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Espectrofotometría

Principios, Componentes, Cuidados, Control de Calidad y Mantenimiento

Espectrofotometría Término que se refiere al uso de la Radicación Electromagnética (REM) para medir las concentraciones de una sustancia.

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Un poco de historia • Antes de 1940 la mayoría de las determinaciones en química clínica eran del tipo volumétricas y gravimétricas. Por lo que la mayor parte de los resultados fueron semicuantitativos. • En la década de 1950 se comienza a utilizar el espectrofotómetro (EE.UU.). Éste eliminó el comparador de color, logrando así que los análisis fuesen más cuantitativos, confiables, reproducibles e incrementando la precisión y la exactitud.

• El espectrofotómetro es un instrumento útil, por las ventajas tales como rapidez, sencillez, especificidad y sensibilidad. 3

Antecedentes teóricos • Todo átomo y molécula es capaz de absorber energía (bajo ciertas limitaciones). • La energía puede proporcionarse en forma de REM, “luz”. • El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molécula esta relacionada con su estructura.

• Así mismo la cantidad de REM absorbida está relacionada con el número de moléculas que interaccionan con ella. 4

Antecedentes teóricos • De la REM sólo se trabaja para la espectrofotometría en química clínica con la ultravioleta y la visible.

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Antecedentes teóricos λ máxima absorción (nm)

Color absorbido

Color observado

400-450

Violeta

Amarillo-verde

450-480

Azul

Amarillo

440-470

Verde-azul

Naranja

470-500

Azul-verde

Rojo

500-560

Verde

Púrpura

560-575

Amarillo-verde

Violeta

575-590

Amarillo

Azul

590-625

Naranja

Verde-azul

625-750

Rojo

Azul-verde 6

Antecedentes teóricos • La radicación electromagnética tiene un comportamiento dual, es decir, como onda y como partícula. • Como onda se sabe que presenta la propiedades de reflexión, refracción y difracción, esta última explica la descomposición de la luz en los diferentes colores.

Radiación electromagnética, de luz polarizada en un plano y que se propaga a lo largo del eje de las x

Espectro de luz visible

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Antecedentes teóricos • La REM se desplaza describiendo una onda, mientras más pequeña es la longitud de onda (λ) mayor energía posee y viceversa. • La longitud de onda (λ) es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y se mide comúnmente en nm . • La frecuencia (ν) es el número de ondas que pasan por un punto dado en una unidad de tiempo, es decir, en s-1 = hertz Longitud de (Hz). onda grande Baja Frecuencia

Alta frecuencia Longitud de onda pequeña

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Antecedentes teóricos c • La ecuación ν  describe esa relación. λ

• La velocidad de la luz (c) una constante universal de valor = 2,997 924 58 X 108 m/s. • La potencia (P) de un haz de radiación es la energía del haz que llega a un área dada por segundo. • La intensidad (I) es la potencia por ángulo sólido unitaria.

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Antecedentes teóricos • Como partícula (fotón) permite explicar el proceso energético de la REM. • E = hν donde E = energía y h = constante de Planck (= 6,626 0755 X 10-34 Js). c • Sustituyendo ν de ν  , en E = h ν. λ hc o E  hcν , ν  1 que recibe el • Nos queda que E  λ

nombre de número de onda.



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Antecedentes teóricos • a) b) c) d) •

•

Todas las moléculas poseen energía la cual es debida a: La translación. La vibración de sus constituyentes (átomos). Rotación y. Su configuración electrónica. Dando como resultado que la energía total sea igual a la suma de cada una de las anteriores. Por lo que la mecánica cuántica nos índica que la molécula sólo puede adoptar ciertos valores de energía y que ésta se encuentra cuantizada y es diferente para cada compuesto. 11

Antecedentes teóricos • La absorción de la REM por alguna especie M se considera en dos etapas y como un proceso irreversible. • M + hν M*, donde M* es la partícula en estado excitado, debido a la absorción de un fotón la vida de M* es del orden de 10-8 - 10-9 s. • La molécula regresa a su estado basal mediante la liberación de la energía antes adsorbida, es decir, M*

M + calor.

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Fundamento • Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (P ≤ P0) donde P0 es la que sale del monocromador. • La ley que explica la relación entre la absorción y la concentración de una sustancia es conocida comúnmente como ley de Beer o Lambert-Beer. • Si T es la transmitancia, es decir la radiación que pasa altraves del cuerpo entonces T=P/P0 por lo que T solo puede tener valores que van desde cero hasta uno. 13

Fundamento • Como normalmente se trabaja con %T entonces tenemos que %T  P  100 lo que nos da como resultado P0 100 la ecuación más conocida para la relación de la absorbancia, esta es:

A  2  log%T

• Cuando no se absorbe luz P=P0 A = 0.

• Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se transmite, es decir, P=1/P0 dando un valor de A = 1. • Al absorberse el 99% de la luz, es decir, se transite el 1% A = 2. 14

Fundamento • La importancia de la absorbancia [A] (Densidad Óptica [D.O.] Densidad [D] o Extinción [E]) estiba en que es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente en la muestra, y la expresión matemática que la representa es. A = εbc que es la ley de Lambert-Beer  Donde A es la absorbancia de la muestra, ε (a) es el coeficiente de extinción molar, b es la longitud de la trayectoria óptica y c la concentración de la solución problema. • La relación lineal entre A y b a una concentración fija de sustancia absorbente es una generalización para la que no se conoce excepción. 15

Limitaciones a la ley de Lambert-Beer • La relación directa entre A y c si presenta desviaciones a la linealidad medidas a una misma longitud de trayectoria del haz. • Por lo que la ley sólo se cumple con disoluciones verdaderas y a concentraciones ≤ 0.01M o F. Puesto que en toda solución concentrada las moléculas del soluto interaccionan entre sí por su proximidad: Lo cual hace probablemente que cambien las propiedades eléctricas de las moléculas, causando también una modificación en las propiedades ópticas de éstas.

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Limitaciones a la ley de Lambert-Beer (continuación) • Desviaciones químicas. Debidas a la asociación, disociación o reacción de las sustancia problema con el disolvente. V. g. soluciones mal amortiguadas, lo cual cambia la concentración y la desviación es más aparente que real, por modificación de los equilibrios químicos.

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Instrumento, sus partes Rendija

Escala de lectura T= % transmitancia A = -log (T/100)

Muestra

en una cubeta

Monocromador

Selección de una longitud de onda de luz: 500 nm

Rendija

Lámpara

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Sus partes a. Lámpara: La tungsteno es una magnifica fuente de radiación en el intervalo de los 380 - 780 nm y opera a T de 2 870 K. Las más empleadas en química clínica son las de yoduro de tungsteno que tiene una vida útil de 2 a 3 000 h. por debajo de los 360 nm es conveniente utilizar una lámpara de arco de deuterio la cual emite una radiación en el intervalo de 180 - 400 nm. Menos frecuentes son las lámparas de hidrogeno con intervalos de 150 – 350 siendo parecidos a los de deuterio. Las de mercurio presentan el inconveniente de proporcionar sólo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 “y” 546 nm.

a

b

c

d

e

f

g

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Sus partes • b, c y d son los componentes del monocromador. b. La rendija de entrada reduce al máximo la luz difusa y evita que la luz dispersa penetre al dispersor, éste solo lo puede hacer con un mínimo de luz directa.

b

c

d

c. Dispersor de luz (selector de longitud de onda, o monocromador propiamente dicho). Pueden ser prismas o rejillas de difracción. 20

c Prismas y rejillas de difracción • En caso de los prismas. Para la luz visible un prisma de vidrio es bueno, sin embargo, este material no es conveniente para las mediciones en la región del ultravioleta, pues el vidrio absorbe la radicación a estas λ.

b

c

d

La dispersión producida por un prisma ni es lineal, y se hace mucho menor cuando λ >550 nm. 21

Prismas y rejillas de difracción (continuación) • Las rejillas de difracción, estas se preparan a partir de una rejilla patrón la en la cual se graban surcos –las que se emplean para las regiones visible-uv poseen 2 325 surcos por cm2- sobre una superficie metálica. La dispersión de la luz en las rejillas de difracción es lineal. Como los surcos están muy próximos entre sí cuando la luz es reflejada por la rejilla, cada estría se comporta como una fuente de radiación. Si los rayos de luz adyacentes están en fase, se refuerzan unos a otros. Cuando no lo están, se cancelan parcial o totalmente.

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d Ranura o rendija de salida • Ésta determina el ancho del espectro de dispersión que sale del sistema monocromador. Puede enfocarse una línea particular sobre dicha ranura haciendo girar la rejilla. Si las ranuras de entrada y salida son del mismo tamaño, la imagen de rendija de entrada teóricamente encajará exactamente en la abertura de la ranura de salida cuando al montaje del monocromador corresponde a la longitud de onda de la radicación. Moviendo el montaje del monocromador en una u otra dirección produce una continua disminución de la intensidad emitida, llegado a cero cuando la imagen de la ranura de entrada ha sido desplazada en todo su ancho.

b

c

d

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Ancho de banda • Como la luz obtenida que sale del sistema monocromador no es verdaderamente de una sola λ, sino que comprende un intervalo de λ. El grado de monocromaticidad se define como el Ancho de Banda. Es el intervalo de λ que pasan a través de la rendija de salida.

