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Universidad Estatal del Sur de Manabí CREADA EL 7 DE FEBRERO DEL AÑO 2001, SEGÚN REGISTRO OFICIAL # 261 UNIDAD ACADÉMICA CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE LABORATORIO CLINICO

BACTERIOLOGIA

PROFESIONAL EN FORMACION: ANTHONY ANIBAL PLUA FLORES

TEMA: DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO (conjuntiva)

DOCENTE: LIC. TERESA VELIZ

CURSO: QUINTO “B” PERIODO ACADEMICO (PII) 2020

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

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DESARROLLADO SOBRE NEISSERIA GONORRHOEAE OBJETIVO Detallar y fundamentar el procedimiento de aislamiento, identificación y antibiograma de Neisseria gonorrhoeae FUNDAMENTO TEORICO Bacteria Gram-negativa, oxidasa positiva, aeróbica, nutricionalmente fastidiosa, que microscópicamente aparece como diplococos. Los humanos son los únicos hospedadores naturales del gonococo, el cual se transmite por vía sexual. La gonorrea es causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae y la puede contraer cualquier persona que tenga relaciones sexuales anales, vaginales u orales con una persona que tenga esta enfermedad. Puede causar infecciones en los genitales, el recto y la garganta. Una mujer embarazada con gonorrea puede transmitírsela a su bebé durante el parto. Es posible que algunos hombres con gonorrea no presenten ningún síntoma. (1) DESARROLLO MUESTRA A UTLIZAR: Conjuntiva FASE PRE-ANALITICA (DIA 1) TÉCNICA DE RECOLECCIÓN  Secreción conjuntival: tome una muestra por cada ojo con escobillones separados, previamente humedecidos con solución salina. Rote el escobillón en cada conjuntiva, coloque un escobillón en el medio de transporte o en tubo estéril seco

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con tapa rosca o tapón de caucho y con el otro realice extendido en lámina de vidrio.  Raspado corneal: esta muestra es recolectada por el especialista. Use espátula estéril y raspe las lesiones o úlceras e inocule la muestra en el medio de transporte o en tubo estéril seco con tapa rosca o tapón de caucho; realice extendido en lámina de vidrio.  Aspirado de fluido vítreo: utilice técnica aséptica para realizar punción por aspiración. TRANSPORTE:  Inmediatamente luego de la recolección a temperatura ambiente.

MEDIO DE TRANSPORTE: Agar sangre o chocolate (2) (3) PROCEDIMIENTO:  El medio de cultivo preparado debe retirarse de su empaque plástico, y debe ser atemperado unos 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso, nunca flamearlo. Antes de usarlo, siempre debe ser marcado o identificado apropiadamente en su parte posterior, con los detalles de la muestra de manera que no tape la parte del fondo del medio de cultivo para visualizar si se presenta contaminación.  A partir del material en estudio, Inocule el medio usando une técnica aséptica y apropiada de acuerdo a lo requerido, e incube bajo condiciones apropiadas de

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temperatura y humedad, ambiente de aerobiosis, durante 24-48 horas, entre 35 y 37 °C.  Algunos patógenos necesitan condiciones especiales de incubación para lo cual necesitan dióxido de carbono para su aislamiento primario; esto se logra incubando la placa en una atmósfera que contenga 3-10% de CO 2. Incubar a 35ºC +/- 2ºC durante 18 24 horas.  Examine el medio de cultivo después de la incubación para observar evidencia de métodos aprobados, como la inactivación con amonio cuaternario, descartando luego los agares en sus cajas contenedoras en doble bolsa roja para luego descartarlo como material de riesgo biológico; o por autoclavado, sin remover previamente el agar.  Todos los medios de cultivo deben ser manipulados por personal calificado y que hayan sido entrenados en procedimientos y técnicas microbiológicas.(4)

DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO: TINCIÓN DE GRAM DIRECTA: Se debe realizar la tinción de Gram del exudado uretral. Se observa con el objetivo de x100 con aceite de inmersión durante al menos 2 minutos, buscando la presencia de leucocitos PMNs (núcleo rosa y citoplasma sin color). Generalmente se observarán >4-5 leucocitos PMNs por campo de inmersión. La realización de la tinción de Gram de la orina requiere la centrifugación de los 10 ml primeros de la micción y la observación del sedimento, en el que generalmente se observarán al menos 10 leucocitos PMNs por campo. (5)

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TINCION DE GRAM RESULTADO DE OBSERVACION:  Diplococos Gramnegativos 0,6 a  1u intra y extra celular PMN x mm3

CULTIVO-SIEMBRA-ESTRIADO CULTIVO THAYER-MARTIN medio sólido altamente nutritivo y selectivo para el aislamiento de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae; ambas conocidas como Neisserias patógenas o de importancia clínica. Una de las características especiales más importantes que presenta el agar Thayer Martin es su alto contenido en suplementos nutritivos. Esta propiedad es indispensable, debido a que las Neisserias son microorganismos muy exigentes desde el punto de vista nutricional y por tanto no crecen en medios comunes.

Agar sangre El agar sangre es un medio de cultivo sólido enriquecido, diferencial pero no selectivo. Es utilizado para la recuperación y crecimiento de una gran variedad de microorganismos provenientes de muestras clínicas o para subcultivos.

