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Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Ciencias Biológicas BIO 297C - Laboratorio de Bioquímica, Biología celular

Laboratorio N°1: Espectrofotometría.

Integrantes: Paula Amado - Valentina Alarcón - Marcela Huenumilla Fecha de Realización: 13 - Marzo - 2018 Fecha de entrega: 20 - Marzo - 2018 Introducción

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La técnica utilizada en el presente informe fue espectrofotometría. Mediante esta técnica es posible obtener datos de absorbancia para una muestra dada, entendiendo la absorbancia como una forma de medir la absorción de radiación (UV o visible) por parte de la molécula en estudio (Harris, 2003).

La forma de cuantificar la absorbancia de la muestra experimentalmente es mediante un espectrofotómetro, instrumento que consiste en una fuente constante de luz, monocromador, muestra, fotodetector y computador (Boyer, 1986). En términos de los principios por los cuales es posible la utilización de la técnica es preciso hablar de la radiación electromagnética. Este tipo de radiación, que se desplaza a gran velocidad por el espacio, logra atravesar los tres estados básicos de la materia provocando que ciertas frecuencias sean absorbidas por las moléculas, de modo que la energía electromagnética es transferida a los átomos. Este comportamiento de la luz de trasladarse por el espacio y además ser absorbida por las moléculas se conoce como comportamiento dual de la luz, en que se puede encontrar como onda y como partícula separada en cuantos denominados fotones (Rodriguez y Virgós, 1998). Por la teoría cuántica, nombrada anteriormente, los fotones entregados para la excitación de las moléculas deben ser exactamente iguales a la diferencia entre en estado basal y el excitado para que dicha radiación sea absorbida (Skoog, Holler y Niemann, 2001).

Desde la Ley de Beer se enuncia que la absorción que una molécula efectúa es proporcional a la concentración de la solución dada. Así también, se debe considerar la Ley de Lambert en la que se enuncia la relación entre el camino recorrido por la molécula para absorber y la absorción que esta misma logra efectuar (Walton y Reyes, 2005). Las moléculas dentro de la cubeta en solución deben tener suficiente espacio para tener oportunidad de absorber luz sin ser enmascaradas por otras moléculas en disolución. Además, implica que cada fotón que atraviesa la cubeta puede ser absorbido de igual forma dando a conocer la presencia de una luz monocromática.

La unión de ambas ecuaciones o principios permite dar explicación al fenómeno de absorbancia y como usando la técnica de espectrofotometría se logra determinar la concentración de una muestra problema dada. Esta técnica e instrumento han sido escogidos debido al fácil uso de este último, rápida lectura de los datos que se presentan de forma digital, es de análisis rápido, alta precisión (±2nm) y se requiere baja preparación de la muestra problema para el estudio. Sin embargo, presenta

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desventajas como el alto precio del instrumento y la sensibilidad de las celdas que requiere especial cuidado al introducir la muestra.

Existen métodos que presentan mayor sensibilidad para la detección de concentraciones bajas, como lo es la fluorimetría, que se describe con aquellos compuestos que absorben luz remitiéndola a una longitud de onda más elevada, esta es medida en ángulo recto al haz de excitación contra un fondo oscuro y las mediciones de de absorbancia implican la detección de pequeños cambios en la luz trasmitida.

Con toda la información precisada acerca de la técnica a utilizar, el objetivo del práctico realizado es comprender los principios teóricos de la espectrometría y habituar el uso con las micropipetas, evaluando la precisión y exactitud del material volumétrico presente en el laboratorio.

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Materiales y Métodos 1) Materiales -

Espectrofotómetro Jenway 6300

-

Micropipeta P1000

-

Agua destilada

-

Tubos Falcon

-

Violeta de gencenia

2) Metodología En la primera parte del práctico se usó el espectrofotómetro Jenway 6300, este se calibró automáticamente y luego se llevó 0 absorbancia a 450nm de longitud de onda. Se insertó la muestra blanco, que corresponde a 1mL de agua, en el portacubetas. Considerando que la cubeta estuviera limpia y en la posición correcta, para que haz de luz incidiera.

Luego para determinar el espectro de absorción del Violeta de Gencenia en una concentración 1:5, se midió la absorbancia de 1mL a 450nm y 400nm de longitud de onda. Se determinó la absorbancia en espectrofotómetro, luego se realizó un primera serie de medidas en un rango de longitudes de ondas desde 420nm a 700nm, cada 20 nanómetros como se observa en la tabla 1. Posteriormente se determinó un valor de absorbancia máxima a una longitud de onda determinada, lo que constituye la segunda serie de medidas en el rango de 550nm a 615nm, cada 5 nanometros (Ver tabla 2). La tercera serie de medidas se realiza con la absorbancia máxima considera en la segunda serie de medidas, el rango de longitud de onda que abarcan se realizó cada 1 nanómetros, desde 583nm a 597nm obteniendo los datos tabulados en la Tabla 3. En la segunda parte del práctico se realizó cuatro diluciones en la proporción de ½, ¼, ⅛ y 1/16, aparte de una solución de Violeta de Gencenia 1:5, mediante una micropipeta 1000. En la disolución ½ , se dispuso de 2mL de dicha solución concentrada y se traspasaron a un tubo falcon, agregando 2 mL de agua destilada, para las siguientes se extrajo 2mL de la solución anterior y agregando 2 mL agua destilada, generando diluciones seriadas.

