRÁCTICA No. 2............................................................................................................................... 8 “TINCIONES DE GRAM Y ZIEHL-NEELSEN” ..................................................................................... 8 PRÁCTICA NO. 3 ............................................................................................................................ 15 “CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO” ...................................................... 15 UNIDAD III INFECCIONES DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS SUPERIORES............................................. 21 PRÁCTICA No. 4............................................................................................................................. 21 “CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO” ........................................................................................... 21 PRÁCTICA No. 5............................................................................................................................. 26 “DETECCIÓN DIRECTA DE ANTÍGENOS MICROBIANOS. ANTIESTREPTOLISINA O” .................... 26 PRÁCTICA NO. 6 ............................................................................................................................ 31 “CULTIVO DE EXUDADO ÓTICO” .................................................................................................. 31 UNIDAD IV INFECCIONES DEL OJO ................................................................................................... 36 PRÁCTICA NO. 7 ............................................................................................................................ 36 “CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL” ..................................................................................... 36 PRÁCTICA NO. 8 ............................................................................................................................ 40 “DETERMINACIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS POR INMUNOENSAYO” ............................. 40 UNIDAD V INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS INFERIORES............................................... 45 PRÁCTICA No. 9............................................................................................................................. 46 “CULTIVO DE MATERIAL DE VÍAS ÁREAS INFERIORES, CULTIVO DE EXPECTORACIÓN” ............ 46 PRÁCTICA NO. 10 .......................................................................................................................... 51 “UROCULTIVO” ............................................................................................................................. 51 PRÁCTICA NO. 11 .......................................................................................................................... 54 “PRUEBAS BIOQUIMICAS”............................................................................................................ 54 PRÁCTICA NO. 12 .......................................................................................................................... 60 “COPROCULTIVO” ......................................................................................................................... 60 UNIDAD IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ......................................................... 65 PRÁCTICA No. 13........................................................................................................................... 65 “CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO” .............................................................................. 65 PRÁCTICA No. 14........................................................................................................................... 69 “HEMOCULTIVO” .......................................................................................................................... 69

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

1. No se permitirá la entrada al laboratorio al alumno que llegue 15 minutos después de la hora de inicio. 2. No se permitirá la permanencia en el laboratorio si no se trae bata y se presente debidamente abrochada. 3. Los objetos personales deberán permanecer en sitios diferentes a las mesas de trabajo. 4. El alumno deberá estar provisto del material necesario para la práctica antes del inicio de la misma. 5. Queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO comer, beber, fumar y llevarse cosas a la boca dentro del laboratorio. 6. Deberá evitarse interrumpir el trabajo de laboratorio con conversaciones que no pertenezcan a la práctica. 7. El material contaminado tal como: algodón, papeles, cerillos, etc., deberán depositarse en los botes de basura para que no permanezcan el tiempo necesario en las mesas de trabajo. 8. Las mesas antes y después de la práctica deberán limpiarse con solución de fenol al 5% 9. Al derramar material probablemente contaminado se debe verter benzal sobre la zona dejándolo actuar aproximadamente 10 min antes de limpiar. 10. El material que se rompa o extravíe deberá ser repuesto máximo a la siguiente práctica. 11. Incubar el material que aplique el tiempo indicado ya que posterior a este tiempo será desechado. 12. Almacenar solo el material indicado en el refrigerador. 13. Al finalizar cada práctica, guardar los materiales separando el material sucio para esterilizar, quitando etiquetas, colocando el material a lavar en otro sitio; los reactivos deberán ser colocados y ordenados de manera adecuada. 14. No dejar bancos en zonas que provoquen accidentes. 15. Los informes de las prácticas serán terminados en borrador inmediatamente después de las mismas siendo revisadas por el profesor. 16. Colocar los microscopios limpios (sobre todo la lente de inmersión) en el lugar que le corresponde

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UNIDAD I ASPECTOS ADMINISTRATIVOS Y LEGISLATIVOS RELACIONADOS CON EL LABORATORIO CLÍNICO PRÁCTICA NO. 1 “MEDIDAS DE SEGURIDAD Y MANEJO DE RPBI” OBJETIVO:  Que el alumno ponga en práctica las principales medidas de seguridad que se requieren en un laboratorio de bacteriología así como el manejo adecuado de los residuos biológicos infecciosos, de acuerdo a la normatividad vigente, desarrollando actitudes de compromiso con la preservación de la salud y del medio ambiente.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-007-SSA3-2011, PARA LA ORGANIZACIÓN Y FUNCIONAMIENTO DE LOS LABORATORIOS CLÍNICOS 1. ¿Qué es el índice de superficie libre de trabajador y en qué numeral se menciona? R= Es la superficie libre por trabajador, para que pueda realizar su trabajo. Debe de ser de dos metros cuadrados. Numeral: 8.1 2. Numeral que indica el área para el depósito y almacenamiento de RPBI. R= Numeral: 5.2.7 3. ¿Con qué documentos debe contar el laboratorio y en qué numeral se encuentra?  Avisos de funcionamiento y aviso de responsable sanitario  numeral: 4.1  Si se utiliza fuentes de radiación ionizante deberá contar con una licencia sanitaria, y permiso de responsable sanitario y de la operación y funcionamiento de establecimientos de diagnóstico médico con rayos X  numeral: 4.2  Registro cronológico de los estudios de laboratorio realizados numeral: 4.7  Además de otros numerales que hacen mención de dichos documentos con los que debe de contar el laboratorio: numerales: 5.5 (manuales P á g i n a 3 | 73

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de organización, manejo de equipo, de seguridad e higiene, para RPBI, para toma, identificación, manejo, conservación y transporte de muestras. 4. Numeral que se refiere a la subcontratación. R= Numeral: 6.1 5. Numerales que indican los requisitos para el laboratorio de microbiología. R= Apéndice 2. 6. ¿A quiénes aplica la presente norma? R= 1.2 A los laboratorios clínicos, así como a los profesionales que laboran en ellos. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIÓN AMBIENTAL - SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICOINFECCIOSOS - CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO 1. En el numeral 6.4 inciso c) ¿nos indica que los recipientes de RPBI se pueden reciclar? R= No, por contener RPBI. 2. Define agente biológico infeccioso y menciona el numeral. R= Cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando está presente en concentraciones suficientes (inóculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una vía de entrada  numeral: 3.1 3. ¿A qué porcentaje de llenado se deben utilizar las bolsas de RPBI? Y ¿a qué porcentaje los envases? R= Al 80 % ambos. 4. De acuerdo a la tabla 2 del numeral 6 ¿Qué tipo de envasado utilizaremos en el laboratorio de bacteriología? R= Bolsas de polietileno, recipientes herméticos. P á g i n a 4 | 73

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5. La facultad deberá contar con un programa de contingencias en caso de derrames, fugas o accidentes, con el manejo de RPBI o queda excenta? R= Sí debe contar con dicho programa, ya que de acuerdo al numeral 6.7 somos establecimiento generador de RPBI. 6. Menciona la clasificación de los RPBI.  Sangre y sus derivados.  Cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos.  Utensilios desechables usados para el manejo de agentes biológicoinfecciosos.  Tejidos, órganos y partes que se extirpen durante cirugías o necropsias.  Para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico.  Cadáveres y partes de animales.  Recipientes desechables que contengan sangre líquida.  Materiales de curación.  Materiales que contengan esputos.  Materiales absorbentes.  Objetos punzocortantes. OBSERVACIONES:  Si se quisiera abrir un laboratorio de Bacteriología en la facultad, el responsable inmediato sería la Secretaría de Salud Estatal.  El manejo de RPBI implica consideraciones donde se establece la seguridad de la persona que los maneje, así como el correcto uso de estos hasta que lleguen a su destino final de eliminación.  Las presentes normas nos ayudan a saber el reglamento general de los establecimientos del sector salud, como lo son los laboratorios clínicos, en los cuales puede que en un futuro entremos a laborar. CONCLUSIONES:  Se cumplió con el objetivo de la práctica porque se revisaron las normas que rigen de forma general a los laboratorios clínicos, así como, a los profesionales que trabajan en ellos. Además, es importante conocer la normatividad vigente, puesto que se va actualizando poco a poco.

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 El manejo de RPBI en la práctica, como nos percatamos, es de suma importancia; debido a que, algunas veces olvidamos como depositar o en qué recipiente va cada tipo de muestra utilizada y los objetos con los cuales las manipulamos. BIBLIOGRAFÍA: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-007-SSA3-2011, PARA LA ORGANIZACIÓN Y FUNCIONAMIENTO DE LOS LABORATORIOS CLÍNICOS. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIÓN AMBIENTAL - SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS - CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO.

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UNIDAD II ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA DE LAS BACTERIAS OBJETIVO:  Que el alumno adquiera habilidad en la realización de los principales métodos de tinción y preparación de medios de cultivo que se utilizan para identificar la morfología y fisiología de las bacterias. INTRODUCCIÓN: Las cubiertas que rodean la célula bacteriana se han identificado por medio de técnicas de tinción en microscopía óptica y electrónica, y técnicas de aislamiento y caracterización bioquímica de los componentes celulares. Las principales cubiertas son: cápsulas y limos, la pared celular de las bacterias Gram-positivas, la pared celular de las bacterias Gram-negativas, la membrana plasmática, los mesosomas (invaginación de la membrana plasmática). Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared celular de peptidoglicanos que les confieren su forma característica y les provee de protección mecánica. La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tinción de Gram (1884). La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas, Figura 1) por esta coloración es un criterio de clasificación importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables. Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la reducción del tamaño de los poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extracción por el solvente del complejo. Avala lo antedicho el hecho que, si después de su tinción se tratan con lisozima bacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teñidos, pero pierden el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide la extracción del colorante. Corroborando esta suposición se observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta "inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere su estructura final pasa a ser Gram positiva. P á g i n a 7 | 73

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Figura 1. Pared celular bacteriana (Gram negativa y Gram positiva). PRÁCTICA No. 2 “TINCIONES DE GRAM Y ZIEHL-NEELSEN” OBJETIVOS:  Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram.  Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias.

FUNDAMENTO: Gram, bacteriólogo dinamarqués, descubrió en 1884, que algunos gérmenes (Gram positivos) contienen ciertos elementos químicos en gran cantidad, peptidoglicano, en su membrana dispuestos estructuralmente en forma muy diferente a la de otros (Gram negativos) y forman con los colorantes derivados de la rosanilina (violeta de genciana, cristal violeta) más el yodo, un compuesto que resiste la acción de decolorantes (alcohol absoluto, alcohol acetona). Está tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de Gram, etanol – acetona al 95% y safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial tiñe a todos los microorganismos, a que es un colorante básico, en segundo lugar está el yodo que actúa como mordiente para aumentar la afinidad entre el P á g i n a 8 | 73

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colorante inicial y la célula. El etanol actúa como decolorante sobre el microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se afín con este. La safranina es el colorante usado como contraste que teñirá a los microorganismos que no se colorean con el cristal violeta. Los microorganismos que retienen el colorante de cristal violeta después de la decoloración y se ven de color azul-violeta se conocen como microorganismos Grampositivos. Los Gramnegativos no son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración y se contra tiñen de rojo con el colorante de safranina.

