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Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Químicas Carrera: Química y Farmacia Guía de Prácticas de Laboratorio INFORME DE LABORATORIO CONTROL DE CALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRADO PARA EL ION CROMO (QC)

Número de la práctica # 8 ANÁLISIS INSTRUMENTAL Q.F. María José Morales Estupiñan I GRUPO DE PRÁCTICA: 1 Integrantes: 1) Moisés Borbor Intriago 2) Josyanna León Molina 3) Bertha Tituana Cabrera 4) María José Viñán SEMESTRE: Sexto PARALELO: 4A Objetivos de la práctica de laboratorio 1) Aprender a realizar controles de calidad en curvas de calibrado 2) Emplear de forma adecuada los controles de calidad en las curvas cuando sea necesario Instrucciones o consideraciones previas Parámetros de Calidad Analítica

Los métodos analíticos que se apliquen para producir datos de composición química de alimentos, plaguicidas, materia orgánica, inorgánica, minerales, etc., deben ser apropiados, utilizar técnicas analíticas exactas y ser realizados por analistas entrenados. La selección de un método analítico debe ser realizada por el consejero científico del programa de base de datos, pero esta responsabilidad debe ser compartida con el analista. El proceso analítico se puede considerar dividido en 3 etapas: i) operaciones previas (muestreo, acondicionamiento, disolución, separaciones, reacciones analíticas y otras); ii) Medición y traducción de la señal analítica mediante el uso de instrumentos y; iii) toma y tratamiento de datos. La calidad de los resultados depende de la calidad de las diferentes etapas del proceso analítico. En la elección de un método se debe focalizar la atención en los principios analíticos involucrados, más bien que en el grado de sofisticación del instrumento. Muchas veces un método con uso de instrumentos modernos puede producir valores menos confiables que el método tradicional que pretende reemplazar y es preferible desarrollar programas que aseguren la calidad de los datos obtenidos. (Armendáris, 2013)

Criterios para la elección de un método Basándose en las consideraciones de Egan, la elección de métodos debe considerar: a. Dar preferencia a métodos cuya calidad y confianza se ha establecido en estudios colaborativos, o similares en varios laboratorios (ISO / REMCO, 1993) b. Preferir métodos documentados o adoptados por organizaciones internacionales reconocidas. c. Preferir métodos de análisis que se aplican en forma uniforme a varios tipos de compuestos sobre todo aquellos que se aplican a compuestos específicos. Entre los atributos a considerar en la calidad de un método se deben mencionar aquellas características que son básicas: confiabilidad, aplicabilidad, especificad, exactitud, precisión, detectabilidad y sensibilidad. (Brown, 2004) Exactitud Es la cercanía del valor analítico al "valor verdadero" de concentración del compuesto de interés en el material bajo examen. Es la concordancia entre la mejor estimación de una cantidad y su valor real. La inexactitud es la diferencia numérica entre el valor promedio de un conjunto de repeticiones y el valor verdadero. En la práctica la cercanía a un estándar de algún tipo se toma como medida de exactitud. Matemáticamente se expresa: Desviación:

Desviación relativa:

(Universo Formulas, 2016) Recuperación:

X = valor promedio ◯= valor verdadero De todas ellas, sin lugar a duda, la más utilizada es la recuperación. Si bien el valor verdadero de la concentración no se conoce, sino que sólo puede estimarse, es posible preparar una muestra por un procedimiento más exacto que el evaluado (por pesada, dilución en peso, etc.) y utilizarla como referencia. La exactitud o mejor dicho la inexactitud debe ser tan pequeña como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia, o sea, la recuperación debe acercarse al 100%. En el análisis de macro componentes, en general se requiere que el valor medido no difiera significativamente del aceptado como referencia. Para determinarlo, se utiliza un ensayo t de Student, efectuando varias determinaciones de la muestra de concentración conocida y calculando el t experimental (tob) que se compara con tablas t para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido, generalmente p=0,05.

Si el tob es menor que el valor tabulado el método tiene la exactitud requerida para ese ámbito de confianza. Si el tob resulta mayor que el valor tabulado, el método tiene un error sistemático, del signo resultante, para ese ámbito de confianza. (Universo Formulas, 2016) Precisión En términos reales más bien se debe considerar la imprecisión que corresponde, aproximadamente, al término dispersión y variabilidad analítica. La imprecisión se determina haciendo ensayos repetitivos de una misma muestra analítica. o de cada. conjunto de muestras analíticas y luego se calcula la desviación estándar, siendo muy importante en este caso la homogeneidad del sustrato. La precisión tiene la desventaja que requiere que los valores se distribuyan normalmente, que enfatiza los valores extremos de una serie de mediciones y que en muchos métodos aumenta la desviación estándar cuando aumenta la concentración. Para evaluar datos de un amplio rango de concentración es más útil calcular la desviación estándar relativa (RSD) o bien el coeficiente de variación por ciento (CV%).

