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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA INTRODUCCION

'Laboratorio clínico' es el lugar donde los alumnos aprenderán a realizar análisis clínicos que contribuyen al estudio, prevención, diagnóstico y tratamiento de los problemas de salud de los pacientes. También se le conoce como Laboratorio de Patología clínica. Los laboratorios de análisis clínicos, de acuerdo con sus funciones, se pueden dividir en: 1. Laboratorios de Rutina o de seguimiento. Los laboratorios de rutina tienen cuatro departamento

básicos: Hematología, Inmunología, Microbiología y

Química

Clínica (o Bioquímica). Los laboratorios de rutina pueden encontrarse dentro de un hospital o ser externos a éste. Los laboratorios hospitalarios, con frecuencia tiene secciones consideradas de urgencia, donde se realizan estudios que servirán para tomar decisiones críticas

en

la

atención

como citometría hemática,

de

los

tiempos

pacientes

graves.

Estudios

tales

de coagulación, glucemia, urea, creatinina y

gases sanguíneos. 2. Laboratorios de Especialidad. En los laboratorios de pruebas especiales se realizan estudios más sofisticados, utilizando metodologías como amplificación de ácidos nucléicos, estudios cromosómicos, citometría de flujo y cromatografía de alta

resolución,

entre

otros.

Estas

pruebas

requieren

instalaciones

y

adiestramiento especial del personal que las realiza. Con frecuencia, estos laboratorios forman parte de programas de investigación. Es importante también considerar, dentro del proceso de análisis, la obtención de las muestras biológicas. Este proceso conocido como toma de muestras, abarca la flebotomía, proceso por el cual se extráe una muestra de sangre; la obtención de otro tipo de muestras, como orina y heces; y la extracción de otros líquidos corporales, como líquido cefalorraquídeo o líquido articular.

Ubicación y Relación con otros servicios clínicos A los laboratorios acuden pacientes externos, puesto que los exámenes que se requieren de los enfermos hospitalizados se hacen mediante muestras que se toman en las unidades de hospitalización. En consecuencia su ubicación será preferentemente en la FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA planta baja, con fácil acceso a la sección de recepción del Archivo Clínico y en menor grado con el departamento de Consulta Externa. Este servicio deberá ubicarse en relación cercana a los servicios de consulta externa, urgencias, terapia intensiva, quirófano y con fácil acceso hacia las áreas de hospitalización . Áreas de Servicio 

Sala de Espera y Recepción. Donde los pacientes esperarán cómodamente a ser atendidos.



Cubículos de Toma de Muestras. En este punto se obtienen las muestras para luego ser distribuidas a las diversas secciones del laboratorio.



Secciones de Laboratorio: 

Hematología:En este se efectúan diversas pruebas que se resumen para el objeto que persigue este estudio en tres: pruebas de coagulación, pruebas de contabilidad sanguínea y morfología.





Química Clínica: Aquí se realizan análisis que se clasifican de la siguiente forma: 

Química sanguínea de rutina



Exámenes generales de orina



Determinación de reserva electrolítica y bióxido de carbono en la sangre

Microbiología: Las diversas labores que se realizan aquí pueden clasificarse en la siguiente forma:



Coproparasitología:Tiene por objeto investigar la presencia de parásitos en materias fecales.



Bacteriología: Consiste en examinar directa o indirectamente la presencia o actividad de organismos

microscópicos

en sangre,orina, materia fecal, jugo

gástrico y exudados orgánicos. 

Inmunología: Realiza pruebas sobre los anticuerpos que revelan la presencia y actividad de microorganismos en el cuerpo humano



Se tendrá el área de Preparación de medios de cultivo, que por sí sola se define, además, la zona de lavado y esterilización de material.

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA En este manual se hallan reunidas las técnicas de los estudios más frecuentes en el área de bioquímica clínica de acuerdo al plan de estudios de los estudiantes

Practica 1 Conocimiento del laboratorio y medidas de seguridad

Introducción FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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El trabajo en el laboratorio implica un riesgo latente desde el momento en que se pone un pie al interior del mismo .Es una zona donde se reúne el mayor numero de reactivos químicos ,tipos de energía y utensilios especializados ,de todo de estudio , llámese universidad ,centro e investigación , hospital ,industria o centro de servicios .Es por todo esto que impera la necesidad de abordar este tema al iniciar un periodo de prácticas de laboratorio ,y al mismo tiempo ,iniciar una cultura de la prevención de accidentes ,de atención al entorno de trabajo ,y de seguridad como modo de trabajar en cualquier ámbito profesional. Pongamos pues las siguientes premisas para plantear un esquema de trabajo hacia la prevención y la seguridad en el laboratorio o en cualquier área de trabajo. •

La seguridad es responsabilidad en línea jerárquica Todos los accidentes pueden ser evitados Las personas son la base fundamental en la gestión de la prevención de riesgos • Una gestión eficaz de la prevención de riesgos produce una mejora en el sistema de calidad , así como el aumento de producción ( días / clase ) La prevención efectiva de riesgos evita días perdidos debido a las bajas causadas por accidente o por enfermedades derivadas del trabajo • •

Riesgos específicos A continuación se enumeran los diferentes riesgos a que se pueden exponer las personas que trabajan en un laboratorio clínico. 

Exposición

a patógenos presentes

en

sangre

mientras

manipulan

muestras

contaminadas como sangre o fluidos corporales (ejemplo: líquido cerebroespinal, y semen). 

Exposición a tuberculosis al trabajar con especímenes que puedan contener tuberculosis y sida. Otros fluidos que pueden ser fuentes potenciales de tuberculosis son esputo, líquido cerebrorraquídeo en la orina, y líquidos recolectados de lavado gástrico o branquial.



Exposición a formaldehído que es utilizado como fijador y que se encuentra comúnmente en la mayoría de laboratorios y morgue.



Riesgos químicos. Exposición a solventes utilizados para fijar tejidos de especímenes y

quitar

manchas.

Se

encuentran

principalmente

en

las

áreas

de histología, hematología, microbiología y citología. 

Exposición a PPS debido a heridas con agujas o cortaduras por objetos afilados al trabajar con especímenes, tubos de centrífugas.



Exposición a materiales / organismos infecciosos.



Exposición al látex y alergia al látex debido al uso de guantes de látex. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Riesgo de deslizarse o caerse si líquido o muestras caen al suelo.



Dolor muscular en diferentes partes del cuerpo por permanecer tiempos prolongados en una misma posición, ya sea sentado o de pie, o por realizar movimientos repetitivos al manipular muestras.



Riesgo de quemaduras

. Seguridad en el laboratorio En los laboratorios de análisis clínicos los riesgos que existen pueden evitarse con el uso de una buena técnica, precauciones sencillas y conocimiento de las medidas a tomar en casos de accidentes leves. Los accidentes sencillos que no se manejen correctamente pueden resultar de consecuencias graves. Los accidentes pueden ser: 1. Incendio y explosión por el uso de solventes, inflamables, etc. Los solventes deben guardarse en lugares frescos, bien ventilados y a prueba de fuego. No deben manejarse cerca de flamas, ni en lugares cerrados donde los vapores pueden acumularse y formar con el aire mezclas explosivas. 2. Reactivos venenosos, corrosivos y cáusticos. Algunos compuestos no tienen efecto importante sobre la piel; pero su ingestión es peligrosa, por ejemplo: cianuros , alcohol metílico, compuestos de arsénico, mercurio, bario , etc. Debe insistirse en la importancia de rotular correctamente todos los frascos de laboratorio y evitar contaminaciones de pipetas, cigarrillos, etc .dejados sobre la mesa. Por su constante uso estas sustancias se manejas sin la debida precaución; las quemaduras con ácidos y bases fuertes, en manos, ojos y cara son las más frecuentes. En caso de quemaduras leves deben seguirse las instrucciones de cada reactivo y en casos extremos, atención medica. 3. Quemaduras y escaldaduras, incluyendo choques eléctricos. Generalmente son causadas por objetos calientes y secos, ó por exposición prolongada a los rayos ultravioleta o infrarojo. Los choques eléctricos en el laboratorio son de pocas importancia; pero si el contacto accidental es intenso, el choque produce perdida de la conciencia y se debe solicitar atención medica de inmediato. 4. Heridas causadas por manipulación de vidriería, cuchillas de micrótomo, etc. Son las mas frecuentes en el laboratorio. Los fragmentos de vidrio, especialmente el grueso, presentan un borde irregular que produce heridas graves. Estos accidentes pueden evitarse con la manipulación cyuidadosa. Medidas de control. Las medidas de control en los laboratorios de análisis clínicos son de gran importancia, ya que estas determinan la calidad del trabajo. 1. Buen estado de limpieza del material de vidrio:la limpieza se efectuara según los requerimientos de cada practica. 2. Menejo y comprobación del buen funcionamiento de los aparatos: antes de usarlos deben leerse cuidadosamente los instructivos. Colocar los aparatos FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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en lugares adecuados y darles el mantenimiento y limpieza debidos. Verificar su exactitud y buen funcionamiento. 3. Revisión de técnicas y curvas de calibración: los pasos en las técnicas deben seguirse estrictamente, las temperaturas t tiempos de incubación ,deben usarse controles y curvas de calibración con soluciones estándar. 4. Conservación y uso correcto de los reactivos: de acuerdo con las instrucciones de cada reactivo, se tomara en cuenta refrigeración , descomposición con la luz, contaminación , etc.

Limpieza del material de vidrio Los resultados de los experimentos, dependen en gran parte, de la limpieza del equipo: 1) muchos reactivos se usan en miligramos o microgramos, por lo tanto cualquier contaminación,podría contribuír a un porcentaje significativo de la muestra experimental total del experimento. 2) Muchas sustancias son sensible a uno o más contaminantes, como iones metálicos, detergentes o residuos organicos.

