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• Juanes Gallego

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PRÁCTICAS DE LABORATORIO BIOLOGÍA CELULAR Coordinadora Astrid Eliana Cuartas Cuartas

FACULTAD DE EDUCACIÓN UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA 2018

PRÁCTICAS DE LABORATORIO: BIOLOGÍA CELULAR INTRODUCCIÓN La asignatura de Biología celular contribuye de manera objetiva a que los estudiantes consoliden su concepción científica del mundo, desarrollando la capacidad de razonamiento abstracto mediante la comprensión y aplicación de métodos científicos, en el estudio de los fenómenos que ocurren a nivel celular. Además, se busca que reafirmen la importancia que tiene el estudio de la célula para desarrollar investigaciones en función de sus intereses y necesidades, siendo capaces de valorar el significado su futura actividad profesional. Asimismo, se contribuye a la formación de valores éticos y morales, al buen hábito de adquirir conocimientos de forma independiente y a la creatividad; permitiendo reforzar el trabajo en colectivo durante las prácticas de laboratorio, con un nivel de actualización en correspondencia con el desarrollo de la ciencia y la innovación tecnológica. El objetivo fundamental de las prácticas de Biología Celular es entonces, desarrollar habilidades mediante la utilización de técnicas propias del trabajo en el laboratorio, identificando al microscopio algunas estructuras celulares, para aplicar los conocimientos a situaciones concretas en su futura labor, a la vez que se contribuye a la comprensión de procesos celulares, función de los orgánulos celulares, estableciendo a su vez, diferencias entre los tipos de células. Cuando se ingresa a un laboratorio, lugar dedicado a la realización de pruebas y experimentos, es importante asumir una actitud adecuada para dicho espacio. En este lugar debe estar presente la curiosidad y la duda; la mente debe permanecer atenta y procesar los estímulos que los sentidos perciben. A diferencia de quienes han empleado la observación de la naturaleza para capturar leyes nuevas, como estudiantes estará expuesta o expuesto a la comprobación de dichas leyes a través de los experimentos que se realicen. Por esta razón, es necesario conocer a fondo los fundamentos que soportan las leyes que se pondrán en observación. Las pruebas y los experimentos siempre tienen un propósito y en la mayoría de los que se van a realizar, se tratará de aprender algún procedimiento que sirva como herramienta en el estudio del funcionamiento de los seres vivos a nivel celular y molecular. Sería una pérdida de tiempo ingresar al laboratorio desconociendo los propósitos u objetivos de la práctica. Llegar al laboratorio sin saber qué se va a hacer y por qué no solo es angustiante, aburrido e inútil, sino que priva de la oportunidad de programar el cerebro para el reconocimiento rápido de observaciones importantes, para el análisis lógico de dichas observaciones y para

la actuación coherente y eficaz, con respecto a un correcto procesamiento mental de la información. Por tanto, es importante estar preparado para cada práctica de laboratorio. Para el buen aprovechamiento de las prácticas se recomienda leer previa y completamente la guía de cada sesión. A continuación, se mencionan la lista de materiales habituales, que deberán tenerse a la mano en todas las prácticas de laboratorio: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Guía del laboratorio correspondiente Bata de laboratorio Sacudidor o trapo de limpieza Pañuelos faciales (Ejemplo: kleenex, no papel higiénico) Guantes quirúrgicos Gafas (opcional) Marcador indeleble Cinta de enmascarar Libreta de apuntes Lápiz y borrador

Cada práctica de laboratorio requiere de otros materiales que se encuentran en la programación completa para el semestre, en el anexo 1. Algunos equipos básicos y material de vidrio de laboratorio:

Microscopio

Estereoscopio

Material de vidrio

Recuerde revisar en algunos libros de química el nombre de materiales de uso frecuente y sus funciones.

PLANEACIÓN DE PRÁCTICAS PARA EL SEMESTRE Resulta relevante introducir conceptos y técnicas básicas del quehacer diario en un laboratorio de Biología Celular, a la luz del desarrollo actual de este campo del saber. Para ello se ha diseñado una serie de actividades prácticas organizadas en 13 sesiones consecutivas: Práctica #

1y2

Fecha

Título de la práctica Diversidad celular y Células sanguíneas (respectivamente)

3 Identificación de compuestos orgánicos en la saliva humana 4

Ósmosis en glóbulos rojos. Observación de los fenómenos de plasmólisis y turgencia.

5

Permeabilidad celular. Acción de los compuestos orgánicos sobre su estructura.

6

Transporte de iones a través de la membrana celular Distribución de enzimas digestivas I (Extracción sistema digestivo)

7 Distribución de enzimas digestivas II (Realización de los experimentos) 8

Enzimas respiratorias y sus funciones

9

Glucólisis anaeróbica. Acción inhibitoria del proceso.

10

Fotosíntesis

11

Cromosomas politénicos.

12

Extracción de ADN a partir de sangre periférica por el método de salting out

13

Electroforesis

Cada sesión, está estructurada en cuatro momentos: 1. Quiz o preguntas de diagnóstico, 2. Introducción teórica de los conceptos más importantes y básicos de la práctica, 3. Desarrollo de la práctica, que consta de actividades y experimentos en equipos y 4. Cierre y conclusiones – preguntas de revisión de aprendizajes. Asimismo, al final de cada guía de laboratorio, se podrá encontrar un cuestionario que ayudará a sistematizar los aspectos prácticos más relevantes.

NORMAS DEL LABORATORIO Los estudiantes deberán estudiar previamente la guía de la práctica de laboratorio correspondiente y han de cumplir con las indicaciones que en dicho instructivo se expresen; tales como haber leído determinados temas, llevar materiales habituales (incluye uso obligatorio de la bata) o cualquier otro material requerido para la práctica. Utilizar siempre la bata de laboratorio, evitará que en un momento dado ciertas sustancias químicas entren en contacto directo con la piel y con las prendas de vestir. Es necesaria la puntualidad a la clase ya que antes de comenzar se hará una explicación teórica del contenido de la misma y en algunos casos preguntas de comprobación o diagnóstico. En algunas sesiones se realizará quiz individual. El tiempo límite de tolerancia para entrar al laboratorio será de 10 minutos, pasados estos minutos se cerrará la puerta. En el laboratorio se trabaja con sustancias que pueden ser tóxicas o nocivas, así como muestras biológicas, lo que hace recomendable que se lave las manos al llegar y antes de salir. En lo posible utilice zapatos cerrados y sin tacón, se trata de trabajar con el mayor confort y seguridad posibles. No está permitido el consumo de ningún tipo de alimento durante el desarrollo de la práctica, tampoco fumar ni maquillarse dentro del laboratorio El uso de guantes, tapabocas y lentes de protección es opcional en la mayoría de los casos, pero es su obligación emplearlos si va a manipular muestras biológicas potencialmente peligrosas para su salud. Pero si en la guía de laboratorio se requiere, debe usarse de manera obligatoria. Si tiene cabello largo es conveniente que lo lleve recogido, disminuirá la superficie de contacto de su cuerpo que estará expuesta a sustancias o elementos peligrosos. Además, se debe evitar el uso de accesorios o alhajas que interfieran con un desempeño cómodo de su trabajo en el laboratorio. Reconozca el lugar donde se encuentran las canillas, dispositivos de seguridad y la salida del laboratorio, es información vital en caso de accidentes. Siempre que realice una práctica debe saber por qué la hace y cómo la hará y para ello, debe llegar conociendo previamente las sustancias y los elementos que va a

manipular, los riesgos que representan y las medidas que tomará en caso de accidentes. Adicionalmente, esto ahorrará tiempo y trabajo. Si en algún momento es víctima o testigo de un accidente, mantenga la calma y avise inmediatamente a la profesa o a la monitora. Cuando reciba diversas sustancias asegúrese de que cada recipiente o frasco que las contiene posee su correspondiente rótulo, no querrá mezclar sustancias equivocadas y exponerse a una situación singularmente sorpresiva. No utilice nunca la boca para succionar sustancias líquidas con las pipetas. Las botellas de reactivos contienen pictogramas y frases que informan sobre su peligrosidad, uso correcto y las medidas a tomar en caso de ingestión, inhalación, etc. La ficha de datos de seguridad, proporciona información complementaria sobre las características propias de cada sustancia.

Si va a emplear material de vidrio debe averiguar con la profesora o la monitora del laboratorio, si éste es resistente al calor o no. No todos los recipientes de vidrio pueden ser usados para calentar sustancias. Adicionalmente, no olvide emplear pinzas para manipularlos o guantes resistentes al calor con la misma finalidad. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. Durante las prácticas, el uso de teléfonos celulares está restringido. Tampoco se permite el empleo de audífonos ni dispositivos o reproductores de música, que

aíslan al estudiante y no permiten la interacción normal con la profesora, la monitora, ni su interacción con el grupo. Si necesita hacer uso del celular pida permiso para abandonar momentáneamente el aula y sólo si es una situación de fuerza mayor. Al ser una actividad docente formal ello implica que debe estar atento a las explicaciones y a los sucesos que ocurren en el laboratorio, además hay que cuidar los recursos de uso común, evitando llamados de atención por manipular éstos sin el consentimiento del docente. Cada estudiante tendrá asignado un puesto en el laboratorio y un equipo óptico, del cual se hará responsable durante todo el semestre, por tanto, debe recordar el código del equipo y completar el formato de préstamo al iniciar y al terminar. Cualquier defecto o falla del equipo deberá comunicarse de inmediato y consignarse por escrito. De otro modo, los daños sufridos por el equipo que sean indicados posteriormente por otros usuarios se atribuirán al último usuario del equipo que no informó sobre los mismos. Asimismo, una vez terminada la práctica el lugar de trabajo debe quedar perfectamente organizado y revisado por la monitora. De la misma manera, cada estudiante será responsable del cuidado y preservación de toda muestra, o instrumental que se le suministre, los cuales deberán ser devueltos al finalizar la práctica, limpios y en perfecto estado. Trabaje en grupo, sea activo y cultive su iniciativa, no espere a que sus compañeros hagan el trabajo por usted, ni cargue con el trabajo de ellos, en ese sentido, es necesario cultivar el sano hábito de la comunicación y la expresión de sus ideas sin imposición, escuchando al mismo tiempo las de los demás. Se debe asistir a todas las sesiones de laboratorio. En caso de no poder asistir deberá presentar por escrito una excusa con los debidos soportes. Para solicitar reemplazar la práctica con el grupo de Puerto Berrío el 2 y 3 de junio de 2018. Sustancias que deben usarse con precaución 1. Ácido fluorhídrico (HF). Causa quemaduras de acción retardada en la piel, en contacto con las uñas causa fuertes dolores, y sólo si se atiende a tiempo se puede evitar la destrucción de los tejidos incluso el óseo. 2. Ácido nítrico (HNO3). Daña permanentemente los ojos en unos segundos y es sumamente corrosivo al contacto con la piel, produciendo quemaduras y manchas de color amarillo por acción sobre las proteínas.

3. Ácido sulfúrico (H2SO4), fosfórico (H3PO4) y clorhídrico (HCl). Las soluciones concentradas de estos ácidos lesionan rápidamente la piel y los tejidos internos. Sus quemaduras tardan en sanar y pueden dejar cicatrices. Los accidentes más frecuentes se producen por salpicaduras y quemaduras al pipetearlos con la boca. En caso de accidente con alguna de las anteriores sustancias, hay que comunicarlo inmediatamente al docente encargado. Lavarse inmediatamente con abundante agua la parte afectada. Si la quemadura fuera en los ojos, acudir al servicio médico más cercano después de realizar el lavado. Si fuera extensa, llevar al lesionado al chorro de agua de la regadera inmediatamente y acudir al servicio médico después. Comportamiento - No correr dentro del laboratorio. - No comer, fumar o tomar bebidas, masticar chicles y golosinas. - No maquillarse, ni cepillar el cabello. - No emplear ningún equipo de laboratorio (refrigeradores, horno microondas) para almacenar o preparar alimentos. - No se permitir la entrada de mascotas. - Cualquier accidente (material roto, derrame de sustancia, cortes, quemaduras) debe ser informado inmediatamente al docente responsable de los laboratorios. - Los usuarios no podrán invitar a otras personas a que desarrollen sus propias prácticas de laboratorio. - Mantener en funcionamiento óptimo llaves de agua y extintores. - Mantener libres de obstáculos las salidas normales y de emergencia. - Permitir el libre paso entre las mesas de trabajo y las salidas del laboratorio. - Ante una situación de urgencia mantener la calma y abandonar tranquilamente el laboratorio, sin correr, empujar o gritar. REGISTRO DE RESULTADOS El registro de los resultados de los experimentos es una parte esencial de cualquier trabajo científico. Los experimentos de laboratorio son el fundamento de nuevas hipótesis, teorías, conocimientos científicos y tecnologías, y son inútiles si no se consigna por escrito la descripción de lo que se ha hecho y observado en tal forma que permita a cualquiera, con cierto conocimiento del asunto, que repita, compruebe o corrija el trabajo realizado sin necesidad de guía especial. Las anotaciones deben ser breves y muy claras. Deben hacerse inmediatamente después de cada experimento sin confiar en la memoria un momento más de lo necesario.

Para que los experimentos de laboratorio tengan valor formativo, se aprenda a hacer observaciones exactas, se estimule la curiosidad y se desarrolle un sentido crítico basado en los aspectos cuantitativos de la ciencia, es necesario que antes de iniciar el trabajo en el laboratorio: – Revise en los textos, los principios fundamentales implicados. – Reflexione y relacione lo encontrado con otros principios o hechos previamente conocidos. – Estudie y comprenda bien las instrucciones del experimento antes de realizarlo. Es importante que la guía se conserve limpia y ordenada, para permitir la lectura fácil de las anotaciones, que deben ser una descripción completa y honesta de lo que se ha visto y hecho. Aunque los experimentos que se harán producen resultados previsibles por las teorías conocidas, cualquier resultado imprevisto, raro o incluso absurdo debe anotarse y de ningún modo llenar el protocolo con lo “que debió pasar”, pues sería una relación completamente inútil. Las afirmaciones falsas o las omisiones no enseñan nada; en cambio, el análisis concienzudo de los resultados inesperados o contrarios a lo previsto puede ser fuente de mucha información útil para el desempeño futuro en el laboratorio donde los resultados inesperados están siempre a la orden del día. Guía para los informes escritos de las prácticas de laboratorios Deberá trabajar con un grupo (constituido mínimo por tres personas, máximo por cuatro) y entregar un informe escrito de la práctica que les corresponde acorde a la guía de programación (anexo 1) y elaborado de acuerdo con las normas básicas para escritura de artículos científicos. Adicionalmente, se tendrá que ajustar dicha práctica, para presentar una propuesta de laboratorio Es importante que tengan en cuenta que la fecha de entrega de este informe no debe exceder los quince días siguientes, por el contrario, deberán esperar hasta la última fecha de entrega sin derecho a devolución para correcciones. Como una ayuda para este trabajo, a continuación, se hace una relación breve de las partes de las cuales consta dicho informe, que pueden ser identificadas rápidamente en un artículo científico. Es de vital importancia la claridad en los análisis, pues de este proceso depende que quien lea y evalué el informe (la profesora u otro jurado lector) comprenda el contenido.

Partes de un artículo científico 1. Título. El título del artículo puede ir centrado o justificado a la derecha o izquierda. Debe reflejar en forma concreta la consecución del objetivo de la práctica; es decir, debe ser coherente con lo propuesto antes y obtenido después de la práctica. Ejemplo: Si el objetivo de la práctica es… El título de dicha práctica puede ser: Determinar cualitativamente carbohidratos entonces… Determinación cualitativa de carbohidratos 2. Autores e institución de origen. Los integrantes del equipo de trabajo deben escribirse en orden alfabético, en forma continua y siguiendo este patrón: Primer apellido: todo en mayúsculas, el nombre: se escribe la inicial en mayúscula y el resto en minúsculas. Cada integrante debe ir separado del otro por “punto y coma”, hasta llegar al último que se separa por un “y”. La institución a la que pertenecen debe escribirse justo después de citar a los integrantes y debe ser lo suficientemente específica. A continuación, un ejemplo: TÍTULO CORTÉS, Iván Darío; FERNÁNDEZ, Carolina; OCAMPO, Daniel Mauricio; PÉREZ, Juliana. Universidad del Occidente– seccional Cali. Facultad de Educación. Licenciatura en Biología. Tercer semestre. Septiembre 8 de 2003 Palabras claves: prueba del Lugol, carbohidratos. 3. Fecha de recepción. La fecha, que en este caso corresponde con la fecha de entrega del informe, no debe estar precedida por ninguna suerte de título y se escribirá uno o dos espacios luego de haber finalizado la escritura de nombres e institución, tal como se muestra en el ejemplo anterior. 4. Palabras clave. Permiten la identificación rápida del contenido del trabajo en las bases de datos bibliográficos que se manejen a través de sistemas informáticos, no es un glosario y deben ser solo unas cuantas que resulten representativas (ver ejemplo del punto 2). 5. Resumen. Hace una brevísima descripción del contenido. Usualmente, cuando el artículo está escrito en un idioma diferente al inglés, también se adiciona un resumen en inglés, el cual se titula “abstract”. El resumen de un trabajo dentro de un artículo o informe describe “brevemente” lo que se hizo y lo que se obtuvo; es decir, no se incluyen detalles sobre el procedimiento, simplemente se citan las técnicas empleadas. Estos detalles deberán incluirse en otros apartados del artículo

(métodos, por ejemplo). Su extensión es breve, no debe superar la página y normalmente emplea diez líneas en promedio. El resumen debe ser redactado en forma impersonal y en pasado (Ej.: se logró extraer, se realizó, etc.). Lo que allí se incluya no debe ser extraído de fuente alguna, debe ser escrito en forma original aunque se aceptan brevísimas intervenciones textuales que resulten muy necesarias para la coherencia de las ideas. 6. Introducción. En la introducción deben quedar expuestos los antecedentes históricos y teóricos del tema estudiado. Algunos le llaman a esto “el estado del arte” refiriéndose con ello al hecho de que es en este apartado del trabajo donde se precisa lo que se ha hecho y lo que se está haciendo con respecto al tema trabajado en la práctica, lo cual es una manera de justificar el trabajo en sí mismo. Es importante que en la introducción queden incluidas las referencias bibliográficas de lo citado en el texto e igualmente es importante recordar que es aquí donde va descrito el objetivo principal del trabajo, el cual no estará precedido por título alguno ni viñeta alguna. La redacción en este caso es de tipo descriptivo e impersonal. 7. Materiales y Métodos. Describe los principales equipos, materiales y reactivos empleados en el trabajo de investigación, así como las técnicas y métodos usados para la obtención de los resultados. En general y aunque los gráficos suelen ser muy ilustrativos, no son estrictamente necesarios en esta parte a menos que las descripciones sean poco exactas y sean requeridos como apoyo. Recuerden que la metodología aquí descrita es un protocolo que otros podrían usar, así que es necesario que clarifiquen muy bien los pasos y las condiciones de realización. La metodología se debe redactar en forma impersonal y en pasado. Se les recomienda tratar de seguir el orden de la guía de laboratorio, pues les ayudará a entender mejor los procedimientos y pasos de que trate cada una de las prácticas para redactarlas en el artículo.

8. Resultados y Discusión. Hace la relación de las observaciones, datos y resultados obtenidos. En esta parte se incluyen las tablas, esquemas, gráficos y fotografías (solo las tomadas en el laboratorio realizado, no las bajadas de Internet) que permitan una clara presentación de los resultados. En cada una de las observaciones indicará a que organismo, estructura y técnica se está refiriendo. Debe aclarase siempre en el título del texto o del diagrama, la identificación de lo que se está señalando y las especificaciones de tamaño, escala y aumento, así como el equipo empleado y técnica de análisis. Pueden usarse fotografías propias. En cuanto a la discusión debemos decir que es la explicación de los resultados observados basándose en la literatura; es decir, en lo que otros ya establecieron y

publicaron y que sirve de apoyo para lo que encontramos. Aquí mismo, se hace la interpretación de los resultados, se comparan estos con otros obtenidos previamente, se discute sobre el alcance y las limitaciones de los resultados obtenidos, se formulan nuevas hipótesis, se sugiere la realización de estudios posteriores y se plantean las conclusiones. No se debe emplear la primera persona. Se deben resolver las preguntas que se plantean en guía de la práctica. 9. Referencias citadas. Aquí se relaciona la bibliografía citada en el texto del artículo. Es importante recordar que nuestro trabajo está sustentado en la literatura, en lo establecido y publicado por otros. De esta manera un buen trabajo está respaldado por buenas fuentes. Así que como mínimo para este tipo de trabajos incluyan cinco referencias. Deben tenerse en cuenta las normas APA. Las fuentes deben ser variadas y corresponder a libros-texto, artículos de revistas científicas y páginas web. Al menos dos libros texto, una revista y dos páginas web. No es aconsejable tomar todo de Internet puesto que existe mucha información en la red que ha sido puesta ahí sin revisión alguna y puede llevarnos a tomar información falsa o malinterpretada. Las referencias correspondientes a las páginas web deben corresponder al sitio preciso de donde se obtuvo la información y no del motor de búsqueda que nos llevó a ella. 10. Anexos. Suelen ser mapas conceptuales, imágenes o tablas que aportan al artículo pero que tienen una extensión igual o superior a una página.

Asesorías en horarios acordados Durante el semestre se tendrá un espacio semanal en el cual podrán discutir aquellos temas tratados en la asignatura y que han resultado particularmente complejos. En este espacio trabajarán en grupos más pequeños y con base en talleres o tareas. Es importante que se emplee adecuadamente, lo cual significa que se debe llegar con una revisión individual del tema y del taller trabajado o tareas adelantadas, implica que se debe leer antes de discutir. De la misma manera, para las asesorías de los informes de laboratorio se deben tener, como mínimo avances del artículo. Realmente este espacio NO es una clase magistral en donde normalmente los profesores hablamos y los estudiantes escuchan, se trata de una conversación guiada en donde se aclararán las dudas que surgieron durante el estudio individual o grupal de un tema en particular. Por lo anterior se sugiere que la cita sea solicitada previamente (como mínimo desde el día anterior a las 7:00 p.m.), para que la profesora programe horarios para los que la deseen. Es necesario indicar si es individual o grupal y cuál es la finalidad.

Evaluación La nota del trabajo en el laboratorio de Biología Celular corresponde al 30% de la nota total del curso. Comprendido por quices (10%), informes de laboratorio (10%) y autoevaluación, coevaluación y heteroevalaución (10%). Sin embargo, no olvide que la evaluación es un proceso permanente y formativo, por tanto, es necesario un alto compromiso de su parte para hacer más asertivo dicho proceso. También serán tenidos en cuenta punto (0.1) por preguntas en clase, participación y cumplimiento. De la misma manera, serán tenidos en cuenta la disciplina del equipo, organización del sitio de trabajo y toma de apuntes.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Chataing, B. y Nieves, E. (2009). Manual de laboratorio de biología Primera edición. Venezuela: Universidad de Los Andes. Cuervo, R.A., Gómez, R.F. y Narváez, M. (2010). Manual de Prácticas de Laboratorio de Biología. Cali: Universidad San Buenaventura. Ducolomb, Y., Fierro, R., González, C., Ortiz, R. y Rodríguez, E. (2012). Manual de prácticas de laboratorio de Biología Celular. México: Universidad Autónoma Metropolitana. Gómez, L., Ferrer, A., Naranjo, E. y Menéndez, J. (2011). Manual de Prácticas de Biología Celular. Recuperado el 10 d eenero de 2018, de: http://ecotoxicologia.uniblog.uo.edu.cu/files/2011/09/Manual-de-Pr%C3%A1cticasBiolog%C3%ADa-Celular.pdf Universidad de las Américas. (2015). Prácticas de laboratorio de Biología celular. Ingeniería en Biotecnología. Recuperado de: http://udla.edu.ec/laboratorios/wpcontent/uploads/2015/05/IBT101_BIOLOG%C3%8DA-CELULAR-INTERGARL.pdf Vega, L.F. y Ortega, C. (2013). Manual de prácticas de biología celular. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Subdirección Académica Área de Docencia de Básicas. Recuperado el 10 de enero de 2018, de: http://veterinaria.uaemex.mx/_docs/603_957_MP%20Biolog%C3%ADa%20Celular .pdf Elaboró Profesora Adriana Marcela Torres Durán

Laboratorio de Biología Celular Preparación Práctica 1: Diversidad celular: Células animales y vegetales

Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos Equipos y materiales Azul de metileno 5% Microscopios compuestos Lugol 5% recipientes con agua y goteros Verde de jano Toallas de papel absorbente cortadas Aceite de inmersión Solución Concentración Cantidad Preparación aceite de Se toma directamente del recipiente inmersión ubicado en el estante de reactivos Observaciones 1. Los estudiantes deben de traer pañuelos desechables o “kleenex” para limpiar el objetivo de 100X. 2. Se debe echar todos los recipientes o pipetas con semen en hipoclorito. Materiales que deben traer los estudiantes Por grupos los estudiantes deben traer: 1. Una cebolla 2. Un tomate 3. Una papa 4. Un banano 5. Palillos de dientes 6. Elodea 7. Pañuelos desechables o Kleenex 8. Muestras de agua de charca, río, pileta o acuario 9. Muestra de semen si se acuerda con el profesor. 10. Muestras que se deseen observar y que tengan que ver con el objetivo de la práctica. Materiales habituales 1. Guía de laboratorio 2. Bata de laboratorio 3. Sacudidor o trapo de limpieza 4. Pañuelos faciales (Ejemplo: kleenex, no papel higiénico) 5. Guantes quirúrgicos 6. Gafas (opcional) 7. Marcador indeleble 8. Cinta de enmascarar 9. Libreta de apuntes 10. Lápiz y borrador.

