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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

NFORME N° 2 TEMA: CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS

GRUPO: C-2

PROFESOR: Ing. AUGUSTO CASTILLO CALDERON

ALUMNOS:  OSORIO DURAN ALEXANDER  PARIA CABALLERO MILAGROS  QUILICHE VERAMENDEZ WILDER  QUISPE CIUDAD JUNIOR  TERRONES ROSALES RUTH

Nvo. Chimbote-Perú 2017

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N° 02 TÍTULO: CULTIVO CELULAR POR LOTES ALIMENTADO (CLA) CON AIREACION Y ALIMENTACION CONSTANTE UTILIZANDO UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 RESUMEN El presente trabajo está referido al desarrollo del inóculo y cultivo celular por lote alimentado con aireación y alimentación constante de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, desarrollado por alumnos en el laboratorio de Bioprocesos. Para este trabajo se contó con cepas de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, la cual fue tomada de un medio en el cual se encontraba inactivada. Se procedió a preparar un determinado medio de mantención, activación y fermentación. Seguido fue la activación y acondicionamiento de la cepa Saccharomyces cerevisiae. La

experiencia

consistió

en

obtener

la

cinética

de

crecimiento

de

Saccharomyces cerevisiae. Este proceso se realizó en un matraz en Shaker, por 11 horas. Evaluando parámetros como consumo de sustrato (sacarosa), densidad óptica. Se observó cómo se va produciendo el crecimiento celular del Saccharomyces con los nutrientes de los medios y como va disminuyendo el sustrato, la Sacarosa (principal fuente de carbono). Y esto fue posible determinarlo mediante las lecturas de absorbancia (640 nm) en el espectrofotómetro y con las prueba de determinación de azúcares reductores – DNS, absorbancia de 540 nm. El monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran importancia, en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas aplicaciones, ayudando así a obtener productos con la calidad o características deseadas u optimizar procesos.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL I.

INTRODUCCIÓN: Las levaduras son importantes para la ciencia desde hace 200 años (recordemos por ejemplo, a Louis Pasteur, considerado padre de la enología moderna,

y

que

realizó

grandes

descubrimientos

acerca

de

las

fermentaciones). La importancia tecnológica de estos microorganismos es evidente: llevan a cabo reacciones de importancia crucial para la elaboración de productos como el vino o la cerveza. Sin embargo, con el desarrollo de la genética, la biología molecular y el estudio de los genomas, las levaduras se han convertido en herramientas de experimentación en laboratorio. Ejemplo de ello es que la levadura Saccharomyces cerevisiae que se utiliza para la elaboración del pan, la cerveza y el vino ha sido el primer organismo eucariota completamente secuenciado, en un proyecto llevado a cabo por un programa internacional. Las industrias que utilizan esta levadura para la alimentación o para la producción de medicamentos o de vacunas estaban interesadas en obtener los resultados de esta secuencia para intentar mejorar sus procedimientos de producción. Al hablar de Saccharomyces, es inevitable pensar en la gran utilidad práctica de la levadura en la vida del hombre, desde tiempos antiguos. Fue tal vez un descubrimiento

casual

de

nuestros

predecesores

y

que

actualmente

agradecemos profundamente. La realidad de la alimentación que conocemos actualmente, fermentada, es una realidad histórica, basada en el tipo de agricultura que implementaron nuestros antepasados mesopotámicos. Pero en muchas partes del mundo los seres humanos controlan fermentaciones de productos sólidos o líquidos, y las especies de levaduras implicadas no son siempre las mismas. Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular, sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005).

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Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010). En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptación en el que no hay incremento en el número de células, sino que se adaptan al medio y en ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales; 2) exponencial o log, donde las células se reproducen sin limitación de de sustancias nutritivas a velocidad máxima y toman sustratos, excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la etapa donde el crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las células mueren, debido a que su reserva de energía se ha agotado (Sánchez, 2003). Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005). En esta práctica se monitoreó el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae en un medio determinado. La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos

y

para

el

mantenimiento

celular.

No

obstante

que

los

microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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II.

OBJETIVOS:

2.1

OBJETIVOS GENERALES: 1. Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Diseño del medio de cultivo. 2. Activación celular y desarrollo del inóculo. 3. Identificar y describir las partes, accesorios y geometría, conocimiento de la operación del fermentador, esterilización, carga, descarga y toma de muestras. 4. Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automatico, asi como la calibración de los sensores. 5. Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar µmax y Yx/s 6. Obtener los perfiles de masa celular, fuente de C y O2 disuelto a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor. 7. Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado. 8. Determinar Yx/s y Qx del CLA.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL III.

MARCO TEORICO

CRECIMIENTO MICROBIAL Para la obtención de datos confiables, la evaluación del crecimiento microbial requiere la normalización de métodos experimentales. En un cultivo por lotes, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa, se inocula el medio con una cantidad determinada de células viables con lo que el cultivo se desarrolla sin intercambio de materiales con los alrededores, excepto por la transferencia de gases tales como aire, dióxido de carbono e hidrógeno. El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas en un sustrato simple y homogéneo (cSi), libre de gradientes de concentración y de sustancias inhibitorias, donde las células se reproducen a intervalos regulares, puede representarse mediante una curva típica, en la cual se observan las diferentes etapas representativas de los cambios de la biomasa (X) y de su ambiente. Curva de crecimiento microbial

El período de latencia (lag) (A), es el período de adaptación de la célula a los

cambios de su ambiente fisicoquímico. Puede ser el tiempo requerido para desactivar un inhibidor presente en el medio, o el tiempo de germinación de un inóculo de esporas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL En el período de crecimiento acelerado (B), la velocidad aumenta desde cero

hasta un valor máximo. En el período de crecimiento exponencial (C), las células se reproducen, en un

medio sin limitación de sustancias nutritivas, a la máxima velocidad compatible con el conjunto de condiciones existentes. En el período de desaceleración (D), la velocidad disminuye al limitarse la disponibilidad de sustancias nutritivas. El período estacionario (E) se produce cuando se agota una sustancia nutritiva. El período de muerte o decaimiento (F) ocurre en aquellos cultivos, en

condiciones de inanición, por la formación de enzimas autolíticas. En algunos cultivos puede apreciarse un período de crecimiento críptico, producido por las sustancias nutritivas liberadas por el citoplasma de las células lisadas.