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Es por ello que deben tomarse todas las precauciones posibles y al final debe realizarse un control de calidad incubando a 37 °C 1 placa por cada 100 que se preparen. Preparación Cada casa comercial trae al reverso del envase las indicaciones para preparar un litro de medio de cultivo. Se pueden hacer los cálculos correspondientes para preparar la cantidad deseada, según el agar base seleccionado. Pesar y disolver El agar base viene deshidratado (en polvo), por tanto, debe disolverse en agua destilada ajustada a pH 7,3. Se pesa la cantidad que indique el agar base escogido y se disuelve en la cantidad de agua correspondiente en una fiola, luego se calienta a fuego moderado y se mezcla con movimientos rotativos hasta disolver todo el polvo. Esterilizar Una vez disuelto, esterilizar en autoclave a 121°C por 20 minutos. Agregado de la sangre Al salir del autoclave se dejar enfriar la fiola hasta que la temperatura oscile entre 40 a 50 °C; es una temperatura que la piel humana soporta y a la vez el agar aún no se ha solidificado. Para ello, se toca la fiola con la mano y si el calor es tolerable, es la temperatura ideal para agregar la cantidad de sangre desfibrinada correspondiente (50 ml por cada litro de agar). Mezclar suavemente para homogeneizar.

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El paso del agregado de la sangre es crucial, pues si se realiza cuando el medio está muy caliente los glóbulos rojos se romperán y el medio no servirá para observar hemólisis. Si se agrega demasiado frío, se formarán grumos y la superficie del medio no quedará lisa para poder hacer el estriado adecuadamente. Verter en las placas de Petri Servir en placas de Petri estériles inmediatamente después de homogeneizar la sangre. En cada placa de Petri se vierte aproximadamente 20 ml. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar o cerca del mechero. Al momento de servir el agar sangre en las placas de Petri no deben quedar burbujas de aire en la superficie de la placa. Si esto sucede se pasa la llama del mechero de Bunsen rápidamente sobre la placa para eliminarlas. Las placas se dejan solidificar y se guardan en nevera (2-8°C) de forma invertida hasta su uso. Antes de usar las placas de agar sangre se deben atemperar (dejar que tomen temperatura ambiente) para poder ser sembradas. Las placas preparadas tienen una duración aproximada de 1 semana. INCUBACION Las placas se incuban a 35-37°C por 24 a 48 horas en jarra de microaerófilo (5% CO2). (6) (7)

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TINCIÓN DE GRAM EN COLONIAS 1. Preparar un frotis bacteriano. 2. Teñir el frotis de cristal violeta durante 1 minuto. 3. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante. 4. Cubrir la preparación con Lugol durante 1 minuto. 5. Se lava con agua destilada hasta eliminar el exceso de Lugol. 6. Lavar con alcohol/acetona la preparación para eliminar el primer colorante. 7. Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de alcohol/acetona. 8. Teñir la preparación con safranina durante 1 minuto. 9. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante. 10. Secar la preparación al aire. 11. Observar al microscopio óptico y finalmente identificar los microorganismos como grampositivos o gramnegativos. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS  Colonias 1-4 mm  redondas  Grisáceas  transparentes

Tinción de Gram: cocos Gramnegativos PRUEBAS DE IDENTIFICACION

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➢ Oxidasa+ Método diagnóstico que evidencia la presencia del complejo enzimático denominado citocromo oxidasa c. Este sistema induce la transformación del citocromo reducido a oxidado, ya que capta el oxígeno y este a su vez actúa como último aceptor de electrones (H+) en la cadena respiratoria. Método indirecto sobre papel 1. Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. 2. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. 3. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. 4. La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

➢ Catalasa+ Catalasa enzima que descompone el peróxido de hidrogeno: 1. Transferir parte de una colonia. 2. Con aguja de inoculación o un palillo de madera a la superficie del portaobjeto 3. Agregar una gota de reactivo de peróxido de hidrogeno y observar la formación de burbujas PRUEBAS SEROLOGICAS  Inmunoglobulina G (IgG): es el tipo de anticuerpo que más abunda en el cuerpo. Se encuentra en la sangre y en otros fluidos, y brinda protección contra las infecciones bacterianas y víricas. La IgG puede tardar un tiempo en formarse después de una infección o vacunación.

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Dilución de suero 1:100 por el método de ELISA. Se emplearon extractos crudos N gonorrhoeae (a Pili). 1. Se prepararon las microplacas con suero (40 µl) diluido con glicerol-PBS (160 µl), 2. Luego se agregó azida de sodio 0.2% peso/volumen como conservador, 3. Posteriormente las placas fueron selladas y congeladas a 20 °C hasta su empleo. 4. Cuando se realizó el análisis, se aplicó el antígeno con una solución de PBSleche. 5. Enseguida se incubó a 35 °C por cuatro horas 6. Luego se aplicó el conjugado anti-IgG (de conejo)-peroxidasa o anti-IgA (de conejo)-peroxidasa 7. Más tarde se aplicó el sustrato de tipo tetrametil-bencidina y se interrumpió la reacción con ácido sulfúrico 2M, se leyó en un espectrofotómetro a 450 nm y el resultado se reportó en densidad óptica. Como controles negativos se emplearon pocillos blancos con 100 µl de diluyente, los cuales dieron lecturas