Figura 2. Membrana de una Bacteria Gram positiva.

Figura 3. Membrana de una Bacteria Gram negativa.

TINCIÓN DE ZHIEL NEELSEN. La tinción de Ziehl-Neelsen demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teñidas de resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Esta propiedad de algunas micobacterias y actinomicetos se correlaciona con el alto contenido en lípidos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy hidrófobo. Además, estos grupos poseen unos lípidos característicos llamados ácidos micólicos que aumentan este carácter hidrófobo. MATERIAL: TINCIÓN DE GRAM        

Portaobjetos. Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Microscopio. Puente de tinción. Aceite de inmersión. Desinfectante. Solución salina.

    

Cristal violeta. Lugol de Gram. Alcohol-acetona. Safranina. Cepa: Staphylococcus aureus, muestra de exudado faríngeo. P á g i n a 9 | 73

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INTERPRETACIÓN Microorganismos color azul-violeta: Gram positivos. Microorganismos color rosado: Gram negativos. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN  Portaobjetos.  Asa bacteriológica.  Mechero Bunsen o lámpara de alcohol.  Microscopio.  Aceite de inmersión.  Puente de tinción.

     

Desinfectante. Solución salina. Fucsina fenicada. Alcohol-ácido. Azul de metileno. Muestra: Esputo de paciente.

INTERPRETACIÓN Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos Ácido Alcohol Resistentes). Esta tinción es utilizada principalmente para identificar el agente causal de la tuberculosis. La tinción Ziehl-Neelsen requiere cuatro colorantes: 1. 2. 3. 4.

Mezcla de fucsina-fenol: capaz de teñir las células en caliente. El fenol facilita la penetración de la fucsina en la envoltura celular. Decolorante orgánico: mezcla de ácido y alcohol. Colorante de contraste: azul de metileno.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes, tras la unión de la fucsina, resisten el tratamiento orgánico y se verán teñidas de rosa. El resto de las bacterias se decolorarán y se contrastarán con el azul de metileno. 1. Prepara un frotis con la muestra. 2. Cubrir completamente con carbolfucsina la preparación. 3. Calentar la preparación cuidadosamente en un mechero Bunsen (puede ser a baño maría, o bien en plancha electrica), sin que hierva la muestra durante 5 min. También puede utilizarse una parrilla electrica, o calentar en vapores de baño maría. Nota: añadir más carbolfucsina conforme ésta se evapora; la preparación no debe quedar seca en ningún momento.

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4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 5. Decolorar con la solución ácido-alcohol hasta que la muestra adopte un color rosa claro (unos 30 seg.). 6. Lavar con agua para detener la decoloración. 7. Teñir con azul de metileno 1 min. 8. Lavar con agua el exceso de colorante. 9. Secar la preparación. 10. Examinar al microscopio. Anotar las diferencias existentes entre los dos grupos bacterianos. TÉCNICA: TINCIÓN DE GRAM

1. Se toma una asada de la colonia, o una pequeña alícuota del cultivo líquido.

3. Dejar secar el frotis. Y fijarlo por calor.

5. Enjuagar al chorro de agua.

2. Se realiza una extensión en un portaobjetos limpio y desengrasado.

4. Colocar en una varilla de tinción; y agregar Cristal Violeta y dejar actuar por 1 a 2 minutos.

6. Agregar la solución de Yodo-Lugol. Y dejar actuar por 30 segundos.

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7. Enjuagar al chorro de agua. Decolorar con alcohol-cetona durante 30 segundos.

9. Enjuagar al chorro de agua.

11. Agregar una gota de aceite de inmersión.

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8. Agregar safranina y dejar por 30 segundos.

10. Dejar secar al aire libre, o colocar el frotis en un papel absorbente.

12. Observar al microscopio en objetivo de 100x.

RESULTADOS. Tinción de Gram.  Cepa: Staphylococcus aureus (paciente desconocido) = Gram positivos.  Muestra: exudado faríngeo (paciente Rafael Sánchez Barradas) = Sin presencia de bacterias de interés. Tinción de Ziehl-Neelsen.  Muestra: Esputo de paciente = No BAAR.

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OBSERVACIONES.

Paciente: Desconocido. Muestra: Del Lab. De Microbiología de la UV, Facultad de QFB Xalapa. Tinción: Gram. Visto a: 100 X. Bacteria: Staphylococcus aureus. Observaciones: micrococos gram positivos, agrupados y dispersos.

Paciente: Rafael Sánchez Barradas. Edad: 21 años. Sexo: Masculino. Muestra: Exudado faríngeo (frotis). Tinción:Gram. Visto a: 100 X. Observaciones: Restos de comida, células epiteliales y otras cosas desconocidas. Sin presencia de cocos, bacilos o bacterias de algún otro tipo.

Paciente: Job Dorantes Montoya. Edad: 21 años. Sexo: Masculino. Muestra: Esputo. Tinción: Ziehl-Neelsen. Visto a: 100 X. Observaciones: Céulas epiteliales, leucocitos polimorfonucleados y algunos cocos. No se observan bacilos ácido-alcohol resistentes.

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CONCLUSIÓN: Después de observar macroscópicamente la morfología colonial es muy importante realizar las tinciones como técnica de identificación y clasificación de las bacterias cuando no sabemos qué clase de microorganismo es el que estamos observando, esto en base a su morfología y a su diferenciación con otros agentes al momento de tomar un color específico, para luego comparar nuestras observaciones y la teoría para dar un diagnóstico acertado. BIBLIOGRAFÍA: Ingraham John, Ingraham Catherine. (1998). Introducción a la microbiología. Editorial Reverté. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica.

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PRÁCTICA NO. 3 “CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO” OBJETIVO: 

Identificar los medios de cultivo empleados en el laboratorio de Bacteriología y clasificarlos de acuerdo a su contenido y función.

FUNDAMENTO: Un medio de cultivo es una solución equilibrada de todos los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para el desarrollo y la multiplicación de los microorganismos en el laboratorio. Para promover el desarrollo microbiano, los medios de cultivo deben reunir ciertos requisitos: contener nutrientes adecuados, poseer humedad suficiente, tener un pH ajustado y estar estéril inicialmente. Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales:    

Medios enriquecidos no selectivos Medios selectivos Medios diferenciales Medios especializados

Medios enriquecidos no selectivos: están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de los gérmenes que no necesitan unas condiciones exigentes. Los siguientes medios son algunos de los más empelados: agar sangre, agar chocolate, agar Mueller-Hinton, medio de tioglicolato y agar dextrosaSabouraud. Medios de cultivo selectivos y diferenciales: los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar gérmenes específicos que pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej., un patógeno entérico en las heces). Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados. Estos medios se hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la identificación del germen en una mezcla. Ejemplos: agar MacConkey, agar sal y manitol, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), medio de Lowenstein-Jensen (LJ), CHROMagar, etc. Medios especializados: se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar gérmenes específicos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros. Ejemplos: agar sitinatelurita, medio de cultivo LIM (lisina-indol-movilidad), etc. P á g i n a 15 | 73

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Ejemplos de tipos de medios de cultivo Tipo

Medios de cultivo (ejemplos) Agar sangre

Agar chocolate

No selectivos

Agar de Mueller-Hinton

Tioglicolato Agar dextrosaSabouraud

Agar MacConkey

Agar sal y manitol

Selectivos, diferenciales

Agar xilosa-lisinadesoxicolato Medio de LowensteinJensen Agar Middlebrook CHROMagar

Especializados

Agar de levaduras inhibidor Agar extracto de levadura con carbón tamponado (BCYE) Agar cistina-telurita

Objetivo Recuperación de bacterias y hongos. Recuperación de bacterias, incluidas Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus. Medio de estudio para la susceptibilidad bacteriana. Medio de enriquecimiento para las bacterias anaerobias. Recuperación de hongos. Selectivo para las bacterias gramnegativas; diferencial para las especies que fermentan la lactosa. Selectiva para los estafilococos; diferencial para S. aureus. Agar diferencial selectivo para Salmonella y Shigella en cultivos entéricos. Selectivo de micobacterias. Selectivo de micobacterias. Selectivo, diferencial para las levaduras. Selectivo para los hongos. Recuperación de Legionella y Nocardia. Recuperación de P á g i n a 16 | 73

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Corynebacterium diphtheriae. Recuperación de Medio de cultivo LIM Streptococcus (lisina-indol-movilidad) agalactiae. Recuperación de Agar sorbitol MacConkey Escherichia coli O157. Recuperación de Agar Regan Lowe Bordetella pertussis. Agar sacarosa sales Recuperación de biliares tiosulfato citrato especies de Vibrio. (TCBS) MATERIAL:         

Matraces Erlenmeyer de 500 mL. Probeta graduada de 250 mL. Cajas Petri. Tubos c/ tapón de rosca de 13 x 100. Parrilla de calentamiento. Gasa. Algodón. Mechero Bunsen. Espátula limpia.

TÉCNICA: 

Preparar los siguientes medios: EMB, AGAR SANGRE, AGAR CHOCOLATE, AGAR SAL Y MANITOL, CALDO TODD HEWITT y AGAR BIGGY aproximadamente 90 ml del caldo y 400 ml de cada agar. 1. Consultar las indicaciones del fabricante del medio de cultivo a preparar para conocer las condiciones en las que se elaborara el medio. 2. Pesar exactamente la cantidad del medio de cultivo calculada por regla de tres en relación con la especificada en el envase, para un litro. El medio deshidratado se debe pesar en papel aluminio o cera, limpio. 3. Al medio de cultivo pesado se le añade aproximadamente la mitad del agua destilada en el matraz, se agita lo suficiente tratando de hacer una suspensión homogénea, se deja reposar unos minutos y después se le adiciona el resto del agua arrastrando el medio que pudo quedar pegado en las paredes del matraz. P á g i n a 17 | 73

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4. El medio de cultivo se debe calentar para disolverlo. El medio estará listo cuando al agitar el recipiente no se adhieran a las paredes internas, partículas del agar. Se hierve durante un minuto. Los medios de cultivo que no contienen agar son fáciles de disolver en el agua fría o con un ligero calentamiento. 5. Para esterilizar, se coloca un tapón con algodón y gasa para que no entren partículas al medio de cultivo. 6. La esterilización del medio de cultivo se lleva a cabo en autoclave, a 121 °C durante 15 minutos. Se recomienda repartir el medio en porciones más pequeñas por ejemplo, en los tubos donde va a quedar definitivamente, NO ESTERILIZAR EN LAS CAJAS PETRI. 7. El vertido en placas se debe hacer, cuando el medio se encuentre a una temperatura de 45 o 50 °C, en un ambiente estéril, evitando la formación de burbujas, si esto ocurre al terminar el vaciado se pasa el mechero rápidamente por la caja con el medio. El volumen que se le agrega a la caja es de unos 15 o 20 ml. En los tubos dependiendo del tamaño se adicionara aproximadamente la mitad del tubo cuando son agares, y para el medio de cultivo líquido (caldos) se le agregara a cada tubo de 2 a 3 ml. 8. Cuando el medio de cultivo este solidificado o frío se empaquetaran y se rotularán con el nombre del medio, fecha de preparación, numero de equipo que lo elaboró y se guardarán en el refrigerador en forma invertida. RESULTADOS: Se realizaron los cálculos para saber cuánto se disolvería del medio de cultivo en agua destilada, tanto para las cajas Petri como para los tubos: AGAR SANGRE: 40 g – 1000 mL X – 400 mL

