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INTRODUCCIÓN

Una de las proteínas presentes en el plasma sanguíneo es la albúmina, la cual posee importantes aplicaciones a nivel terapéutico y como reactivo de laboratorio. Su utilidad terapéutica radica en que restaura y mantiene el volumen de la sangre en circulación (presión oncótica) para así evitar el riesgo de infarto, en situaciones tales como trauma, hemorragias, operaciones de cirugía, pérdida de sangre, quemaduras e intercambio de plasma. También se aplica cuando el paciente presenta desnutrición o deshidratación e infecciones crónicas. (Harrison, 2001) Para el aislamiento de una proteína o cualquier otra molécula biológica, la primera etapa es la disolución; en algunos casos como ocurre con las proteínas del suero sanguíneo no se necesita este primer paso, sin embargo, habitualmente la proteína debe ser liberada de las células que las contienen. Para elegir el mejor método para este procedimiento debe tenerse en cuenta las características mecánicas del tejido de procedencia, como también, la localización de la proteína requerida en la célula. Si la proteína que nos interesa se encuentra localizada en el citosol de la célula, su liberación solo requiere la apertura por ruptura de la célula, usando un método muy conocido llamado lisis osmótica. (Mathews, 2002) Actualmente las técnicas de separación nos permiten obtener en cantidad, una serie de proteínas que hace unos años se creía que su mezcla era una sustancia pura. Las proteínas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento, empleando propiedades fisicoquímicas de las proteínas que interesan para separarlas de las demás sustancias. Las características de las proteínas y de otras biomoléculas empleados en los procedimientos de separación son: (Mathews, 2002)     

Solubilidad Carga iónica Tamaño molecular Propiedades de absorción Capa de unión a otras moléculas biológicas

Ciertas proteínas precipitan de su disolución en condiciones en las que otras permanecen completamente solubles, este efecto se emplea como base de la purificación de una proteína. La solubilidad de una proteína a una fuerza iónica determinada varía el tipo de iones que se hallan en la disolución, cuando la fuerza iónica es pequeña, aumenta con la concentración de la sal, sin embargo, cuando la fuerza iónica es mayor, la solubilidad disminuye ocasionando la precipitación de las proteínas como consecuencia del aumento de las fuerzas de interacciones soluto-soluto a comparación de las interacciones soluto-disolvente, llegando así a la precipitación del soluto. (Voet, 2006)

La diálisis es un proceso que separa moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas tales como los de los disolventes, sales y metabolitos pequeños, se difundan a través de la membrana pero bloquean el tránsito de moléculas mayores. La diálisis puede emplearse para concentrar una disolución macromolecular, empaquetando un saco de diálisis lleno en un desecante polimérico tal como el polietilenglicol que no puede penetrar a través de la membrana. La concentración se consigue porque el agua se difunde a través de la membrana y es absorbida por el polímero. (Voet, 2006)

IMAGEN 1: La imagen del lado izquierdo muestra el comienzo de la diálisis donde la concentración dentro de la bolsa de diálisis es alta. La imagen del lado derecho muestra el final de la diálisis cuando se encuentra en equilibrio.

OBJETIVOS

 

Precipitar albúmina a partir de una mezcla compleja de proteínas séricas con distintas concentraciones de Sulfato de amonio. Dializar la fracción proteína que contiene albúmina para eliminar la sal precipitante.

PROCEDIMIENTO

A. Colección de muestra (suero) 1. Colectar 4 ml de sangre en tubos vacutainer sin anticoagulante. 2. Centrifugara1000g por 10 minutos a una temperatura de 4°C. 3. Colectar el suero obtenido y almacenar en un criovial de 2ml. B. Precipitación 4. Colocar 200 uL de la muestra de suero en 2 tubos de microcentrífuga de 1.5 mL y mantener a 4°C (hielo) y rotular P10, P20, P30. 5. Colocar 30 uL de muestra problema y colocarlos en un tubo de 1.5 mL rotulado como “M” para su posterior análisis. 6. Adicionar según la tabla adjunta los siguientes volúmenes de PBS, solución de Sulfato de Amonio al 50% a cada uno de los tubos rotulados como P10, P20 y P30 y mezclar por inversión. (Realizar todos los procedimientos a 4°C – hielo). El volumen total de los 3 tubos será de 500 uL. 7. Mezclar por inversión un par de veces e incubar en hielo por 20 minutos. 8. Centrifugar los tubos P10, P2O y P30 a 10000 rpm por 10 minutos. 9. Retirar los sobrenadantes y transferirlos a 3 tubos de microcentrifuga de 1.5 mL rotulados S10, S20 y S30. Medir el volumen transferido y anotarlo. Mantener los sobrenadantes y precipitados en hielo. 10. Agregar 500 uL de buffer Tris-HCl 0.05M, 0.5mM MgCl2, pH 9 a cada precipitado obtenido

en los tubos P10, P20 y P30. Disolver en la medida de lo posible los precipitados utilizando el vortex por 20 segundos. Colocar los tubos en hielo.