Práctica 1. CELULAS ANIMALES Y VEGETALES INTRODUCCIÓN La célula es un microcosmos, con límites definidos, dentro de los cuales se desarrolla continuamente una gran actividad química; constituye esencialmente un sistema complejo, organizado, dinámico y autodirigido de moléculas y agregados moleculares, que toman y emplean energía del medio que los rodea para utilizarla en fenómenos de síntesis, crecimiento y reproducción. La citología estudia las diferentes clases de células para comprender su organización y su estructura en términos de su actividad y sus funciones, y ver la célula no sólo como una entidad individual, sino también como parte integrante de los órganos y sistemas de órganos más complejos de las plantas y de los animales pluricelulares, pues el crecimiento, el desarrollo, la herencia, la evolución, el envejecimiento y la muerte no son más que diversos aspectos de la actividad celular. En 1665 Robert Hook observó por primera vez las células en un corte de corcho y fue él mismo quien les dio esta denominación. Posteriormente, en 1838, Matthias Schleiden y Theodor Schwann enunciaron la Teoría Celular, basada en el concepto de que la célula es la unidad básica de los seres vivos. Esta teoría puede resumirse en tres conceptos principales: 1. La célula es la unidad estructural de los organismos vivos; 2. Es la unidad funcional de los seres vivos; 3. Todas las células provienen de otras células preexistentes. Las estructuras celulares comunes para las células: animal y vegetal son (figura 1 y 2, respectivamente): 1. Membrana plasmática: Consta de una bicapa de fosfolípidos, carbohidratos y proteínas. Las proteínas pueden se integrales (atravesando la membrana) o periféricas ubicadas cerca de las proteínas integrales y hacia la cara citoplasmática. La membrana plasmática tiene permeabilidad selectiva, controlando el paso de partículas y sustancias hacia el interior y exterior de la célula. 2. Complejo de Golgi: Se presenta como un apilamiento de sacos aplanados, con bordes dilatados, con vesículas o cistermas ubicadas cerca de esos. En células vegetales los dictiosomas (vesículas unidas por membranas) forman el Aparato de Golgi. El complejo de Golgi es un centro de procesamiento y compactación de materiales que se mueven a través de la célula y salen de ella. Cada complejo de Golgi recibe vesículas del retículo endoplasmático, modifica sus membranas y sus

contenidos e incorpora los productos terminados en vesículas de transporte que los llevan a otras partes del sistema de endomembranas, a la superficie celular y al exterior de la célula. En pocas palabras, su función es el empaquetamiento, maduración y secreción de las proteínas que estaban almacenadas y fueron glicosiladas en el retículo endoplasmático rugoso. 3. Vacuola: Organela esférica llena de líquido, de diámetro variable, limitadas por membranas. En general, su función es la de almacenamiento. El contenido de la vacuola está integrado por agua y altas concentraciones de sales inorgánicas, azúcares y otras sustancias. En células vegetales se encuentra sólo una vacuola grande que almacena desechos. 4. Mitocondria: Son organelas cilíndricas u ovoides; hay también esféricas y en forma de Y. Allí se realizan oxidaciones de moléculas orgánicas, utilizando O2 como último aceptor de electrones, con el objeto de obtener energía química para otros procesos celulares. 5. Retículo Endoplasmático Liso o Agranular: Se presenta como una serie de casos o bolsas aplanadas y túbulos membranosos, su función es la síntesis de lípidos y de los derivados de los lípidos (quilomicrones intestinales, lipoproteínas, ácidos biliares) y también con la detoxificación celular de sustancias liposolubles (insecticidas, drogas, medicamentos, desechos industriales). 6. Retículo Endoplasmático Rugoso o Granular: Presenta una imagen semejante a la del R.E.L, es decir bolsas aplanadas y túbulos membranosos interconectados, pero se diferencia del anterior en que sus membranas están cubiertas en su superficie externa por ribosomas. Sus funciones son la circulación intracelular de sustancias que no se liberan al citoplasma y el almacenamiento y posterior glicosilación de las proteínas que sintetizaron los ribosomas que estaban adheridos a él para luego exportarlas al complejo de Golgi. 7. Lisosoma: Se presentan como vesículas esféricas u ovales, limitadas por una unidad de membrana. En el interior de estos organelos se encuentran enzimas hidrolíticas o hidrolasas, es decir, con capacidad para catalizar la degradación o digestión de diversas sustancias. 8. Ribosomas: Se presentan como cuerpos esféricos o elípticos. La función de los ribosomas es la síntesis de proteínas tanto en el citoplasma como en el retículo endoplasmático rugoso. Las proteínas sintetizadas por los ribosomas adheridos se almacenan en el retículo endoplasmático rugoso y luego son utilizadas para formar membranas citoplasmáticas o pueden ser proteínas de secreción. Las proteínas

que se sintetizan en los ribosomas libres en el citoplasma, no se glicosilan, se empaquetan y quedan en el hialoplasma. 9. Citoplasma: Es un gel casi líquido, que durante mucho tiempo fue considerado como una matriz sin estructura; sin embrago, estudios más recientes han revelado que posee un sistema de fibras que constituyen un citoesqueleto, en el cual están suspendidos los organelos y las formaciones intracelulares identificables microscópicamente. La matriz citoplasmática está compuesta por agua, iones inorgánicos y moléculas orgánicas pequeñas, macromoléculas y enzimas solubles, y las proteínas que constituyen el citoesqueleto. 10. Los plastidios. Son parte característica de las células vegetales. Cada plastidio está rodeado por una membrana doble. Dentro de esa doble membrana tenemos el estroma que es la substancia acuosa contenida en el plastidio. Los plastidios se clasifican de acuerdo al tipo de pigmento que contengan. a. Cloroplastos, contienen clorofila y pigmentos carotenoides. Es el sitio donde ocurre fotosíntesis. En los tilacoides encontramos la clorofila y pigmentos carotenoides. Un grupo de tilacoides forman las granas, estas últimas están conectadas con otras granas por tilacoides intergranas. La función de los cloroplastos es llevar a cabo fotosíntesis, pero además están envueltos en la síntesis de aminoácidos y ácidos grasos, así como proveer un espacio temporal para el almacenaje de almidón. Los cloroplastos al igual que las mitocondrias son organelos semiautonómicos ya que poseen su propio DNA y ribosomas para sintetizar sus propias proteínas. b. Cromoplastos, son plastidios pigmentado que no poseen clorofila, pero sintetizan y retienen pigmentos carotenoides. Estos son responsables de los colores amarillo, anaranjado y rojo de las flores, frutas y raíces. Los cromoplastos se desarrollan de cloroplastos ya existentes por medio de una transformación en la cual la clorofila y las membranas internas desaparecen, dando lugar a una acumulación de carotenoides. Esto ocurre, por ejemplo, al madurarse las frutas. c. Leucoplastos son plastidios no pigmentados. Entre sus funciones tenemos que algunos sintetizan almidón, estos se llaman amiloplastos, otros producen aceites y proteínas. Si los leucoplastos se exponen a la luz se convierten en cloroplastos. d. Proplastidios son plastidios sin diferenciar, pequeños, incoloros y se encuentran en áreas meristemáticas de raíces y tallos. Son los precursores de los plastidios antes mencionados. 11. Núcleo: Es el organelo más sobresaliente de la célula eucariote animal y vegetal. Puede presentar formas regulares o irregulares. Su tamaño es variable, al

igual que el número de núcleos por célula: es uno en la mayoría de las células; pueden ser dos, como en algunos hepatocitos, o muchos, como en los osteoclastos y las fibras musculares estriadas. Está constituido por una envoltura nuclear que lo limita y separa del citoplasma; el jugo nuclear, carioplasma o nucleoplasma, que es un coloide en el cual se hallan suspendidos: la cromatina, donde se halla el material genético o hereditario y el o los nucleolos, lugar de armado de los ribosomas citoplasmáticos. Las células tienen ciertos elementos estructurales comunes: Todas están encerradas por algún tipo de envoltura externa semipermeable que protege un interior fluido rico en agua, llamado citoplasma, y todas contienen material genético en forma de ADN (ácido desoxirribonucleico). En el siguiente cuadro se pueden apreciar las diferencias y semejanzas de células procarióticas y eucarióticas. Cuadro 1. Diferencias y semejanzas de células procariotas y eucariotas CÉLULA PROCARIOTE

CÉLULA EUCARIOTE CÉLULA ANIMAL

CÉLULA VEGETAL

1. Tamaño

Entre 0.5 y 5 µm de Entre 5.0 µm y hasta 75 mm. Entre 10 µm y 100 µm. diámetro. (Como es el caso del óvulo de avestruz)

2.Envoltura Nuclear

No posee envoltura nuclear, el ADN se encuentra disperso en el citoplasma.

Posee una envoltura nuclear Posee envoltura nuclear definida que contiene el DNA. definida, al igual que la célula Esta membrana tiene eucariote animal. muchos poros para dejar entrar o salir sustancias.

3. Nucleolos

No posee nucleolos.

Posee nucleolo más denso, Algunas veces posee más de para la síntesis de uno. subunidades de ribosomas.

4. Cromosomas El ADN se organiza en un Posee más de 1 solo cromosoma. cromosomas, en células de animales superiores se presenta en pares y su número depende de la especie a cuál corresponda.

Posee más de 1 cromosomas, en células vegetales se presenta en pares y su número es fijo para cada especie.

5. Pared Celular Posee una pared celular No posee una pared celular. Posee una pared celular rígida rígida, protege frente a compuesta de celulosa. daños e hinchamiento osmótico.

6. Organelas

Ribosomas (partículas -Aparato de Golgi formadas por proteínas y ácidos nucleicos que -Vacuolas pequeñas sintetizan proteínas). -Ribosomas -Lisosomas

-Aparato de Golgi -Vacuolas grandes -Ribosomas -Lisosomas

-Retículo endoplasmático liso -Retículo endoplasmático liso y y rugoso rugoso

7.Membrana.

Posee una membrana plasmática formada por una doble capa de lípidos y de proteínas.

-Mitocondrias

-Mitocondrias

-Centríolos

-Cloroplastos

Posee una membrana Posee una membrana plasmática, permite entrada o plasmática. Su forma se adapta salida de componentes a la rigidez de la pared celular. mediante multitud de transportadores específicos. Así mismo tiene muchos receptores de señales. No está relacionada con la producción de energía.

A continuación, se encuentran dos imágenes que muestran las partes de las células animal y vegetal.

FIGURA 1. Célula animal y sus partes. Tomado de: http://www.educarchile.cl/ech/pro/app/detalle?id=135197

FIGURA 2. Célula vegetal y sus partes. Tomado de: https://respuestas.tips/que-es-una-celula-vegetal/ 1. OBJETIVOS Con esta práctica se pretende que el estudiante: •

• •

Observe algunos tipos de células, tanto de animales como de vegetales. Observe estructuras celulares como pared celular, cloroplastos, amiloplastos y núcleo. Determine algunas semejanzas y diferencias entre las distintas células observadas. Se dé cuenta de la importancia de ciertos colorantes y soluciones en la identificación de estructuras y sustancias celulares.

2. MATERIALES Microscopios compuestos binoculares Portaobjetos Cubreobjetos (Laminillas) Goteros Beakers o frascos pequeños con agua Toallas de papel absorbente Beakers de 100 mililitros Aceite de inmersión Palillos de dientes

Cuchillas de afeitar nuevas Lugol al 1% Azul de metileno al 1% Bulbos de cebolla de huevo (Allium cepa), preferiblemente blanca 1 rama de Elodea (Anacharis sp.) se consigue en acuarios 1 Papa (Solanum tuberosum) 1 Tomate (Lycopersicon esculentum) 1 Banano (Musa paradisíaca) Placas permanentes de sangre humana Papel para limpiar lentes (Kleenex facial blanco) Tela suave para limpiar el microscopio Muestra de semen de cualquier tipo de animal. Lancetas, se consiguen en cualquier farmacia Recuerde: los materiales y recipientes con sangre o fluidos como semen, se depositan en los contenedores con hipolcorito y las lancetas en los guardianes rojos. ¡OBLIGATORIO el uso de guantes! 3. PROCEDIMIENTO 1. Células vegetales a. Cebolla. Tome una cebolla de huevo y divídala en ocho partes. Note que consta de varias capas o escamas. Cada capa está recubierta, en ambas superficies, por una membrana transparente formada por células epidérmicas o epiteliales. Separe una porción pequeña de la membrana externa (que es más coloreada o pigmentada que la interna), extiéndala sobre un portaobjeto, agregue una gota de solución salina al 0.7% y póngale un cubreobjetos tratando de evitar la formación de burbujas. Dibuje varias células en 10X y en 40X. ¿Qué forma tienen las células? Luego, agregue una gota de solución de Lugol a un lado del cubreobjetos y al lado opuesto ponga un pedazo de papel absorbente para facilitar la entrada del colorante a la muestra. Observe nuevamente en 10X y en 40X. Realice el montaje de una muestra de cebolla en inmersión de solución salina concentrada, que previamente preparó la monitora, luego agréguele Lugol. ¿Qué diferencia encuentra en relación con las diferentes observaciones? ¿Estas células son mononucleadas o polinucleadas? Describa lo observado en cada caso.

b. Elodea Ponga una hoja de la planta acuática elodea sobre un portaobjeto, agregue una gota del agua en la que se encuentra la planta y colóquele un cubreobjetos. Esquematice varias células en 10X y en 40X. ¿Se ve el núcleo celular? Observe detenidamente algunas células con el objetivo de 40X. ¿Se nota en ellas algún movimiento? ¿Si es así, cómo se llaman las estructuras que permiten darse cuenta de ese movimiento? ¿Qué nombre recibe ese fenómeno? ¿A qué se debe? c. Papa Con una cuchilla quítele la cáscara a un pedazo de papa. A continuación, saque porciones en forma de "palitos" de aproximadamente medio centímetro de ancho. Luego haga un corte muy delgado, transparente, en uno de los extremos y deposítelo sobre un portaobjeto, agregue una gota de agua y póngale un cubreobjetos (también puede probar haciendo raspado de papa usando un palillo). Observe que hay un gran número de estructuras transparentes, de tamaños variables y de formas más o menos ovaladas. Estas estructuras también son plastidios, como los cloroplastos. ¿Cómo se llaman? ¿Qué función tienen? ¿Además de ellos, se ven células? ¿Qué forma tienen éstas? Para hacer tinción, use la preparación con Lugol (10 agua: 1 Lugol). ¿Qué coloración toman los plastidios con la solución de Lugol? ¿Por qué se da dicha tinción? ¿El lugol será específico para la identificación de almidón o se podrá utilizar para reconocer cualquier carbohidrato? Haga un esquema de lo que se observa con el objetivo de 10X y 40X. d. Tomate Tome un tomate maduro y quítele con una cuchilla una parte de la cáscara. Con la misma cuchilla o con un palillo de dientes raspe, en forma horizontal, una pequeña porción del tejido contiguo (mesocarpio o pulpa), espárzalo sobre un portaobjeto seco, agréguele una gota de agua y póngale un cubreobjetos. Dibuje varias células en 10X y en 40X. ¿Hay estructuras diferentes a las observadas en las células anteriores? Observe unas pequeñas estructuras de color rojo, que son otro tipo de plastidios. ¿Cómo se llaman? ¿Cuál es su función? Para hacer la tinción use la preparación con Lugol (4 agua: 1 Lugol). ¿Hay algunas estructuras que se ven mejor que antes de colorear?

e. Banano Tome un banano y quítele la cáscara a un trozo, con una cuchilla raspe en forma horizontal, una pequeña porción del tejido contiguo (mesocarpio o pulpa), espárzalo sobre un portaobjeto seco, agréguele una gota de agua y póngale un cubreobjetos. Dibuje varias células en 10X y en 40X. ¿Hay estructuras diferentes a las observadas en las células anteriores? Observe unas pequeñas estructuras ¿Cómo se llaman? ¿Cuál es su función? Para hacer la tinción use la preparación con Lugol (4 agua: 1 Lugol). ¿Hay algunas estructuras que se ven mejor que antes de colorear?

FIGURA 3. Clasificación de plastidios. Tomado de: http://slideplayer.es/slide/11861095/ 2. Células animales a. Mucosa bucal Ponga una gota de agua sobre un portaobjeto. Enjuáguese la boca y con un palillo de dientes haga un raspado suave sobre la pared interna de las mejillas o carrillos. Mezcle el raspado con la gota de agua, espárzalo sobre el portaobjeto, póngale un cubreobjeto y observe con los objetivos de 10X y de 40X. ¿Qué estructuras ve en estas células?

Use para hacer tinción la preparación con azul de metileno. ¿Qué diferencias encuentra entre esta observación y la inmediatamente anterior? Dibuje, en 40X, algunas de las células observadas. b. Sangre humana La sangre está compuesta de diferentes tipos de células que se encuentran suspendidas en un líquido llamado plasma. Cada centímetro cúbico de sangre puede contener millones de estas células. Las tres formas de células sanguíneas son los eritrocitos o glóbulos rojos, los leucocitos o glóbulos blancos (que son de distintos tipos) y los trombocitos o plaquetas.

FIGURA 4. Clasificación de glóbulos rojos y blancos. Tomado de: https://es.123rf.com/photo_63173780_descripci%C3%B3n-de-los-tipos-de-c%C3%A9lulassangu%C3%ADneas-ilustraci%C3%B3n.html

Para observar estas células tome elabore una placa de extendido de sangre, a partir de una muestra obtenida con una lanceta punzando su propio dedo. Evite tomarla de la yema, puesto que allí encuentra más terminaciones nerviosas. Ubique la gota sobre el portaobjetos y siga los pasos de la figura 5.

FIGURA 5. Pasos para realizar un extendido de sangre. Tomado de: https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookId=1506§ionId=98183011

Rotulado su extendido de sangre, se debe tratar la muestra con el colorante Wright (Eosina y Azul de Metileno), agregue el colorante y espere 10 minutos sin dejar secar, agregando más colorante y soplar suavemente. Luego lavar con agua hasta que desaparezca el colorante en exceso. Ahora enfoque la muestra en los objetivos de 40X y 100X (usando aceite de inmersión). ¿Cuántas clases diferentes de células hay? ¿Cuáles son las características de cada una en cuanto a la forma como se tiñen? ¿Por qué algunas se tiñen y otras

no? ¿Qué función tiene cada una de las distintas clases de células? Dibuje lo observado con el objetivo de 100X o con el de 40X.

FIGURA 6. Observación en detalle de células sanguíneas. Tomado de: https://www.youtube.com/watch?v=-LItYblSo6g c. Espermatozoides. Realice un montaje en fresco de una muestra de semen que su profesor le proporcione. Observe la placa en 10X y 40X y realice un esquema comparando las partes de acuerdo con la figura 3 y la forma, tamaño y características con la figura 7.

FIGURA 7. Partes del espermatozoide. Tomado de: https://www.partesdel.com/espermatozoide.html

A

B C

C

FIGURA 8. Espermatozoides de diferentes tipos de animales. A. Humano(Microscopía óptica y electrónica de barrido); B. Roedores (hamster, ratón; tuco-tuco) ; C. Armadillos (peludo; tatú carreta; mataco bola (observar la prolongación posterior); gualacate, mostrando la forma de cuchara de la cabeza espermática (microscopía electrónica de barrido); gualacate, ilustrando la extrema delgadez de la cabeza espermática (microscopía electrónica de transmisión).

D. PREGUNTAS 1. Fuera de las estructuras u organelas que vio en las diferentes células, hay otras que no se pudieron observar. Explique por qué se dio dicha situación y qué se podría hacer para observarlas. 2. Enuncie al menos tres diferencias generales entre células animales y células vegetales.

3. ¿De qué factores puede depender el hecho de que las células tengan distintas formas? ¿Todas las células tienen núcleo? ¿Habrá células con más de un núcleo? Explique con ejemplos. 4. ¿En las células de cebolla, elodea, papa y tomate se observa la membrana celular? Explique las razones y describa lo observado en cada caso. 5. ¿Por qué todas las células vegetales tienen cloroplastos? ¿Qué característica da la presencia de cloroplastos a las células vegetales? ¿Se puede hacer fotosíntesis de manera artificial?, realice una consulta al respecto. 6. ¿Por qué ciertos colorantes son específicos para determinadas estructuras celulares? Cite algunos ejemplos. 7. Teniendo en cuenta el siguiente texto, elabore un modelo para la enseñanza de las partes de la célula, recuerde describir el proceso de construcción y presentar la propuesta en la asesoría. Importancia de los modelos explicativos en el aprendizaje de la Biología La transposición didáctica es la reconstrucción de la ciencia para ser enseñada (Chevalard, 1990; Joshua y Dupin, 2004), se “concibe como un proceso complejo de transformación de los modelos científicos eruditos en modelos teóricos para la enseñanza, que tiene como objetivos que los alumnos se apropien de formas de pensar y hablar” (Bahamonde, 2006, p.29). Concretamente la transposición didáctica es la etapa entre enseñanza y aprendizaje, es decir, desde la perspectiva del docente, identificar y comprender los modelos teóricos para luego, relacionar y seleccionar los aspectos más relevantes para el aprendizaje del estudiante, finalizando en la construcción o reconstrucción de los modelos mentales. Así, la actividad científica escolar se constituye en un proceso que le atribuye sentido a las y los estudiantes sobre los fenómenos del mundo a través de la construcción de modelos explicativos. La enseñanza de la biología y su aprendizaje, se articula bajo representaciones de ideas, teorías, leyes, que pretenden ser enseñadas, siendo un problema el poder representar de mejor manera un modelo que explique el pensamiento de los científicos, docentes y estudiantes y que finalmente, conduzcan a un aprendizaje “puesto que cuando el alumno estudia biología inicia una situación de aprendizaje escolar, ya lleva su particular visión explicativa del fenómeno que se le propone aprender” (Quintanilla, 2000, p. 2). El uso de analogías está presente en muchas situaciones de aprendizajes y con estas, se puede promover la elaboración de modelos y su expresión. “la construcción de una teoría se hace a partir de la construcción de modelos (sistemas conceptuales que representan con cierta aproximación algunos aspectos y relaciones de los objetos reales)” (Bunge, 1985). Finalmente, la enseñanza de la Biología y su complejo aprendizaje, se orienta bajo diversas representaciones de la realidad, ideas, teorías y/o leyes, que buscan como objetivo ser enseñadas, así surge la necesidad de repensar cómo representar de mejor manera un modelo que explique el pensamiento científico, qué instancias didácticas son más adecuadas, qué características deben tener los modelos científicos escolares a enseñar y cómo resignificar la enseñanza de la Biología hacia la promoción de modelos explicativos que permitan comprender el mundo. Tomado de: Arzola,N., Muñoz,T., Rodríguez, G. y Camacho, J. (2011). Importancia de los modelos explicativos en el aprendizaje de la biología. Revista Ciencia Escolar: enseñanza y modelización. 1 (1), 7-16. Recuperado de: http://modelamientoparabiologia.weebly.com/uploads/1/4/4/8/14480368/pdffff.pdf

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 2: Preparación de células

sanguíneas y observación de leucocitos, núcleo, lisosomas y citoplasma

Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas

Solución Colorante Wright Aceite de inmersión

Reactivos

Equipos y materiales

Colorante Wright Agua destilada Aceite de inmersión

1 gotero por mesa Recipientes para el agua Puente de coloración Microscopios compuestos

Concentración

Cantidad 50mL 5 mL

Preparación Azul de metileno y eosina. Se toma directamente del recipiente ubicado en el estante de reactivos,

Observaciones 1. El puente de coloración está ubicado en el lava platos lugar donde se debe hacer la coloración. 2. Los materiales y recipientes con sangre se depositan en los contenedores y guardianes rojos. 3. Antes de cada práctica se debe filtrar el Wright. Materiales que deben traer los estudiantes Cada estudiante debe traer: 1. Lancetas 2. Guantes 3. Cubreobjetos y portaobjetos 4. Pañuelos desechables “Kleenex”

Práctica 2. PREPARACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS Y OBSERVACIÓN DE LEUCOCITOS, NÚCLEO, LISOSOMAS Y CITOPLASMA INTRODUCCIÓN Las células sanguíneas tienen como funciones principales el transporte del oxígeno (O2) y el dióxido de carbono (CO2), así como la defensa del organismo contra agentes invasores. Se originan a partir de células totipotenciales (figura 1), de las multipotenciales (figura 2) y las plruipotenciales (figura 3). La principal función de la sangre la realizan los glóbulos rojos (eritrocitos) debido a la hemoglobina. La segunda, la realizan los glóbulos blancos (leucocitos), los cuales intervienen fagocitando bacterias o desencadenando el mecanismo antígeno-anticuerpo.