La precisión está relacionada con la disposición de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea. (Dosal, 2016) La precisión se expresa matemáticamente por "S" o más comúnmente por RSD o CV.

Los estimadores desviación estándar y desviación estándar relativa permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la medida (error aleatorio, correspondiente a la dispersión de datos alrededor de la Media). (Universo Formulas, 2016) La precisión de un método analítico debe estudiarse sobre: a. El sistema, evaluando la dispersión de al menos 6 inyecciones del estándar por ejemplo en técnica HPLC b. El método, evaluando la dispersión de varias preparaciones de la muestra final homogénea. La evaluación corresponde a todo el procedimiento, desde la preparación de la

muestra

hasta

la

medición

del

analito

por

parte

del

instrumento.

La

imprecisión causada por las diluciones es un factor que con frecuencia se olvida. La precisión se puede medir en condiciones repetitivas (mismo analista, mismo día, mismo instrumento) y en condiciones reproducibles (diferente analista, diferente día, diferente instrumento). En muchos casos debe indicarse el límite o intervalo de confianza de la medida el cual corresponde al rango en el cual puede definirse la probabilidad de capturar el parámetro con la probabilidad indicada. Cuando el número de muestras es pequeño (menos de 30), las medidas independientes y la distribución normal se calculan de acuerdo a la distribución t de Student:

Student tabulado para n mediciones con v=n-l grados de libertad y para varios niveles a de significancia (el más aplicado es p=0,05 correspondiente a un intervalo de confianza del 95%). (Universo Formulas, 2016) Detectabilidad Es la cantidad mínima de una sustancia (definida en término de cantidad absoluta o concentración) que proporciona una respuesta medible para un método descrito. Sensibilidad Es la pendiente de la curva respuesta -concentración, o el cambio de respuesta por unidad de concentración. Si la pendiente es empinada el método tiene alta sensibilidad y si la pendiente es poco empinada, el método posee una baja sensibilidad. En estudios de composición de nutrientes el análisis de elementos trazas requiere alta sensibilidad, lo que en la práctica se puede lograr mediante amplificación electrónica o por concentración química del analito. Validación de métodos Aún los métodos bien establecidos necesitan ser validados por los analistas usando el personal, reactivos y equipos del laboratorio cuyo método se quiere validar. La validación puede hacerse analizando un conjunto de muestras que han sido analizadas por otro método o por otro laboratorio. El analista debe familiarizarse con un método y asegurarse que ha alcanzado el grado deseado de recuperación y precisión después de haber analizado un conjunto de blanco y muestras analíticas sintéticas o fortificadas. (Dosal, 2016)

Si un método particular sobre un compuesto, o realizado en otro laboratorio, ha dado un cumplimiento adecuado está indicando que el método es adecuado, pero esto no significa que se pueda asumir que si el método se ha realizado satisfactoriamente con un alimento determinado opere exactamente igual con un alimento diferente sino muy por el contrario, se debe asumir la posición opuesta hasta comprobarlo. Así por ejemplo, alimentos procesados y formulados, especialmente si contienen emulsificantes, pueden constituirse en un problema especial cuando se analiza, con un método de análisis desarrollando para un alimento primario. La validación consiste, en esencia, en confirmar y documentar que los resultados emanados de la aplicación de un método de análisis son confiables. Evidentemente todo nuevo método analítico debe validarse para demostrar su idoneidad, pero generalmente existen metodologías antiguas aplicadas durante mucho tiempo y entonces tiene poco sentido validar como si fuera una metodología desconocida. Se habla entonces de una validación retrospectiva, donde se pueden combinar los nuevos criterios de validación con toda la experiencia ya adquirida. En cambio, se conoce como validación prospectiva a la que se realiza frente a un producto nuevo. En muchos casos un método analítico es desarrollado y validado por un grupo de trabajo y aplicado por otro grupo y para asegurar que este último sea a su vez capaz de entregar resultados confiables, es conveniente realizar una transferencia de validación. Si se trata, por ejemplo, de un método cromatográfico consiste en la comparación de resultados de las pruebas de adecuación y análisis en paralelo, al menos dos muestras homogéneas de concentraciones conocidas, dentro del rango de aceptación del producto o dentro del rango de aplicación de la metodología. (Dosal, 2016) En un ensayo de validación deben considerarse los siguientes parámetros: - selectividad - linealidad - precisión - exactitud - sensibilidad - robustez