Objetivos: Los alumnos conocerán el laboratorio , los materiales , los reactivos, las instalaciones eléctricas , de gas ,de agua y el funcionamiento de cada uno de ellos , sus interacciones ,utilidades ,modos de desecharlos ,etc. Con la finalidad de aprender el manejo de los mismos en las practicas a realizar ,en casos extremos de riesgos y contingencias. De igual manera aprenderán a usar los utensilios de primeros auxilios y contra incendios ,así como las rutas de evacuación ,elaborando un plan estratégico de emergencia para cada caso. Rombo de seguridad para sustancias químicas.

Material • Mesas de laboratorio • Tomas de gas • Agua • Electricidad • Material de vidrio • De metal • Aparatos FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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•

Instrumental

Reactivos • Solidos • Acidos • Soluciones • Alcoholes ,etc.

Procedimiento experimental: A través de la observación y conocimiento del equipo de laboratorio, los reactivos y materiales, se plantearan formas de trabajar( vestimenta , organización , lentes , guantes) ,de prever posibles accidentes (distribución de espacio , rutas de evacuación , anaqueles ), zonas de riesgo , puntos críticos , y todos los casos que requieran revisión y modificación para mejorar la seguridad al interior del lugar de trabajo

Cuestionario 1. Elabora un proyecto que implique un plan de seguridad para casos de contingencia en el laboratorio, detectando puntos críticos , manejo de reactivos ,posibles soluciones y estrategias para asegurar la estancia y evacuación de las personas presentes durante el fenómeno correspondiente ( sismo , incendio , accidente ,etc.) 2. ¿Cómo se clasifican los reactivos de laboratorio? 3. ¿Cuáles son los colores utilizados para diferenciar la reactividad de las sustancias, y que significa cada uno de ellos? 4. ¿Cuál es el procedimiento adecuado para tratar un accidente donde hubo contacto con un acido, con una base , con fuego , con electricidad y con agua hirviendo? 5. ¿ porque es tan importante el mantenimiento de equipos y reactivos en las técnicas de análisis clínicos?

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Practica 2

Toma de muestra OBJETIVOS: 1. Que el alumno aplique las técnicas estandarizadas más comunes de obtención de muestras de sangre periférica con calidad analítica. INTRODUCCIÓN: La sangre es una suspensión, en la que aproximadamente el 50% del volumen total de esta corresponde al plasma y el otro 50% de este volumen corresponde a células que se encuentran suspendidas en el plasma. La obtención de muestras de sangre para los estudios hematológicos requiere de la aplicación de las recomendaciones internacionales de control de calidad, que garanticen la integridad de la muestra. La punción venosa es uno de los procedimientos más comunes para extraer sangre, ya que posibilita la recolección de sangre venosa para posteriores análisis de laboratorio, se requiere que el paciente esté en condiciones basales (ayuno de 8 horas). Los sitos para punción venosa son las venas del antebrazo y fosa antecubital; la vena basílica, cefálica y mediana del antebrazo y radial superficial, cubital superficial y mediana de la fosa antecubital. La obtención de sangre capilar actualmente está limitada a estudios pediátricos, sin embargo anteriormente era el método ideal de extracción de sangre para realizar frotes sanguíneos, ya que inmediatamente después de la punción se recoge en las laminillas para realizar los extendidos, sin que haya necesidad del uso de anticoagulantes que puedan alterar la el volumen de la sangre y morfología celular. Para realizar los extendidos de sangre periférica, se utiliza sangre venosa anticoagulada generalmente con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA preferentemente en su forma seca analizados los extendidos antes de que transcurran 2 horas desde la extracción de sangre, o bien sangre capilar directamente de la punción al portaobjetos( es lo ideal). Es recomendable que la sangre anticoagulada sea utilizada inmediatamente para impedir alteraciones morfológicas. El control de calidad en todas las fases del análisis hematológico es indispensable para lograr confiabilidad de los resultados, por lo que se recomienda obtener muestras de sangre con calidad analítica, siguiendo el protocolo para la toma de muestra que sea apropiada al estudio. La calidad de las extensiones de sangre es indispensable y esto depende del anticoagulante usado, el tipo de sangre (venosa o capilar) con o sin anticoagulante.

MATERIAL: • 1 gradilla • Tubos de ensaye DE 13 X 100 mm con anticoagulante EDTA ( 3 por equipo) • 1Pipeta automática de 10L 5 puntas amarillas • Jeringas o dispositivos para extracción de sangre con tubos al vacío • Torundas • Torniquete o ligadura de 25 a 30 cm de largo • Alcohol al 70% • Lancetas estériles • Papel absorbente suave • Etiquetas para identificar al paciente • Contenedor de objetos punzo cortantes • Jabón de tocador para lavarse las manos • Toallas de papel • Franela o esponja • Lápiz graso o crayola Reactivos: • EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) • Metanol absoluto 100 mL • Agua destilada pH 7 • Amortiguador de fosfatos pH 6.4 100 mL (1 gotero) • Solución de hipoclorito al 5% para desinfección de mesas de trabajo.

Material biológico: •

Muestras de sangre total FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD: 1.- ponerse la bata y despejar el área de trabajo dejando sobre la mesa solo el material que va a utilizar en la práctica. 2.- desinfectar la mesa de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% (cloro de uso doméstico). 3.-seguir las recomendaciones universales para disminuir los riesgos al exponerse a productos biológicos potencialmente contaminados, en la práctica clínica. Debido a que todos los pacientes pueden ser potenciales portadores de patologías que se transmiten por la vía parenteral, sin tener un diagnóstico objetivable, LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES deben aplicarse en la práctica de la atención de cualquier paciente en todo momento y en cualquier ámbito de la atención de salud, siendo esto lo que les confiere el carácter de Universales. a) Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recolección de muestras con riesgo de salpicaduras procedentes de pacientes de con enfermedades infectocontagiosas. b) No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (o desechar la aguja y la jeringa en un galón destinado para tal fin, evitando la manipulación. c) Preservar la técnica aséptica en la obtención de muestras mediante procedimientos invasivos (venopunción periférica, catéter central etc.) PROCEDIMIENTO PARA PUNCIÓN VENOSA 1.- Lavarse las manos perfectamente con agua y jabón. 2- Verificar que cada muestra esté acompañada de información que incluya; nombre y apellidos del paciente, edad, sexo, procedencia cuando proviene de otra institución, tipo de muestra, diagnóstico presuntivo, fecha y hora de toma de la muestra, medicación (si el paciente está recibiendo tratamiento), tipo de estudio a realizar. Por lo que las muestras de los alumnos deben estar acompañadas de esta información. 3.- Preguntar al paciente si guardó el ayuno adecuado (en caso necesario), preguntar la hora de la última ingesta. 4- Tranquilizar al paciente e informarle del procedimiento al que será sometido. 5.-Colocar adecuadamente al paciente; sentado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyará el brazo sobre la mesa colocando una almohadilla bajo el codo y la palma de la mano hacia .arriba. 6.-Verificar el material a utilizar; tubos, jeringas torniquete, torundas etc. 7.-Pedir al paciente que abra y cierre el puño para palpar mejor las venas. 8.-Seleccionar una avena adecuada para la punción. Evitar tomar la muestra en el brazo donde hay catéter. No extraer sangre de la misma extremidad utilizada para la administración intravenosa de medicamentos, líquidos o transfusiones. Si no existe otro sitio disponible, asegurarse que la punción venosa se localiza por debajo del catéter IV. Evitar las áreas edematosas, FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA paralizadas o el mismo lado de una masectomía, al igual que las infecciones y problemas cutáneos. La punción venosa causa infección, alteraciones circulatorias o retraso en la cicatrización. 9.- Desinfectar el sitio de punción con una torunda con alcohol al 70%, con movimientos en espiral comenzando por el sitio que se puncionará y prosiguiendo hacia fuera, dejar que la zona se seque y no tocar con ningún objeto que no haya sido esterilizado previamente. 10.- Aplicar el torniquete varios centímetros arriba de la zona de punción, este no se dejará más de un minuto. 11.- Fijar firmemente la vena por encima y por debajo del sitio de punción con ayuda de los dedos pulgar y medio o índice y pulgar de la mano izquierda. 12.- Realizar la venopunción; a) Penetrar a través de la piel con la aguja formando un ángulo de 15º entre el brazo y la aguja con el bisel hacia arriba, seguir la dirección de la vena con la aguja. b) Introducir la guja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias al paciente. c) Si se usa jeringa, tirar del émbolo hacia atrás con tensión lenta y uniforme, a medida que la sangre fluye en su interior, este movimiento no debe ser muy rápido ya que se puede bemolizar la sangre o colapsar la vena. d) Si se utilizan tubos al vacío, en cuanto la aguja haya penetrado la vena, se dirigirá el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujeción, al mismo tiempo sujetar tenuemente la aguja en su lugar. Se debe permitir que el tubo al vació se llene hasta la marca indicada. 13.-Retirar la ligadura tirando del extremo doblado después de obtener el volumen de sangre deseado. 14.-Colocar un pedazo de algodón seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rápido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante. 15.-Pedir al paciente que presione firmemente el algodón durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma. 16.-Mezclar por inversión suave la sangre 15 veces (cuando el tubo colector tiene anticoagulante). 17.-Si la hemorragia de la punción continúa durante un tiempo prolongado, eleve el área y aplique una curación con presión. Observe al paciente y verifique si no ha ingerido anticoagulante o ácido acetilsalicílico. Si el paciente se marea o tiende al desmayo, haga que coloque la cabeza entre las rodillas o se acueste y pídale respirar profundamente. Aplique una toalla fría en al cabeza o parte posterior del cuello. En caso que permanezca inconsciente, notifique de inmediato al médico tratante. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 18.-Los hematomas se previenen con una técnica adecuada que consiste en evitar que la aguja atraviese la vena, liberar el torniquete antes de extraer la aguja, aplicación de suficiente presión sobre el sitio de la punción y al mantener la extremidad extendida hasta que se detenga la hemorragia.