FIGURA 1. Origen de las células sanguíneas a partir de células totipotenciales. Tomado de: http://frantricarico.blogspot.com/2013/09/tarea-n-15-celulas-totipotenciales.html

FIGURA 2. Origen de las células sanguíneas a partir de las células multipotenciales. Tomado de: https://enfermeriaalexa.wordpress.com/2011/05/22/hello-world/

FIGURA 3. Origen de las células sanguíneas a partir de las células pluripotenciales. Tomado de: http://simplebooklet.com/publish.php?wpKey=1jkm1F1SXuLQnLAsYQKXbU

Hay tres clases de células sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Los Glóbulos Rojos o Eritrocitos (figura 4A), que son células muy especializadas que han perdido sus núcleos, poseen un pigmento (Hem) que combinado con una proteína (Globina) forma la hemoglobina quien es la responsable del transporte de O2 y CO2. El índice hematocrito es un indicador sobre el porcentaje de glóbulos rojos que hay en la sangre por unidad de volumen; lo normal esta entre 42% y 50% en hombres y entre el 38% y 47% en mujeres. Las características de la membrana de los eritrocitos definen los grupos sanguíneos. En el caso de los Glóbulos Blancos o Leucocitos (figura 4B-F), su función consiste en proteger al organismo contra las enfermedades y toxinas. En la sangre se encuentran 5 tipos de leucocitos, todos ellos provistos de núcleo. Las Plaquetas (figura 4G), son las que intervienen en el proceso de la coagulación sanguínea. Los leucocitos son menos numerosos que los eritrocitos, se ha contado 7.500 por milímetro cúbico, pero suele variar el número, además son abundantes en caso de infección o por reacciones alérgicas graves. Los tipos de leucocitos con su distribución porcentual son: Neutrófilos: Corresponden al 62% de los leucocitos, poseen núcleo no segmentado cuando aún está en proceso de maduración y núcleo segmentado con 2 ó 3 lóbulos o hasta 5, unidos por un filamento. Con colorante Wright se observa en primer lugar un citoplasma rosado pálido con granulaciones pequeñas rosadas y azules y su núcleo de color azul oscuro y morado (figura 4B). Estos neutrófilos actúan en enfermedades infecciosas agudas. En casos patológicos se pueden diagnosticar la “anemia perniciosa”. Eosinófilos o Acidófilos: Corresponden al 2% de glóbulos blancos, presentan un solo núcleo (bilobulado), con el mismo procedimiento que el anterior, se logran observar. Presentan citoplasma de color anaranjado intenso y granular, con gránulos grandes de color naranja, mientras que su núcleo está coloreado de morado oscuro y porciones rosadas (figura 4C). Estos aumentan en enfermedades alérgicas graves. Basófilos: Estos son el 1% de los leucocitos, presentan un núcleo grande redondo o en forma de haba o lobulados de color morado intenso. El citoplasma ligeramente rosado y gránulos grandes de color azul oscuro en toda la célula (figura 4D). Linfocitos:

Estas células representan el 30% de los leucocitos, poseen un citoplasma azul más intenso y a veces casi nada teñido. Presenta un solo núcleo que se colorea de morado café sin granos (figura 4E). Tienen como funciones dar origen a otras células, transporte de sustancias nutritivas, producen cuerpos inmunes. Monocitos: Representan el 5%, son de forma variada, ovalados, con seudópodos, etc. Son más grandes que los neutrófilos. Presentan al colorearse, un citoplasma azul claro sin granos y un núcleo de varias formas, de color morado oscuro (figura 4F). Estos monocitos aumentan en enfermedades infecciosas de larga duración. Por medio de ellos se puede diagnosticar la leucemia monocítica. Existe una clasificación complementaria de dichos glóbulos en: • •

Granulocitos (Eosinófilos, Basófilos, Neutrófilos). Agranulocitos (Monocitos, Linfocitos).

A continuación, se presenta un cuadro resumen de los tipos de células sanguíneas:

Cuadro 1. Clasificación de las células sanguíneas, forma, función y lugar de formación.

OB

A

B

D

C

F E

G

FIGURA 1. Células sanguíneas

FIGURA 2. Clasificación de las células sanguíneas según origen. Tomado de: https://enfermaca.blogspot.com/2015/08/la-sangre-un-repaso-hematologico.html

1. OBJETIVO Mediante el uso del microscopio, identificar las diferentes formas que pueden tener las células sanguíneas y algunas de sus organelas.

2. MATERIALES • • • • • •

Portaobjetos Cubreobjetos Lanceta estéril Microscopio Goteros Gradillas o puentes de coloración

3. REACTIVOS • Colorante Wright • Agua destilada • Aceite de inmersión

4. PROCEDIMIENTO 1. Con una lanceta estéril “pínchese” un dedo para sacar una gota de sangre. Colóquela en el extremo de un portaobjetos, haga una extensión de la sangre (siguiendo las instrucciones de su profesor) y deje secar al aire. 2. Cubra la preparación con colorante Wright y déjelo de 5 a 10 minutos. Durante este tiempo agregue gotas de agua destilada cada dos minutos (no deje secar el colorante, si es necesario agregue una gota más por cada dos gotas de agua destilada) y sople para que se agite suavemente. 3. Una vez terminado este tiempo, lave con agua hasta que desaparezca la coloración. Seque, observe al microscopio (objetivos 10X, 40X y 100X) y haga los esquemas correspondientes a las formas de las células identificadas.

4. Recuerde: los materiales y recipientes con sangre se depositan en los contenedores y guardianes rojos.

A continuación, un recurso que podrá ser de ayuda: Estábamos en guerra desde siempre El papel del ejército, formado por leucocitos a los que los civiles llamaban glóbulos blancos por su uniforme, era fundamental. Ellos eran el bastión para la defensa del territorio. Los leucocitos siempre habían nacido en las regiones llamadas médula espinal o las de tejido linfático. Históricamente, a los leucocitos más pequeños de estatura, aquellos a los que llamábamos linfocitos, se le destinaba siempre a la lucha contra la inmigración ilegal. Ellos, los linfocitos, eran los que eliminaban del territorio a los enemigos infiltrados en nuestro país y que eran detectados por las patrullas de inmigración, las células dendríticas. Como todos los cuerpos de élite los linfocitos estaban especializados en diferentes tareas. Los que se habían quedado en educación básica y no habían ido a la universidad eran la unidad B. Los linfocitos B vivían en sus cuarteles en los tejidos linfáticos hasta que se precisaba su actuación.

Pero había linfocitos que acudían a la universidad para especializarse en alguna tarea vital para nuestra supervivencia y eran los mandos de nuestro ejército. La universidad estaba cerca del corazón y se llamaba Timo, así que a los linfocitos universitarios los llamábamos linfocitos-T. Si las patrullas de células dendríticas identificaban algo en el territorio que no era conocido, lo detenían y acudían al cuartel del ganglio linfático a presentárselo al capitán linfocito T (siempre con corbata) especializado en ese tipo de intrusos. Este lo interrogaba y decidía si había que atacar la zona donde el intruso había sido encontrado y, en ese caso, llamaba a los soldados linfocitos B para pasar al ataque con armas químicas o que decidieran si llamar a los refuerzos. Los capitanes linfocitos T pertenecían a dos agrupaciones principales. Los del sindicato CD4 eran los “reguladores”, pensaban, analizaban y decidían como actuar. Los del sindicatoCD-8 eran más radicales y atacaban por sistema todo aquello que no les parecía familiar. Pero hubo una promoción de linfocitos T que tuvieron un mal profesor en la universidad Timo; el profesor no se explicaba bien y los jefes de nuestro ejército salieron a la calle con unas ideas no muy claras sobre cómo distinguir a un invasor ilegal de un técnico en comunicaciones de nuestro país. También ganó las elecciones el sindicato CD-8, los agresivos entre los linfocitos-T, que había conseguido más miembros; mientras que el CD-4, los reguladores, perdía muchos de los suyos.

Así las cosas, un capitán del CD-8 confundió a un técnico en comunicaciones, llamado Mielina, con un invasor agresivo; el cuerpo CD-4, muy menguado, no consiguió que se impusiera la prudencia y los linfocitos B fueron llamados a atacar a Mielina en medio de un ambiente de disensión entre los capitanes del ejército que hizo que los linfocitos B estuvieran muuuuuy agresivos, más de lo normal. El resultado fue devastador, los técnicos en comunicaciones fueron esquilmados, y, puesto que su labor era fundamental, el país se vio sumido en un desastre organizativo. Tras varios años de caos interno, la ayuda vino de fuera. Otros países nos suministraron tropas para controlar el comportamiento de los linfocitos T y B y la situación se pudo normalizar. Estas tropas, que llamaban inmunomoduladores, inmunosupresores, anticuerpos monoclonales … y consiguieron traer de nuevo la normalidad a nuestra tierra, pero pagando el precio de tener que tenerlos “en casa” todo el tiempo. Tomado de: http://somosem.com/2016/11/29/un-cuento-de-linfocitos/ Recuperado el 31 d enero de 2018. Para tener en cuenta! Uno de los elementos más importantes de la educación es la comunicación y, precisamente, el cuento es un elemento que nos puede ayudar a conseguirla, pues es capaz de generar muchas interacciones entre los estudiantes y el maestro. Si el cuento que se les presenta a los niños es de su agrado, se puede conseguir que los alumnos escriban cuentos similares, que hablen con sus compañeros sobre una determinada acción y, sin duda alguna, esto beneficia al aprendizaje, pues recuerdan contenidos que no recordarían si se les hubiesen transmitido de forma teórica y memorística. Si bien, cualquier cuento no es apropiado. El docente ha de tener la capacidad para elegir el cuento más conveniente para aquello que quiera trabajar. Además, también es muy importante que cuando lo cuente, no se limite simplemente a narrarlo, sino que ha de centrarse en transmitirlo, es decir, adentrarse en el mundo fantástico del cuento y conseguir que los estudiantes viajen junto con él a través de la historia. Por otra parte, también es importante que los docentes estén dispuestos a ir hasta el final, y en caso de que no encuentren un cuento de una determinada temática, que se atrevan a escribirlo, para de esta manera tener una continuidad en la metodología utilizada, al menos, en la mayor medida posible.

Tomado de: Pérez, D., Pérez, A.I. y Sánchez, R. (2013). El cuento como recurso educativo. Revista de investigación Editada por Área de Innovación y Desarrollo, S.L. Recuperado de: https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/4817922.pdf PREGUNTAS PARA RESOLVER 1. ¿Qué diferencias presentan las células totipotenciales, multipotenciales y pluripotenciales? 2. ¿Cómo se le podría explicar a un estudiante que pregunta por qué la sangre del humano es roja? 3. Elabore un esquema de clasificación de las células sanguíneas que pueda servir como recurso para una clase de este tema. 4. Describa mediante una lista las normas de seguridad que deben tenerse en cuenta en este laboratorio. 5. Se dice que la sangre de otros animales no es roja y que en algunos casos es azul. ¿Qué hace que esto cambie? ¿Qué animales presentan sangre de otro color? Explique con ejemplos. 6. ¿Cómo se llama el líquido en el cual se encuentran inmersas las células sanguíneas en la sangre? ¿Cuál es su función? 7. ¿Cómo afecta la producción de células sanguíneas el cambio de altura sobre el nivel del mar? ¿Por qué los niños que viven en zonas montañosas altas se caracterizan por tener mejillas rojas? 8. ¿Cómo leer un examen de sangre? ¿Qué determina y por qué es tan importante en el diagnóstico de tantas enfermedades? 9. Elabore un cuento que permita recordar los tipos de células sanguíneas observadas, sus estructuras particulares y sus funciones. 10. ¿Cómo podría evaluarse la elaboración de un cuento? ¿Qué aspectos se deben tener en cuenta? ¿Qué instrucciones deben darse a los estudiantes?

Laboratorio de Biología Celular

Reactivos

Preparación práctica 3: Identificación de compuestos orgánicos en la saliva humana. Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas

Acetona (C3H6O) Agua destilada Ácido clorhídrico (HCl) 1N y 3N Hidróxido de sódio (NaOH) 3 N y 2,5 N Sulfato cúprico (CuSO4) 0,05 N Cloruro Férrico (FeCl3) 0.1 N Carbonato sódico (Na2CO3) 0.1 N Ácido acético (CH3COOH) 1 N Reactivo de Benedict Solución Concentración Cantidad

Equipos y materiales

Tubos de ensayo (7 por mesa) Probetas plásticas (1 por mesa) Erlenmeyers (para separar mucina) Papel filtro

Preparación Se toma directamente del recipiente Acetona ubicado en el estante de reactivos Ácido 1N 50 mL Se pesa 1,8 g de HCl y se diluye en 50mL de clorhídrico agua destilada Ácido 3N 50 mL Se pesan 5,46 g de HCl y se diluye en 50 mL clorhídrico de agua destilada. 3N 100 mL Se diluyen los 12 g de NaOH en 100 mL de Hidróxido de sodio agua destilada 2,5 N 100 mL Se diluyen los 10 g de NaOH en 100 mL de Hidróxido de sodio agua destilada 0,05 N 50 mL Se diluyen 0,4 g de CuSO4 en 50 mL de agua Sulfato destilada, almacenar en falcon envuelto con cúprico papel aluminio 0,1 N 100 mL Se diluyen 2,7 g de FeCl3 en 100 mL de agua Cloruro destilada, almacenar en falcón envuelto con Férrico papel aluminio Carbonato 0,1 N 100 mL Se diluyen los 2,9 g de Carbonato sódico en sódico 100 mL de agua destilada Ácido 1N 30 mL Se toman 1,80 g de ácido acético y se acético diluyen en 30 mL de agua destilada. Identifica azúcares reductores (aquellos que tienen su OH libre del C Reactivo anomérico), como la lactosa, la glucosa, la maltosa, y celobiosa. En de soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que Benedict precipita de la solución alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. Observaciones 1. Cada recipiente de reactivo debe tener su respectiva pipeta para su uso. 2. La acetona utilizada se puede filtrar y guardar en un recipiente de vidrio para reutilizar posteriormente. Por lo tanto, no se descarta. Materiales que deben traer los estudiantes 1. Los estudiantes deben traer cada uno chicle sin azúcar.

Práctica 3. IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS ORGANICOS EN LA SALIVA HUMANA INTRODUCCIÓN La saliva es una mezcla homogénea de secreciones producidas principalmente por las glándulas salivares y por las glándulas bucales menores, que desempeña una doble función: participa en el proceso de la digestión y facilita la deglución del alimento. Es una secreción compleja proveniente de las glándulas salivales mayores en 93 % de su volumen y las menores en 7 % restante. La saliva desempeña múltiples funciones importantes en el mantenimiento de la salud bucal y general del individuo, entre ellas: lubricación, acción antimicrobiana, capacidad amortiguadora del pH de la cavidad bucal y la placa dental, remineralización y protección contra la desmineralización, masticación, formación del bolo alimenticio, deglución, digestión, gusto y lenguaje. En la composición de este fluido se encuentran diferentes moléculas, dentro de las cuales se destacan las proteínas, las que están involucradas en la mayoría de sus funciones. La saliva es un líquido claro, algo viscoso, alcalino (pH entre 6 y 7), que contiene un 95% de agua, un 3% de sustancias orgánicas y un 2% de sales minerales (grandes cantidades de iones de potasio y bicarbonato, y menos de iones cloro y sodio). Se han descrito numerosas proteínas salivales y se supone que muchas de ellas guardan relación con la salud bucal. Sin embargo, no en todos los casos su mecanismo de acción está claro o se encuentra adecuadamente fundamentado desde el punto de vista de la relación estructura-función de las proteínas. Además, contiene dos tipos de secreción proteica: una secreción serosa rica en ptialina (un alfa-amilasa), que contribuye a la digestión del almidón, y una secreción mucosa, que contiene mucina, elemento lubricante que facilita la masticación y el paso del bolo alimenticio hacia el esófago tras la deglución. Cada minuto se secreta unos 0,5 ml de saliva, excepto durante el sueño, donde la secreción es escasa. La saliva tiene un papel importante en el mantenimiento de los tejidos bucales, ya que ejerce un efecto de limpieza y arrastre de sustancias alimenticias y de gérmenes patógenos que contribuirían en ese caso a la aparición de caries dentales e infecciones, así como al deterioro de los tejidos. Además, contiene iones tiocianato (conocido también como ión sulfocianuro, SCN-), enzimas proteolíticas y anticuerpos proteicos que destruyen las bacterias bucales. Aunque parezca muy extraño, nuestra saliva contiene el ión SCN -. Por supuesto que se encuentra en concentraciones muy bajas, porque en cantidades grandes las sales de SCN- son peligrosas cuando se las ingiere. A pesar de encontrarse en cantidades muy pequeñas, es fácilmente detectable usando ion férrico (Fe3+), porque se produce una coloración roja característica. La función del ión tiocianato en la saliva es ayudar a proteger los dientes del ataque por bacterias. Con ayuda de la enzima lactoperoxidasa, también presente en la

saliva, reacciona con el peróxido de hidrógeno (H2O2), producido por bacterias en la boca, dando hipotiocianato.

Enzima lactoperoxidasa SCN-

OSCN- + Hipotiocianato

+ H2O2 Ion tiocianato Peróxido de hidrógeno

H2O Agua

Este último ión, a diferencia del tiocianato, puede penetrar la célula de las bacterias, disminuyendo su velocidad de crecimiento. Se puede comprobar que la concentración de SCN- en saliva puede ser tres veces mayor en fumadores con respecto a no fumadores. También aumenta con la edad. Es muy fácil determinar la concentración de SCN- presente en la saliva, realizando una determinación colorimétrica basada en la siguiente reacción:

SCN+ Fe3+ Ion tiocianato Ion férrico

Fe(SCN)2+ Ion complejo Tiocianato ferroso

1. OBJETIVO: Comprender la reacción que ocurre a partir de la mucina salival e identificar los compuestos de la misma.

2. MATERIALES • • • • • •

Probetas Erlenmeyers Papel de filtro Tubos de ensayo Beakers Pipetas

3. REACTIVOS • Chicle sin azúcar • Ácido acético (CH3COOH) • Saliva • Acetona (C3H6O) • Agua destilada • Ácido clorhídrico (HCl), concentración 3 N y 1 N

• • • • •

Hidróxido de sodio (NaOH), concentración 3 N y 2,5 N Reactivo de Benedict Carbonato sódico (Na2CO3), concentración 0,1N Sulfato cúprico (CuSO4), concentración 0,05 N Cloruro férrico (FeCl3), concentración 0,1 N

4. PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento de la mucina salivar Recordemos que la mucina es una GIicoproteína que constituye el más abundante de los componentes salivares. Por lo tanto, siga los siguientes pasos: A. Lávese la boca con agua (H2O), mastique el chicle sin azúcar y colecte la mayor cantidad de saliva "estimulada" en un matraz graduado de 50 mL. B. Agregue 3 gotas de ácido acético (CH3COOH) de concentración 1N por cada 15 mL de saliva y mezcle las dos sustancias. C. Coloque en un erlenmeyer, 4 veces el volumen de acetona (C3H6O) por el recolectado de saliva y agréguela lentamente con agitación permanente. Tape el frasco y déjelo reposar por 15 minutos. D. Bote la mayor parte del sobrenadante y filtre la parte final de la mezcla que contiene el precipitado. E. Lave el precipitado 4 veces con 3 mL. de acetona (C3H6O). F. Retire el papel de filtro y déjelo secar. G. Divida el material obtenido (la mucina) en cinco partes. 2. Presencia de Carbohidratos en la mucina A. Coloque aproximadamente 1/5 parte de la mucina aislada en un tubo de ensayo (márquelo como tubo 2A), agréguele 2 mL de ácido clohídrico (HCl) de concentración 3N y coloque el tubo en un baño de agua hirviendo por 20 minutos. Enfríe y agregue 2 mL de hidróxido de sodio (NaOH) de concentración 3 N, hasta hacer la solución debidamente alcalina. Agregue 5 gotas de reactivo de Benedict y caliente por cinco minutos en Baño María, observe la reacción (cambios de coloración). B. Coloque otro 1/5 parte, de mucina en otro tubo de ensayo (márquelo como tubo 2B) y disuélvala en 2 ml carbonato sódico (Na2CO3) de concentración 0,1 N. Observe la naturaleza viscosa de la solución. Agregue 5 gotas de reactivo de Benedict y observe, no olvide calentar por cinco minutos en Baño María. ¿Se observan diferencias entre los dos tubos? Si las hay explique, ¿por qué se dan dichas diferencias o similitudes?

3. Presencia de proteínas en la mucina A. En un tubo de ensayo (tubo 3A), disuelva 1/5 parte de la mucina en 1ml de hidróxido de sodio (NaOH) con concentración 2,5 N y agregue 3 gotas de una solución 0,05% de sulfato cúprico (CuSO4). Observe en detalle y explique lo que ocurre. B. En un tubo de ensayo (tubo 3B), disuelva 1/5 parte de la mucina en 1ml de hidróxido de sodio (NaOH) con concentración 2,5 N. Lleve el tubo a calentamiento durante 20 minutos. Luego agregue 3 gotas de una solución 0,05% de sulfato cúprico (CuSO4). Observe en detalle y explique lo que ocurre. C. En un tubo de ensayo (tubo 3C), disuelva 1/5 parte sobrante de la mucina en 1ml de hidróxido de sodio (NaOH) con concentración 2,5 N, agregue 3 gotas de una solución 0,05% de sulfato cúprico (CuSO4) y tripsina. Observe en detalle y explique lo que ocurre, compare los resultados. 4. Presencia de tiocianatos en la saliva. A. A 2 mL de saliva agregue 2 o 3 gotas de una solución de cloruro férrico (FeCl3) concentración 0,1M y unas 2 o 3 gotas de ácido clorhídrico (HCl) en concentración 1N. Si aparece un color rojo, esto se debe al Tiocianato Férrico (KSCN). B. Pídale a un compañero fumador que se fume un cigarrillo y repita el experimento, usando saliva colectada después de fumar, debe dar rojo (porque se aumenta con el cigarrillo). Se puede ampliar esta experiencia usando muestras (2 mL de saliva) de personas que nunca hayan fumado y fumen para el experimento, de un fumador que hace un tiempo no fuma, de una persona que haya tomado algún medicamento como antibióticos, otros que hayan tomado gaseosa oscura y café. Se repite el procedimiento con cada muestra. Explique lo que ocurre y compare los resultados. 5. Test cualitativo de Benedict Haga el test cualitativo de Benedict a 2 mL de saliva se agrega 5 gotas de reactivo Benedict. Luego se lleva a calentamiento en baño María por cinco minutos. ¿Cuál es el resultado obtenido? ¿Cuál es la explicación fisiológica del resultado? ¿Por qué usar el reactivo de Benedict?

PREGUNTAS ADICIONALES 1. ¿Por qué la saliva tiene una función vital en la integridad de los tejidos orales? 2. Explique cómo funciona el sistema amortiguador de pH en la saliva. 3. ¿Qué compuestos se identificaron en la saliva y mediante qué reacciones se evidenció su presencia? 4. ¿De qué manera afecta masticar chicle después de comer? 5. ¿Qué enfermedades están asociadas al consumo de cigarrillo? 6. ¿Cómo se afectan los dientes por fumar? Busque explicación desde bases químicas. 7. ¿Qué sustancias químicas tóxicas contiene un cigarrillo? 8. ¿Qué efectos tiene el cigarrillo sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos? 9. Con argumentación científica, busque convencer a un fumador de abandonar su mal hábito. 10. Compare los daños que causan los cigarrillos de nicotina y los cigarrillos de marihuana. Saque conclusiones.