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su actividad vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y produce otras sustancias, algunas de interés económico. Uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de los métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y la variación de su concentración con el tiempo. La concentración de células en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. Por esta razón las velocidades crecimiento, consumo de sustrato y de formación de producto, generalmente se expresan como velocidades específicas referidas a la concentración de células activas.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Velocidad específica de crecimiento

Velocidad específica de consumo de sustrato

Velocidad específica de formación de producto

INFLUENCIA DE ALGUNAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO Temperatura La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares, la naturaleza del metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos y la composición de la biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 30ºC, aunque existen microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0ºC y otros a temperaturas superiores a 93ºC. El requisito fundamental es la presencia de agua líquida. En la Antártida existen bacterias que se reproducen a 7ºC, pero que se desarrollan a mayor rapidez a temperaturas entre 20 y 30ºC, (Pelczar, 1977). En la siguiente tabla se presenta una clasificación de los microorganismos en función de la dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Temperatura (ºC) Grupo

Mínimo

Óptimo

Máximo

Termófilos

40 – 45

55 – 75

60 – 80

Mesófilos

10 – 15

30 – 45

35 – 47

Psicrófilos

-5 – 5

15 – 18

19 – 22

-5 – 5

25 – 30

30 – 35

obligados Psicrófilos facultativos

Energía de activación En el intervalo adecuado de temperatura, se estimula inicialmente el crecimiento de los microorganismos. Cuando es demasiado alta, los destruye. La ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento:

Donde, m

EF

es la velocidad efectiva de crecimiento que es igual a la velocidad

de síntesis menos la velocidad de muerte; A, AD son los factores de frecuencia; EA es la energía de activación para el crecimiento, y es la energía necesaria para llevar las moléculas a un estado energético en el cual puedan reaccionar; ED es la energía de activación para la muerte térmica; R es la constante de los gases, y T la temperatura absoluta. La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proceso microbiológico es un procedimiento cinético formal. Sin embargo, la complejidad del crecimiento microbial, entendido como una secuencia de reacciones, permite prever desviaciones de este comportamiento.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL pH En muchos procesos de fermentación aerobia y anaerobia, el pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H + durante la demanda de NH4+; se consume H+, en el metabolismo de NO3- y en la utilización de aminoácidos como fuente de carbono. Estos cambios muestran la necesidad de determinar y controlar el pH de un cultivo, usualmente mediante la adición de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y una de las bases: hidróxido de sodio, de potasio o de amonio; al medio. Se prefiere el amoníaco gaseoso en lugar del hidróxido de amonio, por la posibilidad de contaminación de éste con esporas bacterianas. La concentración del ion hidrógeno puede afectar en gran medida el crecimiento celular y, si el pH no está regulado, se debe considerar como un factor inhibitorio

MEDIOS DE FERMENTACION La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Como ya se explicó, los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes: a. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL c. Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los componentes, en 1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos. 2. Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable. En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos.

Diseño El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Requerimientos nutricionales Los

requerimientos

metabolismo

celular,

nutricionales ya

sea

están

determinados

autotrófico,

que

por

el

corresponde

tipo

de

a

los

microorganismos que obtienen el carbono del C0 2 como las algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial está determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 0 2 es uno de los oxidantes más comunes en el metabolísmo energético. En la ausencia del 0 2, el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energía. Otras protistas obtienen su energía, en condiciones anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía. Otro requerimiento nutricional está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su incorporación a la pared de las células. En algunos casos se requieren también póptidos de histidina. Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes. Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como esencial para la estabilidad de los ribosomas y

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías: 1) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y 2) Los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo. Los

requerimientos

de

factores

de

crecimiento

comprenden

ciertos

aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, cte. En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso considerado. Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industria de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo de los medios.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno. Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería, alpechín y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos. Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el amoníaco o las sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser: 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma. 3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas. Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas. Formulación La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composición elemental y típica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 13; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.4-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. La composición de un medio mínimo basado en este principio, que además tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energía. Por el conocimiento de la estequiometria de crecimiento y de formación del producto, es posible formular adecuadamente un medio. Aunque este tema se tratará en el capítulo 5 es conveniente adelantar aquí algunos aspectos necesarios. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentación: Fuente de C + Fuente de N + 02 + Minerales + nutrientes específicos ---> biomasa + productos + C02 + H20.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Conservación de la calidad nutriente Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en suspensión, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización. Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60 min se producen pérdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura, duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación. Un ejemplo típico de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de proteínas, aminoácidos, etc. Se forman así productos de condensación con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico. Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos. Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se volatiliza. En medios químicamente definidos se puede observar pérdida importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales poco solubles como MgNH4PO4, MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos. Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de sufrir descomposición. En todos estos casos es aconsejable disolverlas

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL separadamente en pequeños volúmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtración. Como ya dijimos es fundamental, además de esterilizar correctamente los medios, conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una reacción cinética de primer orden, también la destrucción de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma.

LEVADURAS Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Las levaduras tienen importancia económica, social y de salud en la culturahumana. A menudo, las levaduras han sido referidas como los primeros organismos “domesticados”, debido a que la fermentación para la producción de vinos representa, probablemente, la primera biotecnología Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de fermentación, propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la producción de pan y de bebidas alcohólicas, y que a su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que ensalzan al Dios del vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Desde el punto de vista científico, el estudio de las levaduras como modelo biológico ha contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular. Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el microorganismo eucariote más estudiado. Este organismo se conoce también como la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el término levadura proviene del latín levare, que significa levantar.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL SACCHAROMYCES CEREVISIAE Saccharomyces

cerevisiae

es

una

levadura, un hongo unicelular, del grupo de los ascomicetos. Este grupo incluye a más de 60000 especies, entre ellas las trufas, las colmenillas o el Penicillium, el hongo que produce la penicilina, pero también a hongos patogénicos tanto de plantas como de animales, el más conocido de los cuales es Candida. En la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas plantas. El término "levadura" (de "levare" en la acepción de subir o levantar) remite a la experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando se añade levadura a la harina. Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular, sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005). Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005). La fisiología de las levaduras es definida como el entendimiento de su crecimiento y metabolismo. En términos generales explica cómo las levaduras interactúan con su medio biótico y abiótico, específicamente explica cómo las levaduras se alimentan, metabolizan, crecen, se reproducen y finalmente mueren. La biotecnología de levaduras se define como el uso de la fisiología de levaduras (Walker, 1998). A continuación se hará una revisión sobre los aspectos más importantes sobre la nutrición y metabolismo de las levaduras.

