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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) FACULTAD DE MEDICINA “SAN FERNANDO” ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS DINÁMICAS SECCIÓN: FARMACOLOGÍA INFORME FINAL

“Efecto antioxidante de la Punica granatum frente a un modelo de daño pulmonar en ratas” AUTORES: 1. Aira Macedo, Alejandro Enrique 2. Alanya Castro, Monica Rita 3. Alí Deza, Alejandra Hortensia 4. Allcahuaman Arones, Christian Eduardo 5. Azcue Puma, Lincoln 6. Huancas Sanchez, Edgar 7. Romero Rugel, Cesar 8. Saldaña Cruzado, Sergio 9. Salinas Ticona, Pedro 10. Sanchez Fuentes, Alexander 11. Sanchez Valiente, Edward Felipe 12. Torres Lastarria. Luisa Belén

PROFESOR ASESOR: Dr. Teodoro Oscanoa Espinoza

2016

1.

TÍTULO Efecto antiinflamatorio de la Punica granatum frente a un modelo de daño pulmonar en ratas.

2.

RESUMEN El estrés oxidativo ocasionado por la exposición a agentes ocupacionales o ambientales, entre ellos el talco por su alto contenido de sílice, es uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de procesos inflamatorios de los alveolos pulmonares, los cuales pueden llevar a futuras complicaciones como las enfermedades fibrosantes del pulmón. Por esta razón el empleo de agentes antioxidantes es un importante punto a tomar en cuenta como medida preventiva. El objetivo de este estudio es demostrar el efecto antiinflamatorio del extracto etanólico de semillas de Punica granatum (granada) en un modelo de daño pulmonar inducido con talco en ratas Sprague Dawley macho. Los animales serán divididos en 4 grupos, un grupo Blanco (B) y 3 grupos experimentales (E1, E2 y E3) a los que se les indujo la enfermedad mediante la exposición periódica a aspiración de talco emitido continuamente en una cámara cerrada durante 3 horas, por 15 días. El grupo E1 no recibió tratamiento de ningún tipo, el grupo E2 recibió tratamiento con 12 mg/kg de prednisona durante los primeros 7 días de la inducción y el grupo E3 recibió tratamiento con 400 mg/kg de extracto etanólico de Punica granatum durante los primeros 7 días de la inducción. Después de los 15 días de inducción, los animales fueron sacrificados y se realizó una evaluación radiológica y anatomopatológica. Los resultados mostraron que el extracto etanólico de las semillas de Punica granatum posee efectos antiinflamatorios en el daño pulmonar inducida por talco en ratas Sprague Dawley macho. Palabras clave: Daño pulmonar, Punica granatum (granada), talco, estrés oxidativo, ratas.

3.

ABSTRACT Anti-inflammatory efect of Punica granatum in a lung damaged model in rats. Oxidative stress caused by exposure to occupational or environmental agents, including talc for its high silica content, is one of the main mechanisms involved in the pathogenesis of pulmonary alveoli inflammatory processes, which can lead to future complications like pulmonary fibrosis. For this reason, the use of antioxidants agents is an important point to consider as a preventive measure. The objective of this study is to demonstrate the antiinflammatory effect of the ethanolyc extract of Punica granatum (Granada) in a lung damaged model induced by talc in male Sprague Dawley rats. The animals were divided into 4 groups, a white group (B) and 3 experimental groups (E1, E2 and E3) that were laid in a close chamber for 3 hours with a periodic exposure to aspiration of talc continuously issued, for 15 days. The E1 group received no treatment, the E2 group was treated with 12 mg / kg of prednisone for the first 7 days of induction and the E3 group was treated with 400 mg / kg of ethanol extract of Punica granatum (Granada) during the first 7 days induction. After 15 days of induction, the animals were sacrificed and a pathological and radiological evaluation was performed. The results showed that the ethanolyc extract of Punica granatum (Granada) seeds has antiinflammatory effects in lung damaged induced by talc in male Sprague Dawley rats.

4.

