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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

RECUENTO DE

MICROORGANISMOS EN

PLACA PETRI

.EXPRESION DE

RESULTADOS

.CARACTERIZACION DE

COLONIAS

.SIEMBRA DE MICROORGANISMOS DE

MEDIO SOLIDO A

MEDIO LIQUIDO.

CUARTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

CUETO YUPA JOSE VENTO

20151384G

ZANABRIA PISCO JAMIL ANGEL

20161379F

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú 06 de abril de 2017

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental INDICE

Tabla de contenido Resumen……………………………………………………………………………… ………………………………………..3 Introducción Objetivos

3

4

Marco teórico

5

Procedimiento experimental7 Resultados 9 Discusion de resultados

10

Recomendacion 10 Fuentes de informacion Anexos

11

Apendice

11

I.

10

RESUMEN En esta experiencia haremos el cálculo estimado del recuento estándar en placas Petri para las colonias que han crecido, así como también la caracterización de las colonias es decir su morfología (superficie, forma y borde). Observamos también como el profesor sembró en las colonias 2

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental escogidas de la placa Petri en caldo BHI, es decir aprendimos como se siembra microorganismos de medio solido a un medio líquido, además de toma de muestras con hisopo estéril de sarro dental y manos para ser colocados en el caldo Nutritivo previo embebido con el agua peptonada. Para el recuento estándar en placas seguiremos algunas reglas Y para colonias las cuales serán usados para la caracterización y aislamiento ya que serán inoculados en el caldo BHI para el crecimiento puro.

II.

INTRODUCCIÓN

En esta unidad de trabajo se tratan de un conjunto de aspectos previos al análisis microbiológico en sí. Nos referimos a las técnicas de selección, toma y preparación de las muestras, así como a su transporte y conservación. La importancia de estas técnicas no debe ser subestimada, pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los resultados del análisis microbiológico. Dentro del proceso analítico, la influencia del muestreo es la más crucial, ya que de nada sirve un análisis riguroso de la muestra, si esta no representa para nada al sistema que se quiere medir. Por ejemplo, es obvio que si se quiere analizar el contenido de un recipiente, se debe de agitar el mismo antes de tomar la muestra, ya que de no hacerlo, parte del contenido del mismo puede haber sedimentado. Si lo que se busca se encuentra sobre todo en esa fracción, el resultado del análisis, por preciso y exacto que fuera, informará sobre una cantidad muy inferior. Además para el caso de la microbiología, se da la circunstancia de que es relativamente fácil que el proceso de muestreo contamine la muestra (si los recipientes, utensilios no son estériles) aportándole microorganismos que no estaban presentes. También puede ocurrir que el proceso de muestreo favorezca el crecimiento de un microorganismo frente a otros. Por ejemplo, para realizar un recuento de bacterias en el agua corriente hay que dejar el grifo abierto durante un tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se toma la muestra nada más abrir el grifo y este lleva varios días sin abrirse, el agua del último tramo de cañería llevará estancada allí el tiempo suficiente para

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental que pueda haber habido crecimiento bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendrá muchas más bacterias que el agua corriente de la red general y los resultados del análisis no serán ciertos para el agua corriente.

III.

OBJETIVOS  Determinar la carga microbiana para evaluar su calidad higiénico sanitaria  Realiza la caracterización de colonias.  Aprender la técnica de siembra de los microorganismos de un medio solido –líquido utilizando un asa de siembra.  Observar el comportamiento de las bacterias en medio líquido.

IV.

MARCO TEÓRICO

Recuento de microorganismos - Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento. - Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los 4

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o Aero tolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales. - Se han desarrollado técnicas automatización del proceso.

que

hacen

posible

la

- Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:. a b c d

Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count). Determinación del número más probable. Métodos basados en la reducción de colorantes por viables. Contaje microscópico directo.

1.Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la muestra. 2 Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos). 3.Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingñlés de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables. 4.Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio. 5.Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación. 6.Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento. 7.Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exácto. 8.Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios líquidos (lácteos). 9.Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL : a) Materiales, medios de cultivo y equipos 6

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        

11 tubos de ensayo Mechero Bunsen, fosforo y marcador Hisopo estéril Contador de colonias .Asa en argolla o anillo, Incubadora Refrigeradora Caldo BHI Agua peptonada

b) Metodología.

 Calculo del recuento estándar en placas



Seleccionar la placa correspondiente a una dilución que contenga entre



30 y 300 colonias usando contador de colonias. Hallar la media aritmética de los dos recuentos y multiplicarlos por el factor de dilución. Reportar como numero de microorganismos mesofilos



aerobios viables por g de muestra. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores a 30 y mayores de 300 colonias tomar el promedio de los dos



recuentos y multiplicarlos por el factor de dilución. Si el número de colonias de colonias de las placas consecutivas están dentro del rango de 30 -300 computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación de los dos recuentos .si el cociente es menor que 2, reportar el promedio de los valores: A/B>2…(A más B)/2.si el recuento mayor contiene contiene dos o más veces el menor en este caso se reportara el recuento del menor : A/B