NUTRICIÓN DE LEVADURAS El término nutrición de levaduras se refiere a cómo las levaduras se alimentan; de forma específica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la adquisición de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos nutricionales y las estrategias de adquisición de nutrientes, junto con la regulación del transporte de nutrientes es importante no sólo para el cultivo de las levaduras en el laboratorio, sino también para la optimización del proceso de fermentación industrial.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los compuestos orgánicos e inorgánicos en un medio de cultivo desempeñan funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento, su efecto dependerá de su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. Cada levadura presenta requerimientos nutricionales diferentes, sin embargo, es posible generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, oligoelementos y factores de crecimiento.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CARBONO Las levaduras son organismos quimioorganotróficos porque obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos. Estos compuestos son generalmente azúcares, de los cuales la glucosa es la más empleada en levaduras; sin embargo, no es el azúcar más efectivamente metabolizable para todas ellas, debido a que no se encuentra libre de forma natural en sus hábitats. Además, la glucosa generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represión en la asimilación de otros azúcares. Las levaduras pueden asimilar azúcares (hexosas, pentosas, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos, polisacáridos), alcoholes, ácidos orgánicos, ácidos grasos, hidrocarburos y compuestos aromáticos. Una pequeña proporción (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser incorporados del dióxido de carbono. GLUCOSA La glucosa es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos–OH y O=. Es una hexosa, es decir que contiene seis átomos de carbono y es una aldosa, esto es el grupo carbonilo está en el extremo de las moléculas, es una forma de azúcar que se encuentra libres en las frutas y en la miel. SACAROSA La sacarosa tiene la fórmula C12H22O11 que pertenece a un grupo de hidratos de carbono llamados disacáridos. Es el azúcar normal de mesa, extraída de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar, es soluble en agua y ligeramente soluble en alcohol y éter. SULFATO DE AMONIO El sulfato de amonio y sulfato diamónico son las sales más utilizadas como fuente de nitrógeno, ya que aportan, al mismo tiempo, azufre y fósforo que la célula necesita. El ión amonio es empleado por las levaduras para la formación del ácido glutámico, que actúa como donador de un grupo amino para la síntesis de otros aminoácidos para la célula (Aguilar, 1998). La asimilación y LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL utilización de nitrógeno amoniacal y nitrógeno amino pueden variar según la levadura utilizada, ya que puede ser afectada por numerosos factores como la aireación y la concentración de glucosa, entre otras. Por otro lado, el ion sulfato aporta el azufre necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras. FOSFATO DE AMONIO El fosforo es esencial para las células de levaduras para su incorporación en moléculas estructurales, los ácidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados. Levaduras también pueden almacenar fosforo en la vacuola, en forma de fosforo ortofofato polimérico común mente disponible para la levadura en forma de ortofosfato inorgánico. Que metabolizan muy rápidamente para el transporte de nucleótidos trifosfato, en la levadura se produce contra un transporte de concentracion en contra de un gradiente de concentración y por lo tanto se activa. También depende de la presencia en la de un sustrato fermentable exógeno como la glucosa, pero sustratos respirables como acetato o etanol que no son compatibles con la absorción de fosfato. En s. Cerevisiae, al menos tres sistemas se cree que translocan ortofosfato. En s. cerevisiae es concebible que los bajos ylos sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente dependiendo sobre la disponibilidad de fosfato, de hecho la absorción de fosfato pueden ser controlados por la concentración de ortofosfato intracelular.

ADQUISICIÓN DE NUTRIENTES Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones, no solo es importante que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios, sino que la levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde un equilibrio con el mismo. El transporte de azúcares en levaduras ha sido estudiado por muchos años, debido a la importancia biotecnológica de esto en fermentaciones industriales. Así, se conoce que la velocidad de formación de etanol está limitada por la velocidad de transferencia de azúcares al interior de la célula (Walker, 1998).

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 20

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las levaduras, generalmente, transportan preferentemente la glucosa; sin embargo, las membranas celulares no son permeables a azúcares, por lo que existen varios mecanismos para la translocación de la glucosa y otros sacáridos; por ejemplo: en S. cerevisiae se conocen 20 transportadores de hexosas que difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas (Kruckeberg, 1996). Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades con respecto al transporte de azucares: a. La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones. b. Los transportadores de glucosa son estéreo específicos para ciertas hexosas, y pueden transportar glucosa, fructosa y manosa. c. El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo. d. Los transportadores de glucosa facilitan la difusión libre. e. Durante el transporte no hay consumo de energía. f. La fosforilación acompaña a la glucosa al entrar a la célula.

TRANSPORTE DE NITRÓGENO Las levaduras no pueden fijar el nitrógeno atmosférico, pero son capaces de trasportar y utilizar compuesto de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno generalmente tienen una función anabólica de proteínas estructurales y enzimas funcionales. Algunas fuentes de nitrógeno pueden ser catabolizadas inmediatamente a la entrada de la célula. Las fuentes favorables de nitrógeno para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio, glutamato y glutamina. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una fuente de nitrógeno y sales de amonio.

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Página 21

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL IV.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

Empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

ESQUEMA Donde F(t): caudal de alimentación Sr(t): concentración de sustrato de la alimentación Vf: volumen final de trabajo Vo: volumen al inicio de la alimentación Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que V o, Xo y So son las condiciones finales de dicho batch. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F (t)), o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr (t)). En el caso del

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Página 22

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte. y Sr=cte.

F(t) SR(t)

Vf, Xf VR = Vf - V0 V0, X0, S0

BOMBA

RESERVORIO

BIORREACTOR

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

S0' µ < µmax

X.V = X0.V0 + F.SR.YX/S.t

X.V

X0.V0

µ = µmax

X0'.V0'

S0 = 0 BATCH

t = t0

BATCH ALIMENTADO

t

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.

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Página 23

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 4.1

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Para diseñar el medio de cultivo se realizará de acuerdo a los alcances que nos proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su mantención, activación y para la fermentación del cultivo por lote alimentado.

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los

requerimientos

nutricionales

del

microorganismo

y

algunos

específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas.

Para el diseño se debe considerar:  Usar Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11).  Duración aproximada de 4 a 6 horas de la etapa de CLA.  Usar el bioreactor automatizado Biostat – A Plus recipiente de 2 litros.  Control de pH usando electrodo y unidad de control.  La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

4.1.1

MEDIO SOLIDO DE MANTENCION (YM solido)

Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

Nutriente

Concentración (g/l)

Extracto de

Peso (g) Para 50 mL

3

0.15

Peptona

5

0.25

Extracto de Malta

3

0.15

Agar

20

1.00

Glucosa

10

0.50

Levadura

Procedimiento: Preparar el medio de mantención, según la tabla Nº1 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. 

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analítica.



Medir 50 ml de agua destilada, en una probeta graduada.



Mezclar todos los compuestos ya pesados en un matraz Erlenmeyer, y después agregar los 50 ml de agua destilada.



Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla 2 minutos.

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Página 25

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 

Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6-7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos, esperar 1 hora.



Colocar los tubos en un vaso de precipitado previa cobertura con cartón, y llevarlos a la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.



Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar 20 minutos, finalizando la esterilización.



Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

4.1.2 MEDIO DE ACTIVACION

Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (15 mL) Nutriente

Concentración (g/l)

Peso (g)

Sacarosa

5

0.075

Extracto de levadura

3

0.045

Extracto de malta

5

0.075

Solución de sales

5 ml/L

0.075 ml

75ul

Procedimiento: Preparar el medio de activación, según los la tabla Nº2 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.  Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2  Prepara 15 ml de medio de activación en un matraz de 50ml (separando fuente de carbono, extracto de levadura y malta, y sales). 

Se esterilizan por separado el extracto de levadura y malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada), la sacarosa en un matraz de 50 ml; esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml. De agua destilada), por un tiempo de 15 min, contando desde la primera burbuja. 

Luego de enfriar, mezclar todo en el matraz en torno al mechero con todas las indicaciones de asepsia, y después llevar al Shaker por un tiempo de 10h; 35°C y 200rpm.

4.1.2

MEDIO DE FERMENTACION 

Para un volumen de medio: 30% del volumen del matraz.



Para una concentración final: g/l.