Keywords: Lung damage, Punica granatum (Granada), talc, oxidative stress, rats. INTRODUCCION 3

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) pertenece al grupo de enfermedades fibrosantes del pulmón, denominadas en conjunto como enfermedades pulmonares intersticiales difusas (EPID) de etiología desconocida, crónica y progresiva 1. Tiene una prevalencia mayor en varones (20/100.000) que en mujeres (13/100.000) y es la de peor pronóstico dentro de las neumonías intersticiales idiopáticas2. La enfermedad se caracteriza por un exceso en la producción de colágeno y la formación de tejido cicatrizante que interfiere con la habilidad de los pulmones de transferir oxígeno al torrente sanguíneo, lo que produce finalmente insuficiencia respiratoria en el paciente 3. La sobrevida media es muy pobre con 2,5 a 3,5 años a partir del diagnóstico 4. Hipótesis actuales señalan que la exposición a agentes ambientales, ocupacionales, tabaquismo, infecciones virales o incluso la injuria por tracción en las zonas más periféricas del pulmón podrían ser causas del daño crónico al epitelio alveolar 1. Por ello la exposición a ciertas partículas como el talco por su alto contenido de sílice puede llevar a un curso de fibrosis pulmonar en estudios experimentales. Por otro lado el tratamiento terapéutico, sigue siendo un reto, perteneciendo aún al grupo de enfermedades incurables. En la actualidad, la pirfenidona y estudios con nintedanib, fármacos antifibróticos, han mostrado enlentecer la progresión del daño pulmonar 5. El estrés oxidativo es uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de la fibrosis pulmonar. En este sentido, se ha llegado evidenciar una reducción en la superficie epitelial alveolar de las concentraciones de glutatión, componente del sistema de defensa antioxidante del pulmón humano, en pacientes con FPI. Por lo tanto, el empleo de agentes antioxidantes en el tratamiento sería un punto muy importante a tomar en cuenta 2. Punica granatum L (Punicaceae), granada, es un árbol cuyos estudios han demostrado una alta actividad antioxidante en extractos de sus diferentes partes cáscara, zumo y semillas. Así 4

mismo, también se ha evidenciado cantidades significativas de compuestos fenólicos. Por lo que ha quedado demostrado que la granada presenta propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antidiabéticas y neuroprotectoras 6. 4.1

ANTECEDENTES

El primer caso de enfermedad pulmonar producida por exposición a talco fue descrito en 1896 por Thorel7. En 1956 Hunt evaluó la relación entre la exposición crónica a polvo de talco comercial con la formación de fibrosis pulmonar generalmente de tipo nodular, aunque ocasionalmente podía ser masiva. Ya anteriormente trabajos como el de Mc Laughlin (1949) y el de Di Biasi (1951) mediante examinaciones patológicas y mineralógicas habían atribuido a la exposición al polvo de talco la formación de agregados nodulares fibrosos en los pulmones 8. En 1989 Pickrell et al reportaron el carácter inflamatorio de la fibrosis pulmonar al detectar el incremento de macrófagos alveolares tras la exposición a inhalación repetida de talco en ratas 9. Fraser en 1990 menciona la aparición de reacciones patológicas (fibrosas) como una respuesta a la acumulación de polvos en los pulmones indicando que las partículas debían tener un tamaño menor a 5 micras para poder ingresar a los alveolos pulmonares. 10 Cuatro formas de daño pulmonar producido por talco han sido descritas, de las cuales tres son producidas por inhalación: talco-silicosis, talco-asbestosis y talcosis 11. Miller en 1976 atribuye las propiedades fibrogénicas del talco a las impurezas encontradas dentro de este, especialmente minerales pertenecientes al grupo de los silicatos 12. Estudios como el de Piniazkiewicz (1994) indican que el talco (fórmula química Mg 3Si4O10(OH)2) contiene 63,4% SiO2, 31,8% MgO y 4,8% agua 13. De entre estos compuestos, se han realizado numerosos estudios acerca del sílice como el de Yang (2010), los cuales han revelado que este ocasiona diversas patologías pulmonares, estrés oxidativo y peroxidación lipidica 14. En 2015 Shim et al. Resalto el papel del estrés oxidativo mediado por la generación de radicales libres 5

producido por la muerte de los macrófagos inducido por la alta toxicidad del sílice contenido en el talco en la formación de fibrosis pulmonar.15 Las propiedades antioxidantes de la granada han sido estudiadas anteriormente por Hernandez (1999), Gil (2000), Poyrazoglu (2002), entre otros, siendo estas atribuidas al alto contenido

de compuestos fenólicos16, 17, 18. en 2001 Kaplan encontró que la suplementación de jugo de granada en ratas reducía la peroxidación lipídica de los macrófagos. Por otro lado, en el 2007 Lansky y Newman reportaron efectos antiinflamatorios del extracto de granada en garganta y piel.19 En el 2013, Hemmati et al. evaluaron el efecto del extracto hidroalcohólico de semillas de granada en un modelo de fibrosis pulmonar inducido por bleomicina encontrando una reducción del daño pulmonar producido en el grupo tratado con el extracto 6. 4.2

MARCO TEÓRICO (20, 21, 22)

Actualmente se sabe que los oxidantes y los radicales libres altamente reactivos realizan un papel trascendental en la génesis del proceso inflamatorio de la enfermedad intersticial pulmonar. Los antioxidantes transforman a los radicales libres en agentes menos agresivos y nocivos, por cuanto limitan sus efectos tóxicos y deletéreos. Normalmente, el pulmón sano está adecuadamente protegido contra los oxidantes exógenos y endógenos a través de una variedad de antioxidantes intracelulares y extracelulares que incluyen un efectivo sistema enzimático y moléculas que “barren” los radicales libres. La molécula antioxidante predominante, tanto dentro como fuera de la célula, es el glutatión reducido (GSH). Sin embargo, el equilibrio oxidación/antioxidación puede alterarse e inclinar la balanza hacia la oxidación por diversos motivos (inmunológicos, ambientales) y causar los cambios tisulares y vasculares propios de la enfermedad.

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El estrés oxidativo tiene lugar cuando los mecanismos antioxidantes protectores no reaccionan adecuadamente, como por ejemplo ante una estimulación persistente, alta contaminación atmosférica, o debido a una disminución de antioxidantes endógenos, es decir, a defectos en los sistemas enzimáticos antioxidantes. Aunque no se puede cuantificar adecuadamente el daño causado por estos radicales de oxigeno con las ayudas biológicas actuales, existen evidencias clinicas que sugieren que el estrés oxidativo contribuye en forma directa al daño pulmonar: 1. La secreción aumentada de moco puede ser consecuencia de los oxidantes por cuanto éstos incrementan la secreción en los cultivos de células epiteliales. 2. El aumento de las quimiotaxinas para neutrófilos y el incremento de estas células (expuestas a hipoxia en cultivos, son bloqueados por antioxidantes. El anión superóxido puede generar quimiotaxinas en el suero, lo cual incrementa el número de neutrófilos. 3. Con frecuencia se presentan vasoconstricción y broncoconstricción en las diversas enfermedades pulmonares a través de mecanismos dependientes de oxidantes como puede ser la generación de tromboxano y la inactivación del oóxido nítrico (ON) por el O-2. 4. La proliferación fibroblástico puede ser acelerada por oxidantes a la vez que se puede inducir la aparición de fibrosis si no se bloquea con el uso de glutatión extracelular.

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5. El incremento de citoquinas y de su actividad es un hecho frecuentemente observado en muchas patologías pulmonares, posiblemente estimulado por radicales de oxígeno. El fenómeno común en todas estas respuestas es la aparición de inflamación. Las especies reactivas derivadas del oxígeno (anión superóxido, radical hidroxilo) o los metabolitos (peróxido de hidrógeno), son mediadores importantes en la lesión celular o tisular, pudiendo ser producidos por diferentes tipos de células inflamatorias. El daño pulmonar inducido por la inhalación de polvo mineral (asbesto, cuarzos y silicatos diversos), parece ser mediado por radicales libres. Estos agentes pueden afectar, tanto a las células epiteliales, mesoteliales como fibroblastos. La exposición ocupacional a los asbestos ha sido asociada con un incremento en el riesgo de fibrosis pulmonar (asbestosis). Las partículas de silicatos (calcio y magnesio) y las fibras de asbesto pueden ser fagocitadas por los macrófagos pulmonares. En esas condiciones estos leucocitos, pueden liberar por exocitosis el contenido lisosomal (enzimas proteolíticas, fosfatasas y glicohidrolasas), y mediadores quimiotácticos, causando la infiltración de otras células como son los neutrófilos e iniciando un proceso inflamatorio 5 que se acompaña de un incremento en la generación de ERO como parte del conjunto de eventos que conforman al estallido respiratorio de los leucocitos. El talco se compone de silicatos de magnesio hidratado en forma de cristales y se encuentra en una amplia variedad de formas. Los depósitos de talco están frecuentemente contaminados por otros minerales, entre los que se cuentan la tremolita fibrosa y no fibrosa y el cuarzo. Los efectos sobre la salud pulmonar de los

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trabajadores expuestos pueden relacionarse tanto con el propio talco como con los otros minerales asociados. La enfermedad puede aparecer por exposición laboral en las minas y en cualquiera de estas empresas, o de forma accidental, no ocupacional: en niños por el uso de talco cosmético, en toxicómanos, por inyección intravenosa de medicamentos orales que contienen talco, tras pleurodesis con talco. La composición del talco varía mucho de una industria a otra asociando otros potenciales patógenos en distinta concentración como asbesto, mica, caolín, etc. Aun así, parece que el talco por sí mismo es capaz de inducir una reacción de células gigantes multinucleadas y daño tisular. La embolización del talco provoca arteritis y una reacción neutrofílica de cuerpo extraño; migra desde la pared vascular al intersticio perivascular adyacente dando lugar a nódulos coalescentes. Produce fibrosis pleural, con posible formación de placas, focos de fibrosis parenquimatosa nodular, fibrosis intersticial e infiltrados peribronquiovasculares de macró- fagos que contienen cristales birrefringentes. La principal alteración radiológica es la aparición de placas pleurales y una afectación parenquimatosa similar a la de la asbestosis sobre todo perihiliar y en lóbulos superiores. Tradicionalmente se utilizan los corticosteroides como tratamiento paliativo en combinación con otros fármacos debido a su efecto antiinflamatorio. Sin embargo el uso prolongado de los corticoesteroides ha demostrado tener efectos secundarios perjudiciales, principalmente a nivel osteomuscular.23 Además los consensos de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Toráxica (SEPAR), de la American Thoracic Society (ATS) y de la European Respiratory Society (ERS) confirmaron que no existe beneficio con ninguna forma de tratamiento con corticoides. A pesar

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de todo esto y debido a la ausencia de opciones terapéuticas, en muchos países, como en el Perú, se continúa con el uso de estos fármacos24 Una pauta basada en el consenso sugiere que un régimen de dos medicamentos (una combinación de prednisona y azatioprina o ciclofosfamida). En la mayor parte de los casos se inicia tratamiento con prednisona a una dosis de 0.5-1 mg/kg/día durante 2 a 4 meses. Debido a que la mejoría se evidenciará en los primeros tres meses es que se requieren controles con score de disnea, estudios de función pulmonar, radiografía de tórax y tomografía axial computarizada 25. La prednisona tiene efectos antiinflamatorio, antialérgico e inmunosupresor, que constituyen la base terapéutica y se deben la inhibición de: la producción y secreción de citokinas proinflamatorias como interleukina (IL)-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma y factor estimulante de colonias granulocíticas y macrofágicas, por interferencia directa sobre las cascadas y mecanismos genómicos. Nuevas evidencias indican que los corticoides son más inmunorreguladores que inmunosupresores pues no anulan la secreción de ciertas citokinas (IL-4, factor estimulante de colonias macrofágicas y factor de crecimiento transformante beta; aumentan la expresión de correceptores para casi todas las citokinas y optimizan el curso temporal de la respuesta de los linfocitos T a la IL-226. La Punica granatum l. (granada) es una planta resistente a la sequía, ya que crece en zonas áridas y semiáridas; son ampliamente cultivadas en Irán, India y los países mediterráneos como Turquía, Egipto, Túnez, España y Marruecos34. Sin embargo, también es cultivada en nuestro país, donde encontramos 1296 hectáreas de cultivo de granada y las regiones que la producen en mayor cantidad son Ica, La Libertad y Arequipa. 27

10

Alrededor del 18% de las semillas, son aceites. El aceite es rico en ácido punícico (65%), que es un ácido graso poliinsaturado omega 5. Además contiene algunos compuestos de fitoestrógenos como el 17-alfa-estradiol, que son similares a las hormonas esteroides sexuales humanas.28 El jugo de granada es una buena fuente de fructosa, sacarosa y glucosa. También tiene algunos de los ácidos orgánicos simples tales como ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido fumárico, y ácido málico. Además, contiene pequeñas cantidades de todos los aminoácidos, principalmente de prolina, metionina y valina. Tanto el jugo como la cáscara, son ricos en polifenoles, que incluyen taninos y flavonoides que indican el potencial farmacológico de la granada debido a sus actividades antioxidantes. Los elagitaninos son un tipo de taninos; que tiene como componentes al ácido hidroxibenzoico y al ácido elágico. Otros dos elagitaninos que se encuentran tanto en el jugo de granada y la cáscara son la punicalagina y punicalina. Varias clases de flavonoides de granada incluyen antocianinas, flavan 3-oles, y flavonoles. El jugo de granada y la cáscara tienen catequinas con una alta actividad antioxidante. Las antocianinas (delfinidina, cianidina y pelargonidina3glucósidos y 3,5-diglucósidos) son pigmentos hidrosolubles que dan el color rojo de zumo. Todos los flavonoides granada muestran actividad antioxidante con la inhibición indirecta de los marcadores inflamatorios, tales como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). 28 Un aumento significativo de los sólidos solubles totales, pH y concentraciones de fructosa y glucosa se observó con avance en la madurez de la fruta y el pH aumentó durante la maduración del fruto en todas las ubicaciones agroclimáticas. 29 La corteza y las raíces del árbol de la granada son ricas fuentes de productos químicos llamados alcaloides.28

