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GUÍA DE PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA

CURSO:

PROFESOR:

AÑO:

VIROLOGÍA

JORGE A. SAMAMÉ MÁRQUEZ GABRIEL E. CABREJOS CHILGE

2018- I

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PRACTICA Nº1 TEMA: SOLUCIONES DESINFECTANTES EN VIROLOGÍA

DESINFECTANTES QUÍMICOS Las fórmulas de los productos desinfectantes comerciales presentan grandes diferencias, por lo tanto, las diluciones se deben realizar siguiendo las instrucciones del fabricante. CLORO: HIPOCLORITO SÓDICO El cloro es un desinfectante universal activo contra todos los microorganismos. En general se utiliza en forma de hipoclorito sódico, las presentaciones comerciales tienen distintas concentraciones de cloro libre. Es un enérgico agente oxidante, corrosivo para los metales. Las soluciones de hipoclorito pierden progresivamente su actividad, por lo que es necesario preparar diariamente las soluciones. Como solución desinfectante para toda clase de trabajos de laboratorio, se utiliza a la concentración de 1 g/litro (1000 ppm de cloro libre). Se recomienda utilizar soluciones de hipoclorito sódico con una concentración de 5 g/litro (5000 ppm de cloro libre) como desinfectante de elección en situaciones de urgencia provocadas por virus ,tales como los virus de Lassa y Ebola. Numerosas soluciones de hipoclorito sódico vendidas para uso industrial y de laboratorio contienen 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y por consiguiente deben diluirse a razón de 1:50 ó 1:10 para obtener concentraciones finales de 1 g/litro y 5 g/litro, respectivamente. Las lejías domésticas suelen contener 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y en consecuencia deben diluirse a la concentración de 1: 10 a 1: 50 para emplearlas. Formaldehido El formaldehído es un gas activo contra todos los microorganismos excepto a temperaturas inferiores de 20°C. Se adquiere comercialmente en forma de un polímero sólido o de tabletas denominado paraformaldehído , o como formol en agua a la concentración de aproximadamente 370 g/litro (37%) y que contiene metanol (100 ml) como estabilizador. El formaldehído a la concentración de 18,5 g/litro (formol al 2 % en agua) puede utilizarse como desinfectante líquido y se recomienda su uso contra los virus en general. Para fines de descontaminación de ambientes se utiliza 0.3 gr/pie 3 de formol mantenido 37° por 8 horas a 24 °C o T.A. (1 m3 = 35.3147 pie3) Nota: El formaldehído es un agente cancerígeno. Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son activos contra todas las formas vegetativas de microorganismos, pero no contra las esporas. Su actividad frente a los virus lipídicos es variable. Los compuestos fenólicos son la base de cierto número de desinfectantes corrientes, pueden emplearse cuando no se dispone de hipoclorito, diluyéndolos de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Alcohol y mezclas alcohólicas El etanol (alcohol etílico) y el 2-propanol (alcohol isopropílico) tienen análogas propiedades desinfectantes. Son activos contra las bacterias vegetativas, los hongos y los virus lipídicos, pero no contra las esporas Su acción contra los virus no lipídicos es variable. Para alcanzar su máxima eficacia deben utilizarse en soluciones acuosas al 70% aproximadamente, las soluciones mas concentradas o más diluidas pueden ser igualmente germicidas.

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Las mezclas con otros productos son más eficaces que el alcohol solo, por ejemplo, alcohol al 70% que contiene 100 g de formaldehido por litro o alcohol que contiene 2 g/litro (2000 ppm) de cloro libre Yodo y yodóforos La acción de estos desinfectantes es parecida a la del cloro. Las superficies limoias pueden tratarse eficazmente con soluciones que contengan 0,075 g/litro (75ppm) de yodo libre. Los yodóforos pueden diluirse en etanol para el lavado de manos como esporicida. Se considera que una concentración de 0,45 g/litro (450 ppm) de yodo libre es eficaz contra los virus de Lasa y Ebola. CUESTIONARIO 1. SEÑALE 5 EJEMPLOS DE AGENTES ETIOLÓGICOS VIRALES PARA CADA UNO DE LOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1, 5 EJEMPLOS PARA NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2, 3, 4. 2. SEÑALE LAS DIFERENTES CLASES Y TIPOS DE CABINA DE FLUJO LAMINAR (CABINAS DE BIOSEGURIDAD) CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES. 3. LOS LABORATORIOS DE UNA UNIVERSIDAD QUE NIVEL DE BIOSEGURIDAD DEBE CONTAR.

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PRÁCTICA Nº2 TEMA: PREPARACIÓN DE REACTIVOS: SOLUC. STOCK 10 X HANKS EARLE Y P.B.S., SOLUCIONES E. INDICADORES DE PH, SOLUC. DE BICARBONATO PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERADAS INTRODUCCIÓN Muchas de las reacciones químicas que se producen en solución acuosa necesitan que el pH del sistema se mantenga constante, para evitar que ocurran otras reacciones no deseadas. Las soluciones ""reguladoras"" o Buffer son capaces de mantener de acidez o basicidad de un sistema dentro de un intervalo reducido de pH, por lo cual tienen múltiples aplicaciones, tanto en la industria como en los laboratorios. Esta practica de laboratorio tiene como propósito reforzar en el estudiante el concepto de lo que son soluciones buffer, además de ayudar a los estudiantes a familiarizarse con la resistencia que estas soluciones poseen en cuanto al ph. Así mismo, se puede obtener una solución reguladora haciendo reaccionar parcialmente por (neutralización) un ácido débil con una base fuerte. o un ácido fuerte con una base débil. Una vez formada la solución reguladora, el pH varia poco por el agregado de pequeñas cantidades de ácido fuerte ó de una base fuerte, y pierde su capacidad reguladora por el agregado de agua (disolución).La disolución no cambia el pH de la solución Buffer pero disminuye considerablemente su capacidad reguladora. En general puede decirse que esta práctica tiene como propósito la comprensión de las adiciones de ácidos y sales a estas soluciones. MARCO TEÓRICO Las soluciones buffers, son soluciones que resisten cambios de su pH. Estas soluciones mantienen constante el pH cuando se adicionan pequeñas cantidades de ácidos o bases. El control del pH es importante en numerosas reacciones químicas, en los sistemas biológicos y en muchas otras aplicaciones. El cambio del pH de la sangre en 0,5 unidades puede resultar fatal, pero la sangre es una solución buffer. El agua no es un buffer y la simple adición de una gota de HCl 1M a un litro de agua cambia el pH de 7,0 a 4,3. Así pues, un buen control del pH es esencial. Una solución buffer debe contener un ácido débil y una sal de éste ácido; por ejemplo ácido acético/acetato de sodio, donde el CH3COOH es el ácido y el Ion CH3COO- es la base o una base débil y una sal de ésta base; por ejemplo amoníaco/cloruro de amonio, donde el NH3 es la base y el Ion NH4+ es el ácido. Las soluciones buffers trabajan removiendo los iones H+ o los iones OH- de la solución. El intervalo de pH para el cual un sistema buffer regula adecuadamente es: pKa – 1 < pH < pKa + 1 El sistema buffer mas adecuado es aquel cuyo valor de pKa esta lo más cerca posible del pH que se desea regular.

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Buffer Fosfato Salino Dulbecco con sales de Calcio y Magnesio (500ml). Buffer Fosfato Salino Dulbecco , con Calcio ,Magnesio, 1000 mg/ L D-Glucosa y 36 mg/L Piruvato de Sodio (500ml). Buffer Fosfato Salino Dulbecco sin sales de Calcio y Magnesio (500ml) Solución DE Balanceada de Sales de Earle con sales de Calcio y PREPARACION SOLUCIONES BUFFERADAS EN VIROLOGIA Magnesio (500ml) Solución Balanceada de Sales Hank con sales de Calcio y Magnesio (1000ml)

A B C D E

(mg/litro)

A

CaCl2 MgCl2 MgSO4

B 100.00 47.00

C 100.00

MgCl2 6H2O KCL KH2PO4 NaHCO3

200.00 200.00

NaCl

8000.00

8000.00

8000.00

Na2HPO4

1150.00

1150.00

1150.00

200.00 200.00

100.00 200.00 200.00

D 200.00

E 140.00

97.00

96.00

400.00

400.00 60.00

2200.00 6800.00

8000.00 48.00

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Na2HPO4 H2O Dextrosa Piruvato Na Rojo Fenol

1000.00 36.00

140.00 1000.00 10.00

1000.00 10.00

Soluciones balanceadas son básicamente buffer fosfatos salinos.

ANEXO C PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT C.1 PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT C.1.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0 • Tris 0,60 g • NaCl 0,60 g • Agua desionizada q.s.p 100,00 mL • Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado. C.1.2 Solución de tratamiento de muestra • Tris/HCl 0,95 mL • 2 Mercapto-Etanol 0,05 mL • Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 0,02 g C.1.3 Solución colorante marcador de corrida • Azul de bromofenol 0,05 g • Glicerol 8,00 mL • Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 1,00 mL • Agua deionizada 1,00 mL • Diluir la muestra V/V con la solución de tratamiento y hervirlo por 10 minutos. • Adicionar solución marcador de corrida 3 ml por cada 100 ml de la muestra. C.1.4 Solución stock de poliacrilamida • Acrilamida 14,60 g • N N’ bis-acrilamida 0,40 g • Água deionizada q.s.p 50,00 mL • Pesar los reactivos en tubo de plástico. Colocar el tubo en agua caliente para ayudar a disolver, luegoesperar hasta que se enfrie y completar el volumen. Conservar a 4°C. C.1.5 Buffer de gel de enpaquetamiento 0,5 M, pH 6,8 • Tris 0,5 M 6,00 g • Agua deionizada 100,00 mL

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C.1.6 Buffer de gel de separación o de corrida 1,5 M pH 8,8 • Tris 1,5 M 18,15 g • Agua deionizada 100,00 mL C.1.7 Solución de persulfato de amonio (APS) al 10% • Persulfato de amonio 10,00 g • Agua deionizada 100,00 mL • Alicuotar y conservar a –20°C C.1.8 Solución de Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% • SDS 10,0 g • Agua deionizada 100,0 mL • Conservar a 4OC o a temperatura ambiente C.1.9 Buffer de corrida (superior/inferior) • Tris 0,05 M 30,0 g • Glicina 0,192 M 14,4 g • SDS a 10% 10,0 mL • Agua deionizada 1000,0 mL Solución Gel Empaquetamiento Separación • 40% 12% 15% • Solución Stock • Poliacrilamida 1,33 mL 4,8 mL 6 mL • Buffer de gel inferior o de 3,6 mL 4,5 mL de separación • Buffer de gel superior o de 2,5 mL de empaquetamiento • SDS 10% 100 μL 120 μL 120 μL • Agua desionizada 6,1 mL 3,6 mL 1,5 mL • Persulfato de 50 μL 60 μL 60 μL • Amonio APS al 10% • Temed 5 μL 4 μL 4 μL Tabla C1. Fórmula de concentración de gel de empaquetamiento y de separación o de corrida al 12% y 15% C.2 PREPARACIÓN DE BUFFER PARA LA TRANSFERENCIA C.2.1 Buffer de transferencia • Tris (0,5 M) 102,8 g • Metanol 400,0 mL • Agua deionizada 2000,0 mL • Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado C.3 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA REACCIÓN IMUNOENZIMATICA C.3.1 Buffer fosfato salino 0,01M, pH 7,2 (PBS)