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Resultados Con el fin de establecer el espectro de absorción para el colorante y mediante el uso del espectrofotómetro se obtuvieron datos de absorbancia para el Violeta de Genciana a distintos valores de longitud de onda, los datos obtenidos se muestran en las Tablas 1, 2 y 3.

Tabla 1. Mediciones de absorbancia de 20 en

Tabla 2. Mediciones de absorbancia de 5

en 20 nm.

en 5 nm.

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Tabla 3. Mediciones de absorbancia de 1 en 1nm.

Longitud de onda del máximo de absorción: 590nm

Los valores obtenidos de absorbancia en cada longitud de onda fueron graficados según Absorbancia vs Longitud de onda, el espectro de absorción obtenido se muestra en el Gráfico 1.

Para obtener el coeficiente de extinción molar del violeta de genciana mediante una curva de calibración se prepararon cuatro diluciones seriadas en las razones 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16

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considerando un volumen final de 4 mL para cada solución según: →

Volumen final: 4mL

2 mL solución + 2 mL agua destilada

Las concentraciones molares de cada una de las diluciones seriadas fueron calculadas mediante la ecuación 1 posterior a haber determinado la concentración molar de la muestra original. Ecuación n°1 C1 ∙ V1 = C2 ∙ V2

Determinación de la concentración molar de la solución ⋅Peso molecular cristal violeta = 407,9 gr/mol ⋅Solución entregada= 0,5 mg/100mL 0,5𝑚𝑔

⋅ 100 𝑚𝐿=

0,005 𝑔𝑟 1𝐿 0,005𝑔𝑟 𝑋 𝑚𝑜𝑙

=

407,9 𝑔𝑟 1 𝑚𝑜𝑙

⇒ 1,225𝑥10−5 mol

Luego, para graficar la curva de calibración correspondiente, se midió la absorbancia de cada una de las diluciones por duplicado mediante el uso de espectrofotómetro y con una longitud de onda de 590 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4. Tabla 4. Datos de absorbancia obtenidos para cada concentración molar. Absorbancia Concentración Molar (M)

1era medición

7,656𝑥10−6M

-

0.009

1,531𝑥10−6M

0.039

0.045

0.092

0.090

0.160

0.163

3,063𝑥10−6M 6,13𝑥10−6M

2da medición

Para integrar ambas mediciones de absorbancia para cada uno de las diluciones seriadas

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se calcularon los promedios indicados en la tabla 5, valores utilizados para elaborar la curva de calibración. En el procedimiento experimental no se realizó la medición n° 1 de la dilución 1:2 por error en el desarrollo de la metodología por lo que el valor utilizado para la curva de calibración corresponde a la única absorbancia obtenida.

Tabla 5. Datos de absorbancia obtenidos por el cálculo del promedio entre ambas mediciones realizadas en el procedimiento experimental en cada una de las diluciones Concentración de la Dilución

Promedio Absorbancia (nm)

7,656𝑥10−6M

-

1,531𝑥10−6M

0,042

3,063𝑥10−6M

0,091

6,13𝑥10−6M

0,1615

Finalmente, con el fin de determinar la concentración de la muestra problema, correspondiente a violeta de genciana, se midió su absorbancia a una longitud de onda de 590 nm, datos entregados en la Tabla 6.

Tabla 6. Datos de absorbancia de medición por duplicado a 590nm Longitud de onda (nm)

Absorbancia

590

0,072

0,075

Promedio absorbancias: 0,0725 Mediante una extrapolación lineal de la gráfica absorbancia vs concentración es posible conocer la concentración de la muestra problema, para eso se utiliza la ecuación de la recta, sabiendo que: Ecuación de la recta ⇒ y = 27764x + 0,003 Con

y = absorbancia x= concentración

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0,0725 = 27724 ∙concentración + 0,003 Concentración =

0,069 27764

Concentración de la muestra problema: 2,485x10

−6

M

El valor teórico de la muestra problema corresponde a una dilución de la solución original 0,5 mg/100mL en una relación 1:5, lo que equivale a una concentración molar de: ✳utilizando ecuación 1 1,225x10

−5

M ∙ 1mL =

C2 ∙ 5mL

Concentración: 2,45x10

−6

M

Se calculó el error relativo de la concentración mediante:

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 Ecuación 2.

