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• Valentina Paz Fuentes Conapiado

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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE LA SANTÍSIMA CONCEPCIÓN FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA DEPTO. DE BIOQUÍMICA

INTEGRANTES:  FERNANDA FUENTEALBA ULLOA  VALENTINA FUENTES CONAPIADO  MACARENA LOBO BLANC  CARLA MORA VOGT  ROMINA PULVERMÜLLER SALVATIERRA  JONATHAN RIQUELME TAPIA DOCENTES:  Dr. REGINALD DEL POZO, Ph.D.  BQ. MIRNA MUÑOZ, M.Sc. FECHA: MIÉRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

2 INDICE

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OBJETIVOS

02

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INTRODUCCIÓN

03

    

RESULTADOS

04 04 05 06 08

APLICACIONES

09

   

09 11 12 12

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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS PROCEDIMIENTO FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN

MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS OTRAS APLICACIONES

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CONCLUSIÓN

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BIBLIOGRAFÍA

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OBJETIVOS  Desarrollar el concepto de las técnicas cromatográficas a nivel general.  Comprender los principios de la cromatografía de intercambio iónico.  Analizar paso a paso el método de la técnica y los distintos tipos de intercambiadores iónicos que permiten su función.

 Determinar los factores que afectan, interfieren o alteran el procedimiento y su correcta ejecución para lograr el objetivo deseado.  Reconocer las distintas aplicaciones preferentemente en el ámbito médico y la importancia de esta técnica cromatográfica.

3 INTRODUCCIÓN Para el estudio de las sustancias se deben ocupar diversas técnicas, que han ido evolucionando con el paso de los años. Una de las técnicas más básicas es la cromatografía, en sus múltiples variantes. Esta técnica se da desde siempre en la naturaleza, como en lo que efectúan las piedras, que permiten purificar el agua. La cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel. El botánico ruso Mijaíl Tswett empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que proviene del griego χρομα y γραφω que significan respectivamente chroma "color" y graphos "escribir"). Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como (1): Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc. Se basa en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser: 1. La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado

el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2. La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas de adsorción de líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que éstos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna.

Imagen 1. Separación de clorofilas mediante cromatografía en papel.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas, como son el de separar los componentes de la mezcla, para así purificarlos, o para medir las proporciones de los componentes. Existen múltiples tipos de cromatografía, que se pueden separar en dos grandes grupos: a) Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son: Cromatografía en papel, Cromatografía en capa fina. b) Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.

4 Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: Cromatografía de líquidos, Cromatografía de gases, Cromatografía de fluidos supercríticos.

Dentro de la cromatografía en columna de líquidos, están un grupo de técnicas, dentro de las que queremos destacar la cromatografía de intercambio iónico, que ocupa en su fase móvil un liquido polar, y estacionaria un sólido. Esta cromatografía es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de moléculas. Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.

El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico(3) es que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material, por los sitios de unión.

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B

Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada “muestra” y los componentes separados individualmente son llamados “analitos”. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad(2).

C

Imagen 2. (A) Con una fase estacionaria cargada negativamente son retenidas las sustancias cargadas positivamente. (B) Deben competir con los contraiones (del amortiguador). (C) Las sustancias cargadas negativamente pasan a través de la face estacionaria sin enlazarse.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO La cromatografía de intercambio iónico es un método de separación que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases, la fase estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil La fase móvil en cromatografía de intercambio iónico suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas en forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase móvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.

 PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos. Si un grupo está cargado negativamente, podrá intercambiar iones positivos y será un intercambiador de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma ácida, y puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca2+. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros grupos de utilización corriente son el carbonilo e hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos

5 débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo un grupo amino cuaternario), es un intercambiador de aniones o aniónico fuertemente básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o aromáticos. A

B

C

Imagen 3. Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Cationes. (A) Resina de poliestireno, ácido fuerte (Dowex-50). (B) Resina de carboximetil celulosa, ácido débil (CM Cellulose). (C) Resina de poliestireno, ácido débil y quelante (Chelex-100).