𝑥=

(40 𝑔)(400 𝑚𝐿) = 𝟏𝟔 𝒈 1000 𝑚𝐿

AGAR SAL Y MANITOL 111 g – 1000 mL X – 400 mL

𝑥=

(111 𝑔)(400 𝑚𝐿) = 𝟒𝟒. 𝟒 𝒈 1000 𝑚𝐿

AGAR Eosina Azul de Metileno (EMB) 36 g – 1000 mL X – 400 mL

𝑥=

(36 𝑔)(400 𝑚𝐿) = 𝟏𝟒. 𝟒 𝒈 1000 𝑚𝐿 P á g i n a 18 | 73

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AGAR BIGGY 45 g – 1000 mL X – 400 mL

𝑥=

(45 𝑔)(400 𝑚𝐿) = 𝟏𝟖 𝒈 1000 𝑚𝐿

𝑥=

(30 𝑔)(90 𝑚𝐿) = 𝟐. 𝟕 𝒈 1000 𝑚𝐿

CALDO TODD HEWITT 30 g – 1000 mL X – 400 mL

A nuestra mesa de trabajo nos tocó realizar el agar sangre el cual contiene: Infusión de músculo de corazón 2.0 g Digerido pancreático de caseína 13.0 g Extracto de levadura 5.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Agar bacteriológico 15.0 g pH final 7.3 ± 0.2 Método de preparación: suspender 40 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa disolución del polvo y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 lb de presión) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50°C y añadir sangre estéril y desfibrinada al 5%. Homogeneizar y vaciar en placas Petri estériles. OBSERVACIONES:

Se observa el medio de cultivo en calentamiento sin la sangre y con constante movimiento, ya que si no, se podría quemar y el medio ya no serviría para sembrar microorganismos.

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En lo que se procedía a esterilizar los medios de cultivo, se realizó la técnica de flebotomía para obtener la sangre que se agregaría al agar chocolate y al agar sangre. Se obtuvieron aproximadamente 10 mL para agregar a cada agar.

Al terminar de esterilizar y agregar la sangre al medio de cultivo, se procedió a vaciar el medio en las cajas Petri en un ambiente anaerobio, es decir, cerca del mechero Bunsen y posteriormente se empaquetaron y guardaron las cajas con el medio ya solidificado.

CONCLUSIÓN: La preparación de medios del cultivo es una herramienta fundamental en el laboratorio de Bacteriología porque nos ayuda a identificar, aislar y dar un posible diagnóstico sobre enfermedades producidas por microrganismos como bacterias principalmente y hongos. Debe mencionarse que se necesita saber de otros conocimientos adquiridos en otras experiencias educativas, por ejemplo, la flebotomía, ya que para realizar la preparación del agar sangre y chocolate se necesita sangre. BIBLIOGRAFÍA: Murray, P. (2009). Microbiología Médica. Capítulo 15. Cultivo in vitro: principios y aplicaciones. 6ª edición. ELSEVIER. España. Pp: 161-164. Negroni, M. (2009). Microbiología estomatológica. Fundamentos y guía práctica. 2ª edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina. Pág. 551.

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UNIDAD III INFECCIONES DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS SUPERIORES PRÁCTICA No. 4 “CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO” OBJETIVO: 

Analizar la flora normal y los principales patógenos del tracto respiratorio superior a partir de una muestra de exudado faríngeo.

FUNDAMENTO: El análisis del exudado faríngeo se basa en la diferenciación entre las bacterias patógenas y flora normal del tracto respiratorio superior del paciente, apoyándose en medios de cultivo selectivos y de enriquecimiento, así como el análisis microscópico y macroscópico de las colonias bacterianas. El cultivo faríngeo es el método estándar para documentar la presencia de S. pyogenes en la faringe, esta prueba alcanza una sensibilidad del 90 a 95%. Flora habitual y patógenos respiratorios Posibles patógenos Flora normal Patógenos definitivos respiratorios Estreptococos betahemolíticos Corynebacterium Estreptococos del Haemophilus influenzae diphtheriae grupo viridans Haemophilus Bordetella pertussis Estafilococos parainfluenzae Micrococos Mycoplasma coagulasa negativo Streptococcus pneumoniae Corynebacterium sp. pneumoniae Streptococcus pyogenes Neisseria sp. (no Neiserias patógenas patógenas) Estreptococos beta Moraxella catarrhalis Lactobacillus sp. hemolíticos grupos Enterobacterias Veillonella sp. B,C,G, Fusobacterium sp. Neisseria gonorrhoeae Espiroquetas Bacteroides sp. Actinomyces sp. MATERIAL:  Hisopos estériles.  Frasco con benzal.  Colorantes para la tinción de Gram.  Aceite para inmersión.  Microscopio.

   

Portaobjetos. Cajas Petri Agares: chocolate, sangre, EMB y sal y manitol. Caldo de Todd-Hewitt P á g i n a 21 | 73

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Equipo 1-B

TÉCNICA: Obtención de la muestra: exudado faríngeo Condiciones previas del paciente  El paciente no debe haber recibido antibióticos en los últimos 8 días, previos a la obtención de la muestra.  El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio.  Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo. 1. Ubicar al paciente en una posición cómoda y con buena iluminación, deprimir la lengua con el abate lengua, visualizar la fosa amigdalina y faringe en busca de exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas. 2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo “ah”, el cual sirve para elevar la úvula y evitar las náuseas. 3. Introducir el hisopo y frotar enérgicamente ambas amígdalas y la pared posterior de la faringe con movimientos de barrido. 4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, úvula, lengua, encías y dientes. 5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la superficie de los portaobjetos para realizar la tinción de Gram. 6. Estriar sobre los medios de cultivo. 7. Incubar las cajas Petri a 37°C RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Agar chocolate: Streptococcus pyogenes Forma: irregular Color: gris Borde: entero Viraje: sin viraje Prueba oxidasa: NEGATIVO

Agar chocolate: MUESTRA Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero Viraje: color verde Prueba oxidasa: NEGATIVO P á g i n a 22 | 73

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Agar EMB: Klebsiella spp. No hubo crecimiento

Agar sangre: Estreptococo grupo C Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero y ondulado Viraje: sin viraje Prueba oxidasa: NEGATIVO

Equipo 1-B

Agar EMB: MUESTRA No hubo crecimiento

Agar sangre: MUESTRA Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero y ondulado Viraje: sin viraje Prueba oxidasa: NEGATIVO

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Agar sal y manitol: Staphyloccocus Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero Viraje: color amarillo Prueba oxidasa: NEGATIVO

Equipo 1-B

Agar sal y manitol: MUESTRA Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero Viraje: color amarillo Prueba oxidasa: NEGATIVO

Tinción de Gram

Se observaron células epiteliales y cúmulos de alguna sustancia extraña que podría ser colorante, también se observaron bacterias pero no se distinguían bien por las lentes del microscopio y no se sabe si son cocos o bacilos, posiblemente son bacterias Gram negativas.

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Equipo 1-B

CONCLUSIÓN: En base a la observación de la morfología macroscópica de los medios de cultivo, como el viraje, borde y color de las colonias, hubo presencia de Streptococcus tipo C, ya que hubo crecimiento bacteriano en el agar sangre, chocolate y sal y manitol. Al realizar el frotis, no se pudo observar los cocos porque la calidad de la imagen fue pésima y no se veía con claridad. BIBLIOGRAFÍA: Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramírez, AC, Sánchez K, Velasco E. (2008). Manual práctico de bacteriología clínica. Universidad de Los Andes. 1ª edición. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 31-46. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiología médica. Texto Atlas Color. 4ª ed. España: Mosby Elsevier Science; 2002.

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Equipo 1-B

PRÁCTICA No. 5 “DETECCIÓN DIRECTA DE ANTÍGENOS MICROBIANOS. ANTIESTREPTOLISINA O” OBJETIVO:  Que el alumno lleve a cabo el método para identificar anticuerpos contra estreptolisina O, una sustancia producida por las bacterias estreptococos del grupo A. FUNDAMENTO: Las enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas definitivamente solo por tres formas: 1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente conocido capaz de provocar la enfermedad, por observación directa en el material clínico obtenido del paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro) 2) Detección de un producto específico del agente infeccioso (que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el material clínico obtenido del paciente 3) Detección en el suero del paciente de una respuesta inmunológica específica dirigida contra el agente infeccioso. Características de los Anticuerpos:  Mecanismo determinado genéticamente.  Dirigidos contra un antígeno o determinante antigénico (epítope).  Los microorganismos pueden contener numerosos determinantes antigénicos.  Habrá por lo tanto numerosos anticuerpos para cada antígeno.  Muchos determinantes antigénicos requieren ser expuestos. Reacciones de Aglutinación. Cuando el antígeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el complejo antígeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinación. El proceso tiene dos fases: unión reversible y aglutinación por formación de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antígenos. Los anticuerpos IgM son más eficaces para aglutinar (Anticuerpos completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos (Anticuerpos incompletos).

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Dan fenómeno de prozona (aglutinación aparente por exceso de antígeno o anticuerpo sin aglutinación. Factores que influyen en las reacciones de aglutinación:     

Carga de las partículas. Tipo de anticuerpo. Concentración de electrolitos. Viscosidad. Número de determinantes antigénicos.

Se emplean tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos. Se pueden hacer de dos maneras: directas o indirectas El método se fundamenta en una reacción de aglutinación de una suspensión de partículas de látex poliestireno sensibilizadas con estreptolisina O estabilizada. La aglutinación es visible en una concentración de ASO en suero igual o superior a 200 UI/mL. MATERIAL. Reactivos. Reactivo 1 Tapón blanco Reactivo 2 Tapón rojo Reactivo 3 Tapón azul

Látex ASO en suspensión Contiene azida sódica 0.1 % Control positivo*. Concentración superior a 200 UI/mL Suero humano. Contiene azida sódica 0.1 % Control negativo*. Concentración inferior a 200 UI/mL Suero humano. Contiene azida sódica 0.1 %

* Los controles son sueros humanos. Aunque no se ha detectado la presencia de antígeno HBs, ni anticuerpos anti-HIV, deben ser manipulados con la misma precaución que un suero muestra.