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A.-NaH2P04.H2O 37,00g, NaCl 8,76 g Água deionizada q.s.p 1000,00 mL B.- Na2HPO4.7H2O 2,68 g NaCl 8,76 g Agua deionizada 1000,00 mL Adicionar la solución A sobre la solución B hasta alcanzar el pH 7,2 C.3.2 Buffer de lavado Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3% C.3.3 Buffer de bloqueo y diluyente Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3% + Leche descremada al 5% C.3.4 Solución reveladora Buffer Fosfato Salino 10,0 mL 3,3' diaminobenzidina tetracloridrato 5 mg Peróxido de hidrógeno 10 mL

ANEXO D PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA DOBLE DIFUSIÓN D.1 SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA (SST) 0,1M, pH 7,4 • Solución Fisiológica (NaCl 0.85 %) 900,00 mL • Fosfato de Potasio dibásico (K2HPO4) 100,00 mL • Ajustar pH 7,4 con solución KH2PO4 0,1 M D.2 GEL DE AGAR NOBLE • Solución salina tamponada 100,00 mL • Agar Noble 1,20 g • Mertiolate 0,01 g • Consevar el gel a 4°C D.3 SOLUCION COLORANTE • Amido Schwarz (Negro Amido) 0,10 g • Acido acético Glacial 20,00 mL • Agua destilada c.s.p. 1000,00 mL • Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado. D.4 SOLUCION DECOLORANTE • Alcohol etílico de 95° 400,00 mL • Acido acético glacial 100,00 mL • Agua destilada c.s.p. 1000,00 mL • Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado. • MPR-CNSP-006 55 Instituto Nacional de Salud • Manual de procedimientos para el diagnóstico serológico de las zoonosis parasitarias

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ANEXO E PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA ELISA E.1. TRIS-HCl 0,01M, pH 7,5 • Trisma-HCl anhidro 0,12 g • Trisma base anhidro 0,02 g • Agua destilada q.s.p. 100,00 mL E.2 BUFFER FOSFATO SALINO 0,01M, pH 7,2 (PBS) A.- NaH2P04.H2O 1,37 g NaCl 8,76 g Água deionizada q.s.p 1000,00 mL B.- Na2HPO4.7H2O 2,68 g NaCl 8,76 g Agua deionizada 1000,00 mL Adicionar la solución A sobre la solución B hasta alcanzar el pH 7,2 E.3 BUFFER DE LAVADO • Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05% E.4 BUFFER DE BLOQUEO Y DILUYENTE • Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05% + Seroalbúmina bovina al 1% E.5 SOLUCIÓN ESTABILIZADORA PARA EL SUSTRASTO Ácido Cítrico 3,00 g • Na2HPO4 anhidro 10,70 g • Agua destilada q.s.p. 100,00 mL

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•

Ajustar el pH a 5. Antes de su uso, completar a 8 mL de las solución estabilizadora del sustrato hasta 25 mL con agua destilada.

E.6 SOLUCIÓN DEL SUSTRATO • Solución estabilizadora para el sustrato 25,0 mL • Orto- phenilendiamine 10,0 mg • Peróxido de hidrógeno al 30% 10 mL E.7 Ácido Sulfúrico 2,5 M • Ácido Sulfúrico 1,4 mL • Agua destilada 8,6 mL ANEXO F PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA IFI F.1 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) pH 7,2, 0,01M • Na2HPO4 1,42 g • NaH2PO4 1,20 g • NaCl 8,2 g • Agua destilada c.s.p. 1000,00 mL F.2 BUFFER FOSFATO DILUYENTE (PBS+Tween 80 al 1%) • PBS 99,0 mL • Tween 80 1,0 mL F.3 SOLUCIÓN DE AZUL DE EVANS (SOLUCION STOCK) • Azul de Evans 10,0 mg • PBS + Tween 80 100,0 mL • Conservar en refrigeración a 4°C • Preparar la solución de trabajo antes de usarla • Solución stock 1,0 parte • PBS Tween 80 9,0 partes F.4 BUFFER CARBONATO – BICARBONATO 0,5M pH 9,5 • Solución A • Na2HCO3 Anhidro 5,3 g • Agua destilada cs.p. 100,0 mL • Solución B • NaHCO3 Anhidro 4,2 g • Agua destilada cs.p 100,0 mL • Agregar la Solución A sobre la solución B, hasta pH 9,5 F.5 GLICERINA TAMPONADA • Glicerina bidestilada 9,0 mL • Buffer Carbonato-Bicarbonato 0,5M, ph 9,5 1,0 mL • MPR-CNSP-006 57 Instituto Nacional de Salud • Manual de procedimientos para el diagnóstico serológico de las zoonosis parasitarias ANEXO G

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PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACION INDIRECTA G.1 SOLUCIÓN DE ALSEVER • Glucosa anhidra 18,66 g • Cloruro de Sodio 4,18 g • Citrato de Sodio 8,0 g • Ácido Citrico 0,55 g • Agua destilada 1000,00 mL G.2 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) 0,15 M Solución 1 • KH2PO4 2,04 g • Agua destilada 100,00 mL • Solución 2 • Na2HPO4 2,13 g • Água destilada 100,00 mL PBS ph 7,2 • Solución 1 7,0 mL • Solución 2 18,0 mL • NaCl 2,1 g • Agua destilada 250,0 mL PBS ph 6,4 • Solución 1 18,4 mL • Solución 2 6,7 mL • NaCl 2,1 g • Agua destilada 250,0 mL G.3 SOLUCIÓN DILUYENTE • Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2 G.4 ÁCIDO TANICO SOLUCION STOCK • Ácido Tánico 10,0 mL • Solución salina 1,0 mL Solución de trabajo: 1/20000 • Ácido Tánico Solución stock 100,0 mL • Solución salina 20,0 mL • MPR-CNSP-

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PRÁCTICA Nº3 TEMA: PREPARACIÓN DE MEDIO DE TRANSPORTE PARA OBTENCIÓN DE

MUESTRAS. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL: HECES, ORINA, LCR, HISOPADO DE GARGANTA 1. El diagnóstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice la toma, manejo y envío de muestras siguiendo al detalle las instrucciones al respecto. 2. La interpretación del resultado del laboratorio debe estar apoyado por un buen diagnóstico clínico y los antecedentes epidemiológicos del caso. 3. La muestra para aislamiento de agentes infecciosos debe ser tomada ANTES de instaurar la terapia con antimicrobianos. 4. La muestra debe identificarse utilizando una cinta de tela adhesiva, escrita con LAPIZ, donde se incluya todos los datos relevantes del caso: nombre completo o clave, diagnóstico presuntivo, fecha de toma y tipo de muestra indicando si es 1a, 2a o 3a. 5. La muestra debe acompañarse siempre de un resumen clínico del caso y sus antecedentes, así como de cualquier dato epidemiológico relevante. ENVIO DE MUESTRAS 1. Hay que verificar que todas las muestras estén identificadas con los datos relevantes del caso, tal como ya se indicó en las consideraciones generales al inicio de esta sección. 2. Los frascos, viales, tubos, etc, deben estar tapados lo más herméticamente posible, colocando bien las tapas y tapones los cuales se asegurarán con tela adhesiva. 3. Cuando se manden varios tubos se aseguran con ligas y se colocan en bolsas cerradas. 4. Los frascos se colocan en bolsas de plástico resistentes y herméticamente cerradas. 5. Las laminillas se deben enviar secas, envueltas individualmente en papel de China y cada una estar bien identificada con un número o el nombre del paciente. 6. Para el envío, las muestras se colocan en cajas térmicas resistentes empaquetandolas con relleno de papel, plástico o madera (viruta), para amortiguar los golpes.

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7. Si se envían por avión asegurarse que el paquete viaje en el área presurizada para evitar la pérdida (evaporación) de los especímenes. 8. No olvidar que las muestras deben estar acompañadas de una carta u oficio en el que se especifique claramente que tipo de prueba se solicita y un resumen clínico enfatizando la fecha de inicio del padecimiento y la fecha de la toma de la muestra, edad y sexo, estos documentos (original y copia), se colocan dentro del paquete en una bolsa de plástico sellada para evitar la pérdida de esta información. Debe verificarse que el nombre de la muestra sea el mismo en oficio y resumen clínico. Escribir con letra de molde, de preferencia a máquina y enviar en original. Que la cantidad de muestra enviada sea de acuerdo a los estudios solicitados. Indicar en el paquete en un lugar visible si éste contiene muestras de cólera, rabia, poliomielitis, aguas residuales, citología, paludismo, VIH etc. 9. Las muestras se remiten lo más pronto posible después de obtenidas para organizar su adecuada preservación.10. Es conveniente que se informe del envío al departamento de recepción de muestras del INS al teléfono 4719920, indicando la forma, el número de guía y si es a domicilio u ocurre. LAS MUESTRAS SE ENVIAN A: LABORATORIO DE REFERENCIAL DE SALUD AREA DE RECEPCION DE MUESTRAS DIRECCION: ………………………. ……………………… Tel: ………………… Fax: ……………….. A continuación se describen, en ORDEN ALFABETICO, los procedimientos adecuados de toma y envío de muestras clínicas (M) para diagnóstico y referencia. PROCEDIMIENTOS M1. EXPECTORACION (ESPUTO) M2. EXUDADO CUTANEO M3. EXUDADO FARINGEO M4. EXUDADO NASOFARINGEO M5. EXUDADO URETRAL M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL M7. FROTIS SANGUINEO M8. GARGARISMO M9. GOTA GRUESA M10. HEMOCULTIVO M11. HISOPO RECTAL M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS M13. LAVADO FARINGEO M14. LAVADO GASTRICO M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) M16. LIQUIDO PLEURAL M17. MATERIA FECAL M18. MEDULA OSEA M19. ORINA M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS M21. SANGRE TOTAL

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M22. SUERO M23. OTRAS MUESTRAS M1. EXPECTORACION (ESPUTO) Toma: En un frasco de plástico combustible, con capacidad de 30 a 50 mL, de boca ancha y estéril, se recogen unos 5 mL de expectoración del paciente. Para el aislamiento de agentes microbianos de infección respiratoria aguda, la muestra debe satisfacer un control de calidad consistente en el recuento celular a seco débil de 25 campos, en busca de la presencia promedio de no más de 10 células epiteliales y más de 25 polimorfonucleares por campo; en caso de no cumplir con estos valores se solicita otra muestra. En los casos de sospecha de tuberculosis sólo hay que cuidar que la muestra sea mucopurulenta y esté libre de saliva; se toman 3 muestras: una es cuando se produce tos, otra se toma en la mañana cuando despierta el paciente y una más al hacer la entrega de las muestras en el laboratorio. Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con refrigerante. M2. EXUDADO CUTANEO Toma: Con un hisopo de algodón se toma una porción del exudado, evitando que sea muy superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar chocolate, PAI, etc) o se inocula en el medio de transporte de Stuart. Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con un refrigerante. M3. EXUDADO FARINGEO Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se ilumina bien la cavidad orofaríngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las áreas hiperémicas, purulentas o necróticas, así como de las membranas o manchas de Koplic, si es que las presenta. Envío: Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 1 a 2 ml de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. M4. EXUDADO NASOFARINGEO Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se introduce un hisopo de alginato de calcio, dacrón o nylon (nunca de algodón en caso de sospechar Bordetella) por las fosas nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de producir un acceso de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos, después de lo cual se retira rápidamente. Envío: Si la muestra no se va a procesar de inmediato, el hisopo se mantiene en un medio de transporte y se envía de inmediato con refrigerante: Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 0.5 mL de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. M5. EXUDADO URETRAL