TABLA 03, 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación TABLA 03 Peso (g)

Nutriente

Concentración (g/l)

Sacarosa

4.26

0.426

1.8

0.18

(NH4)2 SO4

1.67

0.167

KH2 PO4

0.35

0.035

Mg SO4 7H2O

0.16

0.016

Solución de sales

5ml/L

0.50

100 ml/L

10 ml

Extracto de Levadura

Tampón Citrato pH 4,2

Para 100 mL

TABLA 04 LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 27

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Nutriente

Fuente

%

S(g/l)

Elemento Nutriente C

42.11%

3.85g/l

(NH4)2SO4

N

21.21%

0.76

(NH4)2SO4

S

24.24%

0.0165

KH2PO4

P

22.79%

0.09

KH2PO4

K

28.68%

0.157

MgSO4.7H2O

Mg

19.86%

0.073

C12H22O11



Limitante: Fuente Nitrógeno.

Procedimiento: Preparar el medio de fermentación, según la tabla Nº4 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.  Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 4  Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera: 

Sacarosa en un matraz con agua destilada + 15ml de medio de activación.



(NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + solución de sales en un tubo con 10 ml. de agua destilada.



Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada



Esterilizar las diluciones por separado durante 15min. contando desde la primera burbuja.



Terminada la esterilización dejar enfriar.

FERMENTACIÓN DEL CULTIVO

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Página 28

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo medio de fermentación, para la adaptación del crecimiento

Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluaciones del crecimiento de biomasa, tomar una muestra inicial, al que se le mide la absorbancia y se centrífuga, guardando el sobrenadanante en viales y la masa sedimentada en capachos que serán expuestos a la estufa.

Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de alimentación de tal manera que en tiempos determinados, se provoque en el comportamiento del crecimiento.

Luego se llevará a cabo la alimentación; luego, una segunda fermentación que se realizará en el fermentador de 2000 ml.

A. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (1L) 

Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales concentradas para sepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.lo cual se muestra en la guía de Práctica de Bioprocesos:

Tabla 05 Composición de la solución de sales 100 veces concentrado, utilizadas en los medios de cultivo en g/l

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Página 29

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Nutriente

Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O

1.12

ZnSO4.7H2O

0.11

FeSO4.7H2O

0.06

CuSO4.5H2O

0.05

CoCl2.6H2O

0.01

MoO3

0.0005

MnCl2.6H2O

0.027

NaCl

0.28



Cada compuesto se pesara con cuidado.



Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio, la solución se colocara en una fiola de 1 litro y se enrazara con agua destilada hasta completar 1litro.



Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su posterior utilización.

B. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS 

Las pipetas, serán lavados y secados en la estufa



Luego en cada pipeta se colocara un filtro de algodón para no contaminarlo al momento de ser utilizada.



Las pipetas serán forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.

C. TÉCNICA DE ASEPSIA Se usara en los días en que hay sembrado e inoculación de células.

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 30

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 

Para realizar la inoculación es necesario y muy importante tener el lugar bien desinfectado, por lo que se limpiara con paños de algodón toda la zona de trabajo hasta 3 veces, así como también el total acomodo de las herramientas de trabajo (tubos de ensayo y gradilla) a utilizar, etc.



Los tubos de ensayo y los matraces que serán utilizados en el medio rico primero serán lavados, secados y esterilizados en la estufa por un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.

D. INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN Para la inoculación partimos de la cepa incubada en medio sólido de mantención (Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.) 

Tomar una azada e inocular en un matraz con 20 ml del medio de activación, con la ayuda del mechero.



Tapar el matraz que contiene el medio de activación con un tapón de gasa y algodón.



Llevar al Shaker a 200 rpm, Tº = 35ºC y un t=10 horas hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

E. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 

10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/l de NaOH 2N



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

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Página 31

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: 1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 2. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. 3. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. 4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. 6. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

F. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm. Durante 20 minutos. 2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación. 4. Se elimina el sobrenadante, se redisuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80 ºC hasta peso constante.

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CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: Día: Microorganismos: Nº

HORA

01

TIEMPO

Fuente Carbono: Abs.(640 nm)

Nombre del alumno y grupo

Observaciones

0

02 03 04 05 06 CLA

HORA

TIEMPO

Abs.(640 nm)

Nombre del alumno y grupo

01 02 03 04 05 06 07

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 33

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

V.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

Material Biológico: Cepa liofilizada de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 5.1

PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN: 5.1.1 Materiales y Equipos:  Balanza analítica  Matraz Erlenmeyer de 250 ml.  Mechero Bunsen  Gradilla  6 Tubos de ensayo con tapas.  Pipeta de 10 ml.  Vaso de precipitado.  Cocina a gas  Olla a presión.  Varilla de vidrio  Guantes.  Espátula

3.1.2 Reactivos y nutrientes:  Agua destilada.  Extracto de levadura.  Peptona.  Extracto de malta.  Agar.  Glucosa.

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Página 34

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

5.2

PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN:

5.2.1 Materiales y Equipos: 

Balanza analítica



2 Matraz de 125 ml.



Una probeta de 100ml



Micropipeta



Estufa



Algodón



Gasa



Varilla de vidrio



Espátula

5.2.2

Reactivos y nutrientes:



Sacarosa



Extracto de levadura



Extracto de malta



Solución de sales



Agua destilada



Alcohol

5.3

PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN: 5.3.1 Materiales y Equipos: 

Matraz de 1 L



2 Matraces de 125 ml.



Varilla de vidrio



Balanza analítica



Gasa y algodón



Papel aluminio – capachitos.



pHmetro.

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Página 35

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

5.3.2 Reactivos y nutrientes: 

Sacarosa



(NH4)2SO4



Solución de sales



KH2PO4



MgSO4.7H2O



Extracto de Levadura



Agua destilada



Alcohol

5.4

INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN: 5.4.1 Materiales y equipos 

Matraz de 125 ml.



Algodón



Gasa



Agua destilada



Aza bacteriológica



Shaker



Mechero Bunsen, trípode y rejilla

5.5

RESIEMBRA CELULAR (Solido - sólido )

5.5.1

Materiales y equipos



Aza bacteriológica



Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

5.6

ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

5.6.1

Materiales y equipos



Matraz de 125 ml.



Algodón

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Página 36

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 

Gasa



Agua destilada



Aza bacteriológica



Shaker



Mechero Bunsen, trípode y rejilla

5.7

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA

5.7.1

Materiales y equipos



Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación



Espectrofotómetro



pHmetro



Gasa y algodón



Centrifuga



Tubos de ensayo



Capachos de papel aluminio

5.8

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR DENSIDAD ÓPTICA:

5.8.1

Materiales y equipos



Espectrofotómetro.



Centrífuga.



Estufa.

5.8.2

Reactivos



Muestra del medio.



Agua destilada.

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Página 37

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

5.9

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) 5.9.1 Materiales y equipos 

Espectrofotómetro.



Agitador magnético.



Mechero bunsen.



Balanza analítica



Espátula.



Papel aluminio – capachitos.



2 Vasos de precipitado de 1 litro



Matraz de aforo de 1 litro.



Pipeta.