PROCEDIMIENTO PARA PUNCION CAPILAR: 1.-Si la punción se realizará a un RN éste debe ser inmovilizado 2.-seleccionar el sitio de punción 3.- en adultos el sitio adecuado para la punción capilar es el pulpejo del dedo mediano o anular, cerca del borde, en niños el lóbulo de la oreja, y en RN el talón del pie 4.-Se recomienda el lavado clínico de manos y uso de guantes si es necesario 5.-realizar la asepsia de la zona 6.-introducir la lanceta de 2 a 2.5 mm con un movimiento rápido 7.-presionar para extraer la cantidad necesaria de sangre desechando la primera gota 8.-depositar la muestra en capilar o laminilla. 9.-realizar hemostasis en el sitio de punción y proteger con gasa estéril 10.- verificar confort del RN 11.- si se presenta dificultades durante la punción se recomienda repetirla, sobre todo cuando la muestra es insuficiente y se ha exprimido excesivamente la zona de punción, ya que puede sufrir una hemodilución por el líquido hístico.

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CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el objeto de usar sangre total en los estudios de bioquímica clinica? 2. Explica porque es importante el ayuno de determinadas horas para las diferentes pruebas clínicas. 3. ¿Qué entiende por hemostasis? 4.Una muestra de sangre capilar obtenida del talon de un bebe,¿Para que estudio se emplea generalmente? 5.Mencione algunas de las precauciones que se deben tomar al trabajar con muestras sanguíneas y ¿Por qué? FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Practica 3 Cuantificación de glucosa INTRODUCCIÓN

El estudio del metabolismo de la glucosa es esencial para poder apreciar las variaciones en la concentración sanguínea de la glucosa que pueden reflejar alteraciones primarias del metabolismo de los carbohidratos al igual que ser manifestaciones secundarias que acompañan otras enfermedades. Absorción y digestión. Las enzimas (amilasas disacáridos) liberadas por las glándulas salivales, el intestino delgado y el páncreas escinden el almidón, que es el polisacárido más importante de los hidratos de carbono que se ingieren, y los disacáridos (maltosa, lactosa y sacarosa), a hexosas (glucosa, fructuosa y galactosa) o pentosas. Los FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA monosacáridos son absorbidos por el intestino delgado por difusión (gradiente de concentración) y por transporte activo (sodio dependiente), pasando la mayor cantidad a la sangre portal para su transporte al hígado. Las enfermedades gastrointestinales que reducen la superficie de absorción o las enzimas descritas, disminuyen la absorción de las hexosas. La tiroxina acelera la absorción de las hexosas de tal manera que las alteraciones y enfermedades de la función tiroidea, al igual que la función adrenocortical, pueden afectar la velocidad y cantidad de hexosas absorbidas. El metabolismo periférico de los carbohidratos puede considerarse casi por completo en términos de glucosa, ya que la utilización de fructuosa y galactosa por los tejidos extra hepáticos es mínima. Tras la absorción de la glucosa a la sangre, los niveles normales de ayunas, que oscilan entre 60 y 90 mg/100 ml de sangre, se elevan a 120-150 mg/100 ml o incluso más. En los sujetos normales, estos niveles de glucosa bajan en seguida de sus valores máximos, de manera que tras 1 hora y 30 min a 2 horas, se vuelvan a alcanzar los niveles que en ayunas. Sin embargo el diabético es incapaz de utilizar de manera eficiente la glucosa administrada y los niveles hematicos después de la ingestión de glucosa retornan al nivel basal solo después de un periodo prolongado de tiempo. La constancia de la concentración de glucosa entre las comidas, se obtiene a través de de un equilibrio entre la utilización hística de la glucosa y la glucogenólisis. Una parte de la glucosa sanguínea la convierte el hígado en glucógeno (glucogénesis). Otra parte se utiliza directamente para obtener energía, pero la mayor parte de la glucosa derivada de la digestión de los carbohidratos de la ingesta es convertida en grasa. El azúcar de la sangre es la glucosa, que proviene de tres fuentes: 1) De la digestión de los almidones y azucares que produce azúcar que es absorbido en el intestino; 2)De la conversión de precursores no carbohidraticos en la glucosa, por ejemplo, aminoácidos, produce intermediarios de la escisión de la glucosa (ácidos láctico, piruvico y succínico), y glicerol derivado de la hidrólisis de la grasa neutra; y 3) De la glucogenolisis (hidrólisis del glucógeno depositado en el hígado). La glucosa continuamente filtrada por los glomérulos, vuelve en su totalidad a la sangre ya que es absorbida a nivel de los túbulos renales. La capacidad de los túbulos renal es para reabsorber la glucosa (fosforilización) está limitada por la concentración enzimática de las células tubulares y se realiza a razón de unos 250 mg/100 ml. Por tanto, la glucosuria puede aparecer con hiperglucemia. En individuos con función renal normal, la glucosuria ocurre cuando la concentración de glucosa en sangre excede los 160 gr/100 ml. Esto se describe como el umbral renal de glucosa. Sin embargo, los defectos en el túbulo renal pueden causar glucosuria en presencia de normo glucemia. La glucosuria de origen renal la originan defectos congénitos o adquiridos como consecuencia de enfermedades. Los diabéticos con enfermedad renal pueden tener un , apareciendo entonces la glucosuria solamente cuando la concentración de la glucemia sobrepasa los 250 mg/100 ml. Una clasificación de la diabetes se expone en la siguiente tabla:

*Primaria *De origen endocrino Hiperpituitarismo Hiperadrenalismo FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Hipertiroidismo *Destrucción de los islotes pancreáticos *Miscelánea Temperatura con clorotiacidas Stress, cirugía y embarazo Ayuno prolongado y la ingesta pobre en hidratos de carbono Pruebas de selección. Las pruebas para la detección de la diabetes mellitus en la población comprenden determinaciones de la glucosa en la sangre y orina. Glucosa en la orina Glucemia en ayunas Glucemia postprandial a las 2 horas Curva de tolerancia

Determinaciones en sangre Glucosa: (Técnica de Hultman con ortotoluidina) 1. Fundamento La ortotodulina reacciona específicamente con las aldohexosas en solución acética caliente, para formar una mezcla en equilibrio de glicosilamina y la correspondiente base Schiff. El color verde formado es proporcional a la cantidad de glucosa presente. 2. Material y apartados Sustancias Ortotoludina Ticurea Acido acético glacial Dextrosa Acido benzoico Reactivos Ortotoludina 100ª Solución de glucosa 10 mg en 1 ml Preparación de reactivos FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Reactivo 100 a: Tiourea Acido acético glacial

1.5 g 60 ml 940ml

Disolver la tiourea en acido acético glacial y agregar la ortotoludina Solución de glucosa10 mg en 1 ml Dextrosa 10 g Acido benzoico 0.2 por ciento c.b.p. 1000 ml Disolver yaforar Método Material biológico: Suero, plasma, líquido cefalorraquídeo u orina Tecnica: a) En un tubo de ensaye de 16 por 150 mm, medio 0.1 ml de suero, plasma, liquido cefalorraquídeo u orina b) Agregar 5 ml de reactivo de ortotodulina y mezclar c) Tapar los tubos y colocarlos en baño maria durante 10 minutos d) Enfriar en baño de hielo durante 10 minutos e) Leer en longitud de onda de 630 micras contra blanco de reactivos antes de que trascurran 30 min

Calibración De la solución de glucosa 10 mg en 1 ml medir 5, 7.5, 10, y 20 ml en matraces volumétricos de 10 ml y aforar. Esas soluciones contienen 50, 75, 100, 150 y 200 mg de glucosa en 100 ml Matraz aforado Mililitros de Agua destilada Mililitros en 100 de 100 ml solución de c.b.p. ml glucosa 10 mg en un ml 1 5.0 100 50 2 7.5 100 50 3 10.0 100 100 4 15.0 100 150 5 20.0 100 200 De cada una de estas diluciones tomar 0.1 ml y proseguir como se indica en la técnica a partir del paso b) Cálculos En caso de que no se disponga de curva de calibración, se puede proceder de la manera siguiente: Trabajar, al mimso tiempo que el problema, un estanndar que contega 1 mg de glucosa en 1 ml y seguir la misma técnica que se indico antes. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA D.O.ProblemaD.O.Estandar x 100 = mg por ciento de glucosa D.O. = Densidad óptica Valores normales 70 – 100 mg / 100 ml 80 – 120 mg / 100 ml Es importante consultar los valores normales de acuerdo a la técnica empleada y el laboratorio , pues estos varian de uno a otro. Cuestionario. 1. ¿para que sirve una prueba de cuantificación de glucosa? 2. ¿ cual es el espécimen que generalmente se emplea para esta determinación . 3. ¿ cuantos tipos de deabetes conoce.? 4. Si un paciente no se presenta en ayunas ¿se veria aletrado su resultado y porque? 5. Mencione las diferentes determinaciones de glucosa que nos sirven para determinar si un paciente es diabético.