C. Determinación de la concentración de Proteínas por el método de Biuret. 1. Preparar las reacciones enzimáticas siguientes en tubos de vidrio. Reactivo Estándar (μl) Muestras (μl) Biuret (μl) 

B

St

M

P10 %

P40 %

P70 %

S10 %

S40 %

S70 %

--

5

--

--

--

--

--

--

--

--

--

5

5

5

5

5

5

5

500

500

500

500

500

500

500

500

500

Incubar por 10 minutos a 37°C

2. Leer la absorbancia de los tubos a 540 nm. 3. Cálculo de la concentración de proteína total a partir de la concentración del estándar:

Factor=

[ estándar ] absorbancia estandar

[ Proteína total ]=Factor x absorbancia muestras

D. Determinación de la albúmina total Preparar las reacciones para la determinación de albúmina de acuerdo al siguiente esquema:

Reactivo Estándar (μl) Muestras (μl) Albúmina (μl)



B

St

M

P10 %

P20 %

P30 %

S10 %

S20 %

S30 %

--

10

--

--

--

--

--

--

--

--

--

10

10

10

10

10

10

10

100 0

100 0

100 0

100 0

100 0

100 0

100 0

100 0

100 0

Incubar por 3 minutos a temperatura de ambiente.

1) Leer a absorbancia de 620nm. 2) Calcular la concentración de albúmina a partir de la concentración estándar.

Factor=

[ estándar ] absorbancia estandar

[ albúmina ]=factor x absorbancia muestras

E. Cálculo de la concentración de Globulinas

[ Globulina ] =[ Proteína Total ] −[ Albúmina]

RESULTADOS

1) Los resultados con respecto a la determinación de concentración de proteínas por el método de Biuret son los siguientes:



[ proteínas totales estándar ] =5.13 g /dl



absorbancia estándar=0.116



Factor=

[ estándar ] absorbancia estandar

=

5.13 g/dl =44.224 g/ dl 0.116

Entonces la concentración de proteínas totales para cada tubo se determinara mediante la siguiente formula:

[ proteínas totales ] =factor x absorbancia muestras

Tabla 1: Muestra las concentraciones de proteínas totales (g/dl) para cada tubo.

[ prote í nas totales ]

Muest

Absorba

ra

ncia

M

0.203

(g/dl) 8.977

P10

0.002

0.088

P20

0.045

1.990

P30

0.082

3.626

S10

0.081

3.582

S20

0.071

3.139

S30

0.047

2.078

2) Así mismo, los resultados con respecto a la determinación de concentración de albúmina son los siguientes:



[ alúmina estándar ] =3.1 g/dl



absorbancia estándar=0.573



Factor=

[ estándar ] absorbancia estandar

=

3.1 g/ dl =5.410 g/dl 0.573

Entonces la concentración de albúmina total para cada tubo se determinara mediante la siguiente formula:

[ albúmina ]=factor x absorbancia muestras

Tabla 2: MuestraTabla las concentraciones 2 de Albumina (g/dl) para cada tubo.

Mues

Absorba

tra

ncia

M P10 P20 P30 S10 S20 S30

0.874 0 0.007 0.075 0.356 0.320 0.247

[ albúmina ] (g/dl) 4.728 0 0.038 0.405 1.925 1.731 1.336

3) El porcentaje de albúmina en la concentración de proteínas totales para cada tubo es: Tabla 3: Porcentaje de albúmina en la concentración de proteínas totales. M 52.6 6%

P10

P20

0%

1.90%

P30 11.16

S10 53.74

S20 55.1

S30 64.2

%

%

4%

9%

4) Finalmente se determinó la concentración de globulina para cada tubo mediante la siguiente fórmula:

[ globulina ] =[ proteina total ] −[ albúmina ]

Tabla 4: Concentración de globulina para cada tubo

M

P10

P20

P30

S10

S20

S30

4.24 9

0.088

1.952

3.221

1.657

1.40

0.74

8

2

DICUSIÓN:

En la Tabla 1, tenemos las concentraciones de proteínas totales para cada tubo que fue determinada por el método de Biuret. Este método para cuantificar proteínas no es muy efectivo en esta práctica, ya que uno de los reactivos usados es el sulfato de cobre, la cual no tolera altas concentraciones de amonio y como consecuencia llegan a reaccionar. Aquí tenemos nuestro primer error, no se logró obtener la verdadera intensidad de color por lo tanto hubo una variación en la lectura del contenido proteico de las muestras. La concentración total de proteínas para el tubo P30 fue 3.626 g/dl, el cual obtuvo la mayor concentración proteica a comparación de los tubos P10 o P20 que obtuvieron 1.990 g/dl y 0.088 g/dl respectivamente. Con respecto a la concentración de los sobrenadantes el tubo que presenta mayor concentración de proteínas es el S10 con el valor de 3.582, el S20 y S30 presentan 3.139 g/dl y 2.078 g/dl respectivamente. Sin embargo, esto no nos indica, si la mayor parte de la concentración obtenida sea necesariamente albúmina. Así tenemos, que el fraccionamiento por sales, se basa en la solubilidad de las proteínas con relación a la concentración salina (Fuerza iónica del medio) que se basa en 2 fenómenos (Freifelder, 2001): 

El fenómeno Salting in, ocurre cuando la solubilidad de una proteína en una concentración baja de iones, aumenta a medida que se agrega la sal, ocasionando que las fuerzas de atracción entre moléculas individuales de proteínas disminuya por la adición de estos iones.



Fenómeno Salting out, es el resultado de la competencia entre los iones de sales agregados y los otros solutos disueltos por el solvente. Cuando las concentraciones de sales son muy elevadas, los iones agregados son solvatados, provocando que haya una disminución significativa de solvente para disolver a las proteínas.

Entonces, partiendo que la albúmina posee la mayor solubilidad y el menor punto isoeléctrico de todas las proteínas mayores del plasma y que por ello, es la última proteína en precipitar bajo condiciones donde la concentración de sulfato de amonio aumenta en etapas 5. Sin embargo, otras proteínas como el fibrinógeno y las inmunoglobulinas son precipitadas de manera más rápida que la albúmina y en fracciones de sulfato de amonio por encima del 8% o 25%6. Esto confirma el hecho que en el tubo P30 obtuvo la mayor cantidad de precipitado de proteínas totales, mas no obtuvo gran concentración de albumina. Más bien, autores señalan que la albúmina se mantiene en la fracción del sobrenadante durante la separación sólidolíquido de cada suspensión proteica1. Por lo que se podría esperar, que la concentración del tubo S10 haya mayor cantidad de albúmina Con respecto a la Tabla 2, donde nos muestra las concentraciones de albúmina para cada tubo, podemos confirmar lo predicho anteriormente; el tubo P10 no contiene a la proteína albúmina por que a bajas concentraciones de sulfato de amonio no precipita. La albumina es

una molécula con forma alargada que tiene distribución asimétrica de grupos eléctricamente cargados, por esta razón la albumina es insoluble en el agua7. Las bajas concentraciones de sulfato de amonio neutralizan estos grupos cargados y permiten a la albúmina entrar en la solución, por el contrario, las altas concentraciones de sal las precipita otra vez. Por esta razón el tubo S10 presenta mayor concentración de albúmina que los tubos S20 y S30 cuyos valores son: 1.925 g/dl, 1.731 g/dl y 1.336 g/dl respectivamente. Así mismo, en la Tabla 3, se observa que el mayor porcentaje de albúmina lo contiene el tubo S30, luego el tubo S20, posteriormente el tubo S10. Los tubos P30, P20 y P10 obtuvieron los porcentajes más bajos de albúmina, siendo 0% en el tubo P10. Estos datos nos lleva a determinar que agregándole 10% más de sulfato de amonio podemos conseguir el precitado completo de la albúmina. Finalmente, en la Tabla 4, se observa que el tubo con mayor concentración de globulina es el tubo P10. Esto era de esperarse: las globulinas son proteínas con estructura

globular, su uniformidad eléctrica distribuida a través de su superficie, hace que la proteína sea soluble, por lo tanto puede ser precipitado por altas concentraciones de sal.8 CONCLUSIONES:

1) El método de Bradford puede usarse para esta práctica, debido a que sus reactivos utilizados no reaccionan con el sulfato de amonio, por lo tanto obtendríamos resultados confiables.