Gradilla

5.9.2 Reactivos

5.10



10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)



200 mL / L de NaOH 2N



300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado



Sacarosa Estándar

INSTRUMENTOS

Balanza analítica La balanza analítica es una clase de balanza utilizada principalmente para medir pequeñas masas. Este tipo de balanza es uno de los instrumentos de medida más usados en laboratorio y de la cual dependen básicamente todos los resultados analíticos. Las balanzas analíticas modernas, que pueden ofrecer valores de precisión de lectura de 0,1 µg a 0,1 mg, están bastante desarrolladas de manera que no es necesaria la utilización de cuartos especiales para la medida del peso. Aun así, el simple empleo de circuitos electrónicos no elimina las interacciones del sistema con el ambiente. De estos, LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL los efectos físicos son los más importantes porque no pueden ser suprimidos. Shaker Tiene como función agitar los recipientes, en este caso, matraces de distintos volúmenes con sus respectivos tampones para evitar el despilfarro de soluciones, pudiendo modificar el número de las revoluciones y la temperatura. También pueden tener movimientos de balanceo o vibraciones. Se emplean para mover cultivos celulares. A veces tienen un control termostático adicional. El movimiento puede ser orbital o de balanceo. Mechero Bunsen Es un instrumento utilizado en los laboratorios científicos para calentar o esterilizar muestras o reactivos químicos. El quemador tiene una base pesada en la que se introduce el suministro de gas. De allí parte un tubo vertical por el que el gas fluye atravesando un pequeño agujero en el fondo de tubo. Algunas perforaciones en los laterales del tubo permiten la entrada de aire en el flujo de gas (gracias al efecto Venturi) proporcionando una mezcla inflamable a la salida de los gases en la parte superior del tubo donde se produce la combustión, muy eficaz para la química avanzada. pHmetro Es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en medir el

potencial

que

se

fina membrana de vidrio que

desarrolla separa

a

través

disoluciones con

de

una

diferente

concentración de protones. En consecuencia se conoce muy bien la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio durante el pH. Una celda para la medida de pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolución de la que queremos medir el pH. La varita de soporte del electrodo es de vidrio común y no es conductor, mientras que el bulbo sensible, que es el extremo LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 39

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL sensible del electrodo, está formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Espectrofotómetro Sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.1Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica, de absorción

molecular

(que

comúnmente

se

conoce

como

espectrofotómetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un espectrómetro de masa. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Incubadora Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos

celulares.

La

incubadora

mantiene

la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales como el contenido dedióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera interior. Autoclave Una autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento de la autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunas formas a celulares, tal como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 40

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Bioreactor Es

un

recipiente

o

sistema

que

mantiene

un

ambiente

biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra

organismos

o

sustancias

bioquímicamente

activas

derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos

generales,

un

birreactor

busca

mantener

ciertas

condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un birreactor puede ser de tres modos distintos: 

Lote (batch)



Lote alimentado (fed-batch)



Continuo o quimiostato

Unidad de control El diseño compacto de la unidad de control centraliza todos los componentes, tales como: 

Sistema electrónico de control y medida.



Bombas con cabezales expuestos.



Sistemas de control de temperatura oxígeno, espuma. Control automático de proceso de pH, pO2, velocidad de agitación, mezcla de gas, nivel de espuma y bomba de sustrato.

Todo en una sola carcasa, ayudando especialmente en el ahorro de espacio. Los sistemas pre configurados para las aplicaciones

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL microbianas o de cultivo celular facilitan la selección y permiten un inicio rápido y sin complicaciones en el laboratorio. El sistema incluye además un potente ordenador portátil para el control del biorreactor así como el software BioPAT® MFCS/DA para la adquisición y evaluación de los datos. El software de control puede adquirirse también por separado para poder utilizar los ordenadores ya disponibles.

Figura 1: Biorreactor con unidad de control compacta acoplado al tanque de agitación y ordenador para control de datos.

Simple y control automático de aireación El sistema de aireación de la BIOSTAT® A plus proporciona control de flujo continuo sobre el rango de cada gas utilizado. Sólo tiene que conectar el tubo de aireación, configurar de manera pulsada cuenta con una boya flotante en la que se regula el flujo de aire que ingresara al bioreactor este se mide en el centro de la circunferencia y va desde 0.42 a 4.2 . Para aplicaciones de cultivo celular, interfaces para cuatro gases (aire, O2, CO2 y N2) están disponibles para la OD y el control del pH. La

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL versión microbiana cuenta con dos líneas de gas (aire y O2) para el control del OD.

Figura 2: Colocación de los conductos

Figura 3: Sistema de control

de silicona esterilizables en la unidad de

manual de flujo de aire.

control 

Operación: El equipo “Fermentador automatizado Biostat – A Plus de 3 litros” es operado desde el software que es accionado desde la laptop, donde podemos fijar las condiciones como pH, temperatura, velocidad de agitación, reflujo de agua. Y para el caso específico de darle la aireación se tiene el compresor de aire de diafragma,

que es modulado por el centro de control en el

rotámetro donde controlamos el flujo de aire. 

Esterilización: Se esteriliza todo el fermentador menos los sensores, se coloca en el autoclave por 2 horas aproximadamente.



Carga y descarga: Para cargar primero se toman las condiciones de asepsia para evitar cualquier contaminación, luego se coloca un embudo, previamente ya esterilizado, sobre uno de los agujeros en la tapa del fermentador y se

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL inocula el medio de fermentación con el medio de activación vaciando en el fermentador. 

Toma de muestras: Las muestras son tomadas por succión, por el conducto para tomar muestras, un tubo hueco. Las muestras se van a tomar a un nivel entre los dos rotores. Con la jeringa se succiona 5ml de muestra y se vacía en el tubo de ensayo; luego se cierra el conducto a presión con las pequeñas prensas. Antes de tomar la muestra se debe sacar con la jeringa 3ml, que son los que se contienen en el conducto.

SENSORES: Sensor de temperatura: 

Función:

Es un sensor de temperatura que a 0 °C tiene 100 ohms y que al aumentar la temperatura aumenta su resistencia eléctrica. Este sensor PT100 es el corazón sensible a la temperatura de cualquier termómetro de resistencia. El incremento de la resistencia de la PT100 no es lineal pero si creciente y característico del platino de tal forma que mediante tablas es posible encontrar la temperatura exacta a la que corresponde. En un extremo está el elemento sensible (Sensor RTD) y en el otro está el terminal eléctrico de los cables protegido dentro de una caja redonda de aluminio (cabezal).

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Sensor de pH: 

Función:

Para realizar la medición de pH se usan básicamente los sensores electroquímicos translucen la actividad química del ión de hidrógeno en una señal eléctrica. Los componentes

básicos

de

un

sensor

electroquímico son un electrodo de trabajo (que detecta), un contra electrodo y generalmente también un electrodo de referencia. Estos se encuentran dentro de la carcasa del sensor y en contacto con un líquido electrolítico. 

Calibración:

La calibración del medidor de pH varía dependiendo del fabricante, pero básicamente el método es el siguiente. Primero, limpie el bulbo de vidrio del electrodo sumergiéndolo en agua destilada, muévalo para apartar los restos de la solución del sustrato, luego saque el electrodo y déjelo secarse. Siguiente, encienda el medidor en el modo de calibración. Debe de verter la solución de calibración 4,0 en un vaso y después sumerja el electrodo en ella. Una vez que se calibra en la solución de 4,0, el número 7,0 va a comenzar a parpadear. Enjuague el electrodo con agua destilada, déjelo secar y luego sumérjalo en la solución de calibración de 7,0. Una vez que para de parpadear, está calibrado y listo para utilizarse. Descarte las soluciones de calibración; no vuelva a vaciar la solución en el envase original. La calibración debe de realizarse el día que se va a usar el medidor.