Para tener en cuenta

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 4: Osmosis en glóbulos rojos Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas

Reactivos

Equipos y materiales

Soluciones de NaCl Solución de Glucosa Solución salina al 0,9 % Agua destilada Heparina Reactivo de Vam Kampen Solución Concentración Cantidad 20% 100mL NaCl

Falcón de 15ml (9 por mesa) Pipetas pasteur y micropipeta Centrifuga Espectofotómetro Erlemenyers Tubos de ensayo Preparación Tomar 20g de NaCl y diluirlo en 100ml de agua destilada 20% 100mL Tomar 20g de glucosa y diluirlo en 100ml de Glucosa agua destilada 0,9% 100mL Tomar 0,9% de NaCl y diluirlo en 100ml de NaCl agua destilada Reactivo 14 mg KH2PO4, 5 mg KCN, 20mg K3Fe(CN)6 0.01 de Van 100mL mL, 0.002 mL de Tritón X-100 llevar a 100 mL Kampen con agua destilada. Observaciones 1. Los estudiantes a partir de las soluciones del 20% harán las diluciones respectivas. Materiales que deben traer los estudiantes 2. Los estudiantes deben traer camisa, aguja y vacutainer con EDTA

Falcón de 15 mL

Vacutainer con EDTA

Pipeta Pasteur

PRACTICA No. 4 ÓSMOSIS EN GLÓBULOS ROJOS INTRODUCCIÓN La ósmosis es un fenómeno de difusión de un solvente a través de una membrana. El agua se difunde de regiones de bajas concentraciones de sales a otras de altas concentraciones. Así por ejemplo, si se separa una solución concentrada de otra solución diluida, por medio de una membrana, las moléculas de agua atraviesan la membrana desde la solución diluida hacia la concentrada. Este tipo de membranas que permiten el paso de ciertas moléculas, pero no de otras, se conoce como membranas semipermeables. Las membranas de la célula en un organismo vivo son de este tipo, además que son selectivas, es decir, permiten el paso de sustancia que solo a la célula le “interesa”, en un momento determinado (fig. 1A). MOLÉCULAS DE SOLUTO

MEMBRANA CON PERMEABILIDAD SELECTIVA

DIRECCIÓN DEL MOVIMIENTO DEL AGUA

CONDICIONES ISOTÓNICAS

A

CONDICIONES HIPERTÓNICAS

MEMBRANA PLASMÁTICA

CONDICIONES HIPOTÓNICAS

B CELULA ANIMAL

FIGURA 1A. Proceso de ósmosis. 1B. Efectos de los medios de concentración en eritrocitos

La ósmosis entre dos soluciones continúa hasta cuando se alcanza igual concentración de solutos en ambos lados de la membrana. La presión necesaria para alcanzar este estado se conoce como presión osmótica y a mayor concentración de una solución, mayor será la presión osmótica. En las células animales, aunque poseen un mecanismo de osmorregulación, si se presenta una diferencia muy alta de concentraciones puede observarse un proceso de rompimiento celular debido al hinchamiento de la célula por la excesiva acumulación de agua dentro de ella. Este fenómeno se conoce como hemólisis, cuando le sucede a los glóbulos rojos (Fig. 1A y 1B). PLASMÓLISIS Cuando el medio extracelular es hipertónico con respecto al medio intracelular, sale el agua del interior de la célula por ósmosis y se produce la plasmólisis, que en el caso de las células vegetales provoca la rotura de la célula al desprenderse la membrana plasmática de la pared celular (Fig. 2) y en los glóbulos rojos se denomina crenación, inicialmente no ocurre ruptura, pero si una alta deshidratación que lleva a que las células se arruguen o encojan (Fig. 3). TURGENCIA Cuando el medio extracelular es hipotónico con respecto al medio intracelular, se produce la entrada de agua en la célula, lo que ocasiona un aumento del volumen celular, que en el caso de las células animales provocaría su estallido: citólisis o hemólisis (en eritrocitos), mientras que en las vegetales se producirá un hinchamiento o turgencia (Fig. 3).

Figura 2. Proceso de plasmólisis y turgencia en células vegetales

Figura 3. Comparación de los efectos de la ósmosis en células vegetales y animales, inmersas en soluciones hipertónicas e hipotónicas De todos los tipos de membranas, la membrana plasmática del eritrocito humano, es la más estudiada y la mejor comprendida. Las células son económicas en su obtención y disponibles en enormes cantidades en la sangre. Además, se encuentran como células individuales y no es necesario disociarlas de un tejido complejo. Son células sencillas y carecen de membrana nuclear que podrían contaminar la muestra. Estas células, además, responden a choque osmótico mediante la captación de agua y se hinchan, un fenómeno conocido como hemólisis. Conforme aumenta el área, la célula presenta fugas y su contenido, formado casi en su totalidad por hemoglobina disuelta, sale de la célula y deja un “fantasma” de membrana plasmática. 1. OBJETIVOS Al finalizar esta práctica, el estudiante estará en capacidad de: • Comprender el fenómeno de la osmosis en células animales y vegetales. • Preparar diferentes soluciones por el método de diluciones. • Conocer las concentraciones fisiológicas ideales de la célula para sales y glucosa.

2. MATERIALES • Tubos de ensayo • Erlenmeyers • Pipetas Pasteur • Espectrofotómetro • Centrífuga Clínica • Micropipeta de 50 μL Los estudiantes de deben traer previo al laboratorio • Vacutainer con anticoagulante • Jeringa con camisa 3. REACTIVOS • Soluciones de Cloruro de Sodio NaCl (0.1%, 0.2%, 0.4%, 0.7% y 0.9%). • Soluciones de Glucosa (0.5%, 1%, 2%, 4% y 6%).

4. MÉTODOLOGÍA PARTE I. ÓSMOSIS EN GLÓBULOS ROJOS Preparación de la Solución de Eritrocitos al 4% 1. Pase 5 mL de sangre del vacutainer a un tubo Falcon y centrifugue por 10 minutos a 3500 rpm. 2. Extraiga el sobrenadante (plasma) y deje sólo el precipitado (eritrocitos).

3. Complete un volumen de 8mL (con el precipitado), de solución salina al 0.9%

4. Centrifugue de nuevo a 3500 rpm durante 10 minutos y extraiga el sobrenadante. Repita este paso. 5. Mida el volumen de precipitado final y suponga que está al 100%. 6. Se usará en cada tubo de ensayo 3 o 4 gotas de precipitado de eritrocitos. o Método A 1. Tome 11 tubos de ensayo y rotule 5 de ellos con las diferentes concentraciones de solución salina y otros 5 tubos con las concentraciones de glucosa, el onceavo rotúlelo como control (agua destilada).

Solución salina

Tubo 1 Al 0,2%

Tubo 6 Solución de Al 1% glucosa

Tubo 2 Al 0,5 %

Tubo 3 Al 0,9 %

Tubo 4 Al 10%

Tubo 5 Al 30%

Tubo 7 Al 2%

Tubo 8 Al 6%

Tubo 9 Al 10%

Tubo 10 Al 30%

Control Sólo con agua destilada Control Sólo con agua destilada

2. Adicione luego, a cada tubo 5 mL de la solución respectiva (soluciones salinas en los cinco primeros y de glucosa en los siguientes cinco, acorde a la tabla anterior) y 50 μL de solución de eritrocitos (3 a 4 gotas).

Recuerde que para hallar el volumen que requiere para cada solución, debe hacer el cálculo teniendo en cuenta que la solución madre se preparó al 30% y se requiere preparar de cada solución 5mL. Use la fórmula: C1xV1 = C2xV2

3. Deje reposar por 10 minutos mezclando por inversión de vez en cuando. 4. Al término de los 10 minutos observe los tubos y verifique diferencias en la coloración. Centrifugue después de 10 minutos, nuevamente a 3500 rpm y por diez minutos. Observe y concluya. PREGUNTAS 1. Clasifique cada una de las soluciones en las que fueron inmersos los eritrocitos (tanto en las de NaCl como las de Glucosa) acorde a su concentración (hipotónicas, isotónicas e hipertónicas). 2. ¿Cómo se explica cada uno de los resultados obtenidos, teniendo en cuenta el tipo de solución? 3. ¿Qué son las células “fantasma”? ¿Cómo se producen? 4. Explique el comportamiento de los eritrocitos teniendo en cuenta las presiones osmótica y de turgencia. 5. Analice y resuelva: Con base en el siguiente esquema y asumiendo que se tiene un sistema de células con las siguientes características a nivel de concentración de solutos, conteste las siguientes preguntas:

5.1 Si el sistema se coloca en un medio hipertónico para la célula B e hipotónico para la célula D, quiere decir esto que el interior de la célula C con respecto al medio es: __________________________________________________ Sustente su respuesta. 5.2 Si se coloca este mismo sistema en un medio hipotónico ¿Cuál de ellas tendría mayor presión de turgencia? Justifique brevemente.

PARTE II. ÓSMOSIS EN CÉLULAS VEGETALES (OPCIONAL) Materiales 3 vasos de precipitados de 50 ml Bisturí Portaobjetos y cubreobjetos 3 clips Cinta de enmascarar Papa mediana por equipo Reactivos 100 ml de solución de cloruro de sodio al 1% 100 ml de solución de cloruro de sodio al 20% Agua destilada Safranina o azul de metileno. Equipos Balanza electrónica Microscopio óptico 1. Coloca tres vasos de precipitados de 50 ml y enuméralos en el siguiente orden En el vaso 1 agrega 30 ml de agua destilada En el vaso 2 agrega 30 ml de disolución de NaCl al 1% En el vaso 3 agrega 30 ml de disolución de NaCl al 20% 2. Saca tres cilindros de papa o tres tiras gruesas de aproximadamente 1 centímetro de ancho. Corta los extremos de los cilindros hasta obtener pedazos de papa con la misma masa (peso). 3. Extiende un clip e introdúcelo por uno de los extremos de la papa cuidando que atraviese la papa en línea recta hasta que salga por el otro extremo. 4. Sumerge los tres cilindros de papa con los clips atravesados, en los vasos de precipitados 1, 2 y 3. Deja transcurrir 10 minutos. NOTA: Es importante que los cilindros de papa queden totalmente sumergidos en las soluciones de cloruro de sodio y agua destilada. 5. Después de este tiempo extrae los pedazos de papa de los vasos de precipitados, retira el clip y el exceso de agua y pésalos uno por uno en la balanza electrónica. 6. Registra tus resultados en una tabla. 7. Repite la operación cada 10 minutos durante 1 hora.

8. Después de haber tomado los datos durante 1 hora, saca los cilindros de papa y realiza cortes transversales de cada uno de ellos. Obsérvalos al microscopio con el objetivo de 10x. Para observarlos mejor puedes agregar una gota de colorante safranina o azul de metileno. 9. Elabora dibujos de lo observado y anota tus resultados. Saca conclusiones a partir de las comparaciones entre las tres muestras. PREGUNTAS 1. ¿Cómo se comportan las membranas celulares al ponerlas en contacto con soluciones salinas? 2. ¿En qué consiste el fenómeno de turgencia? ¿Qué tipos de soluciones lo provocan? 3. ¿En qué consiste el fenómeno de plasmólisis? ¿Qué tipo de soluciones lo provocan? 4. ¿Qué ocurriría en la experiencia realizada si la solución salina que se pone en contacto con las células vegetales fuera de la misma concentración salina (solución isotónica) que la existente en el interior de la vacuola? Explique claramente. 5. ¿A qué se deben las variaciones de la masa de la papa en las diferentes concentraciones de Cloruro de sodio (NaCl)? 6. ¿Qué diferencias se notan en las células de los tres cilindros de papa? ¿A qué se deben? 7. ¿Cuándo debemos agregarle sal a la ensalada de lechuga? Explique con sus propias palabras.

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 5: Permeabilidad de la membrana Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos Equipos Cloroformo Tubos de ensayo 8 por mesa Alcohol absoluto Pipetas pasteur Beakers para calentar agua o baño Acetona maría Tritón Cuchillo SDS - Dodecilsulfato sódico Detergente comercial blanco Solución Concentración Cantidad Preparación Pesar 20g de SDS en una campana SDS 20% 100ml de extracción debido a que puede Dodecilsulfato ser irritante. Luego llevar a 100ml sódico con agua destilada Alcohol puro 50ml No se hace ninguna dilución absoluto Acetona puro 50ml No se hace ninguna dilución 20% 50ml Se diluyen 10ml de Tritón en 50ml de Tritón agua destilada Detergente 20% 30ml Se diluye 10g de detergente en 50 ml comercial de agua destilada. 20% 50ml Se diluyen 10ml de glicerol en 50 ml Glicerol de agua destilada. Observaciones 1. No se utiliza benceno en esta práctica ya que es reemplazado por el cloroformo 2. Al inicio de la práctica se cortan algunos trozos de remolacha se lavan y se meten al congelador. Materiales que deben traer los estudiantes 1. Los estudiantes deben traer una remolacha por grupo

PRACTICA N. 5 PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR: ACCIÓN DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS Y DE LA TEMPERATURA, SOBRE SU ESTRUCTURA

INTRODUCCIÓN La bicapa lipídica tiene un papel fisicoquímico dual, pues sirve por una parte como un solvente de las proteínas de la membrana y por otra actúa como una barrera a la permeabilidad. Mientras que las moléculas hidrofóbicas, que son solubles en lípidos (como el etanol) pueden pasar fácilmente la membrana, moléculas pequeñas como el oxígeno (O2), dióxido de carbono (CO2), Nitrógeno (N2), pueden difundir entre los fosfolípidos de membrana, pero moléculas hidrofílicas pequeñas como agua, nutrientes como la glucosa e iones como Na+, K+, protones H+) no pueden pasar directamente a través de los fosfolípidos de la membrana plasmática. Estos compuestos deben pasar a través de proteínas de transporte específico situadas en la membrana.

FIGURA 1. Permeabilidad selectiva de sustancias a través de la membrana celular. Tomado de: http://www.wikillerato.org/La_membrana_plasm%C3%A1tica.html De esta manera, la membrana celular es la estructura por donde pasan selectivamente al interior o exterior de la célula las sustancias ionizadas o no, este pasaje suele hacerse a veces, porque las sustancias ser disuelven en la membrana o también como parte de su fisiología que regula el pasaje de dichas sustancias. El

equilibrio entre la impermeabilidad a iones y moléculas como azúcares, y la permeabilidad al agua, es el responsable de la turgencia de la célula. En la actualidad, no se ha podido comprender exactamente el mecanismo que controla la permeabilidad de la membrana celular. Se ha observado que la permeabilidad tiende a aumentar con la temperatura, pero el hecho de que las diferencias observadas a distintas temperaturas no son proporcionales a los aumentos de temperatura, parece indicar que entre 0 y 30 °C no se producen cambios estructurales en las membranas, además no todas las sustancias siguen esa norma. Se supone, por lo tanto, que el aumento de la permeabilidad se debería solo al aumento de la velocidad del movimiento de iones y moléculas que acelerarían el pasaje a través de la membrana. Cambios de temperatura A temperatura fisiológica o corporal, las células logran su mejor funcionamiento. Con un ascenso de las temperaturas, tanto la membrana celular como las proteínas pueden verse afectadas. Las colas de ácidos grasos de la bicapa fosfolipídica pueden "derretirse" a altas temperaturas, lo que significa que se vuelven más fluidas, posibilitando un mayor movimiento. Esto modifica la permeabilidad de la célula, lo que puede permitir el ingreso de moléculas que no deberían ingresar y, por ello, dañar a la célula. La transmembrana o las proteínas periféricas pueden también verse dañadas por las altas temperaturas, que causan una desnaturalización de las proteínas o su desmembramiento. También, pueden producir una aceleración de las reacciones que suceden en el seno de la célula, lo que en algún punto podría ser aceptable, hasta que la temperatura se vuelva demasiado alta, momento en el cual se produce la destrucción de la proteína, las reacciones y las células. Un descenso en la temperatura también provoca un efecto en las membranas celulares y las células. Las colas de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos se tornan más rígidas cuando se exponen a temperaturas frías. Esto afecta la fluidez, la permeabilidad y la capacidad de supervivencia de las células. Cuando las células pierden fluidez, quedan imposibilitadas de moverse y de crecer. El descenso de la permeabilidad implica que moléculas vitales no puedan ingresar a las células. Además, las temperaturas más frías pueden provocar una disminución o el freno de las reacciones celulares. Otros factores que influyen en la fluidez de membrana Colesterol - En cierta medida, aumenta la rigidez de la membrana, ya que los anillos rígidos interactúan con las cadenas hidrocarbonadas de los lípidos, inmovilizándolas parcialmente. Además, agrega orden a la bicapa, dejando zonas más rígidas y otras zonas más flexibles que interactúan con las cadenas de carbono de los fosfolípidos. Así es como el colesterol tiende a hacer menos fluidos a los lípidos. Sin embargo, cuando se encuentran en altas concentraciones, como ocurre

en la mayoría de las células eucariotas, previene el congelamiento, ya que evita que las cadenas carbonadas se ajusten y se "empaqueten" y vuelvan más rígidas a la membrana. Así es como, a baja temperatura esta disminución del empaquetamiento puede determinar que las membranas no se congelen. Los fosfolípidos.- forman una bicapa lipídica debido a su carácter anfipático, es decir por tener una cabeza hidrofílica está formada por un fosfato de un compuesto nitrogenado (colina o etanolamina) y se mezcla bien con el agua cuya molécula se encuentra en contacto con el citosol y con el líquido extracelular y una cola hidrofóbica está formada por ácidos grasos que repelen en agua y su molécula en contacto con interior de la membrana .Su composición de la capa interna y externa de lípidos no es la misma, porque dependen de la presencia de proteínas que requieren unirse a determinados fosfolípidos. Además, mientras más ácidos grasos (cortos y saturados) formen parte de los fosfolípidos, mayor será la fluidez de la membrana.

FIGURA 2. Composición de la membrana celular. Tomada de: https://neetescuela.org/composicion-de-la-membrana-celular/ Fluidez de la membrana Antes de explicar lo que es una fluidez de membrana, debemos tener en cuenta qué es una membrana. La membrana es una estructura laminar formada por lípidos (con

cabeza hidrofilia y cola hidrofóbica) y proteínas que engloba a las células, define sus límites y contribuye a mantener el equilibrio entre el interior (medio intracelular) y el exterior (medio extracelular) de éstas. Ahora, después de haber leído lo que es una membrana, podremos entender lo que es una fluidez de membrana. La fluidez de membrana se refiere a la apariencia liquida o viscosa que posee ésta, dada por su sector lipídico, ya que como sabemos la membrana está constituida por una bicapa lipídica que posee 'cabezas' hidrofílicas (afinidad por el agua) hacia el exterior y las 'colas' hidrofóbicas hacia su interior. Para que se de esta fluidez de membrana intervienen algunos factores importantes como la temperatura, el colesterol y los fosfolípidos. - La temperatura juega un papel importante en la fluidez de la membrana, ya que Cuando la temperatura aumenta, la fluidez se incrementa y la membrana se hace hiperfluída; al disminuir la temperatura, la fluidez de la membrana decae haciéndose más viscosa y, la actividad de la misma se ve limitada. - El colesterol, aumenta la rigidez de la membrana; también afecta la temperatura de una bicapa, ya que regula su fluidez y aumenta la estabilidad mecánica de una membrana fluida. - Y por último los fosfolípidos aportan mayor fluidez, ya que mientras más ácidos grasos (cortos y saturados) formen parte de éstos, mayor será la fluidez de la membrana. 1. OBJETIVO El estudiante desarrollará habilidad en el manejo de las técnicas y los materiales que le permitan observar las funciones celulares, en este caso de la membrana plasmática. 2. MATERIALES 8 tubos de ensayo (por equipo) 1 gradilla para 12 tubos 1 cuchilla o navaja Fotocolorímetro Remolachas jóvenes y frescas

3. REACTIVOS 20 mL de agua saturada de benceno (1 mL de benceno por litro de agua destilada) Alcohol absoluto Acetona (opcional) Detergentes (Tritón, SDS, Comercial) 4. PROCEDIMIENTO Efecto de la temperatura (procedimiento): 1. Corte 8 trozos de remolacha pequeña, de 4 cm de longitud, 0.5 cm de ancho y 0.2 cm de espesor, lo más uniforme posible. 2. Lave los trozos en agua corriente durante 3 minutos para eliminar el pigmento de las células seleccionadas y deje los trozos en agua. 3. Marque 4 tubos de ensayo de la siguiente manera: 0 °C, temperatura ambiente, 50 °C y 70 °C. 4. Coloque un trozo seco en el tubo marcado con 0 °C, tápelo y anote en el tubo el número del equipo. Déjelo en la nevera durante 90 minutos, anote la hora. 5. Ponga otro trozo seco en el tubo temperatura ambiente, tápelo y déjelo en la gradilla. 6. Caliente agua en baño maría hasta 70 °C. Tome un trozo de remolacha con una pinza y agítelo sin soltarlo en el tubo marcado 70 °C y tápelo. 7. Repita el paso anterior con el otro trozo usando agua caliente a 50 °C. 8. Luego de una hora y media, saque el tubo de la nevera, añada 10 mL de agua a cada uno de los 4 tubos, tápelos y déjelos durante 30 minutos, agite los tubos para que difunda en el líquido todo el pigmento que haya salido de las células. Saque los trozos de remolacha y “lea” cada tubo dándole un valor de 10 a la cantidad de pigmento difundido en el tubo de 70 °C, indique los valores arbitrarios para la cantidad de pigmento de los demás tubos, o llévelo a un fotocolorímetro y mida la concentración del pigmento. ESCALA ARBITRARIA

Efecto de los solventes orgánicos: Procedimiento: Separe los trozos de remolacha restantes y divídalos en siete partes iguales, proceda de la siguiente manera: Deposite en cada uno de los 7 tubos medianos, 15 mL del solvente orgánico de acuerdo a lo siguiente: En el tubo 1 solución saturada de benceno; 2 alcohol absoluto; 3 acetona, 4 detergente SDS, 5 detergente comercial y 6 detergente Tritón X-100. Un tubo con agua destilada servirá de control. Deposite en cada tubo un trozo de remolacha y tápelo, déjelos reposar durante 30 minutos, agitándolos de vez en cuando. Al final retire el trozo de remolacha y usando la misma escala anterior haga las lecturas. PARA EL INFORME Para presentar el informe debe tenerse en cuenta las siguientes tablas de datos: Efecto de la temperatura: Tratamiento Calentada a 50 °C Calentada a 70 °C Testigo T.ambiente Enfriada a 0 °C

Valor de la escala arbitraria

Efecto de los solventes orgánicos: Tratamiento C. Agua destilada 1. Solución saturada de benceno 2. Alcohol absoluto 3. Acetona 4. Detergente SDS 5. Detergente comercial 6. Detergente Tritón

Valor de la escala arbitraria

PREGUNTAS 1. ¿Qué efectos causa el cambio de temperatura en la membrana de las células vegetales (de la remolacha)? 2. ¿Qué características presentan los solventes orgánicos que permiten explicar su permeabilidad, no permeabilidad a través de la membrana celular? ¿Qué daños pueden ocasionar a la célula? (especialmente a la membrana celular). 3. Consulte sobre el pigmento de la remolacha y explique qué sucede con este pigmento en cada caso de la experiencia.

Laboratorio de Biología Celular

Reactivos

Preparación práctica 6: Transporte de iones a través de la membrana celular Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas

Equipos y materiales

Peryodato de sodio o de potasio (NaIO4 o KIO4) 5mM

Metabisulfito de sodio o potasio (NaS2O5 o K2S2O5) 5mM Ferrocianato de sodio o potasio (Na3Fe(CN)6 o (K3Fe(CN)6) 5mM Tritón Solución salina 0.9% Hepes 5mM pH 7 Solución Concentración Peryodato 5mM de sodio Metabisulfito 5mM de sodio 5mM Ferrocianato de potasio

Centrífuga Falcon 15ml (1 por mesa) Tubos de ensayo (8 por mesa)

Cantidad 100ml

Preparación Pesar 0,11g de Peryodato de sodio y diluirlo en 100ml de agua destilada 100ml Pesar 0,008g de Metabisulfito de sodio y diluirlo en 100ml de agua destilada. 100ml Tomar 0,2g y diluirlos en 100ml de agua destilada, almacenarlo en un falcon cubierto con papel aluminio Solucion 0,9% 100ml tomar 0,9g de NaCl y diluirlo en 100ml salina de agua destilada 5mM 100ml Pesar 0,12g de Hepes y diluirlo en 100ml Hepes de agua destilada Observaciones 1. Poner en un recipiente grande agua con hipoclorito de sodio concentrado para depositar los tubos, materiales con sangre y descartar sobrenadante. Para luego lavarlos y no descartarlos. Materiales que deben traer los estudiantes 1. Los estudiantes deben traer camisa, aguja y vacutainer con citrato de sodio

PRACTICA No.6. TRANSPORTE DE IONES A TRAVES DE LA MEMBRANA CELULAR INTRODUCCIÓN Las células deben conservar un ambiente interno adecuado a fin de llevar a cabo las reacciones químicas necesarias para sostener la vida. Esto es posible porque todas las células están separadas físicamente del ambiente que las rodea por una membrana plasmática que las limita y las define como una unidad distintiva. La amplia red de membranas internas de las células eucariotas forma compartimientos adicionales con características singulares para actividades muy especializadas. Las membranas celulares son estructuras muy dinámicas y complejas que se componen de moléculas de lípidos y proteínas en constante movimiento. Las propiedades poco comunes de las membranas les permiten realizar numerosas funciones, tales como: superficie para muchas reacciones químicas, regular la entrada o salida de materiales de la célula, transmitir señales e información entre el ambiente externo y el interior de la célula y ser parte indispensable de un sistema de transferencia y almacenamiento de energía. Las moléculas pueden cruzar dicha barrera ya sea por mecanismos de difusión simple o mediante mecanismos especiales. Por difusión simple (mecanismo de transporte pasivo) pueden atravesar la membrana sustancias liposolubles, moléculas pequeñas que no presentan carga (CO 2 y O2) y algunos iones. La difusión siempre se presentará a favor del gradiente de concentración o eléctrico y, por lo tanto, no requiere de energía por parte de la célula. Cuando se trata de moléculas de mayor tamaño (aminoácidos, glucosa, nucleótidos, etc.) y ciertos iones que no se difunden libremente a través de la membrana, se requiere de la participación de proteínas de la membrana. A esta forma de transporte se le conoce como mediado y puede producirse sin gasto de energía (transporte facilitado) y con gasto de energía (transporte activo) si se presenta en contra de un gradiente (Fig.1).