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Muchos estudios han informado de la potencial antiinflamatorio de extracto de granada. En un estudio en 30 ratas Sprague-Dawley con inflamación aguda debido a miringotomía, se observó que 100 μl/ día de extracto de granada podría reducir significativamente los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). 30 Tanto los elagitaninos y ácido elágico son los componentes principales del extracto de granada, que tienen propiedades antiinflamatorias, estos son metabolizados por la flora intestinal para producir urolitinas, que son los principales componentes responsables de las propiedades antiinflamatorias de la granada; se sugiere que la activación de NFkB, activación de la vía de la AMPK y COX-2, y la expresión de mPGES-1 se inhibieron a través de una disminución en la producción de prostaglandina E2 31. Los neutrófilos desempeñan un papel clave en los procesos inflamatorios mediante la liberación de grandes cantidades de ROS generados por NADPH-oxidasa y mieloperoxidasa, se indica que el ácido punícico exhibió un efecto antiinflamatorio potente a través de la inhibición de cebado inducido por TNF-α de la NADPH oxidasa y la liberación de mieloperoxidasa. 32 4.3

OBJETIVOS DEL ESTUDIO 4.3.1 GENERALES Determinar el efecto antioxidante de la Punica granatum (granada) contra la producción de daño pulmonar inducida por talco en ratas Sprague Dawley macho. 4.3.2

ESPECÍFICOS

Destrezas de los investigadores - Aprender a reconocer el estado físico y la anatomía normal de una rata albina. - Aprender la histología y fisiología pulmonar murina. Bioquímico Experimental 12

- Realizar pruebas clínicas basales: Radiográficas. Experimental - Inducir daño pulmonar con talco en ratas Sprague Dawley macho. - Demostrar que los principios activos del extracto etanólico de Punica granatum tienen un efecto protector contra la producción de daño pulmonar. Anatomopatológico experimental: - Evaluar macroscópica y microscópicamente del daño pulmonar producida por talco. 4.4

HIPOTESIS DEL ESTUDIO

El extracto etanólico de Punica granatum (granada) si posee un efecto antioxidante contra el daño pulmonar inducida por talco en ratas Sprague Dawley macho. 5.

MATERIAL Y MÉTODO 5.1 MATERIAL 5.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO Se utilizarán 40 ratas albinas macho de la cepa Sprague Dawley de 9 semanas de edad; cuyo peso promedio oscila entre los 220-280gr. Estas fueron adquiridas del bioterio del laboratorio de Investigación y Desarrollo de Ciencias y Tecnología de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. Estas ratas de experimentación tendrán un ciclo de luzoscuridad de 12 horas. 5.1.2

MATERIAL FITOQUÍMICO

13

Se utilizará el extracto etanólico de semillas de Punica granatum (granada), el cual será procesado en la Sección de Farmacología del Departamento de Ciencias Dinámicas de la Facultad de Medicina de la UNMSM. La materia prima que utilizaremos es la Punica granatum (granada), la cual fue obtenida en el mercado mayorista de frutas en el distrito de La Victoria, Lima.

5.1.3

MATERIAL DE INDUCCIÓN Talco común Se utilizará un sistema de compresión: -Compresora de aire -Dos recipientes de plástico -Dos filtros de aire -Una contenedora de plástico

5.2

MÉTODO 5.2.1 MUESTRA Se utilizaron 32 ratas machos raza Sprague Dawley de 50 días de edad con pesos corporales comprendidos entre 150 y 200 gramos. Estas ratas albinas fueron adquiridas en el bioterio de la Universidad Peruana Cayetano.Heredia y estuvieron provistas de agua y comida a libre disposición, mantenidas con un ciclo de 12 h de día y 12 h de noche, en un ambiente de 25±2 °C de temperatura y humedad de 50 a 70 %. Se les dio 7 días de aclimatación. La muestra inicial de 32 ratas albinas, se distribuyó al azar en dos 14

grupos, el primero: 2 ratas albinas para la fase de piloto; y el segundo: 30 ratas albinas, para la fase experimental de nuestra investigación. 5.2.2

ACLIMATACIÓN

Se les dio 7 días de aclimatación, es decir 7 días en los cuales las ratas se adecuaron a las condiciones del bioterio. Esta aclimatación y el desarrollo del proyecto se realizó en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, ubicado en la Av. Grau cuadra 7 Lima, Perú. 5.2.3

ALEATORIZACIÓN

Se utilizaron 32 ratas macho que fueron distribuidas al azar en 2 grupos. El primer grupo (n=2) fue el grupo piloto y el segundo grupo (n=30) fue el grupo experimental. 5.2.4

PILOTO

En el piloto se utilizó 2 ratas. Las finalidades del piloto fueron aprender a manejar el material biológico, seleccionar la técnica de sacrificio más adecuada y probar la eficacia del material de inducción. 5.2.5

EXPERIMENTAL

En el grupo experimental se utilizó 30 ratas, las cuales fueron divididas de forma aleatoria en 4 grupos, el Grupo B, el Grupo E1, el Grupo E2 y el Grupo E3. •

• •

GRUPO B El Grupo B (n=3) que es el grupo blanco al cual no se le indujo la fibrosis, ni se le administro el extracto etanólico o el fármaco seleccionado. GRUPO E1 El Grupo E1 (n=9) que es el grupo al cual se le indujo la fibrosis. GRUPO E2 El Grupo E2 (n=9) que es el grupo al cual se le indujo la fibrosis y se le administro el fármaco seleccionado, que es la prednisona. 15

•

GRUPO E3 El Grupo E3 (n=9) que es el grupo al cual se le indujo la fibrosis y se le

5.2.6

administro el extracto etanólico de la Punica granatum. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

Para la preparación del extracto etanólico de Punica granatum, se utilizó g de la porción acuosa la cual fue removida por prensado, las semillas se secaron en sombra, posteriormente las semillas secas se pulverizaron mediante acción mecánica gracias a una licuadora, luego 100 g de los granos finos se mezclaron con 300 ml de etanol de 96 % y se dejaron durante siete días a temperatura de 4ºC para su maceración en botellas de color ámbar con tapa, los cuales fueron agitados manualmente por 5 minutos dos veces al día, para evitar la sedimentación y favorecer la homogenización. Cumplido el tiempo, se procedió a realizar la filtración gracias al papel filtro Whatman 1, obteniéndose una solución homogénea la cual fue colocada en un pirex y llevada a la estufa a 40ºC, durante 7 días, para eliminar el etanol. Finalmente el extracto seco se almacenó en frascos ámbar de boca ancha, para ser resuspendidos en el solvente (agua) para su administración a los animales de experimentación. Se dejó en un ambiente refrigerado para su conservación. 5.2.7 5.2.8

MEDICIÓN BASAL (AUXILIARES) INDUCCIÓN

Para poder realizar el proceso de inducción primero se tuvo que tener preparadonel extracto etanólico para poder ser administrado a las muestras y fabricada la máquina liberadora de talco en el proceso. El proceso se llevó a cabo de la siguiente manera: 

1° Se procedió a separar las ratas en 3 grupos marcados: E1, E2 y E3 (especificado anteriormente).

16



2° Se administró 1 ml de prednisona a cada rata del grupo E2 de una mezcla de 100 mg de prednisona en 15 ml por medio de canulación, de la misma forma se administró 1 ml del extracto etanólico a cada rata del grupo E3 de una mezcla de 11 gr del extracto en 100 ml y al grupo E1 no se le dio extracto ni fármaco.



3° Después de la administración del fármaco y extracto se colocaron todas las ratas en una cámara completamente cerrada que emitía talco para inducir fibrosis pulmonar. Se mantuvo a las ratas por 3 horas cada día de inducción.



4° Se procedió a apagar la máquina que emitía talco luego de las tres horas y regresar a las ratas a sus respectivas jaulas (cada rata según el grupo estaba marcada con un color diferente en la cola para evitar confusiones y mezclas).

Este proceso se realizó cada día de la inducción con el mayor rigor por el periodo de 15 días como estaba indicado en los protocolos. 5.2.9 5.2.10

PRUEBAS FINALES SACRIFICIO, OBTENCIÓN

DEL

PULMÓN

Y

EVALUACIÓN

ANATOMOHISTOLÓGICA Con el fin de extraer nuestro órgano blanco, pulmón, para los estudios anatomopatológico, se procedió a realizar el sacrificio de los animales de experimentación. Para ello, teniendo en cuenta aspectos teóricos sobre las diversas técnicas y haciendo una valoración sobre lo positivo y negativo que conlleva emplear tal o cual técnica. Finalmente, se decidió emplear la dislocación cervical, técnica que consiste en separar el cráneo y el cerebro de la médula espinal aplicando presión en la base posterior del cráneo. Al separar la médula, el SNC deja de estimular la función respiratoria debido al gran daño ocasionado a nivel del tronco encefálico, conduciendo de esa manera a la muerte. El procedimiento que se siguió fue el siguiente: 17



1º Situamos los dedos pulgar e índice a cada lado del cuello junto a la base del cráneo.



2º Luego haciendo uso de la otra mano se sujeta la parte inferior del cuello y se gira ambas en sentidos contrario, de tal manera que las vértebras cervicales queden separadas del cráneo.



3º Finalmente, confirmamos la muerte por ausencia de reflejos, relajación de esfínteres y cese de circulación.

Teniendo como base teórica la anatomía de ratas de laboratorio se procedió a la disección y a la posterior extracción del órgano blanco, pulmón. Una vez extraído se procedió a colocarlo en un recipiente con una mezcla de formol al 10% para su fijación. 5.3 5.4

PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO ASPECTOS ÉTICOS El proyecto se guía de acuerdo a “The principles of Humane Experimental Technique” en donde se establecen por primera vez las técnicas de reemplazo, reducción y refinamiento, conocidas como las 3R’s. Actualmente las 3R’s son ampliamente conocidas por todos los investigadores responsables y no hay discusión sobre el bienestar de los animales de laboratorio. 

Reducción. Se refiere a métodos para obtener niveles comparables de información a partir del uso de menos animales en los procedimientos científicos o bien para obtener mayor información con el mismo número de animales.22



Refinamiento. Refiere a modificaciones en las técnicas para reducir el dolor y el estrés experimentado por los animales de experimentación. Por ejemplo, se han desarrollado varios tipos de cubiertas para proteger los catéteres insertados

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en los animales lo que permite a los investigadores administrar dosis continuas de fármacos y asimismo tomar muestras sanguíneas sin tener contener y puncionar cada vez al animal, tomando en cuenta que estos procedimientos significan estrés para el animal.22 

Reemplazo. Refiere a la situación en la cual las técnicas que utilizan animales pueden ser sustituidas por técnicas de laboratorio o de otro tipo. 22

6. 7. 8.

RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES  El modelo expuesto provoco daño pulmonar lo cual se validó con pruebas histológicas, 

macroscópicas y radiográficas presentadas en el trabajo. Este modelo induce una pérdida de masa pulmonar en el tejido estudiado (pulmón), por



inducción de los mecanismos apoptóticos y/o necróticos. Concluimos que el extracto etanólico del fruto de Punica granatum (granada) posee efectos antioxidantes frente a daño pulmonar inducido por talco en ratas Sprague Dawley



macho. Las láminas histológicas del grupo tratado con fármaco presenta menor daño en su estructura que las tratadas con el extracto etanólico del fruto de Punica granatum (granada).

9. SUGERENCIAS 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Tabaj, Gabriela C.; (2014). ARTÍCULOS SELECCIONADOS DE LA ESPECIALIDAD. Una puesta al día en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática. Revista Americana de Medicina Respiratoria, . 338-344. 2. Ancochea, J., Antón, E., & Casanova, A. (2004). Nuevas estrategias terapéuticas en la fibrosis pulmonar idiopática. Archivos de Bronconeumología,40(Supl. 6), 16-22. 3. Miranda, A. V., & López, V. M. R. (2009). Avances recientes en el conocimiento fisiopatológico de la fibrosis pulmonar idiopática. Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 22(3).

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3 4

1 Posicionamiento 2 Dislocación 3 Confirmación de muerte 4 Obtención del órgano 23