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Toma: Se recomienda al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la muestra. En casos de gonorrea, cuando se produce un exudado abundante, se presiona ligeramente la uretra con el fin de que lo expulse y éste se recoge con un hisopo de alginato estéril el cual se deposita en el medio de transporte de Stuart. Cuando se sospecha de una infección por clamidia, se emplea un hisopo de alginato de calcio adecuado para toma de muestras en varones, el cual se introduce unos 2 a 4 cm en la uretra y se frotan las paredes haciendo girar el hisopo durante 5 a 10 segundos; con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan con acetona. Envío: El tubo y las preparaciones se envía lo antes posible de modo que no lleguen al laboratorio después de 24 horas. M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL Toma: Se utiliza un espejo vaginal para revisar el cérvix. En caso de gonorrea no se hace ningún tipo de limpieza y se recoge una muestra de exudado con ayuda de un hisopo; la muestra se debe sembrar de inmediato en la placa de agar de Thayer Martin y sólo que ésto no sea posible, se puede transportar en medio de Stuart. Cuando se sospecha de infección por clamidias, se limpia el exocérvix con un hisopo de algodón para eliminar el moco y el exudado, se introduce el hisopo (de alginato de calcio o de dacrón, nunca de algodón) o el cepillo unos 2 a 4 cm dentro del canal endocervical y se rota cuidadosamente presionando contra la pared, evitando el contacto con las superficies vaginales. Con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan de inmediato con acetona. Envío: El tubo con el medio de transporte se envía lo antes posible de modo que no llegue al laboratorio después de 24 horas. No es necesario refrigerar la muestra. Las preparaciones se envuelven individualmente y se envían protegidas de la luz y el calor excesivo. M7. FROTIS SANGUINEO Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón empapada en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una punción firme y profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco. Se comprime de nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica. Se toca la parte superior de la gota con un portaobjetos muy limpio y con un extremo de otro portaobjetos, se extiende la sangre para hacer un frote. La sangre se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal. Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente. El conjunto se empaqueta cuidadosamente en un recipiente con doble cubierta para evitar la ruptura y se envía lo antes posible al laboratorio. No hay que refrigerar el paquete. M8. GARGARISMO Toma: Se proporciona al paciente un frasco de boca ancha con tapón de rosca, estéril, con 5 ml de solución salina y se le instruye de modo que mantenga la solución en la garganta el mayor tiempo posible mientras hace gárgaras y depositándo nuevamente el líquido en el frasco. Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegido con un refrigerante. M9. GOTA GRUESA Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón empapada en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una punción firme y profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco. Se comprime de nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica, la cual se hace depositar sobre el centro de un portaobjetos limpio. Con ayuda de una arista de un portaobjetos se extiende sobre una superficie de aproximadamente 0.5 a 1cm. La gota se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal.

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Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente y se empaqueta cuidadosamente con doble cubierta para evitar la ruptura y se envía lo antes posible al laboratorio. No hay que refrigerar el paquete, pero si protegerlo de la humedad y la luz solar. M10. HEMOCULTIVO Toma: Se limpia el sitio de la punción con una torunda de algodón impregnada con etanol al 70% o solución de yodo al 2%. Si se trata de un adulto, se toman de 5 a 8 mL de sangre total, sin anticoagulante, o de 2 a 3 mL si se trata de un niño, siguiendo las indicaciones que se describen en el inciso M20. De inmediato la sangre se inyecta a través del tapón (previamente desinfectado con alcohol) de un frasco con medio bifásico para hemocultivo. Envío: El frasco del hemocultivo se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta para evitar su ruptura. No hay que refrigerarlo. M11. HISOPO RECTAL Toma: La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de algodón humedecido en solución salina o medio de transporte en el recto y haciéndolo rotar ligeramente. Estará bien tomada si observamos un ligero color café en el hisopo. Una vez tomada la muestra se introduce el hisópo hasta el fondo en un tubo con medio de transporte Cary-Blair que debe estar bien tapado (tapón de rosca). Para estudios bacteriológicos se envía inmediatamente después de haberse tomado. En caso de ser para estudios virales mandarlo en refrigeración, aunque no se recomienda usar hisópo para el caso de virus. Envío: Si se trata de estudios bacteriológicos no hay que refrigerar el paquete, pero sí en el caso de estudios virales. M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS Toma: En caso una lesión ulcerosa, se presiona un portaobjeto perfectamente bien desengrasado sobre la lesión. Si la lesión está cicatrizada con la punta de un portaobjeto se levanta la cicatriz y se toma la muestra como se indicó anteriormente. En caso de una lesión nodular, se pincha el nódulo con una lanceta y se presiona con un portaobjeto sobre la lesión hasta que salga líquido tisular el cual contendrá al parásito.Hay que evitar en lo posible el sangrado durante la toma de la muestra. Se fija con alcohol metílico absoluto. Envío: Las laminillas se envuelven individualmente y se empaquetan bien en un recipiente con doble cubierta para evitar su ruptura y se envía lo antes posible al laboratorio. Hay que proteger el paquete de la humedad y de la luz solar. M13. LAVADO FARINGEO Toma: Se pide al paciente que se siente cómodamente e inclina la cabeza hacia atrás. Se mide la distancia media entre la fosa nasal y la base del pabellón auricular, para saber la profundidad a la que se debe introducir la sonda. Se aplicará 1 mL de solución salina o PBS estéril e inmediatamente se introducirá la sonda, que estará conectada a través de una trampa a un tubo o recipiente estéril para la recepción del material. Envío: La muestra se coloca en hielo hasta su procesamiento (dos a cuatro horas en las técnicas rápidas). M14. LAVADO GASTRICO Toma: Debe ser efectuada por personal médico bien entrenado. Se introduce una sonda por vía bucal hasta el estómago en ayunas. La muestra se deposita en un frasco de boca ancha y de preferencia estéril. Envío: El frasco se envía lo antes posible al laboratorio, donde no debe llegar después de 6 horas de tomada la muestra. Se debe acompañar de refrigerante. M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)

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Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico quien la tomará bajo rigurosas condiciones de asepsia. Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca. Envío: Cuando se trate de estudios virológicos, la muestra se envía refrigerada. Si se sospecha de una infección bacteriana, la muestra no debe refrigerarse, ni acompañarse de hielo. Cuando el envío tarda más de 24 horas, la muestra debe enviarse inoculada en medios específicos. M16. LIQUIDO PLEURAL Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico, quien la tomará bajo condiciones rigurosas de asepsia. Se obtiene una muestra de aproximadamente 5 mL en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca. Envío: El tubo se envía lo antes posible al laboratorio acompañado de refrigerante. M17. MATERIA FECAL Toma: Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermética que permitan su fácil transporte, de preferencia que no sea de vidrio. Las heces obtenidas del suelo, excusado así como del pañal no son satisfactorias, debido a que pueden contaminarse con material extraño. Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio. Estudios virales: el tiempo de envío debe ser menor a los tres días y en condiciones de refrigeración, con la cantidad de 10 gramos. Si se trata de hisopo rectal en solución salina, sueros y L.C.R. en envases apropiados correctamente sellados. Estudios bacteriológicos: se inocula en un medio de transporte (Cary Blair o Amies) y se envía a temperatura ambiente Estudios parasitológicos: se adiciona formol al 10% v/v neutralizado y se homogeniza bien. El envío se hace a temperatura ambiente. Estudios para determinación de coproantígenos por ELISA: el tamaño que se envía será similar al tamaño de una nuéz independientemente de la consistencia. Estudios parasitoscópicos : tres muestras consecutivas (de diferente día), El envío se hace a temperatura ambiente. Cuando la muestra presente sangre y/o moco de preferencia mandar de esa parte. M18. MEDULA OSEA Toma: La muestra deberá ser tomada exclusivamente por el médico en condiciones rigurosas de asepsia. Se obtienen aproximadamente de 0.25 a 0.3 mL de material con una jeringa heparinizada estéril de 1 mL de capacidad. La jeringa se gira cuidadosamente para mezclar el material aspirado y se deposita en un tubo estéril con 0.5 mL de solución salina fisiológica. Si se dispone de medios de cultivo se recomienda sembrar de inmediato la muestra: Bacterias: caldo soya-tripticasa Hongos: medios de Sabouraud simple y de Sabouraud con antibióticos Leishmaniosis: medio de Marin NNN y/o RPMI con 10% de suero de ternera fetal Envío: Si el laboratorio está cerca la muestra se puede transportar en la misma jeringa solamente cuidando que la aguja quede bien protegida para evitar la contaminación. Si el transporte se tarda más de 24 horas, las muestras (jeringa o tubo) se conservan en refrigeración. El tubo o tubos sembrados se mantienen a temperatura ambiente y se envían lo más rápido posible al laboratorio. M19. ORINA Toma: Se usa un recipiente estéril, de boca ancha con tapa de rosca. Aunque el sondeo vesical es la forma ideal para evitar la contaminación, debido a la posibilidad de extender la infección en el paciente, se utiliza en casos muy excepcionales en el hospital. Por esto, la micción espontánea es la técnica más aconsejable: después de una cuidadosa limpieza de la

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región urogenital con agua y jabón y después con benzal al 1%, se instruye al paciente para que deseche la primera parte de la micción y se colecta el chorro medio. Sólo en caso de sospechar parásitos, se usa la primera parte de la micción. Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio con refrigerante. Estudios virales: el envío debe tardar menos de un día. M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS Toma: Se lava bien el sitio de la lesión, primero con agua y jabón y luego con alcohol al 70%, utilizando gasa (no debe utilizarse algodón) y se deja secar. Con bisturí estéril, se raspa el borde de la lesión y se recoje el material que se desprende. Si la epidermis está desprendida se toman porciones de ésta. Para la búsqueda morfológica del agente, las costras o escamas se colocan en una caja de petri estéril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva para que no se abra, o bien se pueden colocar en sobres de papel que se sellan. Envío: El material sólo debe congelarse cuando la muestra es para estudios virológicos. Para estudios bacteriológicos la muestra se siembra en los medios de transporte adecuados. M21. SANGRE TOTAL Toma: La toma deberá hacerse en un lugar perfectamente iluminado y con el paciente cómodamente sentado. Se localiza una vena adecuada en el brazo del paciente y se coloca el torniquete. Se desinfecta el área de punción con un algodón impregnado de alcohol al 70%, se introduce la aguja con el bisel hacia arriba. Si la muestra necesaria es sangre total hay que utilizar el anticoagulante adecuado según el proceso que vaya a seguirse, ya que algunos anticoagulantes pueden ser inhibitorios. Si la toma de sangre es para la obtención de suero, no debe usarse ningún anticoagulante. Si la sangre no fluye espontáneamente y se está utilizando una jeringa, se jala el émbolo y se aspira con suavidad; si se está empleando equipo al vacío se presiona el tubo de ensaye hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre el torniquete se retira y hasta que se haya obtenido la cantidad de sangre que se requiere (generalmente 6-10 mL) se retira la aguja y se coloca una torunda con alcohol sobre el sitio de punción ejerciendo presión para detener la hemorragia. Si la toma se hizo con jeringa, la sangre se vierte de la jeringa ya sin aguja sobre un tubo estéril dejándola resbalar lentamente por la pared para evitar hemólisis. El tubo se tapa cuidadosamente. Envío: Es muy importante estar seguro que para el estudio a realizar es correcto el envío de sangre total, ya que ésta puede sufrir hemólisis y dejar de ser útil. Si efectivamente es el caso, el tubo con la muestra se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta y hermético y se envía de inmediato, protegiéndolo del calor excesivo con un refrigerante y de la luz solar. M22. SUERO Toma: Se debe seguir la misma técnica que para la obtención de sangre total (M21), pero sin anticoagulante. El coágulo formado se separa de las paredes del tubo con un aplicador de madera. Se debe esperar el tiempo necesario para que se retraiga el coágulo y el suero se separa por centrifugación a 2,500-3,000 rpm. El suero no debe mostrar indicios de hemólisis, ni debe estar lipémico y se debe conservar refrigerado o congelado, a menos que se dé otra indicación. Actualmente existe un equipo comercial de tubos al vacío con un gel especial, con este sistema se puede separar el suero directamente en los tubos centrifugando a 3,000 rpm por 5 minutos. El suero se conserva en los mismos tubos por varios días. Este procedimiento tiene la ventaja de que no se destapan los tubos en ningún momento, así el contenido se conserva estéril y además representa un riesgo mínimo. Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegiéndolo del calor con hielo o un refrigerante. Si es necesario congelarlo, hay que empaquetarlo bien con hielo seco. Si el suero muestra indicios de contaminación debe desecharse de inmediato. M23. OTRAS MUESTRAS

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Para diversos diagnósticos especiales y para las investigaciones de brotes se pueden requerir otros tipos de muestras. En estos casos dirigirse directamente al laboratorio correspondiente para recibir la información respectiva.