1

2) Las estructuras de las proteínas y su distribución eléctrica influyen mucho en la solubilidad de la proteína. 3) El fraccionamiento por sales es un método de separación de proteínas basado en el principio

si las proteínas son menos solubles a altas

concentraciones de sal.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es el fundamento de la precipitación diferencial de proteínas por sales? El fundamento de la precipitación por sales es lograr purificar una proteína, por efecto del tratamiento con diferentes concentraciones de sal, logrando que algunas precipiten y otras no, el sobrenadante será tratado luego con métodos para identificar las concentraciones totales de las proteínas presentes. (Harvey, 1991).

2.- ¿Qué otras sales pueden utilizarse para precipitar proteínas y cuáles son sus ventajas y desventajas de su uso?

Las series de Hofmeister indican que los aniones y los cationes son más efectivos en el siguiente orden:

Para seleccionar la sal tenemos que tener en cuenta estos puntos:  

Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que requiere el método. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea diferente a la de la solución para facilitar su separación. (Sergio Huerta Ochoa. Precipitación, Departamento de bioquímica)

3. En base a los resultados observados, a que concentración de Sulfato de amonio Ud. recomendaría la precipitación de la albúmina. Sustente su respuesta. Observamos en la tabla 3 que la concentración de albúmina en el tubo S30 es 64.29% del total, cuya concentración en el sobrenadante se debió al añadir 300 uL de sulfato de amonio al 50%. Se esperaría que la albúmina precipite añadiendo 100 uL más, ya que las proteínas solubles pueden precipitarse con una concentración mayor de la misma sal. (http://recursostic.educacion.es/newton/web/materiales_didacticos/equilibrio _quimico/aulaequilibrio.pdf)

4. ¿Porqué las proteínas precipitan cuando están en la presencia de etanol? ¿Qué otros solventes se pueden utilizar para precipitar proteínas? Mencione algún ejemplo que encuentre en la literatura. Las proteínas precipitan porque el etanol es un solvente orgánico que presenta una constante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización de los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad de ésta. (Sergio Huerta Ochoa. Precipitación, Departamento de bioquímica)

5. ¿Qué diferencia hay entre el principio de la precipitación por solventes y el de la precipitación por incremento de la concentración de sales?

La diferencia es que el principio de la precipitación de solventes se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un solvente orgánico ligeramente polar mientras que el principio de la precipitación de la concentración de sales se basa en la disminución de la solubilidad mediante el aumento de las concentraciones de sales (Voet, 2006). 7. ¿Qué es el cut-off de una membrana de diálisis? ¿Cuál es el cut-off de la membrana que ha utilizado? El cut-off es el tamaño de los poros de la membrana de diálisis. Puesto que la membrana porosa permite selectivamente solutos más pequeños para pasar mientras que conserva las especies más grandes, la diálisis puede ser usado efectivamente como un proceso de separación basado en el rechazo tamaño. Las condiciones de diálisis se puede controlar o manipular para producir resultados deseados para una variedad de aplicaciones de diálisis. Se utilizó cut-off de 14000 Da. (Mathews, 2002)

8. ¿Cuánto tiempo toma, normalmente, una diálisis? El tiempo que se requiere es a día.

BIBLIOGRAFIA:

1. BRAUWALD, E. y RANDOLPH HARRISON T. Principios de Medicina Interna. 15 Ed. Mc Graw Hill, 2001 2. C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Bioquímica. 3era Ed. Pearson Educación S.A. 2002 3. Voet D. Voet J. Bioquímica. 3 Edicion. Editorial Medica Panamericana, 2006. 4. Freifelder D. Reverté. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. 2001.

5. Producción de albúmina bovina, evaluación de dos métodos. Gonzales Luis, Acuña Teresa, Lara Jenny. 6. Purificación de proteínas. Principios y métodos. More, J; Harvey, M. 1991 7. Manual de prácticas de biología molecular de la célula I. Segal Kischinevzky, Claudia; Ortega Lule, Gustavo. Primera edición. Facultad de ciencias UNAM. México, 2005 8. Purificación de proteínas. Principios y métodos. More, J; Harvey, M. 1991 9. Sergio Huerta Ochoa. Precipitación, Departamento de bioquímica.

http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/files/users/uami/sho/Precipitacion.pdf