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Sensor de Oxigeno: 

Función:

Los sensores de medición de oxígeno disuelto (OD) consisten básicamente de una camisa de acero inoxidable o de cristal que contiene dos electrodos y un electrolito adecuado. Para separar los electrodos y los electrolitos del caldo de fermentación, el sensor está cubierto por una membrana. El oxígeno difunde a través de la membrana y se reduce en el cátodo, que está polarizado negativamente con respecto al ánodo. Esto produce una corriente que puede ser traducida como concentración de oxígeno 

Calibración:

El método más simple para calibrar este sensor es en aire, ya que si el Agua está saturada en aire la presión parcial de O.D. en agua será la misma que este tiene en aire. De este modo se obtiene el 100%. El 0% se logra mediante una solución saturada en Bisulfito de Sodio. Aguardar en cada caso a que la medición se encuentre estabilizada previo a tomar las mediciones, esto puede tomar unos 10 minutos aproximadamente.

Sensor de Espuma:  Métodos mecánicos: Consisten de adaptaciones de disco rotatorios montados sobre el eje principal de agitación. Estos dispositivos aseguran una buena eliminación de espuma, con la desventaja de que consumen elevadas cantidades de energía, lo cual se refleja en un incremento en los costos de producción.

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 Métodos químicos Se realizan con la ayuda de agente antiespumantes los cuales pueden ser suministrados

de

metabolizados

por

forma los

automática.

Algunos

microorganismos,

por

antiespumantes lo

cual

pueden

son ser

considerados como una fuente de carbono adicional

VI.

PROCEDIMIENTO 6.1

Preparación Del Medio De Mantención

De acuerdo con la tabla N° 01, se pesaron las cantidades requeridas, haciendo uso de la balanza analítica.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se mezcló todos los compuestos ya pesados, en un matraz Erlenmeyer, y después se le agregó los 50 ml de agua destilada ya medidos.

Se calentó el matraz en el mechero Bunsen agitando constantemente con ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual controlamos 2 minutos.

Se preparó 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente se le adicionó entre 67ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, y se tapó inmediatamente. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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Luego se colocó los tubos en un vaso de precipitado y se puso dentro de la olla a presión, previamente se aflojaron las tapas, para permitir el intercambio de gases.

Se calentó hasta que la temperatura alcanzó los 121°C y a partir de ello se controló 20 min. Finalizando la esterilización. Se ajustó las tapas de los tubos y luego se les colocó en posición inclinada a temperatura ambiente.

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6.2

Resiembra Celular (Solido - sólido )

Para la resiembra se siguieron las técnicas de asepsia y se colocó bajo mechero para mantener un ambiente estéril. El asa bacteriológica se sometió a fuego hasta alcanzar el rojo vivo.

El procedimiento de resiembra se hizo en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar). La azada se realizó en el tubo desde adentro hacia fuera. Luego se llevó a la incubadora a 30 °C durante 48 h.

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6.3

Determinación de La Curva de Calibrado de DNS (Ácido Dinitrosalicílico)

Hidrólisis acida de la muestra Se tuvo una solución estándar de Sacarosa 2g/L, de la cual se prepararon 8 tubos de ensayo a diferentes concentraciones, indicados en la siguiente tabla: N° Tubo

ml. Solución

ml. Agua

Concentración

Stándar

destilada

g/l

1

2

0

2

2

1.75

0.25

1.75

3

1.5

0.l50

1.5

4

1.25

0.75

1.25

5

1

1

1

6

0.75

1.25

0.75

7

0.5

1.5

0.5

8

0

2

0

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

A los 8 tubos que contenían diferentes concentraciones de sacarosa, se les agregó a cada uno 0.5 ml de HCl concentrado y se agitó bien en el agitador de tubos.

Se colocó los 8 tubos de ensayo en un vaso precipitado y se llevó a baño María a 60 °C por 10 minutos. Seguido se colocó el vaso precipitado con los tubos en baño con hielo por 3 minutos. Luego se agregó 3.5 ml de NaOH 1.7M y se llevó nuevamente al agitador de tubos.

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Reactivo DNS

Se rotuló 8 tubos de ensayo con tapas y de las muestras de la Hidrólisis Acida, se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos.

Se adición 500 µl de DNS a cada tubo y luego se llevaron a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Luego con una pipeta, se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y se dejó reposar por 15 minutos.

Después de reposar los tubos, se agitó en el Maxi mix 8agitador de tubos). Luego se llevó al espectrofotómetro y a 540 nm se midió la absorbancia.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm – CURVA DE CALIBRADO DNS:

Se había encendido el equipo al inicio de la práctica. Luego se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada tubo, para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes. Así se obtuvo los datos para la curva de calibrado de DNS.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6.4

Preparación Del Medio De Activación para la curva de Calibrado de Biomasa.

Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio.

En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de sales y agregamos 5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja.

Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Después de las 10 horas se sacaron los matraces del Shaker, para tener el mismo medio de activación para los 3 subgrupos, se procedió a vaciar el contenido en un solo matraz. Luego se sacaron 4 muestras de 5 ml del matraz y se les midió absorbancia en el espectrofotómetro a 640 nm. De aquí se obtiene un promedio de absorbancia para el valor de 1:1 (sin dilución)

Luego se centrifugó los 4 tubos por 15 minutos, seguido se eliminó el sobrenadante y se quedó con el pellet (sólido); luego se agregó tampón citrato (aprox. 5ml).

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Se agitó y se volvió a centrifugar en el Vortex (centrifuga) por 20 minutos, luego se volvió a botar el sobrenadante, nuevamente se agregó solución tampón y se centrifugó, al final se quedó el pellets en los tubos. Luego se colocó los pellets en los capachos, que previamente habían sido rotulados y colocados en la estufa. Se colocó los capachos con pellets en la estufa, por 12 horas a 80 °C.

Después que se retiró los capachos de la estufa (día siguiente), se colocaron en el desecador por media hora. Luego se procedió a pesar cada capacho. Así se obtuvo el peso seco de cada capacho, el promedio de este sirvió para saber la concentración de biomasa en el medio de activación (g/ml).

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Con lo que quedó en el matraz de medio de activación se hizo diluciones según la tabla siguiente. A los cuales se les medió absorbancia en el espectrofotómetro a 640nm. CON LO CUAL SE OBTUVO LA CURVA DE CALIBRADO DE

Diluciones

Biomasa

Agua destilada

Absorbancia

(ml)

(ml)

640nm

01:03

01

0

0.970

01:04

01

01

0.790

01:05

01

02

0.712

01:06

01

04

0.607

01:07

01

06

0.530

01:8

01

09

0.453

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

6.5

Preparación Del Medio De Activación para la Cinética.

Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio.

En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de 9 sales y agregamos 5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja.

Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

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Página 62

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6.6

Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética.

De acuerdo con la tabla N° 03, se pesó las cantidades requeridas en la balanza analítica, sobre capachos de papel aluminio.