Practica 4 Examen general de Orina Introducción: El examen de orina con fines diagnósticos se ha practicado durante siglos y probablemente es el más antiguo de los procedimientos de laboratorio que hoy en día se usan en medicina. Los antiguos dieron mucha importancia a las características de la orina en la enfermedad. La escuela de medicina de Hipócrates en el siglo V a.C. probablemente contaba con enseñanzas anteriores. Hipócrates se dio cuenta que la cantidad de orina debe ser proporcional a la cantidad de bebidas ingeridas y algo más densa que el liquido ingerido. Distinguió entre los cambios de orina que se producen por una enfermedad generalizada, una observación que más tarde seria elogiada por Galeno , en la edad media también se realizaban estudios en orina en que se involucraban 20 colores , tres densidades y cuatro zonas para predecir el curso de una enfermedad. Entre 1210-1280 Saliceto relaciono la retracción del riñón con

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA los cambios en la orina, pero fue hasta el siglo XVIII con el desarrollo de la química y fisiología en que el estudio de la orina paso de un mito a una ciencia. Durante muchos año fue transcurriendo el empleo de la orina y sus componentes como base del diagnostico clínico, pero fue en 1863 que Neubauer y Vogel al igual que Hipócrates en el siglo V a C. exhortaron a los médicos “provistos de los métodos más nuevos y más simples para el análisis, puede descubrir la presencia de componentes anormales y darse cuenta de la presencia de una enfermedad renal o de otras enfermedades”. Este principio tiene vigencia aun en nuestros días. La orina es un líquido acuoso transparente y amarillento, de olor característico (sui géneris), secretado por los riñones y eliminado al exterior por el aparato urinario. En los laboratorios clínicos se abrevia u o uri (del latín urinam). Después de la producción de orina por los riñones, esta recorre los uréteres hasta la vejiga urinaria donde se almacena y después es expulsada al exterior del cuerpo a través de la uretra, mediante la micción.

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Funciones de la orina Las funciones de la orina influyen en la homeostasis como son::

1. Eliminación de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo celular como la urea. 2. Eliminación de sustancias tóxicas como la ingesta de drogas. 3. El control electrolítico, regulando la excreción de sodio y potasio principalmente.

4. Regulación hídrica o de la volemia, para el control de la tensión arterial. 5. Control del equilibrio ácido-base. 6. Eliminación de sustancias tóxicas como la ingesta de drogas. 7. El control Eliminación de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo celular como la urea. 8. electrolítico, regulando la excreción de sodio y potasio principalmente.

9. Regulación hídrica o de la volemia, para el control de la tensión arterial. 10. Control del equilibrio ácido-base. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Composición de la orina En los seres humanos la orina normal suele ser un líquido transparente o amarillento. Se eliminan aproximadamente 1,4 litros de orina al día. La orina normal contiene un 96% de agua, un 4% de sólidos en solución y aproximadamente 20 g de urea por litro. Cerca de la mitad de los sólidos son urea, el principal producto de degradación del metabolismo de las proteínas. El resto incluye nitrógeno,cloruros, cetosteroides, fósforo, amonio, creatinina y ácido úrico. Composición de la orina en mg/100 ml de fluido - Urea: 2.0 - Ácido úrico: 0.05 - Sales inorgánicas: 1.50 La orina puede ayudar al diagnóstico de varias enfermedades mediante el análisis de orina o el urocultivo.

Contenidos anormales de la orina

Los cristales de urato de amonio son anormales solo si se encuentran en orinas recién emitidas.



Glucosuria: Es la presencia de glucosa en la orina y aparece sobre todo en la diabetes mellitus.



Hematuria: Es la presencia de sangre en la orina, debiendo descartarse: infección urinaria,litiasis urinaria, glomerulonefritis, neoplasia (cáncer de vejiga, uréter, riñón, próstata, etc.)



Bacteriuria: Es la presencia de bacterias en la orina, cuando normalmente es estéril.



Piuria: Es la presencia de pus en la orina.

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 

Proteinuria: Es la presencia de proteínas en la orina como suele observarse en: glomerulonefritis, infección urinaria, intoxicaciones, diabetes, etc.

Producción de la orina Se divide en los siguientes pasos: 1. Filtración: Tiene lugar en una de las múltiples nefronas que hay en los riñones, concretamente en los glomérulos. La sangre, al llegar a las nefronas, es sometida a gran presión extrayendo de ella agua, glucosa, aminoácidos, sodio, potasio, cloruros, urea y otras sales. Esto equivale a, aproximadamente, el 20% del volumen plasmático que llega a esa nefrona, es aproximadamente 180 litros/día, que es 4,5 veces la cantidad total de líquidos del cuerpo, por lo que no se puede permitir la pérdida de todos estos líquidos, pues en cuestión de minutos el individuo acusaría una deshidratación grave. 2. Reabsorción: Cuando este filtrado rico en sustancias necesarias para el cuerpo pasa al túbulo contorneado proximal, es sometido a una reabsorción de glucosa, aminoácidos, sodio, cloruro, potasio y otras sustancias. Esta equivale, aproximadamente, al 65% del filtrado. Aunque la mayor parte se absorbe en el túbulo contorneado proximal, este proceso continúa en el asa de Henle y en el túbulo contorneado distal para las sustancias de reabsorción más difícil. Los túbulos son impermeables al filtrado de la urea. 3. Secreción: En el túbulo contorneado distal ciertas sustancias, como la penicilina, el potasio e hidrógeno, son excretadas hacia la orina en formación. Después el cerebro manda una señal para cuando esté lista la orina.

Términos relacionados 

Anuria, falta de producción de orina.



Oliguria, disminución del volumen de orina por debajo del normal (1,4 l/dia).



Retención urinaria, imposibilidad de eliminación de la orina acumulada en la vejiga urinaria.

Usos La orina como fertilizante contiene nutrientes útiles para las plantas como grandes cantidades de nitrógeno en forma de urea y una pequeña cantidad en forma de ácido úrico. También

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA contiene potasio además de otros nutrientes necesarios en menor cantidad como el magnesio y el calcio todos ellos de asimilación rápida. La orina por si sola no es una solución nutriente completa, por ejemplo para usar en hidroponía pues carece de fósforo, en caso de ser usada debería complementarse, por ejemplo, con guano. La

composición

de

la

orina

varía

según

la

alimentación.

La

producida

por

animales herbívoros suele ser más alcalina, contiene más potasio y menos nitrógeno y es la más adecuada para usar como fertilizante. La de los humanos contiene más sodio, que las plantas no necesitan en grandes cantidades por lo que podría perjudicarlas. El nitrógeno se encuentra principalmente en forma de urea, que se convierte bastante rápido en amoníaco. Si la concentración es excesiva puede perjudicar a las plantas. Los microorganismos del suelo convierten parte en nitratos y nitritos. A pesar del asco que produce la orina es un líquido estéril como el semen o la sangre y contiene menos bacterias que la saliva o lasheces por lo que sólo en caso que el animal esté enfermo esta puede ser fuente de enfermedades. Es posible almacenarla durante un tiempo para que la subida del pH al formar amonio, mate los posibles patógenos. Aunque al poco tiempo de ser expulsada la orina huele muy fuerte a amoníaco, al utilizarla como abono en dosis adecuadas no debería oler. Las plantas y los microorganismos lo deben absorber. Ya en la antigüedad era costumbre utilizar la orina para lavarse los dientes. Este tipo de orinoterapia la observaron los romanos, por ejemplo, cuando conquistaron la península Ibérica entre los pueblos del norte (cántabros, galaicos, etc.). De hecho, la orina deLusitania llegó a convertirse en un bien muy preciado en la metrópoli romana, en donde se comercializaba a buen precio, aunque esta se usaba principalmente para blanquear la ropa.

Razones por las que se realiza el examen Un análisis de orina se puede hacer: •

Como parte de un examen médico de rutina para detectar los signos iniciales de una enfermedad.

•

Si la persona tiene signos de diabetes o enfermedad renal, o para vigilar si está recibiendo tratamiento para tales afecciones

•

Para verificar la presencia de sangre en la orina

•

Para diagnosticar infecciones urinarias

Otras afecciones por las cuales se puede realizar el examen son:

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA •

Uropatía obstructiva aguda bilateral

•

Síndrome nefrítico agudo

•

Necrosis tubular aguda

•

Uropatía obstructiva aguda unilateral

•

Alcalosis

•

Síndrome de Alport

•

Nefropatía por analgésicos

•

Anorexia nerviosa

•

Enfermedad renal ateroembólica

•

Mixoma auricular

•

Cálculos en la vejiga

•

Uropatía obstructiva bilateral crónica

•

Glomerulonefritis crónica

•

Infección urinaria crónica o recurrente

•

Insuficiencia renal crónica

•

Uropatía obstructiva unilateral crónica

•

Uretritis crónica

•

Infección complicada de las vías urinarias (pielonefritis)

•

Síndrome nefrótico congénito

•

Cistinuria

•

Delirio

•

Demencia

•

Demencia de origen metabólico

•

Diabetes insípida central

•

Nefropatía/esclerosis diabética

•

Enuresis

•

Epididimitis

•

Retraso en el desarrollo

•

Glomeruloesclerosis focal y segmentaria

•

Síndrome de Goodpasture

•

Insuficiencia cardíaca

•

Síndrome urémico hemolítico (HUS)

•

Púrpura de Henoch-Schoenlein

•

Diabetes mellitus insulinodependiente (DMID)

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA •

Nefropatía por IgA (enfermedad de Berger)

•

Lesión del riñón y del uréter

•

Nefritis intersticial

•

Vejiga irritable

•

Insuficiencia cardíaca izquierda

•

Nefritis lúpica

•

Hipertensión maligna (nefroesclerosis arteriolar)

•

Nefropatía quística medular

•

GN membranoproliferativa I

•

GN membranoproliferativa II

•

Nefropatía membranosa

•

Mielomeningocele (niños)

•

Vasculitis necrosante

•

Síndrome nefrótico

•

Diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID)

•

Orquitis

•

Cáncer de ovario

•

Hemoglobinuria paroxística nocturna (HNP)

•

Poliquistosis renal

•

GN posestreptocócica

•

Azotemia prerrenal

•

Amiloidosis primaria

•

Cáncer de la próstata

•

Prostatitis aguda

•

Prostatitis crónica

•

Prostatitis abacteriana

•

Pielonefritis aguda

•

Glomerulonefritis (semilunar) rápidamente progresiva

•

Nefropatía por reflujo

•

Necrosis papilar renal

•

Acidosis tubular renal distal

•

Acidosis tubular renal proximal

•

Trombosis de la vena renal

•

Eyaculación retrógrada

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA •

Rabdomiólisis

•

Insuficiencia cardíaca derecha

•

Amiloidosis sistémica secundaria

•

Incontinencia urinaria de esfuerzo

•

Lupus eritematoso sistémico

•

Esclerosis sistémica (esclerodermia)