FIGURA 1. Transporte de sustancias a través de la membrana celular. Tomado de: https://bio2bach10.blogspot.com/2010/11/transporte-traves-de-la-membrana.html

Aunque los iones individuales, como el sodio (Na+) y el cloruro (Cl-), son bastante pequeños, en solución acuosa se encuentran rodeados por moléculas de agua y, tanto el tamaño como las cargas de los agregados resultantes impiden que los iones se deslicen a través de las aberturas momentáneas que sí permiten el pasaje de las moléculas de agua. El transporte de estos agregados y de todas las moléculas hidrofílicas, excepto las muy pequeñas, depende de proteínas integrales de membrana que actúan como transportadores, transfiriendo a las moléculas hacia uno y otro lado de la membrana sin que entren en contacto con su interior hidrofóbico. Para realizar este proceso de transporte mediado, las proteínas integrales de membrana se sirven de varios mecanismos: bombas iónicas (bombas de Na+ - K+), canales iónicos (Ca++, Cl-) y receptores de membrana. Se pueden distinguir dos tipos principales de proteínas de transporte: las llamadas proteínas transportadoras o "carrier" y las proteínas formadoras de canales (canales iónicos). Las proteínas "carrier" que se encuentran en la membrana plasmática o en la membrana que rodea a las organelas son altamente selectivas. Lo que determina qué moléculas puede transportar es la configuración de la proteína, o sea, su estructura terciaria o, en algunos casos, cuaternaria. Aunque en el curso del proceso del transporte la proteína sufre típicamente cambios en la configuración, esa alteración no es permanente. Las proteínas "carrier" son muy similares a las enzimas, que son también altamente selectivas en cuanto a las moléculas con las que interactúan y no se alteran permanentemente por esas interacciones.

FIGURA 2. Tipos de proteínas de transporte y ejemplos de transporte de sustancias a través de la membrana celular. Tomado de: https://www.researchgate.net/figure/Figura-33-Resumen-de-los-modos-deaccion-de-las-proteinas-de-transporte-en-las_fig11_324975554

El modelo actual del mecanismo de transporte llevado a cabo por proteínas carrier sugiere que la proteína transportadora se une específicamente a la molécula a transportar y sufre cambios temporales en su configuración provocados, en general, por la unión misma del soluto. Son estos cambios conformacionales los que permiten la transferencia del soluto a través de la membrana. En el sistema de transporte más simple, conocido como uniporte, un soluto en particular se mueve directamente a través de la membrana en una dirección. En el tipo de cotransporte conocido como simporte dos solutos diferentes se mueven a través de la membrana, simultáneamente y en el mismo sentido. Frecuentemente, un gradiente de concentración, que involucra a uno de los solutos transportados, impulsa el transporte del otro; por ejemplo, un gradiente de concentración de iones Na+ frecuentemente impulsa el cotransporte de moléculas de glucosa. En otro tipo de sistema de cotransporte, conocido como antiporte, dos solutos diferentes se mueven a través de la membrana, simultánea o secuencialmente en sentidos opuestos. La bomba Na+ - K+ es un ejemplo de sistema de cotransporte que implica un antiporte. Las proteínas que forman canales no se unen al soluto, sino que forman poros hidrofílicos que atraviesan la membrana permitiendo exclusivamente el pasaje de iones (canales iónicos); el tipo de ion se selecciona de acuerdo al tamaño y a la carga. Los canales iónicos se encuentran generalmente cerrados con una especie de "compuerta", que impide el pasaje de iones por el poro. Los canales pueden abrirse por un intervalo de tiempo breve como respuesta a distintos tipos de estímulos, permitiendo el pasaje de un ion específico a través de la membrana. Las proteínas canal y muchas proteínas "carrier" sólo pueden trasladar sustancias a través de la membrana en forma pasiva. Este pasaje mediado por proteínas se conoce como difusión facilitada. La glucosa, por ejemplo, es una molécula hidrofílica que entra en la mayoría de las células por difusión facilitada. Dado que la glucosa se degrada rápidamente cuando entra en una célula, se mantiene un marcado gradiente de concentración entre el interior y el exterior. Sin embargo, cuando en el medio circundante hay un número muy grande de moléculas de glucosa, la velocidad de entrada no se incrementa más allá de un cierto punto; alcanza un pico y luego permanece estacionaria en ese nivel. Este límite a la velocidad de entrada es el resultado del número limitado de moléculas de la proteína de transporte específica de la glucosa que existen en la membrana celular. El pasaje de iones a través de canales iónicos es más rápido que a través de las proteínas "carrier", ya que no requiere la unión del ion con la proteína del poro. Durante el intervalo de tiempo en que el canal se encuentra abierto, los iones difunden rápidamente a favor de su gradiente electroquímico. Esta característica de los canales iónicos es fundamental en la transmisión de señales eléctricas -impulso nervioso- en el sistema nervioso. Tanto la difusión facilitada como la difusión simple son impulsadas por un gradiente de potencial químico. Las moléculas sin carga son transportadas simplemente a

favor del gradiente, desde una región de mayor concentración a una de concentración menor. Pero, si el soluto transportado tiene carga neta (iones) su transporte no sólo depende de su gradiente de concentración sino también de la diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana (diferencia de carga eléctrica a ambos lados de la membrana debida a la distribución desigual de iones). La fuerza total que mueve el soluto en este caso es la resultante de la combinación de ambos gradientes: el eléctrico y el químico. El gradiente resultante se denomina gradiente electroquímico. Casi todas las membranas plasmáticas tienen una diferencia de potencial eléctrico, llamado potencial de membrana, en el que el lado citoplasmático de la membrana es negativo respecto al lado externo. Existen otras proteínas "carrier" que pueden trasladar moléculas contra gradiente, proceso conocido como transporte activo. En el transporte activo, las moléculas o iones se mueven contra el gradiente electroquímico, proceso análogo al de empujar una roca cuesta arriba y que requiere energía. El transporte activo es mediado siempre por proteínas "carrier"; así, las proteínas "carrier" están asociadas tanto al transporte pasivo (difusión facilitada) como al transporte activo, mientras que en los canales iónicos el transporte es únicamente pasivo. El transporte activo requiere siempre un gasto de energía, que en algunos casos es liberada de la molécula de ATP y en otros casos proviene de la energía potencial eléctrica asociada con el gradiente de concentración de un ion a través de la membrana. Por ejemplo, la glucosa es transportada desde la luz del intestino al citoplasma de las células del epitelio intestinal. Este proceso de absorción de glucosa se realiza, aunque la concentración de glucosa sea mayor en el interior de la célula, es decir contra su gradiente de concentración. Recordemos que este tipo de transporte es un cotransporte de glucosa y sodio (Na +). La energía para el movimiento de la glucosa contra su gradiente de concentración es aportada por la energía potencial eléctrica asociada al gradiente de concentración de Na+ generado, a su vez, por la bomba de sodio-potasio. EL CASO DE LOS ERITROCITOS Los glóbulos rojos de la sangre no poseen núcleo ni organelas internas, por esta razón la membrana plasmática es su única membrana y pueden ser aislados sin contaminación de otras membranas internas. La hemoglobina que no se encuentra en la membrana y constituye su principal proteína. Por su parte, la membrana de los glóbulos rojos posee aproximadamente 15 proteínas principales, con pesos moleculares de 15.000 a 250.000 Daltons: tres de ellas son Espectrina (=24.000 y =220.000), Glicoforina = 30.000 y Banda 3 = 100.000. Estas proteínas constituyen aproximadamente el 60%, en peso, del total de las proteínas de la membrana del eritrocito. Cada una de ellas presenta un arreglo diferente en la membrana (Fig. 3).

FIGURA 3. Principales moléculas y organización de la membrana del eritrocito. Tomado de: https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx? La proteína Banda 3 (glicoproteína) (Fig. 4) es un dímero (dos cadenas idénticas, cada una con 930 aminoácidos) transmembranal que cataliza el transporte acoplado de aniones (cloruro y bicarbonato), y de esta forma juega un papel importante en la función de los glóbulos rojos.

FIGURA 4. Proteína transportadora Banda 3, de la membrana celular de los eritrocitos humanos.

Fosfolípido de membrana

Colesterol

FIGURA 5. Componentes principales de la membrana celular: fosfolípido y colesterol. De todos los tipos de membranas, la membrana plasmática del eritrocito humano, es la más estudiada y la mejor comprendida. Las células son económicas en su obtención y disponibles en enormes cantidades en la sangre. Además, se encuentran como células individuales y no es necesario disociarlas de un tejido complejo. Son células sencillas y carecen de membrana nuclear que podrían

contaminar la muestra. Estas células, además, responden a choque osmótico mediante la captación de agua y se hinchan, un fenómeno conocido como hemólisis. Conforme aumenta el área, la célula presenta fugas y su contenido, formado casi en su totalidad por hemoglobina disuelta, sale de la célula y deja un “fantasma” de membrana plasmática. La hemoglobina es una proteína que posee una función importante en el organismo, esta proteína se encuentra dentro de los eritrocitos y esta se encarga del transporte gaseoso a nivel sanguíneo, tiene la capacidad de trasladar el O 2 hacia los tejidos y el CO2 hacia los pulmones, específicamente a nivel de los alvéolos para que se produzca el proceso de hematosis (intercambio gaseoso), por cada gramo de hemoglobina se transporta 1,34 ml de O2; cada eritrocito debe contener normalmente un valor de 27 a 32 picogramos de hemoglobina.

FIGURA 5. Glóbulos rojos y molécula de hemoglobina. Estructura de la hemoglobina. Tomado de: La hemoglobina logra la oxigenación de los tejidos gracias a su capacidad de asociación y disociación con el oxígeno, este proceso es denominado efecto de Bohr, este efecto consiste en el aumento de la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno cuando hay disminución de temperatura y aumento del pH lo cual ocurre a nivel pulmonar, generando la captación de oxigeno; a su vez disminuye la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno cuando aumenta la temperatura y disminuye el pH como sucede en los tejidos produciendo la liberación de oxígeno.

OBJETIVO Observar de una manera indirecta, la difusión de algunos iones a través de la membrana del eritrocito humano.

MATERIALES • • • • • • •

Tubos de ensayo Erlenmeyers Centrífuga clínica Pipetas de 1 mL Medidor de pH microscopio Cubreobjetos Portaobjetos

REACTIVOS • • • • • • •

5 mM peryodato de sodio o de potasio (NaIO4 o KIO4) De metabisulfito de sodio o potasio (NaS2O5 o K2S2O5) De ferrocianato desodio o potasio (Na3Fe(CN)6 o H3Fe(CN)6) Tritón Solución salina (0.9%) Sangre heparinizada Hepes

PROCEDIMIENTO Preparación de la Solución de Eritrocitos a. Pase 5 mL de sangre del vacutainer a un tubo Falcon y centrifugue por 10 minutos a 3500 rpm. b. Extraiga el sobrenadante (plasma) y deje sólo el precipitado (eritrocitos). c. Complete un volumen de 5 mL (con el precipitado), de solución salina al 0.9% d. Centrifugue de nuevo a 3500 rpm durante 10 minutos y extraiga el sobrenadante. e. Agregar 5 mL de solución isotónica Hepes (Buffer 5 mM, pH=6.4) y resuspender. f. Para cada tubo de ensayo se usarán 0.5 mL de la solución de eritrocitos.

1. Tomar 7 tubos de ensayo y proceder como se indica en el cuadro siguiente: SUSTANCIA EN ML Eritrocitos Ion Peryodato Ion Metabisulfito Ion Ferrocianato Agua Destilada (control) Agua Destilada Ion Peryodato Ion Metabisulfito Ion Ferrocianato

1 0.5 0.5

2 0.5

3 0.5

4 0.5

5 0.5

6 0.5

7 0.5

0.5 0.5

0.5

0.5

0.5 0.5 0.5

0.5 0.5

2. Agitar un poco cada uno de los tubos y esperar 20 minutos. 3. Observar el cambio de color que se presente en cada tubo y compararlos. 4. Luego de 90 minutos, tomar los tubos 1, 2 y 3 y agregar tres gotas de detergente Tritón X-100. Observar y comparar.

5. Analizar y sacar conclusiones.

PREGUNTAS 1. ¿Qué papel desempeña la proteína banda 3 en los eritrocitos? Explique 2. ¿Cómo es la afinidad de iones con la hemoglobina y la proteína banda 3? 3. ¿Qué tipo de ion es cada uno de los utilizados en el laboratorio? 4. Explique, en forma general, ¿cómo se produce el transporte de estos iones a través de la membrana plasmática? 5. ¿De qué manera observamos la entrada de iones a través de la membrana celular? 6. Resuelva la siguiente situación: Se extraen unas células animales que poseen dos tipos de proteínas canales transportadoras de iones. De estas proteínas, se sabe lo siguiente: • •

La proteína A, es intercambiadora catiónica con un diámetro conocido de 212 La proteína B es un intercambiador aniónico con un diámetro de 280

Si dichas células se ponen en contacto con los siguientes iones: Iones Ca2+ S-2 Be2+ O-2 Mg2+

Radio iónico 106 184 34 140 78

6.1 ¿Cuál(es) de ellos atravesaría(n) la membrana por la proteína A? 6.2 ¿Cuál(es) de ellos atravesaría(n) la membrana por la proteína B? 6.3 ¿Qué carga presenta cada proteína? Responda con argumentos. 1. Atraviesan membrana por proteína A

2. Atraviesan membrana por proteína B

JUSTIFICACIÓN

JUSTIFICACIÓN

CARGA DE LA PROTEÍNA A:

CARGA DE LA PROTEÍNA B:

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 7: Distribución de enzimas digestivas Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos Equipos y materiales Solución salina 0,9% Toallas de papel Solución de sacarosa al 5% Tubos de ensayo (10 por mesa) Solución de glucosa al 5% Caja de petri (2 ó 3) Vidrio de reloj (1 ó 2) Solución de NaOH al 0.005 N Éter o Cloroformo Solución de almidón al 1% Fenolftaleína Reactivo de Benedict Lugol Aceite de oliva Solución Concentración Solución 0,9% salina Solución de 5% sacarosa Solución de 5% glucosa 1% almidón

Papel fotográfico (10 a 15 cuadros) Cápsulas de porcelana Papel filtro Baño maría Bolsas de hielo Tijeras Cantidad Preparación 300ml tomar 2,7g de NaCl y diluirlo en 300ml de agua destilada 100ml pesar 5g de sacarosa y diluirlo en 100ml de agua destilada 50ml pesar 2,5g de glucosa y diluirlo en 50ml de agua destilada 100ml Pesar 1g de almidón y diluirlos en 100ml de agua, hervirlo y prepararlo en el momento que inicie la práctica para que no se formen grumos. 100ml tomar 0,2g y diluirlo en 1 L 20ml se toma directamente del recipiente ubicado en el estante de reactivos tomarlo directamente del recipiente ubicado en el estante de reactivos

NaOH 0.005 N Aceite de oliva Éter o cloroformo Observaciones 1. El éter o cloroformo es para sacrificar las cucarachas, esto se realiza en los recipientes de vidrio que traen los estudiantes y se hace echando algodones con éter en el interior. 2. El papel fotográfico se corta en cuadros pequeños aproximadamente del mismo tamaño. 3. se deben sacar las bolsas de gel congelado para que se macere los extractos. Materiales que deben traer los estudiantes 1. Los estudiantes deben traer tres o cuatro cucarachas en recipientes de vidrio con tapa.

PRACTICA No.7 DISTRIBUCIÓN DE ENZIMAS DIGESTIVAS INTRODUCCIÓN En los organismos superiores, a lo largo de todo su tracto digestivo, se produce una serie de enzimas que van a cumplir una misión específica en el catabolismo de sustancias determinadas. Este proceso, consiste en degradar dichas sustancias de forma compleja y llevarlas a sus unidades mínimas por las que están compuestas; de esta forma pueden ser absorbidas por el organismo. Estas enzimas son específicas y actúan en sitios determinados, en donde estas proteínas encuentren condiciones ideales a nivel de pH, temperatura y otros factores indispensables para su normal funcionamiento.

FIGURA 1. Tracto digestivo de un mamífero y sus diferentes etapas de digestión. Tomado de: https://i1.wp.com/www.innovabiologia.com/wpcontent/uploads/2016/06/diversidad-digestivo-1.jpg En los mamíferos (Figura 1), la digestión por procesos enzimáticos comienza en la boca. Las glándulas salivares segregan ptialina (amilasa), enzima que desdobla el almidón en azúcar. El estómago segrega ácido clorhídrico (HCl) que disuelve los componentes resistentes, a la vez que activa la cadena de varios zimógenos, haciendo que el alimento sea más fácilmente disponible para las enzimas digestivas. Las diversas células que recubren las paredes del estómago, también producen mucus y enzimas como la pepsina, la cual inicia el desdoblamiento de las proteínas. Sin embargo, las principales fases de la digestión tienen lugar en el intestino delgado. El páncreas y el hígado, glándulas anexas, también juegan un importante papel en la digestión.

El páncreas es una fuente importante de enzimas digestivas tal como el quimio tripsinógeno que es vertido en el intestino delgado. El hígado produce bilis, que se acumula en la vesícula biliar y después se vierte en el intestino. Esta sustancia emulsiona las grasas haciéndolas más expuestas para ser atacables por las enzimas (ver tabla 1).

Tabla 1. Enzimas digestivas. Tomado de: https://unapartepormillon.com/enzimasgastricas Los insectos poseen sistemas tan complejos como otros organismos superiores. Al igual que estos, los insectos necesitan metabolizar el alimento que consumen y reproducirse para preservar su especie. Por su parte, el aparato digestivo de los insectos es como un tubo. Generalmente, es un tubo enrollado que se extiende desde la boca al ano. Se divide en tres regiones: el estomodeo, el menestrón y el proctodeo. Además de tener un esqueleto externo, los insectos se caracterizan por: su cuerpo dividido en 3 partes: Cabeza, Tórax y Abdomen. Desarrollo por metamorfosis simple (insectos hemimetábolos) o por metamorfosis completa (insectos holometábolos). El abdomen de los insectos generalmente posee 10 segmentos y contiene muchos órganos internos. Los segmentos genitales contienen estructuras asociadas con las aberturas externas de los conductos genitales (Figura 2).

FIGURA 2. Partes internas https://sistemadigestivo.net/insectos/

de

un

insecto.

Tomado

de:

La boca de los insectos varía dependiendo del orden al que pertenezca cada uno (ver figura 3.1). Cada una de sus partes son denominados piezas bucales. Sin embargo, hay cuatro elementos que conforman la estructura primitiva de todo insecto, que son los siguientes: labro, mandíbulas, maxilas y labio. Muchos insectos poseen glándulas salivales que por no segregar siempre saliva son llamadas glándulas labiales. Estás glándulas se ubican debajo de la parte anterior de la boca de los insectos.

FIGURA 3. Boca de los insectos. 3.1 Tipos de aparato bucal de insectos. Tomado de: http://insectosbio.blogspot.com/2013/05/aparato-bucal-de-los-insectos.html y 3.2 glándulas salivares de abeja. Tomado de: https://www.pinterest.es/pin/435652963934848555/ Las funciones de estás glándulas varían. La de algunos insectos, por ejemplo, segregan seda mientras que las de otros segregan veneno. Estas secreciones se almacenan en un ensanchamiento de estas glándulas (ver figura 3.2). La forma de estás glándulas suele ser de conductos que tienen un ducto común ubicado cerca de la hipofaringe o de la base del labio.

FIGURA 4. Partes de la cabeza de un insecto. Tomado de: http://adaptacionbiologia.blogspot.com/p/blog-page_22.html El estomodeo es la parte anterior del tubo digestivo y comienza en la boca (figura 5). En esta región se distinguen subregiones como la faringe, el esófago, el buche y los proventrículos. También posee la válvula estomodeal, la cual regula el movimiento de los alimentos y de los jugos digestivos mientras pasan al mesenterón; una membrana hecha de cutícula cubre el interior del estomodeo, esta membrana puede llegar a tener pliegues y proyecciones o incluso cercas o espículas. Por cada muda del insecto, también se reemplaza esta parte. La parte anterior del estomodeo tiene músculos dilatadores. Estos están más desarrollados en insectos chupadores, los cuales utilizan la faringe como una bomba.

FIGURA 5. Partes del aparato digestivo de un insecto. Tomado de: http://biologiadeinsectos.blogspot.com/p/aparato-digestivo-en-los-animales-la.html El mesenterón, es otra región del aparato digestivo, también llamada intestino medio; consiste en un saco alargado con un diámetro que posee un diámetro uniforme y divertículos. Esta parte no posee cutícula ni segrega mucus para lubricar el alimento. En su lugar, las células epiteliales secretan quitina y proteína como una membrana conocida como membrana peritrófica. Esta tiene la función de impedir que el alimento toque las células epiteliales.

Sin embargo, es una membrana permeable que permite pasar a las enzimas digestivas en una dirección y a los productos de la digestión en la dirección opuesta. Cuando ha cumplido con su propósito, esta membrana es eliminada. El mesenterón tiene a su alrededor una capa muscular más fina en comparación a la que tiene el estomodeo. También posee el epitelio más grueso que de todas las demás partes del tubo digestivo de los insectos. Este epitelio posee proyecciones e irregularidades. El proctodeo es la parte que se encuentra al final del sistema digestivo, que se extiende desde la válvula pilórica hasta el ano. El proctodeo posee una parte posterior que se sostiene por los músculos insertados en las paredes abdominales. Hay dos partes que se pueden distinguir del proctodeo, una es el recto y la otra, el intestino anterior. Este último en algunos insectos es un simple tubo y en otros está subdividido en colon e íleo. Una cutícula cubre al proctodeo del mismo modo que lo está el estomodeo, con las diferencias de que la cutícula del proctodeo es permeable al agua y más fina. La cámara de filtración es la última parte del sistema digestivo de los insectos, la poseen muchos hemípteros, y su función es extraer el agua de los alimentos que incursionan en el estomodeo. Se conforma de dos partes que son sostenidas por tejido conectivo, la parte anterior del proctodeo y la parte posterior del mesenterón. La cámara de filtración también elimina el exceso de agua que pueden contener los alimentos que consumen los insectos chupadores.

FIGURA 6. Resumen partes de un insecto -partes del aparato digestivo. Tomado de: http://www.biologia.edu.ar/animales/celomados%201.htm Cucarachas En esta práctica se trabajará con la cucaracha, que hace parte del orden de los insectos hemimetábolos paurometábolos de cuerpo aplanado y que miden entre 3 cm a 7,5 cm. Se conocen más de 4.500 especies de cucarachas en cerca de 500 géneros. Los primeros fósiles parecidos a blatodeos datan del periodo Carbonífero, hace 354–295 millones de años.

La cabeza pequeña suele estar protegida por un pronoto en forma de escudo. Sus antenas son filiformes, sus ojos compuestos son pequeños, las patas largas, aplanadas y espinosas, y las piezas bucales masticadoras. Tiene dos pares de alas, de ellos las alas del par posterior que son grandes y membranosas están cubiertas y protegidas por las alas anteriores que son más pequeñas y están esclerotizadas. Presentan un par de cercos laterales en el extremo del abdomen.