Muestra.  Utilizar suero. Los sueros, conservados a 2-8°C, mantienen su actividad durante 2 días.  No utilizar sueros hemolizados. No utilizar sueros altamente lipémicos pues podrían dar una aglutinación no específica. P á g i n a 27 | 73

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TÉCNICA: Método cualitativo 1. Atemperar el reactivo y los controles a temperatura ambiente. 2. Homogeneizar el reactivo 1 ASO-látex, con agitación suave. 3. Comprobar la funcionalidad del reactivo mediante los controles positivo y negativo (ver procedimiento a continuación). 4. Dosificar 50 mL (1 gota) de suero muestra a analizar en un círculo del porta, SIN DILUIR. 5. Añadir, aliado de la anterior, una gota de R1 ASO-látex 6. Mezclar las dos gotas mediante agitación y extenderlas por todo el círculo. 7. Colocar el porta en el agitador rotatorio (80-100 RPM) Y observar la aparición o ausencia de aglutinación exactamente al cabo de 2 minutos. El exceso del tiempo de reacción podría dar lugar a falsos resultados. Método semicuantitativo Siguiendo la metódica cualitativa, se procederá con diluciones del suero muestra con solución salina (NaCI 9 g/L).

INTERPRETACIÓN  

La presencia de aglutinación indica un nivel de ASO igual o superior a 200 UI/mL en la muestra. La ausencia de aglutinación indica un nivel de ASO inferior a 200 UI/mL en la muestra.

Valores normales. Adultos: < 200 UI/mL. Los valores superiores a 200 UI/mL se encuentran en pacientes con recientes enfermedades debidas a Streptococcus del grupo A, β-hemolíticos. P á g i n a 28 | 73

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RESULTADOS:    

Prueba Antiestreptolisina O (test de aglutinación): Negativa. Paciente: Ivonne Díaz Sosa. Sexo: Femenino. Edad: 20 años.

OBSERVACIONES:

Extracción de sangre de la paciente, para la posterior obtención del suero a utilizar en esta práctica.

Se muestra el suero y a los demás controles, observando que el positivo dio como se esperaba (hubo aglutinación). Estos son los reactivos utilizados del kit (inserto) para realizar la prueba de detección de antígenos.

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Se muestra el suero de la paciente. Esto cuando se estaban aplicando los reactivos del inserto. Al finalizar de aplicar los reactivos a los tres grupos (positivo, negativo y suero), obtuvimos un resultado sin aglutinación, indicando que el paciente no tiene valores altos de antiestreptolisina O.

CONCLUSIÓN. Los estudios microbiológicos y/o bacteriológicos de laboratorio son muy importantes para llegar a un diagnóstico y tratamiento adecuado a una enfermedad específica. En este caso el método utilizado de detección de antígenos microbianos, ayuda al médico a dar un medicamento específico de acuerdo al agente patógeno que está causando la enfermedad en el paciente, puesto que, de alguna manera el anticuerpo ASO (por sus siglas en inglés) se puede encontrar en la sangre durante semanas o meses después de que la infección por estreptococos haya desaparecido. Nuestro resultado fue negativo, siendo así que la paciente no presenta alguna infección por estreptococos reciente. BIBLIOGRAFÍA. Assimeh, S.N., Johnson, P.M. J. (1980). lmmunnol. Methods. EUA: Academic Press. Pp. 1970-1973. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica.

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PRÁCTICA NO. 6 “CULTIVO DE EXUDADO ÓTICO” OBJETIVO: 

Realizar el estudio microbiológico de la flora normal y los principales patógenos del oído medio a partir de una muestra de exudado ótico.

FUNDAMENTO: La mayor parte de las infecciones del oído afectan el conducto auditivo externo (otitis externa) o la cavidad media (otitis media) que contiene los huecesillos y está rodeada por otras estructuras óseas y la membrana timpánica. La otitis es una enfermedad del oído caracterizada por inflamación de la mucosa del oído externo, medio o interno (mastoides), perforación de la membrana timpánica y otorrea. La microbiota general del oído externo es similar a la de la piel, predominando Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del género Corynebacterium. Con menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y Neisseria. En esta localización se han aislado también otros microorganismos que colonizan la piel en forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P. aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre ellos, los géneros Proteus, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella. Estudios micológicos demuestran que los siguientes géneros de hongos pertenecen a la microbiota normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y Saccharomyces. Algunos de los agentes etiológicos más frecuentes de infecciones óticas se muestran en la tabla que se muestra a continuación: Agentes etiológicos más frecuentes de otitis Cuadro clínico Agente etiológico  Pseudomonas aeruginosa.  Proteus.  E. coli. Otitis externa  S. aureus.  Aspergillus.  Streptococcus pneumoniae. Otitis media aguda  Estreptococos del grupo “B”.  Haemophilus influenzae. < 3 meses de edad  S. aureus.  P. aeruginosa P á g i n a 31 | 73

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 Bacterias entéricas gramnegativas.

> 3 meses de edad

Otitis media crónica

Otitis media serosa

           

Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenzae. Streptococcus pyogenes. Moraxella catarrhalis. S. aureus. P. aeruginosa. Haemophilus influenzae. S. aureus. Proteus. K. pneumoniae. Moraxella catarrhalis. Bacterias anaerobias grampositivas y gramnegativas. Igual que la otitis media crónica.

MATERIALES:      

Hisopos estériles. Benzal diluido 10% Solución salina fisiológica estéril. Medios de cultivo: agar sangre, agar EMB, agar Vogel-Johnson, agar CLED. Gasas. Colorantes para tinción de Gram.

TÉCNICA: 1. Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo impregnado con solución de benzal con una gasa. 2. Humedecer varios hisopos estériles con solución salina igualmente estéril y tomar la muestra del conducto auditivo externo de cada oído. 3. Introducir el hisopo siguiendo una dirección oblicua de atrás hacia delante y de abajo hacia arriba. 4. Girar el hisopo con cautela unas cinco veces para obtener la muestra. 5. Realizar un examen directo y colorearlo con la tinción de Gram con muestra proveniente de cada oído, los hisopos se descartan una vez utilizados.

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RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Se observa una célula epitelial proveniente del frotis ótico, al realizar la tinción de Gram, no se observaron bacterias.

Agar EMB: MUESTRA No hubo crecimiento.

Agar EMB: E. coli Forma: puntiforme Color: violeta Borde: entero Viraje: verde metálico.

Agar sangre: Muestra Forma: puntiforme Color: gris Borde: entero Viraje: café

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Agar Vogel Johnson: Muestra Forma: puntiforme Color: blanco Borde: entero Viraje: rosa El medio se contaminó, ya que el control – también se contaminó.

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Agar sangre: Streptoccocus tipo C Forma: puntiforme Color: gris Borde: entero Viraje: café

Agar CLED: Proteus vulgaris Forma: puntiforme Color: amarillo Borde: entero Viraje: amarillo

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CONCLUSIÓN: Se realizó la siembra de la muestra del exudado ótico y no hubo crecimiento por lo cual, el paciente se encuentra sano. Se cumplió con el objetivo de realizar la toma de muestra del exudado ótico, aunque no hubo crecimiento bacteriano, además es importante conocer la metodología que se realiza para conocer los posibles agentes infecciosos en el oído para diagnosticar e iniciar un tratamiento lo antes posible. BIBLIOGRAFIA: Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramírez, AC, Sánchez K, Velasco E. (2008). Manual práctico de bacteriología clínica. Universidad de Los Andes. 1ª edición. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 65-77. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiología médica. 4ª ed. España: Mosby; 2004. Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiología. 4ª ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.

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UNIDAD IV INFECCIONES DEL OJO PRÁCTICA NO. 7 “CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL” OBJETIVO: 

Realizar el estudio microbiológico de la flora normal y los principales patógenos de la conjuntiva del ojo de una muestra de exudado conjuntival.

FUNDAMENTO: En el saco conjuntival existe una microbiota habitual relativamente escasa. Entre los microorganismos que se encuentran con mayor frecuencia se citan: Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus sp. y Corynebacterium sp. Entre 0-30% de las personas son portadores de S. aureus y Haemophilus influenzae no tipificables en 0,4-25%. En un pequeño porcentaje de individuos se presentan Moraxella catarrhalis, algunas Enterobacterias, S. pyogenes, S. pneumoniae, otros alfa y beta-hemolíticos. La conjuntivitis es una de las causas más frecuentes de enfermedad ocular. Se define como un estado inflamatorio de la conjuntiva, con hiperemia conjuntival (dilatación de los vasos sanguíneos) o con hemorragia subconjuntival. La conjuntivitis aguda es la presentación clínica más común, según su etiología se clasifica en: 







Conjuntivitis no gonocócica: ocasionada frecuentemente por S. aureus, S. pneumoniae y H. influenzae biogrupo aegyptius, Moraxella lacunata; éstos se adquieren por inoculación mano-ojo y por fómites. Conjuntivitis gonocócica: producida por N. gonorrhoeae, afecta principalmente a los adultos que se contagian por un contacto sexual con sujetos con gonorrea o por autoinoculación (genital-mano-ojo). Conjuntivitis de inclusión: causada por Chlamydia trachomatis serotipos D hasta la K, se produce en los adultos (por autoinoculación) y en los neonatos (durante el paso por el canal de parto infectado). Conjuntivitis alérgica: producida por una reacción de hipersensibilidad tipo I o anafiláctica frente a determinados antígenos, como pólenes que son transportados por el aire. Otras enfermedades comunes del ojo son:

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

Queratitis: es la inflamación de la córnea producto de la aplicación de medidas quirúrgicas con fines curativos o correctivos y del uso indiscriminado de ciertos medicamentos tipo corticoesteroides o antibióticos, así mismo están implicados en un 60-90% las infecciones bacterianas producidas por: Pseudomonas aeruginosa, S. aureus o Streptococcus del grupo viridans, también levaduras como Candida albicans.



Blefaritis: es una inflamación del borde palpebral con hiperemia, engrosamiento y formación de escamas o costras o úlceras superficiales. Las de origen infeccioso son producidas principalmente por S. aureus. La blefaritis crónica es causada por Demodex folliculorum, especies de Corynebacterium y Staphylococcus sp.



Orzuelo: induración redondeada y dolorosa localizada en el folículo de la pestaña o en una o más glándulas de Zeis, Moll o de Meibomio. El microorganismo implicado generalmente es S. aureus.

MATERIALES:     

Hisopos estériles o asa bacteriológica nueva. Solución salina fisiológica estéril. Medios de cultivo: agar Vogel-Johnson y agar CLED. Gasas. Colorantes para tinción de Gram.

TÉCNICA: Condiciones previas del paciente  No aplicarse tratamientos tópicos.  No estar recibiendo tratamientos antimicrobianos.  No lavarse los ojos para el momento de la obtención de la muestra. En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendrá del ángulo interno del ojo. 1. Con el asa o hisopo rotar suavemente en el ángulo interno del ojo unas 5 veces. 2. Cultivar el exudado de cada ojo por separado en una misma placa. 3. Incubar a 36 °C, por 24 h hasta 72 h. 4. Obtener muestras de cada ojo para realizar los preparados directos en láminas para teñir con Gram y Giemsa. P á g i n a 37 | 73

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RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Agar Vogel Johnson: muestra Forma: circular y puntiforme Color: amarillo Borde: entero Viraje: rosa El medio se contaminó, ya que el control – también se contaminó.

Agar CLED: muestra Forma: puntiforme Color: amarillo Borde: entero Viraje: ligeramente amarillo

Agar CLED: control Forma: puntiforme Color: gris y amarillo Borde: entero Viraje: ligeramente amarillo Este medio está muy enriquecido y es muy fácil de que se contamine si no se le da un manejo apropiado.