•

Púrpura trombocitopénica trombótica

•

Lesión traumática de la vejiga y la uretra

•

Ureterocele

•

Estenosis o estrechez uretral

•

Uretritis

•

Granulomatosis de Wegener

•

Tumor de Wilms

El estado de nutrición, el estado de los procesos metabólicos y la capacidad del riñón para manejar selectivamente las sustancias que recibe son los tres factores principales que determinan la composición de la orina. En un adulto normal, unos 1.200 ml de sangre pasan por el riñón en un minuto. La composición de la orina es urea, sodio cloro, acido úrico, potasio, pequeñas cantidades de azúcar, metabolitos intermediarios como el acido oxálico, piruvico y cítrico ácidos grasos libres e indicios de colesterol, así como cantidades pequeñas de colesterol. Existen también hormonas y aminas biogenéticas que son reflejo metabólico y endocrino. En general la composición de la orina refleja la capacidad de los riñones para retener o excretar los diferentes elementos necesarios, productos fina les o tóxicos para el organismo. El examen de orina puede considerarse desde dos puntos de vista generales: el diagnostico y tratamiento de la enfermedad renal del aparato urinario y la detección de enfermedades metabólicas o sistémicas que no están directamente relacionadas con el riñón. La orina puede también ser investigada para detectar metabolitos de fármacos.

Muestra de orina. El volumen necesario depende del número de pruebas que van a efectuarse, deben conservarse refrigeradas sino se van a analizar inmediatamente, deben estar libres de contaminación fecal y vaginal. El examen de orina comprende tres aspectos:

Físico

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Químico Microscópico

Dentro del examen físico se determina: Color: amarillo claro, amarillo oscuro, café, rojizo, etc. Olor: característico Aspecto: transparente, turbio, hemorrágico, etc. Sedimento. Escaso, abundante, etc. Densidad: que se determina en el refractómetro por capilaridad, leyendo en la primera escala de la izquierda. Turbidez: que está dada por células, cristales, bacterias, blastosporas, leucocitos, eritrocitos, la mucina no da turbidez. El examen químico que se puede llevar a cabo manualmente, con tiras reactivas o automatizado. Fundamento de las tiras reactivas. 1. pH.la mezcla de los colorantes rojo de metilo y azul de bromotimol, permite obtener pH de 5 a 9, coloraciones que varían de amarillo verde y azul. 2. Proteínas. El indicador de tetrabromofenol azul tiene color amarillo, que en presencia de proteínas cambia de verde amarillento a azul verde. La solución amortiguadora de acetato que tiene la zona reactiva permite mantener el pH constante. 3. Glucosa. La glucosa oxidada reacciona con la glucosa presente en la orina, con la eliminación de 2 átomos de hidrogeno, los que se combinan con el oxigeno atmosférico y forman peróxido de hidrogeno (H₂O₂), el que en presencia de peroxidasa oxida la ortotoluidina que pasa de incolora a color azul, proporcional a la cantidad de glucosa presente. 4. Acetona. El acido acético con nitroprusiato de sodio y en presencia de acido amino acético forman un complejo colorido. 5. Hemoglobina. La hemoglobina de la sangre catalíticamente desdobla el peróxido de hidrogeno con la liberación de oxigeno, el cual oxida la ortotoluidina, con formación de color azul. Examen microscópico. Este se lleva a cabo revisando el sedimento, obtenido después de centrifugar la orina, en un microscopio, se buscan células, mucina, bacterias, leucocitos (numero /campo) eritrocitos, cilindros, zoospermos, tricomonas, etc.

Material • Tiras reactivas • Tubo de ensaye • Portaobjetos • Cubreobjetos • Pipetas Pasteur FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Centrifuga Microscopio

Material biológico •

Orina (preferentemente de la primera micción de la mañana)

Procedimiento. 1. Observar las características físicas de la muestra dentro del recipiente de recolección. 2. Colocar en un tubo de ensaye orina, hasta 1 cm del borde. 3. Medir la densidad. 4. Introducir la tira reactiva y leer según especificaciones del fabricante. 5. Centrifugar, decantar el sobrenadante y hacer el examen microscópico del sedimento.

Valores normales: • • • • • • • • • • • •

Volumen : 800 – 1500 ml en 24 horas Densidad : 1.003 – 1.030 pH : 6 – 7 Albumina: no contiene Glucosa : no contiene Cuerpos cetonicos. No contiene Hemoglobina: no contiene Bilirrubinas: no contiene Urobilinogeno. 0 – 4 mg en 24 horas Leucocitos : menos de 10 por campo Eritrocitos : 0 – 1 por campo Cilindros : no contiene

Cuestionario: 1. ¿Cuál es la importancia de un análisis de orina? 2. ¿a que se asocia la presencia de glucosa en la orina? 3. Si en una muestra de orina encontramos hemoglobina ¿que nos sugiere? FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 4. La presencia de +++ de bacterias en orina ¿Qué significa? 5. Mencione cuales serian las condiciones de una muestra de orina normal.

Practica 5

Determinación de Proteínas totales FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Las proteínas son biomoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. El nombre proteína proviene de la palabra griega πρωτεῖος ("proteios"), que significa "primario" o deldios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar. Por sus propiedades físico-químicas, las proteínas se pueden clasificar en proteínas simples (holoproteidos), que por hidrólisis dan solo aminoácidos o sus derivados; proteínas conjugadas (heteroproteidos), que por hidrólisis dan aminoácidos acompañados de

sustancias

diversas,

por desnaturalización y

y

proteínas

desdoblamiento

de

derivadas, las

anteriores.

sustancias Las

formadas

proteínas

son

indispensables para la vida, sobre todo por su función plástica (constituyen el 80% del protoplasma deshidratado

de

toda

célula),

pero

también

por

sus

funciones biorreguladora (forma parte de las enzimas) y de defensa (losanticuerpos son proteínas).1 Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan: 

Estructural. Ésta es la función más importante de una proteína



Inmunológica (anticuerpos),



Enzimática (sacarasa y pepsina),



Contráctil (actina y miosina).



Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH,



Transducción de señales (rodopsina) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Protectora o defensiva (trombina y fibrinógeno)

Las proteínas están formadas por aminoácidos los cuales a su vez están formados por enlaces peptídicos para formar esfingocinas. Las proteínas de todos los seres vivos están determinadas mayoritariamente por su genética (con

excepción

de

algunos péptidos

antimicrobianos de síntesis

no

ribosomal), es decir, la información genética determina en gran medida qué proteínas tiene una célula, un tejido y un organismo. Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El conjunto de las proteínas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.

Características Los prótidos o proteínas son biopolímeros, están formadas por gran número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran tamaño, cuando

estas

moléculas

siempredispersiones

se

dispersan

en

un disolvente adecuado,

coloidales, con características

que las

diferencian

forman de las

disoluciones de moléculas más pequeñas. Por hidrólisis, las moléculas de proteína se dividen en numerosos compuestos relativamente simples, de masa molecular pequeña, que son las unidades fundamentales constituyentes de la macromolécula. Estas unidades son los aminoácidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína. Todas las proteínas tienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, y casi todas poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el contenido de nitrógeno representa, por término medio, 16% de la masa total de la molécula; es decir, cada 6,25 g de proteína contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición de N de la misma. La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las directrices de la información suministrada por losgenes. Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen (una porción de FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA ADN) mediante el código genético. Aunque este código genético especifica los 20 aminoácidos "estándar" más la selenocisteína y —en ciertos Archaea— la pirrolisina, los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula, o como parte de mecanismos de control. Las proteínas también pueden trabajar juntas para cumplir una función particular, a menudo asociándose para formar complejos proteicos estables.

Funciones Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas: 

Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes;



Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;



La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre;



Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o agentes patogenos;



Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada;



La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo durante la contracción;



El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén.

Funciones de reserva. Como la ovoalbúmina en el huevo, o la caseína de la leche.

Estructura

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Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia de aminoácidos. Para el estudio de la estructura es frecuente considerar una división en cuatro niveles de organización, aunque el cuarto no siempre está presente. Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional: 

Estructura primaria.



Estructura secundaria. 

Nivel de dominio.



Estructura terciaria.



Estructura cuaternaria.

A partir del nivel de dominio sólo las hay globulares

Propiedades de las proteínas FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 

Solubilidad: Se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y débiles estén presentes. Si se aumenta la temperatura y el pH, se pierde la solubilidad.



Capacidad electrolítica: Se determina a través de la electroforesis, técnica analítica en la cual si las proteínas se trasladan al polo positivo es porque su molécula tiene carga negativa y viceversa.



Especificidad: Cada proteína tiene una función específica que está determinada por su estructura primaria.



Amortiguador de pH (conocido como efecto tampón): Actúan como amortiguadores de pH debido a su carácter anfótero, es decir, pueden comportarse como ácidos (donando electrones) o como bases (aceptando electrones).

Desnaturalización : Desnaturalización de proteínas Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentración,

agitación

molecular

o

variaciones

bruscas

de temperatura,

la solubilidad de las proteínas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitación. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformación globular se rompen y la proteína adopta la conformación filamentosa. De este modo, la capa de moléculas de agua no recubre completamente a las moléculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre sí dando lugar a grandes partículas que precipitan. Además, sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo. Las proteínas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseñadas, en resumen, no son funcionales. Esta variación de la conformación se denomina desnaturalización. La desnaturalización no afecta a los enlaces peptídicos: al volver a las condiciones normales, puede darse el caso de que la proteína recupere la conformación primitiva, lo que se denomina renaturalización. Ejemplos

de

desnaturalización

son

la leche cortada

como

consecuencia

de

la

desnaturalización de la caseína, la precipitación de la clara de huevo al desnaturalizarse la ovoalbúmina por efecto del calor o la fijación de un peinado del cabello por efecto de calor sobre las queratinas del pelo.