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜

x 100

Error relativo: 1,43%

Discusión Cuando ondas del espectro electromagnético, cuyas longitudes de onda varían a lo largo de este, son capaces de excitar a las partículas presentes en la materia quiere decir que los

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electrones son movilizados desde un estado basal a uno de mayor energía gracias a la interacción de las moléculas con los fotones del haz de luz, estos últimos, otorgarán la energía necesaria para compensar la diferencia energética entre ambos estados de los electrones(Boyer, 200). Al confeccionar el espectro de absorción del violeta de genciana es posible observar cómo a distintas longitudes de ondas se obtienen distintos valores de absorbancia, debido a que los fotones, al poseer distintas energías interactúan de manera desigual con las partículas presentes en la muestra. Esto se explica con la relación que existe entre la cantidad de energía de los cuantos pertenecientes a un haz de luz con su longitud de onda dada por la ecuación de Planck:

E=hv (Buefe, 2004)

En ella se establece que la energía (E) es proporcional a la constante de planck (h) y a la frecuencia (v) a partir de esto se encuentra la relación con la longitud de onda la cual es definida por Lambda= c/v (Boyer, 2000)

Donde c corresponderá a la velocidad de la luz. Así es posible establecer que a una mayor longitud de onda existirá una menor frecuencia y por tanto una menor cantidad energía. En el gráfico 1 se observa como la absorbancia aumenta desde los 460nm hasta los 590nm debido a que a partir de esa longitud de onda con su respectiva energía, la interacción de los fotones con las partículas del violeta de genciana varía acercándose al punto de absorbancia máxima en donde la energía de los fotones iguala a la diferencia energética entre el estado de excitación y el estado basal de los electrones. La mantención y disminución de absorbancia observada en el intervalo 586-588nm puede ser explicada por errores del operador en un mal manejo de la cubeta que contiene la muestra al dejar marcas que impidan una medición correcta, o del espectofotómetro, con un mal cierre o un mal encaje de la cubeta dentro de este.

El máximo de absorbancia se encontró en los 590nm, longitud de onda utilizada para confeccionar la curva de calibración a partir de las diluciones en serie, se escoge este valor debido a que la curva es relativamente aplanada en las proximidades del máximo de manera que apenas varía la absorbancia (Harris, 2007) lo que da cierto rango en longitudes de onda

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cuyas absorbancias son lo suficientemente similares para evitar grandes errores de cálculos y porque la sensibilidad del análisis es máxima en el máximo de absorbancia (Harris, 2007) lo cual significa que es en este punto donde se encuentra la máxima respuesta de las partículas de la muestra para una concentración dada de la misma.

Lo que otorga la curva de calibración es la posibilidad de establecer una relación lineal entre la concentración y la absorbancia lo que permite extrapolarla linealmente y así determinar concentraciones de muestras problemas mediante el análisis de la ecuación de la recta. En esta última (y=mx+b) sabiendo que y corresponderá a la absorbancia, x a la concentración y b a 0 (idealmente debido que a concentración 0 la absorbancia es 0) es posible determinar que si y=mx, la pendiente corresponde al coeficiente de extinción molar (estableciendo 1 la trayectoria óptica) ya que según la ley de Lambert-Beer la Absorbancia(A o y) es proporcional a la concentración(c o x), trayectoria óptica(1) y coeficiente de extinción molar (e o m). Por lo tanto la pendiente m=27764 corresponde al valor del coeficiente de extinción molar.

Las curva de calibración presentada en el gráfico 2, si bien no presenta grandes desviaciones, no muestra una relación completamente lineal, esto puede ser explicado por errores tanto en el manejo de la muestra al momento del desarrollo experimental que alteraron la correcta medición de la absorbancia, como en alteraciones en la concentración de la muestra debido a errores en el proceso de dilución seriada, esto es altamente probable debido a que al trabajar con concentraciones tan bajas cualquier error, por mínimo que fuera puede generar resultados que se alejen de lo esperado, lo que explica también el hecho de que n en la ecuación de la recta no fuera exactamente 0. Además, algunos de los errores más comunes de la espectrofotometría, es que ciertas leyes que la rigen como la ley de Lambert-Beer, ya sea por las altas concentraciones o un cambio de absorción del cromóforo, la amplitud de banda del monocromador es demasiada ancha por lo que longitudes de onda diferentes de las absorbidas por el cromóforo se transmiten a la muestra. Siguiendo la lógica que explica el uso de la absorbancia máxima para elaborar la curva de calibración, se midió a 590nm la muestra problema cuya concentración teórica corresponde a 1:5, es decir una parte de la muestra original diluida en cuatro partes de agua destilada que en concentración molar equivale a 2,45x10

−6

M. El resultado obtenido por la extrapolación

de la curva de calibración, reemplazando datos en la ecuación de la recta obtenida (y=27764x+0,003) corresponde a 2,485x10

−6

M, a partir de esto se puede establecer un

error relativo que indica una desviación del resultado experimental del esperado (teórico). El

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error relativo indica que si bien existieron errores dentro del desarrollo experimental, los cuales se observaron gráficamente en el espectro de absorción y la curva de calibración, el desarrollo del análisis de las mediciones se realizó de manera correcta.