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CONCLUSIÓN: Se realizó la siembra de la muestra del exudado conjuntival y no hubo crecimiento de patógenos, por lo cual, el paciente se encuentra sano. Aunque los medios se contaminaron de algún microorganismo ajeno a los cultivos, dándonos colonias amarillas bien definidas. Se cumplió con el objetivo de realizar la toma de muestra de exudado conjuntival, aunque no hubo crecimiento bacteriano, además es importante conocer la metodología que se realiza para conocer los posibles agentes infecciosos en la conjuntiva para diagnosticar e iniciar un tratamiento lo antes posible. BIBLIOGRAFIA: Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramírez, AC, Sánchez K, Velasco E. (2008). Manual práctico de bacteriología clínica. Universidad de Los Andes. 1ª edición. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 79-89. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiología médica. 4ª ed. España: Mosby; 2004. Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiología. 4ª ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.

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PRÁCTICA NO. 8 “DETERMINACIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS POR INMUNOENSAYO” OBJETIVO:  Que el alumno determine de forma cualitativa Chlamydia trachomatis por el método de inmunoensayo. FUNDAMENTO: El examen está basado en la investigación de Chlamydia trachomatis como agente patógeno en el raspado conjuntival por lo que se emplea inmunofluorescencia directa y tinción de Giemsa. Las clamydias son bacterias INTRACELULARES OBLIGADAS que se diferencian de otras bacterias por su morfología y por presentar un ciclo de desarrollo único durante el cual se pueden observar dos formas, una adaptada a vivir extracelularmente llamada CUERPO ELEMENTAL que mide entre 200 y 400 nm de diámetro, es inefectivo, es antigénico, resistente a la tripsina y la otra es llamada CUERPO RETICULAR o CUERPO DE INFUSIÓN, que mide entre 600 y 1500 nm de diámetro no es inefectivo, es lisado por la tripsina y no es letal para el ratón. El género chlamydia está constituido por tres especies: C. trachomatis, C. Psittaci y C. Pneumoniae que pueden diferenciarse en base a su susceptibilidad a las sulfonamidas a la morfología de los cuerpos elementales y de los cuerpos reticulares, a la presencia de glucógeno en las inclusiones, al huésped que infectan, a la homología de su DNA y a la presencia de DNA plasmídico. C. trachomatis es un patógeno exclusivo del hombre, se han descritos tres biovares con 15 serovares, que están relacionados como enfermedades en el humano. El biovar linfogranuloma venereum es el agente de linfogranuloma venéreo que es una enfermedad que se transmite por contacto sexual y se caracteriza por presentar una inflamación granulomatosa de los cambios linfáticos en las regiones inguinal y rectal. MATERIAL: Materiales proveídos.  Dispositivo de prueba empacado en una bolsa sellada.  Reactivo de extracción A (ácido) y B (alcalino).  Manual de instrucción. P á g i n a 40 | 73

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Materiales requeridos pero no provistos.  Contador de tiempo.  Papel de prueba pH.  Suero de paciente.  Torundas.  Jeringa de 5 mL. TÉCNICA: DEMOSTRACIÓN DE Chamydia trachomatis POR TINCIÓN DE GIEMSA a. Fijar un frotis con metanol durante 5 minutos. b. Cubrir la preparación con el colorante de Giemsa y dejarlo actuar durante 60 minutos. c. Lavar d. Decolorar con etanol al 95%. e. Dejar secar. f. Observar al microscopio. INTERPRETACIÓN La presencia de inclusiones intracelulares en las células epiteliales, preferentemente cerca del núcleo, hace sospechar C. trachomatis. Nota: No se llevó a cabo la tinción de Giemsa, para la demostración de Chlamydia trachomatis.

Grupo MexLab Chlamydia Test Prueba rápida Procedimiento de extracción. 1. Agregue 9 gotas de reactivo A en un tubo limpio. 2. Inserte el hisopo que contenga la muestra dentro del tubo y talle el hisopo 10 veces. 3. Espere 2 minutos y talle el hisopo 10 tiempos. Se requiere un tiempo mayor si las muestras son muy pegajosas.

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4. Con el hisopo pegado a un lado, agregue 9 gotas de reactivo B al tubo y talle el hisopo 10 veces. Si la textura es viscosa, agregue otra gota de A para cambiarlo a claro. 5. Exprima el líquido del hisopo comprimiendo el hisopo y saque el siopo del tubo. Deseche el hisopo. Procedimiento de la prueba. 1. Saque el “dispositivo de prueba” de la bolsa sellada cortando por donde dice “splice”, y colóquelo sobre una superficie limpia. Deseche el desecante. 2. Agregue 2 gotas de la muestra extraída del tubo dentro del pozo de muestra (S) como se muestra en el dibujo. 3. Lea los resultados antes de 10 minutos.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Resultado positivo: Si la banda de prueba (marcada con una T) aparece. Usualmente la banda T aparece son unos minutos si está positiva. Se presentan dos bandas. Resultado negativo: Si no hay línea de color mostrada dentro de 10 minutos en la zona T. Se presenta una banda. Resultado inválido: Si el color de la banda no aparece en la zona de control “C”, el resultado de la prueba será inválido. La muestra pudo haber sido añadido en la ventana equivocada, o el dispositivo de prueba pudo haber deteriorado. El espécimen debe ser re-analizado usando un dispositivo nuevo.

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Figura 2. Así se debe mostrar un resultado positivo de Chlamydia trachomatis en el dispositivo de imunoensayo. Dos bandas.

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Figura 3. Así se debe mostrar un resultado negativo de Chlamydia trachomatis en el dispositivo de imunoensayo. Una sola banda.

RESULTADOS:

 Muestra: de exudado endocervical  negativo a Chlamydia trachomatis.

OBSERVACIONES:

Se tomaron las muestras del exudado endocervical con mucha precaución de los hisopos que se observan, después con una pipeta se tomó una cantidad mínima de muestra para colocarla al dispositivo de test rápido para la detección de Chlamydia trachomatis.

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Se aprecian 5 dispositivos utilizados para la determinación de Chlamydia trachomatis, y en todos dio un resultado negativo. Observaciones generales.  La muestra se obtuvo por exudado endocervical un día antes de la prueba, ya que se refrigeró.  Antes del análisis se atemperó durante 30 minutos a temperatura ambiente.  Se presentó una banda roja en la zona control.  Se tomó la muestra del tubo 3 (en el caso de nuestro equipo). CONCLUSIONES.   

Se cumplió con el objetivo de la práctica que era determinar de forma cualitativa Chlamydia trachomatis. El resultado del diagnóstico fue negativo para Chlamydia trachomatis. El inmunoensayo, da a conocer la presencia de algún microorganismo causante de alguna patología, de forma rápida y eficaz. Lo anterior, para un diagnóstico que se requiera de manera inmediata.

BIBLIOGRAFÍA. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica. Grupo MexLab. (2010). Chlamydia Test: Prueba rápida. México: Grupo Industrial Mexlab S. A. de C. V.

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UNIDAD V INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS INFERIORES INTRODUCCIÓN. Es de todos sabidos que la población infantil es la que se expone a mayores riesgos con las Infecciones Respiratorias Agudas. De acuerdo con la normatividad mexicana para la atención a la salud del niño, lo primero que se debe identificar a través de los métodos de consulta es la presencia de neumonía, otitis media, faringo-amigdalitis u otra alteración de origen bacteriano que -ya se dijo en las entregas anteriores- pueden ser complicaciones de un resfriado común o un cuadro de gripe o influenza. Según las características manifiestas en el paciente, al realizar el interrogatorio y la auscultación completa, estas se clasifican en los siguientes casos cerca del 30% de las infecciones del paciente son debidas a virus. Los virus respiratorios suelen tener una relación muy clara con la estación del año. No siempre son ellos la causa directa de la infección. ¿Qué quiere decir esto? Los virus pueden dañar la mucosa bronquial y favorecer así el asentamiento de bacterias causantes del cuadro infeccioso. El virus es, por una parte, difícil de diagnosticar, y, por otra, carece de tratamiento específico.

 VIRUS: Virus respiratorio sincitial, Virus influenzae, Virus parainfluenzae, Coronavirus, Rhinovirus, Adenovirus.  BACTERIAS: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Pseudomona aeruginosa, Enterobacterias, Staphilococcus aureus, Streptococcus spp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae.

El papel de las bacterias ha sido muy estudiado. Por desgracia, tampoco resulta sencillo su diagnóstico. Esto se debe a que como ya hemos comentado anteriormente, en estos pacientes se produce con mucha frecuencia una colonización de la mucosa por bacterias. La obtención de esputo para hacer un análisis microbiológico del mismo no es sencilla porque no siempre el paciente puede expectorar. Además los resultados pueden ser confusos al obtener en ocasiones diferentes tipos de bacterias. El examen de la expectoración se complica por el hecho de que contiene muchos gérmenes potencialmente patógenos, como comensales en la garganta normal.

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PRÁCTICA No. 9 “CULTIVO DE MATERIAL DE VÍAS ÁREAS INFERIORES, CULTIVO DE EXPECTORACIÓN” OBJETIVO:  El alumno realizará cultivos de muestra de vías aéreas inferiores, particularmente de expectoración para la posible identificación de bacterias patógenas de acuerdo a los resultados macroscópicos y microscópicos. FUNDAMENTO: A pesar de las críticas de su sensibilidad, especificidad y fiabilidad, la tinción de Gram y el cultivo del esputo son una herramienta importante en la evaluación microbiológica y/o bacteriológica no invasiva de la neumonía. Los métodos de recolección de esputo y la contaminación orofaríngea son el principal problema a resolver para aumentar la fiabilidad. Primero, la obtención del esputo requiere la cooperación del paciente y la supervisión por personal calificado para obtener una muestra adecuada. Una proporción importante de los pacientes con neumonía son incapaces de producir una muestra adecuada. Esta dificultad ha hecho desarrollar técnicas específicas para inducir el esputo, que son particularmente útiles y coste-efectivas en pacientes con SIDA y neumonía por Pneumocystis carinii. Además, el esputo inducido se ha mostrado útil en el diagnóstico microbiológico de infecciones debidas a organismos distintos a P. carinii. Cualquiera que sea el método de recogida, el esputo es una mezcla de secreciones del tracto inferior con una cantidad variable de secreción orofaríngea. Por tanto, una valoración y procesamiento adecuados representan un paso obligado antes del cultivo. MATERIAL:  Cajas Petri (40 por todo el grupo).  Equipo de tinción de Gram.  Hisopos.  Asa bacteriológica.  Microscopio.

     

Portaobjetos. Agar Sangre. Agar Gelosa Chocolate. Agar McConkey. Agar Sal y Manitol. Agar Biggy.