PRÁCTICA Nº4 TEMA: Cuantificación Viral

SUSTRATO CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS. CULTIVOS CELULARES DE LÍNEA.  (HOMÓLOGOS Y HETERÓLOGOS) ANIMALES DE LABORATORIO  HUEVOS EMBRIONADOS  PEQUEÑOS ROEDORES O O o o

MUESTRAS SIMPLES COMBINADAS COMPLEMENTARIAS SEROLOGÍA - HISTOPATOLOGÍA PROCEDIMIENTO

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EFECTO CITOPÁTOGÉNICO LÍTICO POR HERPESVIRUS

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EFECTO CITOPATOGÉNICO: SINCICIOS, C. DE INCLUSIÓN

PLACAS NECRÓTICAS EN MCA (VIRUELA AVIAR)

SÍNTOMAS NERVIOSOS (MENINGOENCEFALITIS POR VIRUS DE THEILER

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¿COMO HAGO PARA SABER CUÁNTO VIRUS TENGO? TITULACIÓN VIRAL MÉTODOS EMPLEADOS  

BASADOS EN LA CONSTITUCIÓN FÍSICO-QUÍMICA BASADOS EN SUS PROPIEDADES BIOLÓGICAS

MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS    

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA HEMAGLUTINACIÓN PRESENCIA DE ENZIMAS ESPECÍFICAS PROPIEDADES ANTIGÉNICAS (PRECIPITACIÓN, COMPLEMENTO

FIJACIÓN

DE

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 22

Nº DE PARTÍCULAS X VOLUMEN DE LAS MUESTRA HEMAGLUTINACIÓN

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PROPIEDADES BIOLÓGICAS DETERMINAR LA ACTIVIDAD O POTENCIA DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL TITULACIÓN VIRAL ¿COMO SE HACE? APLICANDO MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN ADECUADOS Y PERFECTAMENTE ESTANDARIZADOS. (BIOMETRÍA: ESTADÍSTICA APLICADA A LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS). PROPIEDADES BIOLÓGICAS SE TOMA EN CUENTA LA INTERACCIÓN DE LA HUÉSPED. VIRUS + CÉLULA  EFECTO OBSERVABLE

PARTÍCULA VIRAL CON LA CÉLULA

1) SE UTILIZAN DILUCIONES SUCESIVAS DE LA SUSPENSIÓN VIRAL (DE UN FACTOR CONSTANTE DETERMINADO) DILUCIONES

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2) SE CONTABILIZAN EL NÚMERO DE RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL NÚMERO TOTAL DE RESPUESTAS POSIBLES PRODUCIDAS EN UN SISTEMA HOSPEDADOR  MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR  MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50% MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR  ENUMERATIVO  UN EFECTO OBSERVABLE = UNA PARTÍCULA VIRAL  DIFERENTES SUSTRATOS: -CULTIVOS CELULARES………….PLACAS -E. DE POLLO (MCA)……………… POCKS -PEQUEÑOS ROEDORES…………FOCOS NEOPLÁSICOS MATERIALES  MONOCAPAS CELULARES  INÓCULO (5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN)  MEDIO DE CULTIVO SEMISÓLIDO  COLORANTE (ROJO NEUTRO: CÉLULAS VIVAS) (CRISTAL VIOLETA: CÉLULAS MUERTAS) MÉTODO DE PLACA

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MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR CALCULO _ X N= -----VXD _ X= PROMEDIO DE LESIONES OBSERVADAS POR DILUCIÓN EN LAS 5 MUESTRAS V= VOLUMEN DEL INÓCULO D= DILUCIÓN EMPLEADA

MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50%  ESTADÍSTICO  RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL TOTAL DE LAS POSIBLES  GRADIENTE DE ACTIVIDAD  (A > DILUCIÓN < ACTIVIDAD)  

SI O NO POSITIVO O NEGATIVO

MATERIALES  SISTEMA HOSPEDADOR

CÉLULAS EMBRIÓN DE POLLO PEQUEÑOS ROEDORES 

INÓCULO DILUCIONES EN BASE 10 5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN MEDIO DE CULTIVO

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 

EL PUNTO FINAL 50% EN LA TITULACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL, ES LA DILUCIÓN DE VIRUS QUE PRODUCE EL 50% DE EFECTOS POSITIVOS. EL TÍTULO ES LA INVERSA DE AQUELLA DILUCIÓN A LA CUAL REACCIONA, ESTADÍSTICAMENTE, LA MITAD DE LOS SUJETOS INFECTADOS O UNIDADES REVELADORAS

MÉTODO DE RM. CÁLCULO I

-1

-2

-3

-4

-5

-6

-7

A

+

+

+

+

+

+

-

B

+

+

+

+

+

-

-

C

+

+

+

+

+

-

-

D

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

-

-

-

E

+

F

MÉTODO DE RM. CÁLCULO II

FREC.ACUM. + FREC.ACUM. -

24 19 14 9 0 0 0 0 24/24 19/19 14/14 9/9

4 2 4/6

1 6 1/7

100% 100% 100% 100% 66% 14%

(AM/AM+ AV) 100

0 11 0/11

0 16 0/16

0%

0%

50%

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MÉTODO DE RM. CÁLCULO III (% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - 50% -----------------------------------------------------------------------------------= DP (% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - (% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR DEBAJO DEL 50%) 66-50 DP = --------- = 0,3 (-0,3) 66-14 MÉTODO DE RM. CÁLCULO III DILUCIÓN DONDE ESTÁN LOS EFECTOS POSITIVOS POR ARRIBA DEL 50% = DIST. PROPORCIONAL (-0,3) X LOG DEL FACTOR DE DILUCIÓN (LOG 10=1) = SUMA (PUNTO FINAL 50%)

-5 -0,3 =

-5,3

ES DECIR QUE EN LA DILUCIÓN -5,3 TENEMOS 1DICT50% INVERSA DE LA DILUCIÓN DONDE REACCIONA EL 50% TÍTULO DICT 50% / X 50 L = 10 5.3 ES DECIR QUE EN LAS SUSPENSIÓN PURA TENEMOS INFECCIOSAS (DETERMINADO POR ANTILOGARITMO)

=

5,3

199526 PARTÍCULAS

MÉTODO DE RM. CÁLCULOIII

10 5.3

DICT 50% / 50 L

PRÁCTICA Nº5 TEMA: INOCULACION DE HUEVOS EMBRIONADOS Materiales:  Huevos embrionados (de preferencia)  Ovoscopio

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     

Alcohol Algodón Parafiana (1 vela) Fosforo o encendedor Mechero Jeringa de tuberculina con aguja 21 x 1 ½

PROCEDIMIENTO: 1. Seleccione los huevos embrionados de 10 a 11 días de incubación y verifique la viabilidad de los embriones por transiluminación. 2. Ordene los huevos en el soporte con la cámara de aire hacia arriba. Rotule con número de material y fecha. 3. Con un algodón embebido en alcohol al 70%, limpie el área correspondiente a la cámara de aire y deje secar. 4. Perfore con un punzón la cáscara al centro de la cámara de aire. 5. Con una jeringa de 1 ml. cargue 0.8 ml del material a inocular a una dilución adecuada según las características del mismo (a los efectos de practicar el estudiante realizará las inoculaciones con una solución de Azul de Metileno).Con el huevo colocado sobre la lámpara, inserte la aguja en dirección del embrión, y pinche suavemente el mismo. Verifique que el embrión sigue el movimiento de la aguja, (lo que indica que esta en el lugar deseado), e inyecte 0.2 ml del material y de esa manera se inocula el saco amniótico. 6. Retire algo la aguja, de modo de caer en la cavidad alantoidea, e inocule 0.2 ml. 7. Retire la aguja del huevo y selle el orificio con parafina o esmalte de uña. 8. Incube los huevos inoculados de acuerdo al procedimiento antes indicado, a 33oC durante 3 días. COSECHA 1. Al finalizar el plazo de incubación, coloque los huevos inoculados durante la noche a 4 oC para lograr una vasoconstricción que minimice el sangrado durante la cosecha. 2. Limpie con alcohol al 70% el área del saco de aire y deje secar y prepare 2 tubos por cada huevo inoculado: uno con el número del material y AMN y el segundo con igual número pero marcado ALA. 3. Rompa la cáscara del huevo que recubre la cámara de aire y con una pinza y una pipeta estéril proceda a romper la membrana alantoidea y aspire el líquido contenido en la cavidad depositándolo en el tubo marcado ALA. 4. Coseche el líquido amniótico con jeringa de 1 ml. Manipule con la pinza el embrión de modo que no interfiera con la aspiración del líquido, y deposítelo en el tubo AMN. 5. Una vez terminada la cosecha e inspeccionado, los materiales en buenas condiciones procedentes de varios huevos inoculados con la misma muestra podrán mezclarse, para luego proceder a su testado por hemoaglutinación para verificar la presencia de virus y determinar su concentración (título). 6. Inoculación de huevos embrionados. Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observándolos en un ovoscopio o con iluminación adecuada. De acuerdo al agente viral que se sospecha, será la vía de inoculación y por ende, la edad del embrión (ver cuadro 1) a utilizar.

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CUADRO 1 AISLAMIENTO VIRAL CULTIVO DE TEJIDOS PRIMARIOS RFB-TFB

LINEAS MDBK BOV. TURB.

RFB-TFB

MDBK BOV. TURB.

RFB-TFB

MDBK BOV. TURB.

Bovine RFB-TFB Adenovirus (BAdV) Foot and RFB-TFB Mouse Disease TirFB (FMDV)

MDBK BOV. TURB.

Bovine Herpesvirus Type 1(BHV-1) Bovine Viral Diarhoea Virus(BVDV) Parainfluenza Type 3 (PI-3)

ANIMALES DE LABORATORIO OTROS

BHK

Ratón lactante (im., ic. o ip) Cobayo (adap)

MDBK IBRS2

Vesicular EP.BOV Stomatitis Virus (VSV) CERDOS

Bovine Entero Virus (BEV)

MONO.COB. RFB-TFB

BOV. TURB VERO

Ratón lactante Huevos embrionados Cobayo-Conejo

BHK MDBK

Bovine Rotavirus (BRV) Bovine Corona Virus (BCV) Pox V Clasical Swine Fever Virus (CSFV) African Swine Fever Virus (ASFV)

RFB

BOV. T (RB) MA 104 Explantos

Homólogo RFP (sin ecp) PK15 (sin ecp) TFP C Leucocitos

Huevos embrionados. MCA.