Clasificación FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Según su forma Fibrosas: presentan cadenas polipeptídicas largas y una estructura secundaria atípica. Son insolubles en agua y en disoluciones acuosas. Algunos ejemplos de éstas son queratina, colágeno y fibrina Globulares: se caracterizan por doblar sus cadenas en una forma esférica apretada o compacta dejando grupos hidrófobos hacia adentro de la proteína y grupos hidrófilos hacia afuera, lo que hace que sean solubles en disolventes polares como el agua. La mayoría de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas y proteínas de transporte, son ejemplos de proteínas globulares. Mixtas: posee una parte fibrilar (comúnmente en el centro de la proteína) y otra parte globular (en los extremos). según su composición química Simples: su hidrólisis sólo

produce

aminoácidos.

Ejemplos

de estas

son

la insulina y el colágeno (globulares y fibrosas). Conjugadas o heteroproteínas:

su

hidrólisis

produce

aminoácidos

y

otras

sustancias no proteicas con un grupo prostético Fuentes de proteínas Las fuentes dietéticas de proteínas incluyen carne, huevos, soya, granos, leguminosas y productos lácteos tales como queso o yogurt. Las fuentes animales de proteínas poseen los 20 aminoácidos.

Las

fuentes

vegetales

son

deficientes

en

aminoácidos y se dice que sus proteínas son incompletas. Por ejemplo, la mayoría de las leguminosas típicamente carecen de cuatro aminoácidos incluyendo el aminoácido esencial metionina, mientras los granos carecen de dos, tres o cuatro aminoácidos incluyendo el aminoácido esenciallisina.

Calidad proteica Las diferentes proteínas tienen diferentes niveles de familia biológica para el cuerpo humano. Muchos alimentos han sido introducidos para medir la tasa de utilización y retención de proteínas en humanos. Éstos incluyen valor biológico, NPU (Net Protein Utilization), NPR (Cociente Proteico Neto) y PDCAAS FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA (Protein Digestibility Corrected Amino Acids Score), la cual fue desarrollado por la FDA mejorando el PER (Protein Efficiency Ratio). Estos métodos examinan qué proteínas son más eficientemente usadas por el organismo. En general, éstos concluyeron que las proteínas animales que contienen todos los aminoácidos esenciales (leche, huevos, carne) y la proteína de soya son las más valiosas para el organismo. Reacciones de reconocimiento 

Reacción de Biuret

El reactivo de Biuret está formado por una disolución de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos delnitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, lo que produce una coloración rojo-violeta. 

Reacción de los aminoácidos Azufrados

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. 

Reacción de Millon

Reconoce residuos fenólicos, o sea aquellas proteínas que contengan tirosina. Las proteínas se precipitan por acción de los ácidos inorgánicos fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar. 

Reacción xantoproteica

Reconoce grupos aromáticos, o sea aquellas proteínas que contengan tirosina o fenilalanina,

con

las

cuales

el ácido

nítrico forma compuestos nitrados amarillos. Deficiencia de proteínas Deficiencia de proteínas en el tercer mundo La deficiencia de proteína es una causa importante de enfermedad y muerte en FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA eltercer mundo. La deficiencia de proteína juega una parte en la enfermedad conocida como kwashiorkor. La guerra, la hambruna, lasobrepoblación y

otros

factores

incrementaron

la

tasa

de malnutrición y deficiencia de proteínas. La deficiencia de proteína puede conducir a una inteligencia reducida o retardo mental. La malnutrición proteico calórica afecta a 500 millones de personas y más de 10 millones anualmente. En casos severos el número de células blancas disminuye, de la misma manera se ve reducida drásticamente la habilidad de los leucocitos de combatir una infección. Deficiencia

de

proteínas

en

países

desarrollados La

deficiencia de proteínas es rara en países desarrollados pero un pequeño número de personas tiene dificultad para obtener suficiente proteína debido a la pobreza. La deficiencia de proteína también puede ocurrir en países desarrollados en personas que están haciendo dieta para perder peso, o en adultos mayores quienes

pueden

convalecientes,

tener

una

dieta

recuperándose

de

pobre.

Las

cirugía,

personas trauma

o

enfermedades pueden tener déficit proteico si no incrementan su consumo para soportar el incremento en sus necesidades. Una deficiencia también puede ocurrir si la proteína consumida por una persona está incompleta y falla en proveer todos los aminoácidos esenciales.

Exceso de consumo de proteínas Como el organismo es incapaz de almacenar las proteínas, el exceso

de

proteínas

en azúcares o ácidos

grasos.

es

digerido

El hígado retira

y

convertido

el nitrógeno de

los aminoácidos, una manera de que éstos pueden ser consumidos como combustible, y el nitrógeno es incorporado en la urea, la sustancia que es excretada por los riñones. Estos órganos normalmente pueden lidiar con cualquier sobrecarga adicional, pero si existe enfermedad renal, una disminución en la proteína frecuentemente será prescrita. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA El exceso en el consumo de proteínas también puede causar la pérdida de calcio corporal, lo cual puede conducir a pérdida de masa ósea a largo plazo. Sin embargo, varios suplementos proteicos vienen suplementados con diferentes cantidades de calcio por ración, de manera que pueden contrarrestar el efecto de la pérdida de calcio. Algunos sospechan que el consumo excesivo de proteínas está ligado a varios problemas: 

Hiperactividad del sistema inmune.



Disfunción hepática debido a incremento de residuos tóxicos.



Pérdida de densidad ósea; la fragilidad de los huesos se debe a que el calcio y la glutamina se filtran de los huesos y el tejido muscular para balancear el incremento en la ingesta de ácidos a partir de la dieta. Este efecto no está presente si el consumo de minerales alcalinos (a partir de frutas y vegetales [los cereales son ácidos como las proteínas; las grasas son neutrales]) es alto.

En tales casos, el consumo de proteínas es anabólico para el hueso. Muchos investigadores piensan que un consumo excesivo de proteínas produce un incremento forzado en la excreción del calcio. Si hay consumo excesivo de proteínas, se piensa que un consumo regular de calcio sería capaz de estabilizar, o inclusive incrementar, la captación de calcio por el intestino delgado, lo cual sería más beneficioso en mujeres mayores.[1] Las proteínas son frecuentemente causa de alergias y reacciones alérgicas a ciertos alimentos. Esto ocurre porque la estructura de cada forma de proteína es ligeramente diferente. Algunas pueden desencadenar una respuesta a partir del sistema inmune, mientras que otras permanecen perfectamente seguras. Muchas personas son alérgicas a la caseína (la proteína en la leche), al gluten (la proteína en el trigo) y otros granos, a la proteína particular

encontrada

en

el maní o

aquellas

encontradas

en mariscos y otras comidas marinas.

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Es extremadamente inusual que una misma persona reaccione adversamente a más de dos tipos diferentes de proteínas, debido a la diversidad entre los tipos de proteínas o aminoácidos. Aparte de eso, las proteínas ayudan a la formación de la masa muscular, para todas aquellas personas que les guste hacer ejercicio, en cuyo caso se recomienda la pechuga de pollo salcochado debido al alto índice de proteína que tiene (no se debe consumir la grasa).[3] Análisis de proteínas en alimentos El clásico ensayo para medir concentración de proteínas en alimentos es el método de Kjeldahl. Este ensayo determina el nitrógeno total en una muestra. El único componente de la mayoría de los alimentos que contiene nitrógeno son las proteínas (las grasas, los carbohidratos y la fibra dietética no contienen nitrógeno). Si la cantidad de nitrógeno es multiplicada por un factor dependiente del tipo de proteína esperada en el alimento, la cantidad total de proteínas puede ser determinada. En las etiquetas de los alimentos, la proteína es expresada como el nitrógeno multiplicado por 6,25, porque el contenido de nitrógeno promedio de las proteínas es de aproximadamente 16%. El método de Kjeldahl es usado porque es el método que la AOAC International ha adoptado y por lo tanto es usado por varias agencias alimentarias alrededor del mundo

Proteinas totales en suero Es una medición aproximada de todas las proteínas encontradas en la porción líquida de la sangre. Esta prueba examina específicamente la cantidad total de dos clases de proteínas: albúmina y globulina. Las proteínas son partes importantes de todas las células y tejidos. Por ejemplo, la albúmina ayuda a mantener un cierto tipo de presión arterial, impidiendo que el líquido se escape fuera de los vasos sanguíneos.

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se hace para diagnosticar problemas nutricionales, enfermedad renal o enfermedad hepática. Si la proteína total es anormal, se tienen que realizar exámenes adicionales para identificar el problema específico.

Valores normales El rango normal es de 6.0 a 8.3 gm/dl (gramos por decilitro). Los valores normales pueden variar levemente entre laboratorios.

Significado de los resultados anormales Los niveles superiores a los niveles normales pueden deberse a: •

Inflamación o infección crónica, incluyendo VIH y hepatitis B o hepatitis C

•

Mieloma múltiple

•

Enfermedad de Waldenstrom Los niveles inferiores a los normales pueden deberse a:

•

Agamaglobulinemia

•

Sangrado (hemorragia)

•

Quemaduras (extensas)

Determinación de proteínas totales Técnica de Biuret Fundamento: las proteínas dan coloración violeta en presencia de iones cúpricos en solución alcalina, proporcional a la cantidad de proteínas presentes. La reacción es del enlace peptidico de las proteínas.