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TÉCNICA: Cultivo. 1. Seleccionar la porción de la muestra más purulenta o que contenga sangre. 2. Utilizando un hisopo estéril o un aplicador de madera inocular la muestra en un extremo de la superficie de las placas con los medios de cultivo. 3. Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inoculo de la muestra, realizar la siembra por dispersión agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el propósito de obtener colonias aisladas 4. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 – 37° C por 24 a 48 horas. 5. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas. Frotis. 1. Seleccionar la porción más purulenta de la muestra que contenga sangre. 2. Suavemente extenderla en la lámina portaobjetos. 3. Dejar secar el frotis al aire, de preferencia dentro de una cabina de flujo laminar. 4. Fijar con metanol y colorearlo por Gram. 5. Usar bajo aumento (10 X) para examinar el frotis y la determinación de polimorfonucleares y células escamosas (100 X). Lectura a las 24 horas. Si no hubiera crecimiento incubar por 24 horas más. 1. 2. 3. 4. 5.

6. 7. 8.

Tomar la muestra Rotar el aza en cada una de las zonas de las placas. Incubar los cultivos a 37 °C durante 24 h. Fijar el frote y teñirlo con el método de Gram. Hacer la observación microscópica con el objetivo de l00X. Al terminar la incubación de los medios utilizado, observar la morfología colonial: microscópica, identificar la flora aislada y si se encuentran microorganismos flora patógena realizar sensibilidad a lo antibióticos. Hacer las observaciones correspondientes, del crecimiento de cada una de las ajas. Dibujar los campos observados en el microscopio. Identificar las colonias. Hacer un reporte del resultado del paciente.

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RESULTADOS.  Agar sangre: Sin crecimiento bacteriano o algún tipo de microorganismo que haya crecido (contaminación).  Agar gelosa chocolate: Sin crecimiento bacteriano o algún tipo de microorganismo que haya crecido (contaminación).  Agar McConkey: Sin crecimiento bacteriano o algún tipo de microorganismo que haya crecido (contaminación).  Agar Sal y Manitol: Sin crecimiento bacteriano o algún tipo de microorganismo que haya crecido (contaminación).  Agar Biggy: Sin crecimiento bacteriano o algún tipo de microorganismo que haya crecido (contaminación). Nota: Se dejaron incubar 24 horas las cajas y posteriormente, 48 horas ya que no se presentaba crecimiento alguno. OBSERVACIONES.

Se puede observar la toma de muestra de expectoración, aunque cabe decir que no tenía sangre y se procedió junto con un hisopo a abrir de alguna forma la muestra de tal manera que se agarrara de en medio lo que se debía de inocular en cada una de las placas.

Como indicaba la técnica, la siembra del inóculo de la muestra se realizó por dispersión por agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa con los medios de cultivo a 35-37 °C por 24 hrs. y luego a 48 hrs.

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Se aprecian los cinco medios utilizados, en los cuales al pasar 48 hrs., no presentaron crecimiento alguno no sabemos porque, pero suponemos que el paciente no presenta alguna enfermedad de las vías respiratorias inferiores.

No se observaron células polimorfonucleares ni escamosas. Esta imagen representa la tinción de Gram hecha antes del cultivo de la muestra de expectoración. El paciente es desconocido. Visto a 10 X.

No se observaron células polimorfonucleares. Pero si se puede observar una célula escamosa, la cual está señalada. Esta imagen es de la tinción de Gram hecha de la muestra a las 48 hrs. Visto a 100 X.

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CONCLUSIÓN: No se tuvo crecimiento bacteriano alguno, por lo que no se pudo observar la morfología colonial. Esperábamos que a lo mejor la muestra estuviese contaminada, pero tampoco lo que nos indica que el procedimiento llevado a cabo durante la siembra de la muestra fue correcto y realizado con las medidas de esterilidad adecuadas. Suponemos que el paciente no está enfermo de algún tipo de agente causal que propicie a que tenga alguna patología referente a las vías inferiores aéreas. Por lo que se concluye que ahora sabemos la importancia de hacer este tipo de análisis bacteriológico para descartar enfermedades respiratorias. Así como, siempre tomar las medidas adecuadas en la elaboración de este tipo de prácticas. Las tinciones realizadas tampoco dieron muestra alguna de presencia de microorganismos patógenos. BIBLIOGRAFÍA. Torres A, Mensa J, Niederman M. (1999). Infecciones respiratorias en UCI. Barcelona: Springer-Verlag Ibérica. Pág. 241. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica.

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PRÁCTICA NO. 10 “UROCULTIVO” OBJETIVO: 

Aplicar los métodos convencionales para el diagnóstico microbiológico de infecciones del trato urinario (ITU).

FUNDAMENTO: El diagnóstico de laboratorio de una ITU se realiza a través del urocultivo, el cual consiste en el cultivo bacteriológico de la orina para determinar la presencia y cuantificación de gérmenes patógenos. Para la evaluación de estos gérmenes y de su potencial importancia en un proceso infeccioso de las vías urinarias es imperativo conocer los siguientes aspectos: 

Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior: Estafilococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patógenas (difteroides), Enterobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., entre otras. Micobacterias saprofíticas, especialmente Mycobacterium smegmatis, Levaduras y Streptococcus sp. Todos estos microorganismos pueden contaminar fácilmente las muestras de orina sin que ello signifique infección, por eso se deben seguir estrictamente las normas que se explican más adelante, que permiten recolectar y conservar correctamente las muestras para urocultivo.



Agentes productores de ITU: todo microorganismo puede potencialmente producir infección urinaria; sin embargo, las más frecuentes son: Escherichia coli (85% aproximadamente), Proteus sp. (especialmente Proteus mirabilis), Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp., Enterobacter sp. Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter generalmente en pacientes hospitalizados con sondas permanentes o con otra patología de base. Levaduras, Staphylococcus saprophyticus (generalmente en mujeres en edad reproductiva), Haemophilus, principalmente en niños.

MATERIALES:     

Guantes de látex estériles. Gasa estéril. Jabón. Agua tibia estéril. Frasco estéril de boca ancha para la muestra de orina.

  

Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Medios de cultivo: agar sangre y agar McConkey.

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TÉCNICA: Toma de muestra  

Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabón, de adelante hacia atrás, secarse con toalla limpia, orinar separando los labios mayores. Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco balanoprepucial con agua y jabón (no usar antisépticos). Se elimina el primer chorro de orina y luego se recolecta en un envase estéril la fracción siguiente. Siembra en medios de cultivo

1. Mezclar la orina cuidadosamente. 2. Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del frasco en el mechero Bunsen. 3. Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en forma vertical. Tapar el frasco con la muestra. 4. Insertar el asa estéril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre la superficie de la placa desde el centro, formando una línea y posteriormente hacer estrías sobre la placa cruzando la línea del inóculo varias veces. 5. Incubar las placas durante 24 horas a 37 °C. En caso de tener cultivos negativos a las 24 horas, se deben incubar 24–48 horas más.

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RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Imágenes representativas de los medios de cultivo agar sangre y McConkey ya que no se observaba ningún crecimiento y no se tomaron fotografías CONCLUSIÓN: Al sembrar la muestra de orina, no hubo crecimiento bacteriano a las 24 horas de haber puesto a inocular el medio, por lo cual, se dejó otras 24 horas para que hubiera un crecimiento en los medios pero no hubo crecimiento bacteriano y además los medios de cultivo se contaminaron ya que en el control negativo se observó un crecimiento de hongos. BIBLIOGRAFIA: Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramírez, AC, Sánchez K, Velasco E. (2008). Manual práctico de bacteriología clínica. Universidad de Los Andes. 1ª edición. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 65-77. Zorc J, Kiddoo D, Shaw K. Diagnosis and management of pediatric urinary tract infections. Clin Microbiol Rev 2005, 18(2): 417-422.

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PRÁCTICA NO. 11 “PRUEBAS BIOQUIMICAS” OBJETIVO: 

Identificar bacterias en base a su metabolismo utilizando diferentes sustratos y condiciones de oxígeno.

FUNDAMENTO: El medio TSI (Triple Sugar Iron/Hierro Triple Azúcar) es uno de los medios más utilizados para observar la fermentación de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Para su utilización el medio debe estar en forma de pico de flauta. Se han incorporado a estos medios cuatro derivados proteicos: extracto de carne, extracto de levadura, peptona y proteosa, que hacen que los medios sean muy ricos nutricionalmente. La ausencia de inhibidores en el medio permite el crecimiento de todas las especies bacterianas excepto anaerobios obligados y otras bacterias exigentes. Por su contenido de sulfato ferroso se puede detectar ácido sulfihídrico. El medio se utiliza en forma de pico de flauta. En el medio LIA (Lysine Iron Agar/Agar Hierro Lisina) se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa, ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (púrpura) hacia amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio, si el microorganismo produce lisina descarboxilasa la acción de esta sobre la lisina dará lugar a la cadaverina la cual producirá un cambio en el pH que sobrepasa la acidez debida a la glucosa dando un color púrpura, así pues un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color púrpura que si es producida. LIA al igual que en TSI o KIA se puede detectar la producción de sulfuro de hierro. El medio se utiliza en forma de pico de flauta. El medio de Citrato de Simmons, se basa en la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como única fuente de carbono para metabolismo y crecimiento. Una prueba positiva está representada por la aparición de un color azul oscuro en 24 o 48 horas, en el medio originalmente de color verde, que indica que el microorganismo ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la producción de productos alcalinos. La prueba también es considerada positiva si hay crecimiento en la línea de inoculación, si se incube 24 horas más aparecerá el color azul. El medio se utiliza en forma de pico de flauta.

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El medio MIO (Motilidad Indol Ornitina) es un medio semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. Por descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo. Este medio se solidifica en forma vertical. MATERIALES:     

Asa bacteriológica recta. Mechero Bunsen. Medios de cultivo: LIA, MIO, TSI y Citrato. Cepas de Citrobacter y Enterobacter. Gradilla.

TÉCNICA: 1. Marcar los tubos con sus nombres correspondientes y el de la bacteria en estudio. Acomodarlos en serie de la siguiente manera: Urea, TSI, LIA, citrato, SIM. 2. Inocular cada tubo de acuerdo como sigue: - TSI: Picar en el medio sin tocar el fondo del tubo ni las paredes y estriar la superficie. - MIO: Picar en el medio sin tocar las paredes ni el fondo del tubo. - LIA: Picar el fondo del tubo dos veces y estriar la superficie. - CITRATO: Inocular solo la superficie del medio. P á g i n a 55 | 73

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3. Tapar los tubos verificando que la rosca de los tapones no estén totalmente cerrados. Incubar a 37 ºC por 24 horas. 4. Después de incubarlos, agregar 2 gotas del reactivo de Kovac’s al medio MIO para observar si cambia de color. Si cambia a color rojo es positivo a indol. RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

En la imagen se muestra los medios de cultivo ya inoculados antes de ser introducidos a la estufa para que se incuben.  El tubo del lado izquierdo de color rojo es el medio MIO.  El tubo de color naranja es el medio TSI.  El tubo de color verde es el medio de Citrato.  El tubo del lado derecho de color café es el medio LIA.