VERO MS

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Porcine Parvovirus (PVP) Pseudorabies Virus (PRV)

RFP (IF HA) RFP y B

BHK

Conejo (sc.)

TFP y B

MDBK

Ratón lactante (ic.)

Fibroblasto de IBRS2 pollo

Huevo embrionado

PK15 VERO BHK

Blue Tongue Virus (BTV) Ovine Pulmonar Adenomatosis (OPA)

-

-

Huevos embrionados (ev.)

Histopatología

-

VÍAS DE INOCULACIÓN a. Cavidad Amniótica: el material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de 10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1). Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico. b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpéticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de inoculación. Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina (ver figura 1). Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no tóxico. c. Cavidad alantoidea: el virus se difundirá en el fluido e infectará las células ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad, Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de inoculación que debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2 ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo (ver figura 2). Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico. d. Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en

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línea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se sella con parafina líquida u otro sellador no tóxico.

e. Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose

al ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un rectángulo, enmarcando la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe observarse cómo el inóculo al diluir la sangre, circula por la vena). Ver figura 2. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

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PRÁCTICA Nº6 TEMA: INOCULACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO Materiales:  Ratones de 11 a 15 gr machos de preferencia 1 x grupo de 4 a 5 personas  Ratones lactantes 3 a 5 , Con su madre. 3 x grupo de 4 a 5 personas  Alcohol  Algodón  Jeringa de tuberculina con aguja 26 G  1 rejilla

Introducción Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infección por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el hospedador experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en algunos casos puede causarle la muerte. Es un método sencillo, sensible y rápido aunque son pocos los virus animales de nuestro interés que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante, constituye una importante técnica en la identificación y caracterización de agentes (diagnóstico diferencial). Inoculación de Ratón Lactante

a) Vía Intracerebral: el punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml. b) Vía Intramuscular: se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro posterior, aspirando previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa similar al anterior

c) Vía intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cúbito dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina. TECNICAS DE INOCULACIÓN Y SANGRIA DE ANIMALES El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado que, siempre que sea posible, deberá ser conocido por los animales. No hay tampoco que sobre valorar el papel clave desempeñado por la persona que sujeta al animal y evidencia la vena. La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda) y la punción llevada a cabo decididamente mejor que con vacilaciones. Puede que el animal muestre signos de incomodidad (¡como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le debe tranquilizar, tratándole con suavidad y hablándole. Puede que se necesite alguna presión próxima al lugar de oclusión del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de sangre. La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una micropipeta con punta de plástico.

Después de haber sacado la sangre, se debe mantener una presión suave pero firme sobre el lugar durante unos 30 segundos, lo que detendrá rápidamente cualquier sangrado. También hay varios preparados hemostáticos de alginato de calcio, fibrillas de colágeno y esponja gelatinosa que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado. 1) a) b) c) d) e) f)

¿Cuales son los animales comúnmente utilizados para estas pruebas? Ratón Rata Hámster Gerbo Cobayo Conejo

2) Describa La Técnica De Inyección intravenosa, intraperitoneal, Subcutánea, Intramuscular. A. RATÓN : Intravenosa Equipamiento: agujas de 27 - 30 g, jeringas 1 ml de TB, sujetador para ratón, lámpara de calentamiento. La vena lateral de la cola del ratón es el sitio más común para esta técnica. Mejores resultados se logran si la cola se introduce en agua caliente o el ratón es calentado en la jaula con una lámpara. Las venas se observan cuando la cola es levantada y girada lentamente en cualquier dirección. La punta de la aguja puede verse como penetra en la vena. No obstante ser una técnica de fácil aplicación práctica y entrenamiento es fundamental. Intraperitoneal Equipamiento: jeringas y agujas 23 - 27 g, ½ a 1 pulgada, preferiblemente con el Bisel pequeño. La inyección se aplica en el cuadrante izquierdo bajo como se observa, en la figura 7.

Figura 7.- Sujeción para la aplicación de la inyección intraperitoneal en ratón. El uso del bisel pequeño en la aguja y su inserción a través de la piel, levantando la aguja en contra de la pared abdominal, evita la posibilidad de punción en el intestino. Una rápida administración del fluido puede causar daños en el tejido y hemorragia debido a la presión.

Si no se inmoviliza la pata derecha del ratón pudiera existir el riesgo de punción en los intestinos. El máximo posible de administrar por esta vía a un ratón de 20 g es de 2 ml. Subcutánea Equipamiento: agujas de 25 a 27 g, ½ a ¾ pulgada con jeringas de TB. Esta vía es utilizada como alternativa a la intramuscular en los ratones. El área escogida es el hombro. Como alternativa el abdomen ventral es usado utilizando la técnica de restricción de la figura 1.

Figura 1.- Métodos de sujeción y manipulación en el ratón para inyecciones intraperitoneales o intramusculares. Bibliografía •

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Proceeding of 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971 "Recommended Standard Laboratory Techniques for diagnosing infectious bovino rhinotracheitis. Bovine virus diarrhea and Shipping fever (Parainfluenza-3)". Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Disease". Third Edition.

PRACTICA Nº7 TEMA: CULTIVOS CELULARES

LOS CULTIVOS CELULARES Y SUS APLICACIONES I (CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES)

Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener poblaciones celulares homogéneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (“en vidrio” = en recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en la investigación científica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y en diversas aplicaciones de la biotecnología, como la producción de moléculas de interés industrial, ingeniería de tejidos, etc. ¿Cómo se obtienen las células? El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas 1. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes (como el EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una suspensión celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido. Para separar los diferentes tipos celulares se pueden utilizar varios métodos: I. La centrifugación, que permite separar a las células por tamaño. II. La capacidad de adherencia al vidrio o al plástico que tienen algunos tipos celulares. III. La unión a ciertos anticuerpos específicos para determinados componentes celulares. Estos anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices (colágeno, bolitas de polisacáridos, de látex o de plástico). Las células unidas a la matriz (a través de los anticuerpos) se recuperan por agitación, tratamiento con tripsina (digiere a las proteínas que median la adhesión) o, en el caso de una matriz digerible (como el colágeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa). IV. La unión a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las células que contienen un determinado componente son reconocidas y “marcadas” por los anticuerpos. Las células marcadas son separadas de las no marcadas en un separador de células activado por fluorescencia o cell sorter (Figura 1). V. La disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para microscopía. La región que contiene las células de interés es irradiada con un láser, que funde un pequeño círculo con las células que están por debajo. Estas células capturadas son luego removidas para un posterior análisis. La técnica, denominada “microdisección de captura por láser”, puede utilizarse para aislar y estudiar diferentes partes de un tumor, por ejemplo. Otra técnica relacionada emplea un láser para disertar un grupo de células y “catapultarlas” a un contenedor apropiado para un posterior análisis (Figura 2). Figura 1. Equipo para la separación de células marcadas por fluorescencia. Las células individuales viajan a través de un conducto muy delgado y son iluminadas por un láser. El

equipo puede detectar qué células emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada célula es incorporada en una gota que es “cargada” eléctricamente como negativa o positiva en función de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son separadas por un campo eléctrico hacia los recipientes colectores según su carga (adaptado de Alberts y col., MBC 2002). 1 La matriz extracelular está compuesta por diferentes tipos de moléculas, entre las que se encuentran los proteoglicanos, polisacáridos como el ácido hialurónico, y proteínas como el colágeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina. Figura 2. Técnica de microdisección para aislar células a partir de secciones de tejidos. Este método emplea un láser para escindir una región de interés y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento de determinadas células (hasta células individuales) a partir de un tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002). ¿Cómo se cultivan las células? La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”)2. Como se mencionó anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plástico, aunque a veces los requerimientos son más complejos y el plástico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en los tejidos, y con la cual interactúan), como por ejemplo el colágeno y la laminina. Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción de tejido neural, incluido en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com. El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado para esclarecer una controversia en el área de la neurobiología. El investigador Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, publicó un breve pero crítico artículo (“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que introdujo exitosamente una nueva técnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cómo se originan las fibras nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos”. Utilizando técnicas asépticas, Harrison tomó fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrión de rana, y lo depositó en una gota de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de rana colocada sobre un cubreobjetos estéril. Una vez que la linfa coaguló, invirtió el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para estudiar las bacterias. Luego de periódicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular, como el medio, la observación y la contaminación.

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En los laboratorios de bioquímica, por in vitro se entienden aquellas reacciones químicas que se llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de células, mientras que in vivo se refiere a las reacciones químicas que ocurren dentro de la célula, aún en cultivo. CULTIVOS PRIMARIOS Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u órgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su proliferación es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios (figura 3). CULTIVOS SECUNDARIOS En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o meses. En este estadío, las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarán colágeno, las células derivadas de tejido muscular esquelético se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad contráctil espontánea, las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células nerviosas, las células epiteliales formarán largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 4). Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos. CULTIVOS CONTINUOS O LÍNEAS CELULARES La mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado número de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferación es el resultado de un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas). En las células somáticas (todas las células que no son células sexuales) se encuentra “apagado” el gen que codifica para la enzima telomerasa, que se encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia, los telómeros se acortan en cada división celular. A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular “inmortalizada”. Pero como se mencionó, no todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas células, a pesar de que sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control” (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos “oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden obtenerse de virus que causan cáncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc. Figura 4. Células en cultivo. A) Micrografías de contraste de fase de fibroblastos en cultivo. B) Micrografías de mioblastos en cultivo mostrando las células fusionadas para formar células musculares multinucleadas. C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo.

D) Células de tabaco en cultivo Figura 3. A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen “apagado” el gen de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen el largo a través de las divisiones celulares. Pero cuando son cultivadas, esas células experimentan cambios genéticos que inactivan los mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas espontáneamente. Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigación. A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del cual se aísla una sola célula, la que prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas). Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para inferir el papel que tiene la proteína ausente o alterada en las células normales. Entre los cultivos celulares más promisorios, desde el punto de vista médico, se encuentran las líneas de células madre embrionarias humanas. Estas células, obtenidas del macizo celular interno de un embrión en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podrían revolucionar la medicina al proveer de células capaces de reemplazar o reparar tejidos dañados. Hay otras fuentes de células madre que se están investigando en tejidos adultos, como la médula ósea y el cordón umbilical. LOS HIBRIDOMAS Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte (o heterocarion), es decir, una célula con dos núcleos separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensión de células con compuestos que inducen la fusión de membranas (fusógenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse estableciendo una línea celular, pero se sabe que en muchos casos la línea resultante es inestable genéticamente, y tiende a perder parte del material genético. En 1975, un equipo integrado por el científico argentino César Milstein, desarrolló, mediante la técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la producción de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines terapéuticos y de diagnóstico: los hibridomas (este desarrollo llevó al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son líneas resultantes de la fusión de dos tipos celulares: linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y células derivadas de una línea tumoral de linfocitos B (figura 5 de la fusión se obtiene una mezcla heterogénea de células, y con un medio de cultivo especial se seleccionan las células fusionadas que producen anticuerpos y proliferan indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, y cada uno de ellos sirve como una fuente estable y permanente de un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo reconoce un único epítope antigénico (es decir, una pequeña porción de una proteína). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparación con los cultivos clonales de linfocitos B, es que estos últimos tienen una vida limitada en cultivo. Figura 5. Preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un antígeno en particular. El medio de cultivo selectivo utilizado luego de la fusión celular contiene un inhibidor que bloquea las rutas de síntesis de los nucleótidos. Como consecuencia, las células deben utilizar una vía alternativa para fabricar sus ácidos nucleicos.