Se disolvió el compuesto con agua destilada de la siguiente manera:  Sacarosa en un matraz de 500ml con 76 ml de agua destilada.  (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + 10 ml tampón citrato + 1ml de solución de sales.  Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada. Dentro de los 76 ml de H2O destilada se consideró 2ml por las pérdidas en evaporación durante la esterilización.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Se esterilizó las diluciones en la olla a presión por 15min. (a partir de la primera burbuja).

Terminada la esterilización, se dejó enfriar y luego se envolvió con papel para ser guardado en la refrigeradora.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6.7

Determinación De La Cinética De Crecimiento De La Biomasa

Debido a que la preparación del Medio de Activación y las diluciones del medio de Fermentación se preparó la semana anterior, se retiraron del congelador. Seguido se colocó en la estufa el medio de activación (debió estar 1 hora pero solo se colocó por 40 minutos). Y se dejó que las diluciones del medio de fermentación se descongelen.

Cerca al mechero se preparó el medio de fermentación. Se vaciaron las mezclas de los tubos en el matraz (con su debido flameado). El medio de fermentación era un medio traslúcido. Se sacó los 3 matraces de medio de activación de la incubadora y se mezclaron frente al mechero. Seguido se agitó el medio de activación y se tomó de él 5ml los cuales se colocaron en el medio de fermentación.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Con una pipeta limpia y estéril se procedió a sacar 5 ml del medio de activación. Los 5 ml de muestra se agregaron en una celda del espectrofotómetro, y se realizó la lectura a 640 nm. Se colocó el matraz en el Shaker, para las próximas lecturas.

Todas las lecturas registradas a través de las horas de fermentación se anotaron en una hoja de registro para ir evaluando el crecimiento de las levaduras durante 11 horas.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Una vez realizada la lectura en el espectrofotómetro, la muestra de la celda se colocó en un tubo de ensayo, y este se centrifugó por 15 minutos.

Terminado la centrifugación, se retiró el tubo de ensayo, y se colocó el sobrenadante en un vial, el cual se tapó. Se tuvo cuidado de que las levaduras no se combinen con el sobrenadante.

El sobrenadante depositado en los viales se colocaron en un recipiente (taper), y este se colocó en la refrigeradora, para su posterior análisis de azucares reductores. – DNS. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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6.8

Determinación De Azúcares Reductores: Método Del Dns (Ácido Dinitrosalicílico)

Hidrólisis acida de la muestra

Se colocó las muestras de los viales en tubos de ensayo, 2 ml y se les agregó a cada uno 0.5 ml de HCl concentrado luego se agitó bien en el agitador de tubos.

Seguido de la agitación se llevó los 5 tubos de ensayo a Baño María a 60°C por 10 minutos.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Después se colocó en baño con hielo por 3 minutos, a continuación se le adicionó a cada tubo 3.5ml de NaOH 1.70M y se agitó en el agitador de tubos.

Reactivo DNS

De las muestras de la Hidrólisis Acida, se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos. Seguido se adicionó 500 µl de DNS a cada tubo.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Se llevó los tubos a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

Luego con una pipeta se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y luego dejar reposar durante 15 minutos.

Después de reposar los tubos, se agitó en el agitador de tubos - Maxi mix. Luego se procedió a leer a 540 nm en el espectrofotómetro.

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm:

Se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada tubo (5 tubos), para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes.

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VII.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES O TAREAS: DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Pichia stipitis NRRL Y-7124

DÍA 12/06/17

ACTIVIDAD 

Presentación del preinforme.



Preparación del medio de mantención.



Preparación del DNS.



Curva de calibrado para DNS.



Resiembra en medio de mantención.



Preparación del medio de activación.



Activación del microorganismo.



Curva de calibrado para peso seco de biomasa.



Esterilización de pipetas y preparación de viales.



Preparación del inoculo.



Seguimiento de cinética en cultivo por lote.



Seguimiento de cinética microbiana por CLA.

21/06/17



Análisis DNS

03/07/17



Presentación del informe final

13/06/17

14/06/17

16/06/17

20/06/17

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: C-2 Día de la experiencia: 21/06/17 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 Fuente Carbono: Sacarosa V∘=1L Nº

Vf=2L HORA

01

pH 4.2

T °C: 35°C

N rpm: 220 rpm

Tcla= 6h

TIEMPO (horas) 0

Absorbancia (640 nm)

Nombre del alumno Todos

TIEMPO (horas)

Absorbancia (640 nm)

Nombre del alumno

Observaciones

02 03 04 05 06 CLA

HORA

Observaciones

01 02 03 04 05 06 07

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

VIII.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Volumen de muestra 8 ml diluido 1:8, de un caldo de medio de activación de 20 mL de volumen fermentado en matraz de 125 mL

N° CAPACHO

PESO (g)

PESO+CELULAS

g CELULAS

X (g/L)

1

0.1907

0.1958

0.0051

0.6375

2

0.1817

0.1879

0.0062

0.775

3

0.2424

0.2487

0.0063

0.7875

X prom (g/L)

0.73333333

La concentración del caldo es: C=8*X promedio =5.866666667g/L [X]

ABS

0.73

0.962

0.65

0.854

0.47

0.613

0.36

0.475

0.15

0.2

0.12

0.157

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Página 74

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 1.2

1

y = 1.3178x + 3*10^(-16) R² = 1

ABS

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

[X]

Se obtuvieron los resultados finales de absorbancia de cada muestra:

N° MUESTRA

ABS

1

0.376

2

0.521

3

0.762

4

0.723

5

0.882

6

0.646

7

0.685

8

0.709

9

0.774

10

0.827

11

0.816

12

0.856

13

0.912

14

0.951

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Reemplazando en la curva de calibrado mis datos de las nuevas absorbancias para asi hallar la curva de t vs [X] t (horas: min)

[X]

0:00:00

0.285

1:00:00

0.395

2:00:00

0.578

3:00:00

1.097

3:30:00

1.339

4:30:00

1.961

5:00:00

2.079

5:30:00

2.152

6:30:00

2.349

7:00:00

2.51

7:30:00

2.477

8:00:00

2.598

9:00:00

2.768

9:30:00

2.887

3.5

CLA

CL 3

BIOMASA [X]

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00 10:48:00

TIEMPO (horas : minutos)

En la imagen se observa que el crecimiento por lote nos da un crecimiento inferior que un alimentado de biomasa, el crecimiento de biomasa en fase alimentada comienza en el punto de inicio de la fase estacionaria del cultivo por lote, este crecimiento que se figura en la gráfica es producto de que la biomasa como tiene más medio para vivir sigue reproduciéndose.