La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso más corriente son el dextrano, la celulosa y copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno contie los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno. La elección entre intercambiadores fuertes o débiles está basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar una sustancia débilmente ácida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos. No obstante, si la sustancia es lábil, es preferible la utilizacion de intercambiadores débiles. Los intercambiadores débiles son tambien excelentes para la separacion de moléculas con una carga elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones debilmente cargados no se unen, por lo general, al intercambiador. Los intercambiadores débiles permiten, asimismo, una mayor resolucion de las sustancias si las diferencias de carga son muy pequeñas. A

B

Imagen 4. Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Aniones. (A) Resina de poliestireno, base fuerte (Dowex1). (B) Resina de dietilaminoetil celulosa, ácido débil (DEAE).

Para una correcta elección de la porosidad y del tamaño de la malla es necesario tener en cuenta que las moléculas pequeñas se separan mejor sobre matrices con tamaño de poro pequeño (o sea, un elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es grande, mientras que las macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor. Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la purificación de moléculas grandes como proteínas y polinucleótidos. Ello es debido a que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos funcionales se encuentran en la superficie y disponibles, incluso, para las moléculas mayores.  PROCEDIMIENTO Para realizar una cromatografía de intercambio iónico son necesarios los siguientes materiales: (1) Columna de vidrio, (2) Matriz de intercambio iónico (Resina), (3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5) Colectores(4). La mayoría de los experimentos basados en esta técnica están basados en 4 etapas(5). 1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catiónico sulfonado asociado a Na+ producto de la disociación de NaOH. 2. Aplicación y Lavado: El paso siguiente es aplicar la muestra la cual queremos filtrar a través de la columna mediante un lavado específico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza iónica que el buffer inicial para que todas las proteínas cargadas se unan al intercambiador. Por ejemplo: A la forma sódica de la resina lavada se le añade una solución ácida (pH=3) de la mezcla de aminoácidos; a dicho pH los aminoácidos se encuentran en forma de cationes con carga neta positiva. Los aminoácidos catiónicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las partículas de resina. A pH 3 los aminoácidos más básicos se unirán a la resina de forma más estrecha y los más ácidos o menos básicos, se unirán menos.

6 A

B

C

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Imagen 5. Fases del procedimiento de cromatografía de intercambio iónico. (A) Fase de Equilibrio en la parte inferior. (A) y (B) Aplicación. (C) Elusión. (D) Regeneración.

3. Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido a cambios en la composición del buffer. Una manera común es incrementando la fuerza iónica con cloruro de sodio u otra sal común. Los aminoácidos serán eluídos dependiendo de la carga neta que estos posean. A medida que se aumenta gradualmente el pH y la concentración de NaCl del medio eluyente acuoso, los aminoácidos descienden en la columna a velocidades diferentes y pueden recogerse en muchas pequeñas fracciones. La disminución del pH protonará a los grupos de los aminoácidos por lo que su carga neta tenderá a ser positiva, al revés si se aumenta el pH. Si se aumenta la concentración de sal, sus iones competirán mucho más por la resina y se intercambiarán por los grupos de aminoácidos. Las diversas fracciones pueden analizarse cuantitativamente mediante la reacción con ninhidrina. Los aminoácidos aniónicos aparecen primero y los más catiónicos aparecen posteriormente (con un intercambiador catiónico). 4. Regeneración: Por último, remover las partículas que aún están asociadas al intercambiador. Para ello se debe generar un cambio más drástico en el pH y la concentración salina. Ahora la fase estacionaria puede volver a ser utilizada. A

B

C

D

E

Imagen 6. (A) Resina de intercambio catiónico antes de añadir la muestra. (B) Se añade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys. (C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el aminoácido con menos carga positiva eluye el primero. (D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser. (E) Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga positiva eluye el último.

 FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN  Tiempo de retención (Tr): se describe como el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que la mayor concentración del analito alcanza el detector (cuando se ha separado todo el analito), es decir, el tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna. En la cromatografía de intercambio iónico la retención está basada en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando la retención de los compuestos se ve afectada, se favorece la elusión de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.  pH: Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico, reduciéndose así, el tiempo de retención. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad, reduciéndose también el tiempo de retención.  Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la de elusión es menor, mientras más cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes). Los iones

7 polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes.

 Porosidad: El tamaño del poro de la resina al que se une el compuesto móvil por intercambio iónico influye directamente en la capacidad de unión. En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño (menor de 600Å) no hay espacio suficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo, en membranas con tamaño de poro mayor (mayor de 600Å) se puede unir el compuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio.