Figura 7. Ciclo de vida de la Periplaneta americana o cucaracha común. Tomado de: https://www.castillodesatascos.com/periplaneta-americana-la-protagonista-delverano/150512-cucaracha-ciclo-vida/ La cucaracha común (Periplaneta americana), también conocida como cucaracha negra u oriental, llega a medir 3,5 cm de largo. El macho tiene alas cortas y no vuela; la hembra carece de alas. Se nutre de gran variedad de alimentos. Las cucarachas se encuentran entre los animales más resistentes del planeta, algunas especies son capaces de mantenerse activas durante un mes sin comida o siendo capaces de sobrevivir con recursos limitados. Algunas pueden vivir sin aire durante 45 minutos o ralentizar los latidos del corazón. Las cucarachas tienen una mayor resistencia a las radiaciones que los vertebrados, con una dosis letal entre 6 y 15 veces mayor que los humanos. Aun así, no son excepcionalmente resistentes a las radiaciones en comparación a otros insectos como la mosca de la fruta. La capacidad de soportar mejor las radiaciones que los humanos, se puede explicar en términos de ciclo celular. Las células son más vulnerables a los efectos de la radiación cuando se están dividiendo. Las células de la cucaracha se dividen sólo una vez cuando se encuentran en cada ciclo de muda, lo cual pasa semanalmente en cucarachas jóvenes. Las células del animal tardan 48 horas para completar un ciclo, lo que dejaría bastante tiempo a la radiación para afectarlas, pero no todas las cucarachas lo harían al mismo tiempo. Eso significa que habría no afectadas por la radiación y que por lo tanto sobrevivirían, al menos inicialmente. Las cucarachas son generalmente omnívoras. Aunque son incapaces de digerir la celulosa por ellas mismas, mantienen una relación

de simbiosis con protozoos que sí lo hacen, lo que les permite extraer nutrientes. Las cucarachas son más comunes en climas tropicales y subtropicales. Algunas especies están estrechamente relacionadas con las viviendas y se localizan en estos casos cerca de canecas de basuras o en la cocina, y en zonas con humedad y calor. Algunos datos curiosos • Las cucarachas pueden sobrevivir a la disección quirúrgica estéril de la cabeza durante un periodo muy largo, especialmente si últimamente se han alimentado, pero naturalmente son incapaces de alimentarse y mueren al cabo de unas pocas semanas por inanición. • Son capaces de soportar dosis de radiactividad de 6 a 15 veces superiores a las de los seres humanos. Sin embargo, sucumben con facilidad ante el calor excesivo ya que carecen de mecanismo regulador de temperatura. • Una cucaracha es capaz de sobrevivir durante más de un mes sin agua. En caso de necesidad, puede absorber la humedad ambiental a través de su cuerpo. • Las cucarachas han cambiado muy poco desde su aparición en el Carbonífero, hace unos 300 millones de años. • Prefieren alimentos con gran contenido en almidón, grasas y azúcares. Pueden comer desde cuero hasta pegamento. • Desarrollan su actividad durante la noche y pasan el 75% de su vida en una grieta, o pequeña cavidad. • Son prácticamente ciegas, utilizando sus antenas en contacto continuo con las superficies para detectar vibraciones, cambios de temperatura y humedad, etc. • Producen secreciones olorosas que llegan a afectar al sabor de la comida. • Sus excrementos, así como partes de su cuerpo, pueden contener un elevado número de alérgenos que en personas sensibles pueden provocar urticarias, estornudos o lagrimeo severo. • Se las considera uno de los principales vectores de transmisión de enfermedades en el ser humano a través de la contaminación de alimentos y de utensilios de cocina por simple contacto. • La mayoría de las veces las cucarachas mueren boca arriba, debido a que el rigor mortis hace que se contraigan sus patas, de forma que se desequilibran y finalmente vuelcan; o debido a espasmos causados por insecticidas. También, es una postura que suelen adoptar como mecanismo de defensa, simulando su muerte para escapar de algún peligro que las aceche. •

Las cucarachas son artrópodos transmisores de enfermedades, que pueden actuar como vectores mecánicos y como reservorio natural de gérmenes patógenos. Se ha demostrado que las cucarachas alojan y transmiten natural o experimentalmente alrededor de 40 especies de bacterias, de las que al menos, 25 pertenecen al grupo Enterobacteriaceae, causantes de gastroenteritis en el hombre. Además, se ha establecido que las cucarachas son huéspedes intermediarios de helmintos patógenos, virus, hongos y protozoos. Es posible que las cucarachas contribuyan a

la transmisión de la enfermedad de Chagas por alimentarse de chinches vectores de esa enfermedad. También hay indicios que sugieren la participación de sustancias procedentes de las cucarachas en algunos procesos alérgicos. SOBRE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS La Invertasa es una enzima que digiere carbohidratos dividiendo la sacarosa (azúcar común o azúcar de mesa) en sus componentes que son la glucosa y la fructosa. Entre los sustratos sobre los que actúa, el más significativo es la sacarosa, de ahí que la enzima se conozca también, como ya se ha señalado, con el nombre de sacarasa. Esta enzima hidroliza reversible: Sacarosa

la fructosa y ↔

la glucosa mediante

la

siguiente reacción

Glucosa + Fructosa

Estos glúcidos, además de ser ampliamente utilizados en la industria alimentaria, son fuentes principales de carbono y energía para organismos procariontes y eucariontes. El nombre de invertasa hace referencia a que los productos de la reacción son conocidos como "azúcares invertidos" debido al cambio rotacional que modifica sus propiedades ópticas; de una rotación positiva o dextrógira a una rotación negativa o levógira: Sacarosa ([α] D = + 66, 5º) + H₂O → D-glucosa ([α] D = + 52, 5º) + D-fructosa ([α] D = -92º) El primero en describir esta propiedad y en dar nombre a la enzima fue el francés Marcellin Berthelot (1827-1907) en 1860. El naturalista y químico suizo Adolph von Planta-Reichenau (1820-1895), demostró la presencia de la enzima en la miel de abeja. Esta enzima se encuentra en levaduras, normalmente en la levadura saccharomyces cerevisiae; en abejas, que utilizan la invertasa para fabricar miel a partir del néctar de las flores, en plantas y en bacterias, como por ejemplo las que se encuentran en el intestino humano.

La amilasa, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-amilasa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas salivales (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad enzimática a un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia). El pH óptimo de la amilasa salival es de 6.9. Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricación de pan para romper glúcidos complejos como el almidón, presente en la harina, en azúcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azúcares simples y convertirlos en productos de fermentación alcohólica, entre ellos el gas carbónico. Este proceso da sabor al pan y leva la masa. Las células del grano de trigo, así como la harina que de él se deriva contienen amilasas, pero en la masa estas enzimas necesitan mucho tiempo para liberar cantidades significativas de azúcares a partir del almidón. Este es el motivo de los habituales largos tiempos de fermentación (muy especialmente en ciertas masas). Las técnicas modernas de elaboración de masas incluyen la presencia de amilasas, aportadas por la harina de malta e incluso amilasas fúngicas, para facilitar y acelerar estos procesos. Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. Aportan en la eliminación del polvo y tierra de la ropa que quedan atrapados en el tejido de las telas. En la maduración de frutas la amilasa es sintetizada, degradando el almidón de las frutas en azúcar, y volviéndolas más dulces. La lipasa es una enzima que se usa en el organismo para disgregar las grasas de los alimentos de manera que se puedan absorber. Su función principal es catalizar la hidrólisis de triacilglicerol a glicerol y ácidos grasos libres. Las lipasas se encuentran en gran variedad de seres vivos. Esta enzima en humanos se encuentra en la leche materna y, según estudios bioquímicos, es idéntica a la enzima colesterol esterasa (o lipasa pancreática no específica), por lo que se supone que el origen es pancreático y llega a las glándulas mamarias a través de la circulación sanguínea. La función principal de esta lipasa gástrica es ayudar a la absorción de grasas. Hay que destacar que la producción de jugo gástrico está controlada por dos mecanismos: Nervioso (sensaciones visuales, gustativas, etc). Hormonal, a través de la hormona gastrina. En microorganismos, las lipasas se encuentran presentes para la digestión de grasas, la reconstitución del organismo y el metabolismo lipoproteico. Las células vegetales las producen para fabricar reservas de energía.

Las aplicaciones que tienen las lipasas en la industria actual son múltiples y van desde la fabricación de detergente, la industria de la leche y los quesos, panaderías para mejoramiento de sabores, industria de bebidas, producción de productos químicos de interés por medio de enlaces éster, polimerización e incluso se hacen investigaciones para la producción de biodiésel. Las Proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Usan una molécula de agua para hacerlo y por lo tanto se clasifican como hidrolasas. Es una enzima secretada por el páncreas que participa en la degradación de las proteínas o peptonas, resultantes de la acción de la pepsina gástrica. La proteasa se secreta en forma de proenzima y es activada por el jugo intestinal. Se administra junto con las otras proenzimas pancreáticas (amilasa, lipasa) cuando existe disminución de las secreciones pancreáticas. Si se tiene una deficiencia de proteasa, la salud podría verse afectada en gran medida. Una falta de proteasa puede provocar una acumulación alcalina en el torrente sanguíneo, dando lugar a síntomas tales como ansiedad. Las proteasas también se utilizan para digerir organismos como bacterias y hongos. Las personas que tienen deficiencia son más susceptibles a las infecciones por hongos, bacterias y virus, ya que el cuerpo no tiene esa primera línea para romperlos. La falta de proteasas también puede dar lugar a problemas tales como enfermedades de deficiencia de calcio e hipoglucemia. Las proteínas son necesarias para llevar calcio al torrente sanguíneo, y si el cuerpo lo procesa incorrectamente, no recibirá la cantidad adecuada para prevenir enfermedades como la osteoporosis o la artritis. Dado que la proteína también se convierte en glucosa, si no se convierte correctamente, el nivel de azúcar en la sangre del cuerpo se reducirá a niveles peligrosos. Para las personas que son deficientes en proteasas, la terapia de enzimas está disponible para ayudar a mantener niveles saludables. Es así como las enzimas proteasas descomponen o cambian la composición de las proteínas o péptidos. Además de ser importantes para el proceso de la digestión y el metabolismo, se cree que algunas enzimas proteasas mejoran la inflamación y fortalecen el sistema inmunológico. Aunque las enzimas proteasas se pueden tomar en forma de suplemento y pueden ser añadidas a ciertos alimentos, también se encuentran naturalmente en ciertas frutas. Papaya: Se trata de una fuente muy potente de la enzima papaína de proteasa, así como una enzima similar llamada chmyopapain. Estas enzimas tienen un mecanismo anti-inflamatorio y también puede desempeñar un papel en la cicatrización de quemaduras. Piña: La piña es una fuente excelente del compuesto de bromelina que contiene proteasa y se cree que ayuda en la digestión, así como en la reducción de la coagulación sanguínea y la inflamación. Además, la bromelina puede tener la

capacidad de reducir el crecimiento de ciertos tipos de tumores. La bromelina se extrae con frecuencia desde el núcleo o tallo de la piña para su uso en suplementos. Kiwi: El kiwi contiene actinidina, una enzima proteolítica con actividad similar a la papaína. La actinidina representa la mitad del contenido de proteínas solubles del kiwi. En algunos casos, la actinidina puede ser un alérgeno y es a veces relacionada con una reacción de hipersensibilidad pocos minutos después de comer kiwi. El zumo de fruta de kiwi se utiliza a veces como un ablandador de carne, debido en parte a la actividad proteolítica de la actinidina.

1. OBJETIVOS Al terminar esta práctica el estudiante logrará: Determinar la producción o no de algunas enzimas digestivas en el tracto digestivo de un animal. Identificar, por medio de reacciones específicas, cada una de dichas enzimas. Determinar experimentalmente los sitios donde se localiza la máxima concentración de la amilasa, la invertasa, las proteasas y las lipasas en el tracto digestivo de un animal. Asociar la actividad de una enzima específica sobre su sustrato, con el sitio donde actúa y las condiciones para que realice su actividad óptima. 2. MATERIALES Un animal (cucaracha, grillo, etc.) Equipo de disección Toallas de papel y algodón Tubos de ensayo Cajas de Petri Pipetas y goteros Trozos de película fotográfica velada Cinta de enmascarar Mortero y mango en congelador Gradilla Baños de maría a 37 °C y 100 °C. REACTIVOS Solución de NaCl al 0.87% Solución de sacarosa al 5% Solución de glucosa al 5%. Solución de NaOH al 0.005 N Éter o Cloroformo Solución de almidón al 1% recién hervido Fenolftaleína Lugol Reactivo de Benedict Aceite de oliva

MÉTODO Se duerme el animal con éter o acetona y con la ayuda del equipo de disección se extrae el aparato digestivo, dividiéndolo luego en 4 partes: Buche, proventrículo, intestino medio e intestino posterior, con la debida indicación del profesor (a) o monitor (a).

Intestino Anterior

Intestino Medio

Intestino Posterior

Proventrículo FIGURA 8. Disección de cucaracha. Tomadas de: http://cucarachasss.blogspot.com/2016/09/caracteristicas.html y https://entomologiaultima.blogspot.com/2017/05/el-sistema-digestivo-de-los-insectos.html

Tomar luego una fracción de cada parte y lavar suficientemente en solución salina (0.9% m/v) para eliminar desechos. Macerar en frío cada fracción por separado en un mortero, con unos 5 mL de solución salina al 0.9% m/v. Marcar cinco tubos de ensayo así: IA (intestino anterior), PR (proventrículo), IM (intestino medio), IP (intestino posterior), TD (todas las fracciones), para depositar allí las soluciones obtenidas después del macerado. El tubo TD, se obtiene sacando 0.5 mL de cada macerado (IA+ PR + IM + IP).

Sacar 2 mL del tubo TD para llevarlo al baño de maría a 100 °C y dejar por 10 minutos en agua hirviendo. Con los macerados (homogenizados) se realizarán pruebas para determinar las siguientes enzimas: invertasa, amilasa, lipasas y proteasas.

Prueba para determinar Invertasa (sacarasa) Se toman 6 tubos previamente identificados con cada una de las fracciones del sistema digestivo, las dos últimas se identificarán como controles: negativo y positivo, respectivamente. A los 5 primeros tubos, se les agrega 1 mL de solución de sacarosa al 5% y 0.5 mL de cada uno de los homogenizados, incluyendo el que estaba en agua hirviendo. Al tubo 6 (control positivo) se le adiciona 1 mL de solución de glucosa al 5% y 7 gotas de Reactivo de Benedict.

Se llevan todos los tubos a baño de maría 37 °C por 10 minutos, luego se le agregan unas 7 gotas de Reactivo de Benedict a los 5 tubos que no tenían. Finalmente se llevan al baño de maría hirviendo (100°C) hasta observar cambio de color. Analizar los resultados. Prueba para determinar Amilasa Se toman 6 tubos previamente identificados con cada una de las fracciones del sistema digestivo, las dos últimas se identificarán como controles: negativo y positivo, respectivamente. A los 5 primeros tubos, se les agrega 1 mL de solución de almidón al 1% recién hervido y que no presente grumos y 0.5 mL de cada uno de los homogenizados, incluyendo el que estaba en agua hirviendo. Al tubo 6 (control positivo) se le adiciona de 1 mL de solución de almidón al 1% recién hervido y 7 gotas de Reactivo de Benedict. Al cabo de 10 minutos de incubación al 37 °C, se saca una gota de cada tubo, se ubica en una caja de Petri y se agrega una gota de reactivo de Lugol.

Observar y concluir. Se espera otros 10 minutos en incubación y luego se le agregan 7 gotas de Reactivo de Benedict a los 5 tubos que no tenían. Finalmente se llevan al baño de maría hirviendo hasta observar cambio de color.

Prueba para determinar Lipasa A los 5 primeros tubos, se les agrega los reactivos en el siguiente orden estricto: 1 mL de agua destilada 3 gotas de aceite de oliva 2 gotas de fenolftaleína Solución de NaOH al 0.005 N hasta obtener color rosado claro 0.5 mL del extracto correspondiente Incubar a 37 °C por 10 minutos. Al tubo 6 se le agrega 1 mL de agua destilada, 2 gotas de fenolftaleína y solución de NaOH hasta obtener el color rosado claro.

Se llevan todos los tubos a baño de maría a 37°C por 10 minutos. Luego, se titulan todos los tubos contando la cantidad de NaOH (0.005 N) que se gastan por cada tubo, para llegar de nuevo al color rosado claro. A mayor volumen gastado de NaOH, mayor actividad de las lipasas. Analice los resultados. Prueba para determinar Proteasas: Se toma una caja de Petri y se le coloca un papel de filtro previamente dividido en 6 partes iguales con un lápiz y se remoja. Se le coloca luego 6 trozos de película velada con el lado de la albúmina hacia arriba y se le agrega a cada trozo 1 gota de cada uno de los cinco homogenizados.

Se lee luego de 24 horas lavando cada trozo de película con agua de grifo. Donde se produzca transparencia, hubo acción de las proteasas. Se observa y analiza resultados. 3. PREGUNTAS 1. ¿Qué son los zimógenos y dónde se producen? 2. ¿Cuál es el orden de activación de la serie de enzimas que degradan las proteínas? 3. ¿Por qué cuando se hace la prueba de sacarosa y de la amilasa, en todos los tubos se obtiene coloración? ¿Qué colores se consideran positivos y por qué? 4. ¿Cuál es la razón para no utilizar una solución amortiguadora (buffer) en esta práctica? 5. ¿Qué enzimas producen las diversas glándulas anexas al sistema digestivo y donde de segregan?

6. Dibuje el sistema digestivo de la cucaracha e indique las zonas en las que se encontró mayor presencia de las enzimas digestivas estudiadas.

7. Elabore una tabla que muestra en cada prueba, cuál es la enzima, el sustrato, el complejo sustrato formado y los productos luego de la acción de la enzima.

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 8: Enzimas respiratorias y sus funciones Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos Equipos y materiales Solución salina al 0.9% Centrifuga Carbón activado Baño maría Cianuro de Potasio (KCN) al 0.5% cuchillo Azul de Metileno al 1/5000 Capsulas de porcelana Agua destilada bolsas de hielo Aceite mineral Fenildiamina al 0.2% Buffer Fósfato pH 7.4 a 0.1 N Succinato de Sodio 0.1 N Malonato de Sodio 0.1 N Solución Concentración Cantidad Preparación Cianuro de 0,5% 100ml Tomar 0,5g de KCN y diluirlos en 100ml de Potasio agua destilada (KCN) 0,5g Se pesan y se agregan los 0,5g al Carbón sobrenadante de musculo para obtener la activado enzima Succinato de 0, 1 N 100ml Pesar 1,189 g del ácido succínico y diluirlos en Sodio 100ml de agua destilada Malonato de 0,1N 100ml Pesar 0,59g de ácido málico y diluirlos en Sodio 100ml de agua destilada Soluciones que Preparación Preparación contiene el de las del Buffer buffer soluciones Pesar en una se toman 80, balanza muy 6 ml de bien Na2HPO4 y calibrada se mezclan 2,388g del con 19,6ml reactivo y Na2HPO4 de KH2PO4 100ml Buffer fosfato 0,1 N a un pH disolverlo en se lleva esta de 7.4 100ml de solución a un agua pH de 7.4 destilada Pesar 0,908g del reactivo y KH2PO4 disolverlo en 100ml de agua destilada 0,2% 100ml Pesar 0,2g de fenilendiamina y diluirlos en Fenildiamina 100ml de agua destilada

Observaciones •

El Na2HPO4 toma tiempo disolverlo, pero después de una agitación vigorosa disuelve.

•

El azul de metileno es muy importante para visualizar los resultados por lo tanto no puede ser muy claro ni muy oscuro, la clave es tomar 10 gotas de azul al 1% y adicionarle 50ml de agua además no es necesario cubrir el recipiente con papel aluminio debido a que NO ES FOTOSENSIBLE.

•

La fenilendiamina es Muy FOTOSENSIBLE por lo tanto es necesario echarla en un recipiente oscuro o cubierto con aluminio, por otro lado, aclarar a los estudiantes que deben agregarla justo cuando ya tengan todo listo para hacer el experimento, porque se pueden alterar los resultados fácilmente

Materiales que deben traer los estudiantes Los estudiantes deben de traer: 1. ¼ libra de músculo de cerdo. 2. Corazón

PRACTICA No. 8. ENZIMAS RESPIRATORIAS Y SUS FUNCIONES INTRODUCCIÓN La glucólisis se entiende como el desdoblamiento de la glucosa hasta ácido pirúvico. Este proceso se realiza en el citosol con la participación de todo un grupo de enzimas y coenzimas localizadas en este mismo sitio. Luego de aquí, el piruvato puede seguir diferentes alternativas dependiendo de circunstancias: En muchos microorganismos que viven en condiciones anaerobias, el destino del ácido pirúvico es desdoblarse en una molécula de etanol y otra de anhídrido carbónico. En los músculos y otros tejidos animales y vegetales, la coenzima NAD+ se regenera en la reacción por la cual este ácido es reducido a lactato. Es pues el ácido láctico el producto final de la glucólisis anaerobia en los animales: proceso conocida como fermentación láctica. En presencia de oxígeno, la reacción puede continuar en la mitocondria (o en el mesosoma en organismos procariotas aeróbicos) hasta la oxidación completa de ácido pirúvico para convertirse en dióxido de carbono y agua. La glucólisis es una vía metabólica que tiene lugar en el citoplasma celular, mediante este proceso se toma una molécula de glucosa a partir de la cual a través de una serie de procesos se forman 2 moléculas de piruvato, 2 ATP y 2 NADH. La glucólisis puede llevarse a cabo tanto en hígado como en tejido adiposo y muscular; además representa la principal fuente de energía del eritrocito y del cerebro (fig. 1).

FIGURA 1. Proceso de glicólisis en hígado, músculo esquelético, tejido adiposo y cerebro. Tomada de: https://biovitanet.wikispaces.com/Glic%C3%B3lisis.

Este proceso se realiza en dos fases: una cíclica y otra acíclica. El primer paso es la conversión del piruvato en acetato por oxidación, con la eliminación de una molécula de CO2 y la formación de una de NADH2 entrándose en el ciclo de Krebs o ciclo de ácido cítrico. La característica fundamental del ciclo es que el acetato de2 carbonos se combina con el oxaloacetato de 4 carbonos para formar el cítrico de 6 carbonos. Este se desdobla en diferentes etapas y con la ayuda de una serie de enzimas y coenzimas genera 3 moléculas de NADH2, una de FADH2 y una de ATP con el desprendimiento en el proceso de 2 moléculas de CO2. A continuación, comienza el proceso por medio del cual se utiliza el oxígeno y que se conoce como respiración celular. Se realiza en una serie de etapas catalizadas por enzimas que están directamente asociadas con la producción de ATP. La cadena de intermediarios está dispuesta en forma tal que cada vez que los átomos de hidrógeno pasan de un intermediario a otro, se libera una pequeña cantidad de energía que es acumulada en una molécula de ATP. La cadena se conoce como cadena de electrones y el proceso como fosforilación oxidativa. Las reacciones que ocurren en la glucólisis (figura 2), son: 1. La glucosa por acción de la enzima hexoquinasa es fosforilada en su posición 6 obteniéndose de esta forma el compuesto glucosa 6P. En esta reacción se requiere de un ATP que sale en forma de ADP. Esta reacción es de tipo irreversible. 2. La glucosa 6P es isomerizada al compuesto fructosa 6P por acción de la enzima glucosa fosfato isomerasa. Siendo esta reacción de tipo reversible. 3. La fructosa 6P es fosforilada en su posición 1 mediante la utilización de ATP formando fructosa 1,6 bifosfato por acción de la fosfofructoquinasa I. Esta reacción es irreversible. 4. El compuesto fructosa 1,6 bifosfato por acción de una aldolasa forma gliceraldehído 3P y dihidroxiacetona. Ahora bien, la dihidroxiacetona es isomerizada a gliceraldehído 3P por acción de la enzima fosfotriosa isomerasa. Esta es una reacción reversible. 5. La molécula de gliceraldehído 3P por acción de la enzima gliceraldehído 3P deshidrogenasa formará 1,3 bifosfoglicerato, en este proceso se requiere de una coenzima oxidada que será reducida, además de la utilización de Pi. Esta reacción es reversible. 6. El 1,3 bifosfoglicerato a través de la enzima fosfogliceratoquinasa forma 3 fosfoglicerato, en esta reacción ocurre una fosforilación a nivel de sustrato. Y esta es una reacción reversible. 7. El 3 fosfoglicerato por acción de la fosfoglicerato mutasa forma 2 fosfoglicerato, es decir, el fosfato es cambiado de su posición. Esta reacción es reversible.

8. El 2 fosfoglicerato por acción de la enolasa forma 2 fosfoenol piruvato. Siendo esta reacción de tipo reversible. 9. El 2 fosfoenol piruvato por acción de la piruvato quinasa forma piruvato y en esta reacción ocurre otra fosforilación a nivel de sustrato, liberándose de esta forma un ATP. Esta reacción es irreversible.

FIGURA 2. Reacciones que ocurren en la https://biovitanet.wikispaces.com/Glic%C3%B3lisis

glucólisis.

Tomado

de:

De esta manera, la glucólisis se define como una serie de reacciones que extraen energía de la glucosa al romperla en dos moléculas de tres carbonos llamadas piruvato. La glucólisis es una vía metabólica ancestral —o sea, que su evolución ocurrió hace mucho tiempo— y se encuentra en la gran mayoría de los organismos vivos hoy en día. En los organismos que realizan respiración celular, la glucólisis es la primera etapa de este proceso. Sin embargo, la glucólisis no requiere de oxígeno, por lo que muchos organismos anaerobios —organismos que no utilizan oxígeno— también tienen esta vía. La glucólisis ocurre en el citosol de una célula y se puede dividir en dos fases principales: la fase que requiere energía y la fase en la que se libera energía. Cada reacción de la glucólisis es catalizada por su propia enzima. La enzima más importante para la regulación de la glucólisis es la fosfofructocinasa, que cataliza la

formación de la inestable molécula de azúcar con dos fosfatos, fructuosa-1,6bifosfato. La fosfofructocinasa acelera o frena la glucólisis en respuesta a las necesidades energéticas de la célula. En resumen, la glucólisis convierte una molécula de glucosa de seis carbonos en dos moléculas de piruvato de tres carbonos. El producto neto de este proceso son dos moléculas de ATP (4 ATP producidos, menos 2 ATP invertidos) y dos moléculas de NADH. ¿Qué le sucede al piruvato y al NADH? Al final de la glucólisis nos quedan dos moléculas de ATP, dos de NADH y dos de piruvato. Si hay oxígeno presente, el piruvato se puede degradar (oxidar) hasta dióxido de carbono en la respiración celular y así obtener más moléculas de ATP. Y en ausencia de oxígeno sigue la ruta de la fermentación. El NADH no puede solo estar por ahí en la célula, acumulándose. Eso es porque las células solo tienen un cierto número de moléculas de NAD+, que va y regresa entre sus estados oxidado NAD+ y reducido NADH:

La glucólisis necesita NAD+ para aceptar electrones durante una reacción específica. Si no hay NAD+ disponible (porque todo está en forma de NADH, esta reacción no puede ocurrir y la glucólisis se detiene. Por lo tanto, todas las células necesitan una forma de convertir NADH de NAD+ para mantener la glucólisis funcionando. Principalmente, hay dos formar de lograr esto. Cuando hay oxígeno presente, el NADH puede donar sus electrones a la cadena de transporte de electrones y así regenerar NAD+ para usar en la glucólisis. (Se produce un poco de ATP). En ausencia de oxígeno, las células pueden usar otras vías más simples para regenerar NAD+. En dichas vías, el NADH dona sus electrones a una molécula aceptora en una reacción que no genera ATP, pero regenera NAD+ y la glucólisis puede continuar. Este proceso se llama fermentación. La fermentación es una de las principales estrategias metabólicas de muchas bacterias. Incluso algunas células del cuerpo humano, como los glóbulos rojos, dependen de la fermentación para generar su ATP. La fermentación y la respiración celular comienzan del mismo modo, con la glucólisis. Sin embargo, en la fermentación, el piruvato producido en la glucólisis no continúa su oxidación ni hacia el ciclo del ácido cítrico, y no funciona la cadena de transporte de electrones. Dado que la cadena de transporte de electrones no es

funcional, el NADH que se produce en la glucólisis no puede entregar allí sus electrones para regresar a NAD+. Las células musculares llevan a cabo la fermentación láctica, pero solo cuando tienen muy poco oxígeno como para continuar la respiración aeróbica, como cuando haces ejercicio muy intenso. Alguna vez se pensó que la acumulación de lactato en los músculos era responsable del dolor causado por el ejercicio, pero investigaciones recientes sugieren que tal vez esa no sea la razón. El ácido láctico producido en las células musculares se transporta a través del torrente sanguíneo hacia el hígado, donde se vuelve a convertir en piruvato y se continúa de manera normal con las reacciones restantes de la respiración celular.