La selectividad, precisión, exactitud y sensibilidad fueron descritas con anterioridad y en lo que respecta a la linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la concentración de analito y su respuesta. Este paso de la validación es necesario si se va a trabajar con un solo estándar en las determinaciones de rutina, aunque pueden aceptarse métodos no lineales, si se opera con estándares múltiples cada vez. Además, conjuntamente se determina el rango lineal, es decir, el intervalo comprendido entre la concentración mínima y máxima de analito para el cual el método ha sido probado y dentro del cual se puede efectuar el dosaje por interpolación en una curva estándar. Para su determinación se prepara una serie de mínimo cinco diluciones de un estándar comprendiendo los ámbitos estimados de trabajo con un exceso de al menos 50% sobre el límite superior y un defecto de 50% debajo del límite inferior. Estas soluciones se inyectan, al menos por duplicado, y se determina la curva de regresión Y = bX+a sobre los puntos individuales sin promedios por el método de los cuadrados mínimos y se grafica para su documentación. En muchos casos es interesante comparar los resultados de la recta de regresión obtenida sobre el analito puro, con la correspondiente a analito + matriz. (Dosal, 2016)

Rectas de regresión del analito y analito más matriz para HPLC

La no correspondencia de las rectas indica problemas por efecto de la matriz y está relacionada con la exactitud del método en cuestión. Estos efectos de matriz pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza en aditivos y multiplicativos. Los aditivos se refieren a un desplazamiento positivo del cero en presencia de la matriz y los multiplicativos a un cambio de la pendiente.

El mejor indicador del modelo lineal, en reemplazo de r es el cálculo del valor tr con n-2 grados de libertad el cual se compara con el valor t tabulado para el nivel de confianza requerido. La hipótesis nula es "no existe correlación entre X e Y", si el valor observado de tr es mayor que t tabla se rechaza la hipótesis y existe correlación lineal significativa con la probabilidad calculada.

(Universo Formulas, 2016) Reactivos de laboratorio  Dicromato de potasio (K2Cr2O7)  Ácido sulfúrico (H2SO4) Materiales de laboratorio      

Matraces volumétricos 25 ml Pipeta volumétrica 2 ml Pipeta automática 1000 µl Picetas Gotero Auxiliar de pipeta

Equipos de laboratorio  

Espectrofotómetro GENESYS 20 Balanza analítica

Actividades operatoria

por o

desarrollar/ procedimiento

ALICUOTA

VOL. DILUCION

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml

CONCENTRACION µg Ion Cromo/ml 10 20 30 40 50

Calcule: ¿Cuál es la concentración en µg del ion cromato/ml de cada una de las diluciones? Solución: Datos: V1= X1, X2, X3, X4, X5 C1= 500 µg/ml V2= 25 ml C2= 10 µg/ml, 20 µg/ml, 30 µg/ml, 40 µg/ml, 50 µg/ml V1 C1 = V2 C2 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 /𝐶1 𝑉1 =

25 ml ∗ 10 µg/ml = 0,5 ml 𝑹// 500 µg/ml

técnica

𝑉1 =

𝑉1 =

25 ml ∗ 30 µg/ml = 1,5 ml 𝑹// 500 µg/ml

𝑉1 =

𝑉1 =

25 ml ∗ 20 µg/ml = 1 ml 𝑹// 500 µg/ml

25 ml ∗ 40 µg/ml = 2 ml 𝑹// 500 µg/ml

25 ml ∗ 50 µg/ml = 2,5 ml 𝑹// 500 µg/ml

Resultados obtenidos

Absorbancia (430.0 nm) 0.088

Concentración 20.34 Y=0.00387x+0.0093 𝑿=

𝒀−𝒃 𝒎

=

𝟎.𝟎𝟖𝟖−𝟎.𝟎𝟎𝟗𝟑 𝟎.𝟎𝟎𝟑𝟖𝟕

= 𝟐𝟎. 𝟑𝟒

𝑽𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒄𝒂𝒍𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐 𝟐𝟎 𝒙𝟏𝟎𝟎 = 𝒙𝟏𝟎𝟎 = 𝟏𝟎𝟏. 𝟕% 𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 𝟐𝟎. 𝟑𝟒

Conclusiones •Logramos aplicar el control de calidad (QC) en la elaboración de la curva de calibración como herramienta para la posterior validación de métodos de ensayo. •Realizamos una curva estándar de calibrado para el ion cromo a partir del Dicromato de potasio, empleando el programa Excel y con la ayuda del espectrofotómetro. Recomendaciones •Debemos recordar y aprender el funcionamiento básico del espectrofotómetro, así como también la lectura y el tratamiento de la muestra. •Utilizar guantes al momento de colocar el ácido sulfúrico. Bibliografía •Armendáris, G., (2013), Absorbancia, Quito, Ecuador: Maya Ediciones. •Brown, Theodore L.; LeMay, H. Eugene, Jr.; Bursten, Bruce E. Química. La Ciencia Central, 9ª edición; Pearson Prentice-Hall: México, 2004. •Universo Formulas (2016), Espectro de absorción, México DF, México. Recuperado de: http://www.universoformulas.com/estadistica/descriptiva/ •Dosal, M.; Pasos, A.; Sandoval, R. & Villanueva, M. (2016) Radiación electromagnética y ondas, Buenos Aires, Argentina. Recuperado de: www.depa.fquim.unam.mx/amyd/Documento_calibracion_material_volumetrico_33701.pdf