Imagen 7. Muestra el intercambio catiónico a la izquierda desde los menos absorbidos a los más absorbidos. A la derecha se muestra la fuerza eluyente en el intercambio aniónico.

 Gradiente: Aumentando la concentración de la fase móvil, los iones compiten cada vez más favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

Imagen 8. Esquema del gradiente del Buffer con contraiones cargados negativamente. Se presenta un gráfico con el poder de elusión (fuerza iónica) y el porcentaje de proteína eluída, que muestra una gradiente directamente proporcional.

Imagen 9. Donde existe mayor porosidad (derecha), se puede unir el compuesto móvil dentro de estos poros incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.

 Supresor es de iones: La cromatografía iónica tardó en desarrollarse debido a la falta de un buen sistema de detección. La elección evidente es un detector conductimétrico. El problema es debido a la elevada concentración iónica necesaria para eluir a la mayoría de los iones en un tiempo razonable. Ello hace que la conductibilidad de la propia fase móvil sea muy elevada haciendo muy difícil la detección de pequeñas concentraciones de analito. Este problema se resolvió mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatográfica. Los primeros supresores fueron columna de intercambio iónico que convierten los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras. Así, por ejemplo, cuando se separan cationes es frecuente emplear una

8 disolución de HCl como eluyente. La columna supresora es anionica y contiene iones OH-. Al paso de la fase móvil por la columna supresora los Cl- son intercambiados por iones OH-. De este modo se ha sustituido el HCl muy conductor por H2O poco conductora. En la separación de iones es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase móvil. La columna supresora es en este caso catiónica. De este modo el Na+ es sustituido por H+ formándose un electrolito débil como H2CO3.

diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada. A

B

A

Imagen 11. Cromatograma. (A) Aniones. (B) Cationes.

B

Imagen 10. (A) Esquema del mecanismo de supresión de iones. (B) Reacciones de supresión de iones.

RESULTADOS El cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los

La cromatografía iónica es una variante de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Es un método eficaz para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de intercambio iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren una separación debido a las diferentes retenciones que sufren al interactuar con la fase fija de las columnas analíticas. Una vez separada, la muestra pasa a través de un detector (conductimétrico, amperométrico, UV, etc.) donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo de retención. El resultado son los cromatogramas donde la posición de los máximos nos indica el ión presente (carácter Cualitativo) y su área nos indica la cantidad existente de dicho ión (carácter Cuantitativo)(6). Imagen 12. El Servicio de Análisis del ICB dispone de un cromatógrafo iónico Metrohm con columna Metrosep A Supp 5 y detector conductimétrico, que se emplea en la determinación de fluoruros, cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos y sulfatos.

9 APLICACIONES  MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA La diabetes mellitus(7) es una condición metabólica de incidencia creciente, caracterizada por disfunción en la homeostasis de la glucosa, con hiperglicemia crónica por inmunodeficiencia absoluta o relativa. La enfermedad es progresiva y asociada con alto riesgo de desarrollar compromiso vascular. La determinación de los niveles de glucosa en sangre y orina y de los cuerpos cetónicos en la orina suministran una información muy útil para el tratamiento diario de la diabetes. Sin embargo, ninguno de estos tests facilita al paciente y al equipo de cuidados médicos un valor representativo y cuantitativo de la glicemia a lo largo del tiempo. La determinación de las proteínas glicosiladas, sobre todo de la hemoglobina y de las proteínas séricas, ha añadido una nueva dimensión a la evaluación de la glicemia. Mediante una simple medida, estos tests permiten cuantificar los valores de la glicemia media durante semanas e incluso meses, complementando los análisis que el paciente lleva a cabo día a día. La hemoglobina(8) es una proteína que se encuentra en los glóbulos rojos de la sangre (hematíes) y sirve para aprovisionar de oxígeno al resto de nuestras células y tejidos. Esta proteína se une a la glucosa circulante por el torrente sanguíneo. El porcentaje de proteína unida a la glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede también en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en la sangre, más se une a las proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la hemoglobina. La HbA1 describe una serie de componentes estables minoritarios de la hemoglobina que se forman lentamente y sin intervención enzimática, a partir de la hemoglobina y la glucosa. La velocidad de formación de HbA1 es directamente proporcional al nivel de glucosa en la sangre y al ciclo de vida de las proteínas glicosiladas. La hemoglobina es una de las proteínas de la sangre que pueden glicosilarse en proporción a la concentración de glucosa en plasma, dependiendo solamente de la concentración de glucosa y del

tiempo de exposición celular a la misma. Como los eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la historia glicémica de los 120 días anteriores, que corresponde a la vida media de estas células. En la mujer en gestación, el estado de la glicemia se relaciona con las últimas 4 semanas precedentes debido al acelerado recambio de los eritrocitos. La American Diabetes Association recomienda que el objetivo de todo tratamiento debe ser un valor de la HbA1 menor a 7% y que los médicos deben de reevaluar cualquier régimen de tratamiento en el que los valores sean consistentemente mayores de 8%. Estos valores específicos de la HbA1 se refieren sólo a los que han sido obtenidos por medios validados frente al método de referencia(9). HbA1c (%) 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 10-11 11-12

Promedio de Glicemias (mg/dl) 80-120 120-150 150-180 180-210 210-240 240-270 270-300

Calificación Excelente Muy Bueno Bueno Regular Problemático Malo Muy Malo

Tabla 1. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) refleja la concentración de la glucosa en los últimos 120 días. El porcentaje de HbA1c se aumenta en proporción a las cifras de glicemia que han precedido en las últimas 6-8 semanas. En general por cada 1% de aumento en la HbA1c, evidencia un incremento en los promedios de glicemia de aproximadamente 30mg/dl. Una HbA1c de 6% refleja un promedio de glicemia de 120mg/dl. Es deseable que las personas con diabetes mantengan un promedio de HbA1c inferior a 7%.

Existen varios métodos para la determinación de la hemoglobina glicosilada, a manera informativa se encuentran las pruebas inmunoquímicas, la electroforesis, la cromatografía de afinidad al borato, la cromatografía líquida de alta presión y la cromatografía de intercambio iónico. El método de cromatografía de intercambio iónico(10) se basa en la elusión diferencial de la hemoglobina glicosilada por el cambio de carga que se produce en la molécula debido a la glicación del grupo amino terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).

10 El valor de la HbA1c ha mostrado su utilidad para predecir el riesgo del desarrollo de muchas de las complicaciones crónicas de la diabetes. La determinación de la HbA1c debe ser realizada rutinariamente en todos los pacientes con diabetes, en primer lugar para documentar el grado de control glicémico al inicio del tratamiento, y luego como parte del mismo.

Imagen 13. Esquema de las variantes de hemoglobina encontradas en el torrente sanguíneo; incluye el porcentaje de HbA1 en estados “normales” en la sangre para el control de la glicemia.

La hemoglobina adulta humana usualmente consiste de HbA (97% del total), HbA2 (2,5%) y HbF (0,5%). El análisis cromatográfico de la HbA identifica distintas hemoglobinas menores llamadas HbA1a, HbA1b, HbA1c, que colectivamente se denominan HbA1, glicohemoglobinas o hemoglobinas glicadas. La hemoglobina glicosilada A1c es el componente mayoritario (80%) de la hemoglobina A1. La HbA1c es el resultado de la condensación de la glucosa con la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina. La incorporación de glucosa es un proceso no enzimático e irreversible.

Para cada paciente individual, la frecuencia de la determinación de HbA1c dependerá del régimen de tratamiento utilizado y del criterio del médico. En ausencia de estudios bien controlados que sugieran un protocolo definido, la opinión de los expertos es que se deben practicar al menos dos determinaciones de la hemoglobina glicosilada en los pacientes bien controlados que se mantienen estables y al menos cada tres meses en sujetos que no han alcanzado un nivel de glicemia óptimo o en los que se ha modificado el tratamiento. Como cualquier otro parámetro, la hemoglobina glicosilada puede resultar modificada por alteraciones que varíen el natural recambio de los glóbulos rojos, tales como por hemorragias, anemia hemolítica, transfusiones, embarazos, etc., situaciones que producirían falsos descensos. También se puede ver alterada por la ingestión de dosis elevadas de ácido acetil salicílico, vitamina C, alcohol, altas cifras de lípidos en sangre, etc., que conducirían a falsos aumentos. La HbA1c puede valorar además el éxito del tratamiento antidiabético; permite comparar y comprobar la eficacia de nuevos tratamientos; nos posibilita determinar la duración de la hiperglicemia y a su vez individualizar los regímenes del control antidiabético.