Material • Cloruro de sodio • Sulfato de cobre • Tartrato de sodio y potasio • Hidróxido de sodio • Yoduro de potasio • Acido clorhídrico FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA • •

Fenoftaleina Sulfato de sodio

Preparación de reactivos. Cloruro de sodio 0.85% 115 a Cloruro de sodio 85g Agua c.b.p. 1000 ml Disolver y aforar Reactivo de Biuret 115 b Sulfato de cobre 1.5 g Tartrato de sodio y potasio 6g Yoduro de potasio 1g Agua c.b.p. 1000 ml En un matraz volumétrico de 1000 ml poner el sulfato de cobre y el tartrato de sodio y potasio, agregar aproximadamente 500 ml de agua destilada y agitar hasta disolución; agregar con agitación constante 300 ml de hidróxido de sodio 2.5N y mezclar. Agregar el yoduro de potasio y agitar hasta disolución. Aforar a 1 litro y conservar en frasco oscuro. La estabilidad del reactivo es grande, pero debe descartarse si se forma un precipitado negro ó rojizo. Hidróxido de sodio 1.5 N Hidróxido de sodio 100 g Agua libre de CO₂ c.b.p. 1000ml Disolver y aforar.. Diluir 20 ml de esta solución a 100 ml y titular con acido clorhídrico 0.5 N; usando fenoftaleina como indicador. Para 20 ml de la dilución anterior deben gastarse 20 ml de la solución de acido clorhídrico 0.5N. Sulfato de sodio 26.8 % Sulfato de sodio Agua c.b.p. Disolver y aforar

268 g 1000 ml

Material biológico 1.0 ml de suero sanguíneo

Técnica: 1. En un tubo de ensaye poner 9.5 ml de cloruro de sodio al 0.85% y 0.5 ml de suero problema, agitar para mezclar 2. En otro tubo de ensaye poner 2 ml de la muestra diluida. 3. En otro tubo que servirá de blanco poner 2 ml de cloruro de sodio 0.85%. 4. A cada tubo agregar 8 ml de reactivo de Biuret y mezclar por inversión FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA 5. Dejar 30 minutos a temperatura ambiente y leer a una longitud de onda de 540 µm o filtro 540. 6. Ajustar el % de trasmitancia con blanco de reactivos.

Valores normales Proteínas totales

6 a 8 g / 100 ml de suero.

Cuestionario 1. ¿ para que nos sirve la determinación de proteínas totales? 2. ¿ a que puede deberse un nivel por arriba de los valores normales de proteínas totales.? 3. ¿ cuales son las 2 clases de proteínas que generalmente se cuantifican? 4. ¿ cual es el fundamento de la técnica de Biuret.? 5. ¿ como se clasifican las proteínas?

Practica 7

Determinación de hierro INTRODUCCIÓN

El elemento hierro es esencial para la mayoría de los organismos vivientes. El hierro es un componente fundamental de muchas enzimas y pigmentos transportadores de oxigeno. En el organismo fácilmente sufre procesos de oxidación y reducción; por ello, el hierro es un constituyente importante de las enzimas que participan en el trasporte de electrones. La distribución de hierro en el organismo es como sigue: Hemoglobina Mioglobina Citocromo Catalasa Ferritina Siderofilina

900 mg 40 0.8 5 3 7.5 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Hierro orgánico total Hierro restante

3.900 300

Solamente del 11 al 14 % de la ingesta de hierro (12 a 18 mg al día) se absorbe en el aparato gastrointestinal. Sin embargo, en los estados que cursan con deficiencia de hierro y durante el crecimiento y embarazo se produce un aumento en la retención normal de este mineral de cerca de 2 ó 3 veces. El hierro es expulsado a través de la piel, por el sudor y la exfoliación de las células escamosas, a través de las heces y la orina, y en la mujer por menstruación. El embarazo origina una perdida materna de aproximadamente 280 mg que van a parar al feto y 100 mg durante el momento del parto. La lactancia constituye otra perdida materna de hierro. El proceso de la regulación de la absorción del hierro a través del intestino es prácticamente desconocido. El hierro, sin embargo, se absorbe en la porción superior del intestino delgado directamente a la sangre. Cuando el hierro atraviesa la mucosa intestinal pasa a la sangre donde rápidamente se una a la trasferrina. El hierro tras su absorción va a parar en gran parte a la medula ósea, hígado y en cantidades más pequeñas a otros tejidos. Aproximadamente el 25 % de hierro del organismo se encuentra en los depósitos como ferritinas y hemosiderinas. Estos representan la reserva disponible para cuando surja la necesidad. Fundamento de la determinación de hierro. Se libera el hierro de las proteínas a estas se les precipita, después se añade al filtrado una solución de bathophenantrolina, sustancia que forma un compuesto coloreado con el hierro , la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de hierro. Material. • Agua libre de Fe • HCl • Acido tricloroacetico • Acido tioglicolico al 80 % • Acetato de sodio • Bathophenentrolina Preparación de los reactivos. 1. Acido clorhídrico: 0.2 N.0.67 ml de acido clorhídrico concentrado y agua libre de Fe c.b.p. 100 ml. 2. Acido tricloroacetico al 30 %: 30 g de acido tricloroacetico agua libre de Fe c.b.p. 100 ml. 3. Acido tioglicolico, solución de 10 mg / 100 ml: sulfato ferroso amónico..En un matraz aforado poner una pequeña cantidad de agua libre de Fe y después 0.15 ml de acido sulfúrico concentrado, disolver y aforar a 100 ml. 4. Solución de bathophenantrolina al 0.02% : 20 mg de bathophenantrolina y alcohol isopropilico c.b.p. 100 ml 5. Solución saturada de acetado de sodio. En un tubo, poner 2 ml de agua libre de Fe y se añade hasta la mitad de este volumen acetato de sodio, se agita hasta que ya no se disuelvan algunos cristales que quedan en el sedimento. Material biológico. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Se toman de 7 a 9 ml de sangre venosa y se colocan en 2 tubos de ensaye sin anticoagulante. La toma de la muestra debe ser en ayunas y entre 7 y 9 de la mañana. Se centrifuga la sangre dentro de las 2 horas que siguen a la toma de la muestra y se separa el suero el cual debe estar libre de hemolisis. Técnica. 1. Se ponen 2 ml del suero en un tubo de ensaye. 2. Se agregan 3.0 ml del HCl 0.2 N y una gota del acido tioglicolico al 80 % y se mezcla 3. Se deja reposar 30 minutos 4. Se mezcla con un agitador de cristal hasta que se disuelvan los grumos. 5. Se deja reposar 15 – 30 minutos a temperatura ambiente, manteniendo el tubo tapado con papel parafilm. 6. Se centrifuga a 2000 r.p.m. durante 15 minutos, se decanta el sobrenadante. 7. Se ponen 4.0 ml en una celda del espectrofotómetro 8. Se agregan 0.5 ml de la solución saturada de acetato de sodio 9. Se mezcla y agregan 2.0 ml de la solución de bathophenentrolina al 0.02% 10. Se agita se deja reposar 15 minutos a temperatura ambiente. 11. Se lee la absorvancia a una longitud de3 onda de 535 µm , después de ajustar a cero con un blanco que tiene todos los reactivos y en lugar de suero 2.0 ml de agua destilada.

Calibración: No. de matraz de 100 ml

1 2 3 4

Sol. Con 10 mg de Fe ml 0.5 1.5 2.0 3.0

agua c.b.p.

Conc. en mg %

ml 100 100 100 100

50 100 200 300

Se procede con el contenido de cada matraz como si fuera suero. D.O. del problema x 200 = microgramos de Fe/ 100 ml de suero D.O. del estándar La reacción colorida sigue la ley de Beer hasta la concentración de 300 mg en 100 ml; si el valor es mayor se usa 1.0 ml de suero y el resultado se multiplica por 2. Valores normales: Hombres 60 – 185 meg / 100 ml Mujeres 65 – 180 meg / 100 ml FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

Cuestionario: 1. ¿Cómo encontramos el hierro en el organismo? 2. ¿a qué padecimientos está ligada la ausencia de hierro? 3. ¿Cuál es la vía de absorción de hierro? 4. ¿Cuál es el fundamento de la técnica para cuantificación de hierro? 5. ¿porque usar agua libre de Fe en esta determinación?

Practica 8 TGO TGP INTRODUCCIÓN En los procesos de análisis clínicos que involucren directamente al tejido hepático, resulta de gran utilidad el determinar los niveles sericos de Transaminasas , como lo son la alanina aminotransferasa (ALT ó TGP) y la aspartato aminotransferasa (AST ó TGO), ya que comparando los valores de actividad ALT v/s AST, es posible determinar el origen hepático, ó en su defecto cardiaco , al observar alteraciones en estos patrones enzimáticos. Por otro lado , resulta muy útil para diferenciar hepatitis alcohólicas de otras hepatitis agudas, esto relacionando AST/ALT: En las hepatitis alcohólicas(con necrosis) este índice es generalmente mayor a 1 (AST aumentada por sobre ALT), mientras que en las hepatitis virales es generalmente menor a 1 (AST disminuida ante ALT). En fin cualquiera que sea el caso , la determinación de estas enzimas adquiere importancia diagnóstica cuando sus valores son enfrentados con valores de otras enzimas de similar origen tisular, permitiendo así completar un perfil enzimático de órganos como el hígado. MÉTODO DE REFERENCIA Y DE RUTINA TGO (AST, ASPARTATO AMINOTRANFERASA) METODO DE IFCC (FEDERACION INTERNACIONAL DE QUIMICA CLINICA) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Descripción. La Aspartato aminotransferasa es una enzima que se encuentra localizada tanto a nivel citoplasmático como mitocondrial, de allí que se diga que es una enzima bilocular , se encuentra ampliamente distribuida en músculo esquelético, riñón , cerebro y principalmente en higado y corazón, donde esta en mayor concentración.Cualquier alteración en estos tejidos, se vera reflejado en un aumento en el torrente circulatorio de esta enzima, el cual será directamente proporcional al daño tisular. En aquellos pacientes con afecciones hepáticas se observan las mayores elevaciones de AST, sobre todo en aquellos casos de hepatitis con necrosis. Fundamento. La reacción es catalizada por la TGO (AST), ésta desplaza la reacción hacia la formación de Oxaloacetato que reacciona con la MDH (Malato Deshidrogenasa), de modo que la velocidad de oxidación del NADH medida a 340 nm, es directamente proporcional a la actividad de TGO en la muestra. En el medio de reacción hay además LDH (Lactato Deshidrogenasa) suficiente para consumir los cetoácidos de origen endógeno, evitando así su interferencia. Reacción. TGO L-aspartato + 2-oxoglutarato Oxalacetato + L-glutamato Oxalacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+ MDH Muestra. •

Suero, Plasma (Heparinizado, EDTA).