En esta imagen se observan los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas, nótese el cambio de color en base a la fotografía superior. P á g i n a 56 | 73

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La imagen izquierda representa al medio MIO donde se nota la movilidad donde se estrió, hubo movilidad en las dos cepas, además, hubo un ligero cambio de color de rojo a café claro. Se les adicionó las gotas del reactivo de Kovac’s y no hubo ningún cambio de color por lo que dieron negativo a la prueba de indol. La imagen del medio amarillo representa al medio TSI donde se observa que viró de color y además hubo crecimiento en la parte superior del medio, en las dos cepas hubo crecimiento y cambio de color. El medio de Citrato de color verde muestra que no hubo crecimiento en Citrobacter pero en Enterobacter si hubo un cambio de color a azul. El medio de color café con lila en la superficie, representa al LIA y hubo cambio de color solo en la parte superior con presencia de crecimiento de colonias. Resultados Medios MIO TSI Citrato LIA

Cepas Citrobacter Movilidad + Indol Ornitina Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada -

Enterobacter Movilidad + Indol Ornitina Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada + + descarboxilación

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Ejemplos de cepas de pruebas bioquímicas

Medio LIA (tomado de Difco & BBL Manual, 2009)

Medio MIO (tomado de Difco & BBL Manual, 2009)

Medio TSI (tomado de Difco & BBL Manual, 2009)

Medio Citrato (tomado de Difco & BBL Manual, 2009)

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A nuestra mesa de trabajo le tocó preparar el agar TSI 18 tubos x 4 mL= 72 mL de TSI 1000 mL – 59.4 g X – 80 mL

𝑥=

(80 𝑚𝐿)(59.4 𝑔) = 𝟒. 𝟕𝟓𝟐 𝒈 𝒅𝒆 𝑻𝑺𝑰 1000 𝑚𝐿

CONCLUSIÓN: Al realizar las pruebas bioquímicas a 2 cepas diferentes de bacterias, se llega a la conclusión que un género y especie corresponde a Enterobacter aerogenes y la otra cepa no se puede llegar a una identificación exacta ya que en la prueba de citrato dio un resultado negativo y es la única prueba que evita que el resultado sea Citrobacter freundii. Para obtener mejores resultados, deben repetirse éstas pruebas y agregar más para obtener resultados más confiables, además de que debe trabajarse en un ambiente estéril y que al momento de incubar, la estufa no esté contaminada. BIBLIOGRAFIA: Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramírez, AC, Sánchez K, Velasco E. (2008). Manual práctico de bacteriología clínica. Universidad de Los Andes. 1ª edición. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Medio MIO. Britania Lab. [En línea] Recuperado el día 21 de mayo de 2014 de: http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/miomedio.htm Medio TSI. Britania Lab. [En línea] Recuperado el día 21 de mayo de 2014 de: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm Medio Citrato. Britania Lab. [En línea] Recuperado el día 21 de mayo de 2014 en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm Medio LIA. Britania Lab. [En línea] Recuperado el día 21 de mayo de 2014 de: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm

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PRÁCTICA NO. 12 “COPROCULTIVO” OBJETIVOS: 

Aislar e identificar los agentes etiológicos patógenos causantes de enfermedades gastrointestinales.

FUNDAMENTO: El coprocultivo es el estudio de la materia fecal para el aislamiento e identificación de bacterias productoras de diarrea. Al realizar un coprocultivo es importante tener presente la flora bacteriana intestinal. En el intestino delgado, el duodeno es estéril, en el yeyuno aparecen enterococos, lactobacilos y difteroides, en el íleon se suman algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae y anaerobios gramnegativos.En el intestino grueso, la flora habitual constituye el 50% del peso seco de las heces. Las bacterias anaerobias que se encuentran en mayor proporción son las siguientes: Bacteroides 100%, Peptococcus, Fusobacterium, Peptostrepotococcus, Lactobacillus y Clostridium. Las bacterias anaerobias facultativas o aerobias son las siguientes: E. coli 100%, Klebsiella y Enterobacter 40 – 80%, Proteus 5-50%, Citrobacter sp., Pseudomonas sp., Enterococccus sp. 100%, Staphylococcus 3050%. Esta flora se mantiene en equilibrio por diferentes mecanismos tales como: producción de bacteriocinas y sustancias tóxicas como ácidos grasos, entre otras. Los microorganismos patógenos más comunes son:

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ECET: Escherichia coli enterotoxigénica; ECEP: Escherichia coli enteropatógena; ECEH: Escherichia coli enterohemorrágica; ECEI: Escherichia coli enteroinvasiva; PMN: Leucocitos polimorfonucleares; GR: Glóbulos rojos. Tomado de: Vizcaya y col, 1999; Romero y Herrera, 2002; Ryan y Ray, 2004.

Etapas de un coprocultivo 

 

Primer periodo: examen directo. Consiste en realizar el examen macroscópico y microscópico de las heces fecales. El examen macroscópico consiste en evaluar la consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o sangre. En el microscópico se busca detectar la presencia de leucocitos. También se incluye el aislamiento bacteriano en las heces. Segundo periodo: identificación por pruebas bioquímicas. Tercer periodo: se realizan las pruebas posteriores a las pruebas bioquímicas (oxidasa, indol, etc.) y se realiza un antibiograma.

Medios selectivos y selectivos diferenciales: la muestra completa conservada en Cary Blair se siembra en los medios agar MacConkey (MK), agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), agar salmonella-shigella (SS), agar cefsulodinirgasan-novoviocina (CIN), agar desoxirribonucléico-ampicilina (ADN-AMP), agar tiosulfato-citaro-sales biliares (TCBS) y agar preston modificado (PM). Todos los medios a excepción del CIN y PM, son incubados a 36 °C durante 24 horas y luego a temperatura ambiente por 24 horas más. Los medios CIN y PM se incuban durante 48 horas a temperatura ambiente (25 °C), 42 °C y en microaerofilia, respectivamente. P á g i n a 61 | 73

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Medios de enriquecimiento: Se utiliza el caldo selenito (para enterobacterias) y agua peptonada alcalina (APA) pH 8,4, para Vibrio, los cuales después de transcurridos 6-8 horas de incubación a 36°C, del caldo selenito se toma una muestra con el asa en aro de la parte más superficial del caldo y se inoculan los medios agar MK, XLD y SS, y del mismo modo a partir del APA al agar TCBS, luego estos medios se incuban en las condiciones anteriormente señaladas. Para la posterior identificación se realizan pruebas bioquímicas, para ello se utilizan diferentes medios de cultivo, por ejemplo: Kliger, LIA, MIO, IM, Urea, Citrato. MATERIAL: Primer periodo:      

Muestra de heces Azul de metileno al 1% Medios de cultivo: Cary Blair, Caldo Selenito, APA, agar MK, XLD, SS, TCBS, PM, CIN. Solución salina fisiológica (SSF) Láminas portaobjetos y cubreobjetos Colorantes para tinción de Gram

Segundo periodo:  

Agar Tripticasa Soya (TS) al 3% Pruebas bioquímicas: Kligler, LIA, MIO, IM, Urea, Citrato.

Tercer periodo:       

Reactivo de oxidasa Agar Mueller Hinton Reactivo de Kovacs Patrón de MacFarland Papel de filtro y palillos de madera Hisopos estériles Discos de antibióticos

TÉCNICA: Primer periodo:

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1. Realizar el examen macroscópico y microscópico (leucocitos fecales) de una muestra de heces y describir lo observado en cada caso. 2. Preparar una suspensión fecal en SSF y sembrar con pipeta Pasteur en los diferentes medios selectivos-diferenciales, selectivos y de enriquecimiento, diseminar por agotamiento en las placas de agar e incubar en las condiciones ya señaladas. Segundo periodo: 1. Observar las placas sembradas en el período anterior, describa las características observadas en cada medio y seleccione las colonias de interés, realizar la purificación correspondiente en agar TS 3%, inocular las pruebas bioquímicas según el caso, incubar a 37 °C en aerobiosis durante 12-18 horas. Tercer periodo: 1. Realizar la prueba de oxidasa de las colonias purificadas y ubicar la bacteria según el resultado obtenido. 2. Realizar la lectura de las pruebas bioquímicas montadas en el período anterior e identificar la(s) bacteria(s) presente(s). 3. Realizar las pruebas serológicas en caso necesario. 4. Realizar el antibiograma si el caso lo amerita, de lo contrario realizar el reporte.

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Nota: ESTA PRACTICA NO SE REALIZÓ BIBLIOGRAFÍA: Vizcaya, L. En Araque M, Nieves B, Sánchez K, Velásquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual práctico de bacteriología. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de Bioanálisis, Departamento de Microbiología y Parasitología, Cátedra de Bacteriología Clínica. Murray, P. (2009). Microbiología Médica. Capítulo 15. Cultivo in vitro: principios y aplicaciones. 6ª edición. ELSEVIER. España. Negroni, M. (2009). Microbiología estomatológica. Fundamentos y guía práctica. 2ª edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina.

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UNIDAD IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL PRÁCTICA No. 13 “CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO” OBJETIVO:  El alumno realizará el cultivo de una muestra de líquido cefaloraquídeo para la identificación del agente causal, Neisseria meningitidis, entre otros como: Criptococcus neoformans, H. intluenzae, S. pneumoniae, Haemophilus y Mycobacterium tuberculosis. GENERALIDADES: La enfermedad meningocócica (EM) fue reconocida por primera vez en el año 1805, cuando Vieussex describió una epidemia de fiebre cerebroespinal en Ginebra – Suiza. Desde entonces, la EM ha sido y sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Su potencial epidémico se evidencia por la aparición de diversas epidemias, especialmente después del comienzo del siglo XX. Durante los períodos epidémicos, la tasa de mortalidad puede alcanzar hasta un 70% en las formas graves de la enfermedad, y es común la presencia de secuelas entre los supervivientes. Por ello, la EM es un grave problema de salud pública. FUNDAMENTO: En agente causal, Neisseria meningitidis, es un diplococo Gram-negativo capsulado, que crece en condiciones aeróbicas y que presenta una reacción positiva a la oxidasa y catalasa. Dado que se trata de un organismo con metabolismo heterótrofo, su crecimiento requiere de sales minerales, lactato, aminoácidos y ácido glutámico como fuente de carbono, Aproximadamente un 10% de las cepas requiere además de cistina, y algunos pueden utilizar sales de amonio como fuente de nitrógeno. El medio de cultivo para el aislamiento de meningococo a partir de muestras biológicas estériles, como líquido cefalorraquídeo o sangre, es el agar sangre o el agar chocolate, con base de agar Müeller-Hinton. Para su aislamiento a partir de muestras biológicas no estériles, como el frotis naso-faríngeo, es necesario utilizar medios selectivos como el Thayer-Martin modificado (GC agar suplementado con 5% de sangre de caballo y suplemento VCNT (vancomicina, colistina, niastatina y trimethoprim). Las condiciones óptimas para el crecimiento de N. meningitidis son a una temperatura entre 35-37°C, atmósfera con un 5% CO2 y 50% de humedad.

