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GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA: LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO PERÍODO ACADÉMICO: ABRIL – AGOSTO 2017 DOCENTE: Mgs. XIMENA ROBALINO ASIGNATURA: HEMATOLOGÍA II SEMESTRE: CUARTO FECHA DE LA PRÁCTICA: 01 de noviembre de 2017 HORA: 10:00 – 13:00 horas

NÚMERO DE LA PRÁCTICA: 1 DURACIÓN: 3 HORAS

GRUPO N° 2 NOMBRE DE LOS ALUMNO

OROZCO COELLO KARLA LISSETE SERIE ROJA

TITULO DE LA UNIDAD: DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA EN SANGRE TEMA DE LA PRÁCTICA:

OBJETIVO GENERAL:

Determinar hemoglobina en sangre por el método de la cianmetahemoglobina Realizar la toma de muestra por punción venosa en un tubo con anticoagulante

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Manejar correctamente pipetas de Sahli. Aprender a utilizar el espectofotómetro e interpretar sus resultados, midiendo la concentración de hemoglobina en sangre.

FUNDAMENTO TEÓRICO O CONTENIDO CIENTÍFICO: HEMOGLOBINOMETRÍA La capacidad de combinación del oxígeno de la sangre es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina más que al número de hematíes. Por lo tanto la hemoglobinometría, una de las determinaciones de laboratorio más frecuentes, es importante como prueba para descartar las enfermedades asociadas con anemia y para seguir la respuesta de estas enfermedades al tratamiento. La concentración normal de hemoglobina expresada en gramos/100 ml de sangre varia ampliamente según el estándar de Hemoglobina utilizado, la edad, sexo del paciente y la altitud del lugar. Muchos son los métodos para determinar la concentración de la Hemoglobina, los más comúnmente utilizados se basan en uno de los cuatro procedimientos siguientes: medida de la capacidad de combinación de la sangre con el oxígeno (método gasométrico); medida del contenido en hierro en la sangre (método químico), medida colorimétrica de la densidad de la sangre total en soluciones de sulfato de cobre de densidad conocida y la determinación posterior de la hemoglobina y medida colorimétrica de un derivado coloreado de la hemoglobina por ejemplo la oxihemoglobina, la hematina acida, la hematina alcalina y la cianmetahemoglobina y comparación de la muestra desconocida con una estándar, mediante un método espectrofotométrico. MÉTODO DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA (ICSH-OMS) Principio: 1.- La Hemoglobina de la sangre se une al ferricianuro de potasio y se forma la metahemoglobina. 2.-La metahemoglobina se une al cianuro de potasio y se forma la cianmetahemoglobina, La reacción básica en la producción de Cianmetahemoglobina es la conversión de la hemoglobina por el ferrocianuro y la subsiguiente combinación de la metahemoglobina con cianuro potásico para formar el pigmento cianmetahemoglobina. Todos los tipos de hemoglobina, con excepción de la Suifohemoglobina se transforman en cianmetahemoglobina. Las soluciones de este pigmento son muy estables. La técnica que se utilizó es la que se usa en los labora· torios clínicos de la C.C.S.S MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 1.-Solución de Drabkin Bicarbonato de sodio Cianuro de potasio Ferricianuro de potasio Agua destilada

MUESTRA: SANGRE ANTICOAGULADA

DESFIBRINADA

Y

SANGRE

Esta solución debe ser límpida y colocada en frasco de vidrio oscuro resguardada de la luz. No debe conservarse más de un mes. 2.- patrón o Estándar de cianmetahemoglobina. Materiales 1) Fotocolorímetro o Espectrofotómetro 2) Tubos de 12 x lOOmm 3) Sangre venosa total, mantenida incoagulable con EDLA- K3 o con heparina. Puede emplearse también sangre capilar. 4) Pipetas volumétricas calibradas de cristal de 5mi. Pipetas automáticas de 0,02 mi (20 ul) o pipeta de Sahli. PROCEDIMIENTO: 1.-Toma de muestra de sangre 2.-Determinación de hemoglobina 1) 2) 3) 4)

5) 6)

- Conectar el espectrofotómetro según las especificaciones de la casa comercial. Homogenizar bien la sangre mediante agitación suave durante un tiempo mínimo de 5 minutos o por inversión del tubo 20 veces. - Pipetear 5ml de solución de Drabkin en un tubo. - Mediante micropipeta añadir 0,02 ml de sangre o 20 ul de sangre Homogenizada en el tubo con solución de Drabkin. Al realizar esta operación, es fundamental eliminar el exceso de sangre que puede quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar así mismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. -Agitar el tubo mediante inversión (4o5 veces) con el fin de homogenizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar mínimo 5 minutos para que se produzca la hemolisis total y se completa la transformación de toda la hemoglobina en - Leer la absorbancia de la solución a 540mm o 546mm con blanco de reactivo. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una gráfica o curva de calibración o aplicando la siguiente formula: Hemoglobina g/dl = A (muestra) x Concentración de Standard A (Standard) A: absorbancia o densidad óptica Cuando utilizamos factor: Hemoglobina g/dl = A (muestra) x Factor (36.7) GRÁFICOS Y RESULTADOS:

PIPETA DE SAHLI

MEZCLA DE LA MUESTRA Y REACTIVO

TUBOS CON REACTIVO Y MUESTRA

LECTURA

VALORES DE REFERENCIA: HOMBRES DE 14 a 18 g/dl

MUJERES DE 12 a 16 g/dl

CONCLUSIONES Determinamos la hemoglobina en sangre por el método de la cianmetahemoglobina. Esta comparó la intensidad de la luz y midió también cantidad de metahemoglobina que se calculó por medición de su poder de combinación con el oxígeno o con el monóxido de carbono y también por su contenido en hierro - Se realizó la toma de muestra por punción venosa con los debidos procedimientos, teniendo en cuenta que el tubo que utilizamos contenía anticoagulante, por lo cual se debía homogenizar con inmersiones de al menos 20 veces aproximadamente.

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Al Manejar las pipetas de Sahli se debe tener mucha precaución con nuestro absorbedor ya que necesitaremos para la determinación de hemoglobina una cantidad exacta para realizar las diferentes soluciones y analizarlas en el espectrofotómetro.

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Aprendimos a utilizar el espectrofotómetro con nuestro objetivo que fue el calculo de la hemoglobina en sangre, el espectrofotómetro arrojará 3 resultados que son la absorbancia, el estándar y el factor, con estos tres parámetros y mediante un efectivo calculo tendremos lo que es en sí la concentración de la hemoglobina.

RECOMENDACIONES -

Previamente se deberá rotulas todos los tubos para evitar confusiones La solución de Dranking debe estar preservado en un envase de color ambar Todos los tubos una ves que se los a añadido las diferentes muestras se los debe homogenizar y taparlos con papel parafin Al momento de hacer uso del espectofotómetro, deberemos fijarnos en todos los parámetros que nos pregunta el equipo.

CÁLCULOS

Modo Absorbancia B= 0,172 St=0,455 M= 0,422

Modo Standar B=0,714 St=16.7 M=14,4

Hemoglobina Hemoglobina g/dl = A (muestra) x Concentración de Standard A (Standard)

Hemoglobina g/dl = 0,422 x 16,7 0,455 Hemoglobina = 15,49 g/dl Factor Hemoglobina g/dl = A (muestra) x Factor (36.7) Hemoglobina g/dl = 0,422 x 36.7 Hemoglobina = 15,49 g/dl

Modo Factor B=0,713 St=20,1 M=14,6

Nombre: Velín Josselyn Fecha: 1 de noviembre 2017 Edad: 21 años Código: 012

HEMOGLOBINA

Hemoglobina

15,49

gr/dl

12 a 16 g/dl

PREGUNTAS Diagrama de la estructura de la hemoglobina

Síntesis y catabolismo de la hemoglobina Síntesis de la hemoglobina La hemoglobina se sintetiza en una compleja serie de pasos. La parte heme se sintetiza en una serie de pasos en la mitocondria y elcitosol de los glóbulos rojos inmaduros, mientras que las partes globina son sintetizadas por los ribosomas en el citosol.La producción de hemoglobina continúa en la célula a través de su desarrollo temprano de eritroblasto a reticulocitos en la médulaósea. En este punto, el núcleo se ha perdido. “La hemoglobina tiene una característica estructura cuaternaria de muchas proteínas globulares similares. La estructura cuaternariade la hemoglobina proviene de sus cuatro subunidades en unadistribución tetraédrica. Cada subunidad (4 en total) se compone de una cadena proteínica estrechamente asociada con un grupo heme. Cada cadena de la proteína organiza en un conjunto de segmentos estructurales conectados entre sí” (Ascrib, s.f.). Este plegamientomodelo contiene un bolsillo que se une fuertemente al grupohemo. Un grupo heme consiste en un átomo de hierro (Fe) en un anilloheterocíclico, formando una estructura conocida como Porfirina.Los iones de hierro, que es el sitio de unión del oxígeno seencuentran todos en un mismo plano. “El hierro se une fuertemente ala parte proteínica globular a través de la histidina proximal. Los iones de hierro pueden estar en estado Ferroso (Fe2 +) o en elestado Férrico (Fe3 +). Cuando se transforma en Férrico (Fe3 +) pasa a llamarse METAHEMOGLOBINA y no puede unir oxigeno, locual es letal. En tales casos, la enzima metahemoglobina reductasa debe activarse y ser capaz de hacer a la molécula volver a Fe2 +.2F F3. Catabolismo de la Hemoglobina. Cuando los eritrocitos envejecen y no cumplen su función a cabalidad deben ser degradados y es aquí cuando se da e catabolismo de la hemoglobina a través de los macrófagos tisulares, pertenecientes al sistema reticulo endotelial. En este proceso las globinas se separan de la molécula de hemoglobina, dejando al grupo hemo solo, el cual se convierte en biliverdina, ésta es transformada en su mayoría en bilirrubina y es excretada por la bilis. El Fe del grupo hemo es reutilizado para la síntesis de nueva hemoglobina. La Hemoglobina es una proteína globular, que se encuentra en grandes cantidades dentro de los glóbulos rojos y es vital importancia fisiológica, para el aporte normal de oxígeno a los tejidos. “Varios son los genes que determinan su biosíntesis.Proteína pigmentada de color rojo transportadora de oxígeno que se encuentra solo en los eritrocitos de los vertebrados” (Curso de BIOQUIMICA, s.f.) . Es un tetrámero con dos pares de cadenas polipeptídicas diferentes. Cada una de ellas posee un derivado de la porfirina llamado grupo hemo, que a su vez contiene hierro. Las dos principales funciones de la hemoglobina son el transporte de oxígeno y amortiguador del pH. Las concentraciones de hemoglobina están influidas por variaciones fisiológicas como la edad, sexo, deshidratación, postura y altitud, y por procesos patológicos. Se encuentran valores patológicos en anemias y en policitemias.

La determinación de la concentración de hemoglobina se ha convertido en una de las pruebas más importantes en el diagnóstico y tratamiento de la anemia. Las tres causas principales de anemia son: alteración en la síntesis de los eritrocitos en la médula ósea, pérdidas de sangre excesivas y transporte alterado de eritrocitos hacia sangre periférica. Se observan valores de hemoglobina elevados en policitemia vera, eritrocitosis, deshidratación, recién nacidos, cianosis congénita o adquirida, enfermedad renal y pulmonar crónica, quistes renales y en una serie de tumores productores de eritropoyetina. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio. BIBLIOGRAFÍA: • CAMPAL, Faustina. Fundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos y Citológicos. Thompson-Paraninfo 2004.Pag.35,36 • GARCÍA ESPINOZA, Benjamín. Hematología II, Citología, Fisiología y Patología de hematíes y leucocitos. Paraninfo. • VIVES CORRONS, Joan Lluís. Manual de Técnicas en Laboratorio de Hematología. Tercera edición. Masson.

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Ascrib, C. (s.f.). Scribd. Obtenido de https://es.scribd.com/doc/96889761/Sintesis-de-Hemoglobina Curso de BIOQUIMICA. (s.f.). Obtenido de Curso de BIOQUIMICA: http://www.iqb.es/cbasicas/bioquim/cap11/c11s05.htm

MsC. Patricia Miño Orbe DIRECTOR DE CARRERA

Mgs. Ximena Robalino DOCENTE

Lic. Franklin Ramos RESPONSABLE DEL LABORATORIO