•

Muestras hemolizadas no se aceptan ya que poseen elevados niveles de AST dentro de los eritrocitos.

Linealidad. Si el cambio por minuto de absorbancia excede de 0.160 (340nm y 334 nm) ó 0.080 (365), diluir la muestra 1+ 4 con suero fisiológico. Multiplicar el resultado por 5. La absorbancia inicial debe ser superior a 0.8 A. En caso de no serlo se puede estar en presencia de actividades enzimáticas muy elevadas y obtener resultados erróneos. Diluir la muestra y reprocesarla. Metodología de Análisis. *Lectura: Hg 365 nm, 340 nm, 334 nm. *Paso Óptico: 1 cm. *Temperatura: 37°C. *Medición: Contra aire. Los reactivos y cubetas deben ser llevados a la temperatura del ensayo, la que debe mantenerse constante durante el desarrollo del test. Valores Normales. 37°C (U/L) Hombre

Hasta 37 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA Mujer

hasta 31

Ventajas. •

Simple y Rápido

Desventajas. •

Resulta imposible o poco práctico modificar las mezclas reactivas preestablecidas.

•

Sueros hemolizados dan valores falsamente aumentados.

•

Los sueros con concentraciones de cetoácidos endógenos elevados generan valores

falsos elevados. •

Pacientes hemodializados o con hipovitaminosis u otras patologias asociadas con déficit de Piridoxal Fosfato (coenzima), generan valores falsamente disminuídos.

Consideraciones. •

A mayor temperatura se obtiene mayor sensibilidad , pero un menor rango de linealidad .

•

La preincubación con parte del reactivo es para evitar interferencia con cetoacidos endógenos del suero.

•

El Piridoxal fosfato es una coenzima necesaria en la actividad de la TGO, por ello esta última se ve afectada en ausencia de la misma. ejemplo: pacientes hemodializados o con hipovitaminosis.

•

Para evitar contaminación de reactivos , usar pipetas nuevas y no intercambiar las tapas de los reactivos. MÉTODO DE RUTINA Y REFERENCIA. TGP (ALT, ALANINA AMINOTRANFERASA) METODO IFCC (FEDERACION INTERNACIONAL DE QUIMICA CLINICA)

Descripción. La alanina aminotranferasa es una enzima que tiene como única localización el citoplasma , de ahí que se le denomine unilocular. Su mayor actividad la presenta en el tejido hepático y la menor actividad en músculo esquelético, corazón, riñón, páncreas y eritrocitos (en ese orden). Por lo tanto la destrucción o cambio en la permeabilidad de membrana celular provoca la liberación de ALT a la circulación sanguínea. Su aumento se debe principalmente a alteración hepática (como colestiasis, hepatitis tóxicas o virales). En hepatitis viral el aumento de ALT precede a la aparición de ictericia, si los valores están aumentados por sobre 6 semanas, nos debe hacer pensar en una hepatitis activa o el comienzo de una hepatitis crónica. Fundamento. La reacción catalizada por ALT esta desplazada hacia al formación de piruvato, que reacciona inmediatamente con la LDH (Lactato Deshidrogenasa), de modo que la velocidad de oxidación del NADH, medida a 340 nm, es proporcional a la actividad de ALT en la muestra. El exceso de LDH en el medio es para consumir cetoácidos de origen endógeno, evitando así su interferencia. Reacción. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA TGP L-alanina + 2-oxoglutarato Piruvato + L-glutamato Piruvato + NADH + H L-lactato + NAD+ LDH Muestra. Suero, plasma heparinizado o EDTA. El oxalato , la heparina no inhiben la actividad enzimática , pero pueden causar cierta turbidez. La ALT es estable en suero durante 3 dias a temperatura ambiente y hasta una semana a 4°C.En la orina se encuentra poca o ninguna actividad, por lo cual no se recomienda para el análisis. Porcentaje de pérdida de actividad. Refrigerada

10%

Hasta 25°C

17%

Linealidad. Si el cambio por minuto de absorbancia excede de 0.160 (340 nm y 334 nm) ó 0.080 (365 nm), diluir la muestra 1 + 4 con suero fisiológico. Multiplicar el resultado por 5. La absorbancia inicial debe ser superior a 0.80 A. En el caso de no serlo se puede estar en presencia de actividades enzimáticas muy elevadas y obtener resultados erróneos. Diluir la muestra y reprocesarla. Valores de referencia. 37°C (U/L) Hombre

Hasta 40

Mujer

Hasta 31

Metodología de análisis. •

Lectura: Hg 365 nm, 340 nm, 334 nm.

•

Paso Óptico: 1 cm.

•

Temperatura: 37°C.

•

Medición: contra aire.

Los reactivos y cubetas deben ser llevados a la temperatura del ensayo, la que debe mantenerse constante durante el desarrollo del test. Ventajas. •

Simple y Rápido.

•

El uso de buffer TRIS nos permite que el NADH sea más estable que en otros métodos que usan fosfato.

•

El piridoxal 5-Fosfato(PP) es un activador más efectivo de la ALT en buffer Tris que en el de fosfato. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA •

Este método tiene una alta especificidad , carencia de interferencias, alta linealidda, reproductibilidad y rapidez.

Desventajas. •

Sueros hemolizados generan valores falsos elevados, debido a que el eritrocito contiene 3 a 5 veces más ALT que el suero.

•

Sueros con concentraciones de cetoácidos endogenos elevados generan valores falsamente elevados.

Consideraciones.

•

Muestras de pacientes hemolizadializados o con hipovitaminosis u otras patologías asociadas

con déficit de Piridoxal Fosfato generan valores falsamente disminuidos. •

A mayor temperatura , mayor sensibilidad, pero menor rango de linealidad .

•

Una absorvancia inicial bajo 0,800 D.O., estando reactivos en condiciones, indica una muestra con muy alta actividad de TGP. Por lo tanto es necesario diluir la muestra.

•

Cuando la técnica se realiza como ensayo de punto final, la reacción presenta un efecto de retroinhibición por piruvato, este disminuye la linealidad.

•

No es conveniente modificar la formulación de un fabricante luego de adquirir los reactivos. MÉTODOS ALTERNATIVOS.

Método de Reitman y Frankel. Esta es una reacción acoplada con dinitrofenilhidrazina (DNPH). Es una técnica colorimétrica y cuantitativa. Reacción. Alanina + cetoglutarato Glutamato + Piruvato Piruvato + DNPH Complejo formado por Pir-DNP-Hidrazona. La lectura se hace a 505 nm. Es una reacción de punto final. Es necesario un tiempo de retardo de la reacción con cetoglutarato, lo que permite el consumo de cetoglutarato endógeno y todo otro proceso que consuma NADH. Este retardo no debe ser inferior a 90 segundos. Muestra. •

Suero.

Método de Wrodlewski y LaDue. Este es un método enzimático cuantitativo. Alanina + cetoglutarato Glutamato + Piruvato LD Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ Esta es una medición del consumo de NADH a 340 nm. Es de uso muy frecuente. La diferencia con el método de referencia es que este método requiere un tiempo de retardo no inferior a 90 segundos antes de la reacción con cetoglutarato para FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA permitir el consumo de cetoglutarato endogeno y todo otro proceso que consuma NADH. Además se recomienda un período de preincubación de 10 minutos con el cofactor piridoxal-5-fosfato. Muestra. •

Suero MÉTODO ALTERNATIVO. (método propuesto por la AACC)

A propuesto un método para los laboratorios pequeños de Química Clínica, el cual se diferencia del de la IFCC en que: 1.- Se emplea un solo reactivo para evitar el procedimiento en dos pasos. 2.- La reacción se lee después de 150 segundos , durante los 180 segundos siguientes. 3.- No se agrega Fosfato de Piridoxal. Cuestionario 1. ¿Para que nos sirve la determinación de TGO y TGP.? 2. ¿Con que otro nombre se conocen TGO y TGP respectivamente? 3. Mencione como se altera la relación TGO, TGP en casos e hepatitis viral y como en hepatitis cirrótica 4. ¿ Porque no se emplea suero hemolisado para la determinación de estas enzimas? BIBLIOGRAFIA Título: Procedimientos Técnicos de Laboratorio Clínico Autor : Instituto de Salud Pública de Chile Editorial: El Instituto Santiago de Chile 1994 Título: Química Clínica Autor: Anderson, Shauna C.

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LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

Practica 9 Proyecto fina Determinación de glucosa posprandial

La determinación de glucossa posprandial es un estudio que nos sirve para conocer la asimilación de glucosa en un paciente , y así determinar si esta propenso a diabetes. La prueba consiste en tomar una muestra en ayunas ,en la cual se valorara o determinara el nivel de azúcar basal. Posteriormente el paciente tomara un desayuno rico en azúcar(malteada, hot-cakes, pastel, jugo,etc.) siempre y cuando no sea diabético o tenga alguna dieta indicada por su medico, anotan el tiempo en que empieza a desayunar. Al cumplir 2 horas de haber desayunado se le tomara una nueva muestra, se determinara glucosa y se hara el estudio y conclusiones obtenidos de dichos valores.

Procedimiento. El alumno haciendo uso de los conocimientos adquiridos en este curso, toma de muestra, realización de la cuantificación de glucosa, material necesario, etc. Podrá entregar resultados. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS