• Author / Uploaded
• Miguel

• Categories
• Las bacterias
• Microorganismo
• Biología Celular)
• tijeras
• Laboratorios

Citation preview

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

RECUENTO EN PLACA, CARACTERIZACION DE COLONIAS Y SIEMBRA DE MEDIO SOLIDO EN MEDIO LIQUIDO

CUARTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

SANCHEZ CHAVEZ MIGUEL- 20174535A

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú 18 de mayo de 2018

1. RESUMEN En este laboratorio hemos realizados una serie de de procesos que tienen una continuidad comenzando por el conteo de de las colonias en las placas petri, para luego proceder a caracterizar las colonias elegidas para el siguiente proceso que es la siembre de estas colonias escogidas en el caldo BHI, así también una muestra de mano y boca. Para el conteo de las unidades formadoras de colonias se utilizo el método de recuento en placa, que tiene una serie de requisitos. Por otro lado para la siembra de las colonias en el caldo se procedió a realizar el método de la inoculación. Como no siempre se puede llegar a un resultado favorable, en cuanto al conteo fui muy difícil hallar el recuento estándar de las placas debido a que en el experimento anterior hubo presencias de contaminantes en la siembra en las placas petri, aunque en algunas placas si se pudieron encontrar algunas colonias, justamente estas se utilizaron para la inoculación en el caldo BHI.

2. INTRODUCCION El metodo de recuento en placa nos ayuda a obtener con una gran aproximacion la cantidad de unidades formadoras de colonias de la muestra que se sembro en las placas petri, para realizar esto solo se deben aplicar reglas matematicas previamente habiendo escogido dos placas donde se sembraron muestras de dos disoluciones consecutivas, aunque existen algunas excepciones. La caracterizacion de las colonias se dan según la forma, color, textura, grosor y mas, esto nos puede mostrar que microorganismo partenece a esa colonia. La siembra de de un medio solido a uno liquido es muy importante pues despues este medio nos dira si los microorganismos son anarobios, anaerobios facultativos o aerobios, asi como tambien la siembra en medio liquido nos ayuda a que luego este medio liquido se siembre nuevamente en un medio selectivo y diferencial para obtener certeramente que microorganismo es el que se cultivo. En cuanto a las muestras de boca y mano nos ayuda a reconocer que microorganismos estan presentes en dichos lugares de donde se saco la muestra con hisopos.

3. OBJETIVOS 

Determinar mediante la tecnica de recuento en placa el numero mas probable de microorganismos de la muestra cultivada.



Identificar y caracterizar las colonias mas conservadas para su posterior utilizacion.



Aprender el metodo de inuculacion en medio liquido con las medidas necesarias para un resultado eficaz.



Observar el comportamiento del crecimiento de bacterias en medio liquido.

4. MARCO TEORICO El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido

celular

del

nitrógeno

o

indirectamente

por

turbidimetría,

proporcional al número de células) y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana). Existen muchos medios diferenciales, en la práctica rutinaria se usan los siguientes: Conteo en caja de petri Método más usado para contar bacterias. Se prepara un caldo de cultivo, el cual posteriormente se vierte en las placas de petri. Dependiendo del tipo de sembrado, puede que la muestra se encuentre incorporada en el agar (Pour method) o puede que la muestra se disperse sobre el agar gelificado (Spread method). Es de suponerse que cada célula o grupo de células presentes en la muestra se reproducirá en sus múltiples alrededores para producir "colonias de células" separadas en el agar. Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser así, éstas pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias). El conteo se

facilita utilizando un contador de colonias. Este método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo células vivas); en contraste con el conteo microscópico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias, ya que se necesitan como mínimo 24 horas o más. Por otra parte, no es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en grupos. Conteo por filtración Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del filtro. Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son distintivas cuando ocupan un medio diferencial. Este método es aplicado frecuentemente en la detección y enumeración de bacterias coliformes, las cuales son indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua. Método del número más probable (NMP) Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de células. Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el caso de las bacterias nitrificantes quimioautótrofas. También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la única afirmación en la cual existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más probable.

Determinación directa por microscopio Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed, colocando en la preparación un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias. Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos microscópicos seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro objetivo, se puede calcular fácilmente el área, entonces el número de campos en 1 cm2 se multiplicará por el promedio del número de células por campo y después por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será igual al número de células por mililitro. Este método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote. Método de turbidez Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las células. El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro). En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la primera señal de turbidez sea visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.

Determinación del peso seco en las células Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material extraño, drenado en un secador y después es pesado. MORFOLOGIA COLONIAL BACTERIANA Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células. El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico. El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo. La morfología de la colonia de una bacteria puede variar según el medio en que crezca la bacteria. Aquí podemos ver la variedad en cuanto a caracterizacion. • Forma – Puntiforme – Circular y ovalada – Filamentosa – Irregular – Rizoide – Fusiforme • Elevación – Plana – Convexa – Planoconvexa – Acuminada – Umbilicada – Papilada • Márgen – Redondeado – Espiculado

– Ondulado – Lobulado – Filamentoso – Rizado MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Materiales y sustancias Tubos de ensayo

El

tubo

de

ensayo

es

un

instrumento de laboratorio que se utiliza

principalmente

como

contenedor de líquidos y sólidos a las cuales se les va a someter a reacciones

químicas

u

otras

pruebas Asa de siembra

Se

emplea

arrastrar,

para trasvasar

transportar, inóculos

(pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión) desde la solución de trabajo también llamada “solución madre”

al medio de cultivo (sólido o líquido) o de un medio a otro (resiembra). También sirve para la realización de frotis. Tijera

Una

tijera,

frecuentemente

denominada en

su

plural

tijeras, es una herramienta manual que sirve para cortar tela, papel, cabello, etc. Está formada por dos cuchillas de acero que giran alrededor de un tornillo axial común, respecto al cual se sitúan los filos de corte a un lado y las agarraderas en el lado contrario. Las

agarraderas

conllevan

agujeros para sujetar y maniobrar con el pulgar y el cordial. Hisopos

Un hisopo, bastoncillo, cotonito, cotonete, varita o varilla de papel es un instrumento utilizado para recoger

muestras,

para

su

posterior estudio, normalmente en medicina se usa para saber que germen afecta a una infección, también se usa en cosméticos y en la limpieza del conducto auditivo. Tiene

forma

de

bastoncillo

acabado en una punta de algodón.

Pipetas

La

pipeta

es

un

instrumento

volumétrico de laboratorio que permite medir la alícuota de un líquido

con

mucha

precisión.

Suelen ser de vidrio o plástico. Está

formada

por

un

tubo

transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) con la que se indican distintos volúmenes. Caldo BHI

El caldo BHI medio de cultivo líquido

ha

sido

preparado

principalmente para el cultivo de microorganismos

de

difícil

crecimiento y microorganismos de crecimiento rápido entre los que se incluyen bacterias aerobias y/o microaero los presentes en una amplia

variedad

de

muestras

clínicas. Mechero Bunsen

Un mechero o quemador Bunsen es un instrumento utilizado en los laboratorios

científicos

para

calentar, esterilizar o proceder a la combustión

de

reactivos químicos.

muestras

o

Procedimiento 

Conteo en placa - Elegir las dos placas, correspondientes a una dilución, que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada placa utilizando el contador de colonias y el dispositivo de registro automático. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución (la inversa de la dilución cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el valor obtenido como el recuento estándar en placa. - Si una de las placas de la dilución elegida presenta algo menos de 30 colonias o algo más de 300, deben de contarse también todas las colonias de ambas y como en el caso anterior, hallar la media aritmética y multiplicarla por el factor de dilución. El valor obtenido se dará como el recuento estándar en placa. - Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, deben hallarse los recuentos estándar en placa de cada dilución tal como se ha señalado anteriormente y se dará como resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser que uno de ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso se dará como recuento estándar en placa el valor más bajo. - Si todas las placas presentan más de 300 colonias, dividir las dos placas, correspondientes a la dilución más elevada, en secciones radiales (2,4 u 8) y contar todas las colonias obtenidas en cada caso por el factor adecuado, con el fin de conseguir una estimación del número total de colonias presentes en la placa. Hallar la media del valor estimado por las dos placas y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. El valor obtenido se da como el recuento estándar en placa estimado. - Si en las placas inoculadas con la dilución menos concentrada se encuentran más de 200 colonias en una sección correspondiente a la octava parte de la placa, multiplicar 1.600 (procedente de 200 x 8) por el factor de dilución y expresar el recuento estándar en placa estimado como superior (>) al valor obtenido. En estos casos resulta aconsejable sena ̃ lar entre paréntesis la dilución utilizada.

- Cuando no se encuentran colonias en las placas correspondientes a la dilución más concentrada, expresar el recuento estándar en placa estimado como inferior a (