Imagen 14. La glucosa se una de las cadenas β de la hemoglobina en el extremo Val terminal, transformando la HbAo en HbA1c.

La hemoglobina glicosilada es muy importante, sin embargo no puede sustituir al monitoreo de glicemias, ya que ésta no puede medir su control diario y por lo tanto no le permite ajustar sus dosis de

11 medicamentos orales, de insulina, de actividad física o de ingesta de alimentos en el día a día.  DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA Las porfirias son un grupo de enfermedades de origen genético o adquirido que tienen como característica común una alteración en la actividad de una o varias enzimas de la vía metabólica del grupo HEM, lo que ocasiona niveles anormalmente elevados de porfirinas o sus precursores (p. ej., ácido deltaaminolevulínico [ALA] y porfobilinógeno [PBG]). Estos se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones patológicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema nervioso y la piel (11).

Imagen 15. Estructuras químicas del Aminolevulinato y del porfobilinógeno.

Las variedades de porfiria que presentan sobreproducción de los precursores de las porfirinas ácido delta aminolevulínico (ALA) y porfobilinógeno (PBG)- suelen presentar crisis agudas, las que pueden ser muy graves y causa de muerte. Estas crisis se caracterizan por síntomas digestivos (dolor cólico, vómitos, estreñimiento), neuropsíquicos (paresias, parestesias, parálisis, confusión, depresión, alucinaciones y psicosis), cardiovasculares (taquicardia e hipertensión) y otros (secreción inadecuada de la hormona antidiurética, intolerancia a la glucosa, alteración de los niveles de la hormona del crecimiento e hipercolesterolemia). Su patogenia ha sido explicada en parte por un efecto neurotóxico del ALA y PBG, y por un déficit del grupo HEM(12). Los pacientes con variedades de porfirias que presentan producción aumentada de porfirinas manifiestan fotosensibilidad debido a la activación de estos compuestos por acción de la luz UV. Las alteraciones cutáneas se caracterizan por eritema y ampollas, que al mejorar dejan cicatrices hiper o hipopigmentadas.

La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es una de las más comunes y severas de las porfirias heredadas. Es un desorden autosómico dominante, que causa deficiencia parcial de la actividad de la porfobilinógeno desaminasa (PBGD), tercera enzima de la ruta de síntesis del grupo HEM.

Imagen 16. Signos de una crisis aguda de porfiria. Cambio de Porfobilinógeno de coloración normal a Uroporfiria I en la orina reposa.

Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia los niveles de Porfobilinógeno (BPG) y/o Ácido 5- Aminolevulónico (ALA) en la orina se incrementan significativamente. Por lo cual es necesario contar con un método que cuantifique estos precursores metabólicos para una pronta confirmación del diagnóstico e inicio del tratamiento. Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200 mg/día, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/día, y la excreción de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/día, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/día. El método de Mauzerall-Granick y otros parecidos son los más usados para la cuantificación de estos dos precursores(13). Este método se basa en la técnica de cromatografía de intercambio iónico, en la cual se utilizan columnas con resinas aniónicas y catiónicas. El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en la catiónica. En la columna con PBG, se utiliza ácido

12 acético 1M para que éste eluya y pueda ser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M para que éste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columna reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso. Este reactivo está conformado por 4-dimetilbenceno diluido en ácido acético y ácido perclórico. El producto es medido espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir de esta medición se puede calcular la concentración de estos intermediarios. En casos de intoxicación por plomo pueden detectarse concentraciones de ALA elevadas en orina también, ya que el plomo puede bloquear la vía metabólica en la que interviene el ALA. Por lo tanto, la determinación conjunta de ALA y PBG permite diferenciar las porfirias de la intoxicación por plomo(14).  EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La cromatografía de intercambio iónico es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elusión) ya que los iones del tampón de elusión interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico. Primero fluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elusión, eluiran las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta(15). Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores aniónicos(16): el metilaminoetanol (MAE) o el dietilaminoetil (DEAE). La unión del ADN (cargado negativamente) depende principalmente del componente estérico de los grupos funcionales y de la afinidad del intercambiador aniónico por el respectivo ácido nucleico; puesto que el grupo MAE es menos voluminoso y más hidrofílico que el DEAE, la unión de los ácidos nucleicos a los primeros es más efectiva que a los segundos. Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz

intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elusión se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtiene una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (ADN y/o ARN). Al final los ácidos nucleicos se eluyen con un tampón de máxima salinidad. Por último, se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas, finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampón de baja salinidad para su posterior utilización o almacenamiento. Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con esta tecnología, la principal aplicación de esta cromatografía es la purificación de ADN plasmídico para transfección (introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos). Esta técnica incluye un pretratamiento de la muestra que consiste en una lisis bacteriana en condiciones alcalinas que ocasiona una desnaturalización del ADN cromosómico y plasmídico. Antes de la introducción de la muestra en la columna se trata con acetato potásico, lo que ocasiona que el ADN cromosómico precipite junto con el resto de componentes de la muestra, mientras que el ADN plasmídico se renaturaliza y permanece en disolución.  OTRAS APLICACIONES  Purificación de agua  Purificación del fibrinógeno de la leche  Determinación de anticonvulsantes en el suero después de la extracción de la fase sólida.  Análisis de antibióticos de poliéter  Determinación de pesticidas.  Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.  Detección de derivación-fluorescencia postcolumna para análisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .  Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.

13 CONCLUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA

La cromatografía de intercambio iónico, también llamada cromatografía iónica o cromatografía del ión, es una técnica que permite la separación de iones y moléculas polares basada en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula con carga. La solución que debe inyectarse es llamada "muestra" y los componentes separados individualmente; “analitos”.

(1) http://www.textoscientificos.com/quimica/cromato grafia (2) Harris, Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”, 3ª Edición, Editorial Reverté. (Página 641). (3) Freifelder, D. “Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular”, Editorial Reverté. (Página 217). (4) http://www.mnstate.edu/provost/IonExchangeProt ocol.pdf (5) http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivo s/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf (6) http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/ class/08_chrom.pdf (7) Costanzo, Linda S. “Fisiología”, 2000, McGrawHill, México. (Página 416). (8) http://www.diabetesalinstante.com/index.php?id= 7 (9) Hernández Ventura, Jaime Roberto. “Importancia de la Hemoglobina Glicosilada”, SlideShare.net (Documento Power Point). (10) “Hemoglobina Glicosilada, el marcador de la diabetes”. Diagnostics Roche. (Folleto informativo) (11) http://manualmerck.tripod.com/MMCap14.htm (12) http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S021271992003000600012&script=sci_arttext (13) http://www.aebm.org/formacion%20distancia/dist ancia%202007-2008/taller/monografias/3.%20PORFIRIAS.pdf (14) http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/CROM ATOGRAFIA/11017c.pdf (15) http://interware.org/labeutm2006/wpcontent/uploads/2007/09/practico-eutm.doc (16) http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluci ones-QPCR-protocolos.pdf

El intercambio iónico es el intercambio reversible y estequiométrico de iones entre una fase sólida y una fase líquida. Si nos interesa separar analitos catiónicos se utiliza una fase estacionaria que contenga sitios activos negativos, los cuales deberán encontrarse unidos a algún catión que mantenga la electroneutralidad. Este catión deberá ser desplazado por el analito para establecer el equilibrio y unirse al sitio aniónico de la fase estacionaria. De manera análoga, para separar aniones se utilizan fases estacionarias con cargas fijas positivas que se encontrarán unidas a algún anión encargado de mantener la electroneutralidad, y que será desplazado por el analito para el establecimiento del equilibrio. Diversos factores como el pH, cargas, gradiente y porosidad afectan el tiempo que un compuesto demora en eluir de la columna (tiempo de retención). Los resultados se muestran en un cromatograma, que es una representación gráfica de los resultados obtenidos; en el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada. Este tipo de cromatografía presenta diversas aplicaciones, en este informe se mecionaron la determinación de la hemoglobina glicosilada, determinación de PBG y ALA en orina y separación de ácidos nucleicos, pero su uso no termina allí, ya que hay numerosos usos más, como por ejemplo, análisis de proteínas en la industria alimenticia con valor nutricional, y en la purificación del agua; así como también a lo largo de la historia cobró relevancia en el Proyecto Manhattan durante la segunda guerra mundial para la fabricación de la bomba atómica.

**** Voet, Donald; Voet, Judith. “Bioquímica” 3a Edición 2006 **** Texto base guía para todo el desarrollo y entendimiento de la investigación sobre cromatografía de intercambio iónico.