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Estructura antigénica de N. meningitidis La membrana externa del meningococo presenta una estructura típica de las bacterias Gram negativas. Está rodeado por una membrana citoplasmática, una pared de peptidoglicano y una membrana externa constituida por lipopolisacárido (LPS) y una bicapa fosfolipídica en la cual se insertan las proteínas de membrana externa (OMPs). Adicionalmente, el meningococo puede estar rodeado por una cápsula externa compuesta de polisacárido. Cápsula. La cápsula a del meningococo está compuesta por un polisacárido aniónico de alto peso molecular. Las diferencias inmunoquímicas en la composición de la cápsula permiten clasificar el meningococo en hasta 13 serogrupos distintos de los cuales solamente 6: A, B, C, W135, Y y X, se asocian habitualmente con la enfermedaD. Se ha sugerido que la función de la cápsula es proteger a la bacteria de la desecación durante la transmisión de persona a persona, y se ha demostrado que actúa como protección contra la actividad de sistema inmunológico del huésped durante la fase invasiva de la enfermedad. Membrana externa La membrana externa del meningococo está formada por componentes proteicos y glicolípidos.

Estructura de la membrana externa de meningococo. P á g i n a 66 | 73

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En las meningitis purulentas el diagnóstico microbiológico se realiza, demostrando el agente etiológico en la muestra del líquido cefalorraquídeo la que debe ser tomada por el personal médico. El líquido cefalorraquídeo se recoge en dos tubos de preferencia con tapón de hule, uno de ellos contendrá citrato de sodio 0.01 g. por cada 5 mI. de la muestra y de éste se hará el estudio citoquímico, mientras que el otro sin anticoagulante se emplea para hacer pruebas bacteriológicas. El diagnóstico específico rápido, cuando se trata de H. influenzae o pneumoniae, se realiza con las reacciones de Quellung o por las pruebas contrainmunoeletroforesis de inrnunofluorescencia directa o coaglutinación. observación directa del frotis teñido por Gram o Giemsa permite dar diagnóstico presuntivo.

S. de La un

MATERIAL.      

Cajas Petri. Asa bacteriológica. Microscopio. Portaobjetos. Mechero bunsen. Agar chocolate.

   

Agar EMB. Agar sangre. Equipo para tinción de Gram. Equipo para tinción de ZiehINielsen.

TÉCNICA. 1. El líquido cefaloraquideo (LCR) debe ser manejado en condiciones de e sterilidad, enviando la porción correspondiente al laboratorio clínico para el estudio citoquímico. 2. Centrifugar el LCR a 2500 rpm durante 15 minutos y descartar el sobrenadante.  Hacer tres frotis: uno teñirlo por la técnica de Gram, el segundo por Ziehl Neelsen y el último por tinción negativa (para investigar la posible presencia de Criptococcus neoformans encapsulado, observarlos en objetivo de inmersión. El resultado se debe informar de inmediato.  Realizar las pruebas de coaglutinación para H. intluenzae y S. pneumoniae (si se cuenta con el equipo).  Inocular en agar sangre, en agar chocolate enriquecido con los factores V y X para Haemophilus, en EMB; si hay sospecha clínica o los frotis indican la presencia de hongos, usar el medio Sabouraud y medio Lowestein-Jensen en caso de Mycobacterium tuberculosis. Incubar a 48 a 72 horas en atmósfera parcial de CO2. P á g i n a 67 | 73

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 Observar a las 24 horas (y diariamente a partir de entonces) en busca de crecimiento; si lo hay, hacer tinción de Gram y subcultivar en los medios apropiados después de interpretar el frotis. Es importante incluir en estas placas de sensibilidad a los antibióticos.  Conservar en incubación los cultivos negativos de 72 a 96 horas antes de desecharlos.  Inocular en medio de tioglicolato. Los cultivos anaeróbicos deberán mantenerse por lo menos de 7 a 10 días.  La identificación final de los microorganismos aislados se hace empleando las pruebas bioquímicas o serológicas indicadas en cada caso.  El líquido cefalorraquídeo normal es estéril. Notas.  La toma de muestra es llevada a cabo por médico especialista o Q.F.B. especialista en la columna vertebral (Con anestesia de Xilocaína local).  LCR es como agua de roca (transparente y cristalino). Cuando es anormal puede ser de aspecto: turbio, amarillento, algunas veces con eritrocitos.  No se llevó a cabo dicha práctica, considerándose solamente teórica.

BIBLIOGRAFÍA. Vieusseux, M., Memoire sur la maldie qui a regne a Geneva au printemps de 1805. J med Chir Pharmacol., 1805. 11: Pág. 163. Peltola, H., Meningococcal disease: still with us. Rev Infect Dis, 1983. 5(1): Pp. 7175. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica.

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PRÁCTICA No. 14 “HEMOCULTIVO” OBJETIVOS:  El alumno llevará a cabo la realización de un hemocultivo para así, verificar si hay bacterias u otros microorganismos en una muestra de sangre.  El hemocultivo o cultivo microbiológico de la sangre constituye en los casos de septicemia, el único examen que permite su confirmación  En caso de bacteremia permite aislar el agente causal. FUNDAMENTO: Las bacterimias y fungemias se diagnostican por hemocultivo, que consiste en el cultivo de una muestra de sangre en medios adecuados para recuperar las bacterias y hongos que son capaces de crecer en medios artificiales. Para realizar un hemocultivo en un adulto se extrae al paciente entre 10 y 20 mL de sangre sin anticoagulante y se inocula en dos frascos con 50 mL de caldo de cultivo, uno de los cuales tiene atmósfera aerobia y el otro anaerobia para permitir el crecimiento de los respectivos microorganismos (Figura 1). La extracción debe hacerse mediante una técnica rigurosamente aséptica para evitar contaminaciones. Tabla 1. Algunos agentes causales de septicemia.

Frecuentes

Sepsis adquirida en la comunidad

Sepsis de origen intrahospitalario

E. coli y otras enterobacterias Neumococo S. aureus

E. coli y otras enterobacterias S. epidermidis y otros estafilococos coagulasa negativa P. aeruginosa Acinetobacter baumannii y otros BGN-NF (bacilos gramnegativos no fermentadores) Estreptococo del grupo viridans Enterococo

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Poco frecuentes

Meningococo Salmonelas gastroentéricas Anaerobios P. aeruginosa Salmonella entérica serovar Typhi Brucella

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Cándida Bacteroides fragilis y otros Clostridium perfingens y otros Corinebacterias

Frascos para hemocultivo. El hemocultivo complementa urocultivos y cultivos de LCR en la evaluación de neonatos con sospecha de sepsis. Uno de los medios más utilizados es el Medio Bifásico de Ruiz – Castañeda. Las botellas deben observarse macroscópicamente a diario en busca de evidencia de desarrollo bacteriano por un total de 7 días. HEMOCULTIVO POSITIVO. El desarrollo bacteriano se detecta por turbidez del medio de cultivo; colonias visibles en la capa sedimentada de sangre, o sobre ésta. Hemólisis de la sangre, producción de gas. Cuando se obtiene un cultivo positivo se debe efectuar una tinción de Gram, que es particularmente útil para distinguir Streptococcus de Staphylococcus, o detectar la presencia de Bacilos Gram Negativos. De los subcultivos se debe aislar e identificar la cepa con medios y pruebas diferenciales. Pruebas diferenciales de Genéro y especie, como son la catalasa y la coagulasa, para cocos Gram Positivos; o Sistema Bioquímico, para identificación de Enterobacterias, Prueba de Oxidasa, para diferenciar Bacilos Gram Negativos, etc.

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ANTIBIOGRAMA. Subcultivos: una alícuota del caldo con desarrollo se siembra en un medio sólido, con incubación de 7 hrs ya hay crecimiento suficiente para ser utilizado como inóculo para las pruebas de sensibilidad. Los organismos aislados de hemocultivos deben guardarse por algunas semanas en caso que se necesiten mayores estudios diagnósticos. PRINCIPALES PATÓGENOS CAUSANTES DE BACTEREMIA La bacteremia normalmente es causada por: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli. La Sepsis se presenta principalmente en pacientes hospitalizados, y comunmente se desarrolla a partir de un sitio de infección primaria. a) CULTIVOS NEGATIVOS. Si todos los cultivos, subcultivos y frotis teñidos por Gram fueran Negativos, el cultivo de sangre puede informarse así: No hubo desarrollo, ni aerobio, ni anaerobio, después de tres días de incubación. Informe Final: No hubo desarrollo después de 7 a 14 días de incubación. b) CULTIVOS POSITIVOS. Los patógenos encontrados más comúnmente en cultivos de sangre incluyen los siguientes: Especies de Bacteroides, Especies de Brucilla, Bacilos Coniformes, Filarias, Francisella tularensis, Haemophillus influenzae, Especies de Leptospira, Listeria monocytogenes, Paludismo, Meningococo, Gonococo, Rickettsias, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Salmonella especies, Tripanosomas, Bacilos Gram negativos: E. coli, especies de Enterobacter, especies de Klebsiella, etc. MATERIAL:    

Medio Bifásico de Ruiz – Castañeda. Jeringa De 10 mL. Gasa estéril. Solución de yodo. P á g i n a 71 | 73

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 Alcohol 70 %.  Placas de selosa Sangre, EMB, agar chocolate, agar sal y manitol.  Material habitual para laboratorio de bacteriología. TÉCNICA: 1. Interrogar al paciente si se encuentra bajo tratamiento con antibióticos. Consignar esta información. 2. Seleccionar la zona que será puncionada para la extracción de sangre (vena palpable). 3. Desinfectar alrededor la zona seleccionada. 4. Lavar cuidadosamente la región, con agua y jabón (remover el desinfectante). 5. Aplicar con gasa o algodón, una solución de yodo sobre el área seleccionada en forma concéntrica del centro hacia la periferia, y desechar el algodón o gasa utilizados. 6. Permitir la acción del yodo durante tres a cinco minutos. Remover completamente la solución de yodo con gasa o algodón estériles impregnados en alcohol de 70º. Realizar el procedimiento en forma concéntrica descartando siempre la torunda o gasa una vez se llega a la periferia de la zona de punción. Repetir este procedimiento cinco veces. 7. No se debe tocar la piel con la mano una vez que el área ha sido desinfectada. Antes de hacer la punción venosa con aguja y jeringa de 10 mL estériles, palpar la vena utilizando guantes desechables y estériles, para proceder con seguridad. 8. En caso de utilizar recipientes comerciales de hemocultivos, seguir cuidadosamente las instrucciones de utilización del equipo de venoclisis que usualmente se incluye. 9. Una vez concluida la toma, debe reemplazarse la aguja con la cual se hizo la punción, por una aguja nueva estéril desechable con la cual se inyectará la muestra de sangre obtenida en los recipientes. Colocar las cantidades necesarias de sangre en los recipientes de hemocultivo, previa limpieza y desinfección de la zona de punción en la tapa de los mismos. 10. Mezclar suavemente los recipientes de hemocultivo. No agitarlos bruscamente y procurar que la sangre se impregne en todas las superficies de los medios de cultivo de los frascos. 11. Proceder con actividades propias del estudio (Rotulación, incubación 37°C, revisión diaria de cultivos, resiembras, interpretación de resultados, etc.).

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Nota: No se llevó a cabo la realización de esta práctica, por lo cual sólo es teórica. BIBLIOGRAFÍA: Prats, G. (2005). Microbiología clínica. España: Médica Panamericana. Pp. 291293. Ramírez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriología. Facultad de Química Farmacéutica Biológica.

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