Esta vía es defectiva en la línea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero está intacta en las células de bazo (linfocitos B) obtenidas del ratón inmunizado. Debido a que ninguna de las células utilizadas para la fusión inicial puede crecer por sí sola, sólo las células híbridas o hibridomas sobreviven. ¿Qué contienen los medios para el cultivo de células? Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía ser producto de una mezcla de ciencia y alquimia. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas cantidades de una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación celular: sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Además, la mayoría de los medios incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, y por lo tanto es difícil saber qué macromoléculas requiere un determinado tipo celular para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y proliferación, como los factores de crecimiento. Así, gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares. Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen, además, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse también antibióticos y antimicóticos para impedir la contaminación con microorganismos. Composición de medios de cultivo para células de mamífero Aminoácidos

Vitaminas

Sales

Otros compuesto s*

Proteínas requeridas en los medios definidos libres de suero

Arginina Cisteína Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Biotina Colina Folato Nicotinamid a Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2

Glucosa Penicilina Estreptomic ina Anfotericina Rojo fenol Suero fetal bovino

Insulina Transferrina Factores de crecimiento específicos

PRACTICA Nº8 TEMA: OBTENCIÓN DE BACTERIOFAGOS DE E. COLI. 1. Aislamiento de Bacteriófagos: Introducción:

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Los bacteriófagos son parásitos de las bacterias importantes como instrumento de identificación de especies bacterianas. Así como instrumento epidemiologico en la tipificación de fagos de staphylococcus y salmonella. Sirve como vector de material genético, estudio en biología molecular y genética.

2. Objetivos: • Demostrar la contaminación en la muestra por fagos como indicadores de contaminación en forma rápida y segura. 3. MATERIALES Y EQUIPO: • Tubos de ensayo • Tubos de dunkan. • Placas petri. • Pipeta de 10, 1 ml • Probeta de 100 ml. • Erlenmeyer de 250 ml • Mechero Bunsen • Baño maría. • Balanza de platillo. • Estufa. • Autoclave. • Incubadora.

4. PROCEDIMIENTO: • Autoclave los materiales antes de limpiarlos. • Limpiar con cepillo y agua corriente. • Colocarlos en detergente y hervir por 15´. • Enjuagar 6 veces. • Embeber 1h. En Hcl 0.05% 1N. • Enjuagar 3 veces. 5. REACTIVOS: 5.1 Caldo enriquecido para fagos (C.E.F): • ClNa 5 g. • Peptona 5 g. • MgSO4.7H2O 0.20g. • MgSO4.4H2O 0.05g. • Estrac. de lev.3g. NOTA: Autoclave a 121°c por 15´ a 15 Lbrs. 6. Método Directo: Demostración cualitativa. 6.1 Trabajo de la cepa: • Uso de cepa E. Coli B. • Repicar unas colonias al C.E.F incubar 24h a 35°c. • Tomar 0.2ml de la primera incubación y colocarlo en otro tubo con C.E.F. Incubar por 3h a 35°c. • En este caso la bacteria se encuentra en etapa logaritmica de desarrollo. 6.2 Trabajo con la Muestra:

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Tomar 10 ml de muestra de agua contaminada. Proceder a diluir 1/10, 1/100,1/1000, etc, en 90ml de agua.

6.3 Obtención de Colifagos: • Licuar 3ml de A.B.E.F. Mantenerlo a 45-50 °c. • Agregar 2 gotas de Cl2Ca al 1.5%. • Agregar 0.2 ml de del C.E.F con las bacterias incubadas x3h. • 1ml de la muestra diluida y homogenizada. • Vertirlo a la placa petri q tiene el A.E.F. • Homogenizar e incubar a 35°c por 24h. 7. Resultados: • Luego de incubarlos la lisis aparecera a las 4h.de incubación. • Esto demuestra la rapidez de la prueba.

PRÁCTICA N° 9 TEMA: DE HEMOAGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE HEMOAGLUTINACIÓN Una de las propiedades de muchos virus es la habilidad para poder aglutinar (hemoaglutinación) puede ser dividido dentro de tres categorías: 1. El grupo de los myxovirus en el cual las partículas virales misma es el agente hemoaglutinante. La propiedad infecciosa de los virus no puede ser separada de la propiedad hemoaglutinante. Estos virus tienen la propiedad enzimática con el subsecuentemente se produce elución con los glóbulos rojos.

2. Virus con los cuales la partícula infectiva no puede ser separado de las partículas infectivas no puede ser separado de las partículas hemoaglutinante, pero las cuales no posen actividad enzimática por elución con el virus. Este grupo incluye a los arbovirus. 3. Virus que durante la replicación produce una hemoaglutinina que es distinta de la partícula infecciosa. Esto incluye algunos poxvirus y miembros de la psitasicosis. La hemoaglutinación es inhibida por antisuero específico esto es llamado como inhibición a la hemoaglutinación y puede ser usado para el serodiagnóstico o identificación de partícula viral. ESPECIE DE GR SUSCEPTIBLES A LA AGLUTINACIÓN POR DIFERENTES VIRUS VIRUS

Herpes simplex

ESPECIE DE GR SUSCEPTIBLES PARA HA Herpes simplex

OBSERVACION

Herpes simplex

Varicella Herpes Zoster Poxvirus Vaccinia Variola

Pollo. Solo 50 % de los La hemoaglutinación es GR de ave es susceptible separable de la partícula a la HA. infecciosa.

Cowpox (vacuna)

Los GR de pavo es No ay elusión con los GR. susceptible a Vaccinia. La IHA puede ser usado para el Dx.

Sarampión

GR de monos Rhesus.

También produce hemolisina viral. No ay elusión del virus por GR. La IHA puede ser usado para el Dx.

Myxovirus

Cobayo, pollo y humano

Cepa especifica pu3ede ser usado para la ident6ificacion de cepas y serodiagnóstico. Los virus son e luidos enzimáticamente. La hemaglutinina no se puede separar de la partícula infecciosa.

Rata, mono Rhesus

Agrupado de acuerdo a la aglutinación de GR de la sp. .Hemaglutinina no separable de la partícula infecciosa. Virus no eluidos por los GR enzimaticamente.

Influenza Parainfluenza Parotiditis

Adenovirus

Reovirus

humano

IHA puede ser usado para tipificar el serodiagnóstico. No eluyen los GR por el virus.

Arbovirus

GR de pollo o de ganso

Depende del pH La IHA se usa para el Dx. No hay elusión del virus por los GR. La hemaglutinina no separable de la partícula infecciosa.

ECHOVIRUS

Humano

Los tipos difiere con la temperatura para la máxima aglutinación.

Coxsackie A

Humano

Coxsackie B

Humano fetal

Hemaglutinina no separable de la partícula infecciosa. Los virus no eluyen los GR

Poliovirus

Ninguno

Virus basofilicos

Raton, Hamster

Tracoma Psitasicosis Linfogranuloma

La elusión ocurre a los 4 °C específica para agrupar, no especifico para tipear hemoaglutinina no separable del virus.

venéreo

HEMOAGLUTINACIÓN (HA) ARBOVIRUS Principio: La HA por Arbovirus depende del ph. Es necesario, por lo tanto para determinar el pH óptimo para cada antígeno (Ag). Reactivos:        

Ag. Preparados en Cultivo celular o en ratones lactante. Solución Alsever. Hematíes de ganso adulto. Solución Stock de Buffer (monobásico, dibásico) Solución stock de borato salino pH 9 (BS) Solución de albúmina bovina (AB) fracción V al 0.4 % en borato salino (ABBS) pH 9. Solución suero fisiológico (NaCl al 0.9 %) Desinfectante.

Equipos y materiales:

             

Estufa regulada a 37 °C. Congeladora a –20 °C Refrigeradora. Balanza analítica Dispensador automático. Potenciómetro Espejo bicóncavo Micropipeta multicanal 25 – 250 ul. Micropipeta unicanal 2 – 20 ul y 20 – 200 ul. Propipetas Papel filtro Tubos 13 x 100 Viales Bandeja con hielo

Procedimiento: Obtención de hematíes de ganso  Tener un ganso adulto, macho (las hembras no se utilizan ya que los cambios del ciclo hormonal pueden cambiar los títulos hemoaglutinantes), de preferencia realizar el sangrado como mínimo una vez por semana.  Rextraer sangre de la vena radial del ganso, empleando una jeringa con aguja N° 20. Colectar la cantidad necesatria para la prueba (una parte de sangre mas 3 de Alsever). Guardar la sangre de ganso a 4 °C. no debe utilizarse pasado los 10 días.  Lavar el volumen de sangre requerido para la prueba tres veces con solución salina. Centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos a 4 °C.  Una vez lavados los hematíes de ganso re suspender al 0.5 % con cada uno de los buffer de los diferentes (pH Ver Anexo). Comprobar su densidad óptica empleando filtro de 490 nm (La densidad óptima es de 0.75). Prueba propiamente dicha: 1. Rehidratar cada Ag liofilizado con agua destilada y diluir 1:10 en frío con 0.4 % de albumina bovina fracción V en borato salino, pH 9.0 2. Permitir a cada Ag para disolverse totalmente toda la noche a 5 °C. 3. Realizar diluciones seriada del Ag en placas de microtitulacion, agregar 0.1 ml a la primera cavidad. 4. Agregar 0.05 ml de 0.4 % a todas las cavidades de las placas. 5. Utilizando micropipeta de 0.05 ml hacer diluciones seriadas sucesivamente. 6. agitar suavemente. 7. La suspensión de GR. a diferente pH agregar 0.05 ml /cavidad. 8. Agregar en primera cavidad de la ultima fila 100 ul de la suspensión de GR usada. 9. incubar a T° ambiente. Interpretación:  Hemoaglutinación completa: Punto donde a hemoaglutinación es completa +  Hemoaglutinación parcial: Se considera positiva pero no es leído como punto medio +/-.  No hemoaglutinación formación de un botón de hematíes.

PRÁCTICA N° 10 TEMA: PRUEBA DE ELISA, DIAGNÓSTICO RÁPIDO

INTRODUCCIÓN La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han

permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Dispositivos empleados en ELISASe han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High troughput system').

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

FASES DE UN ENSAYO ELISA Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

TIPOS DE ENSAYOS ELISA ENZIMA

SUSTRATO

TAMPÓN

OPD TMB ABTS HRP DAB (peroxidasa de rábano) CNP AEC

ASA PNPP NAPFB AP (Fosfatasa alcalina) NAPR BCIP beta-G

ONPG

ureasa

BP

PG

IS

10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; añadir microL de 30% peróxido de hidrógeno 30% 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0.1M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30% 60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0.1 M pH 6; añadir 35 microL de peróxido de hidrógeno 30%; parar con fluoruro sódico 1.25%; leer a 405 nm 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 20 microL de peróxido de hidrógeno 1% 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30% 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno 30% 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y añadir 10 % por volumen de 0.05% peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol) 2.5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; añadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar elpH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4ºC Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampón fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidón en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampón fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solución stock (en una botella oscura)

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes. ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado.

Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran cantidad de antígenos. ELISA 'sandwich'. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo antiantígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unido a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. MARCADORES ENZIMÁTICOS MÁS COMÚNMENTE UTILIZADOS En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos. ELISA DE CAPTURA DE IGM PRINCIPIO DE LA TECNICA Las tiras serán sensibilizadas con una Inmunoglobulina de carnero anti IgM humana, la cual reaccionara con los anticuerpos de clase IgM presentes en la muestra del paciente. Al adicionar el antígeno del virus del Dengue (VD) este reaccionara con las Inmunoglobulinas M capturadas previamente si estas son específicas para el VD. Posteriormente se adiciona el conjugado, formado por inmuglobulinas anti VD acopladas a la enzima peroxidasa del rábano. Si las reacciones previas han sido específicas el conjugado reaccionará con el antígeno del VD. Cuando se adiciona el substrato este es degradado por la enzima peroxidasa traduciéndose en un cambio de color en la reacción en las muestras positivas. APLICACIÓN: La detección de IgM específica contra el virus del Dengue (VD) es un método rápido, sencillo y económico, que tiene una elevada sensibilidad y especificidad, por lo que constituye el sistema de elección para la vigilancia seroepidemiológica del Dengue. Los resultados de esta técnica deben interpretarse con cuidado, porque dependen en gran medida del momento en que se tome la muestra y del tipo infección (primaria o secundaria) que presente la persona afectada.

ELISA IPK - DENGUE (CUBA) Todos los reactivos deben retirarse de la refrigeradora para que alcancen la temperatura ambiente. MATERIALES, REACTIVOS Y PREPARACION • Placas de poliestireno de 96 pocillos separables en tiras. Cuando las tiras no estén en uso guardarlas en la bolsa y mantenerlas en refrigeración. • Solución para Lavado (1 x 100 ml)

Antes de utilizarlo poner en baño de María para disolver cristales. Preparar una solución 1:25 con agua destilada en un volumen de 450 ml por placa. Se utiliza para los lavados de las placas, para diluir el antígeno y conjugado. • Controles Positivos y Negativos listos para usar. • Diluyente de Muestra (1 x 3 ml) Se prepara una dilución 1:25 con agua destilada y queda lista para utilizarla en las diluciones de las muestras (preparar según necesidad). • Suero Humano Negativo a Dengue (SHN) Se utiliza en la preparación de la solución diluyente del antígeno y el conjugado, y se prepara inmediatamente antes de usarlo. • Antígeno Liofilizado (6 x 2 ml). Antígeno inactivado de virus Dengue (vienen los 4 serotipos) se van a reconstituir los viales necesarios para el uso con 2 ml de solución de lavado conteniendo SHN al 0.5%. 3 ml Solución de lavado / SHN 0.5 0.5 _________ 100 2 ml al Vial de Ag X _________ 3 ml = 15 μl SHN Para 3 ml S.Lavado • Conjugado Antidengue-peroxidasa (1 x 0.2 ml) Se prepara una solución de lavado al 5% con SHN. 5 __________ 100 ml 250μl de SHN + 5 ml de Soluc. Lavado X __________ 5 ml Para la dilución del conjugado se pone 30 μl de conjugado en 2 ml de la solución de lavado SHN al 5%. Esto se prepara según necesidad. • Sustrato (OPD) Liofilizado (6 x 5 ml) Reconstituir cada vial al momento de su uso con 5 ml de agua destilada, esperar hasta su completa disolución y añadir 2 μl de Peróxido de Hidrógeno, homogeneizar. TECNICA DE ANALISIS 1. Preparar un protocolo de trabajo identificando la posición de cada muestra y los controles. 2. Realizar una dilución 1:20 con el diluyente de muestras 1:25. 10μl de muestra + 190μl de diluyente. 3. Dispensar 50 μl de la dilución 1:20 y 50 μl de los controles: 2 positivos y 4 negativos Sin diluir. 4. Incubar 2 horas a temperatura ambiente en Cámara Húmeda. 5. Lavar la placa 5 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla. 6. Dispensar 50μl de antígeno preparado según las instrucciones, incubar toda la noche a 4°C en Cámara Húmeda. 7. Lavar la placa 5 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla. 8. Dispensar 50μl por pozo del conjugado diluido, incubar 1 hora a 37°C en cámara húmeda. 9. Lavar la placa 7 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla. 10. Reconstituir cada vial de substrato con 5 ml de agua destilada + H2O2 11. Dispensar 100μl en cada pozo e incubar 30 minutos, pasado este tiempo detener la reacción adicionando 100μl de Acido Sulfúrico al 12.5% en el mismo sentido en que se añadió el substrato. 12. Leer la microplaca y medir la D.O. a 492 nm ajustar el blanco contra aire.

CALCULO DE RESULTADOS. • Calcular la media de la D.O. de los controles negativos y multiplicarlo por 2 (Valor de Corte) • Calcular la media de la D.O. de los controles Positivos. Es válida la prueba si la media de los controles positivos es mayor o igual a 5 veces el valor de la media de los controles negativos. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS EN LA DETERMINACION DE IgM ESPECÍFICA CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE La presencia de IgM específica contra el virus del Dengue en una de muestra de suero significa que esta persona se ha infectado recientemente con este virus. Los resultados negativos deben interpretarse cuidadosamente. Una muestra tomada antes del 7mo día de iniciados los síntomas puede resultar negativa. En este caso debe tomarse una segunda muestra o auxiliarse de otro método diagnóstico. En las infecciones secundarias o terciarias la IgM puede fallar en un porciento bajo, en ese caso se puede auxiliar de otros métodos serológicos que determinen fundamentalmente IgG anti virus del dengue. CONTROL DE CALIDAD En cada ensayo debe incluirse 3 controles negativos y 2 controles positivos, un positivo alto y un positivo bajo. Los controles negativos deben presentar valores de absorbancia inferiores a 0.2. El control positivo alto debe presentar valores de absorbancia superiores a 1.00 y el control positivo bajo debe resultar siempre con valores de absorbancia superiores al valor de corte. Periódicamente un panel de sueros conocidos (aproximadamente de 20 muestras) debe procesarse para evaluar el comportamiento de la técnica. Se debe participar en las pruebas de proficiencia organizadas por IPK y CDC.

PRÁCTICA N° 11 TEMA: PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA Materiales      

Uno a dos 2 ratones de 11 a 15 gr de preferencia machos. Laminas cubre y porta objetos Microscopio de inmunofluorescencia Cámara húmeda Micropipetas (20ul, 50 ul, 100ul) Pipetas

     

 

 

  



Equipo de disección Guantes de cirugía Mandil (guardapolvo) Mascarilla Recipiente con desinfectante (solución jabonosa) Estufa 37°C PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MUESTRAS . Sujetar firmemente la cabeza del animal a una superficie de trabajo. Realizar una incisión profunda a lo largo de la línea media del cráneo, empezando por delante y encima de los ojos hasta la base del cráneo o cuello, a través de la piel, fascia y músculo. Separar la piel lo máximo posible, exponiendo los huesos del cráneo. Realizar cuatro cortes al cráneo con una sierra, asegurándose de atravesar todo el cráneo: un corte transversal inmediatamente detrás de los cuernos, dos cortes longitudinales al lado izquierdo y derecho del hueso frontal y un corte transversal encima de los ojos uniendo los dos cortes anteriores. Levantar la tapa del cráneo con un desarmador para exponer las meninges y el cerebro. Cortar las meninges, levantar el cerebro y colocarlo en un papel absorbente limpio. Retirar porciones (del tamaño del cerebro de un can) de corteza, cerebelo, asta de Ammón y médula y depositarlas en una placa petri o en envases primarios para su envío respectivo. Rotular la muestra con el código correspondiente. MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA

1.1 FUNDAMENTO 1.1.1La función del microscopio de fluorescencia es proveer luz necesaria para excitar un colorante fluorescente y luego transmitir esta luz al observador. En inmunofluorescencia, el colorante más utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (ITCF), debido a su gran afinidad por las proteínas (globulinas). 1.1.2 Para entender el fundamento de esta técnica es necesario conocer el fenómeno que ocurre cuando un compuesto es irradiado con energía luminosa. Al irradiar el colorante ITCF, la energía excita las moléculas, desubicando los electrones de los átomos de su núcleo central (absorción de energía). Como el ITCF es un compuesto luminiscente, emitirá nuevamente energía luminosa en forma de luz visible de una

longitud de onda más larga. 1.1.3Para el diagnóstico de rabia se emplea este principio, utilizando un microscopio de fluorescencia que presenta una fuente de iluminación de luz ultravioleta y mediante un sistema de lentes y filtros se amplifica la imagen de la reacción del compuesto marcado con ITCF con el antígeno. Para realizar la observación es necesario contar con una habitación poco iluminada (“cuarto oscuro”). 1.2

OBJETIVO

Establecer los procedimientos a seguir para el empleo y mantenimiento del microscopio de fluorescencia 1.3   

MATERIALES Microscopio de fluorescencia (epifluorescente) Aceite de inmersión no fluorescente (Merck) o glicerina pura Lámina control positiva (coloreada con ITCF)

1.4

PROCEDIMIENTOS DE USO

1.4.1 Antes de encender el microscopio, verificar que los objetivos y oculares estén limpios. Si es necesario, limpiar con papel lente seco. Nunca tocar los lentes con los dedos. 1.4.2 Enchufar el microscopio y encender la fuente de poder (algunos microscopios poseen un indicador de prendido). El encendido debe realizarse de 3 a 5 minutos antes de iniciar cada sesión de lectura, para permitir que la lámpara emita energía con adecuada intensidad. 1.4.3

Colocar la lámina porta-objeto coloreada en la platina, sin tocar el objetivo

1.4.4

Enfocar el campo con el objetivo de 40X, utilizando el micrométrico, evitando que la lámina toque al objetivo. Con el micrométrico, enfocar para lograr una imagen clara.

1.4.5 Mover el sistema, agregar aceite de inmersión no fluorescente o glicerina pura y enfocar con el objetivo de 100X. 1..4.6

Ubicarse en el extremo superior izquierdo, recorrer la lámina a la derecha y luego hacia abajo recorriendo ordenadamente toda la lámina.

1.5

PROCEDIMIENTOS DE MANTENIMIENTO

1.5.1

El microscopio presenta una lámpara de mercurio, la cual debe encenderse en una sola sesión de lectura debido a que cada encendido equivale a 3 horas de vida de la lámpara. Cuando la intensidad de luz disminuye notoriamente es necesario cambiar la lámpara por otra, de acuerdo a los siguientes pasos:

1.5.1.1

Desconectar el equipo y dejar enfriar la lámpara a temperatura ambiente (caso contrario, existe el peligro de explosión).

1.5.1.2 Abrir la caja que contiene la lámpara y retirarla aflojando los tornillos ubicados en ambos lados. 1.5.1.3

Coger la nueva lámpara por los extremos (sin tocar el bulbo con los dedos) y colocarla en la caja portadora ajustando en ambos lados.

1.5.1.4

Cerrar adecuadamente la caja portadora.

1.5.1.5 Si hubieran manchas en la superficie de la lámpara, limpiarla con un algodón embebido en alcohol.

1.5.1.6 Los objetivos y oculares se limpiarán al inicio y término de cada sesión de lectura con bencina ligera o alcohol, para remover las manchas y/o el aceite de inmersión. 1.5.1.7 Proteger el equipo contra temperaturas superiores a 50ºC, humedad, sustancias químicas y contra el polvo, utilizando fundas protectoras de tela. SECCION 2 ENSAYOS O ANÁLISIS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE RABIA 2.1

RESUMEN DE LOS ENSAYOS (Anexo D)

2.1.1

Para el diagnóstico de rabia se emplean dos pruebas de rutina: la prueba de inmunofluorescencia directa (IFD) y la prueba biológica de inoculación en ratones (IR). Ambas pruebas poseen una alta sensibilidad y especificidad.

2.1.2

La prueba de IFD es una prueba rápida, con alta sensibilidad y que permite obtener resultados en unas pocas horas. Por el contrario, la prueba de IR posee una mayor especificidad, pero los resultados se obtienen en 21 días, además que confirma el diagnóstico de pruebas negativas por IFD.

2.1.3

En la prueba de IFD es necesario titular el conjugado antirrábico, buscando encontrar la dilución óptima de éste.

2.1.4 De acuerdo a las recomendaciones del Comité de Expertos de Rabia de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un diagnóstico positivo en cualquiera de las dos pruebas es concluyente. 2.1.5

La prueba de seroneutralización (neutralización del suero) en ratones es un procedimiento serológico que se utiliza para determinar si una persona o un animal está protegido contra la rabia.

2.2

PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA La IFD, debido a su rapidez y sencillez, es la primera prueba que se utiliza para el diagnóstico de rabia. Si el resultado de la prueba es negativo, se procederá a realizar la inoculación en ratones. La prueba de IFD detecta el antígeno rábico de la impronta mediante el uso del conjugado antirrábico que contiene globulinas marcadas con ITCF. 2.3 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INOCULACIÓN EN RATONES La prueba de inoculación en ratones es una técnica sencilla, basada en procedimientos rigurosos. Esta inoculación se realiza en ratones debido a su alta susceptibilidad al virus rábico y se manifiesta con una sintomatología clásica (erizamiento, parálisis, postración y muerte). Una vez muerto el animal se procede a realizar la prueba de IFD para determinar si la muestra inoculada es positiva a rabia. 2.4

PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE SERONEUTRALIZACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIRRÁBICOS

La prueba de neutralización del suero en ratones es un procedimiento serológico que se utiliza para determinar si una persona o un animal está protegido contra la rabia. Este método determina la cantidad de anticuerpos presentes en el suero y se basa en la neutralización de una serie de diluciones de suero con una dosis constante de un virus de desafío previamente titulado. Los resultados son expresados en términos de títulos serológicos, definidos como la dilución más elevada que neutraliza una cantidad estándar de virus. SECCIÓN 3 TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO RABICO 3.1

PRINCIPIO Y UTILIDAD La técnica de inmunofluorescencia directa está basada en la reacción antígenoanticuerpo que ocurre al enfrentrar la impronta positiva (antígeno) con el conjugado antirrábico (anticuerpos). Esta reac- ción puede ser detectada mediante la luz ultravioleta del microscopio de inmunofluorescencia.

3.2

ESQUEMA Y SIMBOLOGÍA

Figura Nº 1. Esquema de lámina de IFD para rabia

SIMBOLOS Antígeno rábico Isotiocianato de fluoresceína Conjugado antirrábico Figura Nº2. Simbología empleada en la técnica de inmunofluorescencia

3.3

FUNDAMENTO

3.3.1 Si las improntas de cerebro y cerebelo contienen virus rábico, el resultado de la prueba será positiva

3.3.2

El antígeno está fijado y permeabilizado. Se añade una gota de conjugado antirrábico+ CRN a la impronta cercana al lado pavonado y otra gota de conjugado antirrábico + CVS a la impronta alejada del lado pavonado. Luego, se incuba los porta-objetos a 37ºC por 30 minutos. Si la impronta tiene antígeno rábico, se unirá el conjugado antirrábico + CRN a la impronta del lado izquierdo, formando el complejo antígenoanticuerpo. En la impronta que contiene el conjugado + CVS no se unirán los anticuerpos a la impronta porque ya están tomados por el CVS. Estos complejos conjugado + CVS serán retirados durante los lavados con el PBS.

CRN + conjugado

CVS + conjugado

3.3.3 La unión del conjugado antirrábico al antígeno rábico es detectada mediante la excitación de la luz ultravioleta que se observa por la fluorescencia de color verde limón emitida por el fluorocromo (FITC). LÁMPARA DE MERCURIO Luz ultravioleta

CRN + conjugado

3.4

MATERIALES Y REACTIVOS

Fluoresce ncia

CVS + conjugado

        

Solución salina tamponada, pH 7,2-7,4 Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CRN al 20% Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CVS al 20% Acetona Q.P. Aceite de inmersión (Merck) ND 1,515 o glicerina pura Porta-objetos pavonados en un extremo Pipeta de transferencia o gotero Agua destilada Beaker de 1000 mL

3.5

PROCEDIMIENTO

3.5.1

Examen y lavado de la muestra

3.5.1.1 Luego de desembalar y verificar la codificación de las muestras se procede a codificar las fichas con el código del laboratorio y el respectivo día de procesamiento, así como su ingreso en el registro de muestras para diagnóstico de rabia (Anexo E). 3.5.1.2

Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se procederá a realizar un lavado utilizando suero fisiológico (solución salina estéril 0,09%).

3.5.1.3

Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo

3.5.1.4

Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolución caudal cortando para- lelamente a la línea que divide ambos hemisferios. El corte se extenderá de 3 a 5 cm hacia delante, profundizándose hasta ubicar el ventrículo lateral a nivel de una estructura de color blanco nacarado en forma de cuerno, que sobresale lateralmente del suelo del ventrículo. Esta estructura es el hipocampo o asta de Ammon, que al corte transversal muestra una estructura típica de contorno espiralado (“pionono”).

3.5.1.5

Se realizarán dos cortes más, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el cerebelo, siempre procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm.

3.5.1.6

Realizar dos láminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo en el caso de animales menores (felinos y caninos). Para el caso de animales mayores (bovinos) se realizarán cuatro láminas de las mismas zonas, con especial interés en el cerebelo.

3.5.1.7

Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel secante o filtro y éste sobre un bajalengua.

3.5.1.8

Tomar un porta-objeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una cruz. Realizar dos impresiones en cada lámina procurando que la impronta no sea muy gruesa. Si la impronta fuera muy gruesa, se podrá adelgazar presionando la impronta sobre el papel filtro.

3.5.1.9 Colocar las láminas secas en un coplin con acetona fría (-20ºC) por un mínimo de 30 minutos. 3.5.1.10

Una vez seca la impronta, se procederá a delinear los bordes de ambas improntas con un corrector líquido (liquid paper).

3.5.1.11 Diluir el conjugado antirrábico previamente titulado 1/5 con la suspensión de CRN o agua destilada 3.5.1.12

Diluir el conjugado antirrábico con la suspensión de CVS 1/5

3.5.1.13

Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la impronta más cercana del extremo pavonado o que contenga el código. Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la impronta más alejada del extremo pavonado. Llevar a la estufa a 37ºC por 30 minutos Lavar con solución salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por 10 minutos Lavar con agua destilada Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersión o glicerina pura, sin colocar laminilla a la impronta. La observación de las láminas se iniciará en el extremo superior izquierdo y proseguirá hacia la derecha y luego hacia abajo, asegurando la observación ordenada de toda la impronta.

3.5.1.14 3.5.1.15 3.5.1.16 3.5.1.17 3.5.1.18 3.5.1.19

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 3.6.1

Lámina control positivo: La impronta teñida con CRN + conjugado muestra un campo oscuro con células nerviosas, en cuyo interior o exterior, se observan estructuras redondeadas (corpúsculos rábicos) o pequeños puntos de color verde limón (Figura Nº 7). En el lado de la impronta teñida con CVS + conjugado, no deberá observarse fluorescencia de color verde limón.

3.6.2 Lámina control negativo: Ambas improntas no mostrarán ningún tipo de fluorescencia. 3.6.3

Láminas problema: Si la lámina se asemeja al control positivo, significará que la muestra es posi- tiva; si se asemeja al control negativo, significa que la muestra es negativa, hasta que se emita el resultado de inoculación en ratones.

Figura Nº3. Fotografía microscópica de una impronta de cerebro positivo a rabia marcada con conjugado antirrábico. (Fotografiada por R López, Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia) 3.7

PRECAUCIONES

3.7.1

Cuando las muestras contienen glicerina 50% en agua destilada se lavará con solución salina fisiológica 0,09% por 5 a 10 minutos, pudiéndose utilizar agua destilada.

3.7.2

Si la muestra contiene preservantes como alcohol o formol, descartarla y obtener en lo posible una nueva muestra que reúna las condiciones indicadas.

3.7.3 Si la muestra está demasiado contaminada (al punto de liquefacción), descartarla y avisar al remitente.

1. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Indicadores de pH, Soluc. De Bicarbonato. 2. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Indicadores de pH, Soluc. De Bicarbonato. 3.8

Earle y P.B.S., Sclue. Earle y P.B.S., Sclue.

PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA

3.8.1 La lámina control positivo de la impronta de CRN + conjugado no presenta fluorescencia. Explicación: La lámina tiene muchos días de preparación. En este caso es necesario volver a preparar láminas control. 3.8.2 positivo.

La impronta de CVS + conjugado presenta fluorescencia en la lámina control Explicación: El CVS ha bajado su título y ya no inhibe a los anticuerpos coloreados del conjugado.

3.8.3

La impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan fluorescencia en la lámina control negativo. Explicación: Presencia de precipitado o fluorescencia inespecífica. Observe si la morfología es irregular debido a las sales de fluoresceína.

3.8.4

En la lámina problema la impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan fluorescencia. Explicación: Posible contaminación bacteriana. Observe la morfología característica de bacilos o coco bacilos. Pudiera ser también conjugado inespecífico que se presenta en forma de cristales. En estos casos, centrifugue el conjugado para eliminar la coloración inespecífica.

FUENTE DE REFERENCIA INS Manual de procedimientos para el diagnóstico de la rabia, Norma técnica N° 3 Año: 2002.

PRÁCTICA N° 12 TEMA: PRUEBA DE WESTERN BLOT, LIA (PRÁCTICA DEMOSTRATIVA) INTRODUCCION Propósito para identificar proteínas utilizando anticuerpos. (Este ensayo identifica las proteínas más específicamente que el ensayo por Inmuno histoquímica). Pasos básicos: (Estos pasos no incluyen el bloqueo, lavados, etc.) Aislar las proteínas. • Ejecutar las proteínas (eléctricamente) a través de un gel Polyarcrilimida • Seque las proteínas en una membrana nitrocelulosa (eléctricamente) • Aplicar los anticuerpos primarios a la membrana (unirá a las proteínas de estar presente).Aplicar anticuerpos secundarios - (unirá al anticuerpo primario). Este anticuerpo está conjugado con una etiqueta fluorescente o luminosa (o molécula) que reacciona con un sustrato para producir un resplandor.  Aplicar sustrato. Este reacciona con la etiqueta en el anticuerpo secundario y si la proteína fluorescente original estaba presente en el primer lugar. • Rayos X detecta la luminiscencia, y las bandas se producen en estos puntos.  Las bandas representan las proteínas de diferentes tamaños medidos en kilo Daltons (KDa). Bandas más abajo en la mancha representan proteínas más pequeñas. Esto se puede medir con relación al testigo. El control contiene proteínas conocidas en kDa conocida, que puede ser utilizado como una referencia