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Conclusión

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Para concluir el estudio de los fenómenos que fundamentan la espectrofotometría, podemos decir que la Ley de Lambert- Beer cumple varias condiciones, por lo que se puede asumir la que ley no se cumple producto de las desviaciones que sufre a bajas o altas concentraciones. El realizar un curva de calibrado nos permite calcular la concentración de la disolución de colorante que diluimos. Pero, además poder determinar la de la muestra problema. Al construir una curva de espectro de absorción, se enfatiza el punto de máxima absorbancia a una longitud de onda determinada, para comprender de qué manera se construye el espectro. Las micropipetas son un instrumento que mide varios tipos de volumen por lo que tienen una medición poco exacta.

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Bibliografía -

Boyer, R. (1986). Modern experimental biochemistry. :Pearson Education India. pp 152

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Buefe, F. (2004). Ciencias Físicas. (pp. 240) España: Editorial Reverté.

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Harris, D. (2007). Fundamentos de espectrofotometría. En Análisis químico cuantitativo. (6ta ed., pp. 427-428, 240). Barcelona, España: Editorial Reverté.

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Rodríguez, J., Virgós, J. (1998). Teoría electromagnética de la luz. En Fundamentos de óptica ondulatoria. (1era ed., pp. 21). España: Universidad de Oviedo.

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Skoog, D., Holler, F., Niemann, T. (2001). Introducción a los métodos espectrométricos. En Principios de Análisis instrumental. (5ta ed., pp. 141-145). Madrid, España: McGraw-Hill.

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Walton, H., Reyes, J. (2005). Absorcion de radiacion. En Análisis químico e instrumental moderno. (1ra ed., pp. 146). España: Editorial Reverté.

Anexo: Cuestionario

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1) A bajas y altas concentraciones de un cromóforo se observan desviaciones a la Ley de Lambert-Beer. Explíquelas.

Una causa importante de la desviación de linealidad corresponde a la pérdida de monocromaticidad que es conocida como luz parásita dentro del detector. Entonces esta luz parásita que no es absorbida aporta error en la medición de absorbancia. Una desviación frecuente corresponde a la producida por cambios redox, esto es, la molécula en estudio genera un equilibrio que puede, incluso, generar una dimerización que sea observable a una mayor longitud de onda comparada con su estado monomérico. Ocurre también que a altas concentraciones el soluto se convierte prácticamente en solvente debido a la proximidad de ambas fases. Con esta interacción se produce un cambio en sus propiedades, tales como la absorbancia y por ende la medición cambia y sesgada por las nuevas propiedades de la molécula. Las soluciones de baja concentración con aproximadamente 0,01𝑀 están perce más propensas a desviaciones de la Ley puesto que pequeño cambios en distintos parámetros (intensidad de fuente de luz, por ejemplo) causan cambios significativos en la medición de absorbancia.

2) Explique por qué una sustancia que absorbe luz en el rango visible presenta a la vista el color complementario de la longitud de onda que absorbe. ¿Ocurre esto en el rango UV? ¿Por qué?

Si, porque la porción de radiación de UV-visible absorbida implica una porción no absorbida por la muestra y qué es transmitida a través de ella. Dicha porción no absorbida o reflejada puede ser captada por el ojo humano y entonces distinguir el color complementario.

3) Averigüe la estructura molecular de los colorantes que empleó en este práctico e identifique el cromóforo.

Para la estructura mostrada en la Figura 1 se observa el cromóforo ubicado en sus tres anillos aromáticos que se conjugan para poder darle la propiedad de absorción de luz UVvisible.

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Figura 1. Estructura molecular de Violeta de gencenia.

4)

Indique cuáles son los cromóforos de proteínas y DNA en el rango UV.

En el rango UV, la proteínas poseen algunos aminoácidos capaces de comportarse como cromóforo. Entre ellos se cuentan: Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr) y Triptófano (Trp). Esto se debe a que todos corresponden a aminoácidos aromáticos que poseen composición de enlaces conjugados permitiendo la absorción de luz y siendo la base de los cromóforos.

5) Haga una lista de biomoléculas que absorben a una longitud de onda similar al DNA. Indique claramente qué tienen en común.

La principal característica en común es que naturalmente las moléculas presentan un cromóforo en su grupos funcionales. Las biomoléculas corresponde a: -

FMN

-

FMNH

-

NAD

-

NADH

-

Nucleótidos