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Página 76

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL En el proceso de DNS obtuvimos las concentraciones de sustrato durante el periodo de lote y alimentación:

[X]

[S] 0.285 0.395 0.578 1.097 1.339 1.961 2.079 2.152 2.349 2.51 2.477 2.598 2.768 2.887

4 3.5

4.36 3.849 3.095 0.526 0.111 0.228 0.231 0.289 0.219 0.278 0.202 0.196 0.289 0.441

6

CLA

CL

5

3 4

2.5 2

3

1.5

2

1 1

0.5 0 0:00:00

1:12:00

2:24:00

3:36:00

4:48:00

6:00:00

7:12:00

8:24:00

9:36:00

0 10:48:00

Concentración de sacarosa (g/L)

Concentración de biomasa (g/L)

t (horas:min) 0:00:00 1:00:00 2:00:00 3:00:00 3:30:00 4:30:00 5:00:00 5:30:00 6:30:00 7:00:00 7:30:00 8:00:00 9:00:00 9:30:00

Tiempo (horas : minutos) [X]

[S]

En la gráfica se nota que el crecimiento de biomasa esta en relación a la disminución de sustrato, pero se recalca que en el medio alimentado la disminución de sustrato se hace casi constante pues la alimentación es pequeña y cada vez que se consume el sustrato lo compensa la alimentación.

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

IX.

CONCLUSIONES Se logró diseñar el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr crecimiento óptimo de Saccaharomyces cerevisiae ATCC 4126.

El medio adecuado para la mantención de un cultivo debe poseer una fuente de carbono, nitrógeno y sales en cantidades adecuadas para así satisfacer los requerimientos nutricionales del microbio y favorecer la reproducción celular y la producción de etanol.

La activación celular permitió el reinicio de las actividades metabólicas de la Saccaharomyces cerevisiae con el desarrollo del inóculo se alcanzó una cantidad inicial de………. g/L de biomasa para iniciar la fermentación.

En el desarrollo de la fermentación notamos que el consumo del nutriente es más acelerado que el crecimiento de la biomasa.

El diseño de los diferentes medios tanto activación como fermentación debe tener la adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono, vitaminas (extracto de levadura) y otros (las demás sales usadas) para que Saccharomyces cerevisiae pueda desarrollarse.

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Página 78

E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se determinó que para el medio de cultivo mínimo utilizado de la Saccharomyces cerevisiae los valores cinéticos experimentales de µmáx = ……. h-1 , un td= …… hr, YX/S = ……….g de Biomasa/g de Fructosa.

X.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:



Y. Li et al./ Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 312-317



A. Karapatsia et al./ Biomass and Bioenergy 90 (2016) 32-41

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Microbiologia, Pelczar J. M.; Reid D. R. y Chan E.C.S. 2da Edición, 1982. Editorial McGraw-Hill de México, S. A. De C. V.



Leveau,

J.

Y.

y

Bouix,

M.

(2000).

Microbiología

Industrial.

Los

Microorganismos de Interés Industrial. Editorial Acribia S. A. Zaragoza. 

QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica

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http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-deMedios-de-Cultivo

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http://biorreactores.tripod.com/C3CBCL.htm

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http://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&ve d=0CEUQFjAG&url=http%3A%2F%2Ffcqmicrodealimentos.wikispaces.com%2Ffile%2Fview%2FCientica%2Bde%2BS.c erevisiae.docx&ei=6HOPUKrEE5L69gTD9IDYCQ&usg=AFQjCNGJvUWxc23QunI lWBgir0IGA2YqGw&cad=rja

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ANEXO LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DISEÑO DEL MEDIO DE MANTENCIÓN (50 ML) Nutriente

Concentración (g/l)

Extracto de Levadura

3

Peptona

5

Extracto de Malta

3

Agar

20

Glucosa

10

Cálculos: 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.15𝑔 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.25𝑔 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.15𝑔

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 𝐴𝑔𝑎𝑟 ∶ 20𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 1𝑔 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ∶ 10𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.5𝑔

DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN (15 ML) Nutriente

Concentración (g/l) 5

Sacarosa

3

Extracto de levadura

5

Extracto de malta

5 ml/L

Solución de sales

𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.075𝑔

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.045𝑔 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.075𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝑙𝑖𝑞𝑢𝑖𝑑𝑜) ∶ 5𝑚𝑙 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.075𝑚

DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

Hallamos porcentaje de nutrientes:

𝐶12 𝐻22 𝑂11

PM = 342 gr/mol

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

HALLAMOS EL % NUTRIENTE %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

%𝐶 =

12𝑥12 𝑥100 342

%𝐶 = 42.11%

Nutriente

Fuente

% Elemento Nutriente

C12H22O11

C

42.11%

(NH4)2SO4

N

21.21%

(NH4)2SO4

S

24.24%

KH2PO4

P

22.79%

KH2PO4

K

28.68%

MgSO4.7H2O

Mg

19.86%

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

PORCENTAJE DE BIOMASA: Composición elemental de la Saccharomyce. VF= 1L; XF=3.39 gr/l

Hallamos para el C:

C

45%

N

9%

Mg

0.4%

K

0.5%

P

2.0%

𝑌 𝑥⁄𝑠 . 𝑓 = 0.5

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

%𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝑓 %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

42.11 𝑥0.5 45

𝑌 𝑥⁄𝑠 = 0.468𝑔𝑟/𝑔𝑟

Hallamos el So 𝑆0 =

∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑌𝑥/𝑠

𝑆0 =

2 0.468

𝑆0 = 4.273𝑔𝑟/𝑙

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Sulfato de amonio: (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 𝑃𝑀 = 132.06 𝑔𝑟/𝑚𝑜𝑙

Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

14𝑥2 𝑥100 132.06

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 21.2%

Hallamos

𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙 𝑌 𝑥⁄𝑠 =

%𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

21.2 2

𝑌 𝑥⁄𝑠 = 2.36𝑔𝑟/𝑔𝑟

Hallamos el So 𝑆0 =

∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑌𝑥/𝑠

𝑆0 =

3.39 2.36

𝑆0 = 1.436 𝑔𝑟 /𝑙

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BiFosfato diacido de potasio 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 𝑃𝑀 = 136

Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

39𝑥1 𝑥100 136

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 28.68%

Hallamos

𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙 𝑌 𝑥⁄𝑠 =

%𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

28.68 2.5

𝑌 𝑥⁄𝑠 = 11.47 𝑔𝑟/𝑔𝑟

Hallamos el so 𝑆0 =

∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑌𝑥/𝑠

𝑆0 =

3.39 11.47

𝑆0 = 0.296 𝑔𝑟/𝑙

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Sulfato de magnesio heptahidratado:

Hallamos: 𝑀𝑔𝑆𝑂4 . 7𝐻2 𝑂 Pm= 246.47 gr/mol Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =

24.3 𝑥100 246.47

%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 9.86% Hallamos

𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

%𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑌 𝑥⁄𝑠 =

9.86 0.4

𝑌 𝑥⁄𝑠 = 24.65𝑔𝑟/𝑔𝑟

Hallamos el so 𝑆0 =

∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑌𝑥/𝑠

𝑆0 =

3.39 24.65

𝑆0 = 0.138 𝑔𝑟/𝑙

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E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Nutriente

Fuente

% Elemento Nutriente

C12H22O11

C

42.11%

(NH4)2SO4

N

21.21%

(NH4)2SO4

S

24.24%

KH2PO4

P

22.79%

KH2PO4

K

28.68%

MgSO4.7H2O

Mg

19.86%

INSTRUMENTOS

Autoclave

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Mechero Bunsen

Incubadora

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pHmetro

Espectrofotómetro

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Balanza analítica

Shaker

Biorreactor

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