Lo que se observa en una rendija de salida cuando se explora con el monocromador son longitudes de onda que van desde λ1 – δλ hasta λ2 + δλ 24

e Celdas o portamuestras • Existen de todos tamaños y formas. Las más comunes para medir espectros visibles y de ultravioleta son de cuarzo, tienen un espesor de 1,00 cm (o trayectoria óptica). • Las más fáciles de conseguir son las redondas (tipo tubo de ensayo) las mejores son las cúbicas.

e

f

g

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f

Detectores, fotomultiplicadores y fototubos • Poseen la capacidad de producir una señal eléctrica cuando son bombardeados por fotones. • Se basan en el efecto fotoeléctrico. • El más sensible es el fotomultiplicador. En éste los electrones emitidos por una superficie fotosensible inciden en una segunda superficie, llamada dínodo, la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible.

f

g

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Fotomultipicadores

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g Registrador • De aguja o digital. • Incorporado a un sistema de impresión. • Conectado a una computadora.

g

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Errores en espectrofotometría Para el análisis cuantitativo se debe tomar en cuenta: 1. La absorbancia no debe ser demasiado grande. 2. La absorbancia debe medirse en un pico o en una meseta donde dA/dλ sea pequeña. 3. El ancho de banda del monocromador debe ser lo más grande posible, mas pequeña comparada con la banda que va a medirse. Los errores instrumentales • Las mediciones más exactas suelen hacerse cuando la absorbancia se encuentra entre 0,4 y 0,9. • Para mayor precisión, las muestras deben estar libres de polvo, las celdas de huellas digitales, o cualquier otra contaminación o daño físico que modifique o altere la óptica en general. 29

Control de calidad Es necesario realizar periódicamente pruebas para verificar que el instrumento esta trabajando adecuadamente: exactitud de longitud de onda, linealidad de la respuesta del detector, radiación errática, y exactitud fotométrica.

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Disco de Newton 800 400

620

Rojo

Violeta

430

Azul

Naranja

Verde

580

490

560 31

Colores complementarios para leer en el espectrofotómetro Intervalo de longitud de onda (nm)

Color de la luz absorbida

Color complementario trasmitido

400 – 435

Violeta

Amarillo verdoso

435 – 480

Azul

Amarillo

480 – 490

Azul verdoso

Anaranjado

490 – 500

Verde azulado

Rojo

500 – 560

Verde

Púrpura

560 – 580

Amarillo verdoso

Violeta

580 – 595

Amarillo

Azul

595 – 650

Anaranjado

Azul verdoso

650 – 750

Rojo

Verde azulado

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Exactitud de longitud de onda Se han sugerido varios estándares para verificarla en las regiones visible y uv.  Las lámparas de mercurio producen como ya se ha mencionado líneas de emisión.  Las líneas de emisión del hidrógeno (o deuterio) con líneas de emisión útiles a 486 y 656 nm.  El espectro de absorción del óxido de holmio como vidrio o en solución posee fuertes líneas de absorción a aproximadamente 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm.  El didimio tiene bandas de absorción mucho más amplias 573, 586, 685, 741 y 803.  Espectro de absorción del benceno.  Solución alcalina de cromato de potasio.  Puntos isosbésticos. 33

Puntos isosbésticos Cuando una sustancia presenta varias formas (como los colorantes ácido-base), éstas pueden presentar un mismo punto donde se cruzan los espectros de absorbancia, éstos son fijos por lo que permiten verificar la exactitud de la longitud de onda. La limitación que este procedimiento tiene es que se debe hacer el barrido espectrofotométrico para cada una de las formas de dicha sustancia (v. g. rojo de metilo) y realizar la gráfica tal como lo muestra la figura siguiente.

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Linealidad Un espectrofotómetro que trabaje adecuadamente debe mostrar una relación lineal entre la cantidad de energía radiante absorbida y la lectura del indicador. Ésta es un requisito para la exactitud tanto instrumental como analítica.  Filtros de vidrio pueden emplearse.  El empleo de soluciones a distintas concentraciones de un compuesto que siga la ley de Lambert-Beer por ejemplo:  La oxihemoglobina a 415 nm. p-nitrofenol a 405 nm. Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm. Sulfato de cobre a 650 nm.

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Mantenimiento • Preventivo. Éste se realiza tomando en cuenta los datos vertidos en la bitácora. – Registrar el tiempo que permanece encendida la lámpara – Verificar el la vida útil de la lámpara y solicitar a compras un repuesto con tiempo suficiente para su cambio. – Anotar fecha, hora, y personal que realizó el cambio de lámpara. – Anotar fecha, hora y operador que hizo la verificación de linealidad, y exactitud de λ. – Anotar hora y día que se realizó la limpieza, engrasado y revisión de partes del instrumento. – Anotar el último mantenimiento correctivo que se le realizó al instrumento. 36