1. OBJETIVOS • • • •

Observar la forma como funcionan algunas enzimas y coenzimas implicadas en el desdoblamiento de la glucosa. Demostrar la relación enzima-coenzima y sustrato en la acción de la deshidrogenasa láctica. Verificar la inhibición competitiva que realiza el malonato sobre el succinato deshidrogenasa. Obtener, lo más puramente posible, tanto la coenzima NADH 2, como las demás enzimas a trabajar en esta práctica.

2. • • • • • • •

MATERIALES Tubos de ensayo. Beakers. Centrífuga clínica. Pipetas y gasa. Equipo de disección. Hielo y baño María. Músculo de cerdo y corazón

3. • • • • • • • • • •

REACTIVOS Solución salina al 0.9%. Carbón activado. Cianuro de Potasio (KCN) al 0.5%. Azul de Metileno al 1/5000. Agua destilada. Aceite mineral. Fenildiamina al 0.2%. Buffer Fosfato pH 7.4 a 0.1 N Succinato de Sodio 0.1 N. Malonato de Sodio 0.1 N.

4. PROCESO Colocar el corazón en hielo y remover el tejido muscular de la pierna del animal para la preparación de la enzima y la coenzima de la deshidrogenasa láctica. 1. Preparación de la Enzima Tome aproximadamente 6 gramos de músculo de la pierna de cerdo y macere en frío. Añada unos 6 mL de solución salina al 0.9% y homogenice. Luego filtre con gasa y centrifugue durante 5 minutos a 3500 rpm y retire el sobrenadante que contiene la enzima deshidrogenasa láctica. Para remover cualquier resto de coenzima de la preparación enzimática, añada a la solución 0.5 gramos de carbón activado y mezcle por inversión. Deje reposar la muestra agitándola de vez en cuando, durante veinte minutos. Luego centrifugue por 5 minutos a 3500 rpm la mezcla y guarde el sobrenadante, que será la solución de enzima pura. Rotule en tubo de ensayo o Falcon “ENZIMA” y guarde en hielo. 2. Preparación de la Coenzima Tome aproximadamente 6 gramos de músculo de la pierna de cerdo, coloque agua bien caliente y macere. Lleve un baño de agua hirviendo durante 10 minutos con el fin de destruir las enzimas musculares. Luego de enfriarse, filtre con gasa y centrifugue durante unos 5 minutos a 3500 rpm. Retirar el sobrenadante y rotular como “COENZIMA”. Guardar en hielo.

a) Acción de la deshidrogenasa láctica y su coenzima Para demostrar la relación enzima, coenzima y sustrato, coloque las siguientes mezclas en tubos de ensayo:

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 ENZIMA 1 mL 1 mL 1 mL ----------COENZIMA -----------1 mL 1 mL 1 mL KCN 0.5% 1 mL 1 mL ----------1 mL AZUL DE METILENO AL 1/50000 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL AGUA DESTILADA 1 mL -----------1 mL 1 mL Agite los tubos con frecuencia y anote cualquier cambio de color. Explique la razón para el comportamiento de cada tubo.

3. Preparación del Complejo enzimático Lave bien el tejido del corazón con solución salina al 0.9% y con una tijera córtelo en pequeños trocitos. Macerar en mortero y agregar 10 mL de solución salina al 0.9 %. Filtrar (homogenizar) en gasa y usar el sobrenadante. Ubique el sobrenadante en un tubo limpio, rotúlelo y colóquelo entre hielo. Esta preparación contiene no solamente la deshidrogenasa succínica, sino los citocromos y la citocromo oxidasa. Rotule como “COMPLEJO ENZIMÁTICO”.

b) Acción de la Citocromo-Oxidasa y Deshidrogenasa Succínica Prepare 3 tubos de ensayo de la siguiente forma:

PREPARADO DE CORAZÓN KCN 0.5% AGUA DESTILADA FENILENDIAMINA 0.2%

TUBO 1A TUBO 2A TUBO 3A 1 mL 1 mL ------------------------------1 mL ---------------1 mL -----------------2 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Agite los tubos con frecuencia y anote cualquier cambio de color. Explique la razón para el comportamiento de cada tubo.

De nuevo prepare 3 tubos de ensayo en la siguiente forma: OJO: Tenga todos los reactivos en el tubo de ensayo antes de agregar el preparado de corazón (deshidrogenasa succínica).

AZUL DE METILENO AL 1/5000 AGUA DESTILADA BUFFER pH 7.4 SUCCINATO DE SODIO 0.1% PREPARADO DE CORAZÓN

TUBO 1B 0.5 mL 2.0 mL 1.0 mL ---------------1.0 mL

TUBO 2B 0.5 mL 1.5 mL 1.0 mL 1.0 mL 0.5 mL

TUBO 3B 0.5 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Mezcle por inversión, deje reposar los tubos y anote el tiempo necesario para la decoloración del azul de metileno. Explique los resultados en cada tubo.

c. Inhibición Competitiva de la Deshidrogenasa Succínica por el Malonato: Prepare 3 tubos de ensayo con las siguientes sustancias. Recuerde que la enzima es la última en ser agregada.

AZUL DE METILENO AL 1/5000 AGUA DESTILADA BUFFER pH 7.4 MALONATO DE SODIO 0.1 M SUCCINATO DE SODIO 0.1 M PREPARADO DE CORAZÓN

TUBO 1 0.5 mL 0.6 mL 1.0 mL ---------------0.1 mL 1.0 mL

TUBO 2 0.5 mL 0.5 mL 1.0 mL 0.1 mL 0.1 mL 1.0 mL

TUBO 3 0.5 mL 0.4 mL 1.0 mL 0.2 mL 0.1 mL 1.0 mL

Mezcle por inversión. Anote el tiempo requerido para la decoloración del azul de metileno. Explique los resultados obtenidos en cada tubo. RECUERDE

5. PREGUNTAS 1. ¿Cuál es el aceptor de electrones procedentes del ácido succínico en condiciones fisiológicas? 2. ¿Qué es un inhibidor competitivo y cuáles son sus características? 3. ¿Qué es un inhibidor no competitivo y cuáles son sus características? 4. ¿Cómo se pueden diferenciar estos inhibidores en el laboratorio? 5. ¿Qué otras enzimas del ciclo de Krebs se pueden inhibir y con qué sustancias? Mencione algunas. 6. Explique la formación del complejo enzima-sustrato usando los resultados de esta práctica. 7. ¿Cómo se puede relacionar los resultados obtenidos con el inhibidor y el mecanismo de resistencia a los antibióticos que se presenta en los seres humanos? 8. Describa la importancia de las enzimas en el metabolismo de los seres vivos.

9. Analice la siguiente situación: Si un inhibidor no competitivo no impide que la enzima se una con el sustrato. ¿Cuál sería el efecto de aumentar la concentración de sustrato en presencia de un inhibidor no competitivo?

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 9: Glicólisis y fermentación Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos Equipos y materiales Levadura en solución 7% Baño maria a 37°C Glucosa 7% Tubos de ensayo (10 por mesa) Fructosa 7% Tapones de plástico Galactosa 7% Agujas grandes Sacarosa 7% Papel milimetrado Lactosa 7% Maltosa 7% Floruro de sodio 7% Agua destilada

Solución Concentración 7% Levadura Glucosa Fructosa Galactosa Sacarosa Lactosa Maltosa Fluoruro de sodio

Cantidad 100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

7%

100 ml

Preparación Pese 7g de levadura en grano y disuélvala en 100 ml de agua del grifo. Pese 7g de glucosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de fructosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de galactosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de sacarosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de lactosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de maltosa y disuélvala en 100 ml de agua destilada Pese 7g de fluoruro de sodio y disuélvala en 100 ml de agua destilada

Observaciones 1. Cortar tirillas de papel milimetrado y colocar una en cada mesa. 2. Fijarse si la levadura esta vencida para pedir a los estudiantes que traigan 3. en caso de que el baño maría este malo calentar agua hasta 37°C y repartirla en beakers grandes a cada grupo para que introduzcan los tubos de ensayo con solución.

Materiales que deben traer los estudiantes Levadura en caso de que en el laboratorio no haya

PRACTICA No. 9. GLUCÓLISIS Y FERMENTACIÓN 1. MARCO TEÓRICO De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente anaeróbicas, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxígeno. La mayoría son microorganismos, en particular aquellas especies propias del ambiente que tienen poco oxigeno o que carecen de él, es decir, en suelos, aguas profundas o en el lodo marino. Entre ellos algunos son patógenos (organismos que producen enfermedades). Un ejemplo de las bacterias del suelo Clostridium welchii, causa de la gangrena gaseosa en infecciones de heridas. Sucede, sin embargo, que hay gran cantidad de organismos que pueden vivir en ausencia y en presencia de oxígeno. Entre ellos se incluyen no solo microorganismos, sino también muchos animales superiores y plantas. Incluso ciertos tejidos del organismo pueden funcionar anaeróbica o aeróbicamente. Las células que pueden vivir bajo ambas condiciones, reciben el nombre de células facultativas. El aspecto significativo de ellas es que cuando el oxígeno está ausente de su medio ambiente, puede extraer energía de la glucosa, mediante el mismo tipo de mecanismo de fermentación anaeróbica que utilizan las aeróbicas estrictas, mientras que en presencia de oxigeno prefieren oxidar completamente los alimentos hasta la formación de agua y gas carbónico mediante dicho elemento.

FIGURA 1. Rendimiento energético del proceso de glucolisis y de la fermentación. Tomado de: http://slideplayer.com/slide/10753332/

La fermentación alcohólica es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, sirve con cualquier sustancia que tenga la forma empírica de la glucosa, es decir, que sea una Hexosa.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. La transformación del mosto de uva en vino es un proceso complejo en el que las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae, juegan el papel más destacado. Durante la vinificación, las levaduras utilizan los azúcares glucosa y fructosa y otros componentes del mosto para su crecimiento. Los azúcares son transformados principalmente en etanol y anhídrido carbónico y, en menor medida, en otros compuestos que son responsables de la composición química y las cualidades sensoriales del vino; estos compuestos reciben el nombre de productos secundarios. En el siguiente esquema, puedes observar la reacción química realizada por las levaduras: Glucosa + levadura ----- alcohol + gas carbónico + calor + productos secundarios + ATP

FIGURA 2. Fermentación alcohólica. Tomado de: http://urbinavinos.blogspot.com.co/2014/11/fundamentos-de-la-fermentacion.html

Las levaduras Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma esférica) de un tamaño entre los 2 a 4 μm y que están presentes de forma natural en algunos productos como las frutas, cereales y verduras. Son lo que se denominan: organismos anaeróbicos facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno. Se puede decir que el 96% de la producción de etanol la llevan a cabo hongos microscópicos, diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis, Torulaspora y Zymomonas mobilis. Los microorganismos responsables de la fermentación son de tres tipos: bacterias, mohos y levaduras. Cada uno de estos microorganismos posee una característica propia sobre la fermentación que son capaces de provocar. En algunos casos son capaces de proporcionar un sabor característico al producto final (como en el caso de los vinos o cervezas). A veces estos microorganismos no actúan solos, sino que cooperan entre sí para la obtención del proceso global de fermentación. Cuando el medio es rico en azúcar, la transformación del mismo en alcohol hace que la presencia de una cierta concentración (generalmente expresada en grados brix) afecte a la supervivencia de levaduras no pudiendo realizar la fermentación en tal medio (las altas concentraciones de azúcar frenan los procesos osmóticos de las membranas de las células). Aunque hay distintos tipos de levaduras con diferentes tolerancias a las concentraciones de azúcares y de etanol, el límite suele estar en torno a los 14 o de alcohol para las levaduras del vino, por ejemplo. Los azúcares empleados en la fermentación suelen ser: dextrosa, maltosa, sacarosa y lactosa (azúcar de la leche). Los microorganismos 'atacan' específicamente a cada una de los hidratos de carbono, siendo la maltosa la más afectada por las levaduras. Otros factores como el número de levaduras (contadas en el laboratorio, o la industria, a veces mediante cámaras de Neubauer).

FIGURA 3. Enzimas que participan en la fermentación

Algunas enzimas participan en la fermentación, como puede ser la diastasa o la invertasa. Aunque la única responsable de convertir los hidratos de carbono en etanol y dióxido de carbono es la zimasa. La zimasa es la responsable final de dirigir la reacción bioquímica que convierte la glucosa en etanol. La idea de que una sustancia albuminoide específica desarrollada en la célula de la levadura llega a producir la fermentación fue ya expuesta en el año 1858 por Moritz Traube como la teoría enzimática o fermentativa y, más tarde, ha sido defendida por Felix HoppeSeyler hasta llegar al descubrimiento de Eduard Buchner que llegó a hacer la fermentación sin la intervención de células y hongos de levadura.

2. OBJETIVOS • • •

Observar los efectos, en una situación simulada, del glicólisis que en realidad se efectúa en los seres vivos. Verificar la inhibición ocasionada en la ruta metabólica del glicólisis por el NaF. Determinar, por medio de la literatura, la clase y el modo de inhibición de los fluoruros, lo mismo que el sitio de acción dentro de la ruta glucolítica.

3. MATERIALES • • • • •

Tubos de ensayo. Beakers de 300 mL. Baño de maría. Tapones. Papel milimetrado.

4. REACTIVOS • • • •

Levadura fresca (5 al 10%). Glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, lactosa y maltosa (5 al 10%). Fluoruro de Sodio (5 al 10%). Agua destilada.

5. MÉTODO Marque tres tubos de ensayo: A, B, C y prepárelos de la siguiente forma: Tubo A: Llene una tercera parte con suspensión de levadura, luego agregue agua destilada hasta llenarlo totalmente. Tubo B: Llene una tercera parte con suspensión de levadura y agregue solución de glucosa hasta llenarlo totalmente. Este tubo se hará también con otros carbohidratos como: fructosa, galactosa, sacarosa, lactosa y maltosa, así que márquelos como B1, B2, B3, …

Tubo C: Llene una tercera parte con suspensión de levadura, agregue otra tercera parte con solución de glucosa y termine de llenarlo con solución de fluoruro de sodio (NaF). Tome los tubos y colóqueles un tapón de corcho o caucho (cuidando de que no quede muy apretado) e inviértalos para que el tubo quede “boca abajo”; colóquelos en un beaker que contenga agua a 37 °C. Si el procedimiento estuvo bien hecho sólo quedará una pequeña burbuja de aire en la parte superior. Mida la longitud de la burbuja, si se formó, y anote en milímetros. Debe llevar los tubos debidamente marcados y dentro del beaker al baño de maría a 37 °C y examinarlos cada diez minutos hasta completar 60 (6 lecturas). Anote cada 10 minutos los resultados en el cuadro. Tubo Contenido

Tiempo

A

Levadura y agua

B

Levadura y glucosa

B1

Levadura y fructosa

B2

Levadura y sacarosa

C

Levadura, glucosa y NaF

0

10

20

30

40

50

60

Longitud de la burbuja (mm) Haga una gráfica con los datos anteriores, colocando en las ordenadas (eje Y) el tiempo en minutos y en las abscisas (eje X) la producción de CO2 en mL. Explique los resultados: A (Agua) - control B (Glucosa) – acción acorde al tipo de sacárido C (glucosa + NaF) – acción del inhibidor 6. PREGUNTAS 1. Explique la ruta metabólica de la fermentación alcohólica. 2. ¿Cuáles son las reacciones más importantes que regulan esta ruta? 3. ¿En qué paso se forman las triosas y cuál es la enzima que allí actúa? 4. ¿Cómo se llama la enzima alostérica que regula la glucólisis? 5. ¿Qué otras reacciones pueden sufrir el ácido pirúvico además de la ocurrida? 6. ¿Nombre otros inhibidores de la ruta glucolítica, e indique en qué lugar actúan, qué enzimas afectan y cómo se clasifica?

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 10: Fotosíntesis Elaborada por: Melisa Giraldo Montoya Reactivos Equipos y materiales Solución salina 0,9% Lámparas (40w – 60w – 100w) Bicarbonato de sodio Gradillas Acetona pura (No reutilizada) 10 tubos de ensayo por mesa Morteros Papel filtro o gasa Solución Concentración Cantidad Preparación 200ml Pesar 1,8 g de NaCl y diluirlo en Solución 0,9% 200 ml de agua destilada. salina Bretaña

10%

Bicarbonato de sodio

10%

100ml

Medir 100 ml de Bretaña y diluirlo en 100 ml de agua destilada.

100ml

Pesar 10 g de bicarbonato de sodio y diluirlo en 100ml de agua destilada.

Observaciones 1. La acetona se toma directamente del estante de reactivos (si no hay, con un día de anticipación pedirla en laboratorios de química).

Materiales que deben traer los estudiantes 1. Elodea y hojas de acelga 2. Bretaña

PRÁCTICA No. 10 FOTOSÍNTESIS MARCO TEÓRICO Para empezar, es necesario reconocer que todos los seres vivos dependen en último término de la fotosíntesis. Este proceso ocurre gracias a la luz radiante del sol, la fotosíntesis ocurre no sólo en las familiares plantas verdes, sino en multitud de microorganismos acuáticos. Estos organismos fotosintéticos utilizan cada año cerca de 550 billones de toneladas de anhídrido carbónico (CO2) y 25 billones de toneladas de H20 en el proceso de fotosíntesis. Cerca del 90% de la actividad fotosintética ocurre en el mar. La reacción global del proceso es:

6 C02 + 6 H20

luz solar

C6 H12 O6 + 6 O2

Clorofila Sin embargo, el proceso no es tan simple y ocurre en varios pasos. Esto ocurre en el cloroplasto. El primero de ellos la “captura” de la luz por la clorofila y utilización de esta energía para romper el anhídrido carbónico y formar los carbohidratos. La velocidad de la primera etapa, llamada reacción lumínica, aumenta con la intensidad luminosa (dentro de ciertos límites), pero no con la temperatura. En la segunda etapa, llamada reacción en la oscuridad, la velocidad aumenta con la temperatura (dentro de ciertos límites), pero no con la intensidad luminosa.

FIGURA 1. Procesos de fotosíntesis y respiración en la planta. Tomado de: http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/Fotosintesis.htm

La vida en la tierra depende fundamentalmente de la energía solar, la cual es atrapada mediante el proceso fotosintético, que es responsable de la producción de toda la materia orgánica que conocemos. La materia orgánica comprende los alimentos que consumimos diariamente tanto nosotros como los animales, los combustibles fósiles (petróleo, gas, gasolina, carbón); así como la leña, madera, pulpa para papel, inclusive la materia prima para la fabricación de fibras sintéticas, plásticos, poliéster, etc. La cantidad de carbono fijado por la fotosíntesis es espectacular, como lo demuestran las cifras de la producción anual de materia orgánica seca, estimada en 1,55 x 1011 toneladas, con aproximadamente 60% formada en la tierra, el resto en océanos y aguas continentales. Los organismos que en el curso de la evolución aprendieron a usar la energía solar y a transformarla en energía química son los llamados autótrofos, que están representados por bacterias y organismos del Reino Vegetal. Para realizar la fotosíntesis una planta requiere de varios elementos que se encuentran en el medio abiótico. Estos son: Luz solar. Proviene del Sol y la planta la puede captar por sus hojas. En ellas tiene un pigmento de color verde llamado clorofila, que se encuentra en el interior de los cloroplastos (las células vegetales son las únicas que poseen cloroplastos). La clorofila se encuentra esencialmente en hojas y tallos tiernos. Anhídrido carbónico o dióxido de Carbono (CO2). Gas presente en la atmósfera, sustancia inorgánica que el vegetal puede incorporarla al interior de sus células desde la atmósfera, por medio de una especie de poros llamados estomas. Agua. Sustancia también inorgánica presente en la tierra. El vegetal la obtiene desde el suelo a través de sus raíces. El agua, al pasar a la raíz, asciende hasta las hojas por unos conductos especiales llamados vasos conductores. Importancia biológica de la fotosíntesis La fotosíntesis es seguramente el proceso bioquímico más importante de la biósfera por varios motivos: 1. La síntesis de materia orgánica a partir de la materia inorgánica se realiza fundamentalmente mediante la fotosíntesis; luego irá pasando de unos seres vivos a otros mediante las cadenas tróficas, para ser transformada en materia propia por los diferentes seres vivos. 2. Produce la transformación de la energía luminosa en energía química, necesaria y utilizada por los seres vivos 3. En la fotosíntesis se libera oxígeno, que será utilizado en la respiración aerobia como oxidante.

4. La fotosíntesis fue causante del cambio producido en la atmósfera primitiva, que era anaerobia y reductora. 5. De la fotosíntesis depende también la energía almacenada en combustibles fósiles como carbón, petróleo y gas natural. 6. El equilibrio necesario entre seres autótrofos y heterótrofos no sería posible sin la fotosíntesis. Se puede concluir que la diversidad de la vida existente en la Tierra depende principalmente de la fotosíntesis. Pigmentos vegetales Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es probablemente el color. Algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a sus actividades fisiológicas. Es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, pero existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos químicos definidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinación de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada prácticamente sin sufrir modificación. Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. También, aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. Estos pigmentos se encuentran en el interior de las células vegetales en los cloroplastos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son las xantofilas y carotenoides.

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo. En el método de extracción simple, se utiliza como extractante el alcohol etílico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos no misibles y con diferente peso específico. En el segundo método por cromatografía se utiliza como extractante la acetona y como separador el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los pigmentos, y se basa en la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la técnica. Para el adecuado conocimiento de la fotosíntesis, de la síntesis y propiedades de la clorofila y de muchos otros procesos vegetales, es esencial un conocimiento elemental de las propiedades físicas de la luz y otros tipos de energía radiante. Ésta se propaga a través del espacio en forma de ondas. La luz del sol o la luz blanca procedente de cualquier fuente artificial aparece como homogénea al ojo humano, pero cuando se la pasa a través de un prisma, se descompone en un espectro de colores. El orden que aparecen los colores más importantes en el espectro de la luz blanca es: el rojo, anaranjado, amarillo, amarillo-verdoso, vede, verde-azulado, azul, índigo, violeta. Cada uno de estos colores responde a un rango diferente de longitud de onda de luz. La longitud de onda es la diferencia entre dos crestas de ondas sucesivas. Las longitudes de onda que producen la luz se hallan aproximadamente entre los 3900 Å en el violeta hasta 7600 Å en la zona más alejada al rojo. Por debajo de la región de la luz visible, en la escala de energía radiante, sigue la zona del ultravioleta (UV). Aquellos que están por encima de la luz visible responden al infrarrojo (IR.). En la actualidad, todos estos fenómenos de la luz pueden ser explicados si se admite que la luz tiene naturaleza particulada (formada por partículas). Conforme a este concepto, un rayo de luz puede ser imaginado como una corriente de pequeñas partículas, cada una de las cuales se llama fotón. Cuando tales fotones chocan contra una sustancia adecuada, su energía puede ser transferida a los electrones sobre los que golpean, realizando así reacciones fotosintéticas. La manifestación energética de un fotón se llama cuanto. El valor energético del cuanto varía inversamente con la longitud de onda.

OBJETIVOS • Comprobar los efectos lumínicos de concentración de uno de los reactivos (CO2) en el rendimiento energético del proceso realizado por la planta. • Conocer procesos biológicos relacionados con la obtención de energía a partir de moléculas orgánicas. • Analizar la organización de componentes moleculares, supramoleculares y subcelulares relacionados con el metabolismo energético. MATERIALES • • • • • • • • • • • • • • • • •

Lámpara de diferente intensidad lumínica. Cada grupo trabajará con una intensidad de luz diferente Tubos de ensayo Hojas o cuchillas de afeitar Hojas de elodea fresca Hojas frescas de espinaca Mortero Centrífuga clínica Gasa Tubos de ensayo para centrífuga Hielo PH-metro Beakers Agitador magnético Probetas Lámparas de 120W, 100W, 60W, 40W y 25W Pinzas Paño negro

REACTIVOS •

•

• •

Medio de preparación: Tris 20 mM. KCI 40 mM. Sucrosa o sacarosa 4 mM pH 7.8. Medio de lavado: KC 140 mM. MgCl2 2 mM. Sucrosa o sacarosa 4 mM. pH 7.8. Pyocianina. HCL 1.0 mM.

• • • •

NaOH 1.0 mM. Bicarbonato de sodio (NaHCO3) (al 2, 4, 6, 8 y 10%) Gaseosa Bretaña (al 2, 4, 6, 8 y 10%) DCFIF: 2-6 Diclorofenol indofenol

PROCEDIMIENTO 1. Método para aislar cloroplastos Como este procedimiento toma algún tiempo, es necesario mantener la preparación en frío. Utilice el hielo proporcionado y trabaje lo más rápido posible. Cuando esta se mantiene en frío, la preparación es bastante estable. Triture 25 gramos de hojas de espinaca frescas en 75 mL de medio de preparación por 15 segundos a velocidad máxima en una licuadora. Filtre a través de una gasa previamente enfriada y vierta en 2 tubos de centrifuga. Lleve a centrifugar por 1 minuto a 3500 rpm para remover los desechos. Utilice el sobrenadante y centrifugue nuevamente por 5 minutos a 3500 rpm y guarde el precipitado. Resuspenda (disuelva) el precipitado suavemente en 20 mL de medio de lavado y centrifugue de nuevo por 2 minutos a 3500 rpm. Repita el lavado 3 veces. Guarde los cloroplastos "lavados" en el medio de lavado y en hielo. 2. Factores que afectan la tasa fotosintética a. Efecto de la concentración de CO2 en la fotosíntesis El proceso se realizará con dos fuentes de CO2. Una gaseosa (soda - Bretaña) y bicarbonato de sodio. 1. Destapar la gaseosa y eliminar el exceso de burbujas agitándola suavemente. Realizar las respectivas diluciones (prepare 30 mL de cada dilución) tanto de soda como de bicarbonato (tenga cuidado para no provocar burbujas indeseadas). Diluciones: 2:10; 4:10; 6:10; 8:10; 10:10 (Por ejemplo, en la primera dilución se usa 2 mL de soda en 8 mL de agua destilada). 2. Cortar ramitas de elodea de 3 cm de longitud y depositarias en los diferentes tubos (soda y bicarbonato de sodio) de modo que el corte quede hacia arriba dentro de la dilución. (Ver figura 1). Iluminar los tubos con una lámpara de 60W durante 10 minutos.

FIGURA 2. Iluminación de ramitas de elodea.

Otra manera de hacer el montaje se muestra en la figura 3.

FIGURA 2. Iluminación de ramitas de elodea opción 2. 3. Observar la formación, de burbujas y estimar la producción de ellas. Cuente el número de burbujas producido a partir del momento en que se desprendió la primera burbuja, (cuando el tamaño de la burbuja es pequeñito, 10 de ellas equivalen a 1). Anote los resultados. 4. Repetir los numerales anteriores, pero esta vez agregando1 mL de solución de cloroplastos. Apuntar la dilución donde mayor producción de burbujas hubo para utilizada después, tanto de soda como de bicarbonato. En su informe elabore una gráfica, y discuta sus resultados.

b. Efecto de la intensidad lumínica en la fotosíntesis Como el oxígeno es un subproducto de la fotosíntesis, se puede tornar como una medida directa de dicho proceso ya que en las plantas acuáticas escapa en forma de burbujas. Estas las podemos contar y hacer un promedio según la tabla 1. Para esta experiencia se recomienda seleccionar las diluciones que más burbujas produjeron en la experiencia anterior. Apagando la luz del laboratorio, tenga preparado en cada mesa de trabajo, una lámpara con: bombillo de 25 W, de 40 W, de 60 W, de 100 W, de 120 W y un registro a la luz del día. Se exponen durante 1 minuto (dejando descansar por un minuto), variando las intensidades lumínicas. Recuerde hacer un corte un ápice de elodea de aproximadamente 4 cm de largo, este corte hágalo bajo el agua, coloque la plantita dentro de la solución de tal modo que el corte quede hacia arriba en el tubo (Figura 1). Repetir el proceso, pero separando los tubos de ensayo con las diluciones de soda y bicarbonato de sodio que mayor producción de burbujas haya obtenido del procedimiento anterior que hizo con la solución de cloroplastos.

Tabla No. 1 Conteo de burbujas en plantas acuáticas a diferentes intensidades lumínicas. INTENSIDAD LUMÍNICA Vatios – W

1

2

3

4

5

6

7

8

Promedio de burbujas

25 W 40 W 60 W 10 W 120 W LUZ DÍA

3. Efecto de la luz sobre la clorofila Prepare un tubo de ensayo (tubo A) con un homogeneizado de hojas de acelga o espinacas en solución cetónica y otra (tubo B) en solución salina al 0.9 %. Coloque el tubo a 10 cm de una fuente de luz. Obsérvelo por el lado que incide la luz y también por el lado contrario. Repita las mismas observaciones anteriores, pero empleando esta vez un tubo de ensayo que contiene un homogeneizado en la solución de medio salina (Tubo B). Con relación a las observaciones anteriores responda las siguientes preguntas: a. ¿En qué estructura celular se encuentra la clorofila? b. ¿Observa en ambos tubos el mismo color siempre? c. ¿Qué nombre recibe el efecto observado? Explique También se realizará este proceso para obtener extractos de hojas y flores de variados colores usando la solución cetónica. Luego se observa en el transiluminador. El Transiluminador se caracteriza por el hecho de que dicha fuente de luz emite radiación visible, dicho filtro de excitación seleccionan un intervalo de longitudes de onda comprendido dentro de la región visible y dicho filtro de detección presentan transmisión a longitudes de onda superiores a las de dicho intervalo.

4. Cromatografía de pigmentos vegetales Triture las hojas de espinaca, sin nervaduras, suavemente en un mortero con un poco de arena y unos 50 mL de alcohol etílico hasta que el alcohol se haya vuelto verde. Filtre el preparado para separar las partes sólidas del alcohol teñido y ponga 10 mL del preparado en un tubo de ensayo A y 10 mL en otro llamado B. Al tubo A póngale 5 mL de éter de petróleo y agítelo suavemente. Agréguele 5 mL de agua destilada y agite otra vez suavemente. Deje que repose. Corte una tira de 2 cm de ancho de papel de filtro. Ponga 2 gotas del preparado de clorofila a unos pocos milímetros de la orilla de la tira que recortó. Llene un beacker con etanol hasta que toque ligeramente la tira de papel dejada hacia adentro sin tocar la muestra de clorofila. Coloque con cuidado el papel de filtro de manera que quede como se muestra en la figura 3.

FIGURA 3. Cromatografía de papel para separar pigmentos vegetales. Tomado de: http://biologiastv.weebly.com Espere media hora. ¿Qué ocurrió con la gota del preparado de clorofila? Este procedimiento se llama cromatografía y consiste en la separación de compuestos de una mezcla tomando en cuenta algunas características físicas o químicas de las sustancias a separar. ¿En qué orden están las manchas de color y a qué compuestos corresponden? También se puede usar macerado de hojas de variados colores o de flores.

PREGUNTAS 1. En los procesos realizados, ¿Ha ocurrido transformación de energía luminosa en energía química? Explique: ¿ocurre síntesis de ATP con relación con este proceso? 2. Realice un esquema explicativo, para responder las siguientes preguntas: ¿Cuál es la fase dependiente de la luz en la fotosíntesis? ¿Qué es la fase independiente de la luz en la fotosíntesis? ¿Qué se requiere para que se produzca fijación de anhídrido carbónico? 3. ¿Cuál es la importancia biológica y ecológica de la fotosíntesis? 4. ¿Por qué es importante que se consuma CO2 durante la fotosíntesis? 5. ¿Qué sucede con la fotosíntesis de las plantas acuáticas en un lago donde no puede penetrar la luz del sol? 6. ¿Qué sucedería en todas las formas de vida actuales si no se presentara la fotosíntesis? 7. ¿En qué consiste la bioluminiscencia? Dar tres ejemplos. 8. ¿Qué tipos de pigmentos existen en las plantas y cuál es su función? 9. Sólo algunas células vegetales tienen cloroplastos, pero todas las metabólicamente activas tienen mitocondrias. Expliqué ¿Por qué? 10. ¿Qué tipo de planta C3, C4 o CAM se esperaría que funcionara mejor si se expusiera a la luz diurna continua en condiciones cálidas y secas? Explique.

Laboratorio de Biología Celular Preparación práctica 11: Cromosomas politénicos Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Reactivos

Equipos y materiales

Solución salina 0,9%

Larvas de tercer estadio de Drosophila melanogaster

Colorante acetorceína

Toallas de papel absorbente

Aceite de inmersión

Goteros (1 por mesa) para la solución salina Microscopios Estereoscopios Jeringas de insulina

Solución

Concentración

Cantidad

Preparación

Solución salina

0,9%

200ml

Pesar 1,8 g de NaCl y diluirlo en 200ml de agua destilada

Colorante acetorceína Observaciones

1. Se deben pedir las larvas con una semana de anticipación en el laboratorio de Jorge, justo enseguida del 327. 2. El colorante se debe filtrar con servilleta antes de cada práctica.

Materiales que deben traer los estudiantes

1. En caso de que en el laboratorio no haya jeringas de insulina reutilizadas los estudiantes deben de traerlas 2. Pañuelos desechables o Kleenex

PRACTICA No. 11 CROMOSOMAS POLITÉNICOS

INTRODUCCIÓN Los cromosomas son estructuras filamentosas de tamaños y formas variables observables durante la división celular eucarióticas. Están constituidas de cromatina (ácidos nucleicos y proteínas), y el número por núcleo es característico de cada especie; así por ejemplo en el hombre hay 46, en el sapo 22, en el tomate 24, la rata 42, en la mosca 8, etc. Los cromosomas politénicos y plumosos son considerados como gigantes. Estos últimos, se observan en oocitos de algunos animales durante la profase de la meiosis. Los politénicos se localizan, sobretodo, en las glándulas salivares de las larvas de algunos dípteros de los géneros Chironomus, Simulium y Drosophila, son producidos por una excesiva replicación cromosómica sin sucesiva división nuclear (endomitosis) y según la especie y el estado de desarrollo, las cromátides pueden llegar a más de mil en cada núcleo. Estos cromosomas gigantes tienen franjas o banda características que relacionan la disposición de genes a lo largo del cromosoma. Balbiani, el primero en observarlos, descubrió un engrosamiento en algunos sitios; estos se conocen como “puff” y están relacionados con la producción de RNA.

FIGURA 1. Cromosomas politénicos en Drosophila. Tomado de http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Two/1GeneW2b.html

Cromosomas politénicos en Drosophila Además del cambio en el tamaño, los cromosomas politénicos presentan otras dos características. En primer lugar, los cromosomas homólogos están asociados entre sí en toda su extensión. Esta condición, denominada apareamiento somático es propia de la mitosis de la mayoría de los Dípteros. La otra característica peculiar es que los cromosomas muestran un patrón particular de bandeo transversal que consiste en zonas más oscuras, llamadas bandas, que alternan con zonas claras, llamadas interbandas. Cuando se observan al microscopio óptico se identifican como bandas oscuras y claras transversales alternantes. Aunque la mayoría de las bandas son continuas a través del cromosoma, otras aparecen como una serie de puntos. Éste bandeo es reproducible de núcleo a núcleo, formando un patrón constante de tal manera que los cromosomas pueden ser identificados y mapeados en toda su longitud. Hay aproximadamente 5000 bandas y 5000 interbandas en total en el genoma de Drosophila melanogaster. FIGURA 2. Drosophila Melanogaster Debido a que el patrón de bandeo que presentan los cromosomas politénicos es un reflejo constante de las secuencias de ADN, las bandas sirven como marcadores para localizar varias características genéticas (lugar de los genes, o cambios en el genoma debido a reordenamientos cromosómicos, por ejemplo: deleciones, duplicaciones de bandas y translocaciones) y se han utilizado en diversos estudios genéticos y evolutivos.

FIGURA 3. Cariotipo de la Drosophila melanogaster. Tomado de: https://www.educabras.com/ensino_medio/materia/biologia/genetica/aulas/determinacao_do_sexo

1. OBJETIVOS En esta práctica el estudiante podrá: Adquirir destreza en el método de realización de placas con cromosomas politénicos. Observar las características morfológicas de un cromosoma de este tipo. Conocer la localización y extracción de las glándulas salivares en las larvas de la Drosophila melanogaster. 2. REACTIVOS • Solución salina al 0.8%. • Colorante acetorceína. 3. • • • • • •

MATERIALES Larvas del género Drosophila. Portaobjetos. Cubreobjetos. Dos agujas finas. Gotero. Papel absorbente.

4. MÉTODO En un portaobjetos se coloca una larva a la que previamente se le ha agregado una gota de solución salina. Con una aguja se sujeta por el centro de la larva y con la otra aguja se tira de la cavidad bucal hasta extraer las glándulas. Estas aparecen de forma alargada y transparente, se descarta luego el resto de la larva y se seca luego el exceso de suero. Se agrega una o dos gotas de y se deja por unos (6) minutos cuidando de no dejar secar el colorante. Luego se coloca con cubreobjetos y se tritura la muestra golpeando el cubreobjetos con la punta de un lápiz o palillo. FIGURA 4. Protocolo de extracción de glándulas salivares en Drosophila. Tomado de http://slideplayer.es/slide

Se retira el exceso de colorante con el papel y se procede a observarlos al microscopio con objetivo de 40 X y 100 X. Se puede fijar la placa en caso de obtener buenos resultados. FIGURA 5. Resultados esperados al microscopio. Tomado de: http://docplayer.es/64975717 5. PREGUNTAS 5.1 ¿Qué otros cromosomas gigantes se conocen y en qué organismos? 5.2 ¿Para qué se utilizan en estudios de genética los cromosomas politénicos? 5.3 ¿A qué se debe el bandeo en estos cromosomas y qué significado biológico tienen estas bandas? 5.4 ¿Qué son los puff y cuál es su importancia? 5.5 ¿De qué otras maneras se pueden observar cromosomas al microscopio con métodos caseros? Describa cada uno 5.6 A partir del siguiente esquema, analice los cambios de la Drosophila de larva a adulto.

Tomado de: https://webs.ucm.es/info/genetica/grupod/Genenzima/ruta14.jpg

Laboratorio de Biología Celular Laboratorio de Biología Celular

Reactivos Buffer de lisis I Buffer de lisis II Isopropanol frío Etanol 75% Mezcla de lisis

Preparación práctica 12: Extracción de ADN a partir de sangre periférica por el método de salting out Elaborada por: Katerin Valencia Posada y Astrid Eliana Cuartas Cuartas Equipos y materiales Centrífuga Vórtex

Preparación de las Preparación del buffer soluciones Pesar 30,80 g de sacarosa y Sacarosa 0,3 M diluirlo en 300 mL de agua Se mezcla 300 mL de destilada. sacarosa al 0,3 M con 10 mL de tris HCl 10 mM y Pesar 6,057 g de Tris y 5ml de MgCl2. Por último, Reactivo Tris-HCl 10mM disolverlos en 50 mL de agua se agrega 100 mL de Buffer de pH 7.5 destilada. Llevar esta solución Tritón lentamente porque lisis I a un pH de 7,5 causa mucha espuma. Por Tomar 0,48 g de MgCl2 y último, se lleva esta MgCl2 5mM diluirlo en 5 mL solución a 1L con agua Pesar 1 g de tritón y diluirlo en destilada Triton X-100 100 mL de agua destilada Reactivos

Agua destilada Se pesan 35, 06 g de NaCl y NaCl 6 M se disuelven en 100 mL de Buffer de agua destilada. lisis II Pesar 3,78 g de EDTA y disolverlo en 24 mL de agua EDTA 24mM destilada. Llevar la solución a pH 8 un pH de 8, para que se pueda disolver en el agua. Agua destilada Mezcla Buffer de lisis II de lisis Tomar 61,2 g de Perclorato y Perclorato de llevarlo hasta 100 mL con agua sodio 5M destilada SDS 20% Pesar 20 g de SDS y diluirlo en 100 mL de agua destilada

Agregar 75 mL de NaCl 6M y mezclarla con 24 mL de una solución de EDTA al 0,5M pH 8. Luego ajustar la mezcla a un pH de 8 y completar con agua destilada hasta 1 L.

Mezclar 10 mL de buffer de lisis II con 5 mL de Perclorato y 700 μL de una solución de SDS.

Observaciones 1. Almacenar el Buffer de lisis I en un frasco de vidrio oscuro o ámbar en la nevera. 2. Tanto la mezcla de lisis como el buffer de lisis II se almacenan en la nevera en tubos de Falcon y recipiente de vidrio respectivamente.

Materiales que deben traer los estudiantes Por grupos deben traer vacutainer con EDTA, camisa y aguja. Cada estudiante debe traer guantes.

PRÁCTICA No. 12 EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA POR EL MÉTODO DE SALTING OUT MARCO TEÓRICO El ADN es el material que en su estructura almacena la información que requiere cada célula para la ejecución de una infinidad de funciones. En las células eucarióticas, el ADN se encuentra localizado exclusivamente en el núcleo, y la información que el ADN expresa debe proyectarse a todos los ámbitos celulares. Este flujo de información ocurre según el dogma de la biología molecular, suele representarse como: ADN → ARN → Proteínas La genética molecular estudia las estructuras y la función del ADN. La información que se almacena en esta molécula, dicta la síntesis del ARN mensajero, el cual madura y migra al citoplasma, donde dirigirá la síntesis de proteínas. Las células son las unidades funcionales del organismo que operan siguiendo las pautas que le imponen el conjunto de proteínas sintetizadas. Estas regulan los géneros de mantenimiento, división, comunicación y muerte celular. Las proteínas a su vez, dirigen la síntesis de ADN, con lo que se completa el ciclo Los ácidos nucleicos son polímetros de nucleótidos, los cuales constan de una base nitrogenada, una pentosa y un grupo fosfato. El tipo de pentosa determina que el ácido nucleico sea ADN o ARN. En el ADN la pentosa es la 2-desoxirribosa, mientras que en el ARN es la ribosa. La ausencia de un grupo hidroxilo en el carbono 2' de la pentosa da al ADN una gran resistencia a la hidrólisis alcalina, contrariamente al ARN, que a pH básico y a 37 º C se rompe los nucleótidos en pocos minutos. Las bases nitrogenadas corresponden a dos categorías: purinas y pirimidinas. Las dos purinas, adenina (A) y guanina (G) están presentes tanto en el ADN como en el ARN. En cuanto a las pirimidinas, el ADN posee citosina (C) y timina (T), mientras que, en el ARN, la timina (T) esta sustituida por el uracilo (U). El ADN es una doble cadena en la que las bases se encuentran en el interior de la molécula y los grupos fosfato en el exterior. La unión entre las bases complementarias se realiza a través de puentes de hidrógeno: dos para A y T, y tres para G y C. La ruptura de los puentes de hidrógeno por calor, álcali o compuestos químicos produce la separación física de las dos hebras del ADN y se denomina desnaturalización. Compuestos químicos como la urea o la formamida, son agentes

desnaturalizantes que interfieren reaccionando directamente con las bases e impidiendo un apareamiento correcto entre ellas, a temperaturas a las que normalmente estarían apareadas. El formaldehído es otro agente desnaturalizante, cuya acción es irreversible porque establece uniones covalentes con los grupos NH de las bases e impide el apareamiento de estas. Las células poseen un contenido de ADN constante, que es característico de cada especie. El aislamiento y la purificación del ADN, es un paso clave en la mayoría de los protocolos de Biología Celular y Molecular. En esta práctica se realizará la purificación de ADN de una muestra de sangre. Debido a que el ADN coexiste con el ARN y otras macromoléculas, durante los pasos de extracción, es necesario liberar el ADN de todos estos compuestos celulares. La purificación del ADN ha permitido la clonación de genes y construcción de librerías de ADN genómico de diferentes especies. En ambos tipos de aislamiento, a menudo es necesario realizar purificación y fraccionamiento del ADN (digestión con enzimas de restricción) o la amplificación de secuencias específicas. A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en cuenta varios factores: • • • • •

La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN. El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN. La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído. El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado. Uso que se le va a dar al ADN extraído.

Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales, tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. Método Salting Out: En este método se utiliza un buffer para destruir las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el ADN presente en soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones.

Figura 1. Extracción de ADN de sangre periférica por el método Salting out. Tomado de: http://buclkej.nation2.com/ficoll-hypaque-protocol Las interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la proteína precipita. La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out varía de acuerdo a las características de la proteína. Es importante tener en cuenta las condiciones normales en las que se encuentran las células sanguíneas en la sangre humana.

Condiciones normales de la sangre humana pH 7.3 – 7.4 Azúcar 4-6 % Sales 0.9 %

FIGURA 2. Protocolo para extracción de ADN usando la técnica del Salting out. Tomado de: https://accessmedicina.mhmedical.com/Content.aspx?bookid=1473§ionid=102743658

OBJETIVOS • • •

Utilizar una metodología fácil y asequible para la purificación del ADN. Extraer por el método de salting out el ADN de una muestra de sangre. Deducir algunas de las propiedades físico químicas de los ácidos nucleicos por medio de la metodología seguida.

MATERIALES Y EQUIPOS • • • • • • • • •

Jeringas de 5 cc Vacutainer con EDTA Viales de 1.5 mL Micropipetas de 10, 20, 200 y 100 μL Vórtex Centrífuga Pipetas Pasteur Guantes Quirúrgicos Marcadores Indelebles de Punta Fina

REACTIVOS • • • • • • • • • • •

Solución Madre de Tris 0.5 M pH 7.4 Solución Madre de Tris 0.5 M pH 7.5 Solución Madre de EDTA 0.5 M pH 8.0 Solución Madre de Sacarosa 1 M Solución Madre de MgCl2 0.5 M Solución de Tritón X-100 al 10% Solución de NaCl 6 M Solución de SDS al 20% Solución de Perclorato de Sodio 5 M Isopropanol Puro y Frio Etanol al 75%

Preparación de Buffer: o Buffer de Lisis I Preparar un litro de una solución de Tris 10 mM pH 7.5, Sacarosa 0.3 M, MgCl2 5 mM, Tritón X-100 al 1%, a partir de las soluciones madres preparadas con

anterioridad. Hacer los cálculos respectivos. Esta solución debe ser almacenada en un frasco oscuro a 4 º C ¿Por qué? o Buffer de Lisis II Preparar un litro de una solución de EDTA 24 mM pH 8.0, NaCl 0.75 M, a partir de las soluciones madres preparadas con anterioridad. Hacer los cálculos respectivos. Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente. o TE (Tris-EDTA) pH 7.4 Preparar 100 mL de una solución de Tris 10 mM pH 7.4, EDTA 1 mM pH 8.0, a partir de las soluciones madres preparadas con anterioridad. Hacer los cálculos respectivos. Esta solución debe ser almacenada en un frasco oscuro a 4 ºC. Nota: Usted debe hacer los cálculos respectivos para trabajar con 2 mL de sangre. 1. PROCEDIMIENTO • • • • • • • • •

• •

Tomar 4 mL de Sangre en un Vacutainer con EDTA. ¿Cuál es la función del EDTA? Repartir la Sangre en 4 tubos Cónicos (Falcon) de 15 mL Llenar dichos tubos hasta completar 15 mL Buffer de Lisis I y mezclar por inversión Centrifugar a 3000 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 minutos Descartar el sobrenadante Agregar 7 mL de Buffer de Lisis I y resuspender el “botón” (precipitado) suavemente. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. Descartar el sobrenadante. Resuspender el “botón” en 2 mL de Buffer de Lisis II, mezclando con el vórtex durante 1 minuto. Adicionar 200 μL de SDS al 20% y 500 μL de Perclorato de Sodio 5 M Mezclar con el vórtex durante 10 minutos.

Nota: este paso es crucial

• • • •

Adicionar 500 μL de NaCl 6M Mezclar con el vórtex durante 15 segundos. Centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.

Nota: Tomar el sobrenadante de su parte intermedia, con pipeta Pasteur sin tocar la superficie del precipitado, permite obtener un ADN sin demasiada proteína. •

Adicionar al nuevo tubo 3 volúmenes de Isopropanol Frío.

Nota: un volumen, en este caso, es la cantidad de sobrenadante obtenida en el paso anterior. •

Mezclar por inversión hasta ver la aparición de una madeja blanca que corresponde, en su mayor parte, a la sal de ADN llamada Desoxirribonucleato de sodio.

•

Transferir a un Vial (tubo pequeño) nuevo y estéril de 1.5 mL, la madeja de ADN utilizando una micropipeta de 1000 μL, descartar el exceso de líquido y lavarla adicionando 1 mL de Etanol al 75%.

•

Descartar con mucho cuidado la mayor cantidad de Etanol posible y dejar evaporar el resto a temperatura ambiente, manteniendo la tapa del vial abierta durante 15 minutos aproximadamente.

• •

Adicionar 200 μL de Buffer TE pH 7.4 e incubar a 37 ºC durante 24 horas. Finalmente, almacenar el DNA resuspendido a 4 ºC (Si va a ser usado en electroforesis).

PREGUNTAS 1. ¿Qué papel desempeñan cada uno de los reactivos en esta práctica? (los buffers de Lisis I y II, el SDS, el Tritón X-100, el Isopropanol frío, el Perclorato de Sodio, el NaCl y el Etanol) 2. ¿Por qué se utiliza como anticoagulante el EDTA y no la Heparina? 3. Mencione y explique otros métodos para la extracción del ADN. 4. ¿Qué técnicas o metodologías se conocen para medir la cantidad de ADN que 5. posee una célula? 6. ¿En qué consiste las técnicas de “Southern blot” y “Northern blot”?

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